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KR102063483B1 - Ａａｖ 캡시드 변이체를 이용한 고효율 유전자 전달을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Ａａｖ 캡시드 변이체를 이용한 고효율 유전자 전달을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR102063483B1
KR102063483B1 KR1020147032322A KR20147032322A KR102063483B1 KR 102063483 B1 KR102063483 B1 KR 102063483B1 KR 1020147032322 A KR1020147032322 A KR 1020147032322A KR 20147032322 A KR20147032322 A KR 20147032322A KR 102063483 B1 KR102063483 B1 KR 102063483B1
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무스타파 엔. 야지시오그루
페데리코 민고찌
사비에르 안구엘라
캐서린 에이. 하이
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더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아
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Abstract

본 발명은 AAV 매개된 유전자 치료를 위한 개선된 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

ＡＡＶ 캡시드 변이체를 이용한 고효율 유전자 전달을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHODS FOR HIGHLY EFFICIENT GENE TRANSFER USING AAV CAPSID VARIANTS}
본 출원은 2012년 4월 18일 및 2013년 3월 15일에 각각 출원된 미국 가특허출원 61/635,273호 및 61/794,995호의 우선권을 주장하며, 각각의 전체 내용은 전부 기재된 것처럼 본원에 참조로서 포함된다.
발명의 분야
본 출원은 유전자 치료 및 분자 생물학의 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 치료적으로 유익한 트랜스젠(trsngene)을 포함하는 AAV 벡터의 형질도입 효율을 개선시키는 단백질 캡시드 변이체를 포함하는 아데노-관련 바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명이 속하는 분야의 상태를 기재하기 위해 본 명세서를 통틀어 여러 공개문헌 및 특허 문서가 인용된다. 이러한 인용들 각각은 전체가 개시된 바와 같이 참조로서 본원에 포함된다.
아데노-관련 바이러스(AAV)는 소형(20 nm), 복제-결손, 비-외피보유 바이러스이다. 많은 별개의 AAV 혈청형이 인간 및 비인간 영장류에서 특성규명되었다. AAV 유전체는 두 개의 말단 모두에 145 bp 역 말단 반복체(ITR)를 지니는 단일-가닥 DNA로 구성된다. rep 및 cap의 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 존재한다. rep 생성물이 AAV 복제에 필수적인 한편, cap 유전자로부터 3개의 캡시드 단백질 (VP1, VP2, 및 VP3)이 발현된다. VP1, VP2 및 VP3은 1:1:10 비로 함께 모여 정20면체 캡시드를 형성한다 (Xie Q et al, 2002). 재조합 AAV (rAAV) 벡터 생성 동안, ITR 측면에 있는 발현 카세트는 AAV 캡시드로 패키징된다. AAV의 복제에 필요한 유전자는 카세트에 포함되지 않는다. 재조합 AAV는 가장 안전한 것으로 고려되며 생체내 유전자 전달을 위해 가장 광범하게 이용되는 바이러스 벡터들 중 하나이다. 벡터는 다수의 조직 유형으로부터의 세포를 감염시켜 강력하고 일관된 트랜스젠 발현을 제공할 수 있다. 이들은 또한 비-병원성이며 낮은 면역원성 프로파일을 지닌다(High KA, 2011).
유전자 치료 임상시험에 대한 즉각적인 목표들 중 하나는 벡터 용량을 최소화하면서 조직 형질도입을 최대화하도록 벡터를 최적화시키는 것이다. 세포로의 진입시에, AAV 캡시드 단백질은 프로테아솜 매개된 분해를 겪는다. AAV 캡시드의 표면-노출된 티로신 잔기의 포스포릴화는 유비퀴틴-프로테아솜 경로를 통한 바이러스의 분해를 초래하는 첫 번째 단계들 중 하나를 나타낸다 (Zhong L et al, 2007). 세포에서 대부분의 조절된 단백질분해는 이러한 경로를 통해 발생한다. 유비퀴틴은 모든 진핵생물 세포에서 발견될 수 있는 소형 단백질 (~8.5 kDa)이다. 유비퀴틴은 기질 단백질의 아미노산의 측쇄에 부착된다. 추가의 유비퀴틴 단백질을 초기에 부착된 유비퀴틴을 통해 기질에 부착시킨 후에, 폴리유비퀴틴 사슬이 형성되고 기질은 분해되는 것으로 표시된다 (Thrower JS et al 2000, Peng J et al 2003, Bedford L et al 2011). 표면-노출된 티로신 잔기의 돌연변이가 AAV2 벡터의 형질도입 효율에서의 증가를 초래한다고 알려져 있다(Zhong L et al, 2008). 보다 최근에, 여러 그룹에서 이러한 전략이 AAV 혈청형 6 및 8을 포함하는 여러 조직의 다른 AAV 혈청형에도 효과적임을 지적하였다.
명백하게, 임상적으로 중요한 트랜스젠을 지니는 AAV의 형질도입을 이를 필요로 하는 환자에서 개선시키는 조성물 및 방법에 대한 요구가 당 분야에 존재한다.
발명의 개요
본 발명에 따르면, 본원에 기재된 변형이 결여된 AAV 혈청형 (예컨대, AAV1, AAV2, AAV8, AAV-rh74)에 비해 증가된 형질도입 효율을 나타내는 신규한 AAV 변이체가 제공된다. 이러한 개선된 벡터는 간, 근육, 뇌, 및 망막을 포함하는 다양한 조직의 형질도입에 유용하다.
한 구체예에서, 변경된 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터가 제공되며, 변경된 캡시드 단백질은 리신 잔기 치환을 포함함으로써 캡시드의 유비퀸화를 감소시키고 표적 조직 및 세포로의 변이체 AAV의 형질도입 효율을 증가시킨다. 한 구체예에서, 상기 벡터는 숙주 세포에서 이종성 핵산 서열로부터 생성물의 발현을 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종성 핵산 (예컨대, AAV 역 말단 반복체 및 이종성 핵산 서열을 포함하는 미니겐(minigene))을 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, AAV 벡터는 본원에 개시된 표에서 제공된 대로 VP1에 하나 이상의 리신 치환을 포함한다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터는 AAV8 혈청형을 지니고 표 3에 제공된 변경을 함유한다.
바람직한 구체예에서, 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 본 발명의 AAV 벡터는 치료적 펩티드 또는 치료적 핵산의 발현에 유용하다. 그러한 펩티드는 비제한적으로 항-바이러스 RNAi 분자, 인자 VIII, 인자 IX 또는 이들의 기능성 단편을 포함한다. 추가의 발현 생성물은 예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 단일쇄 항체를 포함한다. 한 양태에서, 발현 생성물은 HCV 감염 및 복제를 억제하는데 유용한 RNAi이다. 또 다른 구체예에서, 발현 생성물은 관심 표적 세포를 하향 조절하는데 유용한 안티센스 핵산이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 생물학적으로 상용되는 담체 중에 본 발명의 변이체 AAV 벡터를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 본원에 기재된 벡터를 포함하는 세포 배양물이 본 발명에 또한 포함된다.
본 발명은 또한 세포를 본원에 기재된 AAV 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 AAV 벡터는 트랜스젠을 포함하며, 상기 벡터의 VP1 캡시드 서열 중에 리신 치환의 존재는 감소된 유비퀴틴화 및 증가된 형질도입 효율과 관련된 것인, 대상체에서 세포에 트랜스젠을 전달하는 방법을 포함한다.
마지막 양태에서, 본 발명은 세포를 감염시키는 데에는 비효율적이나 2개의 바이러스 변이체의 구조적 유사성으로 인해 유익한 트랜스젠을 지니는 바이러스 변이체의 항체 중화를 차단하기에는 효과적인 데코이 바이러스 변이체를 제공한다. 이러한 목적을 위한 예시적인 캡시드 변이체는, 예를 들어, K38R, K143R, K510R 및 K709R을 포함한다.
