CN117603829B

CN117603829B - 一株解蛋白芽孢杆菌bp29及其应用

Info

Publication number: CN117603829B
Application number: CN202310492189.XA
Authority: CN
Inventors: 黎妍妍; 杨勇; 常晓涵; 冯吉; 文丁锌; 孙敬国; 覃光炯
Original assignee: Tobacco Research Institute of Hubei Province
Current assignee: Tobacco Research Institute of Hubei Province
Priority date: 2023-05-04
Filing date: 2023-05-04
Publication date: 2024-08-20
Anticipated expiration: 2043-05-04
Also published as: CN117603829A

Abstract

本发明提供了一株解蛋白芽孢杆菌BP29及其应用，其命名为解蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)BP29，其保藏编号为CCTCC NO：M 2023166。本发明还提供了所述解蛋白芽孢杆菌BP29在防治烟草枯萎病、促进烟草植株生长、种子萌发中的应用；该解蛋白芽孢杆菌BP29烟草枯萎病具有良好防病效果、并对烟株具有显著促生作用。

Description

一株解蛋白芽孢杆菌BP29及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学术领域，特别涉及一株解蛋白芽孢杆菌BP29及其应用。

背景技术

烟草是一种重要的经济作物，是生产卷烟的核心成分，也是提取木质素、柠檬酸、尼古丁化学物质的等重要原料。烟草枯萎病是由镰刀菌在土壤中传播引起，在烟草苗期至成熟期均可感染。通常病菌从烟株的根侵入，有时仅在一侧发病，病株顶部弯向一侧，剖开病茎、病根，可见木质部褐变，病部变色处或导管附近可见菌丝或分生孢子；有时病菌侵染一侧所有的根，引起烟株一侧维管束或整个维管束染病，形成系统性侵染。受害烟株地上部分，全株叶片褪色变黄、变小、萎蔫，主脉弯曲，通常病株顶部向一侧弯曲，故称“歪茎病”或“弯头病”，最后茎秆干枯，烟株枯死；受害烟株地下部根系受害明显，小根死亡，或小根和大根都死亡干腐。剥去病株根或茎的皮层或横切根或茎，可见木质部有褐色或黑色点块。

目前，针对烟草枯萎病的防治措施主要包括化学药剂防治、抗性品种选育、物理方式消杀等。化学药剂防治虽然效果显著，但会造成环境污染，对环境不够友好；抗性品种选育周期长，而且镰刀菌的变异可能导致抗性减弱或消失，同时抗性品种也可能存在产量低的问题；物理消杀耗时耗力，操作繁琐。

因此，采用生物防治，利用微生物间的拮抗、竞争、寄生等关系，修复和改良作物的微生态环境、抑制病原菌的生长并激活作物的防御反应，成为了目前病害防治的首选。有必要开发一种新的用于防治烟草枯萎病的菌株。

发明内容

本发明目的是提供一株解蛋白芽孢杆菌BP29及其应用，该株解蛋白芽孢杆菌BC3对烟草枯萎病具有良好防病效果、并对烟株具有显著促生作用。

在本发明的第一方面，提供了一株解蛋白芽孢杆菌BP29，所述解蛋白芽孢杆菌BP29的保藏编号为：CCTCC NO：M 2023166。

在本发明的第二方面，提供了所述的解蛋白芽孢杆菌BP29在防治烟草枯萎病中的应用。

在本发明的第三方面，提供了所述的解蛋白芽孢杆菌BP29在促进烟草植株生长中的应用。

在本发明的第四方面，提供了所述的解蛋白芽孢杆菌BP29在促进烟草种子萌发中的应用。

在本发明的第五方面，提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括：

将所述的解蛋白芽孢杆菌BP29进行发酵获得的发酵液；

或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。

在本发明的第六方面，提供了采用所述的解蛋白芽孢杆菌BP29降解邻甲酚或/和2，4-二叔丁基酚的方法，所述方法包括：

将所述的解蛋白芽孢杆菌BP29或者所述的发酵菌剂活化制备成发酵液；

将所述发酵液浸泡烟草种子，或者将所述发酵液施用于烟草植株的根部。

进一步地，所述发酵液中活菌浓度调至(1～3)×10⁸cfu/mL。

进一步地，所述发酵液施用于烟草植株的根部时，将烟株移植50天后浇灌所述发酵液，连续浇灌5次，每隔4天浇灌一次。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的一株解蛋白芽孢杆菌BP29及其应用，以烟草枯萎病为靶标病害，从烟草植物茎内筛选出具有广谱性的镰刀菌拮抗菌株，通过形态观察、生理生化检测及16SrRNA基因序列分析初步鉴定其为解蛋白芽孢杆菌(Bacillusproteolyticus)，采用相关实验方法来检测该菌株对茄病镰刀菌、九州镰刀菌、尖孢镰刀菌的抑菌效果，研究对烟草枯萎病的防治效果及促生能力，以期为生防菌剂的开发研制提供菌种资源，结果表明该解蛋白芽孢杆菌BP29对烟草枯萎病具有良好防病效果、并对烟株具有显著促生作用。为后续的生产应用提供理论依据。

