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CN110317266A - 三种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防O型口蹄疫病制剂中的应用 - Google Patents

三种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防O型口蹄疫病制剂中的应用 Download PDF

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CN110317266A
CN110317266A CN201910643811.6A CN201910643811A CN110317266A CN 110317266 A CN110317266 A CN 110317266A CN 201910643811 A CN201910643811 A CN 201910643811A CN 110317266 A CN110317266 A CN 110317266A
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dna
dna molecular
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尹杰超
任桂萍
李德山
李青青
胡爽
孟婧
刘铭瑶
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Northeast Agricultural University
Original Assignee
Northeast Agricultural University
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Abstract

本发明公布了三种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防0型口蹄疫制剂中的应用。发明提供了三种单链抗体(即scFv抗体)，scFv抗体具有与FMDV结构蛋白1(VP1)蛋白及O型FMDV毒株特异性结合的能力。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁琐、生产成本高、效果不稳定以、工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发明提供的猪源scFv抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、工业化生产质量可控等优点，避免了免疫血清引起的水平传播疾病及过敏反应的问题。

Description

三种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防O型口蹄疫 病制剂中的应用
技术领域
本发明涉及三种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防O型口蹄疫病制剂中的应用。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)所致的一种急性、热性、高度接触传染性病。该病是偶蹄动物的烈性传染病，可迅速远距离传播，易感动物多达70余种。世界动物卫生组织(International Office of Epizootics，OIE)将该病列为A类传染性疾病之首。目前，我国流行的口蹄疫主要为O型，除了常规灭活疫苗与合成肽疫苗等主动免疫制剂外，O型FMDV抗血清也是主要的防治措施之一。目前市场上的口蹄疫被动免疫制剂主要为两种：牛源口蹄疫多血清型多克隆抗血清和猪源口蹄疫多联抗血清(通常为五联：口蹄疫、伪狂犬、猪瘟、传染性胃肠炎、蓝耳病)。但这两类抗血清在临床使用过程中均出现过严重过敏的副作用，需要紧急注射肾上腺素缓解症状。由于血液制品存在质量不均一、容易传播血源性疾病等缺陷，基因工程重组抗体可以有效解决传统高免血清存在的问题，将为该病的防治提供一种更安全、更有效、更标准化的被动免疫制剂。
发明内容
本发明的目的是提供三种单链抗体(scFv抗体)、其编码基因及其在制备治疗或预防O型口蹄疫制剂中的应用。
本发明提供了三种单链抗体，命名为FMDV-VP1 scFv29抗体、FMDV-VP1 scFv45抗体和FMDV-VP1 scFv116抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；
所述FMDV-VP1 scFv29抗体的重链可变区为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2自N末端第1-82位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述FMDV-VP1 scFv29抗体轻链可变区为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列2自N末端第99-206位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv29具体可为如下(e)或(f)：(e)由序列表中序列2所示的蛋白质；(f)将(e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
编码所述单链抗体FMDV-VP1 scFv29的基因也属于本发明的保护范围。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv29基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(1)或(2)或(3)：(1)序列表的序列1自5’末端第1-246位核苷酸所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv29基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4)或(5)或(6)：(4)序列表的序列1自5’末端第259-621位核苷酸所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv29基因具体可为如下(7)或(8)或(9)或(10)：(7)序列表的序列3自5’末端第1-753位核苷酸所示的DNA分子；(8)序列表的序列1所示的DNA分子；(9)在严格条件下与(7)或(8)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(10)与(7)或(8)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述FMDV-VP1 scFv45抗体的重链可变区为如下(a’)或(b’)：(a’)由序列表中序列4自N末端第1-131位氨基酸残基组成的蛋白质；(b’)将(a’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述FMDV-VP1 scFv45抗体轻链可变区为如下(c’)或(d’)：(c’)由序列表中序列4自N末端第147-255位氨基酸残基组成的蛋白质；(d’)将(c’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv45具体可为如下(e’)或(f’)：(e’)由序列表中序列4所示的蛋白质；(f’)将(e’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
