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CN118290514A - 基于阴离子膜的抗体偶联药物的纯化方法及抗体偶联药物 - Google Patents

基于阴离子膜的抗体偶联药物的纯化方法及抗体偶联药物 Download PDF

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CN118290514A
CN118290514A CN202410722289.1A CN202410722289A CN118290514A CN 118290514 A CN118290514 A CN 118290514A CN 202410722289 A CN202410722289 A CN 202410722289A CN 118290514 A CN118290514 A CN 118290514A
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CN
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antibody
drug
toxin
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李志浩
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Tot Biopharm Co ltd
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Tot Biopharm Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种基于阴离子膜的抗体偶联药物的纯化方法及抗体偶联药物。所述方法包括利用阴离子膜对抗体偶联药物进行纯化处理；所述抗体偶联药物中含有游离的毒素连接子。使用本发明的纯化方法，杂质去除效果好，且为抗体偶联药物流穿模式，载量高（抗体偶联药物处理量>10 kg/L），纯化处理后游离毒素连接子低于检测下限。

Description

基于阴离子膜的抗体偶联药物的纯化方法及抗体偶联药物
技术领域
本发明涉及医药领域，具体的说，本发明涉及一种基于阴离子膜的抗体偶联药物的纯化方法及抗体偶联药物。
背景技术
抗体偶联药物 (ADC) 是一种单克隆抗体 (mAb)通过ADC连接子 (linker) 共价连接到细胞毒性药物（毒素分子）。因mAb具备良好的靶向能力，可准确地识别、区分健康细胞和肿瘤细胞，将高活性的细胞毒性药物（payload）带入癌细胞完成杀伤。截至2023年底已有15款ADC药物被批准上市，并且有数百个ADC药物进入临床试验的不同阶段，因此其具有巨大的开发前景和商业价值。
为增加细胞毒性药物的细胞穿透性，增强旁观者效应（bystander effect），许多ADC选择使用疏水性较高的小分子作为细胞毒性药物，由于mAb对于癌细胞的识别能力、递送细胞毒性药物的效率有限，最后仅有1-2%的细胞毒性药物能够真正进入细胞杀伤细胞，所以细胞毒性药物一般具备高毒性（IC50纳摩尔级别或皮摩尔级别）。一旦ADC药物中游离毒素浓度过高，将会造成严重的不良反应。目前临床最为广泛应用的细胞毒性药物为喜树碱类，如伊立替康（Irinotecan）、依喜替康（Exatecan）、德鲁替康（Deruxtecan）等，喜树碱类的小分子疏水性强，特别是在连接子经过亲水改造后聚集趋势更加明显，在水溶液中易聚集形成纳米级别的胶束，这些毒素分子或毒素连接子（LP）的组合使用常规的超滤透析（UF/DF）方法经常去除效果不佳，造成产品不符合质量要求。
为去除毒素连接子，目前广泛的处理方式为在UF/DF置换液中填加有机溶剂或无机盐等，这样不仅不利于蛋白质稳定，而且多数情况下不能从根本上解决问题。有资料报道：通过增加柱层析的步骤可有效去除游离毒素连接子的工艺，如借助阳离子（如图1所示），疏水的柱层析，但是这些方法都是结合洗脱模式，其原理为利用非共价作用将ADC分子吸附在纯化柱上，然后使用缓冲液洗去未结合的小分子等杂质，最后更换缓冲液将ADC洗脱，其工艺复杂并且通常载量较低；也有使用分子排阻层析的方式进行纯化毒素连接子的报道，但其存在流速低、放大困难等严重问题，这无疑会增加生产成本，难以在实际生产中推广应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对常规UF/DF纯化无法有效去除游离毒素连接子的抗体偶联药物的纯化方法。
本发明原理为：使用带负电衍生化试剂与毒素连接子进行衍生化反应生成带负电荷的产物，而在弱酸性条件下多数抗体偶联药物分子本身带正电荷，可使用阴离子膜层析，吸附带负电或不带电的毒素连接子。
本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的抗体偶联药物。
为达上述目的，一方面，本发明提供了一种基于阴离子膜的抗体偶联药物的纯化方法，其中，所述纯化方法包括利用阴离子膜对抗体偶联药物进行纯化处理，去除抗体偶联药物中含有的游离的毒素连接子，所述游离毒素连接子包含带负电或者不带电的毒素连接子。
本发明所述的毒素连接子分子，是指在制备抗体偶联药物中，细胞毒性药物与连接子连接起来形成的化合物（linker-payload，LP），即“细胞毒性药物-连接子”分子，如下简称“毒素连接子”。
