CN118599854A

CN118599854A - 编码best1基因的多核苷酸、载体、应用和基因治疗药物

Info

Publication number: CN118599854A
Application number: CN202410641503.0A
Authority: CN
Inventors: 雷博; 王卫萍; 刘婧阳
Original assignee: Henan Provincial Eye Hospital
Current assignee: Henan Provincial Eye Hospital
Priority date: 2024-05-22
Filing date: 2024-05-22
Publication date: 2024-09-06

Abstract

本发明提供了一种编码BEST1基因的多核苷酸、载体、应用和基因治疗药物，涉及生物医药技术领域。该编码BEST1基因的多核苷酸经密码子优化，序列如SEQ ID NO.1所示，提供了表达密码子优化的功能性BEST1的腺相关病毒载体，优化后BEST1基因在宿主中能够稳定长效的表达。将其应用于基因治疗可以纠正或补偿受试者BEST1基因缺陷或缺失引起的疾病，在多种遗传性疾病，尤其是遗传性眼病中有着广阔的应用前景。

Description

编码BEST1基因的多核苷酸、载体、应用和基因治疗药物

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种编码BEST1基因的多核苷酸、载体、应用和基因治疗药物。

背景技术

BEST1基因突变可引起BEST病，属于视网膜色素上皮和光感受器层面疾病。患病率约为1:5000～1:67000，通常在儿童期或成年早期发病。至今已发现超过300种不同BEST1位点突变引起的BEST病变。其中常染色体隐形遗传BEST1病，BEST卵黄样黄斑营养不良和常染色体显性遗传玻璃体视网膜脉络膜病统称BEST病。该病表现为广泛性视网膜色素上皮细胞(RPE)异常，伴有过多的脂褐素聚集，局部RPE萎缩；RPE下方异常葡萄糖样纤维物质沉积；眼电图(EOG)分光峰/暗谷比小于1.5。目前对该病暂无特殊治疗方法，以观察和治疗并发症为主。

BEST1基因定位于人类11号染色体长臂11q13，包含11个外显子，生成一个1758bp转录本。它编码一种由585个氨基酸组成的跨膜蛋白bestrophin-1(BEST1)，其分子量约为68kDa。定位于RPE细胞膜基底侧，也可在细胞内表达。BEST1是一种多功能蛋白，多项研究显示它是一种可被细胞内Ca²⁺激活的蛋白Cl^-通道。其突变导致氯离子电流大大降低或缺失。BEST1蛋白缺失或异常引起RPE细胞微绒纤毛收缩，影响RPE维持正常的胞内和胞外离子微环境，阻碍RPE对感光细胞外节的吞噬，致使外节沉积在RPE和感光细胞之间，感光细胞长期存在有毒未被代谢的外节，最终造成感光细胞的破坏。因此开发和BEST1基因相关的基因治疗产品，以纠正或补偿受试者自身BEST1基因的缺失或缺陷，有助于BEST病的治疗。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的第一目的在于提供一种编码BEST1基因的多核苷酸，其能够提高BEST1蛋白的表达量。基于该多核苷酸，本发明还提供了携带其的载体和应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

第一方面，提供了一种编码BEST1基因的多核苷酸，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，提供了一种载体，该载体携带第一方面的编码BEST1基因的多核苷酸。

可选的实施方式中，所述载体包括腺相关病毒载体，优选为AAV8。

可选的实施方式中，所述载体中，所述编码BEST1基因的多核苷酸被CAG启动子调控表达，

可选的实施方式中，所述载体由pAAV-CAG-3FLAG-tWPA载体构建得到。

第三方面，还提供了一种重组细胞，所述重组细胞的遗传物质整合有第一方面的多核苷酸，或所述重组细胞中含有第二方面的载体。

第四方面，还提供了第一方面的编码BEST1基因的多核苷酸，或第二方面的载体，或第三方面的重组细胞在制备BEST1蛋白中的应用。

可选的实施方式中，所述应用包括应用于Best1基因敲除的小鼠。

第五方面，还提供了第一方面的编码BEST1基因的多核苷酸，或第二方面的载体，或第三方面的重组细胞在制备药物中的应用，所述药物用于治疗、预防或减轻BEST1基因缺陷或缺失导致的相关疾病。