编码所述单链抗体FMDV-VP1 scFv45的基因也属于本发明的保护范围。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv45基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(1’)或(2’)或(3’)：(1’)序列表的序列3自5’末端第1-393位核苷酸所示的DNA分子；(2’)在严格条件下与(1’)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3’)与(1’)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv45基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4’)或(5’)或(6’)：(4’)序列表的序列3自5’末端第439-768位核苷酸所示的DNA分子；(5’)在严格条件下与(4’)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6’)与(4’)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述FMDV-VP1 scFv116抗体的重链可变区为如下(a*)或(b*)：(a*)由序列表中序列6自N末端第1-124位氨基酸残基组成的蛋白质；(b*)将(a*)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述FMDV-VP1 scFv116抗体轻链可变区为如下(c*)或(d*)：(c*)由序列表中序列6自N末端第141-247位氨基酸残基组成的蛋白质；(d*)将(c*)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv116具体可为如下(e*)或(f*)：(e*)由序列表中序列6所示的蛋白质；(f*)将(e*)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
编码所述单链抗体FMDV-VP1 scFv116的基因也属于本发明的保护范围。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv116基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(1*)或(2*)或(3*)：(1*)序列表的序列5自5’末端第1-372位核苷酸所示的DNA分子；(2*)在严格条件下与(1*)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3*)与(1*)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv116基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4*)或(5*)或(6*)：(4*)序列表的序列5自5’末端第421-744位核苷酸所示的DNA分子；(5*)在严格条件下与(4*)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6*)与(4*)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述单链抗体FMDV-VP1 scFv116基因具体可为如下(7*)或(8*)或(9*)或(10*)：(7*)序列表的序列5自5’末端第1-744位核苷酸所示的DNA分子；(8*)序列表的序列2所示的DNA分子；(9*)在严格条件下与(7*)或(8*)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(10*)与(7*)或(8*)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
基于所述两种单链抗体的其它形式的抗体也属于本发明的保护范围。所述其它形式的抗体可为Fab形式的抗体、IgG形式的抗体等。
本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：(Ⅰ)检测口蹄疫病毒；(Ⅱ)辅助鉴定口蹄疫病毒；(Ⅲ)预防和/或治疗口蹄疫病；(Ⅳ)预防和/或治疗由口蹄疫病毒诱发的其它疾病。
含有所述单链抗体或所述其它形式的抗体的产品也属于本发明的保护范围；所述产品的功能为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：(Ⅰ)检测口蹄疫病毒；(Ⅱ)辅助鉴定口蹄疫病毒；(Ⅲ)预防和/或治疗口蹄疫引起的疾病；(Ⅳ)预防和/或治疗口蹄疫病。
本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在辅助鉴定口蹄疫病毒中的应用。所述应用为非疾病诊断方法。
本发明提供了三种单链抗体(即scFv抗体)，scFv抗体具有与O型FMDV结构蛋白1(VP1)蛋白及FMDV毒株特异性结合的能力。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁琐、生产成本高、效果不稳定以，工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发明提供的scFv抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、治疗效果好，工业化生产质量可控，避免了免疫血清引起的水平传播疾病等优点。
附图说明
图1FMDV-VP1scFv29、FMDV-VP1scFv45和FMDV-VP1scFv116抗体溶液的SDS-PAGE分析
图2VP1溶液的SDS-PAGE分析
图3VP1蛋白的免疫原性分析
图4ELISA检测三种scFv抗体对天然灭活0型FMDV Mya-98株特异性和亲和力
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
感受态：E.coli DH5α感受态菌株、E.coli Rosetta感受态菌株购于TaKaRa公司。
