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CN118019546A - 肿瘤浸润淋巴细胞的cish基因编辑及其在免疫疗法中的用途 - Google Patents

肿瘤浸润淋巴细胞的cish基因编辑及其在免疫疗法中的用途 Download PDF

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CN118019546A
CN118019546A CN202280036081.3A CN202280036081A CN118019546A CN 118019546 A CN118019546 A CN 118019546A CN 202280036081 A CN202280036081 A CN 202280036081A CN 118019546 A CN118019546 A CN 118019546A
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Cellectis SA
Iovance Biotherapeutics Inc
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Abstract

本发明提供用于制备TIL以便制备具有如本文所描述的降低的CISH和任选地PD‑1表达的经基因修饰的TIL治疗性群体的改进和/或缩短的工艺和方法。

Description

肿瘤浸润淋巴细胞的CISH基因编辑及其在免疫疗法中的用途
发明背景
本申请要求2021年3月23日提交的美国临时专利申请第63/165,066号的优先权，所述申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
发明背景
含细胞因子诱导型SH2的蛋白质是人体内由CISH基因编码的蛋白质。参见Uchida等人,(1997)Cytogenet Genome Res.,78:209-212。已在具有测序基因组的大多数哺乳动物中鉴定出CISH异种同源物。CISH控制T细胞受体(TCR)信号传导，并且具有某些SNP的CISH的变异与菌血症、结核病和疟疾的易感性相关。参见Khor等人,(2010)N Engl J Med,362(22):2092-101。由此基因编码的蛋白质含有SH2域和SOCS盒域。所述蛋白质因此属于细胞因子诱导的STAT抑制剂(CIS)(也称为细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)或STAT诱导的STAT抑制剂(SSI))蛋白质家族。已知CIS家族成员是细胞因子信号传导的细胞因子诱导型负调节子。
CISH表达可由适当细胞类型中的白细胞介素-2(IL-2)、IL-3和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导。免疫沉淀分析显示CISH蛋白稳定结合于IL-3Rβ链和EPOR(促红细胞生成素受体)，但仅在配体结合后，表明需要受体的酪氨酸磷酸化。CISH蛋白的过表达抑制细胞生长，从而指示CISH对信号转导具有负面影响。随后，显示CISH表达取决于STAT5活化，并且在CISH启动子区中发现若干STAT5结合位点。参见Matsumoto等人,(1997)Blood 89(9):3148-54。此外，CISH抑制STAT5的EPO依赖性活化并且抑制其他STAT5依赖性受体的活性，从而指示CISH为STAT5的反馈调节子。
广泛多种STAT5依赖性受体诱导CISH表达，包括(但不限于)生长激素(GH)、促乳素(PRL)、血小板生成素(TPO)、瘦素、IL-2、IL-5和IL-9。参见Bhattacharya等人,(2001)Am JRespir Cell Mol Biol,24(3):312-6。已显示CISH结合并抑制来自GH受体(GHR)、PRL受体和IL-2受体β-链的信号传导并且促进GHR的内化和失活。参见Ram等人,(1999)Biol Chem,274(50):35553-61：Endo等人,(2003)J Biochem 133(1):109-13；Aman等人,(1999)J BiolChem 274(42):30266-72；Landsman等人,(2005)J Biol Chem 280(45):37471-80。在许多组织(肝脏、肾脏、心脏、胃、肺、卵巢和骨胳肌)中发现CISH mRNA的表达。参见Palmer等人,(2009)30(12):592-602；Anderson等人,(2009)138(3):537-44；Clasen等人,(2013)JLipidRes 54(7):1988-97。尽管其明显参与大量重要细胞因子和生长因子的信号传导装置，但CISH基因敲除小鼠具有最少的缺陷(免疫反应中的细微变化除外)。参见Palmer等人,(2009)Trends Immunol 30(12):592-602；Trengove等人,(2013)Am J Clin Exp Immunol2(1):1-29。这可归因于其他SOCS家族蛋白质的补偿性活性。在组成性表达由β-肌动蛋白启动子驱动的CISH的转基因小鼠中观测到CISH对假定目标基因的生物学的影响。这些小鼠体重减轻、乳腺发育缺陷以及γ/δT细胞、自然杀手(NK)细胞和NKT细胞数目减少，类似于StatSa和/或StatSb缺陷型小鼠的表型。参见Matsumoto等人,(1999)Mol Cell Biol 19(9):6396-407。
CISH潜在地影响通过许多细胞因子和生长因子进行的信号传导，并且已发现CISH活性和变体与感染性疾病和癌症相关。若干研究已显示在携带某些CISH多态性的受试者中对各种感染源的易感性增加，包括疟疾、钩端螺旋体病、乙型肝炎病毒和结核病。参见Khor等人,(2010)N Engl J Med,362(22):2092-101；Esteves等人,(2014)PLoS One,9(9):e108534；Hu等人,(2014)PLoS One,9(6):e100826；Tong等人,(2012)Immunogenetics,64(4):261-5；Ji等人,(2014)Infect Genet Evol,28:240-4；Sun等人,(2014)PLoS,9(3):e92020。与替代等位基因相比，所有研究共有的一个风险等位基因(rs414171，-292从转录开始)在外周血单核细胞中显示出较低的CISH表达水平。参见Khor和Sun，见上文。与正常组织相比，CISH的表达水平在乳腺癌瘤和癌细胞系中升高，从而使得推测CISH可能通过其活化胞外信号调节的激酶(ERK)的能力促进肿瘤发生。Raccurt等人,(2003)Br.J.Cancer,89(3):524-32。CISH变体也与乳牛的乳汁产生性状相关。参见Arun等人,(2015)Front Genet,6:342。
包括TALEN的工程化核酸酶经设计以特异性结合于目标DNA位点，其具有调节内源基因的基因表达的能力并且可适用于基因组工程化、基因疗法以及例如癌症和炎症的病症的治疗。参见例如美国专利第9,877,988号；第9,394,545号；第9,150,847号；第9,206,404号；第9,045,763号；第9,005,973号；第8,956,828号；第8,936,936号；第8,945,868号；第8,871,905号；第8,586,526号；第8,563,314号；第8,329,986号；第8,399,218号；第6,534,261号；第6,599,692号；第6,503,717号；第6,689,558号；第7,067,317号；第7,262,054号；第7,888,121号；第7,972,854号；第7,914,796号；第7,951,925号；第8,110,379号；第8,409,861号；美国专利公开第2003/0232410号；第2005/0208489号；第2005/0026157号；第2005/0064474号；第2006/0063231号；第2008/0159996号；第2010/0218264号；第2012/0017290号；第2011/0265198号；第2013/0137104号；第2013/0122591号；第2013/0177983号；第2013/0177960号；和第2015/0056705号，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入。此外，基于阿尔古系统(Argonaute system)(例如，来自嗜热菌(T.thermophilus)，称为‘TtAgo’，参见Swarts等人,(2014)Nature 507(7491):258-261)开发靶向核酸酶，所述阿尔古系统也可具有用于基因组编辑和基因疗法中的潜力。
