CN117965718B - 一种与脓毒症相关的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与脓毒症相关的生物标志物及其应用，所述的生物标志物为tiRNA‑1:34‑Lys‑CTT‑5，其可用于制备脓毒症早期诊断和/或预后评估产品。所述的产品通过对检测样本中tiRNA‑1:34‑Lys‑CTT‑5的表达水平进行非诊断目的检测，从而对脓毒症进行早期诊断和/或预后评估。本发明的生物标志物tiRNA‑1:34‑Lys‑CTT‑5可改善脓毒症诊断仅依赖评分系统、无特异性指标的不足，并提高评估该疾病预后的准确性。tiRNA‑1:34‑Lys‑CTT‑5对脓毒症的诊断价值高于IL‑6、IL‑10、TNF‑α等炎症介质，提高了早期诊断脓毒症的准确性；此外，其对评估脓毒症预后的受试者特征工作曲线(ROC曲线)的曲线下面积(AUC)显著提高，有助于临床医生针对该生物标志物及时调整治疗方案，提高患者生存率。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子生物技术领域，尤其涉及一种与脓毒症相关的生物标志物及其应用。
背景技术
脓毒症是机体对感染应答失调所致的威胁生命的器官功能障碍。全球流行病学调查表明，脓毒症病死率最高达41.9％，治疗费用高昂，给社会和家庭带来沉重负担。细胞因子风暴诱发的全身炎症反应和免疫失衡，是脓毒症预后差的主要原因。然而，单纯细胞因子检测存在特异性过低、敏感性过高的问题。寻找早期诊断脓毒症的高特异性生物标志物，对尽早抑制细胞因子风暴、维持免疫稳态、改善预后具有重要价值。
当前筛选和诊断脓毒症均依赖评分系统，缺乏特异性生物标志物。其中，用于筛选脓毒症的qSOFA评分，包括(1)呼吸频率＞22次/分，(2)收缩压＜100mmHg，(3)神志或精神状态改变。满足以上两条或以上，即需考虑脓毒症。该方法筛选脓毒症的特异性过低，临床除脓毒症外，满足该条件的其它疾病较多，无法精准锚定脓毒症。用于诊断脓毒症的SOFA评分，以呼吸系统的氧合指数、凝血系统的血小板、肝脏的总胆红素、循环系统的平均动脉压、神经系统的格拉斯哥评分和肾脏的肌酐等六个器官系统的某单一指标为评分标准，特异性低，早期诊断能效较差，亦不能反映脓毒症本身的严重程度。
寻找脓毒症早期即可升高、特异性高、与疾病预后相关性较好的生物标志物，有助于尽早筛选和诊断脓毒症，为脓毒症的早期治疗提供方向和时机，从而抑制脓毒症器官功能障碍、改善预后。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种与脓毒症相关的生物标志物及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种与脓毒症相关的生物标志物，该生物标志物为tiRNA-1:34-Lys-CTT-5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，所述的生物标志物tiRNA-1:34-Lys-CTT-5，是在现有脓毒症相关基因库的基础上，提供的一种有助于诊断脓毒症的新型基因。所述基因在脓毒症进展中的作用为：过表达tsRNA-Lys促进脓毒症模型细胞凋亡，而敲低tsRNA-Lys则会抑制脓毒症模型细胞凋亡。同时，tsRNA-Lys过表达显著上调脓毒症模型细胞炎症因子表达，tsRNA-Lys敲低则抑制脓毒症模型细胞炎症因子表达。
本发明的第二方面在于，提供了一种检测试剂盒，其包括第一方面所述的与脓毒症相关的生物标志物。
其中，所述的检测试剂盒包括非诊断目的检测tiRNA-1:34-Lys-CTT-5表达水平的实时定量PCR试剂组。
其中，所述实时定量PCR试剂组包括上述的tiRNA-1:34-Lys-CTT-5的扩增引物，所述的tiRNA-1:34-Lys-CTT-5的扩增引物的序列为：
F：5’-TACAGTCCGACGATCGCCCG-3’(SEQ ID NO.2)；
R：5’-TTCCGATCTGAGTCTCATGCTCTAT-3’(SEQ ID NO.3)。
其中，所述的实时定量PCR试剂组还包括内参基因U6的扩增引物，所述的内参基因U6的扩增引物的序列为：
F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’(SEQ ID NO.4)；
R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’(SEQ ID NO.5)。
其中，所述的检测试剂盒还包括外周血单个核细胞提取试剂组、RNA提取试剂组和反转录试剂组。
