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CN118291246A - 用于自动化单细胞处理和分析的系统和方法 - Google Patents

用于自动化单细胞处理和分析的系统和方法 Download PDF

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CN118291246A
CN118291246A CN202410250428.5A CN202410250428A CN118291246A CN 118291246 A CN118291246 A CN 118291246A CN 202410250428 A CN202410250428 A CN 202410250428A CN 118291246 A CN118291246 A CN 118291246A
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CN
China
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sample
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substrate
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Application number
CN202410250428.5A
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Inventor
卡利安·翰迪克
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Bio Rad Laboratories Inc
Original Assignee
Bio Rad Laboratories Inc
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Filing date
Publication date
Application filed by Bio Rad Laboratories Inc filed Critical Bio Rad Laboratories Inc
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Abstract

本申请涉及用于自动化单细胞处理和分析的系统和方法。描述了一种用于自动化单细胞捕获和处理的系统和方法，其中该系统包括支持和定位一组样品处理元件(包括集成的成像子系统)的平台；用于致动工具以与由平台支持的该组样品处理元件相互作用的台架；以及支持各个处理子系统和与处理子系统连通的控制子系统的基座。系统可以自动执行与单细胞处理关联的工作流程，包括抗体检测、其他蛋白检测、mRNA检测和/或与空间转录物组学关联的其他应用。

Description

用于自动化单细胞处理和分析的系统和方法
本申请是申请日为2020年06月02日，申请号为2020800575642，发明名称为“用于自动化单细胞处理和分析的系统和方法”的申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月14日提交的美国临时申请第62/861,826号和于2019年9月30日提交的美国临时申请62/907,791的权益，所述美国临时申请各自通过此引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明总体涉及样品处理领域，并且更具体地涉及一种新的且有用的用于样品处理领域中单细胞处理和分析的自动化系统和方法。
背景
随着对细胞特异性药物测试、诊断和其他测定的兴趣增加，允许个体细胞分离、鉴定和取回的系统和方法变得高度合意。已经显示出单细胞捕获系统和方法对这些应用特别有利。然而，用于单细胞捕获和后续分析的关联方法和方案通常必须以特定的顺序和高精度进行，以正确地维持细胞。因此，这些方法对于用户可能是耗时的，以及如果它们没有正确地进行(例如，通过移液错误、通过试剂混淆等)会导致对细胞的损伤或其他不利的结果。特别地，这些新颖的高通量单细胞细胞术测定在转化医学、个体化疗法选择、临床诊断和/或其他用途应用中具有巨大的效用，但缺乏自动化会妨碍新手用户获得适当的性能，从而限制了通量。
此外，大规模并行单细胞分析系统(例如，关于分析蛋白或mRNA的系统)的进步正在彻底改变免疫学研究。患者免疫细胞的高通量单细胞基因表达剖析现在允许研究人员对受试者的复杂免疫状态进行更精确且精细的评价。然而，尽管过去十年在多重化单细胞分析技术的开发方面不断取得进展，但仍然存在限制这些强大工具的快速采用的实践限制。用于从细胞样品获得生物标志物结果的工作流程仍然非常复杂，要求专家用户干预，经历长处理时间，并且具有受限的访问(例如，关于访问多于一个高成本尖端仪器系统)，从而阻碍了许多人访问这样的工具。因此，存在对于能够分析大量的单细胞和生成定量测量(例如，对每个细胞大量的蛋白和/或其他生物标志物的定量测量)的更具成本效益、快速、集成的和自动化的系统的需求。
附图简述
图1A-图1C描绘了用于自动化单细胞样品处理的系统的实施方案的示意性表示；
图2A-图2D描绘了图1A-图1C中示出的系统的变化形式的视图；
图3A-图3E描绘了与用于自动化单细胞样品处理的系统关联的样品处理筒的变化形式的视图；
图4A-图4C描绘了与图3A-图3E中示出的样品处理筒关联的开盖工具的操作模式；
图5A-图5B描绘了与图3A-图3E中示出的样品处理筒关联的阀和加热子系统的操作模式；
图6描绘了成像子系统的实施方案；
图7描绘了用于自动化单细胞样品处理的方法的实施方案的流程图；
图8描述了用于自动化单细胞样品处理的组合物的实施方案；
图9A-图9B描绘了用于自动化单细胞样品处理的方法的第一变化形式；
图10A-图10B描绘了用于自动化单细胞样品处理的方法的第二变化形式；
图11描绘了用于自动化单细胞样品处理的系统和/或方法的一部分的第一扩展形式(extension)；
图12描绘了用于自动化单细胞样品处理的系统和/或方法的一部分的第二扩展形式；
图13描绘了用于自动化单细胞样品处理的系统和/或方法的一部分的第三扩展形式；
图14描绘了用于自动化单细胞样品处理的系统和/或方法的一部分的第四扩展形式；和
图15描绘了用于自动化单细胞样品处理的系统和/或方法的一部分的第五扩展形式。
优选的实施方案的描述
本发明的优选的实施方案的以下描述不意图将本发明限制为这些优选的实施方案，而是使本领域的任何技术人员能够制造和使用本发明。
1.益处
相对于传统的系统和方法，本发明可以赋予若干益处。
特别地，本发明赋予了以下益处：提供用于通过分析大量单细胞和生成定量测量(例如，对每个细胞大量蛋白和/或其他生物标志物的定量测量)的具有成本效益、快速、集成的和自动化的系统和方法，其中集成的系统还包括具有实时成像(例如，对样品捕获基底荧光成像)的集成的系统。本发明的实施方案可以提供高性能解决方案(例如，在高细胞数方面、在高多重化性能方面、在完全自动化方面等)用于以极具成本效益的方式在不同用户之间快速传播技术。
此外，本发明赋予实现单细胞蛋白基因组学(proteogenomic)应用的益处。例如，单细胞细胞术(SCC)涉及用于基于蛋白标志物表征细胞群体的新颖方法，远远超出了常规流式和质量细胞术(flow and mass cytometry)的检测数量。这样的表征可以包括基于抗体染色/加标签的分析(例如，具有细胞类型分离和细胞群体定量的抗体信号检测、与蛋白定量关联的分析等)。虽然描述了蛋白标志物，但是本发明也涵盖了关于mRNA、DNA、聚糖和/或其他生物物质的标志物和加标签的使用。
此外，本发明赋予了提供端到端(end-to-end)解决方案的益处，该方案可以使尖端高参数单细胞细胞术分散(decentralize)。特别地，这样的解决方案允许更宽泛围的实体进行关于发现、转化和/或临床应用的免疫学研究，使其能够在他们的实验中负担对最先进的单细胞工具的使用。
此外，本发明赋予了以下益处：为样品处理一次性用品提供设计的益处，其中一次性用品包括用于将单细胞形式的细胞与官能化颗粒共捕获的区域。这样的一次性用品可以另外地或可选地包括被设计用于在样品处理期间传递热量的区域。
此外，本发明赋予了实现涉及单细胞捕获和后续处理的方案的至少部分自动化的益处，从而优化了运行成功和一致性。更详细地，用户可以不参与方法的部分或全部(例如，装载样品、加盖(capping lids)、仪器上裂解、逆转录过程、cDNA扩增、珠或cDNA产物取回、仪器上文库制备和清理等)。此外，系统和/或方法能够实现比传统系统和方法更好的方案准确性(例如，添加正确试剂的更好准确性、更好的试剂温度控制、关键液体处理步骤的快速处理、精确的孵育时间、最佳的珠洗涤和分离、自动化条形码读取等)。此外，系统和/或方法可以赋予提供防止可能经常在手动进行方案时发生的事故(例如，敲碰系统、试剂溢出、样品或仪器污染等)的益处。
此外，通过使用有限使用和/或预装载和整体式的试剂筒(reagent cartridges)，系统和/或方法可以赋予提供流线化的用户体验与优化的质量控制和设计架构的益处，以适应正在进行的测定发展和未来应用。因此，系统赋予独立或几乎独立控制试剂或试剂组的益处。在该变化形式的具体实例中，系统包括具有以下专用区域中的任何一个或全部的试剂筒：室温区域、冷却区域、加热区域、磁性区域(例如，与加热区域重叠)、废弃物捕获区域、中间试剂停放区域或任何其他合适的区域。在相关的益处中，系统和/或方法可以赋予用户能够购买更小体积的试剂的益处，诸如通过根据特定的自动化方案以待使用的方案特异性类型和数量使试剂分布。这可以发挥节约成本、减少试剂浪费或有任何其他合适的结果的功能。
此外，通过对流体处理和分离元件(例如，磁分离部件)的使用，系统和/或方法可以赋予提供自动化样品和文库清理步骤的益处。相关地，系统和/或方法可以赋予在整个系统中建立更好的流体流动的益处。在第一个实例中，这是通过自动化移液系统(例如，移液器、台架和各种移液管吸头)实现的，该系统可以监测和/或引导流体流动(例如，以维持最佳流速，以建立最佳的试剂体积，等等)而无需用户干预。如以下更详细地描述的，用于单细胞制备和/或其他测定的流体处理系统部件可以涉及使用以下两者：(a)偶接到台架的液体移液器，用于流体分配和泵入流体通道或流体储库(例如，样品处理筒的流体通道或流体储库)和/或(b)内置的芯片上可加压废弃物室，该室通过与流体网络集成的阀连接并受其控制。这样的合而为一的双液体处理系统给予了对通过流体系统的试剂的流量(例如，微升/秒至数十毫升/秒)、递送(例如，1微升-100,000微升)和驻留时间(例如，毫秒至小时)的前所未有的控制。此外或可选地，系统可以在用户干预的情况下(例如，用最小的用户干预，以鼓励最佳的用户干预，等等)监测和/或引导流体流动)。
此外，通过软件和工作流程的改进，系统和/或方法可以使用户进行的手动操作的数量最小化，并提供相关的系统状态报告以确保顺畅的操作和样品处理。
此外，系统赋予了部件(诸如移液器)的三维移动性的益处。在该变化形式的具体实例中，系统包括为移液器提供X-Y-Z移动性的台架，实现移液器以自动化方式进行与流体递送关联的各种任务(例如，刺穿试剂管的箔覆盖物、在一组孔之间转移物质，等等)和/或其他样品处理步骤(例如，靶物质的分离、加热、冷却，等等)。
此外或可选地，系统和/或方法可以赋予任何其他合适的益处。
2.系统
如图1A-图1C所示，用于自动化单细胞捕获和处理的系统100的实施方案包括：平台(deck)110，所述平台110支持和定位一组样品处理元件；台架170，所述台架170用于致动工具以与由平台110支持的该组样品处理元件相互作用；以及基座180，所述基座180支持各种处理子系统和与处理子系统连通的控制子系统，其中控制子系统控制平台110、该组样品处理元件和台架170的状态，以使系统100在各种操作模式之间转换。提供各种工作流程的操作模式的实施方案、变化形式和实例将在下文第3节中进一步详细描述。
系统100的实施方案发挥以下功能：提供用于分析大量单细胞的mRNA方面和/或蛋白方面和生成定量测量(例如，对每个细胞的大量蛋白和/或其他生物标志物的定量测量)的具有成本效益的、快速的、集成的和自动化的系统和方法，其中集成的系统还包括用于实时成像应用(例如，样品捕获基底的荧光成像)的集成的子系统。系统100的实施方案还可以提供高性能解决方案(例如，在高细胞数方面、在高多重化性能方面、在完全自动化方面等)用于以极具成本效益的方式在不同用户之间快速传播技术。
在具体应用中，系统100的实施方案可以自动实现单细胞蛋白基因组学应用。例如，单细胞细胞术(SCC)涉及用于基于蛋白标志物表征细胞群体的新颖方法，远远超出了常规流式和质量细胞术的检测量。这样的表征可以包括基于抗体染色/加标签的分析(例如，具有细胞类型分离和细胞群体定量的抗体信号检测、与蛋白定量关联的分析等)。虽然描述了蛋白标志物，但是本发明也涵盖了关于mRNA、DNA、聚糖和/或其他生物物质的标志物和加标签的使用。
此外，系统100的实施方案可以发挥提供用于进行高参数单细胞细胞术的端到端解决方案的功能。特别地，这样的解决方案允许更宽泛围的实体进行关于发现、转化和/或临床应用的免疫学研究，使其能够在他们的实验中负担对最先进的单细胞工具的使用。此外，系统100的实施方案可以发挥提供样品处理一次性用品的功能，其中一次性用品包括用于将单细胞形式的细胞和官能化颗粒共捕获的区域。这样的一次性用品可以另外地或可选地包括被设计用于在样品处理期间传递热量的区域。
如上文描述的，关于样品处理，系统100的实施方案可以包括或被配置为处理细胞、细胞来源的物质和/或其他生物物质(例如，无细胞核酸)。细胞可以包括以下中的任何一种或全部：哺乳动物细胞(例如，人类细胞、小鼠细胞等)，胚胎，干细胞，植物细胞，或任何其他合适种类的细胞。细胞可以含有起源于细胞内并且任选地被细胞捕获系统捕获用于处理的靶物质(例如靶裂解物、mRNA、RNA、DNA等)。此外，容纳细胞的容器可以由多于一个含细胞的样品(例如，12个样品、24个样品、48个样品、96个样品、384个样品、1536个样品、其他数量的样品)制备，其中在将各种样品混合到单个容器(或减少的容器数量)中之前，对它们进行散列化(hashed)或条形码化。该特征实现在同一自动化运行中自动化处理多于一个样品用于其各个单细胞制备和文库制备操作。此外或可选地，系统100可以被配置为与颗粒(例如，珠、探针、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸等)、液滴、包封的细胞、包封的生物标志物、试剂或任何其他合适的物质相互作用。
