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CN118370764B - 核酸在制备防治恶液质的药物中的应用和施用方法 - Google Patents

核酸在制备防治恶液质的药物中的应用和施用方法 Download PDF

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CN118370764B
CN118370764B CN202410817427.4A CN202410817427A CN118370764B CN 118370764 B CN118370764 B CN 118370764B CN 202410817427 A CN202410817427 A CN 202410817427A CN 118370764 B CN118370764 B CN 118370764B
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Abstract

本发明公开核酸在制备防治恶液质的药物中的应用和施用方法。本发明的核酸通过其包含或产生的寡核苷酸调节体内恶液质相关的核酸因子，启动自体的重编程状态，通过调节关键核酸因子的活跃/沉默，实现非编码RNA调控信号编程网络，实现单个非编码RNA调控多个信号通路的目的，进而实现重建失调的生理状态的新稳态。以本发明的核酸作为活性成分的药物在防治过程中相对其他核酸药物，用药量极小，实现药效的基础上，确保用药安全，颠覆传统质粒/核酸药物给药的现状。此外，本发明的核酸无特异性反应，具有较高体内安全性。

Description

核酸在制备防治恶液质的药物中的应用和施用方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及核酸在制备防治恶液质的药物中的应用和施用方法。
背景技术
恶液质是机体自身组织被消耗的一种复杂代谢临床综合征，可发生于多种疾病，如肿瘤、艾滋病、严重创伤、术后、吸收不良及败血症等，其中最常见的是肿瘤伴发的恶液质，又称肿瘤恶液质。恶液质标志性临床症状包括系统性炎症进展、肿瘤微环境缺氧形成的以Warburg效应为标志的糖酵解代谢模式、失眠、食欲不振，肌肉消耗引发的体重丢失、全身衰竭及代谢异常等。针对肿瘤恶液质，中国国家卫生健康委办公厅发布了《肿瘤恶液质临床诊断与治疗指南(2020版)》，其中指出有关肿瘤恶液质相关的治疗手段缺乏且治疗效果不佳。临床随机试验显示，包括孕激素类似药等的食欲刺激剂、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)拮抗剂，和包括环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制剂等的抗炎药均不能完全逆转癌性恶液质的异常状态，并伴有血栓栓塞等风险。此外，放化疗等抗肿瘤治疗也加剧恶液质的重要症状，即肌肉消耗的不良反应。
肌肉消耗和体重降低是恶液质诊疗的重要指标。当前逆转肿瘤恶液质患者的体重丢失，进而帮助治疗肿瘤恶液质病症，提高肿瘤末期患者生存质量，是以患者利益为中心的肿瘤治疗研究热点。
发明内容
为解决上述现有技术中的至少部分问题，本发明设计并制备了能够用于防治恶液质的核酸，其包含或能够在体内产生寡核苷酸，并在细胞内及循环系统内稳定存在的同时直接抑制恶液质相关的核酸因子，进一步以直接或间接的方式调控相关通路蛋白表达，最终显著改变恶液质。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供核酸在制备防治恶液质的药物中的应用，其中，所述核酸包括或者能够产生下述(1)和/或(2)的寡核苷酸：
(1) 序列如SEQ ID No.1-42任一项所示的寡核苷酸；
(2) 上述(1)经过核苷酸修饰且具有相同功能的寡核苷酸。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，其中，所述核苷酸修饰包括对磷酸基团和/或核糖基团进行修饰；
其中，所述磷酸基团的修饰是指对磷酸基团中的氧进行修饰，包括硫代修饰、硼烷化修饰，从而稳定核酸的结构；
所述核糖基团的修饰是指对核糖基团中2’-羟基的修饰，包括在核糖基团的2’-羟基位置引入甲氧基或氟，从而使核糖核酸酶不易切割核酸，增加核酸的稳定性。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，其中，能够产生(1)和/或(2)寡核苷酸的核酸为动物细胞表达载体。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，能够产生(1)和/或(2)寡核苷酸的核酸所使用的载体为重组质粒、AAV病毒载体或慢病毒载体。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，所述寡核苷酸包含于细胞外囊泡中。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，所述药物的剂型包括注射剂、注射用粉末、片剂、膏剂、胶囊剂、颗粒剂、气雾剂、喷雾剂或粉吸入剂。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，所述药物经全身给药来施用，包括皮下注射、肌肉注射、静脉内给药、口服给药、吸入给药或缓释给药。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，所述药物设计为以60 kg体重计，以4μg-60 μg/人/次的量施用所述寡核苷酸。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，所述药物设计为能够以0.005-1 μg/kg体重的量施用所述寡核苷酸。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，所述药物设计为能够使所述寡核苷酸在体内循环系统中的有效浓度为1×104-1×109拷贝/μl，或所述药物设计为能够使所述寡核苷酸在靶器官内的有效浓度为1×104-1×109拷贝/mg。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，所述防治包括下述之一：
a. 预防、减轻、逆转、改善、治愈恶液质或其症状；
b. 抑制病灶内细胞的增殖、迁移、侵袭、细胞周期改变中的一种或多种；