克隆载体：pMD19-T Simple Vector株购于TaKaRa公司；scFv抗体文库构建载体pTlinker由东北农业大学生命科学学院生物制药教研室构建。
表达载体：pSUMO原核表达载体由东北农业大学生命科学学院生物制药教研室构建；pET-28a(+)载体购于Novagen公司。
展示载体：细菌展示抗体文库载体pBSD由东北农业大学生命科学学院生物制药教研室构建。
质粒pHisSUMO：参考文献：姜媛媛,尹成凯,李晋南,任桂萍,张薇,李德山.利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东北农业大学学报,2008,39(10):57-62；李璐,尹成凯,李德山.高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO.生物技术,2009,19(3):11-14.。
口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所；HRP-goat anti-Rabbit IgG H&L购于R&D Systems公司；Rabbit anti-FMDV抗体购于艾博抗(上海)贸易有限公司；HRP-anti-FLAG抗体、FITC-anti-FLAG抗体购自美国Sigma公司。
SUMO Protease I由东北农业大学生命科学学院生物制药教研室表达纯化；限制性内切酶购于NEB公司；RNA提取试剂、反转录试剂、PCR试剂、蛋白纯化试剂、抗生素、溶菌酶、DNAMarker、IPTG均购于宝生物工程(TaKaRa)公司。
BCA蛋白浓度测定试剂盒、质粒小量提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒购于OMEGA公司；蛋白胶制备试剂及二硫苏糖醇(DTT)购于Amersham PharmaciaBiotech公司；蛋白Marker(预染、非预染)购于Thermo Fisher scientific；NC膜购于PALL公司。
实施例1：scFv抗体(单链抗体)及其编码基因的发现
1、抗体库的构建
口蹄疫VP1类病毒粒子免疫的猪只，经口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒测定其抗体效价，抗体效价最高(1:256)的猪脾脏，利用Trizol法提取脾脏组织总RNA。参照GenBank中登录的猪源抗体基因序列，对比分析序列，设计用于猪源抗体库重链、轻链可变区扩增的引物，重链上游依次插入Sfi I、Hind III两个酶切位点，下游插入NheI酶切位点；轻链上游插入BamH I酶切位点，下游依次插入Xho I和Sfi I两个酶切位点。将VH与VL片段分别插入到pTlinker载体的Linker的上游和下游，构建出scFv抗体库。将scFv抗体库进行酶切并与细菌展示载体pBSD进行连接，构建抗IBDV抗体的细菌表面展示文库。VH约370bp、VL约340bp，VH-Tlinker-VL约750bp。
2、抗体库的筛选
将scFv利用载体pBSD表达并锚定在大肠杆菌内膜外侧，并将细菌处理成原生质体状态，用VP1-FLAG孵育时，VP1-FLAG就会进入周质与细胞膜表面的scFv结合，而后用荧光标记的抗FLAG抗体孵育，这样通过特异性抗原结合的在表面表达scFv的细菌就可以通过流式细胞仪被筛选出来。具体实验方法如下：
用100μL含有10μL0.1％的BSA和5μg VP1-FLAG蛋白的PBS重新悬起的原生质体，冰浴1h，离心后弃上清，用PBS将沉淀洗涤两次，然后加入3000倍稀释的FITC标记的anti-FLAGantibody避光冰浴1h后，离心，然后用PBS洗涤沉淀3次，离心弃上清，沉淀用PBS重悬。将不含pBSD-scFv重组质粒的DH5α菌用同样的方法处理，作为阴性对照。
将阴性对照和实验组样品用流式细胞仪在488nm激发光条件下进行检测，分选相对于阴性对照荧光强度最高的部分。
将分选的菌体依次进行质粒提取、电转至大肠杆菌DH5α中，得到次级筛选库。按相同的方法进行第二轮筛选，分选荧光强度较高的后1％，提取质粒后再次转化大肠杆菌DH5α，构建成三级筛选库。如此三轮筛选后，提取质粒再次电转至大肠杆菌DH5α中，涂板后挑取多个单菌落，扩增培养后取少量菌液做细菌展示，用流式细胞仪进行逐个检测，将荧光信号强度强于阴性对照的克隆进行序列测定并分析。
经三轮筛选后，得到三个与FLAG融合的VP1蛋白具有结合能力的单链抗体，将其命名为FMDV-VP1 scFv29、FMDV-VP1 scFv45抗体和FMDV-VP1 scFv116抗体。
FMDV-VP1 scFv29抗体(为单链抗体，又称scFv蛋白)如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列4所示。
FMDV-VP1 scFv45抗体(为单链抗体，又称scFv蛋白)如序列表的序列2所示，其编码基因如序列表的序列5所示。
FMDV-VP1 scFv116抗体(为单链抗体，又称scFv蛋白)如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列6所示。
实施例2、scFv抗体的制备
1、以经FACS检测已证明为阳性克隆的质粒pBSD-scFv-29、pBSD-scFv-45、pBSD-scFv-116为模板，设计引物对三株scFv进行克隆。克隆scFv-29的上、下游引物分别为P3、P4；克隆scFv-45的上、下游引物分别为P5、P6；克隆scFv-116的上、下游引物分别为P7、P8；上游引物均引入Nde I，下游引物都引入Xho I酶切位点，由上海生工测序公司合成。PCR扩增scFv基因序列，经核酸电泳分离PCR扩增产物。
限制性内切酶Nde I位点用下划线标注，Xho I酶切位点用波浪线标注：
scFv-29引物：
P3:CATATGATGAAGCTTGGGTCTCTGG
P4:CTCGAGTTATTTGAGCTCCAGCTT
scFv-45引物：
P5:CATATGATGGAGGAGAAGTTGGTGG
P6:CTCGAGTTATTTGATTTCCAGCTTGGT
scFv-116引物：
P7:CATATGATGAAGCTTGGCCCCAGCCG
P8:CTCGAGTTATTTGAGCTCCAGTTTGGTCC
2、将纯化得到的scFv-29、scFv-45、scFv-116基因克隆到pMD19-T-simple克隆载体中并进行测序。
3、将经测序正确scFv片段通过相应的粘性末端连接到pET-28a(+)载体中。连接反应体系共10μL，充分混合均匀后，在16℃条件下连接过夜。然后将连接产物转化DH5α感受态细胞，同时设置阴性对照组，涂布于LB固体培养基上(含100μg/mL Kan+)，于37℃培养12h。
4、将鉴定正确的阳性重组质粒pET-scFv转化Rosetta表达菌感受态细胞并设置对照，涂布于LB固体培养基平板上，37℃培养12h。
