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CN118406751B - 用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的tsRNA、试剂盒及其应用 - Google Patents

用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的tsRNA、试剂盒及其应用 Download PDF

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CN118406751B
CN118406751B CN202410585608.9A CN202410585608A CN118406751B CN 118406751 B CN118406751 B CN 118406751B CN 202410585608 A CN202410585608 A CN 202410585608A CN 118406751 B CN118406751 B CN 118406751B
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sepsis
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kit
seq
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Abstract

本发明提供了用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的tsRNA、试剂盒及其应用，本申请通过实验发现tsRNA在脓毒血症AKI的患者血清和尿液中水平显著升高。进一步发现，tsRNA作为脓毒血症AKI的标志物，灵敏度达到85％以上，特异度达到72％以上。

Description

用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的tsRNA、试剂盒 及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，特别涉及用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的tsRNA、试剂盒及其应用。
背景技术
脓毒血症是由严重感染引起的，并发展为多器官衰竭。2015年～2016年，中国大约有23万脓毒症患者在ICU接受治疗，平均每五位ICU患者，就有一位患脓毒症，而这些患者的90天死亡率高达35.5％
约30％-60％的脓毒血症患者会发展为脓毒血症急性肾损伤(脓毒血症AKI)。在我国，脓毒症患者中急性肾损伤发生率为47.1％。一项纳入了欧洲多中心ICU 1177例脓毒症患者的前瞻性队列研究结果显示，脓毒血症AKI的病死率达41％。即使有感染源控制、抗生素和肾脏替代治疗，脓毒血症AKI也预示着非常高的死亡率。如何及时预测、发现脓毒血症，干预治疗、改善患者预后、降低脓毒血症AKI患者死亡率一直是临床上待攻克的难题。
早期诊断可能为及时干预提供更好的机会。因此，寻求新的早期生物标记物对脓毒症AKI的早期诊断非常重要。现在亟需有一款特异性高、灵敏度高的志物，用于脓毒血症AKI诊断、监测和预警。
发明内容
本发明目的是提供用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的tsRNA、试剂盒及其应用，本申请通过实验发现：相比健康人(healthy control)和脓毒血症无AKI(sepsis)的患者，tsRNA在脓毒血症AKI(septic AKI)的患者血清和尿液中水平显著升高。进一步发现，tsRNA作为脓毒血症AKI的标志物，其敏感性、特异性和阳性预测值比现有的标志物如KIM-1、血清肌酐和尿素高。表明tsRNA可以作为一种有用的标志物用于脓毒血症AKI诊断、监测和预警。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案；
在本发明的第一方面，提供了用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的的tsRNA标志物，所述标志物包括以下3条tsRNA中的一种：
5'Leader-LeuCAG-2-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
tRF3b-LeuTAG-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
3'tiRNA-49-LeuTAG-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的第二方面，提供了血清tsRNA标志物在制备用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的试剂盒中的应用。
进一步地，所述用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的试剂盒包括tsRNA分子标志物的检测试剂和/或检测引物和/或检测试剂盒。
进一步地，所述检测引物包括如下3对引物对中的一种：
引物对1：核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；
引物对2：核苷酸序列如SEQ ID NO.6-7所示；
引物对3：核苷酸序列如SEQ ID NO.8-9所示。
在本发明的第三方面，提供了一种用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的试剂盒，包括：所述的tsRNA分子标志物的检测试剂。
所述检测tsRNA是指在血液、尿液或肾脏组织中通过生物学或化学等方法测定tsRNA的含量水平。
在本发明公开的内容基础上，本领域技术人员容易想到通过多种方式检测tsRNA的含量，包括但不限于聚合酶链式反应，无酶扩增法，测序法、芯片法、质谱法、化学发光法、电化学法、核酸杂交法等手段检测此种tsRNA，也可以是利用其他类似的技术手段检测tsRNA。