TALE介导的基因疗法可用于对细胞进行基因工程改造以具有一个或多个非活化基因和/或以使所述细胞表达先前在所述细胞中未产生的产物(例如，经由转基因插入和/或经由校正内源序列)。使用这些核酸酶的临床试验已显示这些分子能够治疗各种疾患，包括癌症、HIV和/或血液病症(例如血红蛋白病和/或血友病)。参见例如Yu等人,(2006)FASEBJ.20:479-481；Tebas等人,(2014)New Eng J Med370(10):901。因此，这些方法可用于治疗疾病。然而，仍需要用于CISH TALEN介导的基因灭活/缺失的额外方法和组合物以用于治疗和/或预防癌症、炎症性病症和其中需要CISH调节的其他疾病。
使用过继性转移肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗大型(bulky)、难治性癌症代表着对于不良预后患者的一种强大的治疗方案。Gattinoni等人,Nat.Rev.Immunol.2006,6,383-393。迫切需要提供适合于商业规模制造并且经法规批准用于多个临床中心的人类患者的基于此类工艺的经基因修饰的TIL的制造工艺和疗法。特别是，本领域中仍需要与基于TIL的疗法组合的用于CISH和/或PD-1基因灭活/缺失的额外方法和组合物以用于治疗和/或预防癌症、炎症性病症和其中需要CISH和/或PD-1调节的其他疾病并且本发明满足所述需求。
发明内容
本发明提供一种制备包含降低的CISH和任选地PD-1表达的经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地引入一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶；以及
(b)扩增所述TIL。
在一些实施方案中，所述方法包括将编码一种或多种第一TALE核酸酶的核酸引入TIL中包括电穿孔步骤。
在一些实施方案中，所述编码一种或多种第一TALE核酸酶的核酸为RNA并且所述RNA是通过电穿孔引入TIL中。
在一些实施方案中，所述方法还包括在引入步骤之前，通过在存在OKT-3的情况下将TIL在细胞培养基中培养约1-3天来激活TIL的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括在引入步骤之后并且在扩增步骤之前，使TIL在包含IL-2的细胞培养基中静置约1天的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括在引入步骤之前，冷冻保存TIL，接着将TIL解冻并在包含IL-2的细胞培养基中培养约1-3天的步骤。
在一些实施方案中，所述静置步骤中IL-2的浓度为约3000IU/ml。
在一些实施方案中，所述一种或多种第一TALE核酸酶各自由第一半TALE核酸酶和第二半TALE核酸酶构成。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶是由与第一核酸酶催化域融合的第一TALE核酸结合域构成的第一融合蛋白，并且所述第二半TALE核酸酶是由与第二核酸酶催化域融合的第二TALE核酸结合域构成的第二融合蛋白。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸结合域具有第一氨基酸序列并且所述第二TALE核酸结合域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列不同于所述第二氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一核酸酶催化域具有第一氨基酸序列并且所述第二核酸酶催化域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列与所述第二氨基酸序列相同。
在一些实施方案中，所述第一核酸酶催化域和所述第二核酸酶催化域都具有Fok-I的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶和所述第二半TALE核酸酶能够形成异二聚体DNA切割复合物以实现编码CISH的基因中的目标位点处的DNA切割，并且其中编码CISH的基因中的目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶识别位于编码CISH的基因中的目标位点中的第一位置处的第一半目标，并且所述第二半TALE核酸酶识别位于不与第一位置重叠的编码CISH的基因中的目标位点中的第二位置处的第二半目标。
在一些实施方案中，所述TALE核酸酶包含与选自由SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述TALE核酸酶包含选自由SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:165具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且第二半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:167具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列并且所述第二半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经扩增TIL包含足够的TIL以供向有需要的受试者施用治疗有效剂量的TIL。
在一些实施方案中，所述治疗有效剂量的经扩增TIL包含约1×109至约9×1010个TIL。
本发明还提供一种经扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其包含降低的CISH和任选地PD-1表达，所述经扩增TIL群体可通过根据权利要求1至20中任一项所述的方法获得。
本发明还提供一种识别并实现编码CISH的基因中的目标位点处的DNA切割的转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)，其中所述TALE核酸酶包含与选自由SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述TALE核酸酶包含选自由SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的序列。
在一些实施方案中，所述TALE核酸酶由第一半TALE核酸酶和第二半TALE核酸酶构成，并且其中所述第一半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:165具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且所述第二半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:167具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列并且所述第二半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶是由与第一核酸酶催化域融合的第一TALE核酸结合域构成的第一融合蛋白，并且所述第二半TALE核酸酶是由与第二核酸酶催化域融合的第二TALE核酸结合域构成的第二融合蛋白。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸结合域具有第一氨基酸序列并且所述第二TALE核酸结合域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列不同于所述第二氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一核酸酶催化域具有第一氨基酸序列并且所述第二核酸酶催化域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列与所述第二氨基酸序列相同。
在一些实施方案中，所述第一核酸酶催化域和所述第二核酸酶催化域都具有Fok-I的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶和所述第二半TALE核酸酶能够形成异二聚体DNA切割复合物以实现编码CISH的基因中的目标位点处的DNA切割，并且其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶识别位于编码CISH的基因中的目标位点中的第一位置处的第一半目标，并且所述第二半TALE核酸酶识别位于不与第一位置重叠的编码CISH的基因中的目标位点中的第二位置处的第二半目标。
本发明提供一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增至包含降低的CISH和任选地PD-1表达的治疗性TIL群体中的方法，所述方法包括：
