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CN118108613A - 一种阳离子脂质化合物及制备方法和应用、mRNA递送系统 - Google Patents

一种阳离子脂质化合物及制备方法和应用、mRNA递送系统 Download PDF

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CN118108613A
CN118108613A CN202311793156.5A CN202311793156A CN118108613A CN 118108613 A CN118108613 A CN 118108613A CN 202311793156 A CN202311793156 A CN 202311793156A CN 118108613 A CN118108613 A CN 118108613A
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苏焘
李红燕
何华美
孙榕
刘方润
黎丽英
窦文龙
郭凤娟
万季
潘有东
王弈
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Shenzhen Xinhe Ruien Biomedical Technology Co ltd
Beijing Xinhe Ruien Biomedical Technology Co ltd
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Shenzhen Xinhe Ruien Biomedical Technology Co ltd
Beijing Xinhe Ruien Biomedical Technology Co ltd
Shenzhen Neocura Biotechnology Corp
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Abstract

本发明是关于一种阳离子脂质化合物及制备方法和应用、mRNA递送系统；其中，所述阳离子脂质化合物的结构如通式(I)所示：其中，在通式(I)中：R1为带有酯基的饱和基团或带有酯基的不饱和基团；n为4～6；R2为C原子数大于等于8的烷基；X为O或S。本发明主要用于开发一种阳离子脂质化合物，该阳离子脂质化合物用于制备mRNA递送系统(如，LNP)，具有递送效率高、脾脏靶向性好、生物安全性高的技术效果。

Description

一种阳离子脂质化合物及制备方法和应用、mRNA递送系统
本公开要求于2022年12月26日提交中国专利局、申请号为202211675530.7、发明名称为“一种阳离子脂质化合物及制备方法和应用、mRNA递送系统”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中
技术领域
本发明涉及一种医药生物技术领域，特别是涉及一种阳离子脂质化合物及制备方法和应用、mRNA递送系统。
背景技术
mRNA(信使核糖核酸)是由DNA(脱氧核糖核酸)双链中的一条链为模板(template)，在RNA聚合酶(RNA polymerase)的催化作用下，以4种三磷酸核糖核苷(A、U、G、C)为底物，通过磷酸二酯键聚合而成的一类单链核糖核酸。
mRNA能够携带并传递细胞核内DNA所存储的遗传信息，在遗传信息向功能性蛋白的转换过程中发挥着关键作用。在细胞质中，未成熟的mRNA通过加帽，加尾，以及内含子剪切等步骤完成加工修饰变成成熟的mRNA，成熟的mRNA能够精确指导细胞质中蛋白质的合成过程。相对来说，由于mRNA比DNA的分子量小得多，易于转染，并且不会有整合到宿主DNA而引发插入突变的致癌风险。因此，以mRNA为预防性和治疗性药物，在多种疾病的防治方面有着巨大的优势和潜力。
mRNA核酸类药物是利用分子生物学的方法将目的功能基因或者目的基因的功能亚单位通过信使核糖核酸的形式导入患者体内，经靶向性胞内递送，晚期内含体逃逸，细胞内翻译及翻译后加工修饰，表达出具有特定功能的蛋白质，用以预防(功能性蛋白或者亚单位激活宿主免疫系统产生相应体液免疫或细胞免疫反应)或治疗疾病(表达出的蛋白或者亚单位具有治疗疾病的功能或调节其他基因表达的作用)的一种防治策略。与其他方法相比，其优势在于它可以直接在分子水平上激活机体产生针对特定病原体的功能性抗体或细胞免疫反应，或者有针对性地修复致病基因或纠正异常基因的表达，从而达到多种疾病预防和治疗的作用。mRNA核酸类药物可以达到传统药物无法替代的效果，例如单克隆抗体药物只能作用于细胞表面，而mRNA核酸类药物不仅可以针对细胞膜外蛋白发挥作用，也可以对细胞内蛋白发挥作用，甚至可以在细胞核内发挥作用，并具有精确的靶向性。在人类面临的7000多种疾病中，约1/3的疾病是由于功能性基因的表达出现了问题(缺失、降低或过表达)，如血友病(Hemophilia)、杜氏肌营养不良(DMD)、囊性纤维化(Cysticfibrosis)和严重的免疫缺陷综合征(SCID)等，在临床上几乎是无药可治，而mRNA核酸类药物对这种单基因疾病非常有优势。在个性化医疗以及精准医疗普及的时代背景下。理论上，由患者基因差异或基因表达异常引起的疾病，都可利用mRNA核酸药物对其进行精准有效的治疗。
虽然mRNA核酸类药物在调控基因表达及恶性疾病的预防和治疗中有巨大的优势和潜力。但是，此类药物的研发、制备以及后续系统给药中均面临着诸多困难，具体如下：首先，mRNA是以单链的形式存在，导致mRNA在体外及生理条件下极不稳定，不仅易被空气中或血液中的RNA核酸酶(RNAase)所降解，还易被肝脏、脾脏等组织器官中单核巨噬细胞清除；其次，由于mRNA带负电性，使其难以穿过细胞膜进入到细胞内部；再次，mRNA难以从内涵体逃逸并进入细胞质中发挥作用。此外，mRNA的尿嘧啶核糖核苷(U)易产生免疫原性，在某些情况下，免疫原性的产生有可能会增加mRNA药物潜在的毒副作用。最后，易产生脱靶效应也是mRNA核酸类药物在制备以及给药过程中面临的重要挑战。
因此，mRNA核酸类药物胞内递送系统的开发，是使其能够大规模临床应用的关键所在。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种阳离子脂质化合物及制备方法和应用、mRNA递送系统，主要目的在于提供一种阳离子脂质化合物，该阳离子脂质化合物用于制备mRNA递送系统(如，LNP)，具有递送效率高的技术效果。
为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
一方面，本发明的实施例提供一种阳离子脂质化合物，其中，所述阳离子脂质化合物的结构如通式(I)所示：
其中，在通式(I)中：R1为带有酯基的饱和基团或带有酯基的不饱和基团；n为4～6；R2为C原子数大于等于8的烷基；X为O或S。
优选的，R1为以下基团中的任一种：
优选的，所述阳离子脂质化合物为以下化合物中的任一种：
另一方面，本发明实施例提供一种上述阳离子脂质化合物的制备方法，其中，所述阳离子脂质化合物的制备方程式如下：
优选的，所述阳离子脂质化合物的制备步骤如下：在室温条件下，使四丁基氟化铵、四氢呋喃混合，进行反应；反应结束后，进行稀释、洗涤处理；然后将有机相干燥后进行纯化处理，得到阳离子脂质化合物。
优选的，若所述阳离子脂质化合物为化合物1、化合物4、化合物5、化合物9时，制备方程式如下：
优选的，的制备步骤如下：
在室温条件下，将碳酸钾、N,N-二甲基甲酰胺混合后，升温至75-85℃进行反应；反应结束后，进行稀释、洗涤处理；然后将有机相干燥后进行纯化处理，得到
优选的，当所述阳离子脂质化合物为化合物1、化合物5、化合物9时：
所述均为原料1-9其中，原料1-9的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料1-9的制备步骤如下：使原料1-8、二氯甲烷溶液、三氟乙酸反应设定时间；将反应液旋干，然后进行稀释、洗涤处理，将有机相干燥后进行纯化处理，得到原料1-9；
优选的，原料1-8的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料1-8的制备步骤如下：在冰水浴条件下，向反应容器中加入氢化钠、N,N-二甲基甲酰胺，冷却至0-5℃，然后向该反应体系中分批加入原料1-7的四氢呋喃溶液，反应第一设定时间后，再将原料1-6滴加到反应体系中进行反应，反应第二设定时间后，将反应温度升温至室温继续反应；反应结束后，进行淬灭处理，然后进行萃取、分液、干燥、纯化处理，得到原料1-8；