例如用生物芯片检测tsRNA在脓毒血症AKI患者的血清和尿液中含量，利用生物芯片上固定的特异性探针来识别和量化tsRNA的含量。tsRNA是一类短小的非编码RNA，在炎症和细胞应激等生理和病理过程中起重要作用。通过将患者血清和尿液中的RNA提取并标记，然后加到生物芯片上进行杂交反应，利用探针与tsRNA结合的特异性来检测和量化tsRNA的含量。这样可以快速、高通量地检测大量样本中tsRNA的含量，为脓毒血症AKI患者的诊断和治疗提供重要参考；在脓毒血症AKI(脓毒血症相关性肾损伤)患者中，tsRNA的含量可能会发生变化，因此也可以利用体外PCR技术，用于扩增DNA片段的技术，定量检测PCR扩增产物的数量，从而检测tsRNA的含量，为这些患者的诊断和治疗提供重要参考。基于此，无论以何种方式检测tsRNA的含量，这对本领域技术人员来说是容易实现的，其均是属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述检测部位包括但不限于外周血、尿液和肾脏组织，其他的脓毒血症AKI标志物所在人体的部位(如人造瘘液或其它种类的体液)也属于本发明的保护范围。
作为一种可选的实施方式，所述检测试剂包括实时定量PCR试剂，所述实时定量PCR试剂包括检测引物，所述检测引物包括如下3对引物对中的一种：
引物对1：核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；
引物对2：核苷酸序列如SEQ ID NO.6-7所示；
引物对3：核苷酸序列如SEQ ID NO.8-9所示。
进一步地，所述实时定量PCR试剂还包括：用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板和PCR反应常规试剂。所述用于均一化的内参引物为以U6为内参的引物，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。所述阳性对照模板为经测序验证过的tsRNA PCR扩增产物；所述阴性对照模板为去离子水。
作为一种可选的实施方式，所述检测试剂还包括RNA提取试剂和/或逆转录反应试剂。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1、本发明提供的用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的tsRNA、试剂盒及其应用，本发明的研究首次发现，相比健康人群(healthy control)和脓毒血症无急性肾损伤(sepsis)的患者，tsRNA在脓毒血症AKI的患者血清和尿液中含量显著升高。通过进一步的临床队列研究，tsRNA比现有的脓毒血症AKI标志物(KIM-1,肌酐和尿素)在预测、诊断和监测中的效应更好。说明了tsRNA是脓毒血症AKI的有用标志物。相应的，tsRNA的检测技术，可以应用于制备此种脓毒血症AKI标志物的方法和手段，本发明为预测、诊断和监测脓毒血症AKI提供了一种新的思路和策略。
2、本发明通过检测tsRNA实现脓毒血症AKI的预测和诊断，进而起到提早干预、病程监测、减少该疾病死亡率以及减轻患者负担的效果。
3、本发明将tsRNA的表达水平用于辅助诊断脓毒血症急性肾损伤患者，单独检测血浆tsRNA的表达水平区分脓毒血症急性肾损伤患者和正常对照者，灵敏度达到85％以上，特异度达到72％以上(图5)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为实施例中脓毒血症AKI患者与健康对照组的血清和尿液标本中tsRNAs相对表达水平图谱。其中，图1A为脓毒血症AKI患者与健康对照的血清中tsRNA的热图(每组3个样本)，图1B为脓毒血症AKI患者与健康对照的尿液中tsRNA的热图(每组3个样本)；
图2为实施例中脓毒血症AKI患者以及正常对照组的血液标本和尿液标本中显著上调和下调的tsRNA(虚线截断线对应|FC|>＝1.5和p<0.05；红点为上调，蓝点为下调)。其中，图2A为血液标本中tsRNA在两组患者中的表达散图，图2B为尿液本中tsRNA在两组患者中的表达散图；
图3为实施例中脓毒血症AKI患者与健康对照组的血清和尿液标本中在血液和尿液中上调最显著的3种tsRNA。
图4为对三种明显上调的tsRNA5'Leader-LeuCAG-2-2、tRF3b-LeuTAG-2、3'tiRNA-49-LeuTAG-2对芯片结果进行体外验证，对比脓毒血症AKI患者组与健康对照组血清中tsRNA的表达水平。
图5为ROC曲线分析结果，选取健康对照人群血清样本和脓毒血症AKI患者的血清样本各40例，检测tsRNA5'Leader-LeuCAG-2-2、tRF3b-LeuTAG-2、3'tiRNA-49-LeuTAG-2三种tsRNA的相对表达量，并进行特异性和灵敏度的检测。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
通过开展实验首次发现tsRNA的表达与脓毒血症AKI密切相关。研究结果表明，相比健康人群(healthy control)和脓毒血症无急性肾损伤(sepsis)的患者，tsRNA在脓毒血症AKI的患者血清和尿液中含量显著升高。证明了tsRNA可作为一种有效的脓毒血症AKI的分子标志物。所述标志物包括以下3条tsRNA中的一种：
表1
本发明将tsRNA分子标志物的检测引物用于制备脓毒血症AKI辅助诊断的试剂盒中，检测分子标志物—tsRNA的表达水平，从而使脓毒血症AKI的诊断更加方便易行。
其中，所述tsRNA分子标志物的检测引物包括以下引物对中的一种：
所述标志物5'Leader-LeuCAG-2-2的引物对1：核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；
所述标志物tRF3b-LeuTAG-2的引物对2：核苷酸序列如SEQ ID NO.6-7所示；
所述标志物3'tiRNA-49-LeuTAG-2的引物对3：核苷酸序列如SEQ ID NO.8-9所示。
所述试剂盒为实时定量PCR试剂盒，包括所述的检测引物，还包括：用于均一化的内参引物、阳性对照模板、阴性对照模板和qPCR反应常规试剂。
采用实时定量PCR试剂盒用于检测上述分子标记物的方法，包括以下步骤：