根据本发明一些具体实施方案，其中，每1 L膜处理至少10 kg 抗体偶联药物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，每1 L膜处理0.1 kg-20kg 抗体偶联药物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，每1 L膜处理0.1kg-10 kg 抗体偶联药物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法包括将由抗体偶联药物和缓冲液配制的缓冲混合液流穿过阴离子膜以进行纯化处理；所述缓冲混合溶液pH值为3-8。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述缓冲混合溶液pH值为5-7。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述缓冲混合溶液pH值为5.0，5.5，6.0，6.5，7.0。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述缓冲混合溶液pH值为5.5-6.5。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述缓冲液选自组氨酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液或甘氨酸缓冲液。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述缓冲液选自组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述缓冲液选自组氨酸缓冲液。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述缓冲液的摩尔浓度为10-50 mM。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述缓冲液的摩尔浓度为10-30 mM。
根据本发明一些具体实施方案，其中，抗体偶联药物在缓冲混合溶液中的浓度为0.5 mg/mL ~50 mg/mL。
本发明是利用阴离子膜对负电物质的吸附来实现毒素连接子的分离（如图2所示），譬如，在弱酸性条件下，游离的毒素连接子或其他胶束副产物带负电，能够被带正电的阴离子膜所吸附；而抗体/抗体偶联药物等电点一般在8.0以上，在该pH条件下带正电，无法被膜吸附，因此可直接流穿完成纯化。故现有阴离子交换膜一般都可以实现本发明效果。
而根据本发明一些具体实施方案，所述阴离子膜为聚醚砜类阴离子膜、聚丙烯酰胺类阴离子膜或再生纤维素（RC）类阴离子膜。
也就是说，所述的阴离子膜的基架为聚醚砜材质、聚丙烯酰胺材质或再生纤维素材质。
根据本发明一些具体实施方案，所述的阴离子膜的基架为聚醚砜材质或聚丙烯酰胺材质，可以进一步吸附因未衍生化完全而不带电的毒素连接子（如图2所示）。
根据本发明一些具体实施方案，所述的阴离子膜的基架为聚醚砜材质，聚醚砜会非特异的对亲脂性物质吸附的性质，还可以进一步吸附因未衍生化完全而不带电的毒素连接子（如图2所示）。
根据本发明一些具体实施方案，所述的阴离子膜可以为如下公司生产的阴离子膜：科百特公司、Sartorius公司、Pall公司、或者Merck Millipore公司。
譬如可以是：科百特公司的Purcise Q、Sartorius公司的Sartobind Q、Pall公司的Mustang Q XT、或者Merck Millipore公司的Natrix Q。
本发明的阴离子膜可以达到对游离带电及不带电毒素连接子杂质去除的目的，预计可简化工艺路线、降低生产成本。
根据本发明一些具体实施方案，其中，含有抗体偶联药物的缓冲液流穿过阴离子膜的速度为0.1-100 MV/min (MV: Membrane Volume, 膜体积)。
根据本发明一些具体实施方案，其中，含有抗体偶联药物的缓冲液流穿过阴离子膜的速度为5-50 MV/min。
根据本发明一些具体实施方案，其中，含有抗体偶联药物的缓冲液流穿过阴离子膜的速度为5-25 MV/min。
根据本发明一些具体实施方案，其中，含有抗体偶联药物的缓冲液流穿过阴离子膜的速度为10-25 MV/min。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述缓冲液选自组氨酸缓冲液，所述缓冲混合溶液pH值为5-7，含有抗体偶联药物的缓冲液流穿过阴离子膜的速度为10-25 MV/min，所述的阴离子膜的基架为聚醚砜材质。
本发明利用毒素连接子带电性、或者通过衍生化使得毒素连接子带电性的特点来实现阴离子膜对毒素连接子的吸附，而抗体和抗体偶联药物等电点一般在8.0以上，在该pH条件下带正电，无法被膜吸附，因此可直接流穿完成纯化。故本发明对抗体偶联药物本身没有特别的要求；
一般来说，如果获得的抗体偶联药物中的毒素连接子分子带有负电荷，即可直接用于本发明的纯化方法，譬如，当毒素连接子结构中带有磺酸基、羧酸基、硝酸基和磷酸基中的一种或多种基团时，可使得毒素连接子带负电（如核酸类药物等），即可直接用于本发明的纯化方法；或者，抗体偶联药物在制备过程中也可使得毒素连接子分子带负电荷，上述两种情况均可将抗体偶联药物利用本发明的纯化方法进行纯化；
或者，也可以通过进一步的衍生化反应使得游离毒素连接子带电性：