优选的，原料1-6的制备方程式如下：
进一步优选的，原料1-6的制备步骤如下：在室温条件下，使原料1-4、亚油酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二氯甲烷进行反应；反应结束后，进行萃取分液处理，对有机相进行洗涤、干燥、纯化处理，得到原料1-6。
优选的，当所述阳离子脂质化合物为化合物4时：
所述为原料4-5；其中，原料4-5的制备方程式如下：
进一步优选的，原料4-5的制备步骤如下：在室温条件下，使原料4-4、二氯甲烷溶液、三氟乙酸反应；反应结束后，将反应液旋干，然后进行稀释、洗涤，将有机相干燥后进行纯化处理，得到原料4-5；
优选的，原料4-4的制备方程式如下：
进一步优选的，原料4-4的制备步骤如下：在冰水浴条件下，将氢化钠、N,N-二甲基甲酰胺混合后，然后冷却至0-5℃，向该反应体系中分批加入原料1-7的四氢呋喃溶液，反应第一设定时间后，再向其中滴加原料4-3，反应第二设定时间后，升温至室温继续反应第三设定时间；反应结束后，对反应液依次进行淬灭、萃取、分液、干燥、纯化处理，得到原料4-4；
优选的，原料4-3的制备方程式如下：
进一步优选的，原料4-3的制备步骤如下：在室温条件下，将原料4-1、亚油酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应结束后，进行萃取分液，然后洗涤，将有机相干燥、纯化处理，得到原料4-3。
优选的，当所述阳离子脂质化合物为化合物1时：
所述为原料1-5；其中，原料1-5的制备方程式如下：
进一步优选的，原料1-5的制备步骤如下：在室温条件下，将原料1-3、原料1-4、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷反应，反应结束后，进行萃取处理，将有机相洗涤后，进行干燥、纯化处理，得到原料1-5；
优选的，原料1-3的制备方程式如下：
进一步优选的，原料1-3的制备步骤如下：在室温条件下，将原料1-2、乙醇、水、氢氧化钠置于密封装置，混合密封后，升温至105-115℃进行反应。反应结束后，对反应产物进行稀释，然后调节pH值至4.5-5.5，然后萃取，将有机相干燥，得到原料1-3；
优选的，原料1-2的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料1-2的制备步骤如下：将原料1-1、1-辛醇、对甲苯磺酸混合后，升温至100-110℃反应设定时间；加压旋干反应体系，进行纯化，得到无色油状原料1-2。
当所述阳离子脂质化合物为化合物4时：
所述为原料4-2；其中，所述原料4-2的制备方程式如下：
优选的，所述原料4-2的制备步骤如下：在室温条件下，使原料1-3、原料4-1、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷反应；反应结束后，进行萃取分液处理，将有机相洗涤、干燥、纯化处理，得到原料4-2。
当所述阳离子脂质化合物为化合物5时：
所述为原料5-3；其中，所述原料5-3的制备方程式如下：
优选的，原料5-3的制备步骤如下：在室温条件下，使原料5-2、6-溴-1-己醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷反应；反应结束后，进行萃取分液、洗涤、有机相干燥、纯化处理，得到原料5-3；
优选的，所述原料5-2的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料5-2的制备步骤如下：在室温条件下，将原料5-1、乙醇、水、氢氧化钠在反应容器中混合，反应容器密封后，将温度升温至105-115℃进行反应；反应结束后，对反应液进行稀释，然后调节pH值至4.5-5.5后，进行萃取，对有机相进行干燥，得到原料5-2；
优选的，原料5-1的制备方程式如下：
进一步优选的，原料5-1的制备步骤如下：在室温条件下，将原料1-1、正葵醇、对甲苯磺酸混合均匀后，升温至100-110℃进行反应；反应后对反应液进行减压旋干，然后进行纯化，得到无色的油状产品原料5-1。
当所述阳离子脂质化合物为化合物9时：
所述为原料9-4；其中，原料9-4的制备方程式如下：
优选的，所述原料9-4的制备步骤如下：在室温条件下，将原料9-3、6-溴-1-己醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应后，进行萃取分液、洗涤、将有机相干燥后进行纯化，得到原料9-4；
优选的，所述原料9-3的制备方程式如下：
进一步优选的，原料9-3的制备步骤如下：在室温条件下，使原料9-2、乙醇、水和氢氧化钠进行反应；反应结束后，调节pH至6.9-7.1，优选为7；然后进行萃取、将有机相干燥后，得到原料9-3；
优选的，原料9-2的制备方程式如下：
进一步优选的，在室温条件下，使原料9-1、正辛硫醇、三氟化硼乙醚和二氯甲烷进行反应；反应结束后，进行淬灭、萃取；将有机相洗涤、干燥、纯化处理后，得到原料9-2。
优选的，若所述阳离子脂质化合物为化合物2、化合物3、化合物6、化合物7时，制备方程式如下：
其中，为原料2-2
优选的，的制备步骤如下：
在室温条件，使原料Br-R1、碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺混合后，升温至75-85℃进行反应；反应结束后，对反应液进行稀释、洗涤，将有机相干燥后进行纯化，得到
优选的，原料2-2的制备方程式如下：
进一步优选的，原料2-2的制备步骤如下：先向反应容器中加入原料2-1、二氯甲烷溶液，再加入三氟乙酸，进行反应；反应结束后，将反应液旋干后，进行稀释、洗涤处理，将有机相干燥、纯化后，得到原料2-2；
优选的，原料2-1的制备方程式如下：
进一步优选的，原料2-1的制备步骤如下：在冰水浴条件下，在反应容器中加入氢化钠和N,N-二甲基甲酰胺，溶解后，冷却至0-5℃；然后，向该反应体系中分批加入原料1-7的四氢呋喃溶液，反应第一设定时间，然后将原料1-5滴入该反应体系中，滴加完毕，反应第二时间后，将反应温度升高至室温，继续反应第三设定时间；将反应液进行淬灭、萃取，分液、干燥、纯化，得到原料2-1。
优选的，当所述阳离子脂质化合物为化合物2时：所述Br-R1为原料2-4；其中，原料2-4的制备方程式如下：
优选的，所述原料2-4的制备步骤如下：在室温条件下，使6-溴-1-己醇、油酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应结束后进行萃取分液，然后将有机相洗涤、干燥、纯化后，得到原料2-4。
当所述阳离子脂质化合物为化合物3时：所述Br-R1为原料3-2；其中，所述原料3-2的制备方程式如下：
优选的，所述原料3-2的制备步骤如下：在室温条件下，使6-溴己酸、亚油醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应结束后，进行萃取分液，将有机相洗涤、干燥、纯化后，得到原料3-2。
当所述阳离子脂质化合物为化合物6时：所述Br-R1为原料6-2；其中，原料6-2的制备方程式如下：
优选的，所述原料6-2的制备步骤如下：在室温条件下，使6-溴己酸、原料6-1、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应结束后进行萃取分液，然后对有机相进行洗涤、干燥、纯化处理，得到原料6-2；
当所述阳离子脂质化合物为化合物7时：所述Br-R1为原料7-2；其中，原料7-2的制备方程式如下：
优选的，原料7-2的制备步骤如下：在室温条件下，使6-溴己酸、原料7-1、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷(200mL)进行反应；反应结束后进行萃取分液，将有机相进行洗涤、干燥、纯化，得到原料7-2。
优选的，所述化合物8的制备方程式如下：
其中，所述化合物8的制备步骤如下：在室温条件下，使原料8-4、四丁基氟化铵和四氢呋喃溶液混合后，进行反应；反应结束后，对反应液进行稀释、洗涤处理；将有机相干燥后进行纯化得到化合物8；