其中，所述的外周血单个核细胞提取试剂组包括淋巴细胞分离液和生理盐水。优选地，所述的淋巴细胞分离液为淋巴细胞分离液1.084，购自上海翌圣生物公司
所述的RNA提取试剂组包括RNA分离试剂、氯仿、异丙醇、乙醇、糖原和水。优选地，所述的RNA分离试剂购自Sigma公司；所述的乙醇包括100％乙醇和75％乙醇，所述的75％乙醇以DEPC处理的水配制；所述的水为无RNA酶的水；所述的糖原为无RNA酶的糖原。
优选地，所述的反转录试剂组包括rtStarTMtRF&tiRNA Pretreatment Kit和rtStarTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(3’and 5’adaptor)。
本发明的第三方面在于，提供了一种第一方面所述的生物标志物tiRNA-1:34-Lys-CTT-5或第二方面所述的检测试剂盒在制备脓毒症早期诊断和/或预后评估产品中的应用，其中，所述的产品包括试剂或试剂盒。
其中，所述试剂盒对检测样本中tiRNA-1:34-Lys-CTT-5的表达水平进行非诊断目的的检测。
其中，所述的检测样本为外周血单个核细胞。
本发明的第四方面在于，提供一种非诊断目的检测tiRNA-1:34-Lys-CTT-5表达水平的方法，其中，利用第一方面所述的生物标志物tiRNA-1:34-Lys-CTT-5或第二方面所述的检测试剂盒进行检测，包括如下步骤：
(1)采集血液样本，提取外周血单个核细胞，即得所述的检测样本；
(2)采用TRizol法提取检测样本中的RNA并进行反转录；
(3)利用所述的实时定量PCR试剂对反转录产物进行实时定量PCR扩增，检测样本中tiRNA-1:34-Lys-CTT-5的表达水平。
优选地，所述的反转录，反应体系(20μL)为：Adaptor Ligated RNA 15μL、First-Strand Synthesis Reaction Buffer 4μL、RNase Inhibitor 0.5μL、ReverseTranscriptase 0.5μL，反应程序为热循环仪50℃孵育1小时，然后立即在冰上冷却，得到反应产物cDNA。
所述的实时定量PCR，其反应体系为：2×Master Mix 5μl、10μM的PCR扩增引物F0.5μl、10μM的PCR扩增引物R 0.5μl，加水至总体积为8μl轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，再加入对应的cDNA 2μL。
所述的实时定量PCR，其反应程序为：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10s；60℃，60s)。
其中，脓毒症患者的tsRNA-Lys的表达显著上调。
有益效果：
本发明筛选得到的生物标志物tiRNA-1:34-Lys-CTT-5可改善脓毒症诊断仅依赖评分系统、无特异性指标的不足，并提高评估该疾病预后的准确性。本发明在以下几个方面具有突出优势：
①本发明的生物标志物敲低后，脓毒症模型细胞TNF-α和IL-6等炎症介质水平降低，脓毒症炎症风暴减轻，预后改善。
②本发明提供了一种诊断脓毒症的新方法，改善了脓毒症诊断依靠评分，而无特异性指标的不足。
③本发明的生物标志物对脓毒症的诊断价值高于IL-6、IL-10、TNF-α等炎症介质，提高了早期诊断脓毒症的准确性。
④本发明的生物标志物对评估脓毒症预后的受试者特征工作曲线(ROC曲线)的曲线下面积(AUC)显著为高，有助于临床医生针对该生物标志物及时调整治疗方案，提高患者生存率。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为酶联免疫吸附试验检测细胞TNF-α和IL-6的表达量。其中，图1A采用酶联免疫吸附试验检测TNF-α和IL-6在LPS单独刺激THP-1和RAW264.7细胞及过表达tsRNA-Lys同时加入LPS刺激细胞中的表达水平。Con为正常组对照，LPS为LPS刺激细胞，OE为过表达(overexpression)tsRNA-Lys刺激细胞。图1B采用酶联免疫吸附试验检测TNFα和IL-6在LPS单独刺激THP-1和RAW264.7细胞及敲低tsRNA-Lys同时加入LPS刺激细胞中的表达水平。NC：阴性对照，LPS为LPS刺激细胞，KD为敲低(knockdown)tsRNA-Lys刺激细胞，*P<0.05。