(a)通过将从受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤片段来获得和/或接收来源于从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将所述第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-14天以获得所述第二TIL群体，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(d)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列，并且任选地将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶的核酸引入TIL中；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养从步骤(d)获得的TIL来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约7-14天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行；以及
(f)收获从步骤(e)获得的治疗性TIL群体，其中从步骤(e)至步骤(f)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(g)将从步骤(f)收获的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(f)至(g)的转移是在不开放系统的情况下发生。
本发明提供一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增至包含降低的CISH和任选地PD-1表达的治疗性TIL群体中的方法，所述方法包括：
(a)通过将从受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤片段来获得来源于从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-11天以获得第二TIL群体，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(d)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列，并且任选地将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶的核酸引入TIL中；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养从步骤(d)获得的TIL来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约7-11天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行；
(f)收获从步骤(e)获得的治疗性TIL群体，其中从步骤(e)至步骤(f)的转变是在不开放系统的情况下发生；以及
(g)将从步骤(f)收获的治疗性TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(f)至(g)的转移是在不开放系统的情况下发生。
本发明提供一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增至包含降低的CISH和任选地PD-1表达的治疗性TIL群体中的方法，所述方法包括：
(a)由手术切除、穿刺活检、芯针活检、小型活检或其他用于获得含有来自受试者的黑色素瘤的肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的手段获得和/或接收第一TIL群体，
(b)将所述第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-14天以获得第二TIL群体，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(d)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列，并且任选地引入一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养从步骤(d)获得的TIL来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约7-14天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行；
(f)收获从步骤(e)获得的治疗性TIL群体，其中从步骤(e)至步骤(f)的转变是在不开放系统的情况下发生；以及
(g)将从步骤(f)收获的治疗性TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(f)至(g)的转移是在不开放系统的情况下发生。
本发明提供一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增至包含降低的CISH和任选地PD-1表达的治疗性TIL群体中的方法，所述方法包括：
(a)从受试者切除肿瘤，所述肿瘤包含第一TIL群体，任选地由手术切除、穿刺活检、芯针活检、小型活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的手段进行；
(b)将肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-11天以获得第二TIL群体，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(d)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列，并且任选地引入一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养从步骤(d)获得的TIL来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约7-11天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行；
(f)收获从步骤(e)获得的第三TIL群体，其中从步骤(e)至步骤(f)的转变是在不开放系统的情况下发生；以及
(g)将从步骤(f)收获的第三TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(f)至(g)的转移是在不开放系统的情况下发生。
本发明提供一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增至包含降低的CISH和任选地PD-1表达的治疗性TIL群体中的方法，所述方法包括：
(a)通过将从受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤片段来获得来源于从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和任选地OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-14天以获得第二TIL群体，其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(d)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列，并且任选地引入一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶；
(d)通过在包含IL-2、任选地OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养从步骤(d)获得的TIL来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约4-6天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行；
(e)将所述第三TIL群体分成第一多个2-5个TIL亚群，其中至少1.0×109个TIL存在于每个亚群中，其中从步骤(d)至步骤(e)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(f)通过用额外的IL-2、任选地OKT-3补充每个TIL亚群的细胞培养基来进行第一多个TIL亚群的第三次扩增，以产生第二多个TIL亚群，其中所述第三次扩增进行约5-7天，其中每个亚群的第三次扩增是在提供第三透气表面区域的密闭容器中进行，并且其中从步骤(e)至步骤(f)的转变是在不开放系统的情况下发生；以及
(g)收获从步骤(f)获得的第二多个TIL亚群；以及
(h)将从步骤(g)收获的TIL亚群转移至一个或多个输注袋，其中从步骤(g)至(h)的转变。
在一些实施方案中，所述方法还包括使用冷冻保存工艺冷冻保存收获的TIL的步骤。
在一些实施方案中，编码一种或多种第一TALE核酸酶的核酸为RNA。
在所述方法的一些实施方案中，引入编码一种或多种第一TALE核酸酶的核酸是通过电穿孔引入TIL中。