优选的，原料8-4的制备方程式如下：
进一步优选的，原料8-4的制备步骤如下：在室温条件下，使原料8-3、辛硫醇和安息香双甲醚混合，得到反应体系；对反应体系进行紫外光照射以进行反应；反应结束后，进行纯化，得到原料8-4；
优选的，所述原料8-3的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料8-3的制备步骤如下：在室温条件下，将原料1-9、原料8-2、碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺混合后，升温至75-85℃进行反应；反应结束后，对反应液进行稀释、洗涤处理，然后，将有机相进行纯化后，得到原料8-3；
优选的，原料8-2的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料8-2的制备步骤如下：在室温条件下，使8-溴辛酸、丙炔醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应结束后进行萃取分液；然后，将有机相洗涤、干燥、纯化后得到原料8-2。
优选的，上述任一项所述的阳离子脂质化合物在制备mRNA递送系统中的应用；优选的，mRNA递送系统为LNP组合物。
优选的，上述任一项所述的阳离子脂质化合物在制备核酸类药物中的应用。
再一方面，本发明实施例还提供一种mRNA递送系统，其中，所述mRNA递送系统包括上述任一项所述的阳离子脂质化合物；优选的，mRNA递送系统为LNP组合物。
优选的，上述的mRNA递送系统在制备核酸类药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的一种阳离子脂质化合物及制备方法和应用、mRNA递送系统至少具有下列有益效果：
一方面，本发明实施例开发一种新的阳离子脂质化合物，其结构如通式(I)所示，该阳离子脂质化合物用于制备mRNA递送系统(LNP组合物)，具有递送效率高、脾脏靶向性好、生物安全性高的特点。
另一方面，本发明实施例提供一种mRNA递送系统(LNP)，由于该mRNA递送系统包括了上述的阳离子脂质化合物，因此，该mRNA递送系统(LNP)具有递送效率高、脾脏靶向性好、生物安全性高的特点。
另外，上述的阳离子脂质化合物、mRNA递送系统(LNP)主要用于制备核酸类药物。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明的实施例1中的由化合物1制备的脂质纳米颗粒制剂和对照制剂(MC3、SM-102脂质纳米颗粒制剂)的细胞转染效率图；其中，(a)为由化合物1制备的脂质纳米颗粒制剂和对照制剂转染细胞后荧光素酶活性定量图；(b)为化合物1与SM102脂质纳米颗粒制剂相对MC3脂质纳米颗粒制剂转染效率的倍数比较图。
图2是本发明的实施例3中的由化合物1与对照MC3制备的脂质纳米颗粒制剂体内转染效率图；其中，(a)为脂质纳米颗粒制剂静脉给药后6h的活体成像图；(b)为48h内小鼠表达的荧光素酶蛋白的光子总量随时间的变化趋势图；(c)为7天内小鼠的相对体重变化图。
图3为本发明的实施例5中，由本发明的化合物1-9制备成的脂质纳米颗粒制剂和对照在肝脏部位的递送效率对比图。
图4为本发明的实施例5中，由本发明的化合物1-9制备成的脂质纳米颗粒制剂和对照在脾脏部位的递送效率对比图。
图5为本发明的实施例5中，由本发明的化合物1-9制备成的脂质纳米颗粒制剂和对照的脾靶向性对比图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
本发明实施例开发一种新型的阳离子脂质化合物，其用于制备mRNA递送系统，具体递送效率高的技术效果。在此，该阳离子脂质化合物的结构如通式(I)所示：
其中，在通式(I)中，R1为带有酯基的饱和基团或带有酯基的不饱和基团；n为4～6；R2为C原子数大于等于8的烷基；X为O或S。
优选的，本发明的阳离子脂质化合物为化合物1-9中的任一种。下面详细说明化合物1-9的制备方法。
1.化合物1
化合物1的制备步骤如下：
在室温条件下，于100mL的三口烧瓶中，分别加入原料1-1(10.0g，63.7mmol)、1-辛醇(24.8g，191mmol)、对甲苯磺酸(0.55g，3.2mmol)，混合均匀后，升温至100-110℃，反应72小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。加压旋干反应体系，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到无色的油状产品化合物1-2(原料1-2)。
在室温条件下，于100mL的密封管中，分别加入原料1-2(5.0g，15.4mmol)、乙醇(15mL)、水(15mL)和氢氧化钠(1.8g，46.2mmol)，混合均匀密封后，升温至105-115℃，反应16小时。冷却，TLC点板，显示原料反应完全。然后加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用1mol/L的盐酸中和体系至pH至4.5-5.5。用乙酸乙酯(50mL)萃取两次，有机相合并后干燥、旋干。所得粗产品1-3(原料1-3)不进行进一步纯化，直接用于下一步。
在室温条件下，于250mL的单口瓶中，加入原料1-3(4.0g，11.6mmol)、原料1-4(2.1g，11.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.7g,13.9mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.15g，1.2mmol)、三乙胺(2.3g，23.2mmol)和二氯甲烷(100mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料1-5。
在室温条件下，于500mL的单口瓶中，加入原料1-4(10.0g，55.6mmol)、亚油酸(15.6g，55.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(12.8g，66.7mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.68g，5.6mmol)、三乙胺(11.2g，111mmol)和二氯甲烷(200mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(400mL)与水(400mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料1-6。
在冰水浴条件下，于插入温度计的250mL三口瓶中，分别加入氢化钠(60％含量，18.5mmol，0.74g)、以及N,N-二甲基甲酰胺(50mL)溶解，冷却至0-5℃，向该反应体系分批，缓慢加入原料1-7(4.0g，13.2mmol)的四氢呋喃溶液(50mL)，反应30分钟后，然后将原料1-6(5.8g，13.2mmol)通过恒压滴液漏斗加入到上述体系中，滴加完毕，反应1小时后升至室温继续反应5小时。TLC监控，原料大部分反应完全。在反应液中，缓慢加入饱和的氯化铵溶液进行淬灭，然后加入乙酸乙酯(100mL)进行萃取，分液。
经干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料1-8。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料1-8(2.0g，3.0mmol)和二氯甲烷溶液(20mL)然后加入三氟乙酸(5mL)，反应1小时，TLC监控，原料大部分反应完全，反应液旋干，然后加入乙酸乙酯(100mL)，并用饱碳酸氢钠(10mL)洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料1-9。
在室温条件，于100mL烧瓶中，分别加入原料1-9(1.0g，1.7mmol)、原料1-5(0.90g，1.7mmol)、碳酸钾(0.47g，3.4mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，混合均匀后，升温至80℃，反应16小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料1-10。
