CN118108849B - 一种抗cd33的纳米抗体制备方法和抗体的荧光标记流式应用 - Google Patents
一种抗cd33的纳米抗体制备方法和抗体的荧光标记流式应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗CD33的纳米抗体制备方法和抗体的荧光标记流式应用，纳米抗体包含可变区；所述可变区为CDR1、CDR2、CDR3序列中的任意一个或多个；所述CDR1具有如SGRTVTFRQETI所示的氨基酸序列；所述CDR2具有如VYYCWGGLVQAGGS所示的氨基酸序列；所述CDR3具有如RPAKPGKEREFVWTKGLRSDTQ所示的氨基酸序列；提供的抗CD33纳米抗体对CD33具有特异的识别和结合能力，能够在CD33免疫检测特别是流式应用中获得优异的检测效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测试剂技术领域，具体为一种抗CD33的纳米抗体制备方法和抗体的荧光标记流式应用。
背景技术
和传统抗体相比，纳米抗体并非仅以小取胜，它有着多方面的优势：
（1）体积较小，仅为普通抗体的十分之一；因为体积小，它在动物组织体内的穿透力更强，比如，它可以通过人体的脑组织，可以达到高密度的肿瘤内部，这些都是普通抗体做不到的；纳米抗体的小体积优势，让人们可以通过它来治疗某些肿瘤或脑部疾病；
（2）效能稳定；纳米抗体在体内不被自然分解的时间比普通抗体长，这意味着药效时间更持久；而且它适应的温度范围较广，在高达90°C的温度下仍能发挥作用，而传统的抗体在这样的状态下则会失活；即使是在极端pH值下它的表现也十分稳定，甚至能从人胃中通过而保持有效性；
（3） 抗原特异性好，且易于基因改造；纳米抗体能够识别独特的抗原构造表位，比普通抗体具有更广泛的抗原结合能力，并且方便人工改造以获得对抗不同病原的抗体；纳米抗体能够很容易在微生物中进行合成，能在噬菌体、大肠杆菌、酵母等微生物中大量表达，易于大规模生产；
CD33是67千道尔顿糖基化跨膜蛋白，属于唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族；在交联或者配体结合后激活，介导抑制信号，调节细胞内钙动员、细胞粘附、白血病细胞凋亡、髓系细胞成熟和细胞因子的产生等；在分化过程中，成熟粒细胞上CD33降低，但在巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞上保留；CD33在非造血组织中的表达有限，但在A毫升细胞中高表达；此外，现已证实在白血病祖细胞也表达CD33，使该分子成为一个非常有潜力的A毫升的治疗靶点；
CD33属于髓系抗原，从造血干细胞阶段分化成熟的过程中，出现于CD13之后；除了嗜酸粒细胞非常微弱表达或表达缺失之外，其它髓系细胞几乎全都表达CD33；尤其是以下系列的细胞：集落形成单位粒细胞 - 巨噬细胞，原粒细胞，早幼粒细胞，中幼粒细胞，晚幼粒和中性粒细胞，单核细胞和巨噬细胞，小部分巨核细胞，嗜碱粒细胞和肥大细胞，髓样树突状细胞（浆细胞样树突状细胞除外），因此CD33纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种抗CD33的纳米抗体制备方法和抗体的荧光标记流式应用。
实现上述目的本发明的技术方案为，一种抗CD33的纳米抗体，包含可变区；所述可变区为CDR1、CDR2、CDR3序列中的任意一个或多个；
所述CDR1具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
所述CDR2具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；
所述CDR3具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
对本技术方案的进一步补充，所述可变区为CDR1、CDR2、CDR3序列中的任意一个或多个所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与CDR1、CDR2或CDR3中的任意一个或多个所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。
对本技术方案的进一步补充，所述可变区具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
对本技术方案的进一步补充，所述可变区为如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。
对本技术方案的进一步补充，所述取代、缺失或添加一个或多个氨基酸中的多个为2个、3个、4个或5个。
一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码如上述所述的一种抗CD33的纳米抗体。
对本技术方案的进一步补充，所述核酸分子的核苷酸序列为：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。
一种抗CD33的纳米抗体制备方法，包括以下步骤：抗体基因序列直接合成到真核表达载体pcDNA3.1中,转化至感受态细胞Top10中；将转化子接种到5毫升的肉汤培养基中37℃，200转/分过夜培养，然后按照1％接种到400毫升的肉汤培养基中，37℃，200转/分过夜培养；6000转/分,室温离心6分钟，弃上清。
一种包含如上述所述的抗CD33的纳米抗体的荧光标记流式应用。
其有益效果在于，本发明提供的抗CD33纳米抗体对CD33具有特异的识别和结合能力，能够在CD33免疫检测特别是流式应用中获得优异的检测效果。
附图说明
图1是本发明实施例1的抗CD33纳米抗体不同稀释度对CD33抗原的亲和力鉴定；
图2是本发明实施例2的抗CD33纳米抗体的表达鉴定图；
图3是本发明实施例3的抗CD33纳米抗体在流式中的应用；