도 1: AAV1, AAV2 및 AAV8 표면 상의 리신: 본원에 사용된 AAV 혈청형의 PDB 번호는 다음과 같다: AAV1: 3NG9, AAV2: 1LP3, 및 AAV8: 2QA0. 화살표는 개개의 리신 잔기를 나타낸다. (a) AAV1 VP3의 표면 상에 11개의 리신이 존재한다. 잔기 색은 다음과 같다: K258 레드, K459 블루, K491 옐로우, K493 마젠타, K508 시안, K528 다크 세먼, K533 라이트 그린, K545 라이트 블루 (슬레이트), K567 다크 세먼, K666 라이트 시안, K707 그레이. (b) AAV2 VP3의 표면 상에 10개의 리신이 존재한다. 잔기 색은 다음과 같다: K258 레드, K490 옐로우, K507 시안, K527 다크 세먼, K532 라이트 그린, K544 라이트 블루 (슬레이트), K549 라이트 옐로우, K556 라이트 마젠타, K665 라이트 시안, K706 그레이. (c) AAV8 VP3의 표면 상에 8개의 리신이 존재한다. 잔기 색은 다음과 같다: K259 레드, K333 그린, K510 시안, K530 다크 세먼, K547 라이트 블루 (슬레이트), K569 다크 세먼, K668 라이트 시안, K709 그레이. AAV1의 K528 및 K567 및 AAV8의 K530 및 K569는 구조에서 나란히 존재하며 동일한 색으로 표시됨을 주목하라.
도 2: AAV8 캡시드의 몇몇 리신 잔기는 아르기닌으로 돌연변이되었다. 동물로부터의 혈액을 꼬리 정맥을 통해 바이러스를 주입한 지 8주 후에 수집하였다. hF.IX 수준을 ELISA에 의해 검출하였다. (a) 소프트웨어에 의해 높은 그리고 중간 신뢰 수준으로 유비퀴틴화될 것으로 예측되는 잔기를 아르기닌으로 돌연변이시켰다. 마우스당 2.5 x 1010 바이러스 입자를 꼬리 정맥을 통해 주입시켰다 (b,c). 소프트웨어에 의해 낮은 신뢰로 유비퀴틴화될 것으로 예측되는 잔기를 아르기닌으로 돌연변이시켰다. 마우스당 2.5 x 109 바이러스 입자를 꼬리 정맥을 통해 주입시켰다. (b) K569R 및 K668R 캡시드 돌연변이. (c) K38R, K143R, K259R, K510R, K547R 캡시드 돌연변이의 영향을 K530R 돌연변이의 영향과 비교한다.
도 3: K에서 R로의 캡시드 돌연변이들의 조합 (a) K137R, K33R 및 K530R 돌연변이의 조합은 여전히 야생형보다는 높으나 K530R과는 통계적으로 다르지 않다. (b) K709R 돌연변이는 AAV8 형질도입에 부정적인 영향을 미치고, K(137/333/530)R 돌연변이체로의 K709R 돌연변이의 첨가는 또한 바이러스의 형질도입을 감소시킨다. c) 다수의 리신의 아르기닌 돌연변이들의 조합은 형질도입률을 증가시키지 않는다. (d) 페닐알라닌 잔기로의 4개 또는 6개의 티로신과 함께 아르기닌 잔기로의 3개의 리신의 조합은 형질도입률을 감소시킨다.
도 4: AAV1 형질도입 (a) 3개의 상이한 MOI 5K, 50K 및 500K에서 AAV-1 리신 돌연변이체로 형질도입된 HHL5-B7 간세포의 CTL 치사. 펩티드 (AAV1의 경우 IPQYGYLTL; AAV2의 경우 VPQYGYLTL)를 양성 대조군으로서 이용하였다. LDH 방출은 세포 치사와 상관관계가 있다. (b) 50K 및 500K MOI에서 상이한 작제물들 간에 GFP 양성 세포의 전체 수 및 GFP 발현을 비교하였다.
도 5: AAV2 형질도입: a) HHL5 세포주 형질도입률에 관해 AAV2 K137R, K527R 또는 K532R 돌연변이체를 WT AAV2와 비교하였다. 세포를 10K, 50K, 100K 및 500K MOI에서 트랜스펙션시키고, 24시간 후에 GFP 발현에 대해 조사하였다. b) 시험된 변이체의 LDL 방출에 의해 측정된 바와 같은 세포독성을 나타내는 그래프.
도 6: 표적 간세포가 증가하는 농도의 AAV-2 벡터로 형질도입된 후 HLA-매칭된 효과기 세포와 인큐베이션되는 CTL 검정. AAV 벡터는 지시된 대로 야생형 AAV-2 캡시드 또는 단일 리신 돌연변이를 엔코딩하였다. 효과기는 AAV-2 MHC 클래스 I 에피토프 VPQYGYLTL에 대해 시험관내 증식된 PBMC로부터 유래되었고 효과기-대-표적 비는 10:1이었다. 결과는 야생형 벡터에 관한 CTL 활성의 백분율로서 표시된다 (백그라운드 공제 후 최대 세포독성 대조군으로서 10% SDS로 처리된 세포에 대한 % 세포독성).
도 7: RH74 데이터: 인간 F.IX에 특이적인 ELISA에 의해 측정된 혈장 중 인간 F.IX 트랜스젠 발현 수준. a) TMR의 정의=K(137/333/530)R, HMF의 정의= Y(253/275/447/703/707/733)F. b) HMR의 정의: K(137/259/333/530/552/569)R, 195/202의 정의: G195A+ L199V+ S201P+ G202N. HMR+195/202, HMR+195/202+K(38)R, HMR+195/202+K(51)R, HMR+195/202+K(61)R, 및 HMR+195/202+K(77)R은 마우스에게 주입시 더 높은 hFIX 생성을 발생시킨 한편, HMR+195/202+K(122/123)R 또는 HMR+195/202+K(142/413)R 주입은 어떠한 검출가능한 hFIX도 전혀 생성하지 않았다. c): RHM13_1 돌연변이체는 Rh74 WT에 비해 유사한 hFIX 수준을 발생시킨 반면 RHM17_1-처리된 마우스로부터 유래된 hFIX 수준은 간신히 상기 백그라운드 수준 위였다. d) RHM14_2 돌연변이체는 Rh74 WT에 비해 유사한 hFIX 수준을 발생시켰고; RHM15_1 성능은 AAV8 및 AAVrh74 WT의 성능의 중간이었다.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따르면, 본 발명자들은 AAV 캡시드 상의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로 돌연변이시키는 것이 AAV 형질도입 효율을 증가시킴을 발견하였다. 본 발명자들의 초기 실험은 유비퀴틴화의 표적인 것으로 예측되는 리신 잔기의 단일 치환이 변형되지 않은 AAV 벡터를 수용한 동물에 비해 마우스에서 인간 인자 IX (FIX) 트랜스젠의 더 높은 수준의 발현을 발생시켰음을 나타내었다. 본원에 기재된 AAV 리신 돌연변이체를 이용하여 야생형 AAV 캡시드에 비해 높은 효율로 간, CNS, 근육, 및 다른 기관을 표적화하는 벡터를 생성하는 것을 촉진할 수 있었다. 따라서, 이러한 발견은 혈우병 A, B, 헌팅톤병, 및 관심 표적 조직으로의 요망되는 트랜스젠의 증가된 형질도입 수준을 요구하는 사실상 임의의 다른 질환을 치료하기 위한 치료제를 개발하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 이해를 돕기 위해 다음 정의를 제공한다.
I. 정의:
"유전자 치료"는 질환, 일반적으로 결손 돌연변이체 대립유전자가 기능적인 것으로 대체되거나 보충되는 유전병을 치료하기 위한 개체의 세포 및/또는 조직으로의 유전자의 삽입이다.
파보바이러스 패밀리로부터의 "아데노-관련 바이러스"는 단일 가닥 DNA의 유전체를 지니는 소형 바이러스이다. 이러한 바이러스는 염색체 19 상의 특수 부위에 유전 물질을 삽입할 수 있으며 선호되는데, 그 이유는 이들이 인간에서 병원성 질병과 관련이 없기 때문이다.
