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CN110278941B - 一种含有钠尿肽的离体心脏保护液 - Google Patents

一种含有钠尿肽的离体心脏保护液 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有钠尿肽的离体心脏保护液，离体心脏保护液为钠尿肽与HTK液的混合物。上述钠尿肽为心房钠尿肽、脑钠尿肽、C型钠尿肽和人工合成的血管钠肽的任一种。上述心房钠尿肽、脑钠尿肽、C型钠尿肽和人工合成的血管钠肽在HTK液中浓度为10‑8mol/L～10‑6mol/L。本发明的离体心脏保护液的PH为7.2～7.4。本发明的含有钠尿肽离体心脏保护液可以有效维持离体心脏活性，改善心功能，抑制心肌炎性反应。

Description

一种含有钠尿肽的离体心脏保护液
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有钠尿肽的离体心脏保护液。
背景技术
HTK(Histidine-Tryptophane-Ketoglutarate，HTK)心脏保护液又称为康斯特保护液，是1975年由德国Bretschneider等研制的一种仿细胞内液的晶体液，目前主要用于肝、肾、心脏、肺和胰腺等移植供体器官的保存，也可用作心脏手术中的停博液或经肺动脉灌注的肺保护液。作为心脏停博液，“平衡作用”是HTK液的显著特点，它能使血管腔隙得到完全灌注，最终实现细胞内外离子、温度和氧代谢的平衡。同时HTK液中强大的缓冲系统可以有效防止心肌细胞酸中毒，氨基酸可向缺血心肌长时间提供能量，因此HTK液有作用时间长、不影响术野操作、减少预充血量等优点。但HTK液对缺血再灌注损伤心肌的炎性反应无明显改善作用。
因此有必要寻找一种有效的改进型HTK液，既能满足保护心脏时间久、不影响术野操作、减少预充血等功效，又能抑制心肌缺血再灌注损伤的心肌炎性反应，以进一步提高离体心脏的活性。
钠尿肽(natriuretic peptides，NPs)是在维持机体水盐平衡、血压稳定、心血管及肾脏等器官功能中具有重要意义的一组多肽。目前研究较多也较清楚的主要有三种：心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、脑钠尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)和C-型钠尿肽(c-type natriuretic peptide，CNP)，ANP的分子量为3080Da，BNP的分子量为3466Da，CNP的分子量为2360Da。近年来还发现了一些新成员，如在鳗鱼(eel)和虹鳟鱼(rainbow trout)的心室中发现的心室钠尿肽，从Dendroaspis angusticeps蛇毒液中分离、提纯的DNP和1993年Wei等人工合成的血管钠肽(vasonatrin peptide，VNP)等，其中VNP的分子量为2837Da,它们共同组成了钠尿肽家族。
以往的研究表明，NPs不但具有利钠、利尿、舒血管、降血压的作用，而且对于心肌细胞具有抗凋亡、提高细胞活性等直接的保护效应，从而成为心脏保护药物研发的热点。2001年美国FDA批准SCIOS公司重组BNP上市(商品名奈西立肽)用于急性充血性心衰的治疗，取得很好的疗效。2005年我国也上市了BNP(商品名新活素)。将HTK液与NPs相结合，旨在提高离体心脏保护液的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有钠尿肽的离体心脏保护液，既能延长心脏保护时间，又能抑制缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞炎性反应。
本发明所采用的技术方案是：一种含有钠尿肽的离体心脏保护液，离体心脏保护液为钠尿肽与HTK液的混合物。
本发明的特点还在于，
上述钠尿肽为心房钠尿肽、脑钠尿肽、C型钠尿肽和人工合成的血管钠肽的任一种。
心房钠尿肽、脑钠尿肽、C型钠尿肽、人工合成的血管钠肽的浓度均为10-8mol/L～10-6mol/L。
离体心脏保护液的pH为7.2～7.4。
本发明的有益效果是：
1.本发明具有改善心功能的作用。本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液，使得左室收缩压LVSP、左室舒张末压LVEDP、左室收缩压最大上升速率(+dp/dtmax)、左室舒张压最大下降速率(-dp/dtmax)和冠脉流量(CF)明显增加，与现有的HTK液比较，其改善心功能的效应高7％以上。
2.本发明可以预防氧自由基的损伤，本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液，与现有的HTK液比较，其心脏组织的脂类过氧化物MDA和超氧化物歧化酶SOD的水平降低5％以上。
3.本发明可以降低心肌损伤，本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液，与现有的HTK液比较，其心肌肌酸激酶同工酶CK-MB和乳酸脱氢酶LDH的含量比降低20％以上。
4.本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液，与现有的HTK液比较，其心脏离体灌流液中炎性因子TNF-α和IL-6的水平降低30％以上。
附图说明