系统还可以另外地或可选地包括如以下中描述的系统部件中的任何一个或全部：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号、2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号和2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号，所述美国申请各自通过此引用以其整体并入。
2.1系统：平台
如图1A-图1C和图2A-图2D所示，平台110发挥作为支持和定位用于自动化样品处理的系统100的一个或更多个部件(例如，在顶部宽表面、在顶部和底部宽表面、在侧表面等)的平台的功能。此外，如下文描述的，平台110可以发挥定位系统100的一个或更多个部件以与以下对齐或以其他方式相互作用的功能：流体处理子系统、成像子系统、加热子系统、分离子系统(例如，磁分离子系统)和/或偶接到台架170和/或基座180的其他子系统。在这方面，平台110可以作为参考平台是静止的，而其他部件被致动到位以与平台110的元件相互作用。可选地，平台110可以偶接到一个或更多个致动器，用于定位平台110的元件，以与其他子系统相互作用。
在图1A-图1C所示的实施方案中，平台110提供支持一组样品处理元件的平台，其中样品处理元件可以包括一次性和/或可重复使用的部件，其中该部件包括用于容纳样品处理物质的容器和/或用于处理样品(例如，关于流体处理、关于物质分离、关于加热和冷却等)的工具。在实施方案中，平台110可以支持包括以下中的一个或更多个单元的一组样品处理元件：试剂筒120、样品处理筒130、工具容器140、加热和冷却子系统150、泵送子系统157、液位检测子系统(fluid level detection subsystem)159和分离子系统160。此外或可选地，平台110可以包括与成像子系统190(例如，荧光检测子系统、共聚焦显微镜子系统、光谱检测子系统、全内反射荧光(TIRF)子系统、核磁共振(NMR)子系统、拉曼光谱(RS)子系统等)关联的其他合适的部件。
样品处理元件可以由平台110以共平面方式支持，或者可选地在不同的平面支持。优选地，由平台支持的离散元件是非重叠的，但是平台110的可选实施方案可以以重叠的方式(例如，为了节省空间等，为了操作效率等)支持样品处理元件。
由平台110支持的元件的实施方案、变化形式和实例的细节在下文第2.1.1节至第2.1.8节中进一步描述。
2.1.1平台支持的元件：试剂筒
如图2A-2D所示，平台110包括用于支持试剂筒120的单元的至少一个区域，其中该区域发挥以下功能：相对于下文更详细地描述的加热和冷却子系统150和分离子系统160的部分定位试剂筒120。在这方面，区域可以包括一个或更多个开口、凹陷(recesses)和/或突起，用于在试剂筒120的互补部分与加热和冷却子系统150和分离子系统160的关联部分之间提供界面，并且另外地促进和维持这样的部分之间的对齐。
试剂筒120发挥根据用于各种应用的一个或更多个工作流程在一个或更多个隔室(one or more compartments)中容纳用于样品的细胞捕获和/或处理的物质的功能。因此，试剂筒120可以限定跨越一组域分布的一组存储体积，其中该组域可以被配置为用于为每个域的物质内容物提供合适的环境。一组存储体积可以直接容纳样品处理物质，和/或可以可选地被配置为接收和维持容纳样品处理物质的各个容器(例如，管等)的位置。每个域的存储体积可以以阵列分布，或者以其他方式布置。虽然试剂筒120被描述为由平台110支持，但是试剂筒120的变化形式可以可选地被配置为独立于平台110操作。
试剂筒120还可以另外地或可选地包括以下中描述的方面：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；所述美国申请通过此引用以其整体并入。
2.1.2平台支持的元件：样品筒
如图1C和图2A-图2D所示，在实施方案中，平台110还包括用于支持样品处理筒130的单元的至少一个区域，其中该区域发挥以下功能：相对于在下文更详细地描述的加热和冷却子系统150、泵送子系统157、液位检测子系统159和/或成像子系统190的部分定位样品处理筒130。在这方面，区域可以包括一个或更多个开口、凹陷和/或突起，用于在样品处理筒130的互补部分与加热和冷却子系统150、泵送子系统157、液位检测子系统159和成像子系统190的关联部分之间提供界面，并且另外促进和维持这些部分之间的对齐。
样品处理筒130发挥提供一个或更多个样品处理区域的功能，在该样品处理区域中，细胞被捕获并任选地被分选、处理或以其他方式处理用于下游应用，其中下游应用可以在样品处理筒130上(例如，芯片上)和/或远离样品处理筒130(例如，芯片外)进行。样品处理筒130的部分可以被配置在单个基底内，但是可以另外地或可选地包括跨越多于一个基底的多于一个部分(例如，通过流体路径连接)。
如图3A-图3D所示，样品处理筒的一个实例130”可以包括与其他元件偶接的和/或在其中限定其他元件的基座基底131。此外，关于涉及微流体元件的样品处理，基座基底131可以发挥作为歧管的作用以将流体转移到微流体元件，在处理的各个阶段进入样品处理体积，以及转移样品处理期间产生的废弃物材料。在变化形式中，基座基底131支持以下中的一种或更多种：样品处理芯片132；用于接收样品物质(例如，含有细胞、含有颗粒等)并将其递送到样品处理芯片132中的入口储库133；用于进入样品处理芯片132的一个或更多个区域的进入区域(access region)134；盖(lid)135，所述盖135覆盖进入区域并包括提供密封功能的密封垫(gasket)136；以及用于接收来自样品处理芯片132的废弃物物质的废弃物容纳区域137。样品处理筒130的变化形式可以另外地或可选地包括下文更详细地描述的区域(例如，第二基底80)，该区域用于保持用于处理来源于在样品处理筒130处捕获的细胞的靶内容物的官能化颗粒。筒可能有另外的密封垫端口，以还与仪器中存在的筒外泵送系统连接。然而，基座基底131的变化形式可以包括其他元件。例如，如下文更详细地描述的，基座基底可以包括提供与样品处理芯片132的进一步偶接的一个或更多个开口、凹陷和/或突起，以共同限定用于打开和关闭通过样品处理芯片132的流的阀区域。
如图3A和图3C(仰视图)所示，样品处理芯片132(本文中等同地称为微孔器件或载玻片)限定了一组孔(例如，微孔)。一组孔中的每一个可以被配置为捕获单细胞和/或一个或更多个颗粒(例如，探针、珠等)、任何合适的试剂、多于一个细胞或任何其他物质。在变化形式中，样品处理芯片132的微孔可以被配置用于单细胞与单个官能颗粒的共捕获，以实现分析单细胞和/或来自单细胞的物质而没有跨越孔的污染。样品处理芯片132的实施方案、变化形式和实例在以下中的一个或更多个中描述：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；所述美国申请各自通过以上引用以其整体并入。
在材料组合物中，样品处理芯片132可以由微制造的硅或玻璃熔融二氧化硅材料构成，其发挥实现一组孔的更高分辨率的功能，所述更高的分辨率例如通过在该组孔中限定更尖锐的边缘(例如，更薄的孔壁、以接近90度的角度布置的孔壁，等等)实现。关于下文更详细地描述的成像子系统190，材料组合物可以进一步实现对样品处理芯片132的内容物的光学询问(optical interrogation)(例如，通过底表面、通过顶表面)。与传统芯片设计相比，所描述的材料和制造过程可以进一步实现微孔筒的一个或更多个更小的特征尺寸(例如，长度、宽度、总面积(overall footprint)等)。在具体实例中，根据与以下中的一个或更多个关联的规范，使用深反应离子蚀刻(DRIE)技术来制造样品处理芯片132：具有可接受的缺陷水平(例如，<5％)的成品器件的数量；深度被测量为在标称深度(例如，25微米)的+/-1微米内；Rib被测量为在标称rib尺寸(例如，5微米)的+/-1微米内。为了减轻制造期间的任何问题，由以下开发了样品处理芯片132的具体实例：a)确定蚀刻标称深度为30微米及微孔之间标称宽度为5微米的玻璃基底所需的抗蚀剂厚度和光刻；b)横向抗蚀剂溶蚀和确定掩模偏差；c)表征蚀刻后微孔侧壁的垂直锥度；和d)切割过程优化以实现最终器件的良好产量。
此外或可选地，样品处理芯片132可以包括任何其他合适的材料，诸如-但不限于-聚合物、金属、生物材料或任何其他材料或材料组合。样品处理芯片132可以通过各种方法诸如精密注射成型、精密压花、微光刻蚀刻、基于LIGA的蚀刻或通过其他合适的技术制造。
在一些变化形式中，一组孔的一个或更多个表面(例如，底表面、侧表面、底表面和侧表面、所有表面等)可以与寡核苷酸分子反应，用于将来自个体细胞的生物标志物捕获到各个微孔中。每个和各个微孔上存在的寡核苷酸分子可以被条形码化以允许在每个微孔中处理的生物标志物被连接回特定的孔并从而连接回特定的单细胞。在一种变化形式中，如在通过上文引用并入的一项或更多项申请中描述的，一组孔包括一组微孔，该组微孔具有横向于孔的纵轴截取的六边形剖面。
在一种变化形式中，如图3C所示，样品处理芯片132可以包括入口开口32、位于入口开口下游的用于使流体分布到一组微孔34(例如，1,000个至10,000,000个孔)的第一流体分布网络33、位于一组微孔34下游的第二流体分布网络35，以及出口开口36，该出口开口36偶接到第二流体分布网络35的终末部分用于将废弃物流体从样品处理芯片132转移。在该变化形式中，样品处理芯片132偶接到基座基底131的第一侧(例如，下侧)(例如，通过激光焊接、胶结合、溶剂结合、超声波焊接或另一种技术)。将样品处理芯片132偶接到基座基底131的侧面能够实现将热量从加热和冷却子系统150传递到一组微孔34和/或样品处理芯片132的其他区域，其中加热和冷却子系统150在下文更详细地描述。
如上文描述的，基座基底131还可以包括入口储库133(例如，限定在基底131的与样品处理芯片132偶接的第一侧相对的第二侧)。入口储库发挥以下功能：接收样品物质(例如，含有细胞的样品、含有条形码化细胞的样品、含有包封的物质的样品、含有颗粒的样品等)和/或从上文描述的试剂筒120接收样品处理物质，用于递送到样品处理芯片132的入口开口32中。在变化形式中，入口储库133可以被限定为在基座基底131的表面内的凹陷区域，其中凹陷区域包括与样品处理芯片132的入口开口32对齐和/或密封的小孔(aperture)。基座基底131的入口储库133可以与含有组分和/或气泡缓解组分的上游流体接合，如以下中的一项或更多项描述的：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；所述美国申请各自通过以上引用以其整体并入。
入口储库133还可以被配置为与由平台110支持的或者以其他方式与平台110接合的液位检测子系统159接合，如下文更详细描述的。特别地，入口储库133的部分可以由实现感测入口储库133内的液位(例如，通过光学询问、通过压力感测、通过重量感测等)的材料构成。例如，入口储库133可以由对可见光谱电磁辐射和/或非可见光谱电磁辐射光学透明或半透明的材料构成(例如，通过用不同材料制造、通过制造以在入口储库133处产生薄的材料区域，等等)，其中液位检测子系统159的感测元件可以被配置为相应地询问入口储库133内的液位。
在变化形式中，基座基底131的储库133和样品处理芯片132的入口32中的一个或更多个可以包括可以被系统100的一个或更多个部件打开或关闭的阀部件。在第一变化形式中，入口储库132包括可以由移液管吸头或偶接到台架170(在下文更详细地描述)的流体处理子系统的任何其他合适的附接件进入的小孔。在一些实施方案中，小孔可以被关闭并且因此防止流体从入口储库132向样品处理芯片132行进。然而，入口储库132可以以另一种合适的方式被配置。与入口储库133关联的开口可以具有朝向顶部开放的圆锥形表面，这允许接合和密封移液管吸头，使得流体(水性溶液或油或空气)可以被直接泵入图3C中33所限定的微通道中。
如图3A和图3B所示，基座基底131还可以限定用于进入样品处理芯片132的一个或更多个区域的进入区域134，其中该进入区域可以允许在样品处理的各个阶段观察样品处理芯片132的区域和/或从样品处理芯片132取出。如图3A和图3B所示，进入区域134可以被限定为基座基底131内的凹陷区域，并且包括与包括一组微孔的样品处理芯片132的区域对齐的开口37。样品处理芯片132可以具有少至100个微孔到多至1亿个微孔。因此，在其中微孔区域对环境开放(例如，没有覆盖物来密封孔)的变化形式中，进入区域134的开口37可以发挥作为微孔的功能来提供进入微孔的内容物的通道，用于观察和/或物质提取(例如，通过磁分离，如下文进一步详细描述的)。开口37可以匹配微孔区域的形态和面积，并且在第一变化形式中，如图4B所示，可以是方形开口。然而，在其他变化形式中，开口37可以具有另一种合适的形态。
如图3D所示，样品处理筒130的变化形式可以另外地或可选地包括主体(例如，第二基底80)，用于在样品处理芯片132处相对于以单细胞形式捕获的细胞定位官能化颗粒。主体/第二基底80发挥保持或以其他方式定位官能化颗粒的功能，用于以可靠的方式将靶物质捕获，所述靶物质从样品处理芯片132的一组微孔34处捕获的细胞释放。主体/第二基底80还可以发挥在第一模式和第二模式之间转换的功能，该第一模式为样品处理芯片132的一组孔34和第二基底80之间的流体流动提供间隙(gap)(例如，在初始捕获和/或样品处理步骤期间)，并且该第二模式将第二基底80压到样品处理芯片132以促进样品处理芯片132的一组孔34的内容物的分隔(partitioning)(例如，在初始捕获步骤之后)。甚至更进一步，第二基底80可以发挥实现对样品处理芯片的一组孔34的内容物进行光学询问(例如，通过进入区域134(例如，通过由允许光学询问的材料(诸如熔融二氧化硅或玻璃)构成))的功能。
第二基底80可以由微制造的硅或玻璃熔融二氧化硅材料构成，其发挥实现特征(例如，第二基底80的一组孔)的更高分辨率的功能，所述更高分辨率例如通过在特征中限定更尖锐的边缘(例如，更薄的孔壁、以接近90度的角度布置的孔壁等)实现。在具体实例中，使用深反应离子蚀刻(DRIE)技术或其他蚀刻技术制造第二基底80。此外或可选地，第二基底80可以包括任何其他合适的材料，诸如-但不限于-聚合物、金属、生物材料或任何其他材料或材料组合。在其他变化形式中，第二基底80可以通过各种方法诸如精密注射成型、精密压花、微光刻蚀刻、基于LIGA的蚀刻或者通过其他合适的技术制造。
