CN105384815B

CN105384815B - 一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用

Info

Publication number: CN105384815B
Application number: CN201510876063.8A
Authority: CN
Inventors: 李德山; 郭笑辰; 任桂萍
Original assignee: Jiangsu Kangyuan Ruiao Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2035-12-03
Also published as: CN105384815A

Abstract

本发明公开了一种scFv抗体在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。本发明提供的scFv‑GD抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；重链可变区为如下（a）或（b）：（a）由序列1第1‑128位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质；轻链可变区为如下（c）或（d）：（c）由序列1第144‑249位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）将（c）经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质。本发明本发明提供的scFv‑GD抗体，是利用抗原‑抗体共表达的细菌展示技术筛选获得的，该scFv‑GD抗体的中和活性比已授专利权的scFv‑A抗体高10倍以上，具有特异性强、治疗效果更好等优点。

Description

一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。

背景技术

鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）引起的一种以破坏鸡免疫中枢器官—法氏囊为特征的急性、高度接触性传染病，具有传播速度快、传染性强、感染率及死亡率均高的特点。该病目前已遍布全球各地，是危害养鸡业的主要疫病之一，并且因免疫失败而造成的经济损失巨大。

IBDV可在雏鸡法氏囊中的淋巴细胞，尤其是B淋巴细胞中迅速繁殖，导致免疫抑制,从而可增强机体对其它病原体的易感性并且降低对其它疫苗的反应性。抗体药物目前是有效的治疗药物，高免血清和卵黄抗体在发病早期均可起到良好的效果，但是由于工业化生产可控性差和存在水平传播疾病等原因而受到限。本发明利用抗原-抗体共表达的细菌展示技术筛选获得了具有较高中和活性的scFv抗体。抗体药物抗病毒的中和活性与治疗效果成正比，中和活性越高，其治疗效果越好。本发明提供的scFv抗体的中和活性明显提高，将具有较好的治疗效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。该scFv抗体的中和活性比已授专利权的scFv-A抗体（专利“scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用”中的scFv抗体在此专利中命名为scFv-A抗体）高10倍以上，在预防及治疗IBD将具有更好的效果。该scFv抗体与scFv-A抗体的核苷酸的同源性为88.71%，氨基酸的同源性为78%，说明两株scFv是完全不同的两种抗体。

本发明提供了一种单链抗体，命名为scFv-GD抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；

所述重链可变区为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1自N末端第1-128位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；

所述轻链可变区为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列1自N末端第144-249位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）将（c）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。

所述单链抗体具体可为如下（e）或（f）：（e）由序列表中序列1所示的蛋白质；（f）将（e）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。

编码所述单链抗体的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（1）或（2）或（3）：（1）序列表的序列2自5’末端第1-384位核苷酸所示的DNA分子；（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3）与（1）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。

所述基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下（4）或（5）或（6）：（4）序列表的序列2自5’末端第430-747位核苷酸所示的DNA分子；（5）在严格条件下与（4）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6）与（4）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。

所述基因具体可为如下（7）或（8）或（9）或（10）：（7）序列表的序列2自5’末端第1-747位核苷酸所示的DNA分子；（8）序列表的序列2所示的DNA分子；（9）在严格条件下与（7）或（8）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10）与（7）或（8）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1% SDS和1×SSC、0.1% SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

基于所述单链抗体的其它形式的抗体也属于本发明的保护范围。所述其它形式的抗体可为Fab形式的抗体、IgG形式的抗体等。

本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅱ）辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅲ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（Ⅳ）预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。

含有所述单链抗体或所述其它形式的抗体的产品也属于本发明的保护范围；所述产品的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅱ）辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅲ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（Ⅳ）预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。

本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒中的应用。所述应用为非疾病诊断方法。

本发明提供了一种单链抗体（即scFv-GD抗体），scFv-GD抗体具有与VP2蛋白及多种IBDV毒株特异性结合的能力，可阻断IBDV对鸡胚成纤维细胞产生CPE且其中和活性比已授专利权的scFv-A抗体高10倍以上。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁琐、生产成本高、效果不稳定、工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发明提供的scFv-GD抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、治疗效果好，工业化生产质量可控，避免了卵黄抗体引起的水平传播疾病等优点。