5、将转化pET-scFv重组质粒的Rosetta菌液以1％的比例转接于新鲜的LB液体培养基中(含100μg/mLkan+)，37℃培养6h，当OD600值约为0.6时，加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG 37℃诱导4h，制备蛋白样品，用SDS-PAGE进行分析，另设不加IPTG诱导的对照组。
6、对诱导后的菌液离心，弃掉上清收集菌体，用适量PBS溶液重悬菌体，并向其中加入终浓度为1mg/mL的溶菌酶，4℃放置60min，用超声破碎仪破碎，离心收集包涵体，用复性液(浓度为2mol/L的尿素溶液，pH 8.0)洗涤包涵体后用适量变性液(浓度为8mol/L的尿素溶液，pH 8.0)将其充分溶解，于4℃变性4h后，然后向其中逐滴滴加大约为10倍变性液体积的复性液，在4℃条件下复性12h，换PBS透析，12h后换一次透析液。将纯化透析后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。如图1，在约27kDa有阳性条带，与蛋白scFv大小一致，纯化后蛋白中含少量杂蛋白，并经Image J灰度分析，纯度高于90％。
实施例3、VP1蛋白的制备
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列7所示的FMDV VP1双链DNA分子。
2、以步骤合成的双链DNA分子为模板，用P1和P2组成的引物对vp1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
限制性内切酶BamH I位点用下划线表示，Bsa I酶切位点用双下划线表示，FLAG序列倾斜加粗、波浪线标注：
P1：GGTCTCTAGGTATGACCACTTCGACGGGCGAGT
P2：
3、用限制性内切酶BsaⅠ和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BsaⅠ和BamHI双酶切质粒pHisSUMO，回收约5700bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。重组质粒中，VP1蛋白的编码基因和载体骨架上的分子伴侣SUMO的编码序列、以及载体骨架上的His标签的编码序列(位于SUMO的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成)融合，形成融合基因，表达融合蛋白(融合蛋白自N端至C端依次为His标签、分子伴侣SUMO和VP1-FLAG蛋白)。
二、VP1蛋白的制备和纯化
1、将步骤一得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、100r/min振荡培养至OD600nm＝0.35；加入IPTG并使其浓度为0.4mmol/L，25℃、65r/min振荡培养10h。
3、取完成步骤2的培养体系，4℃、4000r/min离心30min，并收集菌体沉淀。
4、取步骤3得到的菌体沉淀，用Binding buffer重悬，加入溶菌酶溶液(购自Amresco)并使溶菌酶的浓度为1mg/ml，4℃放置1h，然后进行超声破碎(25瓦的功率，3min)，4℃、10000g离心30min，收集上清液。
5、取步骤4得到的上清液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为10ml。
洗脱过程：先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：40mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3PO4；pH7.4)洗脱以去除杂蛋白，流速为1ml/min；然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：500mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3PO4；pH7.4)洗脱，流速为1ml/min，280nm波长监测，收集目标峰(即峰值高于80mAU的峰)，即为融合蛋白溶液。
6、采用HiPrepTM 26/10Desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐。
7、取步骤6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I(SUMO蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比为1:50)和终浓度为2mmol/L的DTT 4℃切割过夜。
8、取步骤7得到的溶液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰(即峰值高于30mAU的峰)，即为VP1蛋白溶液。将VP1蛋白溶液进行聚丙烯凝胶电泳，显示分子量约为25KDa的单一蛋白条带，如图2所示，约25kDa处有阳性条带，与目的VP1-FLAG蛋白大小一致，并经Image J灰度分析，纯度高于87％。
实施实例3、VP1-FLAG蛋白的免疫原性检验
1、配制15％SDS-PAGE蛋白胶，处理纯化后的蛋白样进行SDS-PAGE电泳，用BSA作为阴性对照。等条带分离，将蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上，200mA恒流转膜50min，随后用配制好的5％脱脂奶粉37℃水平摇床内封闭3h。
2、将NC膜从中间纵向剪开，一张膜用Rabbit-anti-FMDV VP1抗体(1：400)37℃孵育1h，然后用HRP标记羊抗兔二抗(1:7000)37℃孵育1h。用PBST洗膜6次，每次5min，最后加入显色液显色，曝光。另一张膜只用1：7000倍稀释的HRP-anti-FLAG抗体进行37℃孵育1h，用PBST洗膜6次，每次5min，显色，曝光。
为保证经变性、复性、纯化后的VP1-FLAG蛋白抗原性及FLAG免疫原性，经Westernblot分析，并以BSA作为阴性对照。如图3所示，VP1蛋白的抗原性不受FLAG的影响。Westernblot分析FLAG免疫原性，经HRP标记的anti-FLAG抗体孵育曝光，阴性样品无特异性条带，VP1-FLAG蛋白呈阳性表达，说明FLAG标签具有免疫原性。
实施例4、ELISA检测各scFv对灭活FMDV毒株的特异性及结合能力