本发明的解蛋白芽孢杆菌BP29的保藏日期为2023年2月21日，保藏编号为CCTCCNO：M2023166。其分类命名为解蛋白芽孢杆菌(Bacillusproteolyticus)BP29，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为BP29对3种病原菌的拮抗效果；其中图1a为茄病镰刀菌(F.solani)；图1b为九州镰刀菌(F.kyushuense)；图1c为尖孢镰刀菌(F.oxysporum)；

图2为BP29和BS168无菌发酵滤液对尖孢镰刀菌抑菌效果对比；

图3为BP29挥发性化合物对尖孢镰刀菌的拮抗效果；从左到右依次为3d、5d、7d；

图4为BP29的田间防治效果；其中图4A为对照组；图4B为处理组；图4C为对照组；图4D为处理组；

图5为BP29系统发育树。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

本申请发明人从采集于湖北省恩施土家族苗族自治州烟草科学研究院试验田的烟草植物茎内通过分离纯化、筛选，得到一株具有广谱性的镰刀菌拮抗菌株，发现该菌株对烟草疫霉具有拮抗效果，该细菌经菌落形态、生化及16S rRNA测序分析，该菌株与解蛋白芽孢杆菌(Bacillusproteolyticus)多个的菌株同源性均在96％以上，结合生理生化特性，初步确定该菌株属(Bacillusproteolyticus)，并命名为解蛋白芽孢杆菌(Bacillusproteolyticus)BP29。

本发明的解蛋白芽孢杆菌BP29对烟草种子萌发和烟株生长具有良好的促进作用。对烟草枯萎病具有良好的防病效果，为后续生物菌剂的开发提供了理论基础。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一株解蛋白芽孢杆菌BP29及其应用进行详细说明。

实验菌株：茄病镰刀菌(Fusarium solani)购买于中国药学微生物菌种保藏管理中心(CPCC 460008)、九州镰刀菌(Fusarium kyushuense)购买于中国典型培养物保藏中心(CCTCC AF 2020004)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)购买于中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC 31915)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strains 168)购买于上海保藏生物技术中心模式菌株(ATCC 23857)。

供试培养基：NA培养基：牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15g，蒸馏水补足1000mL，pH7.2，灭菌。LB固体培养基:氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，1000mL水，琼脂15g，灭菌。马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4。

实施例1、菌株BP29的定向富集分离与鉴定

1、烟草内源菌的分离纯化

将烟草清洗干净后分别剪取1g的根、茎、叶样品，依次用75％乙醇浸泡1min，无菌水冲洗3次，5％NaClO浸泡6min，无菌水冲洗3次后，在无菌研钵中加入1mL无菌水研磨。采用稀释平板涂布法，制备10^-3、10^-4、10^-5、10^-6CFU/mL梯度稀释液，各取0.1mL涂布在固体LB平板上，28℃培养48h。挑取培养特征明显不同的单菌落，于LB平板进行划线纯化，将纯化好的菌株4℃保存备用。

2、对枯萎病病原菌的抑制作用测定

从烟株根茎部筛选出多种内生菌并分离纯化，采用PDA平板对峙生长法进行筛选，最终筛出一株对茄病镰刀菌、九州镰刀菌、尖孢镰刀杆菌均有明显拮抗作用的菌株(图1)，将其命名为BP29。后对其抑菌能力进行测定。具体测定时分别以茄病镰刀菌、九州镰刀菌、尖孢镰刀菌为指示菌，采用平板对峙法测定其对真菌病菌的抑制活性。用直径为5mm的无菌打孔器在病菌菌落边缘打取菌饼，接种于PDA平板中央，在距离中心3cm处用打孔器打三个直径为5mm的空洞，每个洞中加入20uL菌悬液，设清水对照，每处理设3次重复，将平板置于37℃恒温箱内培养。待对照菌落长至培养皿2/3时，观察是否有明显的拮抗作用，测量抑菌圈大小并计算抑菌率。抑菌率＝(处理组抑菌圈直径－对照组抑菌圈直径)/处理组抑菌圈直径×100％。菌株BP29对三种不同类型的镰刀菌的抑菌作用结果如表1所示。