在变化形式中，第二基底80可以包括被配置为在操作期间面向样品处理芯片132的一组孔34的一组孔81。第二基底80的一组孔81可以被配置为匹配样品处理芯片132的孔的布置，以在第二操作模式(其中第二基底80与样品处理芯片更紧密地接触)中适当地分隔样品处理芯片132的一组孔34。为了保持官能化颗粒，第二基底80的一组孔81可以在数量上比样品处理芯片132的一组孔更小和更大。然而，第二基底80的孔的数量和布置可以以其他方式配置(例如，孔的数量和布置可以在第二基底80和样品处理芯片132之间匹配)。
在变化形式中，第二基底80的一组孔81可以被配置为保持一组官能化颗粒，用于捕获来源于在样品处理芯片132的一组孔34处捕获的一组细胞的靶物质(例如，该组细胞的后裂解物(post-lysis))。在具体的实例中，一组官能化颗粒嵌入第二基底的一组孔81内。在具体实例的变化形式中，一组官能化颗粒通过可渗透分离物质(例如，水凝胶)的方式保持在第二基底的一组孔81内，该可渗透分离物质允许来自样品处理芯片132的裂解细胞的物质(例如，mRNA等)经过分离物质并向第二基底的官能化颗粒扩散。在变化形式中，一组官能化颗粒可以包括用用于与来自一组细胞的靶物质结合的结合部分(在下文第3节中更详细描述的)处理的二氧化硅珠；然而，在其他变化形式中，一组官能化颗粒可以具有另一种合适的组成和配置。
在变化形式中，第二基底可以被配置为与上文描述的进入区域134互补，从而将第二基底80定位成与样品处理芯片132的微孔区域对齐。在支持操作模式时，第二基底80可以通过可压缩层82(例如，由弹性体构成)与样品处理筒130的样品处理芯片132和/或基座基底131分离，使得在第一操作模式中，可压缩层82未被压缩以产生间隙83，该间隙83允许流体跨越样品处理芯片132的一组孔34并在样品处理芯片132和第二基底之间流动。然后，在第二操作模式中，可压缩层82被抵靠样品处理芯片132压缩以分隔样品处理芯片的一组孔34的内容物和/或允许将细胞来源的内容物特定捕获至第二基底80的官能化颗粒。
在具体的实例中，如图3D所示，第二基底80由硅构成并且含有嵌在六边形填充微孔(例如，3微米宽×3微米深)中的面向样品处理芯片132的表面上的数千万个二氧化硅珠。然而，第二基底80的微孔可以具有其他合适的形态(例如，剖面为多边形、剖面为非多边形等)。在实例中，第二基底80通过进入区域134的方式被定位在样品处理芯片132的一组孔34之上(例如，与一组孔34对齐并面向一组孔34)，并且弹性可压缩层82用于偶接和定位第二基底80，使得第二基底80和样品处理芯片132之间的间隙可以被调节(例如，通过台架170的装配(instrumentation)、通过基座180的装配等)以允许：第一操作模式，其中在第二基底80和样品处理芯片132之间产生大约250微米的间隙，使得细胞悬浮液或试剂可以跨越样品处理芯片132的一组孔流动；以及第二操作模式，其中第二基底80被压到样品处理芯片132，使得含有不同细胞的微孔被分隔并彼此分离。更详细地，第二基底80相对于样品处理芯片132的移动可以通过致动器-加热器子系统(在下文更详细地描述)进行，该子系统可以施加期望的力(例如，小于1lb的力，大于或等于1lb的力等)并且还向样品处理筒130提供用于各种反应的定义的和受控的加热。
在具体实例中，2微米直径的官能化二氧化硅颗粒的致密溶液分散在含有聚合化合物(例如，光引发剂、化学聚合剂等)的水凝胶溶液中，并递送到限定一组孔81的第二基底80的表面。在处理期间，多余的二氧化硅颗粒被洗走，并且重复该过程直到一组孔81被珠完全饱和。由于特定的大小和几何形状，在具体实例的第二基底80的每个微孔中只能捕获一个颗粒。多余的液体和颗粒通过在珠上涂抹(smearing)平坦表面来去除，并且水凝胶被聚合(例如，通过光、通过化学反应等)，从而将二氧化硅颗粒保持在第二基底80处的位置中。水凝胶的组成被优化为促进mRNA分子、PCR试剂和酶以及其他物质通过水凝胶并向官能化颗粒的扩散。
然而，在变化形式中，样品处理芯片132的孔可以用作相对于在样品处理芯片132处以单细胞形式捕获的细胞定位官能化颗粒的区域，使得在样品处理芯片132的各个孔内靶细胞与官能化颗粒共捕获(例如，如2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号中；如2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号中；如2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号中，如通过以上引用并入)。
如图3A-图3C所示，基座基底131可以包括或以其他方式偶接到覆盖进入区域134的盖135，其中盖135可以包括提供密封功能的密封垫136，并且其中盖135发挥将进入区域134在打开和关闭模式之间转换的功能，从而防止操作期间的蒸发样品损失和/或样品处理芯片132的内容物的污染。盖135可以另外地或可选地发挥以下功能：保护样品处理芯片132的微孔或其他处理区域的内容物免受碎片的影响，实现对样品处理芯片132的内容物的处理(例如，通过将区域与周围环境分离)，启动方案的开始(例如，通过打开以接受来自移液器的试剂)，防止用户操纵样品处理芯片132(例如，通过在添加了所有必需的试剂之后关闭)，限定(例如，用盖135限定)部分或全部流体路径、腔或储库(例如，用作入口和一组微孔之间的流体路径的顶表面，用作邻近微孔区域的流体路径的边界，用作一组微孔和废弃物室之间的流体路径的顶表面，等等)，或者进行任何其他合适的功能。在样品处理筒130包括第二基底80的变化形式中，盖135可以覆盖并保持第二基底80在进入区域134内的位置；然而，在可以包括第二基底80的样品处理筒130的变化形式中，盖135可以可选地被省略。
如图3B所示，在至少一个变化形式中，盖135可以在形态上与进入区域134的特征互补，使得盖135与进入区域134配合，同时提供与样品处理芯片132的间隙。此外，在变化形式中(如图3B和图3C所示)，当盖135处于关闭位置时，盖135可以在顶表面处与基座基底131基本齐平。然而，盖135可以以另一种形态上合适的方式配置。
在变化形式中，盖135的突起138可以与进入区域134的开口37接合，从而当盖处于关闭位置时，基本上防止进入开口37。如图3B所示，在一些变化形式中，突起138可以具有被密封垫136包围的基部(或其他区域)，密封垫136发挥在盖135的关闭位置密封进入区域134的开口37的功能。然而，盖135的变化形式可以省略密封垫并以另一种合适的方式促进进入区域134的密封。在另一种实施方案中，最接近样品处理芯片132中微孔的盖的整个底表面可以是弹性体基底(例如，平坦的弹性体基底)，允许弹性体盖覆盖微孔，从而防止分子在每个微孔中热循环期间的任何蒸发或扩散损失。
在一些变化形式中，如图3E所示，盖135可以包括加热接口85(例如，主动和/或被动地将热量传递到样品处理芯片132的加热体，有或没有温度传感器)，从而允许在处理期间样品处理芯片132的受控加热)。
在一些变化形式中，盖135可以包括锁或闩锁机构，该锁或闩锁机构允许盖135与基座基底131一起维持在关闭位置直到锁/闩锁机构被释放。在图4A-图4C所示的变化形式中，盖135的外围部分可以包括一个或更多个翼片139，翼片139与基座基底131的对应翼片接收部分接合，其中，翼片139被配置为当被推入基座基底131时弯曲，直到它们与基底131的翼片接收部分接合并从弯曲配置返回到闩锁状态。此外或可选地，在图4A-图4C所示的变化形式中，锁/闩锁机构可以包括释放元件41(例如，杆、凹陷、钩等)，释放元件41可以与一个或更多个翼片139接合，以从翼片接收部分释放一个或更多个翼片139，并且将盖135关于基座基底131从关闭模式转换到打开模式。因此，盖135为盖提供了打开模式和关闭模式，在打开模式中进入区域134未被覆盖，并且在关闭模式中进入区域134被覆盖。在图4A-图4C所示的变化形式中，释放元件41包括远离基座基底131的进入区域134凹进的杆，其中杆可以可逆地偶接到开盖工具145。在变化形式中，开盖工具145可以包括第一区域(例如，第一端)和第二区域(例如，第二端)，第一区域与致动器(例如，致动端(actuating tip)、偶接到下文描述的台架170的流体处理子系统的移液器等)接合，并且第二区域包括被配置为与盖135的释放元件41接合的连接元件42。然后，随着移液器/移液管接口的移动，开盖工具145可以被配置为拉动释放元件41和/或推动盖135，以将盖在打开和/或关闭模式之间转换。因此，关于偶接到下文描述的台架170的流体处理元件，系统100可以提供用于以下的操作模式：将开盖工具145偶接到致动器(例如，偶接到台架170)，开盖工具包括连接元件42；将开盖工具移动到与盖135的释放元件41对齐，将连接元件42与释放元件41可逆地偶接；并且向释放元件41施加力，从而将盖135从闩锁状态释放，并将盖135从关闭模式转换到打开模式。为了有效地施加解闩锁力(例如，通过致动器(例如，偶接到台架170)，基座基底131可以被保持在适当的位置(例如，通过第2.1.4节中描述的保持元件、通过加热和冷却子系统的保持元件、通过液位检测子系统的保持元件、通过平台的保持元件，等等)被动地或主动地施加反作用力对抗通过开盖工具145施加的解闩锁力。
然而，在变化形式中，锁/闩锁机构可以另外地或可选地包括以下或通过以下方式操作：锁和钥匙机构、磁性元件或另一种合适的机构。此外，在可选的变化形式中，盖135可以包括另一种盖致动器，例如，包括使盖围绕与样品处理筒130的宽表面平行的进入口旋转的马达。致动器可以另外地或可选地被配置为平移盖135(例如，使盖135与样品处理筒130的宽表面平行的滑动，使盖135垂直于宽表面平移，等等)或者以其他方式移动盖135以选择性地覆盖和露出一个或更多个预定区域(例如，一组微孔)。因此，盖135可以被配置为以自动化或半自动化的方式操作，使得盖135在一个或更多个触发(triggers)(例如，细胞捕获方案由用户启动，细胞处理方案由用户启动，用于所选方案的所有试剂已经从试剂筒120中添加，等等)后自动关闭，并在一个或更多个触发(例如，细胞捕获方案已经完成，根据用户请求，已经确定细胞是存活的，已经确定单细胞已经被捕获，等等)后打开。此外或可选地，盖135的操作可以由用户启动和/或完成，根据时间表或其他时间模式操作，或者以其他方式操作。
如图3A-图3C所示，基座基底131还可以包括用于接收来自样品处理芯片132的废弃物物质的废弃物容纳区域137。废弃物容纳区域137还可以发挥在样品处理芯片132内维持期望的压力(例如，真空压力等)的功能，从而实现液体从入口储库133通过样品处理芯片132并到达废弃物容纳区域137的流动。废弃物容纳区域137可以被定义为用于从样品处理芯片132接收废弃物或其他物质的体积(例如，凹入基座基底131中，从基座基底132延伸，偶接到基座基底131的出口，等等)。在图3A-图3C所示的变化形式中，废弃物容纳区域137被限定在基座基底131的与样品处理芯片132偶接的一侧相对的一侧，使得来自样品处理芯片132的废弃物被下文更详细地描述的泵送子系统157的力向上推入或拉入废弃物容纳区域137。然而，废弃物容纳区域137可以另外地或可选地被配置在相对于基座基底131和样品处理芯片132的另一个合适的位置，以接收废弃物。
废弃物容纳区域137可以具有10-100mL的容积或另一合适的容积。
如图3A-图3C所示，废弃物容纳区域137可以包括盖子(cover)48(例如，与盖135大致共平面的盖子)，盖子48促进废弃物容纳在废弃物容纳区域137内。可选地，废弃物容纳区域137可以不包括盖子。此外，如图3C所示，废弃物容纳区域137的实例可以包括不同于盖子的泵出口51，其中泵出口51可以允许废弃物室中的剩余空气由筒外泵加压(例如，通过泵送机构等)；然而，废弃物容纳区域137的变化形式可以可选地省略废弃物出口。
关于废弃物容纳区域137，系统100可以进一步包括阀43，该阀43被配置为允许和/或阻止从样品处理芯片132到废弃物容纳区域137的流动。阀43可以与上文描述的样品处理芯片132的出口开口36接合，以实现和/或阻断从出口开口36流出并进入废弃物容纳区域137。阀43可以具有通常打开的状态，并在与阀致动机构相互作用后转换到关闭状态。可选地，阀43可以具有通常关闭的状态，并且在与阀致动机构相互作用后转换到打开状态。
在图3A和图5A-图5B所示的变化形式中，阀43包括弹性体，并且被配置为通过样品处理芯片132的开口44将样品处理芯片132偶接到基座基底131，该开口44与基座基底131的对应阀接收部分对齐。在该变化形式中，阀43的可转换部分被配置为沿着从样品处理芯片132的出口开口36到基座基底132的废弃物容纳区域137的入口的流动路径(例如，沿着从微孔区域到样品处理芯片的出口进入样品处理筒的废弃物容纳区域的流动路径)定位。在实例中，样品处理芯片132的开口44与样品处理芯片132的出口开口37邻接；然而，在其他变化形式中，出口开口37和开口44可以彼此移位并通过另一个微流体通道连接。因此，阀43的关闭可以阻断从出口开口37到废弃物容纳区域137的流动，并且阀43可以打开以允许从出口开口37到废弃物容纳区域137的流动。
在图5A-图5B所示的基座基底131的剖面图像中所示的变化形式中，阀致动器45可以从下方(例如，从平台下方)进入基座基底131，并穿过基座基底131的通道或其他凹陷/开口，以与阀43相互作用。特别地，如图5B(上图)所示，当阀致动器45的端46(与基底中的开口对齐)推压阀(例如，阀43的弹性膜)时，阀43可以转换到关闭状态，以将样品处理芯片132的出口开口37与废弃物容纳区域137流体地去偶接。此外或可选地，如图5B(下图)所示，通过阀致动器45去除力可以去除来自阀43的压力，并将其转换到打开状态，以将样品处理芯片132的出口开口36与废弃物容纳区域137流体地偶接。因此，阀致动子系统包括衔接模式和脱离模式；在衔接模式中，端延伸到阀开口中以使弹性阀变形，从而关闭流动路径；在脱离模式中，端缩回，从而打开流动路径。然而，阀43可以另外地或可选地以另一种合适的方式配置。
在其他变化形式中，系统可以包括用于将阀偶接到样品处理芯片132和/或基座基底131的其他流动路径的类似机构。
然而，基座基底131的变化形式可以包括其他元件。例如，如下文更详细地描述的，基座基底131可以包括提供与样品处理芯片132的进一步偶接的一个或更多个开口、凹陷和/或突起，以促进或抑制通过样品处理芯片132的流动。例如，如图5A所示，基座基底131可以包括将基座基底131偶接到泵送子系统157的泵送元件(例如，通过平台110)的泵开口47，以驱动流体流过样品处理芯片132和/或使流体停止流过样品处理芯片132。
然而，样品处理筒130的基座基底131可以包括其他合适的元件。
2.1.3平台支持的元件：工具容器
如图2A和图2B所示，平台110包括用于支持工具容器140的单元的至少一个区域，其中该区域发挥相对于下文描述的台架170的流体处理设备定位工具容器140的功能。