将scFv蛋白依次稀释成100μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL的浓度，包被于ELISA板；其实验阴性对照组1(control 1)：用FGF21蛋白(100μg/mL)代替VP1-FLAG蛋白；阴性对照2(control2)：100μL包被液。依次用灭活的FMDV天然病毒抗原(工作浓度：参照口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒)，Rabbit-anti-FMDV抗体(1：400)，HRP-goat anti-rabbit二抗(1：7000)孵育；样品及对照均设置三个平行孔。孵育条件均为37℃、1h。每一步孵育结束都洗涤5遍，每次6min。用ELISA的方法检测scFv对灭活的FMDV天然病毒抗原的特异性结合能力。如图4，实验组OD450值均高于阴性对照组1、2，且都随scFv蛋白浓度梯度的增加而呈现上升趋势。实验中各孔P/N比值均大于2.1，因此表明这3株scFv均可以与灭活的FMDV天然病毒抗原特异性结合。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 三种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防O型口蹄疫病制剂中的应用
<141> 2019-07-16
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 621
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 1
aagcttgggt ctctggggcc caggcgttga agtcgtcgtg tccccaggct agcacctact 60
acgcagactc tgtgaagggc cgattcaccg cctccagaga caactcccag aacacggcct 120
atctgcaaat gaacagcctg agaaccgaag acacggcccg ctattactgt gcgactagcg 180
gttcctatag cggtcaatct agaggggatc tctggggccc aggcgtcgaa gtcgtcgtgt 240
cctcagctag cggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt ggatccgagc 300
tgcgtgatac acagtctcca gcctccctgg ctgcatctct cggagacacg gtctccatca 360
cttgccgggc cagtcagagc attagcaatt atttagcctg gtatcaacaa caaccaggga 420
aggctcctaa actcttgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcccggt 480
tcaagggcag tggatctggc accgatttca ccctcaccat cagtggcctg caggctgaag 540
atgtggcaac ttattactgt ttccagcata gcagtgcacc tccgtatggt ttcggcgcgg 600
gggccaagct ggagctcata a 621
<210> 3
<211> 206
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 3
Ala Trp Val Ser Gly Ala Gln Ala Leu Lys Ser Ser Cys Pro Gln Ala
1 5 10 15
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg
20 25 30
Asp Asn Ser Gln Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr
35 40 45
Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Gly Ser Tyr Ser Gly
50 55 60
Gln Ser Arg Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Val Glu Val Val Val Ser
65 70 75 80
Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Ser Glu Leu Arg Asp Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser
100 105 110
Leu Gly Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
115 120 125
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
130 135 140
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
145 150 155 160
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu
165 170 175
Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln His Ser Ser Ala
180 185 190
Pro Pro Tyr Gly Phe Gly Ala Gly Ala Lys Leu Glu Leu Ile
195 200 205
<210> 4
<211> 768
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 4
aagcttggcc ccagccggcc gaggcaaagc tggtggagtc tggaggaggc ctggtgcagc 60
ctggggggtc tctgagactc tcctgtgtcg gctctggatt caccttcagt agtacctgga 120
ttcagtgggt ccgccaggct ccagggaagg gcctggagtg gctggcagct attagtacta 180
gtactggtag cacctactac gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca 240
actcccagaa cacggcctat ctgcaaatga acagcctgag aaccgaagac acggcccgct 300
attactgtgc aacaggcggt gactatagcg gtagcgatga ttactatgct atgcatctct 360
ggggcccagg cgttgaagtc gtcgtgtctt cagctagcgg tggtggtggt tctggtggtg 420
gtggttctgg tggtggtgga tccgccatcc agctgaccca gtctccagcc tccctggctg 480
catctctcgg agacacggtc tccatcactt gccgggccag tcagagcatt agcagttatt 540
tagcctggta tcaacaacaa ccagggaggg ctcctaaact cttgatctat gctgcatcca 600