即，所述纯化方法用阴离子膜对抗体偶联药物进行纯化前，还包括用衍生剂对抗体偶联药物进行衍生化处理的步骤，以使得抗体偶联药物中的游离的毒素连接子带负电（如图3所示）；
所述衍生剂为能够与毒素连接子分子进行反应并且使得反应后的产物带负电的化合物。
本发明可以通过进一步的衍生化反应，使得不带电性的游离毒素连接子带负电，对于游离毒素连接子已经带负电或者部分游离毒素连接子带负电的抗体偶联药物，也可采用上述的衍生化反应进行处理。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述衍生剂为含有巯基和负电基团的化合物、或者含有亚磷基和负电基团的化合物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述衍生剂选自N-乙酰基半胱氨酸 (NAC)、2-巯基乙磺酸盐、巯基乙酸盐和三(2-羧乙基)膦（TCEP）中的一种或多种的组合。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：用摩尔量为抗体偶联药物1-60倍的衍生剂与抗体偶联药物混合均匀（以使得抗体偶联药物中的游离毒素连接子与衍生剂发生反应）。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：用摩尔量为抗体偶联药物2-60倍的衍生剂与抗体偶联药物在缓冲液中混合均匀。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：用摩尔量为抗体偶联药物4-60倍的衍生剂与抗体偶联药物在缓冲液中混合均匀。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：用摩尔量为抗体偶联药物5-40倍的衍生剂与抗体偶联药物在缓冲液中混合均匀。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：用摩尔量为抗体偶联药物8-30倍的衍生剂与抗体偶联药物在缓冲液中混合均匀。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：用摩尔量为抗体偶联药物10-20倍的衍生剂与抗体偶联药物在缓冲液中混合均匀。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：用摩尔量为抗体偶联药物10-15倍的衍生剂与抗体偶联药物在缓冲液中混合均匀。
根据本发明一些具体实施方案，其中，缓冲液的用量为使得抗体偶联药物加入缓冲液后，抗体偶联药物在得到的混合溶液中的浓度为0.5 mg/mL ~50 mg/mL。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：衍生剂与抗体偶联药物是在0-37℃下混合均匀。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：衍生剂与抗体偶联药物是在15-30℃下混合均匀。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：衍生剂与抗体偶联药物是在20-30℃下混合均匀。
根据本发明一些具体实施方案，其中，衍生剂与抗体偶联药物在缓冲液中混合均匀后，衍生剂与抗体偶联药物中所含的游离毒素连接子的反应时间为0.5-2h。
根据本发明一些具体实施方案，其中，衍生剂与抗体偶联药物中所含的游离毒素连接子的反应时间为1-2h。
根据本发明一些具体实施方案，其中，衍生剂与抗体偶联药物中所含的游离毒素连接子的反应时间为1-1.5h。
根据本发明一些具体实施方案，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理后，还包括超滤处理的步骤，然后直接用阴离子膜进行纯化处理。
如前所述，本发明对抗体偶联药物本身没有特别的要求，但根据本发明一些具体实施方案，本发明的抗体偶联药物可以按照如下方法制备得到：
向抗体分子的反应体系中加入还原剂，在0-37℃下进行反应，反应结束后加入足量毒素连接子，再在0-37℃下进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，本发明的抗体偶联药物可以按照如下方法制备得到：
向抗体分子的反应体系中加入还原剂，在4-37℃下进行反应，反应结束后加入足量毒素连接子，再在15-30℃下进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，加入还原剂后是在15-30℃下进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，加入还原剂后是在20-30℃下进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，加入毒素连接子后是在15-30℃下进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，加入毒素连接子后是在20-30℃下进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，本发明的抗体偶联药物可以按照如下方法制备得到：向抗体分子的反应体系中加入还原剂，在0-37℃下进行反应，反应结束后加入足量毒素连接子，再在0-37℃下进行反应。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述毒素连接子是先溶解在有机溶剂中，然后再加入到反应体系中；所述有机溶剂选自DMSO、DMA或DMF。
