CN103601808B - 钠肽、制备方法及其在制备基因工程药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钠肽，该钠肽由脑钠肽和蛇钠肽连接组成；脑钠肽位于钠肽的N端，且蛇钠肽位于钠肽的C端；其中，脑钠肽包括由两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构。其制备方法包括：获取脑钠肽基因和蛇钠肽基因，通过PCR方法拼接合成钠肽基因；构建包括钠肽基因的表达质粒；将表达质粒转化至适宜表达菌株中进行诱导培养，诱导钠肽的表达。本发明的钠肽同时具有脑钠肽及蛇钠肽的特性，特异性作用显著增强，药物半衰期明显延长；本发明的制备方法工艺简单、切实可行；具有钠肽的基因工程药物可有效作用心脏、血管及肾脏等效应器官，并有效保护上述器官的功能、预防和治疗心脏及肾脏衰竭等疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种基于基因工程技术制备的钠肽。更具体地，本发明涉及由脑钠肽(brainnatriureticpeptide，BNP)和蛇钠肽(dendroaspisnatriureticpeptide，DNP)组成的基因工程钠肽(BDNP)、制备方法及其在制备用于治疗心血管疾病和肾脏疾病等方面的基因工程药物中的应用。
背景技术
迄今为止已发现多种利钠肽，例如心钠肽、脑钠肽、C型钠肽、尿钠肽及蛇钠肽等等。它们虽然有一些结构上的区别，但具有以下共同的生理作用：利钠肽通过与血管壁上的过氧化物酶体增殖物活化受体结合，激活鸟苷酸环化酶，引起心脏、血管、肾脏等组织细胞内环化鸟苷酸(cGMP)的浓度升高和平滑肌细胞的舒张；作为第二信使，cGMP能扩张动脉和静脉，并可快速降低全身外周动脉压、肺毛细血管楔压、肺动脉压、右房压，从而降低心室的前后负荷；利钠肽治疗能拮抗内皮素、去甲肾上腺素和醛固酮过度激活产生的心脏毒性，从而扩张肾小球的入球小动脉、抑制近曲小管对钠的吸收，使肾小球滤过率和钠排泄增加，产生明显的利尿和利尿钠作用，但不增加尿钾排泄，对肾脏的直接作用是有益的。通过上述机制利钠肽可降低心室后负荷，通过减少肾素和醛固酮的分泌和拮抗垂体后叶加压素和交感神经活性，起到排钠、利尿、降压的作用，使循环血容量降低，减轻了心室的前负荷，改善血管和肾脏的血流动力学平衡。另外，利钠肽抑制转化生长因子诱导的心肌纤维化、抑制炎性因子基因的上调表达及心肌纤维母细胞繁殖分化和胶原合成，进而逆转心室重构。
脑钠肽(BNP)最初从猪脑中分离得到，BNP前体的多肽序列在物种间具有高度同源性。人的脑钠肽由32个氨基酸组成(图1所示)，并包含由两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构。正常心肌细胞合成分泌BNP，病变心肌(例如心肌肥厚、心肌梗死和心力衰竭)也可诱导其产生。BNP与利钠肽受体A(NatriureticpeptideAreceptor，NPRA)结合，激活鸟苷酸环化酶，提高胞内cGMP水平，从而产生多种生理效应，包括利钠、利尿、血管舒张作用；还可抑制血管平滑肌细胞和成纤维细胞增殖等。但是，BNP分泌和清除的半衰期较短，分别约为2分钟和18分钟。
蛇钠肽(DNP)是一种从蛇毒中提取的利钠肽，由38个氨基酸组成(图2)。由于在人和大鼠的血和组织中也可测得DNP的表达，提示DNP可能是另一类内源性利钠肽。同样，DNP也具有促进水钠排泄，诱导血管舒张和抑制血管平滑肌细胞增殖的功能。DNP的羧基末端(即C端)由15个氨基酸组成，可增加cGMP的刺激效应，其刺激心肌细胞产生cGMP的能力是ANP的10倍。NPRC(NatriureticpeptideCreceptor，NPRC)是细胞表面的利钠肽清除受体，DNP与NPRC的亲和力低于ANP和BNP，对中性内肽酶有较强的抵抗力，提示DNP在循环中并不像其他利钠肽那样被快速清除。因此，DNP的半衰期较长。
目前市场上已经有基于基因工程制备的BNP，其主要用于治疗急性心衰。但是，由于作用位点单一且半衰期短等原因，BNP对急性心衰的治疗效果还不够理想。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中将脑钠肽应用于治疗急性心衰时，由于其作用位点特异性结合作用有限且药物半衰期短而造成的对急性心衰防治效果不理想的缺陷，提供一种基于基因工程技术制备的钠肽，这种钠肽同时具有脑钠肽及蛇钠肽的特性，特异性作用显著增强，药物半衰期显著延长，可有效作用于心脏、血管及肾脏等效应器官，并有效保护心脏、肾脏及其他器官的功能，达到保护、预防和治疗心脏、肾脏及其他器官衰竭疾病的目的。