gtttgcaaag tggggtccca tcccggttca agggcagtgg atctggcacc gatttcaccc 660
tcaccatcag tggcctgcag gctgaagatg ttgcaactta ttactgtcag cagcatgata 720
gtgcaccgtg gaatggtttc ggcgcgggga ccaaactgga gctcataa 768
<210> 4
<211> 255
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 4
Ala Trp Pro Gln Pro Ala Glu Ala Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly
20 25 30
Phe Thr Phe Ser Ser Thr Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 45
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Ala Ile Ser Thr Ser Thr Gly Ser Thr
50 55 60
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
65 70 75 80
Ser Gln Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp
85 90 95
Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Gly Asp Tyr Ser Gly Ser Asp
100 105 110
Asp Tyr Tyr Ala Met His Leu Trp Gly Pro Gly Val Glu Val Val Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala
145 150 155 160
Ser Leu Gly Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Arg Ala Pro Lys
180 185 190
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
195 200 205
Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly
210 215 220
Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Ser
225 230 235 240
Ala Pro Trp Asn Gly Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Ile
245 250 255
<210> 5
<211> 744
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 5
gaggagaagt tggtggaatc tggaggaggc ctggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgtcg gcagtggatt caccttcagt agttatagca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gctggcatgt attgataata atggtagaaa cacctactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actcccagaa cgcggcctat 240
ctacaagtga acagcctgag aaccgaagac acggcccgct attactgtgc aataggccat 300
tgctatacct atagtcctac ttggggttta gtgcatctct ggggcccagg cgttgaagtc 360
gtcgtgtccc cagctagcgg tggtggtggt tctggtggtg gtggttctgg tggtggtgga 420
tccgccatcg tgttgaccca gtctccagcc tccctggctg catctctcgg agacacggtc 480
tccatcactt gccgggccag tcaaagcatt aacaagtggc tagcctggta tcaacaacaa 540
ccagggaagg ctcctaaact cctcatttat aaggcatcca gttcgcaaag tggggtccca 600
tcccggttca agggcagtgg atctggcacc gattacaccc tcaccatcag tggcctgcag 660
gctgaagatg ttgcaactta ttactgtcag cagcagctta ctgcaccgta tggtttcggc 720
gcggggacca agctggaaat ctaa 744
<210> 6
<211> 247
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 6
Glu Glu Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Cys Ile Asp Asn Asn Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gly His Cys Tyr Thr Tyr Ser Pro Thr Trp Gly Leu Val His
100 105 110
Leu Trp Gly Pro Gly Val Glu Val Val Val Ser Pro Ala Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Val
130 135 140
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Leu Gly Asp Thr Val
145 150 155 160
Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Lys Trp Leu Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala
180 185 190
Ser Ser Ser Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Val
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Leu Thr Ala Pro Tyr Gly Phe Gly
225 230 235 240