"치료적" 펩티드 또는 단백질은 세포 또는 피검체에서의 단백질의 부재 또는 결함으로부터 야기된 징후를 경감시키거나 감소시킬 수 있는 펩티드 또는 단백질이다. 대안적으로, "치료적" 펩티드 또는 단백질은 피검체에 달리 이익을 주는, 예컨대 항암 효과를 주는 것이다. 치료적 펩티드 및 단백질은 비제한적으로 CFTR (낭성 섬유증 막관통 조절 단백질), 디스트로핀(dystrophin)(디스트로핀 미니-유전자의 단백질 생성물 포함, 예컨대 문헌[Vincent et al., (1993) Nature Genetics 5:130] 참조), 유트로핀(utrophin)(Tinsley et al., (1996) Nature 384:349), 응고 인자(인자 XIII, 인자 IX, 인자 X 등), 모노클로날 항체 (Lewis et al., 2002), 에리트로포이에틴, LDL 수용체, 지단백질 리파제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린(spectrin), α-항트립신, 아데노신 데아미나제, 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, β-글루코세레브로시다제, 스핑고마이엘리나제, 리소소말 헥소사미니다제, 분지쇄 케토산 데하이드로게나제, 호르몬, 성장 인자(예컨대, 인슐린-유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래 성장 인자, 상피 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경영양 인자-3 및 -4, 뇌-유래 신경영양 인자, 신경아교 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 α 및 β 등), 사이토카인 (예컨대, α-인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터루킨 12, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, 림포톡신), 자살 유전자 생성물(예컨대, 단순포진 바이러스 티미딘 키나제, 사이토신 데아미나제, 디프테리아 독소, 사이토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나제, 및 종양 괴사 인자), 암 치료에 사용된 약물에 내성을 부여하는 단백질, 종양 억제 유전자 생성물(예컨대, p53, Rb, Wt-1, NF1, VHL, APC 등), 및 이를 필요로 하는 피검체에서 치료적 효과를 지니는 어떠한 다른 펩티드 또는 단백질을 포함한다.
추가의 예시적인 치료적 펩티드 또는 단백질은 비제한적으로 낭성 섬유증(cystic fibrosis)(및 폐의 기타 질환), 혈우병(hemophilia) A, 혈우병 B, 지중해빈혈(thalassemia), 빈혈(anemia) 및 기타 혈액 질병, AIDS, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 간질(epilepsy), 및 기타 신경학적 질병, 암, 당뇨병(diabetes mellitus), 근육퇴행위축(muscular dystrophies)(예컨대, 뒤시엔느(Duchenne), 베커(Becker)), 고쉐병(Gaucher's disease), 헐러병(Hurler's disease), 아데노신 데아미나제 결핍(adenosine deaminase 결핍), 글리코겐 저장병(glycogen storage diseases) 및 기타 대사적 결함, 망막 퇴행성 질병(retinal degenerative diseases)(및 눈의 다른 질환), 및 고형 기관(예컨대, 뇌, 간, 신장, 심장)의 질환을 포함하는 질환 병태의 치료에 이용될 수 있는 것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터들" 또는 "프로모터"는 재조합 생성물을 엔코딩하는 DNA 서열에 인접하게 위치한 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 프로모터는 바람직하게는 인접한 DNA 서열에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않는 경우에 발현되는 재조합 생성물의 양에 비해 DNA 서열로부터 발현되는 재조합 생성물의 양을 증가시킨다. 한 유기체로부터의 프로모터는 또 다른 유기체에서 비롯된 DNA 서열로부터의 재조합 생성물 발현을 향상시키는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 척추동물 프로모터는 척추동물에서 해파리 GFP의 발현에 이용될 수 있다. 또한, 한 프로모터 엘리먼트는 나란히 부착된 다수의 DNA 서열에 대해 발현되는 재조합 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 따라서, 한 프로모터 엘리먼트는 하나 이상의 재조합 생성물의 발현을 향상시킬 수 있다. 다수의 프로모터 엘리먼트는 당업자에게 잘 알려져 있다.
한 구체예에서, 고수준의 항시적 발현이 요망될 것이다. 그러한 프로모터의 예는 비제한적으로 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터/인핸서, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 조기(immediate early) 프로모터/인핸서 (예컨대, Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985) 참조), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, 세포질 β-액틴 프로모터 및 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 유도성 프로모터가 요망될 수 있다. 유도성 프로모터는 시스 또는 트랜스의 외생적으로 공급된 화합물에 의해 조절되는 것들이고, 비제한적으로 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터; 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터; T7 폴리머라제 프로모터 시스템(WO 98/10088); 테트라사이클린-억제성 시스템(Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)); 테트라사이클린-유도성 시스템(Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995); 또한 Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998) 참조); RU486-유도성 시스템 (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) and Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]; 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997); Rivera et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996))을 포함한다. 본 상황에서 유용할 수 있는 다른 유형의 유도성 프로모터는 예컨대 온도, 급성기, 또는 세포를 단독으로 복제함에 있어서 특수한 생리학적 상태에 의해 조절되는 것들이다.
또 다른 구체예에서, 관심 트랜스젠 또는 핵산 서열에 대한 천연 프로모터를 이용할 것이다. 트랜스젠 또는 핵산 서열의 발현이 천연 발현을 흉내내야 할 것이 요망될 때 천연 프로모터가 바람직할 수 있다. 천연 프로모터는 트랜스젠 또는 기타 핵산 서열의 발현이 일시적으로 또는 점진적으로(developmentally), 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특수한 전사적 자극에 반응하여 조절되어야 할 때 이용될 수 있다. 추가의 구체예에서, 인핸서 엘리먼트, 폴리아데닐화 부위 또는 Kozak 컨센서스 서열과 같은 다른 천연 발현 조절 엘리먼트를 또한 이용하여 천연 발현을 흉내낼 수 있다.
한 구체예에서, 재조합 바이러스 유전체는 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스젠을 포함한다. 예를 들어, 골격근에서의 발현이 요망되는 경우, 근육에서 활성인 프로모터를 이용할 수 있다. 여기에는 골격의 α-액틴을 엔코딩하는 유전자로부터의 프로모터, 마이오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제 뿐만 아니라 천연 발생 프로모터보다 높은 활성을 갖는 합성 근육 프로모터가 포함된다. 문헌[Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)]을 참조하라. 조직-특이적인 프로모터의 예는 특히 간 알부민[Miyatake et al. J. Virol., 71:5124-32 (1997)]; B형 간염 바이러스 코어 프로모터[Sandig et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996)]; 알파-페토단백질 (AFP)[Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)], 뼈(오스테오칼신, [Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)]; 골 시알로단백질[Chen et al., J. Bone Miner. Res. 11:654-64 (1996)]), 림프구(CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998); 면역글로불린 중쇄; T 세포 수용체 a 사슬), 신경세포(뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, Andersen et al. Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993); 신경필라멘트 경쇄 유전자, Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991); 뉴런-특이적 vgf 유전자, Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)]에 대해 알려져 있다.
본원에서 사용되는 용어 "인핸서들" 또는 "인핸서"는 재조합 생성물을 엔코딩하는 DNA 서열에 인접하게 위치한 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 인핸서 엘리먼트는 통상적으로 프로모터 엘리먼트의 업스트림에 위치하거나 DNA 코딩 서열 (예컨대, 재조합 생성물 또는 생성물들로 전사되거나 번역되는 DNA 서열)의 다운스트림 또는 DNA 코딩 서열 내에 위치할 수 있다. 따라서, 인핸서 엘리먼트는 재조합 생성물을 엔코딩하는 DNA 서열의 100개의 염기쌍, 200개의 염기쌍, 또는 300개 이상의 염기쌍 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 수 있다. 인핸서 엘리먼트는 DNA 서열로부터 발현되는 재조합 생성물의 양을 프로모터 엘리먼트에 의해 제공된 증가된 발현 이상으로 증가시킬 수 있다. 다수의 인핸서 엘리먼트는 당업자에게 용이하게 이용가능하다.
본원에서 사용되는 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단일 또는 이중 가닥의 임의의 DNA 또는 RNA 분자를 지칭하고, 단일 가닥인 경우, 이의 상보적 서열의 분자는 선형이거나 원형의 형태이다. 핵산 분자를 논의함에 있어서, 특정 핵산 분자의 서열 또는 구조는 서열을 제공하는 보통 관례에 따라 본원에서 5'에서 3' 방향으로 기재될 수 있다. 본 발명의 핵산에 관해, 용어 "단리된 핵산"이 때로 사용된다. DNA에 적용되는 경우, 이러한 용어는 이것이 비롯된 유기체의 천연 발생 유전체에서 바로 인접한 서열로부터 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나 원핵 또는 진핵 세포 또는 숙주 유기체의 유전체 DNA에 통합된 DNA 분자를 포함할 수 있다.