表1-BP29对3种病原菌抑菌效果

由表1可知：菌株BP29对茄病镰刀菌和九州镰刀菌的抑菌率可达到75％以上，对尖孢镰刀菌的抑制效果虽略低于其他两种病原菌，抑菌圈约为1.95cm，但其抑菌率仍达到了74.04％。

3、菌株BP29的鉴定

(1)形态特征鉴定

将筛选到有明显拮抗作用的菌株从冰箱取出，NA平板划线，28℃培养48h后挑取单菌落，在新的NA平板上划线28℃培养60h，观察并记录菌落的颜色、形态等特征，并通过光学显微镜和革兰氏染色观察细胞形态。

通过革兰氏染色鉴定该菌为革兰氏阳性菌，在LB培养基上，28℃黑暗培养48h的菌落呈白色，不规则圆形，扁平，单个细胞大小约为1～3mm，边缘蔓延一层菌膜，显微观察菌体细胞杆状，符合解蛋白芽胞杆菌特征。

(2)16S rDNA序列同源性分析及进化树构建

用菌悬液沸水浴法提取菌株基因DNA，采用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增。PCR反应体系DNA模板1μL，上、下游引物各1μL，Taq聚合酶12.5μL，ddH2O补足至25μL.PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min 30s、24个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应产物经1％琼脂糖凝聚电泳检测，将16S rRNA的PCR扩增产物回收纯化后由武汉擎科创新生物科技有限公司测序。测序结果提交NCBI数据库进行BLAST同源性分析，再利用MEGA7.0软件进行序列比对以及系统进化树的构建。数据处理采用Excel和DPS7.05软件分析。

将PCR获得的待测菌株的16S rDNA序列在数据库中进行BLAST比对分析，结果显示，菌株BP29(OP905595)与解蛋白芽胞杆菌(Bacillusproteolyticus)的序列相似性达到100％，系统发育树构建结果表明BP29与解蛋白芽胞杆菌(MT573794.1)等属于同一分支(图5)，结合形态学和生理生化鉴定，鉴定该菌为解蛋白芽孢杆菌，并命名为解蛋白芽孢杆菌BP29(Bacillusproteolyticus)，并于2023年2月21日于中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2023166。

实施例2菌株无菌发酵滤液的抑菌活性测定

1、菌株发酵液的制备

将菌株接于盛有100mL LB液体培养基中，28℃，230r/min振荡培养12h制成种子液，再按2％的接种量接种于LB培养液中，28℃，230r/min条件下扩大培养24h得到菌株发酵液。盆栽试验使用前，用LB培养液将发酵液中活菌浓度调至1×10⁸cfu/mL。

2、菌株无菌发酵滤液的抑菌活性测定

生防菌株无菌发酵滤液的制备：将培养得到的菌液发酵液经12000r/min离心10min，上清液用细菌过滤器(0.22μm)除菌过滤两次后得到无菌发酵滤液。

无菌发酵滤液对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响：采用平板打孔法测试拮抗菌无菌发酵滤液的抑菌作用。用打孔器在距离平板(直径为9mm的培养皿)中央2.5cm处均匀打3个孔，每孔注入20μL的发酵滤液，以无菌的LB液体培养基为对照，在培养基中心接直径5mm的病原菌菌块，每个处理重复3次。28℃黑暗培养3d后，测量对照组和处理组靶标菌菌落半径，计算相对抑菌率。同时购买芽孢杆菌模式菌株(Bacillus subtilis strains 168)进行抑菌测定对比试验(图2)。菌株无菌发酵滤液对烟草枯萎病病原菌菌丝生长的影响测定结果如表2所示。

表2BP29无菌发酵滤液的抑菌活性

由图2和表2的结果可知：

本发明实施例的BP29无菌发酵滤液对尖孢镰刀菌菌丝生长具有抑制作用，抑菌圈大小为1.38cm，相对抑菌率为63.46％，抑菌效果略低于活体菌，下降了10.58％。且本发明实施例的BP29无菌发酵滤液抑菌效果显著高于常规芽孢杆菌(Bacillus subtilisstrains 168)无菌滤液，抑菌圈直径和平均抑菌率分别增长了0.72cm、39.95％，抑菌能力较常规模式菌株有了较大提升。

3、菌株挥发性化合物的抑菌活性测定

试验采用平皿对扣培养法。取直径5mm尖孢镰刀菌菌饼置于PDA平板中，将发酵液(OD600＝1.5)在LB平板上涂布，以未处理的LB培养基平板对照，待发酵液晾干后将两平板对扣，封口膜密封，置于培养箱中25℃恒温培养，于3d、5d、7d后观察病原菌株的生长情况并测量其直径，每个处理设3个重复。抑制率计算公式如下：抑制率＝(对照组真菌菌落直径－处理组真菌菌落直径)/对照组真菌菌落直径×100％。结果如表3所示：