可选的实施方式中，所述疾病包括BEST病。

第六方面，还提供了一种基因治疗药物，该基因治疗药物含有第一方面的编码BEST1基因的多核苷酸，或第二方面的载体。

可选的实施方式中，所述药物是注射剂，含有第二方面的载体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的编码BEST1基因的多核苷酸经过密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。优化后的BEST1基因与未优化基因相比，核苷酸一致性为80.52％，氨基酸序列一致性为100％。优化后BEST1基因在宿主中能够稳定长效的表达。将其或含有其的载体应用与基因治疗可以纠正或补偿受试者BEST1基因缺陷或缺失，在多种遗传性疾病，尤其是遗传性眼病中有着广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为优化前后BEST1基因序列对比结果(第1～645位)；

图2为优化前后BEST1基因序列对比结果(第1300～1755位)；

图3为优化前后BEST1基因表达的氨基酸序列对比；

图4为实施例2构建的质粒pAAV-CAG-OPBEST1-3FLAG-tWPA的质粒图谱；

图5为实施例3中各质粒pAAV-OPBEST1、pAAV-BEST1和pAAV-NC转染293T细胞后BEST1蛋白的免疫印记结果；

图6为实施例3中各质粒pAAV-OPBEST1、pAAV-BEST1和pAAV-NC转染293T细胞后BEST1蛋白的表达量；

图7为实施例5中CRISPR/Cas9技术构建Best1基因敲除小鼠模型的基因敲除示意图；

图8为实施例5中水平凝胶电泳Best1基因敲除小鼠模型的目的片段扩增结果；

图9为实施例5中分别注射AAV8-OPBEST1、AAV8-BEST1和AAV8-TWPA的Best1基因敲除小鼠模型的RPE细胞中BEST1蛋白的免疫印记结果；

图10为实施例5中分别注射AAV8-OPBEST1、AAV8-BEST1和AAV8-TWPA的Best1基因敲除小鼠模型的RPE细胞中BEST1蛋白的表达量；

图11为实施例5中HE染色检测分别注射AAV8-OPBEST1和AAV8-TWPA的Best1基因敲除小鼠模型，注射AAV8-TWPA的野生型小鼠的视网膜和RPE基底上层绒毛形态结果；

图12为实施例5中免疫荧光检测分别注射AAV8-OPBEST1和AAV8-TWPA的Best1基因敲除小鼠模型，注射AAV8-TWPA的野生型小鼠的视网膜和RPE基底上层MCT1蛋白定位结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明中，术语“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。当多核苷酸编码蛋白或多肽，编码可选地为编码正义链或反义链。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可任意互换使用。

可选的实施方式中，核酸分子是RNA或DNA，核酸分子可以是单链或双链的，优选是双链DNA。当将核酸分子与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸分子是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。当其连入载体时优选采用DNA。

在本发明中，术语“载体”是指可将遗传元件(例如前述多核苷酸)操作性地插入其中并使该遗传元件获得表达的一种运载工具，例如产生由该遗传元件编码的蛋白质、RNA或DNA，或者复制所述遗传元件。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒(cosmid)、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。载体可以是表达载体或克隆载体。在一些实施方案中，本发明提供的载体(例如表达载体)含有本发明所述的编码BEST1基因的多核苷酸、至少一个可操作地连接至所述核酸序列的启动子(例如，SV40、CMV、EF 1α)，以及至少一个标记。

在本发明中，术语“重组细胞”是指可以或已经导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。外源多核苷酸可以整合或不整合至“重组细胞”的基因组中。当该重组细胞中包含有载体，可以将载体导入到细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达目的蛋白。对该重组细胞进行培养，即可以获得相应目的蛋白。