工具容器140发挥以下功能：根据用于各种应用的一个或更多个工作流程在一个或更多个隔室中容纳用于流体抽吸、流体递送、将样品的靶物质与非靶物质分离的各种工具和/或其他工具的一个或更多个单元。因此，工具容器140可以促进试剂与样品的转移和/或混合，在平台110的各个区域处流体地偶接和/或去偶接元件，或者以其他方式与系统100的一个或更多个部件相互作用。
虽然工具容器140被描述为由平台110支持，但是工具容器140的变化形式可以可选地被配置为独立于平台110操作。
工具容器140还可以另外地或可选地包括以下中描述的方面：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；如以上，所述美国申请各自通过引用以其整体并入。
2.1.4平台支持的元件-成像子系统
如图1A和图6所示，系统100可以包括成像子系统190，所述成像子系统190发挥实现对样品处理芯片132的内容物(例如，同时来自样品处理芯片132的所有微孔)进行实时检测的功能。因此，成像子系统190可以提供比目前现有技术系统实时检测100倍或1000倍或更多细胞的能力。此外，成像子系统190发挥提供低成本、集成的解决方案(例如，具有小的面积尺寸(<1/2立方英尺))使得它可以容易地集成到用于样品制备的台式系统中的功能。更详细地，成像子系统190可以提供固态的、完全集成的检测系统，该检测系统能够观察样品处理芯片132的全部感兴趣的一个或更多个区域，以允许当不同试剂被泵送通过细胞和/或用特定的热反应(例如，温度孵育)处理时，对细胞中发生的事件进行快速的实时检测(例如，基于荧光的检测)。
在实施方案中，成像子系统190包括照明子系统192和检测子系统196，其中照明子系统192发挥对样品处理芯片132和/或其内容物照明(例如，具有与各种处理步骤和反应关联的内容物的激发)的功能。检测子系统196发挥提供对样品处理芯片132的全部感兴趣的一个或更多个区域的实时扫描的功能，以实现实时检测。在变化形式中，成像子系统190还可以包括成像控制器199，其发挥同步或以其他方式协调成像子系统190的照明和检测功能的功能。如图1A和图6所示，成像子系统190可以至少部分地由基座180支持并且被配置为关于在平台110处的样品处理筒130处的靶对象的照明和/或检测与平台110接合；然而，成像子系统190可以以其他方式配置。
在具体实例中，如图6所示，照明子系统192包括：与一组滤光器194(例如，带通干涉滤光器)偶接的一组发射器193(例如，发光二极管LED)，以及一组光学元件195，以均匀地对样品处理芯片的整个表面区域(例如，1cm2的靶区域、小于1cm2的靶区域、大于或等于1cm2的靶区域)照明。在具体实例中，来自特定颜色的发射器的光通过一组光学元件的方式被准直，并以一定角度透射以对靶区域照明。在具体实例中，发射器(例如，LED)被选择为具有大约1瓦的光功率以提供适当的系统灵敏度；然而，在其他变化形式中，发射器可以具有另一种合适的功率输出。在具体实例中，照明子系统192包括偶接到照明子系统192的子单元(例如，LED、带通滤光器、激发滤光器和一个或多于一个透镜)的定制同心持器，从而分别配置对应于每种发射器颜色的每个子单元。在具体实例中，为4色荧光检测系统选择的染料是DAPI(Ex-365nm)、FITC(Ex-475nm)、Alexa Fluor 568(Ex-568nm)和Alexa Fluor 647(Ex-635nm)；然而，可以根据应用选择其他发射器波长、滤光器和染料(例如，可以使用多于4个(例如，6个)或少于4个(例如，3个)波长范围)。为了提高照明子系统192的性能，可以用以下选择滤光器：阻挡OD>6，从通带到阻挡的快速转换以及通带和阻挡带边缘的精确公差。在具体实例中，照明子系统的性能强烈依赖于为4个激发波长中的每一个递送的总功率、中心和外围之间的照明均匀性以及实现最小的背景荧光。因此，实例的变化形式可以包括增加的用于激发的LED的数量(即，从而增加功率)、更亮的LED(即，从而增加功率)和/或使用具有更高量子效率的不同染料；用于产生增加的光照明均匀性的配置(例如，通过改变激发角度、通过使用放置在多于一个位置的LED或使用反射器)；以及在光路中使用的光学元件和/或支持管中实施期望的表面整饰(surface finish)和黑色涂层(例如，从而减轻背景荧光)。
在具体实例中，检测子系统196包括：一组透镜197(例如，两个0.1NA、复消色差物镜，TL2X-SAP)，所述一组透镜197从400-700nm表现出衍射受限性能，用于使从样品处理芯片132的一个或更多个感兴趣区域发出的光(例如，荧光)成形(例如，准直和聚焦)到检测器198(例如，2500万像素照相机)上。检测子系统196还包括滤光器96(例如，多带通滤光器)，所述滤光器96允许从样品处理芯片132的染色内容物发出的光的传输。具体实例的检测器198包括CMOS部件(例如，具有各自为2.4×2.4微米的5472×3648个像素，其中每个官能化微粒具有～4个像素)。具体实例的检测器198的量子效率是400nm到525nm为～80％，在700nm降低到～45％。具体实例的检测器198在室温具有每秒每像素3.26个电子的暗噪声水平，该水平可以通过将冷却元件定位在检测器198邻近处来改善。然而，具体实例的变化形式可以包括检测器、光学元件和/或滤光元件的任何其他配置。例如，检测器198的变化形式可以被配置为具有更大的像素数量，可用于对官能化微粒的每个分布进行成像和/或结合图像处理，检测子系统196可以被配置为解析来自各个微粒的信号同时减轻来自相邻颗粒的发射。
在具体实例中，检测子系统196的成功性能由以下一个或更多个确定：(1)灵敏度，关于检测附接到二氧化硅微粒上的至少1,000个荧光分子发出的荧光的能力；(2)分辨率，关于分辨两个5微米直径微粒的能力，或低至1微米直径分辨率，或低至亚微米直径分辨率；和(3)所用荧光团之间的最小光谱串扰。关于性能，具体实例实施了用于通过以下提高灵敏度的配置：通过降低背景噪声，和/或通过主动冷却或增加对二氧化硅颗粒加标签的荧光分子的数量降低检测器198的暗电流。关于提高分辨率，检测器198可以被配置为在3个轴(例如，x、y或z轴)中的任何一个进行小的局部移动(例如，微米尺寸的位移)的同时拍摄多于一个图像，并且还可以通过与下文描述的控制器199协作进行高级信号处理来配置，以抑制来自相邻颗粒的贡献。关于光谱串扰的最小化，检测子系统196实施激发/发射滤光器与所用一种或更多种染料的改进匹配。提高成像分辨率的其他实施方案可以通过在微孔芯片和透镜197之间引入多于一个针孔阵列实施共聚焦成像元件，使得只有从特定平面发出的光可以聚焦到成像仪上。
在具体实例中，成像控制器199发挥协调发射器激活和图像捕获的功能。更详细地，控制器199包括用于将发射器在各种激活状态之间转换的架构(例如，关于功率衰减到最大功率的1％或更少以内，关于激活持续2毫秒到20分钟之间，等等)；照明子系统192的部件(例如，发射器、光学元件、滤光器等)和/或具有微米分辨率的检测子系统196的部件(例如，照相机部件、光学元件、滤光器等)的致动，从而允许在图像采集期间对图像进行聚焦；以及关于入射到检测器198上的光的传输和集成对由检测子系统196的图像捕获进行协调/同步化以达到所期望的集成长度(例如，2毫秒到20分钟)。
然而，成像子系统190可以，包括如以下中描述的其他元件和/或配置：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；和2014年3月13日提交的美国申请第14/208,458号，所述美国申请各自通过此引用以其整体并入。
2.1.5平台支持的元件-加热和冷却子系统
如图1A-图1C和图2B所示，系统100可以包括加热和冷却子系统150，所述加热和冷却子系统150发挥向和/或从试剂筒120和/或样品处理筒130的期望区域传递热量的功能。加热和冷却子系统150可以另外地或可选地发挥在系统100的内部体积内维持期望温度的功能。在变化形式中，加热和冷却子系统150可以包括以下的一个或更多个单元：加热元件(例如，Peltier加热元件、电阻加热元件、其他加热元件)、冷却元件(例如，Peltier冷却元件、冷却铝块、使冷却剂循环的流体路径系统等)、热接触或非接触体，用于将热量传递到加热和冷却元件或从加热和冷却元件传递到其他对象、散热器、风扇、温度传感器和热控制电路(例如，电偶接到下文更详细地描述的基座180的处理元件)。在变化形式中，一个或更多个冷却元件可以将存储体积和/或样品维持在2摄氏度和8摄氏度之间，进一步优选地在4摄氏度。此外或可选地，冷却元件可以将一个或更多个存储体积/样品维持在任何合适的温度(例如，低于2摄氏度、高于8摄氏度等)。
加热和冷却子系统150的一个或更多个部分可以接入平台110的开口，以与由平台110支持的其他系统元件(例如，试剂筒、样品处理筒、工具容器等)的期望部分热接合或以其他方式偶接，以为各种应用提供热传递功能。可选地，平台110可以在用于热传递应用的期望区域处由导热材料构成，并且加热和冷却子系统150的部分可以被配置为接触平台110的导热材料区域用于热传递。
在变化形式中，加热和冷却子系统150的一个或更多个热体和/或其他部分可以偶接到致动器，该致动器将热体移入和移出与由平台110支持的元件的热连通。例如，关于样品处理筒130的盖135、样品处理芯片132和/或第二基底80，加热和冷却子系统150的一个或更多个部分可以偶接到致动器(例如，与基座180连通、与平台110连通、与台架170的移动部分连通等)，该致动器将加热和/或控制元件定位在盖135、样品处理芯片132和/或第二基底80处，用于在处理期间加热样品处理筒130的内容物。特别地，可移动的加热部件(例如，被配置为与下文描述的台架的移液管接口偶接的加热对象(heating object))可用于抵靠样品处理芯片132加热和/或按压(compress)第二基底80，用于分隔样品处理芯片132的孔，如下文更详细地描述的。此外或可选地，被配置为加热试剂筒120和/或其他元件的加热和冷却子系统150的部件可以类似地偶接到致动器。然而，系统100的变化形式可以省略加热和冷却子系统150的致动器。
加热和冷却子系统150还可以另外地或可选地包括在以下中描述的方面：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；如以上，所述美国申请各自通过引用以其整体并入。
2.1.6平台支持的元件：泵送子系统
如图1A、图2B和图5A-图5B所示，系统100可以包括泵送子系统157(例如，偶接到平台110和/或基座180)，所述泵送子系统157发挥向上文描述的样品处理筒130的期望部分提供正压和/或负压的功能。更详细地，泵送子系统157可以发挥驱动流体从入口储库133流入样品处理筒130的样品处理芯片132的功能。此外或可选地，泵送子系统157可以发挥将流体从样品处理筒130的废弃物容纳区域137去除并进入外部废弃物接收器的功能。在变化形式中，泵送子系统157可以包括以下：一个或更多个端口58(例如，真空端口)，其被配置为通过平台110中的开口与样品处理筒130接合；偶接到端口58的一个或更多个泵(例如，真空泵、蠕动泵等)；一个或更多个歧管，以提供偶接到一个或更多个泵的压力驱动路径；一个或更多个压力传感器，其被配置为检测沿着压力路径的压力水平；和/或一个或更多个控制电路元件，其被配置为控制泵送子系统157的操作(例如，通过电偶接到下文更详细描述的基座180的处理元件)。因此，在变化形式中，泵送子系统157的部分不直接偶接到样品处理筒130，可以位于平台110和基座180之间。
泵送子系统157还可以另外地或可选地包括在以下中描述的方面：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；如以上，所述美国申请各自通过引用以其整体并入。
2.1.7平台支持的元件：液位检测子系统
如图1A、图2B和图9所示，系统100可以包括液位检测子系统159，该液位检测子系统159至少部分地由平台110支持并且被配置为与样品处理筒130接合。液位检测子系统159发挥检测和/或测量与样品处理筒130和/或系统100的其他流体处理元件处的流体关联的流体参数(例如，流体的二元存在、流体体积、流体流速、流体类型等)的功能。在变化形式中，液位检测子系统159可以包括偶接到液位控制电路的液位传感器(例如，通过电偶接到下文更详细地描述的基座180的处理元件)。
液位检测子系统159还可以另外地或可选地包括以下中描述的方面：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；如以上，所述美国申请各自通过引用以其整体并入。
2.1.8平台支持的元件：分离子系统和操作模式
如图1A和图2B所示，系统100可以包括分离子系统160，所述分离子系统160发挥促进靶物质与非靶物质的分离(例如，使用磁力、使用其他力)的功能。例如，可以使用含有只与T细胞结合的抗体的磁性颗粒将T细胞与血液中的其他细胞分离。通过使用负选择技术，不需要的细胞也可以用抗体颗粒结合。分离的另一个实例可以包括从母体血液中分离胎儿细胞。分离的另一个实例可以包括从全血中分离罕见的循环肿瘤细胞。分离的另一个实例可以包括分离分泌罕见抗体的B细胞。在变化形式中，分离子系统160可以包括在以下中描述的部件的实施方案、变化形式和实例：标题为“System and Method for TargetMaterial Retrieval from Microwells”并且于2019年6月26日提交的美国申请第62/866,726号，该美国申请通过此引用以其整体并入本文。分离子系统160还可以另外地或可选地包括在以下中描述的方面：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；如以上，所述美国申请各自通过引用以其整体并入。
2.2系统-台架
如图1A-图1C、图2A和图2C-图2D所示，系统100可以包括偶接到平台110的台架170，所述台架170发挥支持和/或实现用于沿着一组轴与平台110的元件进行各种相互作用的一个或更多个工具的致动的功能。在变化形式中，台架170提供一个或更多个轨/轨道，用于在三维空间(例如，由平台的第一侧约束的三维体积)中移动工具诸如下文描述的具有移液管接口的移液器174。在变化形式中，使用台架170致动的工具可以相对于样品处理筒130、试剂筒120、工具容器140或其他元件移动，用于使物质(例如细胞、试剂、颗粒等)跨越由平台110支持的不同部件转移。此外或可选地，由台架170支持的工具可以用于读取与由平台110支持的各种一次性物品关联的条形码(例如，关于识别运行的正确设置、关于库存管理等)。台架170优选地实现一个或更多个工具沿着与试剂筒120、样品处理筒130和工具容器140的宽表面平行的一个或更多个轴(例如，图2A所示的X轴和Y轴)，并且另外地沿着与宽表面垂直的轴(例如，图2A所示的Z轴)的移动。台架170可以另外地或可选地实现沿着这些方向的子集或沿着任何其他合适的方向移动。为了实现移动，台架170包括或以其他方式偶接到一个或更多个马达(例如，用于每个轴或移动方向的马达)、用于每个轴或移动方向上的位置识别的一个或更多个编码器、和/或用于控制台架170的一个或更多个开关(例如，用于每个轴的光学开关)(例如，其中开关与关于下文的基座180所描述的控制电路电偶接)。