"벡터"는 또 다른 유전 서열 또는 엘리먼트 (DNA 또는 RNA)가 부착하여 부착된 서열 또는 엘리먼트의 복제를 일으킬 수 있는 플라스미드, 코스미드, 바크미드(bacmid), 파지 또는 바이러스와 같은 레플리콘이다.
"발현 오페론"은 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(예컨대, ATG 또는 AUG 코돈), 폴리아데닐화 신호, 종료자 등과 같은 전사적 및 번역적 조절 서열을 소유할 수 있고, 숙주 세포 또는 유기체에서 폴리펩티드 코딩 서열의 발현을 촉진하는 핵산 세그먼트를 지칭한다.
용어 "형질전환", "트랜스펙트", "형질도입"은 핵산이 세포 또는 숙주 유기체로 도입되는 어떠한 방법 또는 수단을 지칭할 것이고 동일한 의미를 전달하기 위해 상호교환적으로 이용될 수 있다. 이러한 방법은 비제한적으로 트랜스펙션, 전기천공, 미세주사, 감염, PEG-융합 등을 포함한다.
도입된 핵산은 수령 세포 또는 유기체의 핵산으로 통합 (공유적으로 연결)되거나 통합되지 않을 수 있다. 박테리아, 효모, 식물 및 포유동물 세포에서, 예를 들어, 도입된 핵산은 에피솜의 엘리먼트 또는 플라스미드와 같은 독립적인 레플리콘으로서 유지될 수 있다. 대안적으로, 도입된 핵산은 수령 세포 또는 유기체의 핵산으로 통합되어질 수 있고 상기 세포 또는 유기체에서 안정하게 유지될 수 있으며, 수령 세포 또는 유기체의 자손 세포 또는 유기체로 추가로 넘어가거나 유전될 수 있다. 마지막으로, 도입된 핵산은 단지 일시적으로 수령 세포 또는 숙주 유기체에 존재할 수 있다.
용어 "선택가능한 마커 유전자"는 발현되었을 때 형질전환된 세포 또는 식물 상에서 항생제 내성과 같은 선택가능한 표현형을 부여하는 유전자를 지칭한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열이 코딩 서열에 대한 적절한 위치에서 DNA 분자에 배치되어 코딩 서열의 발현을 실행시키는 것을 의미한다. 이러한 동일한 정의는 때로 발현 벡터에서 전사 유닛 및 다른 전사 조절 엘리먼트(예컨대, 인핸서)의 정렬에 적용된다.
본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 본 발명의 서열, 프라이머 및 프로브를 지칭하며, 2개 이상, 바람직하게는 3개 초과의 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자로서 정의된다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 크기는 다양한 인자 및 올리고뉴클레오티드의 특정 적용 및 용도에 좌우될 것이다.
구 "특이적으로 하이브리드화된다"는 당 분야에서 일반적으로 이용되는 소정의 조건하에서 그러한 하이브리드화를 가능케 하는 충분히 상보적인 (때로, "실질적으로 상보적인"이라고 지칭됨) 서열의 2개의 단일-가닥 핵산 분자들 간의 결합(association)을 지칭한다. 특히, 상기 용어는 올리고뉴클레오티드와 본 발명의 단일-가닥 DNA 또는 RNA 분자 내에 함유된 실질적으로 상보적인 서열의 하이브리드화를 지칭하고, 올리고뉴클레오티드와 비상보적인 서열의 단일-가닥 핵산의 하이브리드화는 실제로 배제된다.
본원에서 사용되는 용어 "프라이머"는 생물학적 시스템으로부터 유래되거나 제한 효소 분해에 의해 생성되거나 합성에 의해 생성된, 적당한 환경에 놓일 경우, 주형-의존성 핵산 합성의 개시제로서 기능적으로 작용할 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 적절한 핵산 주형, 핵산의 적합한 뉴클레오시드 트리포스페이트 전구체, 폴리머라제 효소, 적합한 보조인자 및 적합한 온도 및 pH와 같은 조건이 제공되는 경우, 프라이머는 폴리머라제의 작용에 의한 뉴클레오티드의 첨가 또는 프라이머 연장 생성물을 산출하는 유사한 활성에 의해 이의 3' 말단에서 연장될 수 있다. 프라이머는 특정 조건 및 적용 요건에 따라 길이가 달라질 수 있다. 예를 들어, 진단적 적용에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로 15-25개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이이다. 프라이머는 요망되는 연장 생성물의 합성을 프라이밍하는 요망되는 주형에 충분한 상동성을 지녀야 하고, 즉, 폴리머라제 또는 유사한 효소에 의한 합성의 개시에 사용하기에 적합한 병렬로 프라이머의 3' 하이드록실 부분을 제공하는데 충분한 방식으로 요망되는 주형 가닥과 어닐링될 수 있어야 한다. 프라이머 서열이 요망되는 주형의 정확한 보체일 필요는 없다. 예를 들어, 비상보적인 뉴클레오티드 서열은 다른 상보적인 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있다. 대안적으로, 비상보적인 염기는, 프라이머 서열이 요망되는 주형 가닥의 서열과 충분한 상보성을 지녀서 연장 생성물의 합성을 위한 주형 프라이머 복합체를 기능적으로 제공한다면, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 내에 산재될 수 있다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 미국특허 4,683,195호, 4,800,195호, 및 4,965,188호에 기재되어 있고, 이들의 전문은 본원에 참조로서 포함된다.
용어 "단리된"은 자연적으로 관련될 다른 화합물로부터 충분히 분리된 화합물 또는 복합체를 지칭할 수 있다. "단리된"은 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 혼합물, 또는 예를 들어 불완전한 정제, 또는 안정화제의 첨가로 인해 존재할 수 있고 기본적 활성 또는 뒤이은 검정을 방해하지 않는 불순물의 존재를 배제하는 것을 의미하지는 않는다.
용어 "면역 반응"은 척추동물 피검체의 면역 시스템에 의한 항원 또는 항원성 결정인자에 대한 임의의 반응을 나타내기 위한 것이다. 예시적인 면역 반응은 하기 본원에 정의된 바와 같은 체액 면역 반응 (예컨대, 항원-특이적 항체의 생성) 및 세포-매개된 면역 반응 (예컨대, 림프구 증식)을 포함한다.
II . 본 발명의 변이체 아데노관련 바이러스 벡터의 사용 방법 및 투여 방법
본 발명의 방법은 분열 및 비분열 세포 둘 모두를 포함하는 넓은 범위의 숙주 세포로 이종성 핵산 서열을 전달하는 수단을 제공한다. 본 발명의 벡터 및 그 밖의 시약, 방법 및 약학적 제형은, 치료 또는 기타 방법처럼, 이를 필요로 하는 피검체에게 단백질 또는 펩티드를 투여하는 방법에 추가로 유용하다. 이러한 방식으로, 이와 같이 단백질 또는 펩티드가 피검체에서 생체내 생성될 수 있다. 피검체는 단백질 또는 펩티드의 결핍을 갖거나, 이러한 피검체에서 단백질 또는 펩티드의 생성은 일부 치료 효과를 제공할 수 있으므로, 피검체는, 치료 또는 기타 방법처럼 그리고 하기에 추가로 설명되는 대로, 단백질 또는 펩티드를 필요로 할 수 있다.
일반적으로, 본 발명은 유전자 발현과 관련된 어떠한 질병과 관련된 증상을 치료하거나 경감시키는 생물학적 효과를 갖는 임의의 외래 핵산을 전달하는데 이용될 수 있다. 예시적인 질병 상태에는, 비제한적으로 낭성 섬유증 (및 폐의 기타 질환), 혈우병 A, 혈우병 B, 지중해빈혈, 빈혈 및 기타 혈액 응고 질병, AIDS, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근육위축가쪽경화증, 간질, 및 기타 신경학적 질병, 암, 당뇨병, 근육퇴행위축 (예컨대, 뒤시엔느, 베커), 고쉐병, 헐러병, 아데노신 데아미나제 결핍, 글리코겐 저장병 및 기타 대사성 결함, 망막 퇴행성 질병 (및 눈의 기타 질환), 고형 기관(예컨대, 뇌, 간, 신장, 심장)의 질환 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 암, 감염성 질환, 및 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염과 관련된 증상을 치료하거나 경감시키는 유익한 생물학적 효과를 제공하는 것으로 알려진 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 엔코딩하는 핵산을 전달하는데 이용될 수 있다. 그 밖의 서열은 예를 들어 질병의 경과를 조절할 수 있는 인터페론-알파와 같은 사이토카인을 엔코딩할 수 있다.