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
245
<210> 7
<211> 663
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 7
accacttcga cgggcgagtc ggctgacccc gtgactgcca ccgttgagaa ttacggtggc 60
gagacacagg tccagaggcg ccaccacaca gacgtctcat tcatattgga cagatttgtg 120
aaagtcacac caaaagactc aataaatgta ttggacctga tgcagacccc ctcccacacc 180
ctagtagggg cgctcctccg cactgccact tactatttcg ctgatctaga ggtggcagtg 240
aaacacgagg gggaccttac ctgggtgcca aatggagcac ctgaagcagc cttggacaac 300
accaccaacc caacggcgta ccataaggcg ccgcttactc ggcttgcatt gccctacacg 360
gcaccacacc gtgttttggc caccgtttac aacgggaact gcaaatacgc cgggggctca 420
ctgcccaacg tgagaggcga tctccaagtg ctggctcaga aggcagcgag gccgctgcct 480
acttctttca actacggtgc catcaaagcc actcgggtga cagaactgct gtaccgcatg 540
aagagggccg agacgtactg tcctcggccc ctcttggctg ttcacccgag tgcggccaga 600
cacaaacaga aaatagtggc gcctgtaaag cagtccttgg actacaagga tgacgacgat 660
aag 663
<210> 8
<211> 221
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 8
Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val
20 25 30
Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Ser Ile
35 40 45
Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ser His Thr Leu Val Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val
65 70 75 80
Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala
85 90 95
Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu
100 105 110
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr
115 120 125
Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val
130 135 140
Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro
145 150 155 160
Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu
165 170 175
Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu
180 185 190
Ala Val His Pro Ser Ala Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro
195 200 205
Val Lys Gln Ser Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
210 215 220

Claims (10)

1.三种单链抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；
所述FMDV-VP1 scFv29抗体重链可变区为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2自N末端第1-82位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将(a)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述FMDV-VP1 scFv29抗体轻链可变区为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列2自N末端第99-206位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)将(c)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述FMDV-VP1 scFv45抗体重链可变区为如下(a’)或(b’)：(a’)由序列表中序列4自N末端第1-131氨基酸残基组成的蛋白质；(b’)将(a’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述FMDV-VP1 scFv45抗体轻链可变区为如下(c’)或(d’)：(c’)由序列表中序列4自N末端第147-255位氨基酸残基组成的蛋白质；(d’)将(c’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述FMDV-VP1 scFv116抗体重链可变区为如下(a*)或(b*)：(a*)由序列表中序列6自N末端第1-124位氨基酸残基组成的蛋白质；(b*)将(a*)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述FMDV-VP1 scFv116抗体轻链可变区为如下(c*)或(d*)：(c*)由序列表中序列6自N末端第141-247位氨基酸残基组成的蛋白质；(d*)将(c*)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的两种单链抗体，其特征在于：