图1是本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液和对照组对心脏组织中MDA水平降低程度的对比图；
图2是本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液和对照组对心脏组织中SOD活性水平降低程度的对比图；
图3是本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液和对照组对离体心脏灌流液中CK-MB活性水平降低程度的对比图；
图4本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液和对照组对离体心脏灌流液中LDH活性水平降低程度的对比图；
图5是本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液和对照组对心肌细胞凋亡的影响对比图；
图6是本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液和对照组凋亡率定量测定对比图；
图7是本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液和对照组对离体心脏灌流液中炎性介质TNF-α的浓度测定对比图；
图8是本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液和对照组对离体心脏灌流液中炎性介质IL-6的浓度测定对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种含有钠尿肽的离体心脏保护液，离体心脏保护液为钠尿肽与HTK液的混合物。
上述钠尿肽为心房钠尿肽、脑钠尿肽、C型钠尿肽和人工合成的血管钠肽中的任一种。
上述心房钠尿肽、脑钠尿肽、C型钠尿肽、人工合成的血管钠肽在HTK液中浓度均为10-8mol/L～10-6mol/L。
上述离体心脏保护液的pH为7.2～7.4。
HTK液的制备方法为：将0.8766g氯化钠、0.6710g氯化钾、0.1842g 2-酮戊二酸-氢-钾、0.8132g六水氯化镁、3.7733g一水一盐酸组氨酸、27.9289g组氨酸、0.4085g色氨酸、5.4651g甘露醇、0.0022g二水氯化钙溶于1000mL超纯水中，得到HTK液。
实施例1
一种含有钠尿肽的离体心脏保护液1，按照以下步骤具体制备：
步骤1、将0.2837g人工合成的血管钠肽(VNP)溶于100mL超纯水中，得到的溶液浓度为10-3mol/L。
步骤2、按照制备HTK液的方法，将0.8766g氯化钠、0.6710g氯化钾、0.1842g 2-酮戊二酸-氢-钾、0.8132g六水氯化镁、3.7733g一水一盐酸组氨酸、27.9289g组氨酸、0.4085g色氨酸、5.4651g甘露醇、0.0022g二水氯化钙溶于1000mL超纯水中，得到HTK液。
步骤3、取100μL步骤1得到的溶液加入步骤2得到的HTK液中，混合均匀，调pH至7.2～7.4，即得到本发明的离体心脏保护液1。
上述离体心脏保护液中，人工合成的血管钠肽在HTK液中的浓度为10-7mol/L。
实施例2
一种含有钠尿肽的离体心脏保护液2，按照以下步骤具体制备：
步骤1、将0.3466g脑钠尿肽(BNP)溶于100mL超纯水中，得到的溶液浓度为10-3mol/L。
步骤2、按照制备HTK液的方法，将0.8766g氯化钠、0.6710g氯化钾、0.1842g 2-酮戊二酸-氢-钾、0.8132g六水氯化镁、3.7733g一水一盐酸组氨酸、27.9289g组氨酸、0.4085g色氨酸、5.4651g甘露醇、0.0022g二水氯化钙溶于1000mL超纯水中，得到HTK液。
步骤3、取100μL步骤1得到的溶液加入步骤2得到的HTK液中，混合均匀，调pH至7.2～7.4，即得到本发明的离体心脏保护液2。
上述离体心脏保护液中，脑钠尿肽在HTK液中的浓度为10-7mol/L。
实施例3
一种含有钠尿肽的离体心脏保护液3，按照以下步骤具体制备：
步骤1、将0.2360gC型钠尿肽(CNP)溶于100mL超纯水中，得到的溶液浓度为10- 3mol/L。
步骤2、按照制备HTK液的方法，将0.8766g氯化钠、0.6710g氯化钾、0.1842g 2-酮戊二酸-氢-钾、0.8132g六水氯化镁、3.7733g一水一盐酸组氨酸、27.9289g组氨酸、0.4085g色氨酸、5.4651g甘露醇、0.0022g二水氯化钙溶于1000mL超纯水中，得到HTK液。
步骤3、取1ml步骤1得到的溶液加入步骤2得到的HTK液中，混合均匀，调pH至7.2～7.4，即得到本发明的离体心脏保护液3。
上述离体心脏保护液中，C型钠尿肽在HTK液中的浓度为10-6mol/L。
实施例4
一种含有钠尿肽的离体心脏保护液4，按照以下步骤具体制备：
步骤1、将0.3080g心房钠尿肽(ANP)溶于100mL超纯水中，得到的溶液浓度为10- 3mol/L。
步骤2、按照制备HTK液的方法，将0.8766g氯化钠、0.6710g氯化钾、0.1842g 2-酮戊二酸-氢-钾、0.8132g六水氯化镁、3.7733g一水一盐酸组氨酸、27.9289g组氨酸、0.4085g色氨酸、5.4651g甘露醇、0.0022g二水氯化钙溶于1000mL超纯水中，得到HTK液。
步骤3、取10μL步骤1得到的溶液加入步骤2制备的HTK液中，混合均匀，调pH至7.2～7.4，即得到本发明的离体心脏保护液4。
上述离体心脏保护液中，心房钠尿肽在HTK液中的浓度为10-8mol/L。