以逆转录获得的cDNA为模板，采用所述实时定量PCR试剂盒配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；所述扩增反应体系包括：
表2
成分 用量
SYBR-Green IPremix Ex Taq 10μL
Forward primer(2μM) 0.8μL
Reverse primer(2μM) 0.8μL
RNase-free water 6.4μL
cDNA 2μL
所述扩增程序为：95℃5min，95℃30sec,61.6℃30sec,72℃30sec，除第一步外，其余共计40个循环，获得Ct tsRNA；
同时用U6作为均一化参照引物对逆转录合成待检测样本cDNA进行qPCR扩增，获得Ct U6；
Ct值是指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，反映了样本所含的起始拷贝数。起始拷贝数越少，Ct越大，反之则越小。通过计算Ct tsRNA-Ct U6，得出ΔCt。
对ΔCt进行分析判断原则为：
将待测样本的ΔCt值与健康对照者样本的ΔCt值进行比较，并进行统计学分析获得P值，以P<0.05为差异有统计学意义。
若P<0.05，待测样本诊断为脓毒血症急性肾损伤；
若P≥0.05，待测样本不诊断为脓毒血症急性肾损伤；
下面将结合实施例及实验数据对本申请的用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的tsRNA、试剂盒及其应用进行详细说明。
实施例1、通过生物芯片检测到tsRNA在脓毒血症AKI患者的血清和尿液中含量显著性增多
利用生物芯片上固定的特异性探针来识别和量化tsRNA的含量。tsRNA是一类短小的非编码RNA，在炎症和细胞应激等生理和病理过程中起重要作用。通过将患者血清和尿液中的RNA提取并标记，然后加到生物芯片上进行杂交反应，利用探针与tsRNA结合的特异性来检测和量化tsRNA的含量。这样可以快速、高通量地检测大量样本中tsRNA的含量，为脓毒血症AKI患者的诊断和治疗提供重要参考。
一、实验对象
收集了2023年9月至2024年3月就诊于武汉大学中南医院的3例脓毒血症急性肾损伤患者和3例健康对照者的血液和尿液标本及临床信息。所纳入的患者均依据其检验检查报告诊断，脓毒症的诊断标准：感染或者可疑感染患者sofa评分≥2分或qSOFA评分≥2分。AKI的KDIGO标准：48小时内Scr升高超过26.5μmol/L(0.3mg/dl)；Scr升高超过基线1.5倍——确认或推测为7天内发生；尿量＜0.5ml/(kg·h)，且持续6小时以上。
所有实验设计及流程均获得武汉大学中南医院伦理委员会批准。
二、实验方法
1、对收集的尿液和血液标本进行RNA提取；
2、RNA样本通过NanoDrop ND-1000分光光度计进行数量质控，再通过Bioanalyzer2100或凝胶电泳检测RNA完整性。对于每个样本，首先对100ng总RNA进行去磷酸化以形成3-OH末端。然后，将3-OH末端的RNA通过DMSO变性并用Cy3酶标记。标记的RNA被杂交到Arraystar Human Small RNA Arrays(8x15K,Arraystar)，并由Agilent扫描仪G2505C扫描该阵列。
3、使用Agilent Feature Extraction软件(版本11.0.1.1)分析获取的阵列图像。使用GeneSpring GX v12.1软件包(Agilent Technologies)进行分位数归一化和后续数据处理。归一化后，保留在至少6个样本中具有Present(P)或Marginal(M)QC标志的探针信号。来自相同小RNA(miRNA/TsRNA (tRF&tiRNA)/pre-miRNA/tRNA/snoRNA)的多个探针被合并为一个RNA水平含量。通过折叠变化(FC)和统计显著性(p值)阈值识别两个比较组之间差异表达的小RNA。使用R软件绘制层次聚类热图、散点图和火山图以显示样本中小RNA的表达。
三、实验结果
结果如图1-图3所示，筛选出脓毒血症AKI患者与健康对照组的血清和尿液标本中在血液和尿液中上调最显著的3种tsRNA：5'Leader-LeuCAG-2-2，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；tRF3b-LeuTAG-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；3'tiRNA-49-LeuTAG-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2、接头法real time PCR体外验证芯片实验中tsRNA 的表达
一、实验对象
收集了2023年9月至2024年3月就诊于武汉大学中南医院的3例脓毒血症急性肾损伤患者、3例脓毒血症患者和3例健康对照者的血液标本及临床信息。所纳入的患者均依据其检验检查报告诊断，脓毒症的诊断标准：感染或者可疑感染患者sofa评分≥2分或qSOFA评分≥2分。AKI的KDIGO标准：48小时内Scr升高超过26.5μmol/L(0.3mg/dl)；Scr升高超过基线1.5倍——确认或推测为7天内发生；尿量＜0.5ml/(kg·h)，且持续6小时以上。
所有实验设计及流程均获得武汉大学中南医院伦理委员会批准。
二、实验方法
在PCR扩增过程中引入一个特定的接头序列，该接头序列与目标tsRNA的序列特异性结合。这样可以通过PCR扩增来检测和定量目标tsRNA的存在和表达水平。
RNA提取及基因检测,包括以下步骤:使用TRIzol LS Reagent(Invitrogen lifetechnologies)提取总RNA。再用rtStarTMtRF&tiRNA Pretreatment Kit(Cat#AS-FS-005,Arraystar)对RNA进行3’末端去乙酰化处理和RNA去甲基化处理。接下来逆转录试剂盒rtStarTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(3’and 5’adaptor)(Cat#AS-FS-003,Arraystar)进行CDNA第一链的合成；采用Arraystar公司的2X PCR master mix(Arraystar：AS-MR-006-5)来做基因表达分析,引物设计软件：Primer 5.0ViiA 7Real-time PCR System(Applied Biosystems)；分析结果采用2-ΔCt法计算mRNA水平。其中接头法Real-time PCR检测验证tsRNA 的标志物表达水平的引物序列如表3所示。