本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现：提供一种基因工程钠肽，所述钠肽由脑钠肽和蛇钠肽连接组成；所述脑钠肽位于所述钠肽的N端，且所述蛇钠肽位于所述钠肽的C端；所述脑钠肽包括由两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构。
在上述基因工程钠肽中，所述钠肽由41个氨基酸组成，其中位于N端的脑钠肽具有26个氨基酸，位于C端的蛇钠肽具有15个氨基酸。
在上述基因工程钠肽中，所述脑钠肽为人脑钠肽且包括一个完整的人脑钠肽的环状功能区，所述蛇钠肽具有完整的蛇钠肽C端的15个氨基酸。
在上述基因工程钠肽中，所述钠肽具有序列表中的SEQIDNo:7所示的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面，提供一种上述基因工程钠肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
A：分别获取脑钠肽基因和蛇钠肽基因；
B：通过PCR方法将步骤A中的所述脑钠肽基因和蛇钠肽基因拼接合成钠肽基因；所述钠肽基因由位于其N端的所述脑钠肽基因和位于其C端的所述蛇钠肽基因连接组成；
C：采用原核表达载体构建包括所述钠肽基因的表达质粒；以及
D：将步骤C中形成的表达质粒转化至表达菌株中进行诱导培养，表达所述钠肽。
在上述钠肽的制备方法中，获取的所述脑钠肽基因为人脑钠肽基因。
在上述钠肽的制备方法中，所述步骤A包括以下子步骤：
获取全长人脑钠肽基因；
从所述全长人脑钠肽基因获取所述人脑钠肽基因的N末端基因片段：构建引物序列3：5’-GAATTCGTTCGTGGTCCGCGTAGCCCGAAGATGGTGCAA-3’和引物序列4：5’-AGCGTTCGGACGCGGGTCACGCAGGCTCGGGCAGCCCAGGCCACTGGA-3’：以及
获取所述蛇钠肽基因的C末端基因片段：构建引物序列5：5’-GTGGATCCTCAAGCGCTAGTGCTCGGAGCGTTCGGACGCGGGTCACG-3’。
在上述钠肽的制备方法中，在所述步骤D之后，所述方法还包括步骤E：离心收集所述表达菌株的菌体，进行纯化后得到所述钠肽。
在上述钠肽的制备方法中，在所述步骤C中，所述原核表达载体为pGEX-4T-1或pCW；在所述步骤D中，所述表达菌株为DH5α、BL21、Rosetta或Rosetta-gami。
根据本发明的另一方面，提供一种上述基因工程钠肽在制备用于保护、预防及治疗心血管疾病和肾脏疾病的基因工程药物中的应用。
实施本发明的技术方案，可以获得以下技术效果：BDNP具有由BNP构成的N端和由DNP构成的C端，构成N端的BNP与利钠肽受体A的结合能力强，同时DNP对中性内肽酶的酶解具有较强的抵抗力；特异性结合以及生物学作用的强度和作用时间显著增加，从而显著增加了cGMP的刺激效应，实现双重增强利钠肽的生理、药理效能；本发明的钠肽能有效作用心脏、血管及肾脏等效应器官，并有效保护心脏及肾脏及其他器官的功能；本发明的制备方法工艺简单、切实可行；具有本发明的钠肽基因工程药物可有效作用于效应器官，达到预防和治疗心脏及肾脏及其他器官衰竭疾病的目的。本发明的钠肽基因工程药物还可以用于治疗急性呼吸窘迫综合症(ARDS)，以及高血压(包括妊娠高血压)、糖尿病、肥胖症等疾病。
附图说明
以下将结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图中：
图1是人脑钠肽的示意图；
图2是蛇钠肽的示意图；以及
图3是本发明实施例中制备得到的钠肽的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的基因工程钠肽(BDNP)由脑钠肽和蛇钠肽连接组成。参见图3，脑钠肽位于该钠肽的N端，而蛇钠肽位于该钠肽的C端，其中脑钠肽包括由两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构。更具体地，本发明的钠肽由41个氨基酸组成，其中N端为脑钠肽N端的26个氨基酸，C端为蛇钠肽C端的15个氨基酸。该C端结构对中性内肽酶的酶解具有较强的抵抗力，可延长最终制备得到的钠肽的半衰期。本发明的基因工程钠肽可用于制备能保护、预防及治疗心血管疾病和肾脏疾病的基因工程药物；当然其也可应用于治疗其他多器官功能不全的药物的制备。