如图2A所示，台架170可以包括和/或被配置为与移液器174相互作用，移液器174发挥持有、移动和/或以其他方式与任何数量的吸头或其他工具(诸如上文描述的工具容器140的那些)相互作用的功能。在变化形式中，移液器174组件可以包括以下中的一个或更多个：泵(例如，位移泵)，用于为流体的递送和抽吸提供压力差；压力传感器，用于感测移液压力；水平传感器，用于感测移液器174内的液位；吸头检测器(例如，以实现对偶接到移液器174的吸头存在或不存在的确认)；以及吸头喷射马达，所述吸头喷射马达偶接到用于将吸头从移液器174取下的吸头喷射器。如图2A所示，移液器174可以偶接到台架170的Z轨；然而，在其他变化形式中，移液器174可以另外地或可选地偶接到台架170的其他部分。
移液器174优选地可以自动化方式操作(例如，机动化、机械化、自操作等)并且可以被配置为控制以下预定参数中的任何一个或全部：体积(例如，分配精确体积、抽吸精确体积)、每种物质被分配的孔上方的高度(例如，灌注缓冲液(priming buffer)被分配在每个孔顶部上方0.25毫米和0.3毫米之间，细胞悬浮液被分配在每个孔顶部上方0.25毫米的高度，等等)，或者可以根据任何合适的参数控制任何其他合适的性质。此外或可选地，移液器174可以被配置为以手动方式(例如，根据用户，在用户干预下，由用户握持和使用等)或以任何合适的方式操作。在又另一种实施方案中，移液器174可用于拾取与工具容器关联的一个或更多个工具，诸如以下中的任何一个或全部：机械工具、磁性工具、光学工具和任何其他合适的工具。工具可以由移液器174移动到试剂筒和/或微孔筒，使得一个或更多个工具可以关于试剂筒或微孔筒的特定内容物进行特定的机械/磁性和/或光学功能。
台架170可以另外地或可选地包括在以下中描述的方面：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；如以上，所述美国申请各自通过引用以其整体并入。
2.3系统-基座
如图1A所示，系统100可以包括基座180，所述基座180发挥支持与上文描述的平台110和台架170的元件关联的控制和处理架构。在变化形式中，基座180可以支持用于一个或更多个系统功能的控制和处理架构，所述系统功能包括：用于整个样品处理筒130和/或移液器174的流体递送的压力修改；液位感测(例如，在样品处理筒130处、在移液器174处、在试剂筒120的各个存储体积处，等等)；样品处理筒130的开盖机构的致动；用于试剂筒120和/或样品处理筒130的热循环和/或其他加热功能；用于试剂筒120和/或样品处理筒130的冷却功能；分离功能(例如，洗脱、磁分离、其他分离等)；用于控制台架170的功能；涉及接收传感器信号和返回输出的功能；涉及接收传感器信号和执行各种动作的功能；用于使系统门在各种状态(例如，打开状态、关闭状态、锁定状态、解锁状态等)之间转换的功能；与系统电源管理关联的功能；与系统状态指示元件(例如，灯、音频输出装置、视觉输出装置等)关联的功能；与系统输入装置(例如，按钮、键盘、小键盘、鼠标、操纵杆、开关、触摸屏等)关联的功能；与显示装置关联的功能；与系统数据存储装置关联的功能；与系统传输装置(例如有线传输装置、无线传输装置等)关联的功能；和其他合适的功能。
在变化形式中，基座180因此可以支持与处理架构关联(例如在系统上、与系统分离等)的电子子系统(例如，PCB、电源、通信模块、编码器等)，或者任何其他合适的部件，其中处理架构可以包括以下中的任何一个或全部：处理器(例如，微处理器)、控制器(例如，微控制器)、存储器、存储、软件、固件或任何其他合适的部件。此外，处理子系统可以包括发挥以下功能的机器视觉模块：读取标签、验证方案、进行错误检测(例如，检测试剂与指派的方案不匹配)或进行任何其他功能。
例如，在示例操作流程中，操作者可以启动方案的进行(例如，通过按下系统的按钮，通过与系统的触敏显示器交互来进行选择等)。条形码读取器通过扫描平台元件(例如，试剂筒、样品处理筒、工具容器等)的标签来进行错误检测方案并与用户选择的方案进行比较；如果标签与所选方案不匹配，则可以向用户发送通知，并且如果标签正确，则可以开始方案。此时，可以不再需要操作者。根据一个或更多个工作流程，其中一些在下文第3节中描述，正确类型和体积的物质(例如，试剂/样品)以自动化方式在正确的时间添加到样品处理筒中或从样品处理筒中去除。在方案完成后，操作者可以根据期望进行收集和/或处理微孔筒的内容物，和/或建立新的运行。由系统100实现的方法和工作流程的变化形式在下文进一步描述。
控制和处理架构的实施方案、变化形式和实例在以下中进一步描述：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；如以上，所述美国专利各自通过引用以其整体并入。
3.方法
如图7所示，用于样品处理的方法300的实施方案包括：将一个或更多个部件(例如，试剂筒、工具容器和样品处理筒)定位在样品处理系统的平台S310；通过以操作顺序使用工具容器的工具在样品处理筒之间传送试剂筒的内容物S320；在样品处理筒和/或试剂筒处处理样品S330；以及，与传输内容物和处理样品协作地，对来源于样品的内容物照明并检测从来源于样品的内容物发出的信号。
方法300发挥使单细胞/颗粒形式的来源于细胞(或其他靶颗粒)的mRNA、蛋白和/或其他生物标志物的样品处理和分析自动化的功能。方法300可以包括用于自动生成定量测量(例如，对每个细胞的大量蛋白、mRNA和/或其他生物标志物的定量测量)的步骤。方法300优选地使用上文描述的系统100的实施方案、变化形式或实例实施，具有硬件平台子系统、一次性用品和试剂的集成以使从初始样品接收到结果生成的样品处理自动化。更详细地，与上文描述的系统方面关联的方法处理步骤可以包括优化所有使用的试剂的流体泵送压力，使得在样品处理芯片的一组孔处捕获的细胞或颗粒不会在流体泵送期间流出；优化用于探针杂交和探针变性二者的加热/孵育参数；开发荧光检测参数，诸如相对于激发的发射器功率和图像采集定时。方法进一步优选为至少部分自动化(例如，要求用户装载试剂和选择方案，不要求用户干预等)，但是一个或更多个部分可以另外地或可选地手动进行(例如，对于质量控制步骤、对于所有方案、对于罕见方案，等等)。
在变化形式中，其实例将在下文更详细地描述，方法300可用于检测和定量细胞来源的蛋白(例如，在免疫细胞中表达的表面蛋白)，以及开发寡核苷酸标签系统(例如，标签-抗体复合物)用于实时检测微孔内以单细胞形式捕获的来自单细胞的大量(例如，数百种、数千种)生物标志物。这样的方法的变化形式实施了顺序探针杂交和检测以快速实现大约几小时的检测。此外或可选地，在变化形式中，其实例在下文更详细地描述，方法300可用于以大约几小时检测来自多于一个单细胞的多于一种mRNA靶(例如，一组100种或更多种mRNA靶的)，以及mRNA分子的定量(例如，基于使用上文描述的成像子系统190的实施方案的荧光检测)。
此外或可选地，方法300可以包括以下中描述的方法中的任何一种或全部：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；2020年3月12日提交的美国申请第16/816,817号；2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,370号；2018年8月28日提交的美国申请第16/115,059号；2018年7月27日提交的美国申请第16/048,104号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,057号；2017年9月29日提交的美国申请第15/720,194号；2017年2月13日提交的美国申请第15/430,833号；2017年11月22日提交的美国申请第15/821,329号；2017年10月12日提交的美国申请第15/782,270号；2018年7月30日提交的美国申请第16/049,240号；和2017年11月16日提交的美国申请第15/815,532号；如以上，所述美国申请各自通过引用以其整体并入。
与上文描述的方法300和系统元件关联的具体工作流程在下文第3.2节和第3.3节中进一步详细描述，其中样品(例如，包括细胞来源的物质、蛋白、mRNA、蛋白和mRNA的样品；包括各自被多重化条形码加标签多于一个样品的样品；包括来源于细胞或非细胞的生物标志物的包封颗粒的样品等)可以根据工作流程处理。第3.1节中描述了实现这样的工作流程的生物化学组合物。
3.1方法-生物化学组合物
如上文描述的，关于靶的捕获和检测的实现，方法300可以实施对靶加标签并允许顺序探针杂交和检测的组合物，从而允许大量生物标志物的检测和定量测量。
在变化形式中，如图8所示，组合物200可以包括由二氧化硅(其提供非荧光且透明的材料，使荧光成像容易)或另一种合适的材料构成的核心基底210(例如，微球、其他微粒)。在具体实例中，核心基底210的单元可以包括链霉抗生物蛋白涂覆的二氧化硅颗粒(例如，2微米直径、5微米直径等)。核心基底210与用于不同靶(例如抗体、mRNA等)的条形码化寡核苷酸标签220的一个或更多个单元(例如具有多于一个条形码区段)偶联，并且其中寡核苷酸标签220可以与多于一组短寡核苷酸探针230杂交。一组探针230中的每一种可以与一组荧光团240中的荧光团偶联，这实现对大约FP的不同靶的检测，其中F是荧光团的数量，并且P是探针的数量。这样的配置可以允许系列顺序探针杂交和检测(例如，对于免疫组，对于与其他生物标志物关联的另一组)。组合物200的多重化应用可以通过具有更多条形码段、更多荧光团关联的颜色、其他信号发射段(例如，非荧光信号发射段)，和/或每种荧光团颜色更多解链点设计来扩展。标签220被偶联到核心基底210(例如，>106种标签/微粒)，采用适当的洗涤步骤以去除未结合的标签。此外，在使用期间，可以进行探针浓度的稀释，以促进检测(例如，关于优化与荧光团关联的适当信号输出，用于通过成像子系统检测)。
在与抗体加标签和检测相关的具体实例中，组合物200可以包括用于一组不同抗体中的每一种的单链寡核苷酸标签220，其中每一种寡核苷酸标签220与3组短寡核苷酸探针230’(～30个碱基，在变化形式中具有其他合适数量的碱基)特异性杂交。探针中的每一种与四种荧光团(例如，与上文描述的染料对应的荧光团)中的一种偶联，这根据下文描述的方法使用顺序杂交和检测实现多达64种(即，4×4×4)不同抗体的检测。通过将探针配置为具有不同解链点(例如，每种颜色2种，每种颜色多于2种，等等)，示例组合物200的变化形式可用于多重化多达128种(即，64×2，或FP*M，其中F是荧光团的数量，P是探针的数量，并且M是解链点的数量)不同的抗体(或其他靶)。为了不混淆对来自同一微孔的不同标签的检测，多组标签(例如4-8组)可以与二氧化硅微球组特异性地结合并在使用期间相应地分布。例如，关于上文描述的样品处理芯片，一组官能化微球可以跨越样品处理芯片和/或第二基底的一组孔(例如，在样品处理芯片或第二基底的孔的底部)随机分布，从而确保每个孔中存在用于每个抗体组合的组合物200的至少一个单元。
在与mRNA捕获相关的另一个具体实例中，组合物200可以包括用于一组不同靶mRNA中每一种的单链寡核苷酸标签220，其中每种寡核苷酸标签220与3组短寡核苷酸探针230”(～15个碱基，在变化形式中具有其他合适数量的碱基)特异性杂交，随后与mRNA基因特异性反向引物(～20个碱基，在变化形式中具有其他合适数量的碱基)特异性杂交。探针中的每一种与四种荧光团(例如，与上文描述的染料对应的荧光团)中的一种偶联，这使用顺序杂交和检测实现多达64种(即，4×4×4)不同的靶mRNA的检测(例如，为了检测第一mRNA，第一标签可以具有带有荧光团1的第一探针、带有荧光团1的第二探针和带有荧光团2的第三探针；为了检测第二mRNA，第二标签可以具有带有荧光团1的第一探针、带有荧光团2的第二探针和带有荧光团2的第三探针；为了检测第三mRNA，第三标签可以具有带有荧光团2的第一探针、带有荧光团1的第二探针和带有荧光团2的第三探针；等等)。
通过将探针配置为具有不同解链点(例如，每种颜色2种，每种颜色多于2种，等等)，示例组合物的变化形式200”可用于多重化多达128种(即，64×2，或FP*M，其中F是荧光团的数量，P是探针的数量，并且M是解链点的数量)不同的mRNA或其他靶。为了不混淆对来自同一微孔的不同标签的检测，多组标签(例如4-8组)可以与二氧化硅微球组特异性地结合并在使用期间相应地分布。例如，关于上文描述的样品处理芯片，一组官能化微球可以跨越样品处理芯片和/或第二基底的一组孔(例如，在样品处理芯片或第二基底的孔的底部)随机分布，从而确保每个孔中存在用于每个抗体组合的组合物200的至少一个单元。例如，为实现100种mRNA检测，组合物200的单元可以配置有寡核苷酸标签220，用于结合34个不同组的二氧化硅微粒，每个二氧化硅组具有独特的3组标签(即，34种二氧化硅颗粒×3种标签/二氧化硅颗粒组＝102种组合)。然后，在制造样品处理芯片和/或第二基底期间，这些二氧化硅颗粒可以随机嵌入孔内。可选地，为实现100组mRNA检测，组合物200”的单元可以配置为33种含有3组mRNA引物的二氧化硅颗粒以及1种仅含有一种mRNA引物的二氧化硅颗粒。
表1呈现了在组合物的各种配置下可能的可特异性检测的靶的组合的示例数量(例如，关于条形码的数量、荧光团的数量和解链点设计的数量)。
此外或可选地，组合物200、200’、200”的实施方案、变化形式和实例可以包括2019年12月6日提交的美国申请第62/945,006号中描述的方面，该美国申请通过此引用以其整体并入本文。
3.2方法-用于抗体/蛋白检测的示例工作流程
