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CN118086104A - 一种球形芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种球形芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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CN118086104A CN202410104404.9A CN202410104404A CN118086104A CN 118086104 A CN118086104 A CN 118086104A CN 202410104404 A CN202410104404 A CN 202410104404A CN 118086104 A CN118086104 A CN 118086104A
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bacillus sphaericus
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bacillus
lunata
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张欣
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Abstract

本发明公开了一种球形芽孢杆菌及其应用，属于农业微生物技术领域。本发明从香蕉根际土壤中筛选得到一株新的球形芽孢杆菌(Bacillus stercoris)，该菌的保藏编号为GDMCC No：64032。该球形芽孢杆菌对多种植物病原真菌具有广谱的抑菌性，能够有效抑制8种植物病原真菌，抑菌率为73.07～85.96％。该球形芽孢杆菌的无菌滤液能够抑制香蕉暗双孢菌的生长，30％的无菌滤液对香蕉暗双孢菌的抑制率为79.17％。同时采用喷施球形芽孢杆菌生防菌液能显著降低病原菌对香蕉的危害。本发明为植物病原真菌的防治提供新的微生物菌株和防治方法策略，具有很好的生物防治效果。

Description

一种球形芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及农微生物技术领域，特别是涉及一种球形芽孢杆菌及其应用。
背景技术
香蕉是芭蕉科、芭蕉属多年生单子叶草本植物，是世界鲜果中产量、贸易量和贸易额最大的水果。我国是世界第二大香蕉生产国，2020年我国香蕉种植面积为489万亩，产量为1151.30万吨，总产值达到361.60亿元。然而香蕉产业一直受病害问题困扰，产量和经济效益也一直受到病害的制约。香蕉灰纹病(Cordana leaf spot of banana)是香蕉生长过程中重要叶部病害之一，受该病为害的香蕉叶片光合作用面积减少，光合利用率降低，影响有机物积累，并对后期果实产生影响。发病严重时，香蕉植株的叶片，从下到上干枯，只留下顶部抽出的嫩叶生长，蕉园病叶率可达70％以上，极大的影响香蕉的生长和产量，可导致香蕉减产30％～50％。该病害现已广泛分布于世界各香蕉产区，在我国各香蕉产区普遍发生为害，且发生面积及危害程度呈逐年上升趋势。
由于生产上缺少抗病品种，对香蕉灰纹病的防治措施主要是化学防治为主，存在农药使用次数多、使用量大的问题，不仅使香蕉灰纹病菌产生抗药性，而且增加生态环境和食品安全的风险。植物保护的新趋势是减少对传统杀菌剂的依赖，生物防治被认为是一个有前途的替代方法。但国内外对于香蕉灰纹病的生物防治研究的报道较少，缺少防治香蕉灰纹病的生防菌株。因此开展香蕉灰纹病的生防菌株的筛选与鉴定，对香蕉产业的可持续健康发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种球形芽孢杆菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该菌能够抑制多种病原真菌以及由病原真菌引起的香蕉病害，为香蕉病害防治提供新的菌资源，并奠定科学依据。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种球形芽孢杆菌(Bacillus stercoris)，命名为球形芽孢杆菌92P，该菌的保藏编号为GDMCC No：64032，保藏时间为2023年11月17日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所。
本发明还提供所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物在抑制病原真菌中的应用。
本发明还提供所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物在制备抑制病原真菌的菌剂中的应用。