在一些实施方案中，所述方法还包括在引入步骤之前，通过在存在OKT-3的情况下将TIL在细胞培养基中培养约1-3天来激活TIL的步骤。
在一些实施方案中，所述OKT-3的浓度为约300ng/ml。
在一些实施方案中，所述方法还包括在引入步骤之后并且在第二次扩增步骤之前，使TIL在包含IL-2的细胞培养基中静置约1天的步骤。
在一些实施方案中，所述静置步骤的浓度为约3000IU/ml。
在一些实施方案中，所述方法还包括冷冻保存TIL，接着将TIL解冻并在包含IL-2的细胞培养基中培养约1-3天。
在一些实施方案中，步骤(a)至(g)在约13天至约29天，任选地约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天或约25天内进行。
在一些实施方案中，编码一种或多种第一TALE核酸酶的核酸为RNA，并且所述RNA是通过电穿孔引入TIL中。
在一些实施方案中，所述一种或多种第一TALE核酸酶各自由第一半TALE核酸酶和第二半TALE核酸酶构成。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶是由与第一核酸酶催化域融合的第一TALE核酸结合域构成的第一融合蛋白，并且所述第二半TALE核酸酶是由与第二核酸酶催化域融合的第二TALE核酸结合域构成的第二融合蛋白。
在一些实施方案中，所述第一TALE核酸结合域具有第一氨基酸序列并且所述第二TALE核酸结合域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列不同于所述第二氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一核酸酶催化域具有第一氨基酸序列并且所述第二核酸酶催化域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列与所述第二氨基酸序列相同。
在一些实施方案中，所述第一核酸酶催化域和所述第二核酸酶催化域都具有Fok-I的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶和所述第二半TALE核酸酶能够形成异二聚体DNA切割复合物以实现目标位点处的DNA切割。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶识别位于目标位点中的第一位置处的第一半目标，并且所述第二半TALE核酸酶识别位于不与第一位置重叠的目标位点中的第二位置处的第二半目标。
在一些实施方案中，所述TALE核酸酶包含与选自由SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述TALE核酸酶包含选自由SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:165具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且所述第二半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:167具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列并且所述第二半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述收获的TIL包含足够的TIL以供向有需要的受试者施用治疗有效剂量的TIL。
在一些实施方案中，所述治疗有效剂量的TIL包含约1×109至约9×1010个TIL。
在一些实施方案中，所述APC包含外周血单核细胞(PBMC)。
在一些实施方案中，所述PBMC以约1:25TIL:PBMC的比率补充。
在一些实施方案中，所述治疗性TIL群体在向受试者施用时提供增加的功效、增加的干扰素-γ(IFN-γ)产生、增加的多克隆性、增加的平均IP-10和/或增加的平均MCP-1。
在一些实施方案中，所述IL-2在第一次扩增中在细胞培养基中以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在。
在一些实施方案中，所述第二次扩增步骤，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在并且所述OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
在一些实施方案中，在第二次和/或第三次扩增步骤中，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在，并且任选地，所述OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
在一些实施方案中，所述第一次扩增是使用透气容器进行的。
在一些实施方案中，所述第二次扩增是使用透气容器进行的。
在一些实施方案中，所述第二次和/或第三次扩增是使用透气容器进行的。
在一些实施方案中，所述第一细胞培养基还包含选自由以下组成的组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和其组合。
在一些实施方案中，所述第二细胞培养基还包含选自由以下组成的组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和其组合。
在一些实施方案中，步骤中(d)和/或(f)中的细胞培养基还包含选自由以下组成的组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和其组合。
在一些实施方案中，所述第二次扩增的细胞培养基还包含选自由以下组成的组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和其组合。
在一些实施方案中，步骤(c)中的第一次扩增和/或步骤(e)中的第二次扩增是在11天的时段内单独地进行。
本发明提供一种包含降低的CISH和/或PD-1表达的经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体或包含TIL的组合物，所述TIL群体或包含TIL的组合物可通过权利要求1至20和32至73中任一项所述的方法获得。
本发明提供一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含降低的CISH和/或CISH和PD-1表达的经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的治疗性群体，其中所述经基因修饰的TIL治疗性群体可通过权利要求1至20和32至73中任一项所述的方法获得。
在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤)、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
附图说明
图1：TIL中双KO的评估。
图2：单和双CISH KO的效率。
图3：双CISH/PD-1 KO TIL中的PD-1 KO效率。
图4：相对于对照减少的CISH KO TIL的倍数扩增。
图5：CISH KO TIL中的T细胞谱系和记忆子集。
图6：CISH：CISH KO TIL中的分化和活化/耗竭。
图7：显示通过将编码一种或多种针对CISH基因中的目标序列的TALE核酸酶的核酸引入TIL中来扩增经基因修饰的TIL的示例性工艺，所述目标序列包含SEQ ID NO:175的核酸序列。
序列表的简要说明
SEQ ID NO:1为莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2为莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3为重组人类IL-2蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4为阿地白介素(aldesleukin)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5为重组人类IL-4蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6为重组人类IL-7蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7为重组人类IL-15蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8为重组人类IL-21蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9-126目前未指定。
SEQ ID NO:127为目标PD-1序列。
SEQ ID NO:128为目标PD-1序列。
SEQ ID NO:129为重复的PD-1左重复序列。
SEQ ID NO:130为重复的PD-1右重复序列。
SEQ ID NO:131为重复的PD-1左重复序列。
SEQ ID NO:132为重复的PD-1右重复序列。