附图说明

图1为scFv-GD抗体溶液的SDS-PAGE图谱。

图2为scFv-GD抗体溶液的SEC-HPLC图谱。

图3为ELISA检测scFv-GD抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力的结果。

图4为ELISA检测scFv-GD抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pET-27b(+)载体：购自Novagen公司，Cat. No. 69337-3。大肠杆菌Rosetta：购自Novagen公司，Cat. No.71403-4。DF1细胞（鸡成纤维细胞）：购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，Cat. No.3131C0001000400030。SPF雏鸡：购自哈尔滨兽医研究所。鸡新城疫灭活疫苗（La Sota株），购买自哈兽研维科生物公司，编号080012008。

鸡传染性法氏囊病活疫苗（Gt株）：哈兽研维科生物公司，编号080012122。鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（NF8株）：扬州威克生物工程有限公司，编号101042056。鸡传染性法氏囊病活疫苗（1-65株）：Shafit InterGumboro，编号S20651010A。鸡传染性法氏囊病活疫苗（BJ836株）：上海海利生物药品有限公司，编号090202026。鸡传染性法氏囊病活疫苗（MB株）：ABIC，编号20621150B。鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株）：湖南省中岸生物药业有限公司，编号180022026。

质粒pHisSUMO：参考文献：姜媛媛, 尹成凯, 李晋南, 任桂萍, 张薇, 李德山.利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究. 东北农业大学学报, 2008, 39(10):57-62；李璐, 尹成凯, 李德山. 高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO. 生物技术, 2009, 19(3): 11-14.。

包被液（pH9.6）：取Na₂CO₃ 0.15g、NaHCO₃0.293g，溶于水并用水定容至100mL。

PBS缓冲液：取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄.12H₂O 3.58g、KH₂PO₄0.24g，溶于1L水。

实施例1、scFv-GD抗体（单链抗体）及其编码基因的发现

1、抗体库的构建

取IBDV免疫后的鸡脾脏，提取RNA后反转录成cDNA。根据GenBank上的抗体序列，设计出克隆抗体可变区的基因引物，以cDNA为模板，使用PCR的方法克隆抗体可变区。将VH与VL片段分别插入到pTlinker载体的Linker的上游和下游，构建出scFv抗体库。将scFv抗体库进行酶切并与细菌展示载体pBFD-Ab-VP2进行连接，构建抗IBDV抗原抗体共表达的细菌表面展示文库。VH约380bp、VL约320bp，VH-Tlinker-VL约740bp。

2、抗体库的筛选

收集转化后全部克隆，经IPTG（0.25mmol/L）诱导4h，经EDTA-MgCl₂处理，与抗兔VP2蛋白的多克隆抗体及FITC标记的羊抗兔二抗（P3838购自sigma公司，工作浓度为1:500倍稀释）各孵育1h，PBS洗涤后利用流式细胞仪对其进行筛选。

经三轮筛选后，得到一个与VP2蛋白具有结合能力的单克隆抗体，将其命名为scFv-GD抗体。

scFv-GD抗体（为单链抗体，又称scFv-GD蛋白）如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。

实施例2、scFv-GD抗体的制备

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5' –CGCCATATGGCCGTGACGTTGGACGAG-3'；

R1：5' –CCCAAGCTTTTAACCTAGGACGGTCAGGG-3'。

3、用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切pET-27b(+)载体，回收约5367bp的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在pET-27b(+)载体的NdeI和HindIII酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。

6、将步骤5得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。

7、将步骤6得到的重组菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、100r/min振荡培养至OD_600nm=0.4；加入IPTG并使其浓度为0.25mmol/L，37℃、 100r/min振荡培养4h。

8、取20L完成步骤7的培养体系，4℃、4000r/min离心30min并收集菌体沉淀。

9、取步骤8得到的菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，加入溶菌酶溶液（购自Amresco）并使溶菌酶的浓度为1mg/ml，4℃放置1h，然后进行超声破碎（25瓦的功率，3min），4℃、10000g离心30min，收集沉淀。

10、使用AKTA Purifier 100蛋白层析系统(购自GE公司)纯化目的蛋白

取步骤9得到的沉淀，用100毫升溶解缓冲液(8mol/L尿素水溶液，pH8.0)充分溶解，然后上样于HiLoad 16/60 Superdex75 pg柱子(购自GE公司)，然后用500毫升复性缓冲液（2mol/L尿素水溶液，pH8.0）洗脱并收集过柱后的洗脱液，然后在PBS缓冲液中透析过夜，得到溶液即为scFv-GD抗体溶液。所有步骤均在4℃环境下。scFv-GD抗体溶液的SDS-PAGE图谱见图1，显示约为28KD的条带，与预期相符。