本发明的基因工程钠肽(BDNP)的制备方法包括以下步骤：A：分别获取脑钠肽基因和蛇钠肽基因；B：通过PCR方法将步骤A中的脑钠肽基因和蛇钠肽基因拼接合成钠肽基因；钠肽基因由位于其N端的脑钠肽基因和位于其C端的蛇钠肽基因连接组成；C：采用原核表达载体构建包括钠肽基因的表达质粒；D：将步骤C中形成的表达质粒转化至表达菌株中进行诱导培养，表达钠肽。诱导表达之后，上述方法还包括步骤E：离心收集表达菌株的菌体，进行纯化后得到基因工程钠肽。该方法操作简便、便于实现上述基因工程钠肽(BDNP)的扩大化生产。
优选地，本发明所采用的脑钠肽为人脑钠肽。以下将具体说明本发明如何通过人脑钠肽和蛇钠肽构建上述基因工程钠肽。
进一步地，上述步骤A具体包括以下步骤：
A1：人全长脑钠肽基因的钓取
设计合适的引物，从人心脏cDNA中钓取全长人脑钠肽基因(pre-BNP)。在美国国立生物信息中心(NCBI)、欧洲生物信息中心(EBI)等数据库中找到人脑钠肽(BNP)基因序列，并进行相应的生物信息学分析。
全长人脑钠肽基因(pre-BNP)的钓取：在美国国立生物信息中心(NCBI)、欧洲生物信息中心(EBI)等数据库中查找人脑钠肽基因序列，设计上游和下游引物，分别为：
上游引物的引物序列1：5’-ATGGATCCCCAGACAGCACCTTCCCGGGCG-3’,
下游引物的引物序列2：5’-TTAATGCCGCCTCAGCACTTTGCAGCCCAGGCC-3’。
以人心脏cDNA为模板，以全长人脑钠肽基因(pre-BNP)的上游和下游引物扩增，获得约400bp大小的基因片段。随后，将扩增得到的基因片段装入T载体，经基因测序分析证实基因片段为所需要的目的基因。
A2：人脑钠肽基因(BNP)N末端基因片段的钓取
设计合适的引物，从步骤A1获得的全长人脑钠肽基因(pre-BNP)中钓取人脑钠肽基因(BNP)N末端基因片段。设计含有酶切位点的上游和下游引物，分别为：
上游引物序列3：5’-GAATTCGTTCGTGGTCCGCGTAGCCCGAAGATGGTGCAA-3’,
下游引物序列4：5’-AGCGTTCGGACGCGGGTCACGCAGGCTCGGGCAGCCCAGGCCACTGGA-3’，
在上游引物中引入了EcoRI酶切位点，同时引入凝血酶蛋白切割位点，以便将目的蛋白(即BDNP)与融合蛋白酶切开。在下游引物中已经引入蛇钠肽基因的部分序列(5’-AGCGTTCGGACGCGGGTCACGCAGGCTCGG-3’)用作后续PCR扩增拼接合成钠肽(BDNP)。
A3：蛇钠肽基因C末端基因片段的合成
在美国国立生物信息中心(NCBI)、欧洲生物信息中心(EBI)等数据库中，找到蛇钠肽(DNP)基因序列，并进行相应的生物信息学分析。合成蛇钠肽(DNP)基因C末端序列，设计同时含有部分脑钠肽(BNP)基因的基因序列和酶切位点，设计的引物序列为
引物序列5：5’-GTGGATCCTCAAGCGCTAGTGCTCGGAGCGTTCGGACGCGGGTCACG-3’，
在引物中引入了BamHI酶切位点和部分脑钠肽(BNP)基因序列(5’-AGCGTTCGGACGCGGGTCACGCAGGCTCGG-3’)用作后续PCR扩增拼接合成钠肽(BDNP)。
上述步骤B具体包括以下步骤——钠肽(BDNP)基因的PCR拼接扩增。以人全长脑钠肽基因(pre-BNP)为模板，分别以引物序列3和引物序列4为上游和下游引物扩增，获得约108bp大小的基因片段，其中含有BNPN末端78bp片段和DNPC末端30bp片段。随后，以上述108bp片段为模板，分别以引物序列3和引物序列5为上游和下游引物扩增，获得约123bp大小的基因片段，其中含有BNPN末端78bp片段和DNPC末端45bp片段，即为钠肽(BDNP)基因片段(参见序列表中序列6)。将扩增得到的BDNP基因片段装入T载体，经基因测序分析证实各基因片段为所需要的目的基因。
上述步骤C具体包括以下流程——构建表达质粒：将钠肽BDNP基因片段的PCR产物经EcoRI和BamHI酶切后连接插入同样酶切的原核表达载体pGEX-4T-1或pCW中，构建成含有BDNP基因的重组质粒pGEX-BDNP或pCW-BDNP；考虑到后续的纯化，优选使用重组质粒pGEX-BDNP。
由于基因工程药物的表达水平与表达菌株密切相关，因此，本发明中表达菌株的选取也很重要，考虑表达产物的产量、可溶性以及宿主菌株的生长状态，本发明选择了多种表达菌株DH5α、BL21、Rosetta或Rosetta-gami作为宿主菌，并优选使用BL21和Rosetta来建立表达菌株。