SEQ ID NO:133为PD-1左TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO:134为PD-1右TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO:135为PD-1左TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO:136为PD-1右TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO:137为IL-2序列。
SEQ ID NO:138为IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO:139为IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO:140为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2。
SEQ ID NO:141为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2。
SEQ ID NO:142为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3。
SEQ ID NO:143为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2kabat。
SEQ ID NO:144为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 kabat。
SEQ ID NO:145为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 kabat。
SEQ ID NO:146为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2clothia。
SEQ ID NO:147为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 clothia。
SEQ ID NO:148为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 clothia。
SEQ ID NO:149为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2IMGT。
SEQ ID NO:150为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 IMGT。
SEQ ID NO:151为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 IMGT。
SEQ ID NO:152为IgG.IL2R67A.H1的VH链。
SEQ ID NO:153为IgG.IL2R67A.H1的重链。
SEQ ID NO:154为IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 kabat。
SEQ ID NO:155为IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 kabat。
SEQ ID NO:156为IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 kabat。
SEQ ID NO:157为IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 chothia。
SEQ ID NO:158为IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 chothia。
SEQ ID NO:159为IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 chothia。
SEQ ID NO:160为VL链。
SEQ ID NO:161为轻链。
SEQ ID NO:162为轻链。
SEQ ID NO:163为轻链。
SEQ ID NO:164为左CISH KO TALE核酸酶的核苷酸序列。
SEQ ID NO:165为左CISH KO TALE核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:166为右CISH KO TALE核酸酶的核苷酸序列。
SEQ ID NO:167为右CISH KO TALE核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:168为人类CISH基因中CISH TALEN KO的切割位点的核苷酸序列。
SEQ ID NO:169为左PD-1 KO TALE核酸酶的mRNA序列。
SEQ ID NO:170为左PD-1 KO TALE核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:171为右PD-1 KO TALE核酸酶的mRNA序列。
SEQ ID NO:172为右PD-1 KO TALE核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:173为CISH正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:174CISH反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:175为人类CISH基因中CISH TALEN KO的目标位点的核苷酸序列。
具体实施方式
I.前言
当前的扩增方案对将输注至患者中的TIL的健康状况提供极少了解。T细胞在其从初始T细胞至效应T细胞的成熟过程中经历了深刻的代谢转变(参见Chang等人,Nat.Immunol.2016,17,364，特此明确地全文并入，并且特别是对于厌氧和好氧代谢的论述和标志物而言)。例如，初始T细胞依赖于线粒体呼吸产生ATP，而成熟、健康的效应T细胞(如TIL)则具有高度糖酵解，依赖于好氧性糖酵解来提供其增殖、迁移、活化和抗肿瘤功效所需的生物能量底物。
先前的论文报道，在转移之前限制TIL中的糖酵解和促进线粒体代谢是合乎需要的，因为大量依赖于糖酵解的细胞将在过继转移时遭受营养剥夺，这引起大多数转移细胞死亡。因此，本领域教导促进线粒体代谢可促进体内长寿命并且事实上表明在诱导免疫反应之前使用糖酵解的抑制剂。参见Chang等人,Nat.Immunol.2016,17(364)。
在一些实施方案中，本发明还涉及使用基因编辑技术来增强TIL的治疗效果。虽然肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继转移提供了一种有前景和有效的疗法，但迫切需要可增加患者的反应率和反应稳健性的更有效的TIL疗法。如本文所描述，本发明的实施方案提供了将TIL扩增至治疗性群体中的方法，所述治疗性群体经基因编辑以提供增强的治疗效果。
II.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文所提及的所有专利和出版物都通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“共同施用(co-administration/co-administering)”、“与……组合施用(administered in combination with/administering in combinationwith)”、“同时(simultaneous)”和“并行(concurrent)”涵盖向受试者施用两种或更多种活性药物成分(在本发明的一个优选实施方案中，例如多个TIL)，使得活性药物成分和/或其代谢物两者同时存在于受试者中。共同施用包括以单独的组合物同时施用、以单独的组合物在不同时间施用或以其中存在两种或更多种活性药物成分的组合物的形式施用。以单独的组合物同时施用和以其中存在两种试剂的组合物的形式施用是优选的。
术语“体内”是指发生于受试者体内的事件。
术语“体外”是指发生于受试者体外的事件。体外测定涵盖采用活细胞或死细胞的基于细胞的测定，并且还可涵盖不采用完整细胞的不含细胞的测定。
术语“离体”是指涉及对已从受试者身体移出的细胞、组织和/或器官进行治疗或执行程序的事件。适当地，细胞、组织和/或器官可利用手术或治疗方法返回至受试者体内。