在本发明中，术语“BEST1病”包括常染色体隐形遗传BEST1病，BEST卵黄样黄斑营养不良和常染色体显性遗传玻璃体视网膜脉络膜病。

第一方面，提供了一种编码BEST1基因的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该多核苷酸的编码序列经过密码子优化，优化后的BEST1基因与未优化基因相比，核苷酸一致性为80.52％，氨基酸序列一致性为100％。优化后核苷酸序列的CAI、CBI和FOP均有所升高，ENC有所降低，且优化后基因CAI数值距离1更近，提示优化后基因在宿主中表达水平更高，表明优化BEST1基因序列密码子得到BEST1蛋白较好的表达。

可选的实施方式中，所述载体包括腺相关病毒(Adeno associated virus，AAV)载体，AAV载体具有基因传递效率高，致病性低和安全性的优点。示例性的AAV包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12或rh10或它们经改造的变体，载体优选为AAV8。

可选的实施方式中，所述载体中还含有任选的调控元件、筛选标记基因、自剪切多肽序列、用于同源重组的同源臂和用于重组或整合的酶的识别位点中的一种或多种。

可选的实施方式中，所述调控元件包括但不限于启动子、内含子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点和核酸限制性位点中的一种或多种。

启动子可以是组成型的或是诱导型的，示例性的启动子包括但不限于L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6和Grm6增强子SV40融合蛋白中一种或集中的组合。本领域技术人员可以依据本领域的一般常识选择合适的启动子。

可选的实施方式中，载体中所述编码BEST1基因的多核苷酸被CAG启动子调控表达。

可选的实施方式中，选择诱导型的启动子调控所述编码BEST1基因的多核苷酸，以实现BEST1蛋白的异源表达。

可选的实施方式中，标记基因包括但不限于编码蛋白标签的基因、编码荧光蛋白的基因和编码筛选标记基因的一种或多种。

蛋白标签的实例包括但不限于Flag标签、3×Flag标签、His标签、GST标签、HA标签、Sumo标签、Avi标签、MBP标签、NusA标签、SNAP标签和C Myc标签中的一种或几种。

荧光蛋白的实例包括但不限于绿色荧光蛋白GFP、增强型绿色荧光白EGFP、黄色荧光蛋白YFP、红色荧光蛋白mCherry、别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、藻红青蛋白和藻红蛋白R中的一种或几种。

筛选标记的实例包括但不限于卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因和潮霉素抗性基因中的一种或多种。

可选的实施方式中，所述载体包括由载体pAAV-CAG-3FLAG-tWPA构建得到的载体pAAV-CAG-OPBEST1-3FLAG-tWPA。整合有优化BEST1基因密码子区的pAAV-CAG-3FLAG-tWPA载体能够稳定高表达BEST1蛋白。

第三方面，还提供了一种重组细胞，所述重组细胞的遗传物质整合有第一方面的多核苷酸，或所述重组细胞中含有第二方面的载体。所述遗传物质包括细胞的内源或外源遗传物质，内源遗传物质例如细胞的基因组；外源遗传物质例如在细胞中稳定表达的表达载体。

可选的实施方式中，所述重组细胞为原核细胞或真核细胞。

可选的实施方式中，所述真核细胞包括哺乳动物细胞。

可选的实施方式中，所述哺乳动物细胞包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞或293T细胞(人胚肾细胞)。

第四方面，还提供了第一方面的编码BEST1基因的多核苷酸，或第二方面的载体，或第三方面的重组细胞在制备BEST1蛋白中的应用。由于本发明提供的编码BEST1基因的多核苷酸经密码子优化，经实验验证其在异源宿主中能高表达BEST1蛋白，因此其可应用于制备BEST1蛋白，提高BEST1蛋白的产量。

第五方面，还提供了第一方面的编码BEST1基因的多核苷酸，或第二方面的载体，或第三方面的重组细胞在制备药物中的应用，所述药物用于治疗、预防或减轻BEST1基因缺陷或缺失导致的相关疾病。可选的实施方式中，所述疾病包括BEST病。

基因治疗可将外源正常基因导入受试者以纠正或补偿缺陷及异常基因引起的疾病，本发明提供的编码BEST1基因的多核苷酸或含有其的载体可提高受试者BEST1基因含量，从而纠正或补偿缺受试者自身BEST1基因缺陷。