图2为不同浓度LPS对细胞活性的影响。图2A为用0、0.5、1和2μg/mL LPS处理THP-1细胞24h，流式细胞术检测细胞凋亡率。左下象限Q4(AnnexinV-FITC)-/PI-细胞为活细胞，右下象限Q3(AnnexinV-FITC)+/PI-细胞为早期凋亡细胞，右上象限Q2(AnnexinV-FITC)+/PI+细胞为晚期凋亡细胞，左上象限Q1(AnnexinV-FITC)-/PI+细胞为坏死细胞。图2B为细胞早期凋亡及晚期凋亡的总和统计，*P<0.05，**P<0.01。图3为LPS处理后的THP-1细胞测序结果。图3A为分层聚类热图显示模型组和正常组差异表达的tsRNA。热图中的颜色表示相对表达式级别(经过log2转换)。颜色刻度如下：蓝色表示低于平均值的表达水平，红色表示高于平均值的表达水平。顶部热图上的彩色条顶部显示样本组，热图右侧的彩色条表示使用K-均值进行的划分。使用差异表达的miRNA进行分层聚类(如果数量超过两个)。每一行代表一个tsRNA，所有被选中的都根据K平均算法被分类为不超过10个簇，每一列代表一个样本。等级聚类的结果显示样本之间存在可区分的tsRNA表达谱。图3B火山图提供了一个可视化的方法，执行一个快速的视觉识别tRF&tsRNA显示大幅度的变化，也具有统计学意义。该图由y轴上的log10(q值)和x轴上两个实验组之间的tRF&tsRNA表达log2(倍数变化)构成。火山图是根据tRF和tsRNA绘制的，具有CPM值。
图4为流式凋亡细胞术检测THP-1和RAW264.7细胞凋亡水平。图4A采用流式凋亡细胞术检测LPS单独刺激THP-1和RAW264.7细胞及过表达tsRNA-Lys同时加入LPS刺激细胞的凋亡水平。Con为正常组对照。图4B采用流式凋亡细胞术检测LPS单独刺激THP-1和RAW264.7细胞及敲低tsRNA-Lys同时加入LPS刺激细胞的凋亡水平。NC：阴性对照。LPS处理组比较，*P<0.05。
图5为实时定量PCR检测脓毒症患者(n＝29)和非脓毒症患者(n＝21)外周血单个核细胞PBMC的tsRNA-Lys表达水平，**P<0.01。
图6为脓毒症患者tsRNA-Lys的表达与感染及容量相关指标的相关性分析。其中CRP为超敏C反应蛋白；WBC为白细胞计数；PCT为降钙素原；Lac为乳酸。*P<0.05。
图7为tsRNA-Lys、IL-6、IL-10、TNF-α对脓毒症的诊断价值。
图8为tsRNA-Lys、SOFA评分对脓毒症预后的价值。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下列实施例中，所述的流式细胞术检测细胞凋亡率，采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，购自于上海翌圣生物有限公司。
所述细胞凋亡率计算方式为：细胞凋亡的早期(右下象限Q3)和细胞晚期凋亡(右上象限Q4)凋亡百分率的总和。
实施例1细胞培养
细胞系THP-1，RAW264.7购自赛库生物(中国广州)，并维持在补充有1％青霉素和链霉素(Genview，USA)和5％胎牛血清(Gibco，USA)的Dulbecco改良培养基(DMEM)中。将细胞置于含有95％空气和5％二氧化碳的37℃培养室中。刺激炎症，细胞用1μg/ml脂多糖(LPS，Sigma，USA)处理指定的持续时间。
实施例2酶联免疫吸附试验(ELISA)
为了检测TNF-α，IL-6的释放，使用人TNF-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(产品型号MLB00C)，人IL-6酶联免疫吸附试验试剂盒(购于基因美生物公司)。将THP-1及RAW细胞接种于96孔板中，细胞密度为3×103个/孔。如实施例1所述的细胞培养方法培养12h，然后用1μg/ml脂多糖处理12h，按照酶联免疫吸附试验试剂盒用户手册，收集和分析细胞培养的上清，检测TNF-α及IL-6分泌。结果见图1，与没有LPS诱导的正常组对照(Con)相比，LPS诱导的THP-1及RAW细胞的TNF-α，IL-6表达量明显上升。
实施例3LPS处理后的THP-1测序及验证
首先采用LPS处理THP-1细胞，建立体外脓毒症细胞模型。为了筛选LPS的最佳浓度，使用0.5、1和2μg/mL LPS孵育THP-1细胞24h。采用流式细胞术检测细胞凋亡率。检测结果表明，如图2A所示，0.5、1和2μg/mL LPS处理显著增加了THP-1细胞凋亡的早期(右下象限Q3)和细胞晚期凋亡(右上象限Q4)，同时伴随着活细胞(左下象限Q4)的减少。三种浓度的LPS对坏死细胞(左上象限Q1)均无影响。如图2B所示，随着LPS浓度的增加，凋亡率增加，提示细胞死亡率增加。因此，选择2μg/mL的浓度进行随后的测定。