如本文所用，本文中“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”意指最初作为已离开受试者血流并迁移至肿瘤中的白细胞获得的细胞群体。TIL包括(但不限于)CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀手细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标志物)或功能性(根据其浸润肿瘤和实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达以下生物标志物中的一者或多者分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外和替代地，TIL可通过其重新引入患者中后浸润实体肿瘤的能力来进行功能性定义。TIL包括初代TIL和继代TIL两者。“初代TIL”是从如本文所概述的患者组织样本中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，并且“继代TIL”是如本文所论述已经扩增或增殖的任何TIL细胞群体，包括但不限于主体TIL和经扩增TIL(“REP TIL”或“REP后TIL”)，并且经基因修饰以包含一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列并且TIL细胞群体可包括这些经基因修饰的TIL。
如本文所用，本文中的“细胞群体”(包括TIL)意指共享共同性状的多种细胞。一般来说，群体数目通常在1X 106至1X 1010个的范围内，其中不同的TIL群体包含不同数目。例如，初代TIL在IL-2的存在下的初始生长产生大约1×108个细胞的主体TIL群体。通常进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞群体用于输注。群体中至少多个TIL经一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)基因修饰，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ IDNO:175的核酸序列的TALE核酸酶。
在本文中，“冷冻保存的TIL”意指初代、主体或经扩增TIL，其包括经一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)基因修饰的经基因修饰的TIL，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列并且经处理并储存于约-150℃至-60℃的范围中的TALE核酸酶。用于冷冻保存的通用方法也描述于本文别处，包括在实施例中描述。为了清楚起见，“冷冻保存的TIL”可与可用作初代TIL来源的冷冻组织样本区分。
本文中“解冻的冷冻保存的TIL”意指先前经冷冻保存并且接着处理以恢复至室温或更高温度(包括但不限于细胞培养温度或可向患者施用TIL的温度)的TIL群体。
术语“冷冻保存培养基(cryopreservation media/cryopreservation medium)”是指可用于冷冻保存细胞的任何培养基。此类培养基可包括包含7％至10％ DMSO的培养基。示例性培养基包含CryoStor CS10、Hyperthermosol以及其组合。术语“CS10”是指获自Stemcell Technologies或Biolife Solutions的冷冻保存培养基。CS10培养基可以商品名“CS10”来指代。CS10培养基为包含DMSO的无血清、无动物组分的培养基。
术语“中央记忆T细胞”是指在人类中为CD45R0+并且组成性表达CCR7(CCR7高)和CD62L(CD62高)的T细胞子集。中央记忆T细胞的表面表型也包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中央记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。中央记忆T细胞在TCR引发之后主要分泌IL-2和CD40L作为效应分子。中央记忆T细胞主要存在于血液的CD4隔室中，并且在人类中按比例富集于淋巴结和扁桃体中。
术语“效应记忆T细胞”是指人类或哺乳动物T细胞的子集，如中央记忆T细胞，为CD45R0+，但已经失去对CCR7的组成性表达(CCR7低)并且对于CD62L表达而言为异质的或低的(CD62L低)。中央记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中央记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激之后快速分泌高水平炎症性细胞因子，包括干扰素-γ、IL4-和IL-5。效应记忆T细胞主要存在于血液中的CD8隔室中，并且在人类中按比例富集于肺、肝脏和肠道中。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔素。
如本文所用，术语“破碎(fragmenting)”、“片段(fragment)”和“破碎的(fragmented)”描述将肿瘤破坏的过程，包括机械破碎方法，如压碎、切片、分割和粉碎肿瘤组织，以及任何其他用于破坏肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“外周血单核细胞”和“PBMC”是指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。当用作抗原呈递细胞(PBMC是一种类型的抗原呈递细胞)时，外周血单核细胞优选为经照射的同种异体外周血单核细胞。
术语“外周血淋巴细胞”和“PBL”是指从外周血扩增的T细胞。在一些实施方案中，PBL是与来自供体的全血或血球分离术产物分离。在一些实施方案中，PBL是通过正向或负向选择T细胞表型(如CD3+CD45+的T细胞表型)而与来自供体的全血或血球分离术产物分离。
术语“抗CD3抗体”是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括人类、人源化、嵌合、鼠类或哺乳动物抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗。抗CD3抗体也包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(在本文中也被称作“OKT3”)是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物类似物或变体，包括人类、人源化、嵌合或鼠类抗体，并且包括市售形式如OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3纯，美国加利福尼亚州圣地亚哥美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech,Inc,San Diego,CA,USA))和莫罗单抗或其变体、保守氨基酸取代、糖化形式或生物类似物。表1中给出了莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列(SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2)。能够产生OKT-3的杂交瘤寄存于美国菌种保藏中心(American TypeCulture Collection)并且所指派的ATCC登录号为CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也寄存于欧洲认证细胞培养物保藏中心(European Collection of Authenticated CellCultures；ECACC)并且所指派的目录号为86022706。
表1：莫罗单抗(示例性OKT-3抗体)的氨基酸序列。
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)是指称为白细胞介素-2的T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-2，包括人类和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和其变体。IL-2描述于例如Nelson,J.Immunol.2004,172,3983-88和Malek,Annu.Rev.Immunol.2008,26,453-79中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的重组人类IL-2的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO:3)。例如，术语IL-2涵盖人类重组形式的IL-2，例如阿地白介素(PROLEUKIN，可购自多个供应商，每单次使用小瓶含2200万IU)以及由美国新罕布什尔州次茅斯(Portsmouth,NH,USA)的CellGenix,Inc.(CELLGRO GMP)或美国新泽西州东不伦瑞克(East Brunswick,NJ,USA)的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-209-b)供应的重组IL-2形式和来自其他供应商的其他商业等同物。阿地白介素(去丙氨酰基-1，丝氨酸-125人类IL-2)是分子量为大约15kDa的非糖基化人类重组形式的IL-2。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO:4)。术语IL-2还涵盖如本文所描述的IL-2的聚乙二醇化形式，包括可购自美国加利福尼亚州南旧金山(South San Francisco,CA,USA)的Nektar Therapeutics的聚乙二醇化IL2前药NKTR-214。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化IL-2描述于美国专利申请公开第US 2014/0328791A1号和国际专利申请公开第WO 2012/065086 A1号中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的替代形式的缀合IL-2描述于美国专利第4,766,106号、第5,206,344号、第5,089,261号和第4902,502号中，其公开内容通过引用并入本文。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利第6,706,289号中，其公开内容通过引用并入本文。