优选的是，所述病原真菌包括香蕉暗双孢菌(Cordana musae)、新月弯孢菌(Curvularia lunata)、芭蕉炭疽菌(Colletotrichum muase)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis menezesiana)、簇生长蠕孢菌(Helminthosporium torulosum)、首都叶点霉菌(Phyllosticta capitalensis)、喙突脐蠕孢菌(Exserohilum rostratum)或球黑孢霉菌(Nigrospora sphaerica)。
本发明还提供一种菌剂，包括所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物。
本发明还提供所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物在防治植物病原真菌引起的香蕉病害中的应用。
本发明还提供所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物在制备防治植物病原真菌引起的香蕉病害的菌剂中的应用。
优选的是，所述植物病原真菌引起的香蕉病害包括香蕉灰纹病、香蕉大灰斑病、香蕉炭疽病、香蕉拟盘多毛孢叶斑病、香蕉煤纹病、香蕉黑星病、香蕉喙突脐蠕孢叶斑病或香蕉黑孢霉叶斑病。
本发明还提供一种抑制植物病原真菌的方法，利用所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物处理植物病原真菌；所述植物病原真菌包括香蕉暗双孢菌(Cordanamusae)、新月弯孢菌(Curvularia lunata)、芭蕉炭疽菌(Colletotrichum muase)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis menezesiana)、簇生长蠕孢菌(Helminthosporiumtorulosum)、首都叶点霉菌(Phyllosticta capitalensis)、喙突脐蠕孢菌(Exserohilumrostratum)或球黑孢霉菌(Nigrospora sphaerica)。
本发明还提供一种防治香蕉病害的方法，利用所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物处理香蕉病害；所述香蕉病害包括香蕉灰纹病、香蕉大灰斑病、香蕉炭疽病、香蕉拟盘多毛孢叶斑病、香蕉煤纹病、香蕉黑星病、香蕉喙突脐蠕孢叶斑病或香蕉黑孢霉叶斑病。
本发明公开了以下技术效果：
本发明从香蕉根际土壤中筛选得到一株新的球形芽孢杆菌(Bacillusstercoris)92p，通过抑菌实验发现，该92p菌株能够分泌蛋白酶和淀粉酶，抑制菌丝生长；该92p菌株能够有效抑制8种植物病原真菌，抑菌率为73.07～85.96％，具有广谱的抑菌性。该92p菌株的无菌滤液能够抑制香蕉暗双孢菌的生长，30％的无菌滤液对香蕉暗双孢菌的抑制率为79.17％。同时采用喷施球形芽孢杆菌92p生防菌液能显著降低病原菌对香蕉的危害，防治效果可达到67.22％。本发明为植物病原真菌的防治提供新的微生物菌株和防治方法策略，具有很好的生物防治效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为球形芽孢杆菌92p和香蕉暗双孢菌的平板对峙图；A：无菌水处理的对照；B：球形芽孢杆菌92p；
图2为球形芽孢杆菌92p在LB平板上的形态图；
图3为球形芽孢杆菌92p分泌蛋白酶(A)、淀粉酶(B)和分解无机磷(C)的测定结果；
图4为根据16SrRNA测定结果构建的系统进化树；
图5为根据gyrB基因测定结果构建的系统发育树；
图6为球形芽孢杆菌92p对病原真菌抑菌谱1的测定结果；1：芭蕉炭疽菌和92p平板对峙；2：新月弯孢菌和92p平板对峙；3：弥泽那拟盘多毛孢菌和92p平板对峙；4：芭蕉炭疽菌对照；5：新月弯孢菌对照；6：弥泽那拟盘多毛孢菌对照；
图7为球形芽孢杆菌92p对病原真菌抑菌谱2的测定结果；1：喙突脐蠕孢菌和92p平板对峙；2：首都叶点霉菌和92p平板对峙；3.簇生长蠕孢菌和92p平板对峙；4：球黑孢霉菌和92p平板对峙；5：喙突脐蠕孢菌；6：首都叶点霉菌；7：簇生长蠕孢菌；8：球黑孢霉菌；
图8为不同浓度的球形芽孢杆菌92p无菌滤液对香蕉暗双孢菌的抑制作用；1-3分别表示球形芽孢杆菌92p无菌滤液的浓度10％、20％和30％的抑菌效果，4为对照。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1球形芽孢杆菌(Bacillus stercoris)92p的筛选与鉴定
1、培养基
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g和水1L，调节pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
马铃薯葡萄糖培养基(PDB)：马铃薯200g、葡萄糖20g和水1L，调节pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