c. 促进病灶内细胞的凋亡、裂解或吸收。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，所述恶液质包括因肿瘤发展所引起的恶液质前期、恶液质期和恶液质难治期阶段中的一种或多种。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，所述恶液质的症状包括肌肉消耗、体重减少、精神萎靡、失眠、全身衰竭、代谢异常、饮食下降和/或活动力减弱。
本发明的另一方面，提供体外调整细胞增殖的方法，其包括使体外细胞与本发明所述寡核苷酸接触的步骤。优选地，体外细胞包括肿瘤细胞或永生化细胞。
本发明的另一方面，提供一种含核酸药物的施用方法，其中，所述核酸包括或者能够产生下述(1)和/或(2)的寡核苷酸：
(1) 序列如SEQ ID No.1-42任一项所示的寡核苷酸；
(2) 上述(1)经过核苷酸修饰且具有相同功能的寡核苷酸；
所述方法包括以全身给药方式施用所述药物。
在某些实施方案中，根据本发明所述的含核酸药物的施用方法，其包括以皮下注射、肌肉注射、静脉内给药、口服给药、吸入给药或缓释给药的方式全身给药。
在某些实施方案中，根据本发明所述的含核酸药物的施用方法，其中，所述药物的施用能够以60 kg体重计，4 μg-60 μg/人/次的量将所述寡核苷酸递送到体内。
在某些实施方案中，根据本发明所述的含核酸药物的施用方法，其中，所述药物的施用能够以60 kg体重计，5 μg-50 μg/人/次的量将所述寡核苷酸递送到体内。
在某些实施方案中，根据本发明所述的含核酸药物的施用方法，其中，所述药物的施用能够使所述寡核苷酸在体内循环系统中的有效浓度为1×104-1×109拷贝/μl，或能够使所述寡核苷酸在靶器官内的有效浓度为1×104-1×109拷贝/mg。
本发明的核酸通过其包含或产生的寡核苷酸调节体内恶液质相关的核酸因子，启动自体的重编程状态，通过调节关键核酸因子的活跃/沉默，实现非编码RNA调控信号编程网络，实现单个非编码RNA调控多个信号通路的目的，进而实现重建失调的生理状态的新稳态。以本发明的核酸作为活性成分的药物在防治过程中相对其他核酸药物，用药量极小，在实现药效的基础上，确保用药安全，颠覆传统质粒/核酸药物给药的现状。此外，本发明的核酸无特异性反应，具有较高体内安全性。
附图说明
图1为示例性寡核苷酸在SK-Hep-1细胞系中的表达结果。
图2为示例性寡核苷酸对MKN45细胞中A2AR表达量的影响。
图3为示例性寡核苷酸对H292细胞增殖的影响。
图4为示例性寡核苷酸对肿瘤恶液质裸鼠的影响。图中(a)摄食量；(b)饮水量。
图5为示例性寡核苷酸对肿瘤恶液质裸鼠的影响。图中(a)体重增长率；(b)肿瘤体积；(c)肿瘤数量；(d)肿瘤抑制率。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在具体实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
研究发现，细胞透过外泌机理主动分泌“核酸因子”到胞外，在体内全局性地改变机体的免疫与代谢。此类主动分泌的“核酸因子”与细胞因子、化学因子等生理性调节因子一样，参与体内重编程、系统调控过程。另外，核酸因子在罹患肿瘤患者中可能涉及多个信号通路，例如PTEN、MEK3、TWIST1、EZH2，与细胞增殖、细胞周期、血管生成、侵袭、细胞干性、化疗耐药等多个功能相关。本发明通过调节恶液质相关核酸因子的表达来解决恶液质患者生理状态失衡，改善恶液质特别是肿瘤恶液质症状，提高患者生存质量。
本发明中，术语“恶液质”是指患者机体自身组织被消耗的一种复杂代谢临床综合征，该疾病类型以食欲减退、体重下降、全身衰竭及代谢异常为特征，可发生于多种疾病，如新血管疾病、肿瘤、艾滋病、严重创伤、术后、吸收不良及败血症。本领域公认的恶液质以持续性骨骼肌消耗为特征，伴或不伴有脂肪组织丢失，常规营养治疗不能完全缓解。目前正式上市的针对恶病质状态的药物仅有在日本的小野制药株式会社(Ono Pharmaceutical)生产的阿那莫林(Anamorelin)，其通过提高食欲来达到改善恶病质状态的目的，但其在欧盟的上市申请未获批准，在我国尚处于临床试验I期。
本发明中，术语“寡核苷酸”是指由多个连接的核苷酸组成的分子，每个核苷酸包含糖(例如，核糖或脱氧核糖)和与之连接的有机碱基。有机碱基包括嘧啶(例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或嘌呤(例如，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。根据糖基的不同，寡核苷酸分为DNA和RNA。本发明中，寡核苷酸可以不包含任何修饰，也可以修饰。修饰类型包括碱基修饰、糖修饰和骨架修饰等。在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含硫代磷酸酯骨架修饰，从而使寡核苷酸耐受核酸酶的影响，提高寡核苷酸的稳定性。本发明寡核苷酸的制备方式不限定，可以是体外合成，也可以是通过生物技术或生物工程方法得到。具体这些方法在本领域中也是已知的。
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸为能够抑制恶液质相关核酸因子的寡核苷酸。示例性地，本发明的寡核苷酸具有以下SEQ ID No.1-42所示的序列：
寡核苷酸序列 编号 寡核苷酸序列 编号
ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGUAC SEQ ID No.1 ACTGCCTGTCTGTGCCTGCTGTAC SEQ ID No.22
ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGUA SEQ ID No.2 ACTGCCTGTCTGTGCCTGCTGTA SEQ ID No.23
CUGCCUGUCUGUGCCUGCUGUA SEQ ID No.3 CTGCCTGTCTGTGCCTGCTGTA SEQ ID No.24
UGCCUGUCUGUGCCUGCUGUAC SEQ ID No.4 TGCCTGTCTGTGCCTGCTGTAC SEQ ID No.25
ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU SEQ ID No.5 ACTGCCTGTCTGTGCCTGCTGT SEQ ID No.26
CUGCCUGUCUGUGCCUGCAGUA SEQ ID No.6 CTGCCTGTCTGTGCCTGCAGTA SEQ ID No.27
CUGCCUGUCUGUGCCUGCUGUAC SEQ ID No.7 CTGCCTGTCTGTGCCTGCTGTAC SEQ ID No.28