11、取步骤10得到的scFv-GD抗体溶液，进行SEC-HPLC分析

硅胶填充物，型号为G-3000swxl；将scFv-GD抗体溶液上样后，用流速为0.5ml/min的洗脱液（pH8.0，溶剂为水，含50mM Na₃PO₄和150mM NaCl）进行洗脱。SEC-HPLC图谱见图2，目的蛋白的纯度可达90%。

实施例3、VP2蛋白的制备

一、重组质粒的构建

1、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。

2、以步骤合成的双链DNA分子为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F2：5’-GAAGACTTAGGT ACAAACCTGCAAGATCAA-3’；

R2：5’-GGATCCTTA TGCTCCTGCAATCTTCAG-3’。

3、用限制性内切酶BbsⅠ和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶BbsⅠ和BamHI双酶切质粒pHisSUMO，回收约5700bp的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。重组质粒中，VP2蛋白的编码基因和载体骨架上的分子伴侣SUMO的编码序列、以及载体骨架上的His标签的编码序列（位于SUMO的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成）融合，形成融合基因，表达融合蛋白（融合蛋白自N端至C端依次为His标签、分子伴侣SUMO和VP2蛋白）。

二、VP2蛋白的制备和纯化

1、将步骤一得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。

2、将步骤1得到的重组菌接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基， 37℃、100r/min振荡培养至OD_600nm=0.35；加入IPTG并使其终浓度为0.4mmol/L，25℃、 65r/min振荡培养10h。

3、取完成步骤2的培养体系，4℃、4000r/min离心30min，并收集菌体沉淀。

4、取步骤3得到的菌体沉淀，用Binding buffer重悬，加入溶菌酶溶液（购自Amresco）并使溶菌酶的浓度为1mg/ml，4℃放置1h，然后进行超声破碎（25瓦的功率，3min），4℃、10000g离心30min，收集上清液。

5、取步骤4得到的上清液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。

柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。

上样量为10ml。

洗脱过程：先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：40mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na₃PO₄；pH7.4）洗脱以去除杂蛋白，流速为1ml/min；然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：500mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na₃PO₄；pH7.4）洗脱，流速为1ml/min，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于80mAU的峰），即为融合蛋白溶液。

6、采用HiPrepTM 26/10 Desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐。

7、取步骤6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I（SUMO蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比为1:50）和终浓度为2mmol/L的DTT 4℃切割过夜。

8、取步骤7得到的溶液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。

柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。

上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于30mAU的峰），即为VP2蛋白溶液。将VP2蛋白溶液进行聚丙烯凝胶电泳，显示分子量约为42KDa的单一蛋白条带，回收蛋白条带并测序，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列3自N末端第1至15位氨基酸残基所示。

实验例4、抗兔VP2多克隆抗体的制备和纯化

一、免疫家兔

1、用实验例3得到的VP2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂，置于混合器上剧烈振荡混匀，形成“油包水”状乳悬液，充分乳化后采取背部多点皮下免疫注射，每点注射约100μL，免疫剂量为0．5 mg。

2、2周后用同样剂量蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。

3、一周后用同样剂量蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。

4、一周后用同样剂量蛋白质与等体积的弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。

5、6 d后，颈静脉采血，先放37℃1h，再放4℃过夜，取血清。

二、多克隆抗体的纯化

1、取步骤一得到的血清，进行protein A亲和层析。

柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。

上样量为20ml。

以每分钟0.5 ml的速度将抗血清上到柱上,为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质: 50 mM/L Tris, 150 mM/L NaCl；pH7.4）清洗柱子去除杂蛋白，后加洗脱缓冲溶液(溶剂为水，含有如下浓度的溶质50 mM/L甘氨酸; pH2.7 )，以0.5ml/min的速度洗脱，280nm波长监测，收集目标峰，即为多克隆抗体。将多克隆抗体溶液进行聚丙烯凝胶电泳，显示分子量约为50 kDa和25 kDa的两条蛋白条带。

实施例5、ELISA检测scFv-GD抗体的亲和力和特异性

一、ELISA检测scFv-GD抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力

1、分别用蛋白浓度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml的scFv-GD抗体溶液（即实施例2制备的scFv-GD抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度）包被酶标板，4℃过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