LB液体培养基：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g和水1L，调节pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。
LB固体培养基：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g，琼脂18g，水1L，调节pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
2、筛选
(1)采集海南省香蕉园香蕉根际土壤样品，称取样品5g，加入装有玻璃珠(5mm)的45mL无菌水的三角瓶中，37℃200rpm振荡1h，然后用无菌水进行梯度稀释，取100μL的适合梯度的稀释液涂布于LB平板上。每个处理3次重复，平板倒置于恒温培养箱内，37℃培养48～72h。根据菌落的形态、颜色等特征，挑取不同单菌落进行纯化。
(2)采用抑菌圈法进行初筛：将香蕉暗双孢菌接种在PDB培养基中，28℃培养3d，取适量菌丝悬液涂布在PDA平板上，将分离纯化的细菌点接在PDA平板，每株菌重复3次，以点接无菌水作为对照，将平板置于28℃培养3d，观察细菌周围有无抑菌圈，并记录抑菌圈直径。选取有抑菌圈的菌株进行下一步复筛。
(3)采用平板对峙法进行复筛：将香蕉暗双孢菌菌饼(8mm)接种在PDA平板(直径90mm)中心，在平板中心约25mm处的4个对称点点接初筛有抑菌圈的菌株，28℃培养10d，以点接无菌水作为对照。每个处理均设置3次重复。测量香蕉暗双孢菌的直径，计算抑菌率。
抑菌率计算公式为：抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-菌饼直径)-(对峙培养菌落直径-菌饼直径)]/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％。
其中，编号为92p的菌株对香蕉暗双孢菌的抑菌率达到76.71％，抑菌效果如图1所示。
3、鉴定
3.1传统的生物学鉴定
菌落形态特征如图2所示，92p菌株在LB培养基上的菌落呈圆形，菌落为乳白色，边缘完整，菌落表面粗糙，不透明，菌落易挑起。
3.2生理生化特征测定
3.2.1配制培养基
(1)配制溶磷培养基：葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.2g、Ca3(PO4)2 5g、KCl0.2g、MgSO4.7H2O 0.1g、FeSO4.7H2O 2mg、MnSO4.4H2O 2mg和水1L，116℃灭菌30min。
(2)配制蛋白酶鉴定培养基：称取脱脂奶粉4g，琼脂粉2g，水100mL，116℃灭菌15min。
(3)配制淀粉酶鉴定培养基：可溶性淀粉2g、FeSO4·H2O 0.005g、KNO3 3.1g、NaCl0.5g、K3PO4·3H2O 0.05g、MgSO4·H2O 0.05g、琼脂2g和蒸馏水100mL，调节PH为7.0，121℃灭菌20min。
3.2.2接种
将溶磷培养基、蛋白酶鉴定培养基和淀粉酶鉴定培养基分别倒平板，将92p菌株接种后放于37℃培养箱中培养3-5d。观察有无透明圈。其中，淀粉酶鉴定培养基取出后加入稀碘液，15min后观察有无透明圈。
测定结果如图3所示，92p菌株能够分解无机磷，分泌蛋白酶和淀粉酶。
3.3分子生物学鉴定
将92p菌株的单菌落接种在LB培养基中，于37℃、180r/min培养24h，12000rpm离心5min收集菌体，采用细菌提取试剂盒对细菌DNA进行提取。16S rDNA选择通用引27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增。PCR扩增反应体系(25μL)为：Premix taq 12.5μL、无菌ddH2O 9.5μL、27F/1492R各1.0μL和基因组DNA 1μL。PCR扩增条件为：94℃5min；94℃1min；58℃30s；72℃90s，35个循环；72℃10min。
gyrB基因扩增，选择引物gyrB-F(5’-ATTCCRGTCGGTATTCA-3’)，gyrB-R(5’-GCAGAGTCACCCTCAWCGAT-3’)，PCR反应体系为：PCR Master Mix 12.5μL，无菌ddH2O 9.5μL，gyrB-F/R各1.0μL，基因组DNA 1μL。PCR扩增条件为：94℃5min；94℃1min；55℃30s；72℃90s，35个循环；72℃10min。
PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送至海南楠山生物技术有限公司进行测序。
3.4系统发育分析