유전자 전달은 질병 상태를 이해하고 이에 대한 요법을 제공하는데 실제로 잠재적인 용도를 지닌다. 결손 유전자가 알려져 있고 클로닝된 다수의 유전병이 존재한다. 일부 경우에, 이러한 클로닝된 유전자의 기능이 공지되어 있다. 일반적으로, 상기 질환 상태는 2개의 부류로 나뉜다: 역행하는 방식으로 일반적으로 유전된, 일반적으로 효소의 결핍 상태, 및 우성 방식으로 유전된, 조절 또는 구조적 단백질을 적어도 때로 수반하는 불균형 상태, 결핍 상태 질병의 경우, 유전자 전달을 이용하여 대체 요법을 위해 정상 유전자를 영향받은 조직에 가져올 수 있었을 뿐만 아니라, 안티센스 돌연변이를 이용하여 질병에 대한 동물 모델을 생성할 수 있었다. 불균형 상태 질병의 경우, 유전자 전달을 이용하여 모델 시스템에서 질병 상태를 발생시킬 수 있었고, 이는 이어서 질병 상태를 중화시키는 노력에 이용될 수 있었다. 따라서 본 발명의 방법은 유전병의 치료를 가능하게 한다. 본원에서 이용된 대로, 질병 상태는 질병을 야기하거나 이를 더욱 심각하게 만드는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 전체적으로 개선시킴에 의해 치료된다. 돌연변이를 야기하거나 결함을 수정하는 핵산 서열의 부위-특이적 통합의 이용도 가능하다.
마지막으로, 본 발명은 진단적 및 스크리닝 방법에서의 추가 용도가 발견되며, 이에 의해 관심 유전자는 세포 배양 시스템에서, 또는 대안적으로, 트랜스제닉 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정하게 발현된다.
III . 피검체 , 약학적 제형, 백신, 및 투여 방식
본 발명은 수의적 및 의학적 적용 둘 모두에 이용된다. 적합한 피검체는 조류 및 포유동물 둘 모두를 포함하고, 포유동물이 바람직하다. 본원에서 사용되는 용어 "조류"는 비제한적으로 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "포유동물"은 비제한적으로 인간, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개, 토끼 등을 포함한다. 인간 피검체가 가장 바람직하다. 인간 피검체는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 피검체를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 담체 또는 기타 의약 작용제, 약학적 작용제, 담체, 애쥬번트, 희석제 등에 본 발명의 바이러스 입자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 주입을 위해, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 다른 투여 방법의 경우, 담체는 고체 또는 액체일 수 있고, 예컨대 살균된 발열원-비함유 수 또는 살균된 발열원-비함유 포스페이트 완충된 염수 용액이다. 흡입 투여를 위해, 담체는 호흡할 수 있고, 바람직하게는 고체 또는 액체 미립자 형태일 것이다. 주입 매질로서, 안정화제, 염 또는 염수, 및/또는 완충제와 같은 주입 용액에 일반적인 첨가제를 함유하는 물을 사용하는 것이 바람직하다.
다른 구체예에서, 본 발명은 약학적으로-허용되는 담체 또는 다른 의약 작용제, 약학적 작용제, 담체, 애쥬번트, 희석제 등 중에 AAV 프로바이러스가 유전체로 통합된 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
"약학적으로 허용되는"이란 생물학적으로 또는 달리 불리하지 않은 물질을 의미하고, 예컨대 상기 물질은 어떠한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않으며 피검체에 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 약학적 조성물은, 예를 들어, 생체외에서 세포의 트랜스펙션에서 또는 피검체로의 바이러스 입자 또는 세포의 직접 투여에 이용될 수 있다.
본 발명은 핵산을 세포에 전달하는 방법을 추가로 제공한다. 시험관내 방법에 있어서, 바이러스는 당 분야에 공지된 대로 표준 바이러스 형질도입 방법에 의해 세포에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 입자는 특정 표적 세포에 적절한 표준 형질도입 방법에 따라 적절한 많은 감염에서 세포에 첨가된다. 투여되는 바이러스의 역가는 표적 세포 유형 및 특정의 바이러스 벡터에 따라 다양할 수 있고, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 파보바이러스 벡터의 투여는 당 분야에 공지된 어떠한 다른 수단에 의해 수행될 수 있다.
재조합 바이러스 벡터는 바람직하게는 생물학적으로-효과적인 양으로 세포에 투여된다. 바이러스 벡터의 "생물학적으로-효과적인" 양은 세포에서 감염 (또는 형질도입) 및 이종성 핵산 서열의 발현을 발생시키기에 충분한 양이다. 바이러스가 생체내 세포에 투여되는 경우 (예컨대, 바이러스는 하기 기재된 대로 피검체에 투여된다), 바이러스 벡터의 "생물학적으로-효과적인" 양은 표적 세포에서 형질도입 및 이종성 핵산 서열의 발현을 발생시키기에 충분한 양이다.
본 발명의 바이러스 벡터가 투여되는 세포는 임의의 유형일 수 있고, 비제한적으로 신경 세포 (말초 및 중추 신경계의 세포, 특히 뇌세포 포함), 폐 세포, 망막 세포, 상피 세포(예컨대, 창자 및 호흡기 상피 세포), 근세포, 췌장 세포 (섬 세포 포함), 간 세포, 심근 세포, 골 세포 (예컨대, 골수 줄기 세포), 조혈 줄기 세포, 비장 세포, 각질형성세포, 섬유모세포, 내피 세포, 전립선 세포, 종자 세포 등을 포함한다. 대안적으로. 세포는 임의의 전구 세포일 수 있다. 추가의 대안으로서, 세포는 줄기 세포일 수 있다 (예컨대, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포). 더욱이, 세포는 상기 지시된 대로, 임의의 종 기원으로부터 비롯될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 세포는 피검체로부터 제거되고, 파보바이러스 벡터가 그 안에 도입되며, 그 후 세포가 피검체로 다시 되돌려진다. 생체외 치료를 위해 세포를 피검체로부터 제거한 후 피검체로 재도입시키는 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 대안적으로, rAAV 벡터는 또 다른 피검체로부터의 세포, 배양 세포 또는 어떠한 다른 적합한 공급원으로부터의 세포로 도입되고, 세포는 이를 필요로 하는 피검체에게 투여된다.
생체외 유전자 치료에 적합한 세포는 비제한적으로 간 세포, 신경 세포 (말초 및 중추 신경계의 세포, 특히 뇌세포 포함), 췌장 세포, 비장 세포, 섬유모세포(예컨대, 피부 섬유모세포), 각질형성세포, 내피 세포, 상피 세포, 근모세포, 조혈 세포, 골수 기질 세포, 전구 세포, 및 줄기 세포를 포함한다.
피검체에 투여되는 세포의 투여량은 피검체의 연령, 상태 및 종, 세포의 유형, 세포에 의해 발현되는 핵산, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 적어도 약 102 내지 약 108, 바람직하게는 약 103 내지 약 106 세포가 용량당 투여될 것이다. 바람직하게는, 세포는 "치료적 유효량"으로 투여될 것이다.
본원에서 사용되는 "치료적으로-효과적인" 양은 질병 상태와 관련된 증상들 중 적어도 하나를 경감시키기에 (예컨대, 완화, 경감, 감소) 충분한 양이다. 대안적으로 언급하자면, "치료적으로-효과적인" 양은 피검체의 상태에서 일부 개선을 제공하기에 충분한 양이다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명의 바이러스 입자로 피검체를 생체내 치료하는 방법이다. 본 발명의 파보바이러스 입자를 필요로 하는 인간 피검체 또는 동물로의 이의 투여는 바이러스 벡터를 투여하기 위해 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해서 이루어질 수 있다.
예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 국소, 경피, 흡입, 비경구(예컨대, 정맥내, 피하, 피내, 근내, 및 관절내) 투여 등 뿐만 아니라 직접 조직 또는 기관 주입, 대안적으로, 경막내, 직접 근내, 심실내, 정맥내, 복강내, 비내 또는 안구내 주입을 포함한다. 액체 용액 또는 현탁액, 주입 전에 액체에서 용해 또는 현탁되기에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼과 같은 통상적인 형태의 주입제가 제조될 수 있다. 대안적으로, 당업자는, 예를 들어, 데포 또는 지속-방출 제형으로, 전신보다는 국소 방식으로 바이러스를 투여할 수 있다.