对上述本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液1和2进行效果验证(离体建立大鼠心Langendorff模型行血液灌注-冷存-再灌注研究，模拟心脏移植手术对心脏供体获取、保存及移植过程中心脏保护液对心肌的保护)，并和HTK液心脏保护液(对照组)进行分析比较。
具体步骤如下：
取成年雄性SD大鼠24只，随机分为3组：HTK组、HTK-B组、HTK-V组(每组大鼠的数量n＝8)。
每组大鼠经50mg/kg氯胺酮+10mg/kg氯丙嗪腹膜内麻醉，舌下静脉内注射250U/kg肝素防止凝血。经胸肋三角开胸，心脏取出后分别立即放入HTK液组、HTK-V组和HTK-B组的心脏保护液中。
以HTK-V组大鼠为例，开胸取出心脏立即放入含有浓度为1.0×10-7mol/L人工合成的血管钠肽的HTK液(实施例1)中用手轻轻揉洗10s，以洗净血管、心腔中残留血液，避免血凝块形成，随后放入4℃含有1.0×10-7mol/L人工合成的血管钠肽的HTK液中浸泡6h，6h后将心脏固定于Langendorff离体心脏灌流装置上，37℃用KH液(Krebs-Henseleit缓冲液)经主动脉以75mmHg恒压灌注30min。测定血流动力学、心肌酶、抗氧化有关指标和心肌炎性因子等相关指标。得到本发明实施例1一种含有钠尿肽的离体心脏保护液1(HTK-V组)的数据。
同样的步骤，用脑钠尿肽替换人工合成的血管钠尿肽，得到本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液2(HTK-B组)的数据。
对照组应用HTK液代替发明的含有钠尿肽的离体心脏保护液进行对比实验。
大鼠心功能变化的实验结果如下表1所示：6h保存后，再灌注30min时的LVSP；LVEDP；±dp/dtmax；CF。
Figure BDA0002126915960000071
Figure BDA0002126915960000081
与对照组HTK液组比较，**p＜0.01and*p＜0.05，(mean±SD，n＝8)。
抗氧化有关指标测试结果如图1和图2所示：本实施例1、实施例2和对照组HTK液在6h冷保存、再灌注30min后，移植心脏的氧化损伤情况均得到改善。由图1和图2可知：本发明的含有钠尿肽的立体心脏保护液能够降低MDA水平、显著降低组织的SOD活性显著降低。(与对照组HTK液组比较，**p＜0.01and*p＜0.05，mean±SD，n＝8)。
心肌酶测试实验结果如图3和图4所示，心肌酶测试参数：在灌注30min后，与对照组相比，本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液组中冠脉流出液中CK-MB和LDH的量均显著降低。(与对照组HTK液组比较，**p＜0.01and*p＜0.05，mean±SD，n＝8)。
图5为本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液的实施例1、实施例2和对照组(HTK液组)对心肌细胞凋亡的影响(×400)对比图，图中A～C代表三组大鼠心肌细胞凋亡的TUNEL染色结果，A为HTK组的染色结果，B为HTK-B组的染色结果，C为HTK-V组的染色结果(展现标记出现的浅蓝色或淡蓝色为正常心肌细胞核，暗棕色或棕褐色的细胞核即为凋亡细胞核，如箭头所示。HTK液组中可见明显的暗棕色或棕褐色细胞核，HTK-B组和HTK-V组中暗棕色细胞较HTK液组明显减少。)
图6为本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液的实施例1、实施例2和对照组(HTK液组)不同组之间定量测定TUNEL染色测定凋亡率结果图，(与HTK组相比，*p＜0.05and**p＜0.01，mean±SD，n＝8)。
图7和图8分别为本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液的实施例1、实施例2和对照组(HTK液组)在冷保存6h、再灌注30min后心肌细胞炎症介质的浓度以及ELISA检测的心肌组织中TNF-α和IL-6的浓度(与HTK组相比，*p＜0.05and**p＜0.01，mean±SD，n＝8)。
由上述可见，本发明一种含有钠尿肽的离体心脏保护液能够有效增加左室收缩压LVSP、左室舒张末压LVEDP、左室收缩压最大上升速率(+dp/dtmax)、左室舒张压最大下降速率(-dp/dtmax)和冠脉流量(CF)值达7.0％以上，能够有效改善心功能；与对照组比较，HTK-V组和HTK-B组中心脏组织的脂类过氧化物MDA和超氧化物歧化酶SOD的含量优于5％以上，心肌酶肌酸激酶同工酶CK-MB和乳酸脱氢酶LDH的含量低于20％，能够有效防止心肌损伤；HTK-V组和HTK-B组能够有效防止心肌细胞凋亡，对心肌细胞凋亡率的保护作用明显优于对照组10％以上；与对照组HTK液相比本发明一种钠尿肽离体心脏保护液能够有效降低心肌细胞的炎性因子TNF-α和IL-6的含量达30％以上。

Claims (1)

1.一种含有钠尿肽的离体心脏保护液，其特征在于，所述离体心脏保护液为钠尿肽与HTK液的混合物；所述钠尿肽为心房钠尿肽、脑钠尿肽、C型钠尿肽和人工合成的血管钠肽的任一种；
所述心房钠尿肽、脑钠尿肽、C型钠尿肽、人工合成的血管钠肽在HTK液中浓度为10- 8mol/L～10-6mol/L；
所述离体心脏保护液的pH为7.2～7.4。
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