将92p菌株的16S rDNA基因序列和EzBioCloud数据库中的序列进行比对分析，选取芽孢杆菌属不同种的芽孢杆菌模式菌株的序列，采用MEGA7软件构建16S rDNA系统发育树，结果见图4；将92p菌株的gyrB基因序列和NCBI的GenBank数据库中序列进行BLAST比对分析，选用同源性较高的模式菌株序列，采用MEGA7软件构建gyrB基因系统发育树，结果见图5。从图4和图5中可以看出，菌株92p与球形芽孢杆菌Bacillus stercoris聚为一支，且亲缘关系最为接近，置信度较高，结合形态学和分子生物学鉴定结果，将菌株92p鉴定为球形芽孢杆菌(Bacillus stercoris)。
上述球形芽孢杆菌(Bacillus stercoris)92p，已于2023年11月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No:64032。
实施例2球形芽孢杆菌92p的广谱抑菌试验
本试验涉及的病原菌：香蕉暗双孢菌(Cordana musae)、新月弯孢菌(Curvularialunata)、芭蕉炭疽菌(Colletotrichum muase)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsismenezesiana)、簇生长蠕孢菌(Helminthosporium torulosum)、首都叶点霉菌(Phyllosticta capitalensis)、喙突脐蠕孢菌(Exserohilum rostratum)、球黑孢霉菌(Nigrospora sphaerica)由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。上述病原菌均是常见的菌种，公众均可通过商业途径得到。
以香蕉暗双孢菌(Cordana musae)、新月弯孢菌(Curvularia lunata)、芭蕉炭疽菌(Colletotrichum muase)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis menezesiana)、簇生长蠕孢菌(Helminthosporium torulosum)、首都叶点霉菌(Phyllosticta capitalensis)、喙突脐蠕孢菌(Exserohilum rostratum)、球黑孢霉菌(Nigrospora sphaerica)为靶标菌，采用平板对峙法对菌株92p进行抑菌谱试验。具体操作步骤如下：
利用平板对峙法用打孔器取直径为8mm的供试病原菌菌饼接种于PDA平板(直径90mm)中心，将球形芽孢杆菌92p接种于距平板中心约25mm处的4个对称角点，以接种供试病原菌为对照，每个处理设置3次重复，置于28℃恒温培养箱中培养，待对照病原菌菌丝长接近满平板，测量7种病原真菌菌落的直径，计算抑制率。
抑制率计算公式为：抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-菌饼直径)-(对峙培养菌落直径-菌饼直径)]/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％。
结果显示，球形芽孢杆菌92p对新月弯孢菌(Curvularia lunata)、芭蕉炭疽菌(Colletotrichum muase)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis menezesiana)、簇生长蠕孢菌(Helminthosporium torulosum)、首都叶点霉菌(Phyllosticta capitalensis)、喙突脐蠕孢菌(Exserohilum rostratum)、球黑孢霉菌(Nigrospora sphaerica)均具有明显的抑制作用，抑制率在73.07～85.96％，由此表明球形芽孢杆菌92p的抑菌谱较广(见表1)。
表1球形芽孢杆菌92p对8种病原真菌抑菌谱的测定
实施例3球形芽孢杆菌92p的无菌滤液对香蕉暗双孢菌的抑制试验
将球形芽孢杆菌92p接入PDB培养基中，37℃180r/min培养24h，再以接种量10％接种于PDB培养基中，37℃、180r/min培养48h，获得球形芽孢杆菌92p的菌悬液。将菌悬液于12000rpm离心5min，取上清并用0.22μm的水系过滤器过滤除菌，得到无菌滤液。将配制好的PDA培养基用微波炉加热融化，冷却至45℃左右，加入球形芽孢杆菌92p的无菌滤液，配制为无菌滤液含量分别为10％、20％和30％的PDA平板，然后倒平板，等凝固后在平板中心接入香蕉暗双孢菌菌饼(直径8mm)，28℃倒置培养14d。用PDA平板作为对照。测量PDA平板上香蕉暗双孢菌菌落直径，计算抑菌率。
抑菌率计算公式为：抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-菌饼直径)-(对峙培养菌落直径-菌饼直径)]/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％。
结果如表2和图8所示，30％的无菌滤液对香蕉暗双孢菌的抑制率为79.17％。
表2不同浓度的92p无菌滤液对香蕉暗双孢菌的抑制作用
实施例4球形芽孢杆菌92p对香蕉灰纹病的防效试验