CCUGUCUGUGCCUGCUGUACA SEQ ID No.8 CCTGTCTGTGCCTGCTGTACA SEQ ID No.29
ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGUGUCA SEQ ID No.9 ACTGCCTGTCTGTGCCTGCTGTGTCA SEQ ID No.30
ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGUACA SEQ ID No.10 ACTGCCTGTCTGTGCCTGCTGTACA SEQ ID No.31
CUGCCUGUCUGUGCCUGCUGUACA SEQ ID No.11 CTGCCTGTCTGTGCCTGCTGTACA SEQ ID No.32
UGCCUGUCUGUGCCUGCUGUACA SEQ ID No.12 TGCCTGTCTGTGCCTGCTGTACA SEQ ID No.33
GCCUGUCUGUGCCUGCUGUACA SEQ ID No.13 GCCTGTCTGTGCCTGCTGTACA SEQ ID No.34
UCCUGUCUGUGCCUGCUGUACA SEQ ID No.14 TCCTGTCTGTGCCTGCTGTACA SEQ ID No.35
ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGA SEQ ID No.15 ACTGCCTGTCTGTGCCTGCTGA SEQ ID No.36
ACUGCCUGUCUGUGCCUGGAGU SEQ ID No.16 ACTGCCTGTCTGTGCCTGGAGT SEQ ID No.37
ACUGCCUGUCUGUGCCUGCAGU SEQ ID No.17 ACTGCCTGTCTGTGCCTGCAGT SEQ ID No.38
ACUGCCUGUCUGUGCCUGCACU SEQ ID No.18 ACTGCCTGTCTGTGCCTGCACT SEQ ID No.39
ACUGCCUGUCUGUGCCUACUGU SEQ ID No.19 ACTGCCTGTCTGTGCCTACTGT SEQ ID No.40
ACUGCCUGUCUGUGCCUGAUGU SEQ ID No.20 ACTGCCTGTCTGTGCCTGATGT SEQ ID No.41
AAUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU SEQ ID No.21 AATGCCTGTCTGTGCCTGCTGT SEQ ID No.42
本发明中，术语“核酸因子”是指与恶液质相关或调控其发生、发展的核酸，特别是小核酸分子。通常情况下，这些核酸因子能够参与肿瘤细胞代谢，调控肿瘤恶液质的发展。
本发明中，术语“核酸”是指单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的线性片段，其可从任何来源产生。本发明核酸的长度不限定，包括长链核酸或短链核酸。长链核酸的单链一般由200个以上核苷酸组成，即单链长度为200 nt以上。短链核酸有时也称作寡核苷酸，此时一般为单链形式，通常由长度5-200个核苷酸组成，即长度为5-200 nt。
在某些实施方案中，本发明的核酸可以包括本发明所述的寡核苷酸。例如本发明的核酸可以是核酸构建体的形式。本发明的核酸可以包括至少一个本文所示序列的寡核苷酸，例如可以包括两个、三个、多于三个或以上的寡核苷酸，在多个本发明所示的寡核苷酸的情况下，寡核苷酸之间的连接方式不特别限定，例如可以使用合适的间隔序列与寡核苷酸连接。示例性地，核酸包含选自SEQ ID No.1-42中的至少一种寡核苷酸。
在某些实施方案中，本发明的核酸为能够产生本发明所述寡核苷酸的核酸分子，例如核酸通过转录而产生本发明的寡核苷酸。在该情况下，该核酸包括表达SEQ ID No.1-21任一项所示序列的核酸。在某些实施方案中，该核酸可以为表达载体的一部分，“表达载体”是指重组或合成产生的核酸构建体，其携带一系列特定的能够在宿主细胞中转录特定基因的核酸元件，例如启动子元件，增强子元件和选择元件。通常，基因表达置于某些调节元件的控制下，例如组成型或诱导型启动子。本发明中，载体可以是质粒、噬菌粒、病毒(包括但不限于腺病毒、慢病毒)和衍生自病毒或细菌来源的其它类型的载体。用于表达本发明寡核苷酸的基因序列可以与载体的一种或多种元件，例如与启动子元件可操作地连接。“可操作地连接”用于描述调节元件与基因或其编码区之间的连接。也就是说，基因表达通常置于某些调节元件的控制下，基因或编码区与调节元件“可操作地连接”意味着该基因或编码区受该调节元件的控制或影响。
本发明中，寡核苷酸可以“胞外核酸”的形式用于恶液质的防治，所述寡核苷酸为分离的纯的核酸分子，同时可以稳定存在于胞外环境，例如包括但不限于血液、唾液、胃液等，这不仅能够对原位瘤具有治疗效用，同时对转移瘤或远端瘤同样具有重要意义，因为本发明的寡核苷酸能够经循环系统到达靶标(靶核酸)，使得这种全新的全身性治疗方案可以替代放化疗药物，从而避免由于放化疗给患者所带来的毒副作用，使患者在恶液质治疗中获益。
术语“分离的”是指与最初产生时(无论是在自然界中还是/或者在实验环境中)相关联的至少一些组分分离的，和/或(2)由人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约98%、约99%、基本上100%或100%的最初相关联的其他组分分离。在一些实施方案中，经分离的试剂的纯度大于约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、基本上100%或100%。如果一种物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。此外，“分离的细胞”是指不包含在多细胞生物中的细胞。
本发明还提供一种逆转、预防、改善或治疗有需要的受试者中的恶液质或其相关病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的核酸的步骤，其中所述核酸包括或者能够产生SEQ ID No.1-42任一项所示的寡核苷酸。可以理解的是，该方法可以是治疗性的，也可以是预防性的。
在根据本发明应用和方法的一个优选实施方案中，能够产生所述寡核苷酸序列的核酸所使用的载体包括重组质粒、AAV病毒载体或慢病毒载体。在一个具体的实施方案中，能够产生SEQ ID No.1-21任一项所示的寡核苷酸的核酸所使用的载体为动物细胞表达载体。