根据本发明一些具体实施方案，其中，反应体系中的反应溶剂为缓冲液。
根据本发明一些具体实施方案，其中，缓冲液的用量为使得抗体加入缓冲液后，抗体在反应体系中的浓度为5 mg/mL ~20 mg/mL。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述还原剂为含有巯基或亚磷基的可还原抗体中二硫键的化合物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述还原剂选自二硫苏糖醇（DTT）和三(2-羧乙基)膦（TCEP）中的一种或两种的组合。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述还原剂摩尔用量为抗体分子摩尔量的1-16倍。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述还原剂摩尔用量为抗体分子摩尔量的2-10倍。
根据本发明一些具体实施方案，其中，毒素连接子摩尔用量为抗体分子摩尔量的2-20倍。
根据本发明一些具体实施方案，其中，毒素连接子摩尔用量为抗体分子摩尔量的8-20倍。
根据本发明一些具体实施方案，其中，加入还原剂后进行反应以及加入毒素连接子后进行反应的反应时间各自独立的为1-24h。
根据本发明一些具体实施方案，其中，加入还原剂后进行反应以及加入毒素连接子后进行反应的反应时间各自独立的为1-3h。
根据本发明一些具体实施方案，其中，抗体偶联药物在制备过程中包括：
取适量的单克隆抗体，使用缓冲液稀释浓度至 5-20 mg/mL，加入金属螯合剂充分混匀，使其终浓度在1-15 mM范围，加入抗体1-16倍当量的还原剂，0-37℃反应1-24 h，向其中分别加入2-20倍当量的毒素连接子，0-37℃反应1-24 h既得。
根据本发明一些具体实施方案，其中，抗体偶联药物在制备过程中包括在加入抗体后，添加金属螯合剂的步骤。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述金属螯合剂选自EDTA、DTPA、IDHA、EDDHA或HBED等。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述金属螯合剂的终浓度为1-15 mM。
根据本发明一些具体实施方案，其中，抗体偶联药物在制备过程中还包括：加入毒素连接子反应结束后，进行超滤处理，得到超滤反应液，然后直接将超滤反应液用阴离子膜过滤进行纯化处理。
根据本发明一些具体实施方案，其中，当抗体偶联药物在制备过程包括向抗体分子的反应体系中加入还原剂时，上述衍生化处理时加入衍生剂的摩尔用量为抗体偶联药物摩尔量的2-20倍。
根据本发明一些具体实施方案，其中，抗体偶联药物在制备过程中包括：
取适量的单克隆抗体，使用缓冲液稀释浓度至 5-20 mg/mL，加入金属螯合剂充分混匀，使其终浓度在1-15 mM范围，加入抗体2-10倍当量的还原剂，置于水浴锅或冰浴锅上0-37℃反应1-3 h，向其中加入2-20倍当量的毒素连接子(溶于适量DMSO, DMA或 DMF)，置于水浴锅或冰浴锅上15-30℃反应1-3 h既得。
根据本发明一些具体实施方案，其中，本发明所述的超滤处理包括使用超滤系统进行4-16 倍渗滤体积 (Diafiltration Volume, DV）的换液。
根据本发明一些具体实施方案，其中，本发明所述的超滤处理包括超滤膜包的截留分子量为3kd-50kd。
根据本发明一些具体实施方案，其中，本发明所述的超滤处理包括超滤膜包的截留分子量为20kd-30kd。
根据本发明一些具体实施方案，其中，超滤使用的缓冲液可以用常规的缓冲液，譬如，组氨酸-盐酸缓冲液(pH＝6.0)。
根据本发明一些具体实施方案，其中，本发明所述毒素连接子分子中具有能够与巯基反应的基团以作为与抗体反应的接头。
根据本发明一些具体实施方案，其中，本发明所述毒素连接子分子中具有马来酰亚胺基团、α, β-不饱和羰基或卤代乙酰基、吡啶二巯基、卤代烷基、乙烯基砜等其它可与巯基反应的基团。
根据本发明一些具体实施方案，其中，α, β-不饱和羰基为丙烯酸酯类基团。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体偶联药物结构中毒素连接子还包含细胞毒性药物，所述细胞毒性药物为喜树碱类、美登素类、海兔毒素类或吡咯并苯二氮卓类药物。
本发明所述的抗体可以是任意用于制备抗体偶联药物的抗体，而根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体是含有巯基的抗体。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述喜树碱类药物选自伊立替康（Irinotecan）或依喜替康（Exatecan）或德鲁替康（Dxd）或7-乙基-10-羟基喜树碱（SN38）；所述美登素类药物选自美登素硫代衍生物如DM1或DM4；所述海兔毒素类选自奥瑞他汀类衍生物如MMAE或MMAF；所述吡咯并苯二氮卓类药物选自PBD及其衍生物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述毒素连接子为LP1（MC-VC-PAB-SN38）或LP2（MC-GGFG-Dxd）。