在室温条件，于50mL烧瓶中，分别加入原料1-10(0.8g，1.7mmol)、四丁基氟化铵(0.89g，3.4mmol)和四氢呋喃溶液(20mL)。混匀后反应4小时。TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物化合物1。其中，化合物1的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.32(m,4H),4.46(t,J＝5.6Hz,1H),4.02(t,J＝6.7Hz,1H),3.58–3.48(m,5H),3.38(m,1H),2.74(t,J＝6.4Hz,-1H),2.44–2.31(m,2H),2.26(t,J＝7.5Hz,1H),2.02(q,J＝6.9Hz,5H),1.90(q,J＝7.0Hz,2H),1.59(m,3H),1.40–1.18(m,24H),0.86(m,9H).C54H103NO7Exact Mass:877.7735,found[M+H]+:878.77845.
2.化合物2
化合物2的制备步骤如下：
在冰水浴条件下，于插入温度计的250mL三口瓶中，分别加入氢化钠(60％含量，18.5mmol，0.74g)、以及N,N-二甲基甲酰胺(50mL)溶解，冷却至0-5℃，向该反应体系分批，缓慢加入原料1-7(4.0g，13.2mmol)的四氢呋喃溶液(20mL)，反应30分钟后，然后将原料1-5(6.7g，13.2mmol)通过恒压滴液漏斗加入到上述体系中，滴加完毕，反应1小时后升至室温继续反应5小时。TLC监控，原料大部分反应完全。在反应液中，缓慢加入饱和的氯化铵溶液进行淬灭，然后加入乙酸乙酯(50mL)进行萃取，分液。
经干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料2-1。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料2-1(3.0g，4.1mmol)和二氯甲烷溶液(40mL)，然后加入三氟乙酸(8mL)，反应1小时，TLC监控，原料大部分反应完全，反应液旋干，然后加入乙酸乙酯(200mL)，并用饱碳酸氢钠(50mL)洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料2-2。
在室温条件下，于500mL的单口瓶中，加入6-溴-1-己醇(10.0g，55.6mmol)、油酸(2-3，15.7g，55.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(12.8g，66.7mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.68g，5.6mmol)、三乙胺(11.2g，111mmol)和二氯甲烷(200mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(400mL)与水(400mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料2-4。
在室温条件下，于100mL的烧瓶中，分别加入原料2-4(1.0g，2.2mmol)、原料2-2(1.38g，2.2mmol)、碳酸钾(0.61g，4.4mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，混合均匀后，升温至80℃反应16小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料2-5。
在室温条件，于50mL的烧瓶中，分别加入原料2-5(0.6g，1.3mmol)、四丁基氟化铵(0.68g，2.6mmol)和四氢呋喃溶液(10mL)。混匀后反应4小时。TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(30mL)稀释，使用水(30mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物化合物2。
3.化合物3
化合物3的制备步骤如下：
在室温条件下，于500mL的单口瓶中，加入6-溴己酸(10.0g，51.5mmol)、亚油醇(原料3-1，13.7g，51.5mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(11.8g，61.8mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.63g，5.2mmol)、三乙胺(10.4g，103mmol)和二氯甲烷(200mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(400mL)与水(400mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料3-2。
在室温条件下，于100mL的烧瓶中，分别加入原料3-2(1.0g，2.2mmol)、原料2-2(1.4g，2.2mmol)、碳酸钾(0.61g，4.4mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，混合均匀后，升温至80℃反应16小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料3-3。
在室温条件下，于50mL的烧瓶中，分别加入原料3-3(1.0g，1.0mmol)、四丁基氟化铵(0.53g，2.0mmol)和四氢呋喃溶液(10mL)。混匀后反应4小时。TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(30mL)稀释，使用水(30mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物化合物3。
4.化合物4
化合物4的制备步骤如下：
在室温条件下，于250mL的单口瓶中，加入原料1-3(4.0g，11.6mmol)、原料4-1(1.8g，11.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.7g，13.9mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.15g，1.2mmol)、三乙胺(2.3g，23.2mmol)和二氯甲烷(50mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产品4-2。
在室温条件下，于500mL的单口瓶中，加入原料4-1(10.0g，65.8mmol)、亚油酸(18.4g，65.8mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(12.6g，65.8mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.81g，6.6mmol)、三乙胺(13.3g，132mmol)和二氯甲烷(250mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(500mL)与水(500mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料4-3。
在冰水浴条件下，于插入温度计的250mL三口瓶中，分别加入氢化钠(60％含量，18.5mmol，0.74g)、以及N,N-二甲基甲酰胺(50mL)溶解，冷却至0-5℃，向该反应体系分批，缓慢加入原料1-7(4.0g，13.2mmol)的四氢呋喃溶液(50mL)，反应30分钟后，然后将原料4-3(5.5g，13.2mmol)通过恒压滴液漏斗加入到上述体系中，滴加完毕，反应1小时后升至室温继续反应5小时。TLC监控，原料大部分反应完全。在反应液中，缓慢加入饱和的氯化铵溶液进行淬灭，然后加入乙酸乙酯(100mL)进行萃取，分液。
经干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料4-4。