본 발명의 구체적으로 수행된 구체예에서, 관심 뉴클레오티드 서열은 피검체의 간에 전달된다. 간으로의 투여는 비제한적으로 정맥내 투여, 문맥내 투여, 담관내(intrabilary) 투여, 동맥내 투여, 및 간 실질로의 직접 주입을 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
바람직하게는, 세포(예컨대, 간 세포)는 펩티드 또는 단백질을 엔코딩하는 재조합 파보바이러스 벡터에 의해 감염되고, 세포는 엔코딩된 펩티드 또는 단백질을 발현시켜 이를 순환계에 치료적 유효량 (상기 정의된 바와 같음)으로 분비시킨다. 대안적으로, 벡터는, 비제한적으로 뇌, 췌장, 비장 또는 근육을 포함하는 또 다른 세포 또는 조직으로 전달되어 이에 의해 발현된다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 파보바이러스 입자는 근내로, 더욱 바람직하게는 근내 주입에 의해서나 국소 투여 (상기 정의된 바와 같음)에 의해 투여된다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 파보바이러스 입자는 폐로 투여된다.
본원에 기재된 파보바이러스 벡터는 어떠한 적합한 수단에 의해 피검체의 폐에 투여될 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 파보바이러스 벡터로 구성된 호흡가능한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여함에 의해 투여되고, 피검체를 이를 흡입한다. 호흡가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. 본 발명의 파보바이러스 벡터를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 당업자에게 공지된 바와 같은 압력-구동 에어로졸 분무기 또는 초음파 분무기를 이용하는 것과 같은, 임의의 적합한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예컨대 미국특허 4,501,729호를 참조하라. 본 발명의 바이러스 벡터를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 마찬가지로 약학 분야에 공지된 기법에 의해 임의의 고체 미립자 의약 에어로졸 발생기를 지니도록 생성될 수 있다.
본 발명의 파보바이러스 입자의 투여량은 투여 방식, 치료하려는 질환 또는 병태, 개개 피검체의 상태, 특정 바이러스 벡터, 및 전달되는 유전자에 의존적일 것이고, 통상적인 방식으로 결정될 수 있다. 치료적 효과를 달성하기 위한 예시적인 용량은 적어도 약 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016개의 형질도입 유닛 또는 그 초과, 바람직하게는 약 108 내지 1013개의 형질도입 유닛, 또한 더욱 바람직하게는 1012개의 형질도입 유닛의 바이러스 역가이다.
요약해 보면, 본 발명의 파보바이러스 벡터, 시약, 및 방법을 이용하여 분열 또는 비분열 세포로 핵산을 유도하고, 그 안에서 이종성 핵산을 안정하게 발현시킬 수 있다. 이러한 벡터 시스템을 이용하여, 이제 세포 생리학에 영향을 주는 단백질을 엔코딩하는 유전자를 시험관내 또는 생체내에서 세포로 도입시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 벡터는 질병 상태 또는 세포 생리학의 실험적 변형을 위해 유전자 치료에서 유용할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위해 제공된 것이다. 이는 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 I
리신에서 아르기닌으로의 돌연변이는 AAV 형질도입률 및 MHC 전달에 영향을 준다
AAV1 및 AAV8 벡터에서 표적화된 리신 잔기의 확인
본 발명자들은 AAV1, AAV2, AAV8 및 Rh74 캡시드 단백질 상에서 가능한 유비퀴틴화 부위를 예측하기 위해 UbPred 소프트웨어를 이용하였다 (Radivojac P et al, 2010). UbPred 소프트웨어는 http://www.ubpred.org/index.html에서 온라인으로 이용가능하다. 분석 결과는 지시된 AAV 혈청형 캡시드 서열 내에서 유비퀴틴화에 중요한 리신 잔기의 예측이다. 도 1 및 표 1을 참조하라. 이들은 다음과 같다:
AAV1 캡시드 단백질 VP1 서열:
Figure 112014111119610-pct00001
Figure 112014111119610-pct00002
Figure 112014111119610-pct00003
AAV -1에서 바람직한 돌연변이체
Figure 112014111119610-pct00004
AAV8 캡시드 단백질 VP1 서열:
Figure 112014111119610-pct00005
Figure 112014111119610-pct00006
Figure 112014111119610-pct00007
여기에 첨부된 표 3은 본 발명의 AAV8을 포함하는 상이한 캡시드 돌연변이체를 이용하여 수득된 벡터의 수율을 제공한다. 표는 또한 돌연변이가 동일한 혈청형의 야생형 벡터에 비해 증가하거나, 감소되거나 필적하는 형질도입 효율을 발생시켰는지를 나타낸다.
AAV2 캡시드 단백질 VP1 서열:
Figure 112014111119610-pct00008
Figure 112014111119610-pct00009
Figure 112014111119610-pct00010
AAV - Rh74 캡시드 단백질 VP1 서열:
Figure 112014111119610-pct00011
Figure 112014111119610-pct00012
Figure 112014111119610-pct00013
AAV-rh74에서 바람직한 돌연변이체 (표 3도 참조하라)
Figure 112014111119610-pct00014
하기 프라이머 세트는 본 발명의 리신 함유 캡시드 변이체를 생성하는데 이용되었다:
돌연변이유발에 이용된 프라이머 :
Figure 112014111119610-pct00015
Figure 112014111119610-pct00016
Figure 112014111119610-pct00017
표 5는 FIX에 대한 간-특이적 AAV 트랜스젠 발현 카세트를 패키징하는데 이용된 돌연변이유발로부터 유래된 일련의 AAV 벡터를 제공한다. 패키징 효율은 변형되지 않은 야생형 AAV8 벡터로 관찰된 것과 구별되지 않았다.
Figure 112014111119610-pct00018
형질도입 효율을 추가로 증가시키기 위해 본원에 기재된 캡시드 단백질 중 어느 하나에 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 초과의 변경된 리신 잔기를 함유하는 캡시드 돌연변이체가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 데이터는 또한 특정 돌연변이가 현저하게 감소된 형질도입 효율을 나타내는 변이체를 발생시켰음을 나타낸다. 그러한 변이체는 유입되는 벡터에 대한 항체 유도된 면역 반응을 중화시키거나 포화시켜 요망되는 트랜스젠을 지니는 벡터가 더욱 효율적으로 세포에 들어가도록 하는 데코이로서 작용하기 위해, 증가된 형질도입 효율을 나타내는 변이체와 함께 사용될 수 있었다.
도 1은 캡시드 표면의 도식적 다이아그램을 도시한다. 도 2a, 2b 및 2c에 제시된 데이터는 AAV8 상의 VP1 캡시드에서 리신 잔기를 변경시키는 것이 변경된 형질도입 수준으로 인해 생성되는 트랜스젠의 수준을 변경시킴을 입증한다. 도 3a, 3b 및 3c는 형질도입된 세포에서 HF.IX 생성에 대한 단일 및 다수의 돌연변이의 효과를 도시한다. 도 3d는 4개 또는 6개의 티로신의 페닐알라닌 잔기로의 변경과 함께 3개의 리신의 아르기닌 잔기로의 변경과 같은 조합 돌연변이가 형질도입률을 감소시킴을 입증한다.
AAV 리신 돌연변이체를 이용한 HHL5 -B7 간세포의 CTL 치사
본 발명자들은 본원에 기재된 특정 AAV 리신 돌연변이체로 형질도입된 간세포의 CTL 치사를 평가하였다. 하기 물질 및 방법을 이용하여 형질도입된 간세포의 CTL 치사를 평가하였다.
벡터 생성
AAV 벡터는 이전에 기재된 대로 (Matsushita, 1998) 삼중 트랜스펙션 접근법을 이용하여 HEK-293 세포에서 생성되었고 세슘 클로라이드 구배 원심분리 방법으로 정제되었다 (Ayuso, 2010). Genemed 합성에 의해 AAV 에피토프 펩티드를 합성하였고 100% DMSO 중에 5mg/ml의 농도로 재현탁시켰다.