图4是本发明实施例3的同型对照组流式图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员对本技术方案更加清楚，下面将结合附图1-4详细阐述本发明的技术方案：
一种抗CD33的纳米抗体，包含可变区；所述可变区为CDR1、CDR2、CDR3序列中的任意一个或多个；
(Ⅰ)：所述CDR1具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
所述CDR2具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；
所述CDR3具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
(Ⅱ)：可变区为(Ⅰ)中的任意一个或多个所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与CDR1、CDR2或CDR3中的任意一个或多个所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。
(Ⅲ)：可变区为与(Ⅰ)或者(Ⅱ)所述的氨基酸序列具有95％以上同一性的氨基酸序列。
其中，(1)可变区具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
（2）其中，可变区为如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，且与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；
可变区为与（1）或（2）所述的氨基酸序列具有95％以上同一性的氨基酸序列。
对本技术方案的进一步补充，所述取代、缺失或添加一个或多个氨基酸中的多个为2个、3个、4个或5个。
一种抗CD33的纳米抗体的核酸分子，所述核酸分子具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列具有至少95％序列一致性的核苷酸序列；
一种抗CD33的纳米抗体制备方法，包括以下步骤：抗体基因序列直接合成到真核表达载体pcDNA3.1中,转化至感受态细胞Top10中；将转化子接种到5毫升的肉汤培养基中37℃，200转/分过夜培养，然后按照1％接种到400毫升的肉汤培养基中，37℃，200转/分过夜培养；6000转/分,室温离心6分钟，弃上清。
一种包含如上述所述的抗CD33的纳米抗体的荧光标记流式应用。
实施例1 纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选
步骤（1）动物免疫：将CD33抗原与弗氏佐剂按照1：1比例混合后，按照0.5毫克/次的剂量对成年羊驼进行背部皮下多点注射的方式免疫，共免疫4次，免疫间隔为2周。
步骤（2）提取总RNA：所述步骤(1)取免疫动物外周血10毫升,通过密度梯度离心法分离外周血，取1毫升外周血加入500微升核酸提取液与100微升氯仿剧烈震荡15秒，室温静置5分钟；12000g，4℃离心10分钟，弃上清，加入500微升 75％的乙醇清洗沉淀；7500g，4℃离心分钟5分钟，弃上清；室温干燥分钟10分钟，加入适量的焦碳酸二乙酯水溶液，55℃孵育10分钟，琼脂糖凝胶法切胶回收后用无RNA酶水调整浓度到1微克/微升。
步骤（3）获取抗体可变区基因：使用逆转录试剂盒说明书以步骤（2）获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：
SEQ ID No.7：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
SEQ ID No.8：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
PCR反应条件及程序为：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，30循环；72℃7min使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700碱基左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5纳克/微升。
第二轮PCR的引物序列如下：
SEQ ID No.9：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
SEQ ID No.10：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
PCR反应条件及程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，15循坏；72℃7min使用琼脂糖凝胶切胶回收纳米抗体片段；
步骤（4）载体构建与克隆挑选： PstI、BstEII双酶切10微克 pHEN4载体，5微升 10倍浓度缓冲液，加水至50微升，37℃酶切1h；PstI、BstEII双酶切所述步骤(3)中抗体片段，5微升 10x缓冲液，加水至50微升，37℃酶切1h。琼脂糖凝胶回收酶切后的载体与抗体片段；取100纳克酶切回收的抗体片段，300纳克酶切回收的载体，2微升T4连接酶，2微升10浓度缓冲液，加水至20微升，16℃连接过夜。取10微升纯化后的连接产物，电转到含有50微升大肠杆菌TG1感受态细胞，复苏培养后稀释涂板，随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×[阳性率]PCR鉴定×10)。PCR引物序列如下：
SEQ ID No.11：TTATGCTTCCGGCTCGTATG
SEQ ID No.12：CCACAGACAGCCCTCATAG