可选的实施方式中，所述基因治疗药物还包括药学上可接受的辅料，包括但不限于溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、填充剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、抑菌剂、助悬剂、芳香剂、抗氧剂、螯合剂、pH调节剂、吸附剂、表面活性剂、保护剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、释放调节剂、硬化剂、空心胶囊和基质材料中的一种或多种。

可选的实施方式中，所述基因治疗药物的剂型可选自本领域任选的可接受的剂型，包括但不限于注射剂、吸入制剂、喷雾剂、滴剂或口服制剂。适当的制剂形式取决于所选择的给药途径，本领域技术人员可以按照本领域熟知的常识进行制造，以及选择合适的辅料。

可选的实施方式中，所述药物是注射剂，含有第二方面的载体，其中载体为腺相关病毒载体。

可选的实施方式中，所述药物的受试者包括哺乳动物，所述哺乳动物包括但不限于人、猪、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊或山羊。所述受试者可以为癌症患者，也可以为经人工造模得到的疾病动物模型。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

1.BEST1基因的密码子优化和偏好性分析

通过OptimumGen对BEST1基因的密码子进行优化设计。通过GenRCA Rare CodonAnalysis Tool软件分析优化后BEST1和优化前BEST1的CAI、CBI、FOP、ENC等参数对比分析。其中CAI和ENC主要指征密码子偏好性。CAI密码子适应指数(Codon Adaptation Index，CAI)是一种量化基因内密码子适应程度的指标，通过将密码子的使用情况与首选或最优密码子进行比较，其取值范围为0～1。CAI得分越高，表明基因中的密码子使用更倾向于在高表达的参考集中观察到的首选密码子。值越高得分越高的基因，翻译效率越高，蛋白表达水平也越高。CBI密码子偏好性指数(Codon bias index,CBI)反应了一个基因中高表达优越密码子的组分情况。对目的宿主自身的基因，该指数和ENC有很好的相关性，可以明确地反映外源基因在目的宿主中可能的表达情况。FOP最优密码子使用频率(Frequencey ofoptimal codos,FOP)指在某物种高表达基因中使用频率最高的密码子。FOP的取值范围为0到1之间，1表示只有最优密码子被使用，0则表示没有最优密码子被使用到。ENC用于计算有效密码子数(ENC)，这个指数可以评估在一个特定的基因或基因组内使用同义密码子的偏见或偏好的程度。ENC的理论值从61(没有偏差，所有同义密码子都被统一使用)到20(在同义密码子的使用中观察到最大偏差或偏好)。较低的ENC值表明对特定氨基酸的特定密码子有更强的倾向，而较高的ENC值表明对同义密码子的利用更平衡或均匀。

本实施例中未优化的BEST1 DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，密码子优化的BEST1 DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(以下简称OPBEST1)。序列SEQ ID NO.1和序列SEQ ID NO.3的对比结果如表1、图1～图3所示。

表1

	CAI	CBI	FOP	ENC
					未优化BEST1	0.83	0.26	0.5	44.94
优化的BEST1	0.94	0.59	0.73	31.23

从表1可以看出BEST1的CAI为0.83，CBI为0.26，FOP为0.5，ENC为44.94。OPBEST1的CAI为0.94，CBI为0.59，FOP为0.73，ENC为31.23。BEST1与OPBEST1的CAI值差异较大，且OPBEST1的CAI数值距离1更近，表明优化后基因表达水平更高。OPBEST1基因序列的ENC值相比于初始BEST1基因序列更低，表明OPBEST1的偏好性更强。OPBEST1基因序列的FOP高于初始BEST1基因序列，说明最优密码子使用频率更高。OPBEST1基因序列的CBI值明显高于BEST1，说明OPBEST1在宿主中表达效率更高。