表3
注：GSP是对应miRNA的特异引物，R是与RT引物相匹配的引物。
具体实施步骤为
(一)PCR扩增
1、针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应：
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，设置PCR反应：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。
2、PCR产物与100bp DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
(二)进行Realtime PCR反应
1、将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。
2、加样
a.将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中。
b.再加入对应的2μl cDNA。
c.小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。
c.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。
3、将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。
所有的指标均按以下程序进行：
95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。
为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到95℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.075℃/秒)。
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。各样品目的基因和管家基因的Ct值结果直接由机器生成。每个样品的目的基因Ct值减去管家基因的Ct值，即为此样品此基因的校正后的相对含量。
4.统计分析：
运用体外PCR实验验证了芯片中的结果，即tsRNA在脓毒血症AKI中的表达高于脓毒症但无AKI患者和健康对照，提示了tsRNA在在脓毒血症AKI中的诊断潜力。所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0和IBM SPSS Statistics 26.0进行。以P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
如图4所示，脓毒血症AKI患者的三种明显上调的tsRNA5'Leader-LeuCAG-2-2、tRF3b-LeuTAG-2、3'tiRNA-49-LeuTAG-2表达水平显著高于脓毒血症无AKI的患者和正常对照者(P<0.0001)。
实施例3、回顾性病例对照检测tsRNA预测脓毒血症AKI的灵敏度和特异性
一、实验对象同实施例2
二、实验方法
RNA提取、PCR扩增，后进行Realtime PCR反应，具体步骤同实施例2。
统计分析：运用受试者工作特征曲线(Receiver-operator characteristic,ROC)评估了tsRNA在脓毒血症急性肾损伤中的诊断价值。所有统计分析均使用GraphPad Prism8.0和IBM SPSS Statistics 26.0进行。以P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
如图5所示，ROC曲线分析结果表明，血浆tsRNA的水平可用于区分脓毒血症急性肾损伤患者和正常对照者(AUC＝0.8336，P<0.0001)，灵敏度为85.71％，特异度为71.42％。
由此可知，tsRNA作为脓毒血症AKI的标志物，其敏感性、特异性高。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种tsRNA标志物的表达水平的检测试剂在制备用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的试剂盒中的应用，其特征在于，所述标志物包括以下3条tsRNA中的一种：
5'Leader-LeuCAG-2-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
tRF3b-LeuTAG-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
3'tiRNA-49-LeuTAG-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为tsRNA标志物的检测引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测引物包括如下3对引物对中的一种：
用于检测5'Leader-LeuCAG-2-2的引物对1：核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；
用于检测tRF3b-LeuTAG-2的引物对2：核苷酸序列如SEQ ID NO.6-7所示；用于检测3'tiRNA-49-LeuTAG-2的引物对3：核苷酸序列如SEQ ID NO.8-9所示。
4.一种用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求3所述的tsRNA标志物的检测引物。
5.根据权利要求4所述的一种用于预测、诊断或监测脓毒血症急性肾损伤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂和/或逆转录反应试剂。
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