步骤（5）纳米抗体的噬菌体筛选: 取适量步骤（4）中细菌文库接种到200毫升含有四环素和氨苄的培养基中，37℃250转/分培养至吸光度600＝0.5，加入1毫升辅助噬菌体M13KO7，37℃静置感染30分钟。加入终浓度为50微克/毫升的卡那霉素和200微摩尔的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷;硫代半乳糖苷;异丙基硫代-β-D-半乳糖苷;异丙基硫代半乳糖苷;半乳糖，30℃，250转/分培养过夜，通过聚乙二醇8000/氯化钠进行沉淀，磷酸盐缓冲液溶解得到噬菌体展示库。以2微克/毫升的浓度包被CD33抗原，3％牛血清白蛋白封闭，磷酸盐缓冲液洗涤。加入100微升噬菌体，室温孵育2h，用磷酸盐缓冲液洗涤10次，洗脱的噬菌体经过转染TG1后进入下一轮筛选。经过3轮筛选后，利用酶联免疫法验证阳性克隆子，并测序。
实施例2 抗CD33纳米抗体的表达与纯化
步骤（1）质粒制备：抗体基因序列直接合成到真核表达载体pcDNA3.1中,转化至感受态细胞Top10中。将转化子接种到5毫升的肉汤培养基中37℃，200转/分过夜培养，然后按照1％接种到400毫升的肉汤培养基中，37℃，200转/分过夜培养。6000转/分,室温离心6分钟，弃上清。然后用质粒大提试剂盒提取质粒；
步骤（2）质粒表达：293F细胞进行培养，细胞密度为2×106细胞/毫升活率>95%进行转染。以转染20毫升细胞为例，将20微克DNA加入到表达培养基中，使其终体积为1毫升，吹打混匀。将60 微升转染试剂 (1毫克/毫升)加入到940微升表达培养基中，吹打混匀。将混匀的转染试剂加入到混匀的DNA中，吹打混匀，室温静置15 min。将混匀液缓慢加入至18毫升293F细胞中，轻轻摇匀，置于37℃，8% CO2，120转/分摇床上培养5天。以转染当天记为第0天，于第1天、第3天加入补料，第6天，收集上清。
步骤（3）抗体纯化：将步骤（2）所获得的上清8000转/分离心15分钟，取上清加入活化后的镍柱中，4ºC反应2小时。用磷酸盐缓冲液满柱清洗杂蛋白。用磷酸缓冲液+500毫摩尔咪唑洗脱 3 遍，每次1-2-1 毫升，每次放置 10 min，收集洗脱液超滤获得纯化抗体。
实施例3 抗CD33纳米抗体的标记与流式检测
步骤（1）抗体标记：用 0.1摩尔 的 NaHCO3 溶液（pH～8.3）稀释抗体，使抗体终浓度为 2 毫克/毫升。
室温预热一管1微摩尔的荧光素，在管中加入 0.1 毫升的无水 二甲基亚砜，配制浓度为 10 毫摩尔的染料储存液。搅拌或涡旋混匀蛋白溶液，逐步滴加 15-25 微升的染料储存液（10 毫摩尔），使染料/蛋白的摩尔比在 9 : 1 至 15 : 1 的范围内。在室温下搅拌反应 1 h。用磷酸盐缓冲液（pH～7.4）平衡葡聚糖凝胶 G-25 透析柱（10毫米× 300毫米）。反应溶液加入柱子，并用1 ×磷酸盐缓冲液洗脱。得到荧光标记的抗CD33纳米抗体。
步骤（2）荧光标记抗CD33纳米抗体的流式检测：1.细胞重悬：细胞处理计数后，用细胞洗液（含2% 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）重悬细胞，使细胞浓度为1×107/mL；2.对照设置：空白对照、同型对照、待测样本每管取100微升上述重悬的细胞，使每管细胞数达到1×106/管；3.一抗孵育：空白对照管不加抗体，同型对照管和待测样本管分别加入5-20微升同型抗体（品牌深圳达科为生物工程有限公司货号366619）和靶标抗体，充分混匀，至4℃孵育30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应；4.细胞清洗：加入适量细胞洗液，1000转/分离心5min，弃上清，反复洗涤2次；5.细胞重悬：使用100微升细胞洗液重悬细胞；6.二抗孵育：同型对照管和待测管分别加入适量的荧光标记的二抗，充分混匀，至4℃避光孵育30min或冬季可至于室温避光孵育30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管；7.细胞清洗：加入适量细胞洗液，1000转/分离心5分钟，弃上清，反复洗涤2次；8.上机检测；如图3-4所示，与同型产品对照相比，产品特异性与信号强度均无区别。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种抗CD33的纳米抗体，其特征在于，包含CDR1、CDR2、CDR3；
所述CDR1的氨基酸序列为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
所述CDR2的氨基酸序列为如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；
所述CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种抗CD33的纳米抗体，其特征在于，可变区的氨基酸序列为如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
3.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的一种抗CD33的纳米抗体。
4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的一种抗CD33的纳米抗体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：抗体基因序列直接合成到真核表达载体pcDNA3.1中,转化至感受态细胞Top10中；将转化子接种到5毫升的肉汤培养基中37℃，200转/分过夜培养，然后按照1％接种到400毫升的肉汤培养基中，37℃，200转/分过夜培养；6000转/分,室温离心6分钟，弃上清。
6.一种包含如权利要求1所述的抗CD33的纳米抗体在制备荧光标记流式试剂中的应用。
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