2、每孔加入100μl蛋白浓度为40μg/ml的VP2蛋白溶液（即实施例3制备的VP2蛋白溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

3、加入抗兔VP2多克隆抗体（即实施例4制备的多克隆抗体溶液，工作浓度为1:5000倍稀释），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

4、加入HRP标记的羊抗兔抗体（ HAF008购自R&D system公司，工作浓度为1:8000倍稀释），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

5、加入TMB底物显色液，37℃避光显色5min。

6、每孔加入50μl 2mol/L的H₂SO₄水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值。

设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的scFv-GD抗体溶液、步骤2中的VP2蛋白溶液和步骤3中的抗兔VP2多克隆抗体的PBS组。步骤1中用蛋白浓度为400μg/ml的scFv-GD抗体溶液包被酶标板时：设置步骤2中不加入VP2蛋白溶液的对照组1，步骤3中不加入抗兔VP2多克隆抗体的对照组2，步骤2中不加入VP2蛋白溶液且步骤3中不加入抗兔VP2多克隆抗体的对照组3，用等体积且等蛋白浓度的BSA溶液代替VP2蛋白溶液的对照组4。

每个处理设置3个复孔。

结果见图3。ELISA结果表明，scFv-GD抗体可以与VP2蛋白特异性结合。

二、ELISA检测scFv-GD抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力

1、用蛋白浓度为400μg/ml的scFv-GD抗体溶液（即实施例2制备的scFv-GD抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度）包被酶标板，4℃过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

2、每孔加入100μl IBDV病毒液（病毒剂量为10^6.2 TCID₅₀），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。

5、加入TMB底物显色液，37℃避光显色5min。

分别采用如下IBDV的毒株进行上述实验：Gt株、NF8株、1-65株、BJ836株、MB株、B87株。

设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的scFv-GD抗体溶液、步骤2中的IBDV病毒液和步骤3中的抗兔VP2多克隆抗体的PBS组。设置步骤2中不加入IBDV病毒液的对照组1，步骤3中不加入抗兔VP2多克隆抗体的对照组2，步骤2中不加入IBDV病毒液且步骤3中不加入抗兔VP2多克隆抗体的对照组3，用等体积等滴度的新城疫病毒液代替IBDV病毒液的对照组4。

每个处理设置3个复孔。

结果见图4。ELISA结果表明，scFv-GD抗体可以与不同IBDV毒株特异性结合，对不同的IBDV毒株具有不同的亲和力。

实施例6、scFv-GD抗体的中和活性

一、IBDV滴度的测定

将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基10¹至10¹⁴梯度稀释的IBDV病毒液（B87株）接种到单层细胞中（每孔100μl），每一稀释度接种8个细胞孔；设置不加入IBDV病毒液的对照组。将细胞培养板放到细胞培养箱中，37℃、5% CO₂培养，连续观察7天，每天记录细胞生长状态。计算病毒滴度，第7天结果见表1。

表1 IBDV滴度的测定的结果

按照Reed-Muench两氏法计算TCID₅₀=10^-6.2/0.1ml。

二、scFv-GD抗体的中和活性

将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基梯度稀释后的scFv-GD抗体溶液（即实施例2制备的scFv-GD抗体溶液）和100 TCID₅₀的IBDV病毒液（B87株）等体积混合并37℃孵育1h，然后接种到单层细胞中，每一梯度接种8个细胞孔；设置不加入抗体溶液且不加入病毒液的正常对照，设置只不加入抗体溶液只加入病毒液的病毒对照。将细胞培养板放到细培养箱中，37℃，5% CO₂培养连续观察7天，每天记录细胞生长状态。第7天结果见表2。

表2 scFv-GD抗体的中和活性的测定的结果

结果表明，scFv-GD抗体具有中和活性，阻断或抑制CPE的最小蛋白浓度为0.146μg/ml。

序列表

<110> 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司

<120> 一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用

<130>

<160> 4

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Gly Ser Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Cys Ser Thr Tyr Gly Cys Gly Gly Tyr Ala Gly Ser