可以理解的是，本发明的核酸或寡核苷酸可以进一步包含在合适的递送载体中，这样的递送载体是本领域已知的，例如包括但不限于：细胞外囊泡，特别是外泌体、微囊泡等；壳聚糖、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、树枝状大分子等纳米粒子；典型脂质体等。在一个优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸包含于细胞外囊泡，例如外泌体中。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括向受试者施用动物细胞表达载体的步骤，其中该载体能够产生SEQ ID No.1-21任一项所示寡核苷酸。
在一个优选的实施方案中，包括向受试者施用产生所述寡核苷酸序列的载体转化的细胞的步骤。在一个方面中，将本发明的质粒引入细胞可以通过任何合适的用于将载体引入细胞(例如基因转移)的方法例如转染和转导来进行，对此不特别限定。在一个具体实施方案中，本发明构建的重组质粒具有SEQ ID NO.46所示的序列。
在一个优选的实施方案中，包括向受试者施用含有所述寡核苷酸序列的细胞外囊泡，特别是外泌体(或外泌体样颗粒)的步骤，所述外泌体或细胞外囊泡的至少部分膜可以直接来自于细胞，或者通过人工合成进行制备。外泌体或细胞外囊泡的粒径不特别限定，其可以具有微米级，甚至是纳米级的粒径。
在一个最优选的实施方案中，通过向有需要的受试者施用治疗有效量的产生SEQID No.1-21任一项所示的寡核苷酸的重组质粒，从而实现逆转、预防、改善或治疗的恶液质或其相关病症的目的。
本发明中，包含核酸或寡核苷酸的药物可以进一步包括药学上可接受的辅料。术语“药学上可接受的”是指对于暴露在所使用的剂量和浓度下的细胞或哺乳动物无毒的或者具有本领域技术人员所确定的可接受毒性水平的载体、赋形剂或稳定剂。药学上可接受的辅料的非限制性实例是水性pH缓冲溶液。药学上可接受的辅料还可包含下列中的一种或多种：抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)的多肽，蛋白质，例如血清白蛋白；明胶；免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠和非离子表面活性剂，如吐温和聚乙二醇(PEG)。
不受任何理论的束缚，本发明的所述寡核苷酸可以具有SEQ ID No.1-42任一项所示的核苷酸序列或其经化学修饰得到的序列。此外，上述序列的变体序列也在本发明的保护范围之内。术语“变体序列”是指寡核苷酸序列，其与本发明的寡核苷酸序列不完全相同，但保留本发明的寡核苷酸序列的一种或多种功能特征。在一些方面，寡核苷酸序列或经化学修饰序列的变体序列保留该寡核苷酸序列的所有功能特征，例如包括但不限于对靶基因的结合活性、抑制靶标表达或对靶细胞的抑制活性、对靶标调控下游信号通路的调控活性和/或逆转、预防、改善或治疗恶液质的功效。优选地，经修饰后所得到的寡核苷酸不会导致所述寡核苷酸抑制核酸因子的功能和/或抑制其表达的功能丧失。对靶标调控下游信号通路的调控活性进一步包括调控相关蛋白，特别是调控A2AR等蛋白表达，最终显著改变恶液质所特有的糖酵解代谢状态。
本发明中，寡核苷酸对于靶标表达或对靶细胞的抑制活性可以通过本领域已知的方法进行测定，对此不特别进行限定。例如，可以采用实时荧光定量PCR、NorthernBlotting等方法进行核酸因子的定量。再例如，可以采用CCK8检测寡核苷酸对靶细胞的抑制率，本发明的寡核苷酸对靶细胞均具有较高抑制率。此外，本发明如SEQ ID No.1-42序列所示的寡核苷酸对靶基因(核酸因子)的表达和/或核酸因子的功能均具有显著抑制作用。本领域技术人员能够理解的是，可以根据本发明SEQ ID No.1-42所示的序列进行GC含量优化，以进一步提高寡核苷酸与靶序列的亲和力，进而影响其抑制效率。
本发明中，对寡核苷酸进行化学修饰以改善寡核苷酸的稳定性、活性或半衰期是本领域已知的。本发明的寡核苷酸以核苷酸基团(或核苷酸残基)作为基本结构单元，其中核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，优选情况下，所述寡核苷酸含有至少一个修饰的核苷酸基团。所述修饰的核苷酸基团不会导致所述寡核苷酸抑制核酸因子的功能和/或抑制其表达的功能丧失。
在本发明中，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团和/或核糖基团被修饰的核苷酸基团。例如，磷酸基团的修饰是指对磷酸基团中的氧进行修饰，包括但不限于硫代修饰、硼烷化修饰等，如分别用硫和硼烷置换磷酸基团中的氧。磷酸基团被修饰能够稳定核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。优选地，硫代修饰的核苷酸基团是指其中所有的磷酸二酯键中的非桥氧原子被置换成硫原子的核苷酸基团。
核糖基团的修饰是指对核糖基团中2’-羟基(2’-OH)的修饰。在核糖基团的2’-羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加了核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中2’-羟基的修饰包括2’-氟修饰(2’-fluro modification)、2’-甲氧基修饰(2’-OME)、2’-甲氧乙基修饰(2’-MOE)、2’-2,4-二硝基苯酚修饰(2’-DNP modification)、锁核酸修饰(LNA modification)、2’-氨基修饰(2’-Amino modification)、2’-脱氧修饰(2’-Deoxy modification)等。
本发明中，寡核苷酸序列的变体序列可以包括SEQ ID No.1-42任一项所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加且具有相同功能的寡核苷酸，可以通过来自上述序列中的任一个指定序列为基础来确定在不同情况下的变体序列是否与指定序列具有相同的功能。在具体实施方案中，取代、缺失和/或添加是指一个或多个选自A、G、C、T碱基的取代、缺失和/或添加。
在某些实施方案中，核苷酸的插入包括5’和/或3’末端插入，以及单个或多个残基(包括至少1个、2个、3个核苷酸)的序列内插入。
在某些实施方案中，核苷酸的缺失是指从寡核苷酸序列中去除一个或多个残基。这些缺失变体通常通过下列方式来制备：对编码寡核苷酸的DNA中的核苷酸进行位点专一诱变，从而产生编码变体的DNA，并在其后在重组细胞培养中表达DNA。或者，缺失变体可以方便地通过体外合成来制备。