T 세포의 시험관내 증식
인간 PBMC (Cellular Technology LTD)를 해동시키고, 세척하고, 계수하고, 3% 인간 혈청(Bioreclamation), 1% L-글루타민(Gibco), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)을 함유하는 AIM-V 림프구 배지(Gibco)에 2 x 106 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 각각의 증식 조건에 대해, 웰당 1x106 (500 μl) 세포를 24 웰 플레이트(BD Falcon)에 500 μl의 부피로 첨가하였다. 추가의 1x106 (500 μl)의 자가 방사된 비장세포(3000 rad)를 또한 2.5 μg/ml의 인간 β-2-마이크로글로불린(Lee Biosolutions), 및 10 ng/ml의 인간 재조합 IL-7 (R&D Systems)과 함께, 공급자 세포로서 각 웰에 첨가하였다. 세포를 10 μg/ml의 최종 농도의 AAV 펩티드의 존재하에 37℃에서 5% CO2에서 증식시켰다. 처음 24시간 후에 10 ng/ml 농도의 인간 IL-2 (Roche)를 세포 배양물에 첨가하고 그 후 48시간마다 보충하였다. 세포를 필요에 따라 새로운 웰로 나누고 항원성 자극(항원 및 공급자 세포)을 7-10일마다 최대 3라운드의 재자극을 위해 반복하였다.
CTL 검정
CTL 검정을 이전에 기재된 대로 수행하였다 (Pien, 2009). 간단히 말해, CTL-매개된 표적 용해 후 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 방출을 CytoTox 96 비방사성 세포독성 검정(Promega)으로 측정하였다. 4천 개의 HHL5 간세포 표적 세포를 혈청을 함유하지 않는 DMEM에서 Microtest Primaria 편평-바닥 96-웰 플레이트(BD Falcon)의 각 웰에 플레이팅하였다. 표적 세포는 5000, 50,000, 및 500,000의 MOI의 AAV 캡시드로 형질도입되었고 18시간 동안 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션되었다. 처리 및 인큐베이션 후에, 플레이팅된 세포를 배지로 1회 세척한 다음 상기 기재된 대로 증식한 에피토프-특이적 세포독성 T 림프구를 첨가하였다. CTL을 10:1의 효과기-표적 세포 비로 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 첨가하고, LDH를 분광광도계(Spectramax)를 이용하여 490nm에서의 효소적 기질 판독을 이용하여 실온에서 30분의 인큐베이션 후에 측정하였다.
유동 세포계수법
AAV 형질도입 이후 GFP 발현을 유동 세포계수법에 의해 측정하였다. 세포주 HHL5 또는 Huh7로부터의 인간 간세포를 Primaria Multiwell 24-웰 플레이트 (BD Falcon)에서 10% 우태아 혈청, 1% L-글루타민(Gibco), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)을 함유하는 DMEM에서 250,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 5000, 50000, 또는 5000000 MOI의 AAV 벡터로 형질도입하고 18시간 동안 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 트립신화하고, PBS 2% FBS로 2회 세척하고, 2% 파라포름알데히드로 고정시켰다. FACSDiva® (BD Biosciences)을 이용하여 FACS Canto II 유동 세포계수기 상에서 샘플을 수득하고 Flowjo® 소프트웨어(Treestar)를 이용하여 추가 분석을 수행하였다.
CTL 검정 결과
바이러스 형질도입에 대한 리신 돌연변이의 효과를 추가로 시험하기 위해, 본 발명자들은 AAV 벡터의 기능성을 시험하기 위해 본 연구실에서 종래에 개발된 시험관내 CTL-매개된 세포독성 검정을 이용하였다 (Pien et al.). AAV1 및 AAV2 형질도입 결과가 도 4 및 5 및 6에 제시된다. 도 4에서, AAV-1 캡시드의 모든 리신 돌연변이는 표적 세포의 CTL-매개된 치사를 감소시켰는데, 이는 리신 돌연변이가 형질도입시에 덜 효율적인 프로세싱 및 표면 항원의 제시를 초래하였음을 시사한다. 더욱이, 리신 돌연변이의 효과는 CTL-매개된 치사의 가장 큰 감소를 나타내는 삼중 및 사중 리신 돌연변이체에 의해 부가되는 것으로 보인다 (도 4a, b). AAV-2 캡시드에 대한 돌연변이는 유사한 효과를 나타내었다. 도 5 및 6을 참조하라. 도 7은 Rh74 변이체를 시험하는 경우에 수득된 형질도입 결과를 나타낸다.
요약해 보면, 본 발명자들은 AAV 캡시드 상의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로 돌연변이시키는 것이 AAV 형질도입 효율을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 본 실험은 형질도입시에, 비변형된 AAV 벡터를 수용한 동물에 비해 마우스에서 인간 인자 IX (FIX) 트랜스젠을 더 높은 수준으로 발현시킨 여러 변이체를 확인하였다.
참고문헌
Figure 112014111119610-pct00019
본 발명의 바람직한 특정 구체예가 기재되고 구체적으로 상기 예시되었으나, 본 발명을 그러한 구체예로 제한하려는 의도가 아니다. 하기 청구범위에 개시된 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으며 다양한 변형이 이에 대해 이루어질 수 있다.
표 1
AAV1 , AAV2 및 AAV8 리신 위치의 비교 및 이들의 유비퀴틴화 예측
Figure 112014111119610-pct00020
Figure 112014111119610-pct00021
표 2
AAV8 캡시드의 유비퀴틴화 예측
Figure 112014111119610-pct00022
표 3
Figure 112014111119610-pct00023
Figure 112014111119610-pct00024
Figure 112014111119610-pct00025
SEQUENCE LISTING <110> Yazicioglu, Mustafa N. Mingozzi, Federico Anguela, Xavier M. 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Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His 260 265 270 Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe 275 280 285 His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn 290 295 300 Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln 305 310 315 320 Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn 325 330 335 Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro 340 345 350 Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala 355 360 365 Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly 370 375 380 Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro 385 390 395 400 Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe 405 410 415 Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp 420 425 430 Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg 435 440 445 Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser 450 455 460 Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro 465 470 475 480 Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg 565 570 575 Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala 580 585 590 Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu 625 630 635 640 Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu 705 710 715 720 Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro 725 730 735 <210> 2 <211> 738 <212> PRT <213> Adeno-associated virus 8 <400> 2 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro 180 185 190 Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly 195 200 205 Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser 210 215 220 Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val 225 230 235 240 Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His 245 250 255 Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp 260 265 270 Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn 275 280 285 Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn 290 295 300 Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn 305 310 315 320 Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala 325 330 335 Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln 340 345 350 Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe 355 360 365 Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn 370 375 380 Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr 385 390 395 400 Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr 405 410 415 Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser 420 425 430 Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu 435 440 445 Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly 450 455 460 Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp 465 470 475 480 Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly 485 490 495 Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His 500 505 510 Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr 515 520 525 His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile 530 535 540 Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val 545 550 555 560 Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr 565 570 575 Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala 580 585 590 Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val 595 600 605 Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile 610 615 620 Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe 625 630 635 640 Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val 645 650 655 Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe 660 665 670 Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu 675 680 685 Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr 690 695 700 Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu 705 710 715 720 Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 735 Asn Leu <210> 3 <211> 735 <212> PRT <213> Adeno-associated virus 2 <400> 3 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly 145 150 155 160 Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr 260 265 270 Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His 275 280 285 Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp 290 295 300 Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val 305 310 315 320 Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu 325 330 335 Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr 340 345 350 Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp 355 360 365 Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser 370 375 380 Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser 385 390 395 400 Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu 405 410 415 Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg 420 425 430 Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr 435 440 445 Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln 450 455 460 Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly 465 470 475 480 Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn 485 490 495 Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly 500 505 510 Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp 515 520 525 Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys 530 535 540 Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr 545 550 555 560 Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr 565 570 575 Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr 580 585 590 Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn 645 650 655 Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 4 <211> 738 <212> PRT <213> Adeno-associated virus rh.74 <400> 4 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Ser Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln 165 170 175 Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro 180 185 