从图1和图2可以看出约80.53％的序列相似性的天然BEST1(SEQ ID NO.3，上部序列)与密码子优化的OPBEST1(SEQ ID NO.1，下部序列)，且二者表达的氨基酸序列重合率100％(图3)，均如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

pAAV-CAG-OPBEST1-3FLAG-tWPA质粒构建

构建：设计引物通过PCR扩增出OPBEST1和BEST1编码区，退火温度为60℃。通过同源重组法将OPBEST1和BEST1的CDS区分别连接到pAAV-CAG-3FLAG-tWPA质粒中，通过无内毒素质粒大提试剂盒提取pAAV-CAG-OPBEST1-3FLAG-tWPA(pAAV-OPBEST1)质粒(图谱如图4所示)和pAAV-CAG-BEST1-3FLAG-tWPA(pAAV-BEST1)质粒。

实施例3

pAAV-OPBEST1和pAAV-BEST1体外转染293T细胞：

将两种质粒分别转染293T细胞。6孔板铺8×10⁵每孔细胞，每孔2μgDNA、6μllip3000和4μl P3000转染试剂，转染48h，收取细胞，提取蛋白，结果如图5和图6所示，免疫印记证实pAAV-OPBEST1载体能高表达BEST1蛋白。

实施例4

AAV8-OPBEST1、AAV8-BEST1病毒载体制备

将293T细胞传代到100mm平皿中用于转染，确认细胞密度达到约80-90％的汇合率即可进行转染。三质粒转染：pAAV-RC质粒10μg，pHelple质粒20μg，pAAV-OPBEST1或pAAV-BEST1质粒10μg，混合到转染试剂Lipofiter中，轻柔缓慢加入细胞中。转染6h更换含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基。转染72h后，将含有AAV颗粒的细胞用细胞刮轻轻刮下，收集于15mL离心管中，150×g离心3min收集细胞，去除培养基上清，用PBS洗一次，最后再用300μL PBS重悬细胞。准备37℃恒温水浴锅和液氮，将装有液氮及37℃水浴反复冻融三次。4℃，2000×g，5min，去除细胞碎片，收集含AAV颗粒的裂解上清。病毒纯化：在超速离心管中加入2mL的1.4g/mL CsCl溶液。再加入3mL 1.3g/mL的CsCl溶液。最后加入5mL的病毒悬浮液。22800rpm，4℃离心2.5h。收集密度在1.30-1.40g/mL之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10mM的EDTA Na2煮沸10min)。在透析缓冲液(50g蔗糖，10mL 1M pH为8.0的Tris-HCl液，2mL 1M MgCl2溶液定容至1000mL)中，4℃透析过夜，中间更换透析液一次。收集病毒，于-80℃保存。病毒滴度测定：定量PCR检测病毒基因组中BEST1的DNA拷贝数，结果如表2所示。

表2AAV8-OPBEST1载体滴度测定结果

实施例5

体内治疗效果验证：

1.利用CRISPR/Cas9技术构建Best1基因敲除小鼠模型：

如图7模拟图所示，采用CRISPR/Cas9技术，设计sgRNA，删除Best1编码区，达到敲除目的。

(1)制备sgRNA及Cas9-mRNA：以sgRNA-Vector为模板PCR扩增出Best1-sgRNA的DNA片段，然后回收作为sgRNA体外转录的模板。再经过sgRNA体外转录与纯化回收，分装保存于-80℃冰箱备用。将Cas9转录载体线性化，再经过体外转录与纯化回收分装保存于-80℃冰箱备用。

(2)显微注射：将Cas9-mRNA、Best1-sgRNA共同显微注射到C57小鼠胚胎中，注射后将胚胎移植到代孕受体小鼠的输卵管内。

(3)胚胎移植及F0小鼠鉴定与繁殖：将显微注射后的受精卵送回到代孕母鼠输卵管中，胚胎移植后约21天小鼠出生，出生2周左右完成基因型鉴定。

(4)Best1-KO小鼠鉴定：利用One Step Mouse Genotyping Kit试剂盒提取小鼠DNA。以提取DNA为模板，设计两对引进行PCR反应。