在室温条件下，于100mL的单口瓶中，加入原料4-4(2.0g，3.1mmol)和二氯甲烷溶液(20mL)，然后加入三氟乙酸(5mL)，反应1小时，TLC监控，原料大部分反应完全，反应液旋干，然后加入乙酸乙酯(100mL)，并用饱碳酸氢钠(50mL)洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料4-5。
在室温条件，于100mL烧瓶中，分别加入原料4-5(1.0g，1.9mmol),原料4-2(0.89g，1.9mmol)，碳酸钾(0.52g，3.8mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，混合均匀后，升温至80℃，反应16小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。
有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料4-6。
在室温条件，于50mL烧瓶中，分别加入原料4-6(0.8g，0.9mmol),四丁基氟化铵(0.47g，1.8mmol)和四氢呋喃溶液(10mL)。混匀后反应4小时。TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(30mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物化合物4。
5.化合物5
化合物5的制备步骤如下：
在室温条件，于250mL三口烧瓶中，分别加入原料1-1(10.0g，63.7mmol)、正葵醇(30.1g，19mmol)、对甲苯磺酸(0.55g，3.2mmol)，混合均匀后，升温至105℃反应72小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。减压旋干反应体系，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到无色的油状产品原料5-1。
在室温条件，于100mL的密封管中，分别加入原料5-1(5.0g，13.1mmol),乙醇(15mL)、水(15mL)和氢氧化钠(1.6g，39.3mmol)，混合均匀密封后，升温至110℃，反应16小时。冷却，TLC点板，显示原料反应完全。然后加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用1mol/L盐酸中和体系至pH＝5.0。用乙酸乙酯(50mL)萃取两次，有机相合并后干燥、旋干。所得粗产品5-2不进行进一步纯化，直接用于下一步。
在室温条件下，于250mL的单口瓶中，加入原料5-2(4.0g，10.0mmol)、6-溴-1-己醇(1.8g，10.0mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.3g，12.0mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.12g，1.0mmol)、三乙胺(2.2g，20.0mmol)和二氯甲烷(100mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(100mL)与水(100mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料5-3。
在室温条件，于100mL烧瓶中，分别加入原料5-3(1.0g，1.8mmol)、原料1-9(1.2g，1.8mmol)、碳酸钾(0.5g，3.6mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，混合均匀后，升温至80℃反应16小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料5-4。
在室温条件下，于50mL烧瓶中，分别加入原料5-4(1.0g，1.0mmol),四丁基氟化铵(0.5g，2.0mmol)和四氢呋喃溶液(20mL)。混匀后反应4小时。TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物化合物5。
6.化合物6
化合物6的制备步骤如下：
在室温条件下，于500mL的单口瓶中，加入6-溴己酸(10.0g，51.0mmol)、原料6-1(9.9g，51.0mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(9.8g，51.0mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.62g,5.1mmol)、三乙胺(10.3g，102mmol)和二氯甲烷(200mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(400mL)与水(400mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料6-2。
在室温条件下，于100mL烧瓶中，分别加入原料6-2(1.0g，2.7mmol)、原料2-2(1.7g，2.7mmol)、碳酸钾(0.75g，5.4mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，混合均匀后，升温至80℃，反应16小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料6-3。
在室温条件，于50mL烧瓶中，分别加入原料6-3(1.0g，1.1mmol),四丁基氟化铵(0.57g，2.2mmol)和四氢呋喃溶液(10mL)。混匀后反应4小时。TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(30mL)稀释，使用水(30mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物化合物6。
7.化合物7
化合物7的制备步骤如下：
在室温条件下，于500mL的单口瓶中，加入6-溴己酸(10.0g，43.9mmol)、原料7-1(8.5g，43.9mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(8.4g，43.9mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.54g，4.4mmol)、三乙胺(8.9g，87.8mmol)和二氯甲烷(200mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(400mL)与水(400mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料7-2。
在室温条件下，于100mL烧瓶中，分别加入原料7-2(1.0g，2.5mmol)、原料2-2(1.6g，2.5mmol)、碳酸钾(0.69g，5.0mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，混合均匀后，升温至80℃反应16小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料7-3。
在室温条件，于50mL烧瓶中，分别加入原料7-3(1.0g，1.0mmol),四丁基氟化铵(0.53g，2.0mmol)和四氢呋喃溶液(10mL)。混匀后反应4小时。TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(30mL)稀释，使用水(30mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物化合物7。
8.化合物8
化合物8的制备步骤如下：
在室温条件下，于500mL的单口瓶中，加入8-溴辛酸(原料8-1，10.0g,45.0mmol)、丙炔醇(2.5g，45.0mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(8.6g，45.0mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.55g，4.5mmol)、三乙胺(9.1g，90.0mmol)和二氯甲烷(200mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(400mL)与水(400mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料8-2。