LP1的接头为马来酰亚胺（即MC）。
LP1的VC-PAB即Val-Cit-PAB，缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基；LP1的细胞毒性药物为喜树碱衍生物7-乙基-10-羟基喜树碱（即SN38）。
LP2的接头为马来酰亚胺（即MC）。
LP2的GGFG为四肽：即甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸（glycine-glycine-phenylalanine-glycine）；LP2的细胞毒性药物为德鲁替康（即Dxd）。
根据本发明一些具体实施方案，其中，LP1和LP2的结构分别如下所示：
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体是单克隆抗体。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体是曲妥珠单抗、帕托珠单抗或贝伐珠单抗。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体是曲妥珠单抗。
另一方面，本发明还提供了本发明任意的纯化方法制备得到的抗体偶联药物，其中，所述抗体偶联药物中游离的毒素连接子含量小于等于50μg/mL。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述抗体偶联药物中游离的毒素连接子含量小于等于0.1μg/mL。
可以理解的是，本发明在不矛盾的前提下，各具体实施方案之间可以任意的组合。因篇幅所限，本发明对各具体实施方案的组合不再一一赘述。
综上所述，本发明提供了一种基于阴离子膜的抗体偶联药物的纯化方法。本发明的纯化方法具有如下优点：
1、除杂效果：原有技术：（1）超滤透析不能达到杂质去除效果；（2）阳离子及疏水层析为结合洗脱模式，载量低（抗体偶联药物处理量 40-60 g/L）；（3）分子排阻层析法除杂效率不高、需多次操作；（3）有机试剂法，除杂效果差、破坏产物稳定性。本发明技术：使用衍生化+阴离子膜层析，杂质去除效果好，且为抗体偶联药物流穿模式，载量高（抗体偶联药物处理量>10 kg/L），纯化处理后游离LP低于检测下限。
2、成本原因：原有技术：（1）阳离子、疏水、分子排阻层析：需使用纯化层析设备，成本高，载量低，需大量填料；（2）有机试剂：需大量有机试剂、污染环境、耗时耗力。本发明技术：不需要复杂设备，载量高有利于降低成本，更加节省空间，对大规模生产友好。
3、效率原因：原有技术：（1）阳离子/疏水：洗脱模式步骤长，时间久，需考虑填料的结构稳定性，流速较低；（2）分子排阻：操作复杂、多次操作耗费时间；（3）有机试剂：耗费时间，污染环境。本发明技术：洗脱模式步骤短，时间短，易操作，无不稳定组分，可使用高流速进行杂质的去除。
附图说明
图1为现有阳离子填料纯化技术示意图。
图2为阴离子膜处理ADC超滤液示意图。
图3为本发明ADC偶联及后处理示意图。
图4为实施例1吸附前、后的HPLC检测图（LP1），峰1为带电NAC-LP1，峰2为不带电LP1。
图5为实施例1吸附前、后的HPLC检测图（LP2），峰1’为带电NAC-LP2，峰2’为不带电LP2。
图6为实施例1毒素连接子不同浓度的紫外吸收标准曲线（LP1）。
图7为实施例2的不同阴离子膜吸附前后HPLC检测图（LP1）。
图8为实施例3的吸附前HPLC检测图（LP1+mAb1/2）。
图9为实施例3的吸附后HPLC检测图（LP1+mAb1/2）。
图10为实施例4的不同流速纯化后ADC纯度HPLC检测图。
图11为实施例4中阴离子膜处理前，毒素连接子含量HPLC检测图。
图12为实施例4的不同流速毒素连接子含量HPLC检测图。
图13为实施例5的缓冲组分对阴离子膜吸附的影响HPLC检测图。
图14为实施例6阴离子膜吸附前、后的HPLC检测图（LP1）。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。
实施例1
抗体还原：取4g曲妥珠抗体（mAb1），按参数表1中浓度和用量，计算20 mM 磷酸盐缓冲液（PB缓冲液）, pH 7.5和5 mM EDTA的添加量，依次加入反应体系。用1 M NaOH溶液调节反应体系pH至7.5。再加入20 mM TCEP的添加量，并加入反应体系中。将水浴锅调节至所需温度进行控温，然后按所需条件进行还原反应。
表1. 还原反应各参数
偶联反应：还原结束后将还原液分为两份，分别向两反应体系中添加毒素连接子LP1和LP2 （溶于DMSO，DMSO终浓度10 v/v%），结构如下，添加量按下表2进行计算。将水浴锅调节至所需温度进行控温，然后按所需条件进行偶联反应。
表2. 偶联反应各参数
衍生化反应：将衍生化试剂NAC溶于反应缓冲液配置成20 mM的衍生化母液，分别向两个偶联反应加入10倍当量的衍生化试剂，于25℃搅拌反应1 h。具体参数如表3所示。
表3. 衍生化反应及透析各参数
ADC超滤透析（UF/DF）：衍生化结束后，分别使用膜包（30kd）对两ADC反应液进行超滤透析，透析缓冲液为20 mM His/His-HCl, pH 6.0，透析倍数为10 DV（渗滤体积）。取其中一小部分（1 mL）作为对照；另一部分进行如下的阴离子膜层析纯化。