如图9A和图9B所示，配置用于抗体/蛋白检测的方法的变化形式300’可以包括：进行运行准备操作，其中运行准备操作配置系统以进行抗体/蛋白检测方案S305’；在运行准备操作完成后灌注系统的样品处理筒S310’；在样品处理筒处以单细胞形式捕获样品的一组细胞(例如，其中对细胞的抗体/蛋白加标签)S315’；在用于保持一组官能化颗粒(例如，上文描述的组合物200、200’、200”的一组官能化颗粒)的样品处理筒和/或第二基底处，捕获该组官能化颗粒和该组细胞或在该组细胞近捕获一组官能化颗粒S320’；裂解该组细胞并使释放的靶细胞内容物(例如，加标签的抗体、其他靶蛋白)与该组官能化颗粒结合S325’(例如，以及对任何未结合和/或非靶内容物的官能化颗粒进行关联洗涤，和通过分离物质对各个捕获孔进行分隔)；进行逆转录操作S330’，从而将该靶细胞内容物(例如，抗体、其他靶蛋白)的序列与该组官能化颗粒的对应区域(例如，短标签)连接；进行第二链合成操作S335’；在该组官能化颗粒处(例如，在样品处理筒和/或第二基底的孔内)使一组可检测探针(例如，上文组合物的变化形式200的一组可检测探针)中的每一种与第二链杂交S340’；对于该组可检测探针中的每一种，对样品处理筒和/或第二基底照明S345’并生成与对应于该组可检测探针中的每一种的荧光团的发射光关联的图像数据集S350’(例如，以及对先前的可检测探针进行去杂交和洗涤)，从而实现抗体/靶蛋白的检测。方法300’的框与上文描述的系统实施方案的控制和处理元件协同进行。
方法300’可用于大量抗体或其他蛋白的快速检测(例如，关于表征提供一个或更多个被分析的样品的受试者的免疫响应)。在变化形式中，方法300’可适用于免疫响应测试(例如，关于COVID-19，与针对严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)的抗体的检测；关于其他抗体等)。在变化形式中，检测到的抗体可以包括IgM抗体、IgG抗体、IgD抗体、IgA抗体、IgE抗体或其他抗体(例如，非人类抗体)。
更详细地，进行运行准备操作S305’可以包括与以下中的一个或更多个关联的子步骤：制备细胞悬浮液(例如，其中用寡核苷酸标签孵育细胞用于抗体加标签)；初始化和进行系统子系统的操作检查(例如，与平台关联、与台架关联、与基座关联等)；使台架返回到初始位置；将一个或更多个密封件从试剂筒取下和/或将试剂装载到试剂筒上；定位样品处理筒单元；将一个或更多个密封件从定位在平台处的工具容器取下；使用前将细胞悬浮液分配到储存容器中；在用照相机(例如，机器视觉照相机)扫描一次性物品的标签后，验证用于方案的一次性物品的正确定位和状态(例如，关于到期日期)；接收样品识别信息(例如，从操作者接收)；以及启动样品的运行。S305”的步骤可以由系统自动地和/或由操作者实施。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，在运行准备操作完成后灌注系统的样品处理筒S310’和在样品处理筒处以单细胞形式捕获样品的一组细胞S315’，可以包括以下中的一项或更多项：将灌注溶液分散(例如，以防止气泡被截留在样品处理筒内的方式)到样品处理筒的入口储库中；在样品处理筒内孵育灌注溶液；将一种或更多种洗涤溶液分配到样品处理筒的入口储库中；将溶液传送到样品处理筒的废弃物容纳区域；将细胞悬浮液分配到样品处理筒的入口储库中，并在样品处理筒的孔内以单细胞形式捕获细胞；对捕获细胞的抗体(例如，用抗体加标签物质)加标签；以及进行与灌注和细胞捕获关联的其他合适步骤。针对方案中使用的所有试剂对泵送压力进行了优化，使得捕获在孔中的细胞或颗粒不会在流体泵送期间流出。步骤S310’和S315’优选地由系统自动进行但是可以可选地以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，在用于保持一组官能化颗粒(例如，上文描述的组合物200、200’、200”的一组官能化颗粒)的样品处理筒和/或第二基底处，捕获该组官能化颗粒和一组细胞S320’可以包括以下中的一项或更多项：将一组官能化颗粒分配到样品处理筒的入口储库中，并将该组官能化颗粒和该组细胞共捕获；孵育样品处理筒的孔的内容物；以及拾取/释放一个或更多个子步骤所涉及的各种工具(例如，通过偶接到移液管接口的台架)；定位第二基底，其中使该组官能化颗粒与含有单细胞形式的细胞的样品处理筒的孔对齐(例如，通过样品处理筒的盖和/或进入区域)；将该组官能化颗粒保持在位置中(例如，用水凝胶或其他物质等)；以及进行关于官能化颗粒的捕获和定位的其他合适的步骤。针对方案中使用的所有试剂对泵送压力进行了优化，使得捕获在孔中的细胞或颗粒不会在流体泵送期间流出。步骤S320’优选地由系统自动进行，但是也可以以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，裂解该组细胞并使释放的靶细胞内容物(例如，抗体、其他靶蛋白)与该组官能化颗粒结合S325’(例如，以及对任何未结合和/或非靶内容物的官能化颗粒进行关联洗涤，和通过分离物质对各个捕获孔进行分隔)可以包括以下中的一项或更多项：将一种或更多种洗涤溶液分配到样品处理筒的入口储库中；将溶液传送到样品处理筒的废弃物容纳区域；将颗粒结合缓冲液分配到样品处理筒的入口储库中；将裂解溶液(例如，在室温、在低于室温、在高于室温)分配到样品处理筒的入口储库中(例如，持续少于1分钟、持续1分钟、持续多于1分钟，等等)；用裂解缓冲液进行孵育(例如，在室温、在低于室温、在高于室温)；用油置换样品处理筒的孔上方的流体，从而分离孔的内容物并防止不期望的物质跨越孔转移(例如，如2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号中描述的，该美国申请通过此引用以其整体并入本文)；用来自入口储库的空气置换油；将颗粒结合洗涤缓冲液分配到样品处理筒的入口储库中；抵靠样品处理芯片的孔按压第二基底，从而分隔一组孔中含有所捕获细胞的孔；以及进行与细胞裂解关联的其他合适步骤。针对方案中使用的所有试剂对泵送压力进行了优化，使得捕获在孔中的细胞或颗粒不会在流体泵送期间流出。步骤S325’优选地由系统自动进行，但是也可以以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，用该组细胞的裂解物进行逆转录操作S330’，从而将靶细胞内容物(例如，抗体、其他靶蛋白)的序列与该组官能化颗粒的对应区域(例如，短标签)连接，可以包括以下中的一项或更多项：将一种或更多种洗涤溶液分配到样品处理筒的入口储库中(例如，从而洗去不期望的裂解物)；将溶液传送到样品处理筒的废弃物容纳区域；将颗粒结合缓冲液分配到样品处理筒的入口储库中；将DTT溶液分配到样品处理筒的入口储库中；将裂解溶液分配到样品处理筒的入口储库中；用油置换样品处理筒的孔上方的流体，从而分离孔的内容物并防止不期望的物质跨越孔转移(例如，如2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号中描述的，该美国专利通过此引用以其整体并入本文)；用来自入口储库的空气置换油；将颗粒结合洗涤缓冲液分配到样品处理筒的入口储库中；将RT前反应洗涤缓冲液分配到样品处理筒的入口储库中；将RT混合物(RT cocktail)分配到样品处理筒的入口储库中；孵育样品处理筒的内容物；进行孵育步骤；使第二基底朝向和/或远离样品处理芯片移位，从而分隔内容物和/或允许跨越捕获孔的流体流动；以及拾取/释放一个或更多个子步骤中涉及的各种工具。针对方案中使用的所有试剂对泵送压力进行了优化，使得捕获在孔中的细胞或颗粒不会在流体泵送期间流出。步骤S330’优选地由系统自动进行，但是也可以以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，进行第二链合成操作S335’和进行一个或更多个洗涤步骤以去除内容物(例如，不期望的物质、裂解物等)可以包括以下中的一项或更多项：将靶捕获内容物与氢氧化物溶液(例如，氢氧化钠溶液)在容器(例如，试剂筒的容器、样品处理筒的容器)内混合；将官能化磁性颗粒与其他内容物分离(例如，通过所描述的磁性分离子系统的方式)；弃去废弃物物质；洗涤靶内容物；将第二链合成引物酶与洗涤过的靶内容物混合；热循环经分离和洗涤步骤的靶内容物(例如，通过上文描述的子系统的方式)；以及拾取/释放一个或更多个子步骤中涉及的各种工具。步骤S335’优选地由系统自动进行，但是也可以以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，在该组官能化颗粒(例如，在样品处理筒和/或第二基底的孔内)处使一组可检测探针(例如，上文的组合物的变化形式200、200’和200”的一组可检测探针)中的每一种与第二链杂交S340’，可以包括以下中的一项或更多项：将寡核苷酸探针溶液和可荧光检测的部分(例如，如上文关于组合物所描述的)传输到样品处理筒(例如，在微孔芯片的孔内)、第二基底和/或试剂筒，用于在该组官能化颗粒处与物质的对应区域杂交；进行一个或更多个孵育步骤(例如，采用关于温度、渐变(ramp)和循环的合适加热谱)；进行一个或更多个洗涤步骤；以及拾取/释放一个或更多个子步骤中涉及的各种工具。步骤S340’优选地由系统自动进行，但是也可以以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，对于该组可检测探针中的每一种，对样品处理筒和/或第二基底照明S345’可以包括以合适的功率设置通过光学部件向捕获的样品(例如，含有与探针杂交的靶组分)传输光；进行关于光传输的一个或更多个聚焦操作(例如，将光发射和/或样品支持部件致动到位)；协调照明的定时与框S350’中所进行的图像捕获；进行如2014年3月13日提交的美国申请第14/208,458号(通过以上引用并入)中描述的操作；以及进行任何其他合适的照明步骤。步骤S345’优选地由系统(例如，上文描述的成像子系统/照明子系统)自动进行，但是也可以以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，生成与对应于该组可检测探针中的每一种的荧光团的发射光关联的图像数据集S350’可以包括以下中的一项或更多项：通过光学部件将光从捕获的样品(例如，含有与探针杂交的靶组分)向检测子系统传输；进行关于光传输的一个或更多个聚焦操作(例如，将光检测和/或样品支持部件致动到位)；进行关于样品容纳容器的基准的一个或更多个聚焦操作；将多于一幅图像拼接在一起以创建捕获基底(例如，上文描述的样品处理芯片和/或第二基底)的组合图像；协调图像捕获的定时与框S345’中进行的照明；进行如2014年3月13日提交的美国申请第14/208,458号(通过以上引用并入)中描述的操作；以及进行任何其他合适的检测步骤。步骤S350’优选地由系统(例如，上文描述的成像子系统/照明子系统)自动进行，但是也可以以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
关于多于一组探针(例如，与上文描述的各种荧光团对应的多于一组荧光探针)的杂交和检测，步骤S340’、S345’和S350’可以包括用于去杂交(例如，采用加热、通过化学反应、通过光裂解等)和洗涤去杂交的探针的步骤，从而以期望的顺序检测抗体/靶蛋白。因此，第一组条形码化和荧光探针可以杂交到在一组官能化颗粒处捕获的靶上，并且然后以第一荧光谱的检测进行成像。然后，第一组条形码化和荧光探针可以去杂交。然后，可以对一组探针中的每一种重复这些过程，其中基于预设阈值进行图像分析以创建细胞与抗体(或其他蛋白)谱的映射。这样的操作因此可以允许对靶抗体/蛋白的精确检测，具有信号串扰的最小化(例如，关于其中多于一种类型的探针同时与靶组分杂交的情况)。
方法300’的实施方案、变化形式和实例可以另外地或可选地包括2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号、2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号(通过以上引用并入)中描述的步骤。
3.3方法-用于mRNA检测和定量的示例工作流程
如图10A和图10B所示，配置用于mRNA检测的方法的变化形式300”可以包括：进行运行准备操作，其中运行准备操作将系统配置以进行mRNA检测方案S305”；在运行准备操作完成后灌注系统的样品处理筒S310”；在样品处理筒处以单细胞形式捕获样品的一组细胞S315”；在用于保持一组官能化颗粒(例如，上文描述的组合物200的一组官能化颗粒)的样品处理筒和/或第二基底处，捕获一组官能化颗粒和该组细胞S320”；裂解该组细胞并使释放的靶细胞内容物(例如，mRNA)与该组官能化颗粒结合S325”(例如，和对任何未结合和/或非靶内容物的官能化颗粒进行关联洗涤，和通过分离物质对各个捕获孔进行分隔)；进行逆转录操作S330”，从而将该靶内容物(例如，mRNA)的序列与该组官能化颗粒的对应区域(例如，短标签)连接；进行第二链合成操作S335”；在该组官能化颗粒处(例如，在样品处理筒和/或第二基底的孔内)使一组可检测探针(例如，上文的组合物的变化形式200,200’和200”的一组可检测探针)中的每一种与第二链杂交S340”；对于该组可检测探针中的每一种，对样品处理筒和/或第二基底照明S345”并生成与对应于该组可检测探针中的每一种的荧光团的发射光关联的图像数据集S350”(例如，和对先前的可检测探针进行去杂交和洗涤)，从而实现mRNA的检测。方法的变化形式300”还可以包括处理图像数据集的步骤，以及用于检测到的荧光的归一化的一组操作S355”；进行用于减轻与图像数据集关联的光学串扰的操作S360”；以及使用图像数据集进行基于终点PCR检测的mRNA定量操作S365”。
方法300”可以发挥快速(例如，在几小时内)检测每个单细胞上的数百种转录物的功能，以自动化方式在3小时内进行。例如，使用上文描述的系统的实施方案，方法300”的实施可以为单细胞分析提供端到端的解决方案，无论分析是处于发现、转化还是临床阶段。方法300”的扩展形式可以用于空间转录组学，其中对分布在空间(例如，跨越一组微孔、在组织内、在2D结构内、在3D结构内等)中的生物物质(例如，细胞、组织)的mRNA进行分析。