在室温条件，于100mL烧瓶中，分别加入原料1-9(2.0g，3.6mmol)、原料8-2(0.92g，3.6mmol)、碳酸钾(1.0g，7.2mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(50mL)，混合均匀后，升温至80℃反应16小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(100mL)稀释，使用水(100mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料8-3。
在室温条件下，于20mL的反应瓶中，分别加入原料8-3(0.5g，0.67mmol)、辛硫醇(0.55g，3.8mmol)和安息香双甲醚(20mg，4％wt/wt)，混合均匀。反应体系使用10mW/cm2的紫外光照射3分钟，TLC点板，显示原料反应完全。然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料8-4。
在室温条件下，于25mL烧瓶中，分别加入原料8-4(0.5g，0.5mmol)、四丁基氟化铵(0.26g，1.0mmol)和四氢呋喃溶液(10mL)。混匀后反应4小时。TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物化合物8。
9.化合物9
化合物9的制备步骤如下：
在室温条件下，于250mL的单口瓶中，加入原料9-1(2.0g，15.4mmol)、正辛硫醇(5.8g，40mmol)、三氟化硼乙醚(2.2g，15.4mmol)和二氯甲烷(100mL)。反应于室温进行45分钟，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入水(100mL)进行淬灭。二氯甲烷(50mL)萃取两次，有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料9-2。
在室温条件，于100mL的烧瓶中，分别加入原料9-2(1.0g，15.4mmol)、乙醇(15mL)、水(15mL)和氢氧化钠(1.8g，46.2mmol)，混合均匀后，室温反应4小时。冷却，TLC点板，显示原料反应完全。使用1mol/L盐酸中和体系至pH＝7.0。用二氯甲烷(50mL)萃取两次，有机相合并后干燥、旋干。所得粗产品9-3不进行进一步纯化，直接用于下一步。
在室温条件下，于50mL的单口瓶中，加入原料9-3(1.5g，4.0mmol)、6-溴-1-己醇(0.72g，4.0mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.77g，4.0mmol)、4-二甲氨基吡啶(49mg，0.4mmol)、三乙胺(0.81g，8.0mmol)和二氯甲烷(20mL)，反应过夜后，TLC监控，原料大部分反应完全，然后加入乙酸乙酯(50mL)与水(50mL)进行萃取分液，然后有机相在用饱和氯化铵洗涤2-3次，有机相干燥，旋干，然后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料9-4。
在室温条件，于100mL烧瓶中，分别加入原料9-4(1.0g，1.9mmol)、原料1-9(1.0g，1.9mmol)、碳酸钾(0.51g，3.7mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，混合均匀后，升温至80℃，反应16小时，冷却，TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到原料9-5。
在室温条件下，于50mL的烧瓶中，分别加入原料9-5(0.8g，0.8mmol)、四丁基氟化铵(0.41g，1.6mmol)和四氢呋喃溶液(10mL)。混匀后反应4小时。TLC点板，显示原料反应完全。加入乙酸乙酯(50mL)稀释，使用水(50mL)洗涤。有机相干燥后加入硅胶进行拌样，通过柱层析得到产物化合物9。
下面以化合物1为例说明本发明的阳离子脂质化合物应用在mRNA递送系统LNP中的技术效果。
实施例1
脂质纳米颗粒制剂的制备及检测。
1.制备步骤：
将本发明的上述化合物1分别与DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000以50：10：38.5：1.5的摩尔比溶于乙醇制备乙醇脂质溶液。另外，将萤光素酶(Firefly luciferase，Fluc)mRNA用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)稀释得到mRNA水溶液。
通过微流控装置以1：3的体积比混合乙醇脂质溶液和mRNA水溶液制备脂质纳米颗粒，经过1X PBS透析18小时以除去乙醇和完成柠檬酸盐缓冲液换液过程。最后，脂质纳米颗粒溶液通过0.2μm无菌过滤和超滤浓缩过程，最终得到包封萤光素酶mRNA的化合物1脂质纳米颗粒制剂。
另外，用相同方法制备出MC3脂质纳米颗粒制剂作为对照。
2.检测步骤
利用LitesizerTM500(Anton Paar，Austria)测定脂质纳米颗粒粒径，多分散指数(PDI))和电势(Zeta)。其中，粒径及电位均在0.1％PBS中测定。通过RiboGreen法检测脂质纳米颗粒制剂包封率，测试结果如表1所示：
表1
制剂名称 粒径 PDI(％) Zeta EE(％)
MC3-Luc 95.53±6.11 20.2±2.35 17.0±6.56 95.6±3.07
化合物1-Luc 112.16±0.66 21.8±9.69 23.1±3.04 89.7±1.56
从表1可以看出，本发明的化合物1作为可离子化脂质可形成脂质纳米颗粒。
实施例2
脂质纳米颗粒制剂细胞转染。
制备实施例1中包封Fluc mRNA的化合物1脂质纳米颗粒制剂。同时，制备MC3、SM-102脂质纳米颗粒制剂作为对照。
将上述三种制剂用培养基稀释至160ng/mL并加入Hek293细胞。转24h后，去除培养基并用PBS冲洗,随后加入细胞裂解液并孵育10min。裂解完成后加入萤光素酶底物完成检测，测试结果如图1所示。
从图1中的(a)图与(b)图可以看出：相对于MC3脂质纳米颗粒制剂，本发明的化合物1脂质纳米颗粒制剂的细胞转染能力增强了十多倍，并和SM-102脂质纳米颗粒制剂转染能力相当。由此可见，本发明的化合物应用于mRNA递送系统时具有优异的递送效率。
实施例3
脂质纳米颗粒制剂体内转染。
将BALB/c小鼠分为两组，每组3只，各组单次静脉以5μg/只剂量注射MC3或化合物1脂质纳米颗粒制剂。分别在0、6、10、24、48小时腹腔注射萤光素酶底物，等待10min后利用活体成像仪成像并定量。此外为考查化合物1脂质纳米颗粒制剂的生物安全性，用MC3脂质纳米颗粒制剂作对照，分别在给药前，给药后6h、1天、2天、4天及7天记录小鼠体重变化。
6h活体成像结果(参见图2中的(a)图)显示，本发明化合物1脂质纳米颗粒制剂体内转染效率高于MC3脂质纳米颗粒制剂且化合物1脂质纳米颗粒制剂在体内可实现Fluc的持续高表达(参见图2中的(b)图)。此外，化合物1脂质纳米颗粒制剂并未引起体重显著降低(参见图2中的(c)图)，说明其具有良好的生物安全性。
综上所述，本发明的可离子化脂质化合物1，在体内外用于mRNA递送上，具有递送效率高、脾脏靶向性好、生物安全性高的技术效果。
下面以化合物1-9为例进一步说明本发明的阳离子脂质化合物应用在mRNA递送系统LNP中的技术效果。
实施例4
脂质纳米颗粒制剂的制备及检测。
1.制备步骤：
将本发明的上述化合物分别与DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000以50：15：34.5：0.5的摩尔比溶于乙醇，分别制备出乙醇脂质溶液。
将N1-甲基-假尿苷修饰的萤光素酶mRNA用50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4.0)稀释得到mRNA水溶液。