在某些实施方案中，核苷酸的置换是其中已去除了序列的例如至少1个到至少3个核苷酸并且在其位置处插入了不同核苷酸。尽管用于引入序列变异的位点是预先确定的，但突变本身无需是预先确定的。例如，为了优化在给定位点处的突变的性能，可以在靶区域处进行随机诱变，并且就所需活性的最佳组合来筛选所表达的置换变体。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点处进行置换突变的技术是众所周知的。
本发明中，核苷酸置换通常是单个残基，核苷酸插入通常是大约1-10个残基，核苷酸缺失通常是大约1-30个残基。
本发明中，寡核苷酸序列的变体序列可以与SEQ ID No.1-42任一项所示的核苷酸序列具有95%，例如96%、97%、98%，甚至是99%以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。类似地，可以通过来自上述序列中的任一个指定序列为基础来确定在具有上述同源性的变体序列是否与指定序列具有相同的功能。
为了确定序列同源性(有时也称为“同一性”)，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
包含本发明的核酸或寡核苷酸的药物或组合物的剂型不特别限定，其可以选自注射剂、注射用粉末、片剂、膏剂、胶囊剂、颗粒剂、气雾剂、喷雾剂或粉吸入剂。在一个优选的实施方案中，包含本发明的核酸或寡核苷酸的药物或组合物的剂型为注射剂。
本发明中，药物或组合物的施用途径不特别限定，包括但不限于以皮下注射、肌肉注射、静脉内给药、口服给药、吸入给药或缓释给药的方式全身给药。
在一个优选的实施方案中，药物或组合物为适用于肠胃外施用，特别是静脉给药的注射剂型。在一个最优选的实施方案中，通过向有需要的受试者以静脉给药的方式施用治疗有效量的包含寡核苷酸的重组质粒载体实现逆转、改善或治疗的恶液质或其相关病症的目的。
在本发明中，术语“防治”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如恶液质的进展。与同等条件下未经治疗的参照组相比，按照任何标准技术来衡量，这种缓解或预防程度至少是5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%或100%。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。需要治疗的包括那些已经患有癌症或恶液质相关疾病的人或者那些需要预防或改善癌症或恶液质相关疾病的人。
本发明使用的术语“受试者”指任何动物(如哺乳动物)，其包括但不限于即将接受特定治疗的人类、非人灵长类动物、啮齿动物以及诸如此类。通常情况下，“受试者”和“患者”在本发明中可互换使用，都指的是受试人。
本发明所用术语“治疗有效量”是指药学上认为的有效给药剂量，即活性药物(即核酸或寡核苷酸)的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。
虽然治疗剂量可以有大范围变化，但本发明人发现所施用的核酸或寡核苷酸可以在低剂量时达到对恶病质的有效治疗。对于个人，例如60 kg体重的个人而言，所述核酸或寡核苷酸的日给药剂量通常为4 μg/人/次-60 μg/人/次，优选5-50 μg/人/次。示例性的有效给药剂量例如5 μg/人/次、6 μg/人/次、7 μg/人/次、8 μg/人/次、9 μg/人/次、10 μg/人/次、11 μg/人/次、12 μg/人/次、13 μg/人/次、14 μg/人/次、15 μg/人/次、16 μg/人/次、17 μg/人/次、18 μg/人/次、19 μg/人/次、20 μg/人/次、21 μg/人/次、22 μg/人/次、23μg/人/次、24 μg/人/次、25 μg/人/次、26 μg/人/次、27 μg/人/次、28 μg/人/次、29 μg/人/次、30 μg/人/次、31 μg/人/次、32 μg/人/次、33 μg/人/次、34 μg/人/次、35 μg/人/次、36 μg/人/次、37 μg/人/次、38 μg/人/次、39 μg/人/次、40 μg/人/次、41 μg/人/次、42μg/人/次、43 μg/人/次、44 μg/人/次、45 μg/人/次、46 μg/人/次、47 μg/人/次、48 μg/人/次、49 μg/人/次、50 μg/人/次。可以每日一次单剂量施用，可以每天分多次施用，也可以间隔使用。
在某些实施方案中，所述核酸或寡核苷酸的日给药剂量为0.005 μg/kg-1 μg/kg，优选0.006-1 μg/kg。示例性的有效给药剂量例如0.006 μg/kg、0.007 μg/kg、0.008 μg/kg、0.009 μg/kg、0.01 μg/kg、0.02 μg/kg、0.03 μg/kg、0.04 μg/kg、0.05 μg/kg、0.06 μg/kg、0.07 μg/kg、0.08 μg/kg、0.09 μg/kg、0.1 μg/kg、0.2 μg/kg、0.3 μg/kg、0.4 μg/kg、0.5 μg/kg、0.6 μg/kg、0.7 μg/kg、0.8 μg/kg、0.9 μg/kg、1 μg/kg。
在本发明中，所述药物的施用能够使所述寡核苷酸在体内循环系统中有效浓度为1×104-1×109拷贝/μl，优选2×104-1×108拷贝/μl，还优选2×104-1×107拷贝/μl，例如2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107拷贝/μl。
在本发明中，所述药物的施用能够使所述寡核苷酸在靶器官内的有效浓度基于对应靶器官的重量为1×104-1×109拷贝/mg，优选2×104-1×108拷贝/mg，还优选2×104-1×107拷贝/mg，例如2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107拷贝/mg。