引物1-F1：5’-AAGCACTTGTTTGGTGGAGCACCC-3’(SEQ ID NO.4)；

引物R1：5’-TTGTTTTCATGGCCACGGTATTG-3’(SEQ ID NO.5)。

引物2-F1：5’-AAGCACTTGTTTGGTGGAGCACCC-3’(SEQ ID NO.4)；

引物R2：5’-GTGTTTATCGGTCTATTGTTGCC-3’(SEQ ID NO.6)。

扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸35s，35个循环；72℃延伸5min。水平电泳跑胶。F1-R1扩增的567bp片段，F1-R2未扩增出片段即证明Best1全基因敲除，结果如图8所示，Best1基因敲除小鼠未扩增出目的片段，证明Best1-KO模型鼠成功构建。

2.AAV8-OPBEST1介导的基因治疗能改善Best1-KO小鼠RPE形态

(1)免疫印迹证实AAV8-OPBEST1在小鼠RPE细胞(视网膜色素上皮细胞)中高表达BEST1蛋白。在Best1-KO小鼠在出生21天时随机分为三组，每组10～20只，视网膜下分别注射1μL(1ⅹ10¹²vg/mL)AAV8-TWPA对照病毒，AAV8-BEST1和AAV8-OPBEST1病毒载体，1个月后观察RPE中BEST1蛋白表达量。图9和图10显示Best1-KO小鼠注射AAV8-OPBEST1组RPE细胞中BEST1蛋白表达量明显比AAV8-BEST1组表达量高，证实视网膜下注射AAV8-OPBEST1能够使BEST1蛋白高表达。

(2)HE染色证实AAV8-OPBEST1改善Best1-KO小鼠RPE形态。在Best1-KO小鼠在出生21天时随机分为两组，每组10～20只，视网膜下分别注射1μL(1ⅹ10¹²vg/mL)AAV8-TWPA对照病毒和AAV8-OPBEST1，同龄野生型小鼠注射对照病毒AAV8-TWPA，1个月后观察视网膜和RPE基底上层绒毛形态。如图11所示，HE结果证实视网膜下注射AAV8-OPBEST1后可明显改善Best1-KO小鼠的RPE绒毛形态，同时改善其功能。

(3)免疫荧光证实AAV8-OPBEST1改善Best1-KO小鼠RPE细胞绒毛伸展。在Best1-KO小鼠在出生21天时随机分为两组，每组10～20只，视网膜下分别注射1μL(1ⅹ10¹²vg/mL)AAV8-TWPA对照病毒和AAV8-OPBEST1，同龄野生型小鼠注射对照病毒AAV8-TWPA，1个月后观察视网膜和RPE基底上层MCT1蛋白定位。如图12所示，AAV8-OPBEST1组RPE中绒毛蛋白MCT1形态相对AAV8-TWPA组更明显，证实视网膜下注射AAV8-OPBEST1后可明显改善Best1-KO小鼠RPE细胞中MCT1蛋白定位。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.编码BEST1基因的多核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.载体，其特征在于，携带权利要求1所述的编码BEST1基因的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体包括腺相关病毒载体；

可选地，所述腺相关病毒载体包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12或rh10或它们经改造的变体；

可选地，所述腺相关病毒载体为AAV8。

4.根据权利要求2或3所述的载体，其特征在于，所述载体中，所述编码BEST1基因的多核苷酸被CAG启动子调控表达；

可选地，所述载体由pAAV-CAG-3FLAG-tWPA载体构建得到。

5.重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的遗传物质整合有权利要求1的多核苷酸，或所述重组细胞含有权利要求2～4任一项所述的载体。

6.权利要求1所述多核苷酸，或权利要求2～4任一项所述的载体，或权利要求5所述的重组细胞在制备BEST1蛋白中的应用。

7.权利要求1所述多核苷酸，或权利要求2～4任一项所述的载体，或权利要求5所述的重组细胞在制备药物中的应用，所述药物用于治疗、预防或减轻BEST1基因缺陷或缺失导致的相关疾病。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述疾病包括BEST病；

可选地，所述应用包括应用于Best1基因敲除的小鼠。

9.基因治疗药物，其特征在于，含有权利要求1所述多核苷酸，或权利要求2～4任一项所述的载体。

10.根据权利要求9所述的基因治疗药物，其特征在于，所述药物是注射剂，含有权利要求2～4任一项所述的载体。