通过微流控装置以1：3的体积比混合乙醇脂质溶液和mRNA水溶液制备脂质纳米颗粒，经过1X PBS透析18小时以除去乙醇和完成柠檬酸盐缓冲液换液过程。最后，脂质纳米颗粒溶液经过无菌过滤(0.2μm)和超滤浓缩步骤，得到包封萤光素酶mRNA的脂质纳米颗粒制剂(分别简称为：化合物1LNP、化合物2LNP、化合物3LNP、化合物4LNP、化合物5LNP、化合物6LNP、化合物7LNP、化合物8LNP、化合物9LNP)。
另外，用相同方法制备MC3和SM102脂质纳米颗粒制剂作为对照。
2.检测步骤
利用LitesizerTM500(Anton Paar，Austria)测定脂质纳米颗粒粒径、多分散指数(PDI)和电位(Zeta)。其中，粒径及电位均在0.1％PBS中测定。通过RiboGreen法检测脂质纳米颗粒制剂包封率，测试结果如表2所示：
表2
制剂名称 粒径(nm) PDI(％) Zeta(mV) EE(％)
MC3 LNP 148.37 15.3 10.8 92.86
SM102 LNP 131.04 7.3 1.4 86.08
化合物1 LNP 155.66 13.3 8.7 86.55
化合物2 LNP 190.53 7.1 10.6 87.79
化合物3 LNP 167.82 14.9 5.9 90.16
化合物4 LNP 196.87 6.2 4.7 88.99
化合物5 LNP 150.34 5.2 1.8 90.77
化合物6 LNP 214.60 17.3 9.5 56.36
化合物7 LNP 165.38 3.6 4.3 92.30
化合物8 LNP 127.27 18.6 3.6 92.33
化合物9 LNP 175.53 10.9 6.2 93.23
从表2可以看出，本发明的化合物1-9作为阳离子脂质可形成脂质纳米颗粒。
实施例5
脂质纳米颗粒制剂体内转染。
将BALB/c小鼠分为11组，每组三只。各组单次尾静脉(0.3mg/kg剂量)注射MC3或SM102或化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7或化合物8或化合物9脂质纳米颗粒制剂。具体地，第一组注射对照MC3脂质纳米颗粒制剂(MC3LNP)、第二组注射对照SM102脂质纳米颗粒制剂(SM102 LNP)、第三组注射化合物1脂质纳米颗粒制剂(化合物1LNP)、第四组注射化合物2脂质纳米颗粒制剂(化合物2LNP)、第五组注射化合物3脂质纳米颗粒制剂(化合物3LNP)、第六组注射化合物4脂质纳米颗粒制剂(化合物4LNP)、第七组注射化合物5脂质纳米颗粒制剂(化合物5LNP)、第八组注射化合物6脂质纳米颗粒制剂(化合物6LNP)、第九组注射化合物7脂质纳米颗粒制剂(化合物7LNP)、第十组注射化合物8脂质纳米颗粒制剂(化合物8LNP)、第十一组注射化合物9脂质纳米颗粒制剂(化合物9LNP)。
6h后腹腔注射荧光素酶底物，等待10min后解剖并取肝脏、脾脏、肺脏及肾脏等器官，利用小动物活体成像系统观察并定量荧光信号。
根据尾静脉注射结果，可见：本发明化合物1-9脂质纳米颗粒制剂在肝脏部位的递送效率显著低于对照SM102脂质纳米颗粒制剂(参见图3所示)。本发明化合物1-9脂质纳米颗粒制剂在脾脏部位的递送效率相当于或高于SM102脂质纳米颗粒制剂，均显著高于MC3脂质纳米颗粒制剂(参见图4所示)。本发明化合物1-9脂质纳米颗粒制剂的脾脏靶向性显著高于SM102、MC3脂质纳米颗粒制剂(参见图5所示)。
综上所述，本发明开发的可离子化脂质化合物1-9，在体内mRNA递送上，具有递送效率高、脾脏靶向性好的技术效果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (14)

1.一种阳离子脂质化合物，其特征在于，所述阳离子脂质化合物的结构如通式(I)所示：
其中，在通式(I)中：R1为带有酯基的饱和基团或带有酯基的不饱和基团；n为4～6；R2为C原子数大于等于8的烷基；X为O或S。
2.根据权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，R1为以下基团中的任一种：
3.根据权利要求1或2所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，所述阳离子脂质化合物为以下化合物中的任一种：
4.权利要求1-3任一项所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质化合物的制备方程式如下：
优选的，所述阳离子脂质化合物的制备步骤如下：在室温条件下，使四丁基氟化铵、四氢呋喃混合，进行反应；反应结束后，进行稀释、洗涤处理；然后将有机相干燥后进行纯化处理，得到阳离子脂质化合物。
5.根据权利要求4所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，若所述阳离子脂质化合物为化合物1、化合物4、化合物5、化合物9时，制备方程式如下：
优选的，的制备步骤如下：
在室温条件下，将碳酸钾、N,N-二甲基甲酰胺混合后，升温至75-85℃进行反应；反应结束后，进行稀释、洗涤处理；然后将有机相干燥后进行纯化处理，得到
6.根据权利要求5所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，
当所述阳离子脂质化合物为化合物1、化合物5、化合物9时：
所述均为原料1-9其中，原料1-9的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料1-9的制备步骤如下：使原料1-8、二氯甲烷溶液、三氟乙酸反应设定时间；将反应液旋干，然后进行稀释、洗涤处理，将有机相干燥后进行纯化处理，得到原料1-9；
优选的，原料1-8的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料1-8的制备步骤如下：在冰水浴条件下，向反应容器中加入氢化钠、N,N-二甲基甲酰胺，冷却至0-5℃，然后向该反应体系中分批加入原料1-7的四氢呋喃溶液，反应第一设定时间后，再将原料1-6滴加到反应体系中进行反应，反应第二设定时间后，将反应温度升温至室温继续反应；反应结束后，进行淬灭处理，然后进行萃取、分液、干燥、纯化处理，得到原料1-8；
优选的，原料1-6的制备方程式如下：
进一步优选的，原料1-6的制备步骤如下：在室温条件下，使原料1-4、亚油酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二氯甲烷进行反应；反应结束后，进行萃取分液处理，对有机相进行洗涤、干燥、纯化处理，得到原料1-6；
当所述阳离子脂质化合物为化合物4时：
进一步优选的，原料4-5的制备步骤如下：在室温条件下，使原料4-4、二氯甲烷溶液、三氟乙酸反应；反应结束后，将反应液旋干，然后进行稀释、洗涤，将有机相干燥后进行纯化处理，得到原料4-5；
优选的，原料4-4的制备方程式如下：
进一步优选的，原料4-4的制备步骤如下：在冰水浴条件下，将氢化钠、N,N-二甲基甲酰胺混合后，然后冷却至0-5℃，向该反应体系中分批加入原料1-7的四氢呋喃溶液，反应第一设定时间后，再向其中滴加原料4-3，反应第二设定时间后，升温至室温继续反应第三设定时间；反应结束后，对反应液依次进行淬灭、萃取、分液、干燥、纯化处理，得到原料4-4；
优选的，原料4-3的制备方程式如下：
进一步优选的，原料4-3的制备步骤如下：在室温条件下，将原料4-1、亚油酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应结束后，进行萃取分液，然后洗涤，将有机相干燥、纯化处理，得到原料4-3。
7.根据权利要求5所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，
当所述阳离子脂质化合物为化合物1时：
所述为原料1-5；其中，原料1-5的制备方程式如下：
进一步优选的，原料1-5的制备步骤如下：在室温条件下，将原料1-3、原料1-4、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷反应，反应结束后，进行萃取处理，将有机相洗涤后，进行干燥、纯化处理，得到原料1-5；