采用2μg/mL LPS处理2h THP-1细胞样本(L)，与正常无LPS处理样本(C)同时进行tRF&tiRNA测序(tsRNA测序由数谱生物提供技术服务)。结果见图3，聚类热图显示LPS诱导的模型组和正常组单核巨噬细胞之间差异表达的tsRNA倍数变化(FC)>2或<0.5，P<0.05)，包括79个上调的tsRNA和87个下调的tsRNA。
选取了上升趋势最显著的tsRNA(tF_ID：tiRNA-1:34-Lys-CTT-5，核苷酸序列SEQID NO.1：GCCCGGCTAGCTCAGTCGATAGAGCATGAGACTC)进行功能验证。结果见图4，过表达tsRNA-Lys(LPS+OE组)促进LPS诱导的THP-1细胞凋亡(图4A)，而敲低tsRNA-Lys(LPS+KD组)则会抑制LPS诱导的THP-1细胞凋亡(图4B)。另外，如图1所示，tsRNA-lys过表达显著上调LPS诱导的TNF-α和IL-6。tsRNA-lys敲低恢复了LPS诱导的TNF-α、IL-6的失调。
实施例4临床血液样本获取
采集江苏省中医院重症医学中心29例脓毒症患者和21例非脓毒症患者的外周血单个核细胞(PBMCs)。通过人单核细胞分离试剂盒(包括淋巴细胞分离液1.084和生理盐水，购自上海翌圣生物公司)从全血中提取PBMC。所有临床样本获取过程经江苏省中医院伦理审查委员会授权，且具备患者知情同意书。
实施例5临床样本检测及统计分析
应用29例脓毒症患者和21例非脓毒症患者的外周血单核细胞PBMC作为样本检验tsRNA-Lys的表达。采用TRizol法抽提RNA，RNA提取试剂组包括：RNA分离试剂(TRIReagent，购于Sigma公司，Cat#T9424)、氯仿(购于上海化学试剂有限公司)、异丙醇(购于上海化学试剂有限公司)、100％乙醇(购于上海化学试剂有限公司)、75％乙醇(以DEPC处理的水配制)、无RNA酶的水(购于南京碧云天生物公司)和无RNA酶的糖原(购于Ambion公司，Cat#AM9510)。提取得到检测样本的RNA后，反转录合成cDNA，反转录试剂组包括rtStarTMtRF&tiRNA Pretreatment Kit(购于Arraystar，Cat#AS-FS-005)和rtStarTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(3’and 5’adaptor)(购于Arraystar，Cat#AS-FS-003)，反转录的反应体系为：在无核酸酶的200μL PCR管中加入下列反应物，总体积20μL：Adaptor Ligated RNA 15μL、First-Strand Synthesis Reaction Buffer 4μL、RNaseInhibitor 0.5μL、Reverse Transcriptase 0.5μL。反转录的反应程序为：热循环仪50℃孵育1h，然后立即在冰上冷却，得到反应产物cDNA，可直接用于PCR扩增反应。接着进行待测样品的待测基因实时定量PCR及待测样品的管家基因(U6内参)实时定量PCR，实时定量PCR反应体系为：2×Master Mix 5μl、10μM的PCR扩增引物F 0.5μl、10μM的PCR扩增引物R 0.5μl，加水至总体积为8μl轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，再加入对应的cDNA 2μL。实时定量PCR反应程序为：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10s；60℃，60s(收集荧光))。然后各样品目的基因量以内参校正的计算结果。各样品的目的基因和管家基因分别进行实时定量PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品中目的基因的校正后的相对含量。此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物(对照组)的量，即参照物(对照组)是1，其它的样本为参照物量的n倍。使用的目的基因检测引物(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3)及内参引物(SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5)见表1。基因表达量见图5，与非脓毒症患者相比，脓毒症患者tsRNA-Lys的表达显著上调。
表1目的基因检测引物及内参引物