在本发明中，所述核酸或寡核苷酸还可以与其他药物联合以制备成联合施用药物组合物。其他药物可以是或不是用于恶液质的任何治疗剂，对此不特别限定。需要说明的是，所选择的其他药物与本发明的所述核酸或寡核苷酸不发生不期望的任何反应而产生相互抑制活性的情况。在联合其他药物，例如化疗剂、免疫检查点抑制剂、抗肿瘤药物和免疫调节剂，如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体进行给药时，其他药物的给药剂量根据具体的药物种类以及恶病质类型和发展阶段等情况而定，每次给药剂量可以是0.5 mg/kg-30 mg/kg，优选1-20 mg/kg；例如，对于60 kg体重的人而言，每次给药剂量通常可以为1 mg-1500 mg，例如50 mg-1200 mg，或者100 mg-800 mg，150 mg-600 mg或200 mg-500 mg；示例性的每次给药剂量例如50 mg、100 mg、120 mg、160 mg、180 mg、200 mg、240 mg、260 mg、300 mg、320mg、360 mg、400 mg、500 mg、600 mg、800 mg、1000 mg、1200 mg等；间隔给药，给药频率例如每3-7天给药1次或者每1-5周给药1次，例如每3天给药1次，每5天给药1次，每1周给药1次，每10天给药1次，每2周给药1次，每3周给药1次，每4周给药1次；每5周给药1次等。具体剂量和给药频率应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师根据常规技能可以确定的。
本发明中，所述肿瘤包括但不限于实体瘤或非实体瘤，所述实体瘤包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、肺癌、横纹肌肉瘤、尤因肉瘤、膀胱癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、鼻咽癌、喉癌、胃癌、肾癌、头颈部肿瘤、食管癌、睾丸癌、甲状腺癌或脑癌。非实体瘤包括但不限于白血病、淋巴瘤等血液系统的肿瘤，以及神经系统的肿瘤。
实施例1
以下以肺癌细胞、胃癌细胞以及肝癌细胞为例，示例性地示出了细胞的培养、转染及收集。
细胞复苏：快速从液氮罐中取出所需细胞株，将冻存管放入37-40℃水浴中轻轻晃动至剩下少量冰时取出；将冻存管中细胞液转移至含有完全培养基的15 ml离心管中，1200rpm离心10 min后转移至生物安全柜中，吸除上清；用适量完全培养基重悬细胞，并随后将其转移至培养瓶中，在显微镜下观察到细胞均匀分散；随后将培养瓶转移至CO2培养箱中，37℃，5% CO2培养至细胞汇合度至80-90%进行细胞传代。
细胞传代：显微镜下观察培养瓶中细胞，至其汇合度为80-90%时将其转移至生物安全柜中，吸除上清并随后加入PBS洗涤2-3次，吸除PBS后加入胰酶对细胞进行消化，显微镜下观察细胞形态收缩至圆形时完成消化；加入适量培养基并使用移液器将细胞吹落并收集细胞液至离心管中；细胞液在1200 rpm条件下离心10 min后吸除上清；加入适量培养基对细胞进行重悬，按一定比例将细胞分装至培养瓶中并将培养瓶转移至细胞培养箱中37℃5% CO2条件下进行培养，待细胞数及汇合度达到实验要求时进行后续实验。
细胞铺板：在培养瓶中细胞汇合度为80-90%时将其转移至生物安全柜中，吸除培养基并随后加入PBS洗涤2-3次，吸除PBS后加入适量胰酶进行消化，至细胞形态收缩为圆形时终止消化；加入适量培养基并使用移液器对细胞进行缓慢吹打，使其脱落，收集细胞液至离心管中，在1200 rpm条件下离心10 min；吸除上清并加入适量培养基对细胞进行重悬。吸取20 μl细胞悬液至1.5 ml EP管中，按1:1的比例向EP管中加入台盼蓝并混匀，吸取10 μl混悬液至血球计数板中并进行细胞计数。根据计数结果计算吸取一定量的细胞液至12孔板中，并将12孔板转移至细胞培养箱中37℃ 5% CO2条件下过夜培养。
细胞转染：准备A、B两个离心管。A管加入基础培养基、lipo3000，颠倒混匀后静置5min；B管加入p3000和质粒(对照组为缓冲溶剂，实验组为寡核苷酸质粒，即可通过转录生成目标寡核苷酸的质粒溶液)颠倒混匀。配制完成后(Lipo3000：质粒：P3000=1 μl：0.5 μg：1μl)，将A、B试剂混匀后静置15 min。将上述混合液加入至12孔板中，对其进行定点拍照后将其转移至细胞培养箱中37℃ 5% CO2条件下进行培养。
细胞收集：在转染后3 h、6 h、24 h、48 h以及72 h时观察各处理组细胞生长状态。在采样时间点，将12孔板中上清吸除后加入PBS洗涤；向12孔板中加入胰酶进行消化，消化完成后加入适量完全培养基并将细胞吹打均匀，收集各组细胞液；在1200 rpm条件下离心10 min，吸除上清后加入适量PBS进行重悬分装，并将细胞液保存于-80℃冰箱中用于后续实验。
实施例2
本实施例示出了寡核苷酸质粒在SK-Hep-1细胞系中的目标寡核苷酸(SEQ IDNo.19)表达。
按实施例1中所述方法进行SK-Hep-1细胞系的培养、转染及收集，所收集细胞用于寡核苷酸胞内表达的检测。
总RNA提取：向细胞样本中加入适量RNAiso Plus，混匀体系并室温静置3-10 min；将体系转移至无酶离心管中，使用移液器将体系吹打至无沉淀；向体系中加入适量氯仿，混匀后室温静置3-10 min(体系呈乳白色)；在4℃条件下，12000 rpm离心10-20 min；将上层水相转移至新的无酶离心管中，加入适量异丙醇，混匀体系并室温静置3-10 min；将混合液在4℃条件下，12000 rpm离心5-20 min，弃上清并随后加入适量75%乙醇，混匀后在4℃条件下离心5-15 min；弃上清，将沉淀在室温下干燥；向管中加入适量DEPC水溶解沉淀；取适量溶液用于总RNA检测，其余存放于-80℃保存。
RNA逆转录：准备好全新RNase-free离心管并做好标记；按照DEPC水0.5 μl；AMVRT 5xBuffer 2 μl；dNTP Mixture 1 μl；AMV逆转录酶0.5 μl；RT-1(1μM)2 μl；模板4 μl的比例配制逆转体系；将体系转移至PCR仪中，按照16℃反应30 min，37℃反应60 min，85℃反应10 min，40℃反应∞的程序进行逆转。
qPCR定量检测：按照DEPC水5.9 μl；Taq PCR Mix(2×) 10μl；T1-1探针1 μl；F1-1引物0.5 μl；R1-2引物1.5 μl；Rox参比染料0.1 μl；模板(逆转录产物)1 μl的比例配制qPCR反应体系；按表1所示程序进行qPCR定量检测。
表1 qPCR反应程序
反应结果如图1所示。
实验结果表明，寡核苷酸质粒在转染进肝癌SK-Hep-1细胞系中6 h后，目标寡核苷酸的表达量即出现上升，在转染24 h后，目标寡核苷酸的表达量出现峰值(表达量为1.86×105 copies/ng)，之后目标寡核苷酸的表达量逐步下降，但即使是在转染后72 h，其表达量水平仍处于较高状态(表达量为1.13×105 copies/ng)。这表明寡核苷酸质粒可进入到癌细胞中并顺利且持续表达目标寡核苷酸。
实施例3