表2：白细胞介素的氨基酸序列。
术语“IL-4”(在本文中也称为“IL4”)是指被称为白细胞介素4的细胞因子，其由Th2 T细胞和嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。IL-4调节初始辅助T细胞(Th0细胞)分化成Th2 T细胞。Steinke和Borish,Respir.Res.2001,2,66-70。在由IL-4活化后，Th2 T细胞接着以正回馈回路产生额外IL-4。IL-4也刺激B细胞增殖和II类MHC表达，并且诱导来自B细胞的类别转换至IgE和IgG1表达。适用于本发明的重组人类IL-4可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-211)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA,USA)的赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific，Inc.)(人类IL-15重组蛋白，目录号Gibco CTP0043)。适用于本发明的重组人类IL-4的氨基酸序列提供于表2中(SEQ ID NO:5)。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)是指称为白细胞介素7的糖基化的组织衍生的细胞因子，其可获自基质和上皮细胞以及树突状细胞。Fry和Mackall,Blood 2002,99,3892-904。IL-7可以刺激T细胞的发育。IL-7与IL-7受体(一种由IL-7受体α和共同γ链受体组成的异二聚体)结合，其属于对于T细胞在胸腺内的发育和在周边内的存活而言重要的一系列信号。适用于本发明的重组人类IL-7可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-254)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人类IL-15重组蛋白，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人类IL-7的氨基酸序列提供于表2中(SEQ ID NO:6)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)是指称为白细胞介素-15的T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-2，包括人类和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和其变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri,Blood 2001,97,14-32中，其公开内容通过引用并入本文。IL-15与IL-2共享β和γ信号传导受体亚基。重组人类IL-15为分子质量为12.8kDa的含有114个氨基酸(和N端甲硫氨酸)的单一非糖基化多肽链。重组人类IL-15可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGeneLtd.(目录号CYT-230-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人类IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人类IL-15的氨基酸序列提供于表2中(SEQ ID NO:7)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)是指称为白细胞介素-21的多效性细胞因子蛋白，并且包括所有形式的IL-21，包括人类和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和其变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard,Nat.Rev.Drug.Disc.2014,13,379-95，其公开内容通过引用并入本文。IL-21主要通过自然杀手T细胞和经活化的人类CD4+T细胞产生。重组人类IL-21是分子质量为15.4kDa的含有132个氨基酸的单一非糖基化多肽链。重组人类IL-21可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-TanyTechnoGene Ltd.(目录号CYT-408-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人类IL-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人类IL-21的氨基酸序列提供于表2中(SEQ ID NO:8)。
当指示“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，本发明组合物待施用的精确量可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和疾患的个别差异来确定。通常可说明本文所描述的包含肿瘤浸润淋巴细胞(例如，继代TIL或基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)的药物组合物可以104至1011个细胞/千克体重(例如，105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011或109至1010个细胞/千克体重)的剂量施用，包括在所述范围内的所有整数值。肿瘤浸润淋巴细胞(在所有情况下，包括至少多个通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸(例如mRNA)引入细胞毒性淋巴细胞中而经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶)组合物也可以这些剂量施用多次。肿瘤浸润淋巴细胞(在所有情况下，包括至少多个通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸(例如mRNA)引入细胞毒性淋巴细胞中而经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶)可通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术施用(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.,319:1676,1988)。特定患者的最佳剂量和治疗方案可容易由医药领域的技术人员通过监测患者的疾病病征并且相应地调整治疗来确定。
如本文所用，术语“微环境”可指作为整体的实体或血液肿瘤微环境或可指在微环境内的个别细胞子集。如本文所用，肿瘤微环境是指以下的复杂混合物：“促进赘生性转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤不受宿主免疫力影响、鼓励治疗抗性并且提供显性转移茁壮成长的生态栖位(niche)的细胞、可溶因子、信号传导分子、胞外基质和机械信号”，如Swartz等人,Cancer Res.,2012,72,2473中所描述。尽管肿瘤表达应由T细胞识别的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统清除肿瘤的情况是罕见的。