使用Sperman相关性分析，评估脓毒症患者tsRNA-Lys的表达与感染及容量相关指标的相关性。结果见图6，tsRNA-Lys的表达与降钙素原PCT(r＝0.4448，P＝0.0177)呈正相关。
以是否诊断为脓毒症为因变量，14例脓毒症患者和14例非脓毒症但存在感染患者的tsRNA-Lys的表达值为自变量，建立二元Logistic回归模型。结果见表2，tsRNA-Lys是发生脓毒症的独立危险因素，OR＞1，P＜0.05。
表2采用二元Logistic回归模型检测tsRNA-Lys与脓毒症的相关性
使用受试者特征工作(ROC)曲线，评价tsRNA-Lys对脓毒症的诊断价值。结果见图7，与IL-6、IL-10及TNF-α相比，tsRNA-Lys对脓毒症的诊断更有意义，AUC(曲线下方面积)为0.8699，约登指数为0.7143，对应tsRNA-Lys表达水平的cutoff值为5.28。
使用受试者特征工作(ROC)曲线，评价tsRNA-Lys对脓毒症预后的价值。结果见图8，与SOFA评分相比，tsRNA-Lys对脓毒症的预后诊断更有意义，AUC为0.6531，约登指数为0.4285，对应tsRNA-Lys表达水平的cutoff值为7.05。
因此，tiRNA-1:34-Lys-CTT-5可作为脓毒症早期诊断和预后评估的生物标志物。
综上所述，本发明的生物标志物tiRNA-1:34-Lys-CTT-5特异性高，在脓毒症早期即可升高，且与脓毒症的预后具有较好相关性。本发明可解决当前筛选和诊断脓毒症依赖评分系统、缺乏特异性生物标志物的问题，有助于脓毒症的早期特异性诊断。
本发明的关键技术改进点主要集中在以下三个方面：
1)诊断疾病：本发明提供了一种新型的脓毒症诊断方法，该方法不仅提高了诊断脓毒症的准确性，也降低了误诊风险。此外，这种方法还有助于发现潜在的疾病风险，为疾病的早期预防提供科学依据。
2)早期诊断疾病：本发明还提供了一种早期诊断脓毒症的方法，该方法的优势在于，它可以在疾病发生初期就发现异常，从而为疾病的干预提供宝贵的时间，有助于降低疾病的发病率和死亡率。
3)评估预后：本发明还提供了一种可评估预后的脓毒症诊断方法。这种方法的优势在于，它可以帮助医生在治疗过程中对患者的病情进行实时评估，从而及时调整治疗方案，有助于提高治疗效果，提高患者的生存质量和生存率。
总的来说，本发明的专利创新点在早期诊断疾病和预后预测方面具有显著优势，有望为脓毒症领域带来重大突破。
本发明提供了一种与脓毒症相关的生物标志物及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (4)
1.一种检测tiRNA-1:34-Lys-CTT-5表达水平的试剂盒在制备脓毒症早期诊断和/或预后评估产品中的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括检测tiRNA-1:34-Lys-CTT-5表达水平的实时定量PCR试剂组；其中，所述tiRNA-1:34-Lys-CTT-5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的实时定量PCR试剂组包括tiRNA-1:34-Lys-CTT-5的扩增引物，所述的tiRNA-1:34-Lys-CTT-5的扩增引物的序列为：
F：5’-TACAGTCCGACGATCGCCCG-3’；
R：5’-TTCCGATCTGAGTCTCATGCTCTAT-3’。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的实时定量PCR试剂组包括内参基因U6的扩增引物，所述的内参基因U6的扩增引物的序列为：
F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；
R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括外周血单个核细胞提取试剂组、RNA提取试剂组和反转录试剂组；所述的外周血单个核细胞提取试剂组包括淋巴细胞分离液和生理盐水；所述的RNA提取试剂组包括RNA分离试剂、氯仿、异丙醇、乙醇、糖原和水。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒的检测样本为外周血单个核细胞。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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