本实施例示出了表达SEQ ID NO.19的寡核苷酸质粒对MKN45细胞系中A2AR基因表达量的影响。根据寡核苷酸的分子特征并结合寡核苷酸在体内及体外的肿瘤抑制效果，选定A2AR为寡核苷酸在肿瘤细胞中的候选靶标之一，探究寡核苷酸对A2AR在MKN45细胞中的表达量的影响(MKN45细胞培养、转染及样本收集参照实施例1中进行)。
候选靶标：A2AR(SEQ ID NO.43)；
方法开发：针对候选靶标的CDS区进行qPCR上下游引物设计，将包含所设计上下游引物结合位点的序列导入至质粒中组成重组质粒作为标准品。
靶标引物：
F：5’-TGCTCGCTATCCCATTCG-3’(SEQ ID NO.44)；
R：5’-GCGTGAGGACCAGGACAAA-3’(SEQ ID NO.45)。
总RNA提取及RNA样本逆转录过程同实施例2。
基因表达量检测：对所提取的总RNA样本进行逆转录(逆转录程序：37℃，15 min；85℃，5 min)并对引物及标准品进行预处理；按照表2进行qPCR程序设置并运行。
表2 qPCR反应程序(A2AR)
样本中A2AR基因表达量的结果如图2所示。
由图2可知，在转染寡核苷酸质粒6 h后，MKN45细胞中的A2AR靶标的表达量出现显著的升高；在转染24 h后，A2AR靶标的基因表达量向低水平回调，但仍可检出。肿瘤细胞中A2AR的表达升高能够抑制腺苷的积累，从而抑制肿瘤免疫逃逸。这表明，寡核苷酸质粒的介入能够在一定程度上抑制MKN45细胞的免疫逃逸，从侧面佐证了寡核苷酸质粒对肿瘤细胞的抑制效果。
实施例4
本实施例示出了表达SEQ ID NO.19的寡核苷酸质粒对H292细胞系细胞增殖的影响。
按实施例1中的细胞培养方式进行H292细胞的培养，在细胞铺板阶段将H292细胞按照5.78×104/孔的量接种至96孔板中进行培养。细胞转染阶段按Lipo3000：寡核苷酸质粒：P3000=1 μl：0.5 μg：1 μl的比例进行转染试剂的配制。转染后将96孔板转移至细胞培养箱中37℃ 5% CO2条件下进行培养。
分别在3 h、6 h、24 h、48 h以及72 h时对各处理组进行CCK8检测。向所选培养孔中加入CCK8试剂，随后将其转移至细胞培养箱中37℃ 5% CO2条件下进行培养；培养1 h后用酶标仪检测相应孔中OD450值，根据检测值以下式进行细胞抑制率计算：
抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]x100%，
AS：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测药物)的吸光度；
Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测药物)的吸光度；
Ab：空白孔(不含细胞和待测药物的培养基、CCK-8)的吸光度。
实验结果如图3所示，在寡核苷酸质粒转染3 h后即出现对H292细胞的增殖抑制，随着实验的进行，寡核苷酸质粒对H292细胞的抑制率不断提高；至72 h时抑制率已达到57.13%。说明寡核苷酸质粒对H292细胞的增殖存在抑制。
实施例5
本实施例示出了表达SEQ ID NO.14的寡核苷酸质粒对H460和HEPG2细胞的增殖的抑制作用。
按实施例1中的细胞培养方式进行H460细胞和HEPG2的培养，在细胞铺板阶段将H460细胞和HEPG2按照1×104/孔的量接种至96孔板中进行培养，并转染(各试剂比例与实施例1中一致)的配制和添加。后将96孔板转移至细胞培养箱中37℃ 5% CO2条件下进行培养。
在72 h时对各处理组进行CCK8检测。向所选培养孔中加入10 μl CCK8试剂，随后将其转移至细胞培养箱中37℃ 5% CO2条件下进行培养；培养2 h后用酶标仪检测相应孔中OD450值。
SEQ ID NO.14序列所示的寡核苷酸对H460和HEPG2细胞的增殖的抑制结果如下表3所示。
表3
实施例6
本实施例示出了表达SEQ ID NO.5的寡核苷酸质粒对BXPC3细胞和A549细胞系细胞增殖的影响。
按实施例1中的细胞培养方式进行BXPC3细胞和A549细胞培养，在细胞铺板阶段将BXPC3细胞和A549细胞按照1×104/孔的量接种至96孔板中进行培养，并转染(各试剂比例与实施例1中一致)的配制和添加。后将96孔板转移至细胞培养箱中37℃ 5% CO2条件下进行培养。
在72 h时对各处理组进行CCK8检测。向所选培养孔中加入10 μl CCK8试剂，随后将其转移至细胞培养箱中37℃ 5% CO2条件下进行培养；培养2 h后用酶标仪检测相应孔中OD450值。
结果如下表4所示。
表4
实施例7
本实施例示出了表达SEQ ID NO.1、2、4、9、13和15的寡核苷酸质粒对H292细胞增殖的影响。
按实施例1中的细胞培养方式进行H292细胞培养，在细胞铺板阶段将H292细胞按照1×104/孔的量接种至96孔板中进行培养，并转染(各试剂比例与实施例1中一致)的配制和添加。后将96孔板转移至细胞培养箱中37℃ 5% CO2条件下进行培养。
在72 h时对各处理组进行CCK8检测。向所选培养孔中加入10 μl CCK8试剂，随后将其转移至细胞培养箱中37℃ 5% CO2条件下进行培养；培养2 h后用酶标仪检测相应孔中OD450值。
结果如下表5所示。
表5
实施例8
本实施例示出了寡核苷酸质粒对荷瘤裸鼠的影响。
模型建立：购买6周龄BALB/C裸鼠36只，雌雄各半，经检疫合格和适应性饲养后用于“裸鼠恶液质模型”建立。采用实施例1中所培养细胞(H460细胞系)按1×107细胞·200μl-1·只-1的接种量对裸鼠进行皮下接种(3只用于皮下瘤接种，其余用于原位瘤接种)。接种完成后将裸鼠按性别分笼培养，待皮下瘤长至适当体积时，安乐死小鼠，在无菌条件下取出瘤体并用于原位瘤接种。
肿瘤组织取出并修剪好后，将用于原位瘤模型建立裸鼠麻醉，在其左侧肋弓下缘(肺组织)进行肿瘤组织接种，接种完成后将其转移至饲养笼中，定期采样观察模型建立状态至模型建立成功(即体重丢失大于10%或肿瘤发生转移)。
体内药效探究：模型建立成功后将裸鼠随机分为2组，雌雄各半。通过尾静脉注射的方式分别向各组小鼠注射对照试剂及寡核苷酸质粒注射液。给药量为0.2 mg/kg(按寡核苷酸序列计算给药量为0.9 μg/kg)，给药频率为1次/2天，给药7次。给药过程中，对各处理组裸鼠的临床状态、摄食、饮水等恶液质指标进行观察和记录。
实验结果如图4所示。从第二次给药开始，实验组(寡核苷酸)的摄食量(图4的(a))、饮水量(图4的(b))均较对照组(CK)高。除在第四次给药时，观察到对照组裸鼠摄食量高于实验组，其余时间点，实验组裸鼠的摄食量及饮水量均高于对照组。可见，寡核苷酸质粒的介入能够提高肿瘤恶液质裸鼠的摄食及饮水，帮助缓解恶液质症状。