ADC阴离子膜层析：分别使用0.2 mL科百特PurciseTM Q层析膜对两部分超滤后的反应液进行纯化，缓冲液为20 mM His/His·HCl, pH 6.0平衡阴离子膜，上样，流速为2ml/min（即10MV/ min），收集流穿液各200 mL（步骤如图3所示）。
使用HPLC测试毒素连接子的含量，其中，色谱柱为：Symmetry C18 Column, 100Å,5 µm, 4.6 mm X 150 mm；检测波长为：370 nm；流动性A为去离子水（含0.1%三氟乙酸TFA），流动相B为乙腈（含0.1%三氟乙酸TFA），梯度洗脱条件：起始：0 min，95% A，5% B；终点：15min，0% A，100% B。图4为编号1 (LP1) 阴离子膜吸附前后的HPLC检测图，峰1显示为带电毒素连接子NAC-LP1，峰2为不带电的LP1；图5为编号2 (LP2)阴离子膜吸附前后的HPLC检测图，峰1显示为带电毒素连接子NAC-LP2，峰2为不带电的LP2；图6为不同浓度LP1的紫外吸收标准曲线。
使用阴离子膜纯化前后的结果汇总如表4所示：
表4. 阴离子膜处理前后游离毒素含量对比
结果如表4所示，LP1和LP2在经过衍生化操作后仍然有部分毒素连接子无法被衍生化，衍生化效率约为90%，并且此部分毒素连接子通过超滤也无法被完全去除，最终游离药物残留量为：带电毒素连接子NAC-LP1：21.3 ug/mL，毒素连接子LP1： 2.1 ug/mL；带电毒素连接子NAC-LP2：4.1 ug/mL，毒素连接子LP1：0.4 ug/mL。在经过阴离子膜处理后，最终游离药物残留量均低于检测下限0.1 ug/mL。结果显示，阴离子膜层析对于带负电及不带电残留游离毒素连接子去除效果均很明显。
载量计算：按照处理前含量较高的LP1小分子质量计算：阴离子膜对于带负电毒素连接子的吸附载量≥(21.3-0.1) ug/mL * 200 mL/0.2 mL=21.2 mg/mL，对不带电毒素连接子的吸附载量≥(2.1-0.1) ug/mL * 200 mL/0.2 mL =2 mg/mL；按照ADC处理质量计算：阴离子膜的处理量不低于10,000 g/L，远高于目前阳离子填料40-60 g/L的处理量。同理，根据LP2毒素小分子质量计算，阴离子膜对于带负电毒素连接子的吸附载量≥(4.1-0.1)ug/mL * 200 mL/0.2 mL=4 mg/mL，对不带电毒素连接子的吸附载量≥(0.4-0.1) ug/mL *200 mL/0.2 mL =0.3 mg/mL；按照ADC处理质量计算，阴离子膜对ADC样品的处理量亦不低于10000 g/L。
实施例2
以5 g曲妥珠单抗为起始原料，按照实施例1中表1至表3的参数，完成还原、偶联、衍生化，取部分衍生化溶液超滤操作。将超滤液分为4份，分别使用不同厂家的Q膜参照实施例1对超滤液进行处理纯化，其中编号1为未经Q膜处理的样品，编号2-4为不同厂家的Q膜处理的样品。编号2-4膜材使用同种带电配基，但基架不同。处理完毕后，使用HPLC和Nanodrop测试其中游离毒素连接子（LP）含量（带电LP和不带电LP）和ADC产物含量。
表5. 不同阴离子膜处理前后含量对比
由表5可知：三种阴离子交换膜均对ADC分子无明显吸附，不会对产物的损失；三种膜均可完成对带电LP1的高效吸附，吸附完毕后带电LP1浓度均低于最低检测限0.1 ug/mL；PES和PAM对不带电LP1同样吸附效果较好，吸附完毕LP1含量低于检测下限；经过RC (NO.4)膜处理后，不带电LP1浓度为1.6 ug/ml，相对于编号1中的超滤液2.4ug/ml，不带电LP1仍有少量降低，可知RC对不带电LP1吸附效果稍逊于PES和PAM，但对带电LP1吸附效果与PES和PAM膜效果相当，由于衍生化过程中对LP分子的反应程度高，在整体LP1中带电LP1比例远远大于不带电LP1，因此RC膜纯化后的总体LP1含量依然能够满足质量要求。图7为使用PES(NO.2），PAM (NO.3)和RC (NO.4)膜处理吸附前后LP1的变化，其中三种膜材在9.0-9.5 min峰带电游离毒素小分子NAC-LP1完全消失，RC膜中不带电游离毒素小分子LP1的10.5-11.0min峰仍存在。
实施例3
如表6中所示：分别使用曲妥珠单抗mAb1和帕妥珠单抗mAb2与毒素连接子LP1按照实施例1的方法进行还原、偶联和衍生化实验，反应完毕后使用30 Kd 膜包进行10 DV的超滤，分为使用科百特PurciseTMQ膜处理（参照实施例1，编号1和2）和不使用Q膜处理（编号3和4）两组，完毕后使用HPLC和Nanodrop测试其中游离毒素连接子总含量和ADC含量，检测方法与实施例1相同。
表6. 不同抗体反应信息汇总
由表6结果可知：使用不同抗体，同种LP1小分子偶联后，经过同样的超滤操作，小分子的残留基本一致（编号3 VS 编号4）；经过Q膜处理后，游离小分子浓度均有明显下降，检测值低于最低标准检测限。图8和图9为不同抗体偶联后，使用阴离子交换膜处理前/后LP1含量HPLC测试图。
因此针对不同种抗体（mAb1和mAb2，连接LP1）及毒素连接子（LP1和LP2，连接mAb1，实施例1）组合，阴离子交换膜均能完成对于游离毒素连接子（LP + NAC-LP）的去除，并且不会引起对于ADC产物的影响，因此该方法可推广应用于不同的抗体和毒素连接子组合。
实施例4