表3BP29挥发性化合物的抑菌活性测定

由表3可知，菌株BP29挥发性化合物在3d、5d、7d下对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效率分为62.02％、46.85％和45.45％，且随着生长时间的增长，其抑菌程度逐渐降低。菌株BP29处理后，尖孢镰刀菌菌落中心凸起，菌落边缘不整齐、菌丝相互交织，背面中心产生淡紫色，产孢量较低，而对照组菌丝生长旺盛，菌落边缘整齐、表面有白色粉样组织，背面培养基呈亮粉色，且有孢子产生(图3)。综上所述，表明BP29生长过程中产生的挥发化合物可明显地抑制病原菌的生长，达到很好的抑菌效果。

实施例3、对烟草种子萌发及促生作用测定

1、选择颗粒整齐均等的烟草种子，经浓度75％的乙醇表面消毒30s，无菌水洗涤三次，无菌滤纸吸干后，将种子浸于菌株发酵液中4h。取出种子均匀等距置于铺有4层湿润滤纸的培养皿中，每皿50粒，每个浓度处理设3个重复。光照培养箱中黑暗培养14d(湿度80％，温度28±2℃)，每2d统一补充定量无菌水保持滤纸湿润，统计种子发芽粒数并计算发芽率。

2、将菌株分别接种于LB培养基，28℃，230rpm摇菌24h后调节菌悬液浓度为1×10⁸cfu/mL，分别对3-4叶期烟苗进行灌根和叶面喷施处理，每隔5d灌施一次，总共灌施3次，15d后测量比较处理组与对照组苗长、叶长、叶宽、鲜重、根冠比的差异。

发芽率＝(发芽种子粒数÷供试种子粒数)×100％；

根冠比＝地下部鲜重/地上部鲜重x100％；

3、结果如表4所示。

表4BP29对烟株的促生效果

由表4的结果可知，菌株BP29浸种处理10天后，种子发芽率显著上升，可达89.5％，较对照组相比总体提高了5.00％，且处理后农艺性状间具有明显差异，相较于对照组，菌株BP29处理后苗长、叶长、叶宽、鲜重、根冠比均有提高。这说明BP29对烟草种子萌发和烟株生长具有良好的促进作用。

实施例4、菌株对烟草枯萎病的防病效果分析

1、田间实验

烟株移植50天后灌菌株发酵液，连续浇灌5次，每隔4天浇灌一次，15天后在土壤中接种烟草枯萎病病原菌，处理烟株数为50株，以清水作为对照，90天后统计发病情况。

2、对烟草枯萎病的田间防治效果如图4所示，在烟株施用BP29发酵液后可显著提高植株对烟草枯萎病的的抗性诱导能力，对照组植株矮小，叶片发黄、枯萎卷曲，根系变黑腐烂，茎基部出现暗褐色至黑色的病斑，纵剖病茎可看到黑色流脓，茎秆中空；而处理组发病情况明显缓解，病害严重程度显著降低，说明菌株BP29对烟草枯萎病具有良好的防病效果，为后续生物菌剂的开发提供了理论基础。

综上可知，本发明提供的一株解蛋白芽孢杆菌BP29对烟草枯萎病具有良好防病效果、并对烟株具有显著促生作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一株解蛋白芽孢杆菌(Bacillus proteolyticus)BP29，其特征在于，所述解蛋白芽孢杆菌BP29的保藏编号为：CCTCC NO：M2023166。

2.一种权利要求1所述的解蛋白芽孢杆菌BP29在防治烟草枯萎病中的应用。

3.一种权利要求1所述的解蛋白芽孢杆菌BP29在促进烟草植株生长中的应用。

4.一种权利要求1所述的解蛋白芽孢杆菌BP29在促进烟草种子萌发中的应用。

5.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包括：

将如权利要求1所述的解蛋白芽孢杆菌BP29进行发酵获得的发酵液；

或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。

6.一种利用权利要求1所述的解蛋白芽孢杆菌BP29防治烟草枯萎病的方法，其特征在于，所述方法包括：

将权利要求1所述的解蛋白芽孢杆菌BP29或者权利要求5所述的发酵菌剂活化制备成发酵液；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵液中活菌浓度调至(1～3)×10⁸cfu/mL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵液施用于烟草植株的根部时，将烟株移植50天后浇灌所述发酵液，连续浇灌5次，每隔4天浇灌一次。