实施例9
本实施例示出了寡核苷酸质粒对肿瘤恶液质裸鼠的影响。
同实施例8建立肿瘤恶液质裸鼠模型。
体内药效探究：模型建立成功后将裸鼠随机分为2组，雌雄各半。通过尾静脉注射的方式分别向各组小鼠注射对照试剂及寡核苷酸质粒注射液。给药量为0.6 mg/kg，给药频率为1次/2天，给药7次。给药过程中，对各处理组裸鼠的临床状态、饮食指标、肿瘤指标等进行观测。
实验结果如图5所示。由实验结果可知，自肿瘤恶液质裸鼠注射寡核苷酸质粒后，从图5的(a)可知，实验组(寡核苷酸)裸鼠的体重增长率始终维持在相对稳定的水平，恶液质的关键指标，即体重降低得到很大程度的缓解，体重保持平稳增长。至实验结束，实验组裸鼠的体重明显高于对照组(CK)裸鼠。从图5的(b)、(c)和(d)可知，实验结束时，实验组裸鼠的肿瘤体积和肿瘤数量分别较对照组降低了81.39%和62.11%，肿瘤进展受到抑制。此外，实验过程中笼边观察显示，用药全程小鼠未出现腹泻，状态差，精神差，弓背，身体发凉以及死亡的现象，说明寡核苷酸质粒对肿瘤恶液质裸鼠的生存状态起到了改善的作用。
本说明书中提供了核酸或寡核苷酸的具体序列，同时根据相关规定，本申请还提供了计算机可读形式的序列表。需要说明的是，计算机可读形式的序列表中的序列仅供参考，在本说明书中的序列与计算机可读形式的序列表中的序列不一致的情况下，以本说明书中的序列内容为准。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (12)

1.核酸在制备治疗肺癌恶液质的药物中的应用，其特征在于，所述核酸为下述(1)和/或(2)的寡核苷酸，或者所述核酸为用于产生下述(1)和/或(2)的寡核苷酸的表达载体：
(1) 序列如SEQ ID No.5、19、26和40任一项所示的寡核苷酸；
(2) 上述(1)经过核苷酸修饰且具有相同功能的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核苷酸修饰包括对磷酸基团和/或核糖基团进行修饰；
其中，所述磷酸基团的修饰是指对磷酸基团中的氧进行修饰，包括硫代修饰、硼烷化修饰，从而稳定核酸的结构；
所述核糖基团的修饰是指对核糖基团中2’-羟基的修饰，包括在核糖基团的2’-羟基位置引入甲氧基或氟，从而使核糖核酸酶不易切割核酸，增加核酸的稳定性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物进一步包括药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述寡核苷酸包含于细胞外囊泡中。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂、注射用粉末、片剂、膏剂、胶囊剂、颗粒剂、气雾剂、喷雾剂或粉吸入剂。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述恶液质包括因肿瘤发展所引起的恶液质前期、恶液质期和恶液质难治期阶段中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以全身给药方式施用所述药物。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以皮下注射、肌肉注射、静脉内给药、口服给药、吸入给药或缓释给药的方式全身给药。
9. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的施用能够以60 kg体重计，4 μg-60 μg/人/次的量将所述寡核苷酸递送到体内。
10. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的施用能够以60 kg体重计，5μg-50 μg/人/次的量将所述寡核苷酸递送到体内。
11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的施用能够使所述寡核苷酸在体内循环系统中的有效浓度为1×104-1×109拷贝/μl，或所述药物的施用能够使所述寡核苷酸在靶器官内的有效浓度为1×104-1×109拷贝/mg。
12.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的施用能够使所述寡核苷酸在体内循环系统中的有效浓度为2×104-1×108拷贝/μl，或所述药物的施用能够使所述寡核苷酸在靶器官内的有效浓度为2×104-1×108拷贝/mg。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533966A (zh) * 2005-08-01 2012-07-04 俄亥俄州立大学研究基金会 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物
CN113491772A (zh) * 2020-03-20 2021-10-12 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) P4hb抑制剂在治疗或预防肿瘤恶病质中的用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9730967B2 (en) * 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
CN105671072B (zh) * 2014-11-17 2021-03-16 江苏命码生物科技有限公司 含anti-miRNA-214转基因植物的制备方法及其应用
CN105727312A (zh) * 2016-04-14 2016-07-06 冯同保 miR-124的用途、药物组合物及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533966A (zh) * 2005-08-01 2012-07-04 俄亥俄州立大学研究基金会 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物
CN113491772A (zh) * 2020-03-20 2021-10-12 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) P4hb抑制剂在治疗或预防肿瘤恶病质中的用途

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