使用蠕动泵和科百特PurciseTM 阴离子膜（体积0.2 mL）对超滤液（于实施例2中获得）进行过滤。图10 为5 MV/min和50 MV/min 流速下ADC的SEC-HPLC测试图。SEC-HPLC的检测波长为：280 nm；流动相为：50 mM PB + 100 mM NaCl，pH 7.0，等度洗脱20 min。图11为阴离子膜处理前，毒素连接子含量HPLC检测图，图12中从上到下流速分别为：5 MV/min，10MV/min，25 MV/min和50 MV/min（即，1，2，5，10ml/min）过滤后的HPLC检测图。
由HPLC检测结果可知：在5-50 MV/min的流速范围内，不同流速下ADC分子经阴离子交换膜处理后，不同流速的ADC分子的纯度无明显差异，均>95%，满足质量要求；并且在此流速范围内，阴离子交换膜能对带电与不带电的LP1进行高效吸附，吸附完毕后LP1含量低于最低检测限0.1 ug/mL，其纯化流速不低于50 MV/min，远高于市面阴离子填料的流速（对比例1），完全能够满足实际生产的要求，提高生产效率。所以，在不同流速条件下阴离子膜可在不破坏ADC分子的前提下，高效完成对毒素连接子LP1的吸附。
由于过高的流速会引起较高的压力，特别是针对浓度高、粘度大的液体更加明显，因此厂商对阴离子膜流速的范围有所限定，以0.2 mL PurciseTM 为例，其推荐流速为5-25MV/min，综合考虑，确定纯化流速为≤25 MV/min。
实施例5
使用实施例2中的反应液（衍生化完毕）用不同的缓冲液进行离心超滤换液，完毕后再使用0.2 mL PurciseTM阴离子膜进行过滤处理，流速为25 MV/min，完毕后使用HPLC检测NAC-LP1和LP1的含量，具体检测数据见表7，其中编号1为仅衍生化未超滤、未阴离子膜处理的反应液，其他样品使用不同组分、不同pH及不同浓度的缓冲液超滤和阴离子膜处理。
根据HPLC检测结果，使用组氨酸10-40 mM的组氨酸在pH 5.0-7.0范围均可完成对于带电和不带电毒素连接子小分子的有效去除，处理完毕后小分子含量低于最低检测限0.1 ug/mL。使用磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液也可完全吸附不带电小分子（LP1）；但对带电小分子（NAC-LP1）吸附能力有限，效果不如组氨酸缓冲液理想，可能是由于磷酸根和羧酸根与带电小分子发生竞争，降低了吸附效果。但即便如此，经过以磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液作为缓冲液的阴离子膜纯化处理，依然能显著降低带电小分子的含量，大体上实现了本发明的效果。图13为未超滤、未处理（编号1），使用组氨酸（编号4）、磷酸盐（编号7）和柠檬酸盐（编号8）缓冲液超滤和过膜后的HPLC检测图。
表7 不同样品信息
实施例6
按照实施例1的反应步骤进行实验，取100 mg曲妥珠单抗mAb1，加入单抗当量8倍的还原剂TCEP，于25℃下反应2 h；完毕后加入LP1毒素连接子，于25℃下继续反应2 h，最后加入20当量的衍生化试剂TCEP反应1h。
反应完毕后首先进行超滤换液，再使用阴离子膜进行处理，最后使用HPLC检测阴离子膜处理前后的小分子含量。由图14可知：阴离子膜处理前TCEP-LP1的浓度为14 ug/mL，膜处理后最终游离药物TCEP-LP1残留量均低于检测下限0.1 ug/mL。
对比例1
参见图1现有阳离子填料纯化技术示意图，其原理为利用非共价作用将ADC分子吸附在纯化柱上，然后使用缓冲液洗去小分子等杂质，最后更换缓冲液将ADC洗脱，其工艺复杂并且通常载量较低。由于过高流速会破坏层析填料的空间结构，所以一般对于流速会有所限制。根据思拓凡离子填料信息（如下表8所示）可知：以0.24 mL阳离子填料柱为例，其最高流速不超过1 mL/min，远低于Q膜层析的流速。故阴离子膜可使用更高流速进行样品处理，有利于提高生产效率。
表8
并且相较于柱层析需要层析系统、纯化柱、计算机等高昂的硬件设备和复杂的清洁验证，阴离子交换膜仅需要蠕动泵和硅胶管即可完成后续纯化处理工作，成本低廉、操作简便。
对比例2
按照CN115103691A“一种含抗体药物偶联物的药物组合物及其用途”对ADC药物进行纯化处理（参见实施例1-52 ADC-32）：
在25℃条件下，在含有20mM组氨酸-盐酸和2.5mM EDTA的缓冲液(pH 5.6)，5.0克曲妥珠抗体原液(34.44 μmol，20 mM组氨酸-盐酸缓冲液稀释曲妥珠抗体至抗体终浓度15mg/mL)与34.64mg三(2-羧乙基)膦盐酸盐(还原剂TCEP，Sigma，120.84μmol)在恒温水浴中搅拌反应3小时，生成中间体I溶液。
将化合物9较短保留时间化合物9-A(406.2 mg，378.17 μmol)溶解于9.98 mLDMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中间体I溶液中预加23.42 mL DMSO，再将上述化合物9-A的DMSO溶液加入到已预加DMSO的中间体I溶液中，于水浴25℃下搅拌反应1小时，加半胱氨酸淬灭反应过滤。在25℃温度下，将反应液通过超滤膜包(30kd)先后用含有10％(v/v)DMSO的20mM组氨酸-盐酸和2.5 mM EDTA缓冲水溶液(pH＝6.0)、10mM组氨酸-盐酸缓冲水溶液(pH＝5.5)进行10倍和16倍体积等体积超滤换液，去除小分子和残留溶剂，得到FADC-4A通式的示例性产物ADC-32。