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Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtcacccgct ctgagctgct ggtcgtaggc 30 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tggttgagga aggcgctagg acggctcct 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aggagccgtc ctagcgcctt cctcaacca 29 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctaagacggc tcctggaaag agacgtccgg tag 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctaccggacg tctctttcca ggagccgtct tag 33 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cgggcatcgg caggacaggc cagca 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tgctggcctg tcctgccgat gcccg 25 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 agtccggaag tgcccaaaac agggacttgc tgt 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 acagcaagtc cctgttttgg gcacttccgg act 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gcactgctat ggcctcacac agagacgacg aag 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cttcgtcgtc tctgtgtgag gccatagcag tgc 33 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 caaagacgac gaagacaggt tctttcccat gagcg 35 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cgctcatggg aaagaacctg tcttcgtcgt ctttg 35 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tgcagtacac atccaattat gcaagatctg ccaacgttg 39 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 caacgttggc agatcttgca taattggatg tgtactgca 39 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggttgaggaa ggcgctagga cggctcctgg 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccaggagccg tcctagcgcc ttcctcaacc 30 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gcagaatgaa ggcaccagga ccatcgccaa taacc 35 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ggttattggc gatggtcctg gtgccttcat tctgc 35 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gcatcgctat ggcaacacac agagacgacg agg 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 cctcgtcgtc tctgtgtgtt gccatagcga tgc 33 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gtacacctcc aactactaca gatctacaag tgtggacttt g 41 <210> 30 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 caaagtccac acttgtagat ctgtagtagt tggaggtgta c 41 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gcccgcagag cggcataggg acgacag 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ctgtcgtccc tatgccgctc tgcgggc 27 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cctggttgag gaacctgtta ggacggctcc gg 32 <210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ccggagccgt cctaacaggt tcctcaacca gg 32 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 agacggctcc gggaaaaagg aggccggta 29 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 taccggcctc ctttttcccg gagccgtct 29 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 cctcgggaac cggaagggcg ggcc 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 ggcccgccct tccggttccc gagg 24 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ccgccagcag cgagtatcaa ggacatctgc gg 32 <210> 40 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ccgcagatgt ccttgatact cgctgctggc gg 32 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cggccatggc aagccacagg gacgatgaa 29 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ttcatcgtcc ctgtggcttg ccatggccg 29 <210> 43 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 acaaggacga tgaagaaagg ttttttcctc agagcgg 37 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 ccgctctgag gaaaaaacct ttcttcatcg tccttgt 37 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 ctggttgaat cgccggttag gacggctcct g 31 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gaccaactta gcggccaatc ctgccgagga c 31 <210> 47 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gcagaatgaa ggcaccagga ccatcgccaa taacc 35 <210> 48 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ggttattggc gatggtcctg gtgccttcat tctgc 35 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gttgccatgg ctacccacag ggacgacgaa 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 ttcgtcgtcc ctgtgggtag ccatggcaac 30 <210> 51 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ggaaacaggg agctggaaga gacaacgtgg actat 35 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 atagtccacg ttgtctcttc cagctccctg tttcc 35 <210> 53 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ctaaccagcg aggaagaaat aaggaccacc aaccc 35 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gggttggtgg tccttatttc ttcctcgctg gttag 35 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 cgagtgggag ctgcagaggg agaacagcaa 30 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 ttgctgttct ccctctgcag ctcccactcg 30 <210> 57 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 gctgcagaag gagaacagca gacgctggaa cc 32 <210> 58 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 ggttccagcg tctgctgttc tccttctgca gc 32 <210> 59 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 agtacacttc caactactac agatctacaa atgtggactt tgc 43 <210> 60 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 gcaaagtcca catttgtaga tctgtagtag ttggaagtgt act 43

Claims (23)

  1. 아데노-관련 바이러스 1 (AAV1) VP1 캡시드 단백질의 K61R, K84R, K137R, K143R, K161R, K459R, K533R 및 K707R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 리신 치환을 포함하는 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터로서, 상기 벡터가 AAV 역 말단 반복체 및 숙주 세포에서 이종성 핵산 서열로부터 생성물의 발현을 유도하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종성 핵산 서열을 포함하는 미니겐(minigene)을 추가로 포함하고, 상기 리신 치환이 상기 캡시드 단백질의 유비퀴틴화를 억제하기에 효과적이어서, 하나 이상의 리신 치환이 없는 AAV1 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 상기 AAV 벡터의 표적 세포로의 형질도입을 증가시키는, AAV 벡터.
  2. AAV2 VP1 캡시드 단백질의 K39R, K137R, K143R, K161R, K490R, K527R 및 K532R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 리신 치환을 포함하는 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터로서, 상기 벡터가 AAV 역 말단 반복체 및 숙주 세포에서 이종성 핵산 서열로부터 생성물의 발현을 유도하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종성 핵산 서열을 포함하는 미니겐을 추가로 포함하고, 상기 리신 치환이 상기 캡시드 단백질의 유비퀴틴화를 억제하기에 효과적이어서, 하나 이상의 리신 치환이 없는 AAV2 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 상기 AAV 벡터의 표적 세포로의 형질도입을 증가시키는, AAV 벡터.
  3. AAV8 VP1 캡시드 단백질의 K137R, K259R, K333R, K530R, K569R 및 K668R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 리신 치환을 포함하는 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터로서, 상기 벡터가 AAV 역 말단 반복체 및 숙주 세포에서 이종성 핵산 서열로부터 생성물의 발현을 유도하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종성 핵산 서열을 포함하는 미니겐을 추가로 포함하고, 상기 리신 치환이 상기 캡시드 단백질의 유비퀴틴화를 억제하기에 효과적이어서, 하나 이상의 리신 치환이 없는 AAV8 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 상기 AAV 벡터의 표적 세포로의 형질도입을 증가시키는, AAV 벡터.
  4. AAV-rh74 VP1 캡시드 단백질의 K26R, K38R, K51R, K61R, K77R, K137R, K169R, K259R, K333R, K530R, K547R, K552R, K569R, 및 K709R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 리신 치환을 포함하는 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터로서, 상기 벡터가 AAV 역 말단 반복체 및 숙주 세포에서 이종성 핵산 서열로부터 생성물의 발현을 유도하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이종성 핵산 서열을 포함하는 미니겐을 추가로 포함하고, 상기 리신 치환이 상기 캡시드 단백질의 유비퀴틴화를 억제하기에 효과적이어서, 하나 이상의 리신 치환이 없는 AAV-rh74 VP1 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터와 비교하여 상기 AAV 벡터의 표적 세포로의 형질도입을 증가시키는, AAV 벡터.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산 서열의 발현 생성물이 치료적 펩티드 또는 핵산인 AAV 벡터.
  6. 제 5항에 있어서, 치료적 펩티드가 인자 VIII, 인자 IX 또는 이들의 기능성 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 응고 인자인 AAV 벡터.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산 서열의 발현 생성물이 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화 항체, 또는 단일쇄 항체인 AAV 벡터.
  8. 제 7항에 있어서, 이종성 핵산 서열의 발현 생성물이 키메라 면역글로불린인 AAV 벡터.
  9. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산 서열의 발현 생성물이 단일쇄 항체인 AAV 벡터.
  10. 제 5항에 있어서, 발현 생성물이 항바이러스 RNAi인 AAV 벡터.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 RNAi가 HCV 감염 및 복제를 억제하기에 효과적인 AAV 벡터.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 RNAi가 진핵생물 표적 유전자의 발현을 억제하기에 효과적인 AAV 벡터.
  13. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산 서열의 발현 생성물이 질병-변경 사이토카인인 AAV 벡터.
  14. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 핵산 서열의 발현 생성물이 한 쌍의 아연 핑거 누클레아제인 AAV 벡터.
  15. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 2, 3, 또는 4개의 리신 치환을 포함하는 AAV 벡터.
  16. 삭제
  17. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터, 및 이에 상용가능한 생리학적 담체를 포함하는, 낭성 섬유증, 혈우병 A, 혈우병 B, 지중해빈혈, 빈혈, AIDS, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근육위축가쪽경화증, 간질, 암, 당뇨병, 근육퇴행위축, 고쉐병, 헐러병, 아데노신 데아미나제 결핍, 글리코겐 저장병 및 망막 퇴행성 질병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 치료 또는 경감용 약학적 조성물.
  18. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 AAV 벡터를 생성하는 세포 배양물.
  19. 세포를 제 17항에 따른 약학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 트랜스젠을 인간을 제외한 피검체의 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 AAV 벡터가 트랜스젠을 포함하고, 상기 VP1 캡시드 단백질 중 상기 리신 치환의 존재가 상기 캡시드의 유비퀴틴화에서의 감소와 관련되어 상기 벡터를 이용한 표적 세포의 형질도입 효율을 증가시키는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 트랜스젠이 인자 IX인 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 상기 트랜스젠이 인자 VIII인 방법.
  22. 삭제
  23. 삭제
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