所述FMDV-VP1 scFv29单链抗体为如下(e)或(f)：(e)由序列表中序列2所示的蛋白质；(f)将(e)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述FMDV-VP1 scFv45单链抗体为如下(e’)或(f’)：(e’)由序列表中序列4所示的蛋白质；(f’)将(e’)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述FMDV-VP1 scFv116单链抗体为如下(e*)或(f*)：(e*)由序列表中序列6所示的蛋白质；(f*)将(e*)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述单链抗体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：
所述FMDV-VP1 scFv29单链抗体基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(1)或(2)或(3)：(1)序列表的序列1自5’末端第1-246位核苷酸所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；
所述FMDV-VP1 scFv29单链抗体基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4)或(5)或(6)：(4)序列表的序列1自5’末端第295-621位核苷酸所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述FMDV-VP1 scFv45单链抗体基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(1’)或(2’)或(3’)：(1’)序列表的序列3自5’末端第1-393位核苷酸所示的DNA分子；(2’)在严格条件下与(1’)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3’)与(1’)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；
所述FMDV-VP1 scFv45单链抗体基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4’)或(5’)或(6’)：(4’)序列表的序列3自5’末端第439-768位核苷酸所示的DNA分子；(5’)在严格条件下与(4’)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6’)与(4’)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述FMDV-VP1 scFv116单链抗体基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下(1*)或(2*)或(3*)：(1*)序列表的序列5自5’末端第1-372位核苷酸所示的DNA分子；(2*)在严格条件下与(1*)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3*)与(1*)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；
所述FMDV-VP1 scFv116单链抗体基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下(4*)或(5*)或(6*)：(4*)序列表的序列5自5’末端第421-744位核苷酸所示的DNA分子；(5*)在严格条件下与(4*)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(6*)与(4*)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于：
所述FMDV-VP1 scFv29单链抗体基因为如下(7)或(8)或(9)或(10)：(7)序列表的序列1自5’末端第1-621位核苷酸所示的DNA分子；(8)序列表的序列3所示的DNA分子；(9)在严格条件下与(7)或(8)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(10)与(7)或(8)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述FMDV-VP1 scFv45单链抗体基因为如下(7’)或(8’)或(9’)或(10’)：(7’)序列表的序列3自5’末端第1-768位核苷酸所示的DNA分子；(8’)序列表的序列4所示的DNA分子；(9’)在严格条件下与(7’)或(8’)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(10’)与(7)或(8’)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述FMDV-VP1 scFv116单链抗体基因为如下(7*)或(8*)或(9*)或(10*)：(7*)序列表的序列5自5’末端第1-744位核苷酸所示的DNA分子；(8’)序列表的序列4所示的DNA分子；(9*)在严格条件下与(7*)或(8*)限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；(10*)与(7*)或(8*)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
6.含有权利要求3至5中任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
7.基于权利要求1或2所述单链抗体的其它形式的抗体。
8.权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：(Ⅰ)检测口蹄疫病毒；(Ⅱ)辅助鉴定口蹄疫病毒；(Ⅲ)预防和/或治疗口蹄疫病毒引起的疾病；(Ⅳ)预防和/或治疗口蹄疫。
9.含有权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体的产品；所述产品的功能为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)：(Ⅰ)检测口蹄疫病毒；(Ⅱ)辅助鉴定口蹄疫病毒；(Ⅲ)预防和/或治疗口蹄疫病毒引起的疾病；(Ⅳ)预防和/或治疗口蹄疫。
10.权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体在辅助鉴定口蹄疫病毒中的应用。
CN201910643811.6A 2019-07-17 2019-07-17 三种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防O型口蹄疫病制剂中的应用 Pending CN110317266A (zh)

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