上述去除游离毒素连接子的方法，为加DMSO有机试剂法，在纯化中引入了有机溶剂，该有机溶剂中容易影响ADC分子的稳定性和造成环境污染，且需要花费大量时间（总超滤体积10+16=26 DV，＞10小时）。针对难去除的喜树碱类毒素连接子，为节约时间和成本，往往游离毒素连接子浓度只能勉强符合质量要求，达到<10 μg/mL (ADC浓度10 mg/mL)远低于专利方法的<0.1 μg/mL（相同ADC浓度）。
对比例3
按照CN105829346B“抗HER2抗体－药物偶联物” 对ADC药物进行纯化处理（参见说明书实施例2以及共同操作D）：
共通操作D：抗体－药物偶联物的纯化
用市售的磷酸缓冲液(PBS7.4，Cat.No.10010－023，Invitrogen)、含有氯化钠(137mM)的磷酸钠缓冲液(10 mM，pH 6.0；本说明书中称为PBS6.0)或含有山梨糖醇(5％)的乙酸缓冲液(10mM，pH5.5；本说明书中称为ABS)中的任一种缓冲液将NAP－25柱平衡化。在该NAP－25柱中装填抗体－药物偶联物反应水溶液(约1.5 mL)，用制造商规定的量的缓冲液洗脱，由此分离获取抗体级分。将该分离获取的级分再次装填至NAP－25柱，用缓冲液洗脱，进行凝胶过滤纯化操作，反复操作计2～3次，由此，得到了除去了未连接的药物接头、低分子化合物(三(2－羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、N-乙酰基半胱氨酸(NAC)、二甲基亚砜)的抗体－药物偶联物。
上述纯化方法采用了SEC分子排阻色谱法对HER2抗体-药物偶联物进行纯化，柱子为NAP-25柱，如果纯化的量提高后纯化效果明显降低，不适宜放大生产，且需要反复操作2-3次，可知其操作方法复杂，除杂效率不高。且毒素连接子聚集形成的胶束状复合物因分子量较大（＞10 KDa），无法满足NAP-25柱对杂质分子量的要求，因此分离效果不佳。

Claims (12)

1. 一种基于阴离子膜的抗体偶联药物的纯化方法，其中，所述方法包括利用阴离子膜对抗体偶联药物进行纯化处理，除去抗体偶联药物中含有的游离的毒素连接子，所述游离毒素连接子包含带负电或者不带电的毒素连接子；所述抗体偶联药物中的毒素连接子具有能够与巯基反应的基团作为与抗体反应的接头，所述抗体偶联药物中的接头选自具有马来酰亚胺基团、α, β-不饱和羰基、卤代乙酰基、吡啶二巯基、卤代烷基、或乙烯基砜的基团。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述方法包括将由抗体偶联药物和缓冲液配制的缓冲混合溶液流穿过阴离子膜以进行纯化处理；所述缓冲混合溶液pH值为3-8，所述缓冲液选自组氨酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或甘氨酸缓冲液。
3. 根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述阴离子膜为聚醚砜类阴离子膜、聚丙烯酰胺类阴离子膜或再生纤维素类阴离子膜；所述阴离子膜每1 L膜处理0.1-20 kg 抗体偶联药物。
4. 根据权利要求2所述的纯化方法，其中，含有抗体偶联药物的缓冲混合溶液流穿过阴离子膜的速度为0.1-100 MV/min。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的纯化方法，其中，
所述纯化方法在用阴离子膜对抗体偶联药物进行纯化前，还包括用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤，以使得抗体偶联药物中的游离的毒素连接子带负电；
所述衍生剂选自含有巯基和负电基团的化合物、或者含有亚磷基和负电基团的化合物。
6.根据权利要求5所述的纯化方法，其中，所述衍生剂选自N-乙酰基半胱氨酸、2-巯基乙磺酸盐、巯基乙酸盐和三(2-羧乙基)膦中的一种或多种的组合。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其中，用衍生剂对抗体偶联药物进行处理的步骤包括：用摩尔量为抗体偶联药物1-60倍的衍生剂与抗体偶联药物混合均匀。
8.根据权利要求1~4任意一项所述的纯化方法，其中，抗体偶联药物的制备过程包括：向抗体分子的反应体系中加入还原剂，在0-37℃下进行反应，反应结束后，在反应体系中加入足量毒素连接子分子，再在0-37℃下进行反应，所述还原剂摩尔用量为抗体分子摩尔量的1-16倍；
所述还原剂选自三(2-羧乙基)膦和二硫苏糖醇中的一种或两种的组合。
9.根据权利要求1~4任意一项所述的纯化方法，所述抗体偶联药物中毒素连接子还包含细胞毒性药物，所述细胞毒性药物选自喜树碱类、美登素类药物、海兔毒素类或吡咯并苯二氮卓类药物。
10.根据权利要求9所述的纯化方法，其中，所述喜树碱类药物选自伊立替康或依喜替康或德鲁替康或7-乙基-10-羟基喜树碱；所述美登素类药物选自美登素硫代衍生物；所述海兔毒素类选自奥瑞他汀类衍生物；所述吡咯并苯二氮卓类药物选自PBD及其衍生物。
11.根据权利要求1~4任意一项所述的纯化方法，所述毒素连接子为LP1或LP2。
12.权利要求1~11任意一项所述的纯化方法制备得到的抗体偶联药物，其中，所述抗体偶联药物中游离的毒素连接子含量小于等于50μg/mL。
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