优选的，原料1-3的制备方程式如下：
进一步优选的，原料1-3的制备步骤如下：在室温条件下，将原料1-2、乙醇、水、氢氧化钠置于密封装置，混合密封后，升温至105-115℃进行反应。反应结束后，对反应产物进行稀释，然后调节pH值至5.5-6然后萃取，将有机相干燥，得到原料1-3；
优选的，原料1-2的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料1-2的制备步骤如下：将原料1-1、1-辛醇、对甲苯磺酸混合后，升温至100-110℃反应设定时间；加压旋干反应体系，进行纯化，得到无色油状原料1-2；
当所述阳离子脂质化合物为化合物4时：
所述为原料4-2；其中，所述原料4-2的制备方程式如下：
优选的，所述原料4-2的制备步骤如下：在室温条件下，使原料1-3、原料4-1、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷反应；反应结束后，进行萃取分液处理，将有机相洗涤、干燥、纯化处理，得到原料4-2；
当所述阳离子脂质化合物为化合物5时：
所述为原料5-3；其中，所述原料5-3的制备方程式如下：
优选的，原料5-3的制备步骤如下：在室温条件下，使原料5-2、6-溴-1-己醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷反应；反应结束后，进行萃取分液、洗涤、有机相干燥、纯化处理，得到原料5-3；
优选的，所述原料5-2的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料5-2的制备步骤如下：在室温条件下，将原料5-1、乙醇、水、氢氧化钠在反应容器中混合，反应容器密封后，将温度升温至105-115℃进行反应；反应结束后，对反应液进行稀释，然后调节pH值至4.5-5.5后，进行萃取，对有机相进行干燥，得到原料5-2；
优选的，原料5-1的制备方程式如下：
进一步优选的，原料5-1的制备步骤如下：在室温条件下，将原料1-1、正葵醇、对甲苯磺酸混合均匀后，升温至100-110℃进行反应；反应后对反应液进行减压旋干，然后进行纯化，得到无色的油状产品原料5-1；
当所述阳离子脂质化合物为化合物9时：
所述为原料9-4；其中，原料9-4的制备方程式如下：
优选的，所述原料9-4的制备步骤如下：在室温条件下，将原料9-3、6-溴-1-己醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应后，进行萃取分液、洗涤、将有机相干燥后进行纯化，得到原料9-4；
优选的，所述原料9-3的制备方程式如下：
进一步优选的，原料9-3的制备步骤如下：在室温条件下，使原料9-2、乙醇、水和氢氧化钠进行反应；反应结束后，调节pH至为6.9-7.1，优选为7；然后进行萃取、将有机相干燥后，得到原料9-3；
优选的，原料9-2的制备方程式如下：
进一步优选的，在室温条件下，使原料9-1、正辛硫醇、三氟化硼乙醚和二氯甲烷进行反应；反应结束后，进行淬灭、萃取；将有机相洗涤、干燥、纯化处理后，得到原料9-2。
8.根据权利要求4所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，若所述阳离子脂质化合物为化合物2、化合物3、化合物6、化合物7时，制备方程式如下：
其中，为原料2-2
优选的，的制备步骤如下：
在室温条件，使原料Br-R1、碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺混合后，升温至75-85℃进行反应；反应结束后，对反应液进行稀释、洗涤，将有机相干燥后进行纯化，得到
优选的，原料2-2的制备方程式如下：
进一步优选的，原料2-2的制备步骤如下：先向反应容器中加入原料2-1、二氯甲烷溶液，再加入三氟乙酸，进行反应；反应结束后，将反应液旋干后，进行稀释、洗涤处理，将有机相干燥、纯化后，得到原料2-2；
优选的，原料2-1的制备方程式如下：
进一步优选的，原料2-1的制备步骤如下：在冰水浴条件下，在反应容器中加入氢化钠和N,N-二甲基甲酰胺，溶解后，冷却至0-5℃；然后，向该反应体系中分批加入原料1-7的四氢呋喃溶液，反应第一设定时间，然后将原料1-5滴入该反应体系中，滴加完毕，反应第二时间后，将反应温度升高至室温，继续反应第三设定时间；将反应液进行淬灭、萃取，分液、干燥、纯化，得到原料2-1。
9.根据权利要求8所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，
当所述阳离子脂质化合物为化合物2时：
所述BrR1为原料2-4；其中，原料2-4的制备方程式如下：
优选的，所述原料2-4的制备步骤如下：在室温条件下，使6-溴-1-己醇、油酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应结束后进行萃取分液，然后将有机相洗涤、干燥、纯化后，得到原料2-4；
当所述阳离子脂质化合物为化合物3时：
所述BrR为原料3-2；其中，所述原料3-2的制备方程式如下：
优选的，所述原料3-2的制备步骤如下：在室温条件下，使6-溴己酸、亚油醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应结束后，进行萃取分液，将有机相洗涤、干燥、纯化后，得到原料3-2；
当所述阳离子脂质化合物为化合物6时：
所述BrR为原料6-2；其中，原料6-2的制备方程式如下：
优选的，所述原料6-2的制备步骤如下：在室温条件下，使6-溴己酸、原料6-1、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应结束后进行萃取分液，然后对有机相进行洗涤、干燥、纯化处理，得到原料6-2；
当所述阳离子脂质化合物为化合物7时：
所述Br-R1为原料7-2；其中，原料7-2的制备方程式如下：
优选的，原料7-2的制备步骤如下：在室温条件下，使6-溴己酸、原料7-1、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷(200mL)进行反应；反应结束后进行萃取分液，将有机相进行洗涤、干燥、纯化，得到原料7-2。
10.权利要求3所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物8的制备方程式如下：
其中，所述化合物8的制备步骤如下：在室温条件下，使原料8-4、四丁基氟化铵和四氢呋喃溶液混合后，进行反应；反应结束后，对反应液进行稀释、洗涤处理；将有机相干燥后进行纯化，得到化合物8；
优选的，原料8-4的制备方程式如下：
进一步优选的，原料8-4的制备步骤如下：在室温条件下，使原料8-3、辛硫醇和安息香双甲醚混合，得到反应体系；对反应体系进行紫外光照射以进行反应；反应结束后，进行纯化，得到原料8-4；
优选的，所述原料8-3的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料8-3的制备步骤如下：在室温条件下，将原料1-9、原料8-2、碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺混合后，升温至75-85℃进行反应；反应结束后，对反应液进行稀释、洗涤处理，然后，将有机相进行纯化后，得到原料8-3；
优选的，原料8-2的制备方程式如下：
进一步优选的，所述原料8-2的制备步骤如下：在室温条件下，使8-溴辛酸、丙炔醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺和二氯甲烷进行反应；反应结束后进行萃取分液；然后，将有机相洗涤、干燥、纯化后得到原料8-2。
11.权利要求1-3任一项所述的阳离子脂质化合物在制备mRNA递送系统中的应用；优选的，mRNA递送系统为LNP组合物。
12.权利要求1-3任一项所述的阳离子脂质化合物在制备核酸类药物中的应用。
13.一种mRNA递送系统，其特征在于，所述mRNA递送系统包括权利要求1-3任一项所述的阳离子脂质化合物；优选的，mRNA递送系统为LNP组合物。
14.权利要求13所述的mRNA递送系统在制备核酸类药物中的应用。
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