以下的实施例中将详细说明如何采用原核表达载体pGEX-4T-1和pCW构建原核表达质粒pGEX-BDNP和pCW-BDNP并在表达菌株BL21和Rosetta中实现钠肽(BDNP)的高效表达。
实施例1：
将经PCR拼接扩增、并经测序的钠肽(BDNP)基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中，构建成含有钠肽(BDNP)的原核表达质粒pGEX-BDNP。采用BL21和Rosetta作为表达菌株。提取高质量高浓度的原核表达质粒pGEX-BDNP，利用冷CaCl2法转化宿主细菌，将上述质粒分别转化到BL21和Rosetta菌株中，37℃过夜培养；然后挑取表达菌株，接种LB培养基(加入氨苄青霉素，终浓度为100μg/ml)，37℃过夜培养后收集菌液，超声波破碎后提取蛋白，进行WesternBlot检测。
实施例2：
将经PCR拼接扩增、并经测序的钠肽(BDNP)基因克隆至原核表达载体pCW中，构建成含有钠肽(BDNP)的原核表达质粒pCW-BDNP。采用BL21和Rosetta作为表达菌株。提取高质量高浓度的原核表达质粒pCW-BDNP，利用冷CaCl2法转化宿主细菌，将上述质粒分别转化到BL21和Rosetta菌株中，37℃过夜培养；然后挑取表达菌株，接种LB培养基(加入氨苄青霉素，终浓度为100μg/ml)，37℃过夜培养后收集菌液，超声波破碎后提取蛋白，进行WesternBlot检测。
上述步骤E中，对实施例1-2的钠肽进行纯化包括通过离心收集表达菌株，然后通过亲和层析分离出钠肽的融合蛋白，利用凝血酶酶切去除标签蛋白，最后分离纯化获得钠肽(BDNP)。
综上所述，本发明的钠肽同时具有脑钠肽及蛇钠肽的特性，特异性作用显著增强，药物半衰期显著延长；本发明的制备方法工艺简单、切实可行；具有钠肽的基因工程药物可有效作用心脏、血管及肾脏等效应器官，并有效保护心脏及肾脏的功能，预防和治疗心脏及肾脏衰竭等疾病。
Claims (5)
1.一种基因工程钠肽，其特征在于，所述钠肽由脑钠肽和蛇钠肽连接组成；所述脑钠肽位于所述钠肽的N端，且所述蛇钠肽位于所述钠肽的C端；所述脑钠肽包括由两个半胱氨酸残基形成的二硫键环状结构；所述脑钠肽为人脑钠肽且包括一个完整的人脑钠肽的环状功能区，所述蛇钠肽具有完整的蛇钠肽C端的15个氨基酸；
其中，所述钠肽的基因片段为序列表中的SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，所述钠肽为序列表中的SEQIDNo:7所示的氨基酸序列。
2.一种权利要求1的基因工程钠肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A：分别获取脑钠肽基因和蛇钠肽基因，其中所述脑钠肽基因为人脑钠肽基因；
B：通过PCR方法将步骤A中的所述脑钠肽基因和蛇钠肽基因拼接合成钠肽基因；所述钠肽基因由位于其N端的所述脑钠肽基因和位于其C端的所述蛇钠肽基因连接组成；
C：采用原核表达载体构建包括所述钠肽基因的表达质粒；以及
D：将步骤C中形成的表达质粒转化至表达菌株中进行诱导培养，表达所述钠肽；
所述步骤A包括以下子步骤：
获取全长人脑钠肽基因；
从所述全长人脑钠肽基因获取所述人脑钠肽基因的N末端基因片段：构建引物序列3：5’-GAATTCGTTCGTGGTCCGCGTAGCCCGAAGATGGTGCAA-3’和引物序列4：5’-AGCGTTCGGACGCGGGTCACGCAGGCTCGGGCAGCCCAGGCCACTGGA-3’：以及
获取所述蛇钠肽基因的C末端基因片段：构建引物序列5：5’-GTGGATCCTCAAGCGCTAGTGCTCGGAGCGTTCGGACGCGGGTCACG-3’。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤D之后，所述方法还包括步骤E：离心收集所述表达菌株的菌体，进行纯化后得到所述钠肽。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤C中，所述原核表达载体为pGEX-4T-1或pCW；在所述步骤D中，所述表达菌株为DH5α、BL21、Rosetta或Rosetta-gami。
5.权利要求1的基因工程钠肽在制备用于保护、预防及治疗心血管疾病和肾脏疾病的基因工程药物中的应用。
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