更详细地，进行运行准备操作S305”可以包括与以下中的一个或更多个关联的子步骤：制备细胞悬浮液；初始化和进行系统子系统的操作检查(例如，与平台关联、与台架关联、与基座关联等)；使台架返回到初始位置；将一个或更多个密封件从试剂筒取下和/或将试剂装载到试剂筒上；定位样品处理筒单元；将一个或更多个密封件从定位在平台处的工具容器取下；使用前将细胞悬浮液分配到储存容器中；在用照相机(例如，机器视觉照相机)扫描一次性物品的标签后，验证用于方案的一次性物品的正确定位和状态(例如，关于到期日期)；接收样品识别信息(例如，从操作者接收)；以及启动样品的运行。S305”的步骤可以由系统自动地和/或由操作者实施。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，在运行准备操作完成后灌注系统的样品处理筒S310”和在样品处理筒处以单细胞形式捕获样品的一组细胞S315”，可以包括以下中的一项或更多项：将灌注溶液分散(例如，以防止气泡被截留在样品处理筒内的方式)到样品处理筒的入口储库中；在样品处理筒内孵育灌注溶液；将一种或多种洗涤溶液分配到样品处理筒的入口储库中；将溶液传送到样品处理筒的废弃物容纳区域；将细胞悬浮液分配到样品处理筒的入口储库中，并在样品处理筒的孔内以单细胞形式捕获细胞；对捕获细胞的抗体(例如，用抗体加标签物质)加标签；以及进行与灌注和细胞捕获关联的其他合适的步骤。针对方案中使用的所有试剂对泵送压力进行了优化，使得捕获在孔中的细胞或颗粒不会在流体泵送期间流出。步骤S310”和S315”优选地由系统自动进行但是可以可选地以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，在用于保持一组官能化颗粒(例如，上文描述的组合物200的一组官能化颗粒)的样品处理筒和/或第二基底处，捕获该组官能化颗粒和该组细胞S320”可以包括以下中的一项或更多项：将一组官能化颗粒分配到样品处理筒的入口储库中，并将该组官能化颗粒和该组细胞共捕获；孵育样品处理筒的孔的内容物；以及拾取/释放一个或更多个子步骤所涉及的各种工具(例如，通过偶接到移液管接口的台架)；定位第二基底，其中使该组官能化颗粒与含有单细胞形式的细胞的样品处理筒的孔对齐(例如，通过样品处理筒的盖和/或进入区域)；将该组官能化颗粒保持在位置中(例如，用水凝胶或其他物质等)；以及进行关于官能化颗粒的捕获和定位的其他合适步骤。针对方案中使用的所有试剂对泵送压力进行了优化，使得捕获在孔中的细胞或颗粒不会在流体泵送期间流出。步骤S320”优选地由系统自动进行但是可以可选地以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，裂解该组细胞并使释放的靶细胞内容物(例如，mRNA)与该组官能化颗粒结合S325”(例如，和对任何未结合和/或非靶内容物的官能化颗粒进行关联洗涤，并用分离物质对各个捕获孔进行分隔)可以包括以下中的一项或更多项：将一种或更多种洗涤溶液分配到样品处理筒的入口储库中；将溶液传送到样品处理筒的废弃物容纳区域；将颗粒结合缓冲液分配到样品处理筒的入口储库中；将裂解溶液(例如，在室温、在低于室温、在高于室温)分配到样品处理筒的入口储库中(例如，持续少于1分钟、持续1分钟、持续多于1分钟等)；用裂解缓冲液进行孵育(例如，在室温、在低于室温、在高于室温)；用油置换样品处理筒的孔上方的流体，从而分离孔的内容物并防止不期望的物质跨越孔转移(例如，如2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号中描述的，该美国申请通过此引用以其整体并入本文)；用来自入口储库的空气置换油；将颗粒结合洗涤缓冲液分配到样品处理筒的入口储库中；抵靠样品处理芯片的孔按压第二基底，从而分隔该组孔中含有捕获细胞的孔；以及进行与细胞裂解关联的其他合适步骤。针对方案中使用的所有试剂对泵送压力进行了优化，使得捕获在孔中的细胞或颗粒不会在流体泵送期间流出。步骤S325”优选地由系统自动进行但是可以可选地以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，用该组细胞的裂解物进行逆转录操作S330”，从而将靶细胞内容物(例如，mRNA)的序列与该组官能化颗粒的对应区域(例如，基因特异性或mRNA特异性反向引物)连接，可以包括以下中的一项或更多项：将一种或更多种洗涤溶液分配到样品处理筒的入口储库中(例如，从而洗去不期望的裂解物)，其中洗涤可以包括使第二基底远离样品处理芯片移位，并允许洗涤缓冲液在样品处理芯片的孔和第二基底之间流动；将溶液传送到样品处理筒的废弃物容纳区域；将颗粒结合缓冲液分配到样品处理筒的入口储库中；将DTT溶液分配到样品处理筒的入口储库中；将裂解溶液分配到样品处理筒的入口储库中；用油置换样品处理筒的孔上方的流体，从而分离孔的内容物并防止不期望的物质跨越孔转移(例如，如2019年9月9日提交的美国申请第16/564,375号中描述的，该美国申请通过此引用以其整体并入本文)；用来自入口储库的空气置换油；将颗粒结合洗涤缓冲液分配到样品处理筒的入口储库中；将RT前反应洗涤缓冲液分配到样品处理筒的入口储库中；将RT混合物分配到样品处理筒的入口储库中；分配正向引物；分配核苷酸；孵育样品处理筒的内容物；进行孵育步骤；使第二基底朝向和/或远离样品处理芯片移位，从而分隔内容物和/或允许跨越捕获孔的流体流动；以及拾取/释放一个或更多个子步骤中涉及的各种工具。针对方案中使用的所有试剂对泵送压力进行了优化，使得捕获在孔中的细胞或颗粒不会在流体泵送期间流出。步骤S330”优选地由系统自动进行但是可以以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，进行第二链合成操作S335”和进行一个或更多个洗涤步骤以去除内容物(例如，不期望的物质、裂解物等)可以包括以下中的一项或更多项：将靶捕获内容物与微孔筒内的氢氧化物溶液(例如，氢氧化钠溶液)混合；弃去废弃物物质；洗涤靶内容物；将第二链合成引物酶与洗涤过的靶内容物混合；热循环经分离和洗涤步骤的靶内容物(例如，通过上文描述的子系统的方式)；以及拾取/释放一个或更多个子步骤中涉及的各种工具。步骤S335”优选地由系统自动进行但是可以可选地以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
在随后步骤中的杂交和分析之前，框S335”还可以包括用框S335”的双链结果进行PCR操作步骤，包括以下中的一项或更多项：将一种或更多种溶液(例如，含有聚合酶、正向引物、核苷酸等)递送到含有框S335”的双链结果的孔中；进行一个或更多个PCR循环，使得在捕获原始mRNA的同一二氧化硅微球上产生的mRNA模板的多于一个拷贝；使DNA变性；并且洗去变性的DNA，从而在该组官能化颗粒处仅留下单链靶寡核苷酸。
更详细地，在该组官能化颗粒(例如，在样品处理筒和/或第二基底的孔内)处使一组可检测探针(例如，上文的组合物200的变化形式的一组可检测探针)中的每一种与第二链杂交S340”，可以包括以下中的一项或更多项：将寡核苷酸探针溶液和可荧光检测的部分(例如，如上文关于组合物所描述的)传输到样品处理筒(例如，在微孔芯片的孔内)、第二基底和/或试剂筒，用于在该组官能化颗粒处与物质的对应区域杂交；进行一个或更多个孵育步骤(例如，采用关于温度、渐变和循环的合适加热谱)；进行一个或更多个洗涤步骤；以及拾取/释放一个或更多个子步骤中涉及的各种工具。框S340”可以另外地或可选地包括基因特异性探针杂交到捕获的靶寡核苷酸上，以促进对每种官能化颗粒的每种mRNA的模板产物数量的估计，如下文关于mRNA定量步骤进一步描述的。步骤S340”优选地由系统自动进行但是可以可选地以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，对于该组可检测探针中的每一种，对样品处理筒和/或第二基底照明S345”可以包括以合适的功率设置通过光学部件向捕获的样品(例如，含有与探针杂交的靶组分)传输光；进行关于光传输的一个或更多个聚焦操作(例如，将光发射和/或样品支持部件致动到位)；协调照明的定时与框S350”中所进行的图像捕获；进行如2014年3月13日提交的美国申请第14/208,458号(通过以上引用并入)中描述的操作；以及进行任何其他合适的照明步骤。步骤S345”优选地由系统(例如，上文描述的成像子系统/照明子系统)自动进行但是可以以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
更详细地，生成与对应于该组可检测探针中的每一种的荧光团的发射光关联的图像数据集S350”可以包括以下中的一项或更多项：通过光学部件将光从捕获的样品(例如，含有与探针杂交的靶组分)向检测子系统传输；进行关于光传输的一个或更多个聚焦操作(例如，将光检测和/或样品支持部件致动到位)；进行关于样品容纳容器的基准的一个或更多个聚焦操作；将多于一幅图像拼接在一起以创建捕获基底(例如，上文描述的样品处理芯片和/或第二基底)的组合图像；协调图像捕获的定时与框S345”中的照明；进行如2014年3月13日提交的美国申请第14/208,458号(通过以上引用并入)中描述的操作；以及进行任何其他合适的检测步骤。步骤S350”优选地由系统(例如，上文描述的成像子系统/照明子系统)自动进行但是可以以另一种合适的方式进行。此外，各种子步骤可以进行一次，或者按照建议重复进行。
关于多于一组探针(例如，与上文描述的各种荧光团对应的多于一组荧光探针)的杂交和检测，步骤S340”、S345”和S350”可以包括用于用于去杂交(例如，采用加热、通过化学反应、通过光裂解等)和洗涤去杂交的探针的步骤，从而实现以期望的顺序检测抗体/靶蛋白。因此，第一组条形码化和荧光探针可以杂交到在该组官能化颗粒处捕获的靶上，并且然后以第一荧光谱的检测进行成像。然后，第一组条形码化和荧光探针可以去杂交。然后，可以对该组探针中的每一种重复这些过程，其中基于预设阈值进行图像分析以创建细胞与抗体(或其他蛋白)谱的映射。这样的操作因此可以允许对靶抗体/蛋白的精确检测，具有信号串扰的最小化(例如，关于其中多于一种类型的探针同时与靶组分杂交的情况)。
如上文描述的，方法300”可以包括以下中的一项或更多项：处理图像数据集，以及用于检测到的荧光的归一化的一组操作S355”；进行用于减轻与图像数据集关联的光学串扰的操作S360”；以及使用图像数据集进行基于终点PCR检测的mRNA定量操作S365”。
更详细地，处理数据集和一组用于对检测到的荧光进行归一化的操作S355”，可以发挥对空间分布(例如，跨越微孔阵列)的靶(例如，mRNA内容物等)进行归一化检测的功能。例如，与空间中第一位置处的一个官能化颗粒缔合的mRNA探针所发射的绝对荧光可以不同于与空间中第二位置处的另一个官能化颗粒缔合的mRNA探针所发射的绝对荧光，即使它们可能捕获相同数量的mRNA探针。因此，在变化形式中，框S355”可以包括实施与每个官能化颗粒的条形码探针关联的平均颜色特异性荧光，以归一化相应的mRNA探针的荧光值。由于在运行中使用的所有官能化颗粒可以被选择为在相同的制造批次中，因此可以假定每个官能化颗粒具有相似数量的寡核苷酸标签。由于在条形码解码期间，所有官能化颗粒会被视为具有相同浓度的探针分子，因此也可以假定每个官能化颗粒会附接相似数量的条形码标签。在官能化颗粒在其条形码段中不具有特定颜色的情况下，框S355”可以将来自相邻官能化颗粒的值实施用于归一化。然而，归一化可以以另一种合适的方式实施。
更详细地，进行用于减轻与图像数据集关联的光学串扰的操作S360”可以包括以下中的一项或更多项：在被成像的各种基底(例如，样品处理芯片、其他基底)的各个捕获区域(例如，孔)之间实施物理屏障；采用滤光操作进行图像处理；控制成像和照明操作的定时；以及进行其他合适的减轻串扰的操作。
更详细地，使用图像数据集进行基于终点PCR检测的mRNA定量操作S365”可以发挥利用相对“纯”的样品处理配置的功能，其中在扩增步骤之前只有模板mRNA分子存在于官能化颗粒。特别地，关于上文描述的处理步骤，大多数PCR抑制物(例如，细胞裂解物蛋白、脂质等)在多于一个步骤中被洗去，并且最终任何经扩增的模板会集中在相应的官能化颗粒。因此这种集中效应允许对PCR产物的存在进行检测，即使是在珠上只有相对少的数量(例如，～1000个、少于1000个、多于1000个等)的模板分子。因此，关于框S365”，假定PCR效率(例如，90％的PCR效率)可以指导产生期望模板分子扩增以进行定量所需的PCR循环的阈值数量(例如，对于1000倍扩增为11个循环)。因此，定量模型可用于根据来源于捕获的图像数据的终点(或与PCR循环关联的其他点)荧光值来估计模板mRNA(或其他靶)的初始浓度。定量模型可以以单细胞分辨率应用于在捕获的基底处捕获的所有细胞的靶物质(例如，mRNA)。
然而，方法300”的实施方案、变化形式和实例可以另外地或可选地包括在以下中描述的步骤：2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号；2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号；如通过以上引用并入的。
3.4方法-扩展形式
在变化形式中，所描述的方法和/或关联的系统部件可以适用于其他应用。
例如，在方法300”的第一扩展形式中，通过允许官能化颗粒在捕获孔内堆叠，每个细胞中检测到的转录组的数量可以增加(例如，～100个到超过500个)。在变化形式中，如图11所示，一组孔可以配置得更深，使得多于一个官能化颗粒可以在每个孔内堆叠。此外，为了增加独特条形码的数量，用于检测的寡核苷酸标签的数量可以增加(例如，3种增加到多于3种)，从而增加如上文描述的的多重化组合的总数。为了检测和解析来自堆叠的官能化颗粒的荧光，可以修改上文描述的成像系统的实施方案，以进行共聚焦检测或被配置为对样品的不同平面成像的其他检测方法。
在另一种扩展形式中，方法可以适用于组织或其他结构的空间转录组分析。在实例中，如图12所示，包含第二基底的流体歧管可以被定位成与包含安装的组织载玻片的载玻片对齐(例如，代替上文描述的样品处理芯片的实施方案)。因此，这种配置可以对组织载玻片进行免疫表型分型，然后以类似于上文描述的方式将裂解的mRNA转移到官能化颗粒。然后，在官能化颗粒处捕获的mRNA可以通过PCR扩增，随后多重化检测和定量。因此，关于上文描述的方法步骤的实施方案，方法可以包括以下中的一项或更多项：在样品处理基底的一组微孔处，以单阵列形式捕获一组官能化颗粒邻近处的组织样品；在样品处理基底处进行组织样品的裂解，从而允许使从组织样品释放的生物标志物与该组官能化颗粒结合；在样品处理基底的该组微孔处用与该组官能化颗粒结合的内容物进行逆转录操作；用与该组官能化颗粒结合的内容物对逆转录操作的产物进行第二链合成操作；在该组官能化颗粒处对第二链合成操作的产物进行扩增操作；使与一组荧光团对应的一组探针中的每一种与扩增操作的产物杂交；以及生成由该组探针发射的光的图像数据集，从而实现检测样品的该组靶。
在另一种扩展形式中，一种或更多种方法可以适用于单细胞的表型分型，随后是用于下一代测序的单细胞转录组文库制备(例如，如在2020年5月5日提交的美国申请第16/867,235号、2020年5月5日提交的美国申请第16/867,256号(通过以上引用并入)中描述的)。通过寡核苷酸颗粒的多重化条形码检测，方法可以以用于将表型信息与测序期间生成的转录组信息联系起来的方法进行扩展。
在另一种扩展形式中，一种或更多种方法可适用于单细胞的顺序处理，以在第一官能化颗粒类型捕获广泛的非特异性生物标志物，随后在第二颗粒类型进行靶向捕获和检测(例如，如图13所示)。
在另一种扩展形式中，一个或更多个系统和/或一种或更多种方法可以实施微孔设计，由此微孔包括微孔2的底部处的凹陷14(例如，星形凹陷、椭圆形凹陷、多边形凹陷等)与柱15(例如，位于中心的一根柱或多于一根柱)，其中凹陷14被配置为保持官能化颗粒(例如，上文描述的组合物200的实施方案)，并且柱15被配置为将捕获的细胞相对于官能化颗粒定位在微孔2内。图14描绘了具有凹陷14的微孔2(图14，左上)、凹陷内具有官能化颗粒的微孔2(图14，右上和右下)和具有捕获的细胞的微孔2(图14，左下和右下)的实例的俯视图。