将香蕉暗双孢菌接种至PDA平板上，28℃培养10d，用打孔器制备8mm的菌饼。将球形芽孢杆菌92p接种至PDB培养基中，37℃180r/min培养24h，再以接种量10％接种于PDB培养基中，37℃、180r/min培养48h，获得球形芽孢杆菌92p的菌悬液，使用PDB培养基将球形芽孢杆菌92p的菌悬液浓度调至107cfu/mL。
选取长势一致的香蕉苗(品种：巴西)进行盆栽试验，每个处理设置4盆。球形芽孢杆菌92p的菌悬液浓度为107-109cfu/mL，80％多菌灵可湿性粉剂1000倍液，共设置五组处理：A：球形芽孢杆菌92p的菌悬液，浓度为107cfu/mL；B：球形芽孢杆菌92p的菌悬液，浓度为108cfu/mL；C球形芽孢杆菌92p的菌悬液，浓度为109cfu/mL；D：80％多菌灵可湿性粉剂1000倍液；E：CK(PDB对照)。
采用针刺法，将香蕉叶片沿叶脉每侧各针刺3个伤口，分别喷施球形芽孢杆菌菌悬液和药剂，2h后将香蕉暗双孢菌菌饼贴在针刺伤口处，套保鲜袋保湿2d，去掉菌饼，14d后测量病斑直径，计算防治效果。
防治效果＝[(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积]×100％。
结果如表3所示，在接种香蕉暗双孢菌14天后，各处理组防治效果为49.07％～75.36％，其中，80％多菌灵1000倍液处理组的防治效果最好(75.36％)，球形芽孢杆菌92p的109cfu/mL菌悬液处理组的防治效果较好为67.22.％。
表3球形芽孢杆菌92p对香蕉灰纹病防治效果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种球形芽孢杆菌(Bacillus stercoris)，其特征在于，该菌的保藏编号为GDMCCNo：64032。
2.如权利要求1所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物在抑制病原真菌中的应用。
3.如权利要求1所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物在制备抑制病原真菌的菌剂中的应用。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述病原真菌包括香蕉暗双孢菌(Cordana musae)、新月弯孢菌(Curvularia lunata)、芭蕉炭疽菌(Colletotrichummuase)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis menezesiana)、簇生长蠕孢菌(Helminthosporium torulosum)、首都叶点霉菌(Phyllosticta capitalensis)、喙突脐蠕孢菌(Exserohilum rostratum)或球黑孢霉菌(Nigrospora sphaerica)。
5.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物。
6.如权利要求1所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物在防治植物病原真菌引起的香蕉病害中的应用。
7.如权利要求1所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物在制备防治植物病原真菌引起的香蕉病害的菌剂中的应用。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述植物病原真菌引起的香蕉病害包括香蕉灰纹病、香蕉大灰斑病、香蕉炭疽病、香蕉拟盘多毛孢叶斑病、香蕉煤纹病、香蕉黑星病、香蕉喙突脐蠕孢叶斑病或香蕉黑孢霉叶斑病。
9.一种抑制植物病原真菌的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物处理植物病原真菌；所述植物病原真菌包括香蕉暗双孢菌(Cordanamusae)、新月弯孢菌(Curvularia lunata)、芭蕉炭疽菌(Colletotrichum muase)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis menezesiana)、簇生长蠕孢菌(Helminthosporiumtorulosum)、首都叶点霉菌(Phyllosticta capitalensis)、喙突脐蠕孢菌(Exserohilumrostratum)或球黑孢霉菌(Nigrospora sphaerica)。
10.一种防治香蕉病害的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的球形芽孢杆菌或其发酵液或其发酵产物处理香蕉病害；所述香蕉病害包括香蕉灰纹病、香蕉大灰斑病、香蕉炭疽病、香蕉拟盘多毛孢叶斑病、香蕉煤纹病、香蕉黑星病、香蕉喙突脐蠕孢叶斑病或香蕉黑孢霉叶斑病。
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