100 105 110

Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala

130 135 140

Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val Lys

145 150 155 160

Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Gly Tyr Ser Trp His Gln

165 170 175

Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asn Asn Thr

180 185 190

Asn Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

195 200 205

Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala

210 215 220

Ile Tyr Phe Cys Gly Ser Ala Asp Ser Ser Tyr Val Gly Ile Phe Gly

225 230 235 240

Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Gly

245

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60

gtctgcaagg cctccgggtt ctccatcagc agttacagca tggcttgggt gcgccaggcg 120

cccggcaagg ggctggagtg ggtcgcgggt atttacagca gtggtagtag cacatactac 180

gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240

ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct actactgcgc cagaggtggt 300

tgtagtactt acggttgtgg tggttatgct ggtagcatcg acgcatgggg ccacgggacc 360

gaagtcatcg tctcctccgc tagcggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggtggt 420

ggtggatccg cgctgactca gccgtcctcg gtgtcagcga acccgggaga aaccgtcaag 480

atcacctgct ccgggggtgg cagcagctat ggttacagct ggcaccagca gaagtctcct 540

ggcagtgccc ctgtcactgt gatctataac aacaccaaca gaccctcgaa catcccttca 600

cgattctccg gttccaaatc cggctccaca gccacattaa ccatcactgg ggtccaagcc 660

gacgacgagg ctatctactt ctgtgggagt gcagacagca gctatgttgg tatatttggg 720

gccgggacaa ccctgaccgt cctaggt 747

<210> 3

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser

1 5 10 15

Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr Leu

20 25 30

Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr Val

35 40 45

Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro Gly

50 55 60

Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr Lys

65 70 75 80

Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr Asn

85 90 95

Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr Leu

100 105 110

Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr Phe

115 120 125

Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu Met

130 135 140

Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val Gly

145 150 155 160

Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly Tyr

165 170 175

Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys Met

180 185 190

Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr

195 200 205

Ala Ala Asn Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly Val

210 215 220

Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu Ser

225 230 235 240

Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile Leu

245 250 255

Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile Thr

260 265 270

Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn Leu

275 280 285

Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro Ile

290 295 300

Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln Ala

305 310 315 320

Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr Ile

325 330 335

His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val Ala

340 345 350

Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val Ser

355 360 365

Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Ile Thr

370 375 380

Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu Ile

385 390 395 400

Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr Arg

405 410 415

Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu Asn

420 425 430

Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala

435 440

<210> 4

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60

ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120

gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180

cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240

aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300

ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcatta 360

aacggaacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420

tacaatgggt tgatgtctgc gacggccaac atcaacgaca aaatcgggaa cgtcctagta 480

ggggaagggg taactgtcct cagcttaccc acatcatatg atctggggta tgtgagactc 540

ggtgacccca ttcccgctat agggcttgac ccaaagatgg tagcaacatg tgacagcagt 600

gataggccca gagtctacac cataactgca gccaatgact accaattctc atcacagtac 660

caagcaggtg gagtgacaat cacactgttc tcagcaaaca tcgatgccat cacaagcctc 720

agcatcgggg gagaacttgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggcgctacc 780

atctacctta taggcttcga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcagacaat 840

gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaata ttgtgattcc aaccagcgag 900

ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtta cctccaaaag tggtggtcag 960

gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc 1020

aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggctacagga 1080

tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140

aagaacctga tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cacaaaactg 1200

atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtgt ggccaacaag ggagtacacc 1260

gactttcgcg agtactttat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320

gca 1323

Claims

1.一种单链抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；

所述重链可变区为如下（a）：（a）由序列表中序列1自N末端第1-123位氨基酸残基组成的蛋白质；

所述轻链可变区为如下（b）：（b）由序列表中序列1自N末端第139-244位氨基酸残基组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于：所述单链抗体为如下（c）：（c）由序列表中序列1所示的蛋白质。

3.编码权利要求1或2所述单链抗体的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：

所述基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（1）：（1）序列表的序列2自5’末端第1-369位核苷酸所示的DNA分子；

所述基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下（2）：（2）序列表的序列2自5’末端第415-732位核苷酸所示的DNA分子。

5.如权利要求4所述的基因，其特征在于：

所述基因为如下（3）或（4）：（3）序列表的序列2自5’末端第1-732位核苷酸所示的DNA分子；（4）序列表的序列2所示的DNA分子。

6.含有权利要求3至5中任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

7.权利要求1所述单链抗体或权利要求2所述单链抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（Ⅰ）：（Ⅰ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病。

8.含有权利要求1所述单链抗体或权利要求2所述单链抗体的产品；所述产品的功能为如下（Ⅰ）：（Ⅰ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病。