此外，扩展形式可以以任何合适的方式组合。例如，如图15所示，图14所示系统的实施方案可用于涉及单细胞顺序处理的应用，以在第一官能化颗粒类型捕获广泛的非特异性生物标志物，随后在第二颗粒类型进行靶向捕获和检测。
然而，所描述的一种或更多种方法可以扩展到其他用途应用。
4.结论
附图图示了根据优选的实施方案、实例配置及其变化形式的系统、方法和计算机程序产品的可能实施方式的架构、功能和操作。在这方面，流程图或框图中的每个框可以代表模块、区段或代码部分，其包括用于实施指定的一个或更多个逻辑功能的一个或更多个可执行的指令。还应当指出的是，在一些可选的实施方式中，在框中提到的功能可以以在附图中指出的顺序以外的顺序发生。例如，根据所涉及的功能，示出的两个连续的框可以，实际上，基本上同时执行，或者框可以有时以相反的顺序执行。还应当指出的是，框图和/或流程图图示中的每一个框，以及框图和/或流程图图示中的框的组合，可以由进行指定功能或动作的基于特殊目的的硬件的系统、或特殊目的的硬件和计算机指令的组合来实施。
本发明还提供了以下实施方案：
1.一种用于检测样品的一组靶的方法，所述方法包括：
在样品处理基底的一组微孔处，以单细胞形式捕获在一组官能化颗粒邻近处的所述样品的一组细胞；
在所述样品处理基底处对该组细胞进行裂解，从而允许从该组细胞释放的生物标志物与该组官能化颗粒结合；
在所述样品处理基底的该组微孔处，用与该组官能化颗粒结合的内容物进行逆转录操作；
用与该组官能化颗粒结合的内容物对所述逆转录操作的产物进行第二链合成操作；
在该组官能化颗粒处对所述第二链合成操作的产物进行扩增操作；
使对应于一组荧光团的一组探针中的每一种与所述扩增操作的产物杂交；以及
生成由该组探针发射的光的图像数据集，从而实现对所述样品的该组靶的检测。
2.根据实施方案1所述的方法，其中该组靶包括用于评价来自受试者的免疫响应的一组抗体，该组抗体包括以下中的一种或更多种：IgM抗体、IgG抗体、IgD抗体、IgA抗体和IgE抗体。
3.根据实施方案2所述的方法，其中该组抗体包括针对严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)的抗体。
4.根据实施方案1所述的方法，其中该组靶包括一组mRNA分子。
5.根据实施方案4所述的方法，所述方法还包括用跨越所述样品处理基底分布的所述样品对该组mRNA分子进行空间转录组学分析。
6.根据实施方案1所述的方法，其中在该组官能化颗粒邻近处捕获所述样品的该组细胞包括将该组细胞递送到所述样品处理基底的第一组微孔，并将该组官能化颗粒定位在第二基底的与所述第一组微孔对齐并面向所述第一组微孔的第二组微孔内。
7.根据实施方案6所述的方法，所述方法还包括抵靠所述第一组微孔按压具有所述第二组微孔的所述第二基底，从而分隔所述样品处理基底的各个孔并允许来源于该组细胞的内容物向所述第二基底处的该组官能化颗粒扩散。
8.根据实施方案7所述的方法，其中抵靠所述第一组微孔按压具有所述第二组微孔的所述第二基底包括抵靠所述第二基底致动加热对象，从而提供按压并加热所述样品处理基底和所述第二基底中的至少一个的内容物。
9.根据实施方案1所述的方法，其中使该组探针中的每一个杂交包括使该组探针的对应于第一荧光团的第一子集杂交，并进行第一检测操作；去杂交并洗涤探针的所述第一子集；以及使该组探针的对应于第二荧光团的第二子集杂交，并进行第二检测操作。
10.根据实施方案1所述的方法，其中该组探针(P)被配置用于该组靶的多重化检测，其中该组荧光团(F)具有一组熔点(M)，从而在所述样品处理基底上实现M*FP种靶的多重化。
11.根据实施方案1所述的方法，所述方法还包括基于来自所述图像数据集的一组荧光值和所进行的扩增循环数，用在该组官能化颗粒处捕获的mRNA的初始浓度进行mRNA定量操作。
12.一种用于自动处理样品的系统，所述系统包括：
平台，所述平台被配置以支持和放置以下：
在所述平台的第一侧的第一区域处的试剂筒；和
在所述第一侧的第二区域处的样品处理基底；和
台架，所述台架偶接到所述平台并包括：
一组轨道，该组轨道限定移液管接口在由所述平台的第一侧约束的三维体积内沿着一组轴的运动路径；和
基座，所述基座与所述平台的第一侧相对并支持以下：
包括一组热体的加热和冷却子系统；
包括进入所述第二区域的真空端口的泵送子系统；以及
包括以下的成像子系统：
照明子系统，所述照明子系统包括一组发射器和一组光学元件，该组发射器被配置用于光传输通过一组滤光器，所述一组光学元件用于在所述平台处对所述样品处理基底均匀照明，以及
检测子系统，所述检测子系统包括用于将来自所述样品处理基底的光成形到检测器上的一组透镜。
13.根据实施方案12所述的系统，所述系统还包括处理和控制子系统，所述处理和控制子系统支持在所述平台和所述基座之间，包括存储在计算机可读介质中的用于执行自动样品处理操作的非暂时性指令，所述自动样品处理操作包括以下中的至少一项：
使用所述移液管接口和所述泵送子系统：
在样品处理基底的一组微孔处，以单细胞形式在一组官能化颗粒邻近处捕获所述样品的一组细胞；
在所述样品处理基底处对该组细胞进行裂解，从而允许从该组细胞释放的生物标志物与该组官能化颗粒结合；
在所述样品处理基底的该组微孔处，用与该组官能化颗粒结合的内容物进行逆转录操作和第二链合成操作；和
使对应于一组荧光团的一组探针中的每一种与所述扩增操作的产物杂交；以及
用所述成像子系统生成由该组探针发射的光的图像数据集，从而实现对所述样品的该组靶的检测。
14.根据实施方案12所述的系统，其中所述样品处理基底包括含有该组微孔的微孔区域，所述样品处理基底保持在限定来自该组微孔的流动路径的基座内。
15.根据实施方案14所述的系统，所述系统还包括第二基底，所述第二基底包括第二组微孔，所述第二组微孔与所述样品处理基底的该组微孔对齐并面向所述样品处理基底的该组微孔，所述第二基底通过可压缩层与所述样品处理基底部分地分离。
16.根据实施方案15所述的系统，其中所述加热和冷却子系统还包括被配置为偶接到所述台架的移液管接口的加热对象。
17.根据实施方案16所述的系统，所述系统还包括存储在计算机可读介质中的用于以下的非暂时性指令：使所述加热对象抵靠所述第二基底移动，从而抵靠所述样品处理基底按压所述第二基底，分隔所述样品处理基底的各个孔，并将热量传递到所述样品处理基底和所述第二基底中的至少一个的内容物。
18.一种样品处理组件，所述样品处理组件包括：
样品处理基底，所述样品处理基底包括微孔区域，所述微孔区域包括被配置为以单细胞形式捕获一组细胞的一组微孔；
基座，所述基座偶接到所述样品处理基底并限定以下：
流体地偶接到所述样品处理基底的入口储库，和
进入所述样品处理基底的微孔区域中的进入区域；
颗粒捕获区域，所述颗粒捕获区域邻近所述进入区域并被配置用于将该组细胞邻近处的一组官能化颗粒共捕获；和
弹性阀，所述弹性阀沿着从所述微孔区域到所述样品处理基底的出口的流动路径将所述样品处理基底偶接到所述基底。
19.根据实施方案18所述的样品处理组件，所述样品处理组件还包括第二基底，所述第二基底包括限定所述颗粒捕获区域的第二组微孔，其中所述第二组微孔与所述样品处理基底的该组微孔对齐并面向所述样品处理基底的该组微孔，所述第二基底通过可压缩层与所述样品处理基底部分地分离。
20.根据实施方案18所述的样品处理组件，其中所述第二基底能够在第一模式和第二模式之间转换；在所述第一模式中，所述第二基底通过所述可压缩层从所述样品处理基底移位，从而限定与所述微孔区域相邻的腔；在所述第二模式中，所述第二基底借由所述可压缩层的压缩向着所述样品处理基底移位，从而分隔所述微孔区域的各个孔。
21.一种用于检测样品的一组靶的方法，所述方法包括：
在样品处理基底的一组微孔处，以单细胞形式捕获在一组官能化颗粒邻近处的组织样品；
在所述样品处理基底处对所述组织样品进行裂解，从而允许从所述组织样品释放的生物标志物与该组官能化颗粒结合；
在所述样品处理基底的该组微孔处，用与该组官能化颗粒结合的内容物进行逆转录操作；
对所述逆转录操作的产物，用与该组官能化颗粒结合的内容物进行第二链合成操作；
对所述第二链合成操作的产物，在该组官能化颗粒处进行扩增操作；
将对应于一组荧光团的一组探针中的每一种与所述扩增操作的产物杂交；以及
生成由该组探针发射的光的图像数据集，从而实现对所述样品的该组靶的检测。
22.根据实施方案21所述的方法，其中该组靶包括用于评价来自受试者的免疫响应的一组抗体，该组抗体包括以下中的一种或更多种：IgM抗体、IgG抗体、IgD抗体、IgA抗体和IgE抗体。
23.根据实施方案22所述的方法，其中该组抗体包括针对严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)的抗体。
24.根据实施方案21所述的方法，其中该组靶包括一组mRNA分子。
25.根据实施方案24所述的方法，所述方法还包括用跨越所述样品处理基底分布的所述样品对该组mRNA分子进行空间转录组学分析。
如本领域技术人员将从之前的详细描述和从附图和权利要求书认识到，可以对本发明的优选实施方案进行修改和改变而不脱离以下权利要求书中定义的本发明的范围。

Claims (22)

1.一种用于检测样品的一组靶的方法，所述方法包括：
使邻近一组官能化颗粒的所述样品的一组细胞定位在样品处理基底处；
在所述样品处理基底处用试剂处理该组细胞，从而允许来自该组细胞的该组靶与该组官能化颗粒结合；
在所述样品处理基底处，用与该组官能化颗粒的寡核苷酸结合的该组靶进行逆转录操作；
用该组官能化颗粒对所述逆转录操作的产物进行第二链合成操作；
促进第一探针与由所述第二链合成操作产生的靶的第一子集的杂交；
在所述样品处理基底处光学检测所述第一探针，从而表征所述样品的所述靶的第一子集的存在；
使所述第一探针去杂交；以及
促进第二探针与由所述第二链合成操作产生的靶的第二子集的杂交。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：在所述样品处理基底处光学检测所述第二探针，从而表征所述样品的所述靶的第二子集的存在。
3.根据权利要求2所述的方法，还包括：使所述第二探针去杂交。
4.根据权利要求2所述的方法，还包括从所述第一探针和所述第二探针的光学检测生成图像数据集，从而在空间上表征所述样品的所述靶的第一子集和所述靶的第二子集的分布。
5.根据权利要求1所述的方法，还包括从所述第一探针的光学检测生成图像数据集，从而在空间上表征所述样品的所述靶的第一子集的分布。
6.根据权利要求1所述的方法，其中该组官能化颗粒中的每一个官能化有寡核苷酸，所述寡核苷酸包含条形码和用于信使RNA捕获的捕获区段。
7.根据权利要求1所述的方法，其中该组官能化颗粒中的每一个官能化有寡核苷酸，所述寡核苷酸包含条形码和对应于该组靶的靶基因的基因特异性区段。
8.根据权利要求1所述的方法，其中该组靶包括一组mRNA分子，所述方法还包括对该组mRNA分子进行空间转录组学分析，其中所述样品跨越所述样品处理基底分布。
9.根据权利要求1所述的方法，其中该组靶包括用于评价来自受试者的免疫响应的一组抗体，该组抗体包括以下中的一种或更多种：IgM抗体、IgG抗体、IgD抗体、IgA抗体和IgE抗体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中省略了进行第二链合成操作，并且其中所述第一探针与所述靶的第一子集杂交，其中所述靶的第一子集包含cDNA。
11.根据权利要求1所述的方法，其中省略了进行逆转录操作，其中所述第一探针与所述靶的第一子集杂交，并且其中所述靶的第一子集包含RNA。
12.一种用于检测来源于样品的一组单细胞的一组靶的方法，所述方法包括：
在包括一组特征的样品处理基底处，使来源于细胞裂解物的该组靶与该组特征结合；
在所述样品处理基底处，用与该组特征结合的该组靶进行逆转录操作；
用该组特征对所述逆转录操作的产物进行第二链合成操作；
将第一探针与由所述第二链合成操作产生的靶的第一子集杂交；
检测所述第一探针，从而以单细胞分辨率表征所述样品的所述靶的第一子集的存在；
使所述第一探针去杂交；
促进第二探针与由所述第二链合成操作产生的靶的第二子集的杂交；以及
检测所述第二探针，从而以单细胞分辨率表征所述样品的所述靶的第二子集的存在。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括从所述第一探针和所述第二探针的光学检测生成图像数据集，从而在空间上表征所述样品的所述靶的第一子集和所述靶的第二子集的分布。
14.根据权利要求12所述的方法，还包括从所述第一探针和所述第二探针的检测生成单细胞表型分析，以及从所述样品进行单细胞转录组文库制备。
15.根据权利要求12所述的方法，其中该组特征中的每一个官能化有寡核苷酸，所述寡核苷酸包含条形码、独特分子标识符(UMI)和用于信使RNA捕获的捕获区段。
16.根据权利要求12所述的方法，其中该组靶包括一组mRNA分子，所述方法还包括对该组mRNA分子进行空间转录组学分析，其中所述样品跨越所述样品处理基底分布。
17.一种用于检测组织样品的一组靶的方法，所述方法包括：
将所述组织样品与基底的第一组特征对齐，所述第一组特征被官能化用于靶捕获；
使来自所述组织样品的该组靶与所述第一组特征结合；
在所述基底处用该组靶进行逆转录操作；
对所述逆转录操作的产物进行第二链合成操作；
将一组探针与所述第二链合成操作的输出物杂交，该组探针包括：对应于靶的第一子集的第一探针和对应于靶的第二子集的第二探针；
检测所述第一探针，从而表征所述组织样品的所述靶的第一子集的存在；以及
检测所述第二探针，从而表征所述组织样品的所述靶的第二子集的存在。
18.根据权利要求17所述的方法，其中将所述组织样品对齐包括将包含所述基底的歧管定位成与安装在载玻片上的组织样品对齐，并促进该组靶从所述组织样品流向所述第一组特征。
19.根据权利要求17所述的方法，其中将该组探针杂交包括将包含第一荧光团的所述第一探针杂交；使所述第一探针去杂交并洗涤所述第一探针；以及将包含第二荧光团的所述第二探针杂交。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一组特征包括1,000至10,000,000个特征。
21.根据权利要求17所述的方法，还包括进行mRNA定量操作，基于从所述第一探针和所述第二探针的检测产生的一组荧光值，估计捕获的mRNA的初始浓度。
22.根据权利要求17所述的方法，其中该组探针具有探针数量(P)，其中该组探针包含一组具有荧光团数量(F)的荧光团，每个荧光团具有一组状态(M)，从而实现所述组织样品的M*FP种靶的多重化。
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