在一些实施方案中，本发明包括用TIL群体(至少多个TIL，其中群体通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸(例如mRNA)引入TIL中而经基因修饰，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶)治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本发明的此类TIL之前用非清髓性化学疗法预治疗。在一些实施方案中，可提供TIL群体，其中患者在输注根据本发明的TIL之前用非清髓性化学疗法预治疗。在一些实施方案中，所述非清髓性化学疗法为环磷酰胺(cyclophosphamide)60毫克/千克/天持续2天(在输注此类TIL之前第27天和第26天)和氟达拉滨(fludarabine)25毫克/平方米/天持续5天(在输注此类TIL之前第27至23天)。在一些实施方案中，在根据本发明的非清髓性化学疗法和TIL输注之后(第0天)，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2的静脉内输注以达到生理耐受。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指如本文所描述的化合物或化合物组合的量，其足以实现预期应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可根据预期应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病状况(例如，受试者的体重、年龄和性别)、疾病状况的严重程度或施用方式而变化。所述术语也适用于将诱导目标细胞中的特定反应(例如，血小板粘附和/或细胞迁移减少)的剂量。特定剂量将根据以下而变化：所选特定化合物、所依循的给药方案、化合物是否与其他化合物组合施用、施用时序、其所施用的组织和其中携带化合物的物理递送系统。
术语“治疗(treatment/treating/treat)”等是指获得所需的药理学和/或生理学效应。所述效应就完全或部分预防疾病或其症状而言可具预防性，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不良影响而言可具治疗性。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断出患有所述疾病的受试者中出现所述疾病；(b)抑制疾病，即遏制其发展或进展；和(c)缓解疾病，即促使疾病消退和/或缓解一种或多种疾病症状。“治疗”也意在涵盖递送试剂以便提供药理学效应，即使在不存在疾病或疾患的情况下也如此。例如，“治疗”涵盖可在不存在疾病状况的情况下(例如，在疫苗的情况下)引发免疫反应或赋予免疫性的组合物的递送。
当参考核酸或蛋白质的部分使用时，术语“异源”指示核酸或蛋白质包含两个或更多个在自然界中发现彼此之间没有相同关系的子序列。例如，通常以重组方式产生核酸，其具有两个或更多个来自无关基因的经布置以制造新的功能性核酸序列的序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区或来自不同来源的编码区。类似地，异源蛋白指示蛋白质包含两个或更多个在自然界中未发现彼此呈相同关系的子序列(例如，融合蛋白)。
在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“序列同一性(sequenceidentity)”、“同一性百分比(percent identity)”和“序列同一性百分比(sequencepercent identity)”(或其同义词，例如“99％同一”)是指两个或更多个序列或子序列在进行比较和比对(需要时引入空位)以达到最大对应性并且不将任何保守氨基酸取代视为序列同一性的部分时，所述两个或更多个序列或子序列是相同的或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。本领域中已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件。用以测定序列同一性百分比的适合程序包括例如可购自美国政府的国家生物技术信息中心(U.S.Government's National Center for Biotechnology Information)BLAST网站的BLAST程序包。两个序列之间的比较可使用BLASTN或BLASTP算法进行。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(美国加利福尼亚州南旧金山的基因泰克(Genentech))或MegAlign(可购自DNASTAR)是额外的可用于比对序列的可供大众使用的软件程序。本领域技术人员可通过特定的比对软件来测定用于最大比对的适当参数。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。
如本文所用，术语“变体”涵盖但不限于包含与参考抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列的抗体或融合蛋白，不同之处在于在参考抗体的氨基酸序列之内或相邻的某些位置有一个或多个取代、缺失和/或添加。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体可以在其氨基酸序列中包含一个或多个保守取代。保守取代可涉及例如类似带电或不带电氨基酸的取代。变体保留与参考抗体的抗原特异性结合的能力。术语变体还包括聚乙二醇化抗体或蛋白质。TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标志物)或功能性(根据其浸润肿瘤和实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达以下生物标志物中的一者或多者分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外和替代地，TIL可通过其重新引入患者中后浸润实体肿瘤的能力来进行功能性定义。TIL可进一步通过效力表征，例如，如果例如干扰素(IFN)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则TIL可视为强效的。
术语“脱氧核糖核苷酸”涵盖天然的和合成的、未经修饰的和经修饰的脱氧核糖核苷酸。修饰包括改变糖部分、碱基部分和/或寡核苷酸中脱氧核糖核苷酸之间的键联。
术语“RNA”定义包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。术语“核糖核苷酸”定义在b-D-呋喃核糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。术语RNA包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA、基本上纯RNA、合成RNA、以重组方式产生的RNA)以及通过添加、缺失、取代和/或改变一种或多种核苷酸而不同于天然存在的RNA的经改变的RNA。本文中所描述的RNA分子中的核苷酸也可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
术语“药学上可接受的载剂”或“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，以及惰性成分。此类药学上可接受的载剂或药学上可接受的赋形剂用于活性药物成分的用途是本领域中众所周知的。除非任何常规药学上可接受的载剂或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则涵盖其在本发明的治疗性组合物中的用途。例如其他药物的额外活性药物成分也可并入所描述的组合物和方法中。
术语“约”和“大约”意指在值的统计学上有意义的范围内。此范围可在既定值或范围的一个数量级内，优选地50％内，更优选地20％内，再更优选地10％内，并且甚至更优选地5％内。由术语“约”或“大约”涵盖的允许差异取决于研究中的特定系统，并且可由本领域普通技术人员容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”意指尺寸、大小、制剂、参数、形状和其他数量(quantity)和特征并不精确并且不需要精确，而是可以视需要为近似值和/或较大或较小的，反映出公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域的技术人员已知的其他因素。一般来说，无论是否如此明确说明，尺寸、大小、制剂、参数、形状或其他数量或特征都是“约”或“大约”的。应注意，大小、形状和尺寸非常不同的实施方案可采用所描述的布置。
当以原始和修改形式用于所附权利要求中时，过渡术语“包含(comprising)”、“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“由……组成(consisting of)”相对于哪些未叙述的额外权利要求要素或步骤(如果存在)被排除在权利要求的范围的外来定义权利要求范围。术语“包含”旨在为包含性的或开放性的，并且不排除任何额外的、未叙述的要素、方法、步骤或材料。术语“由……组成”不包含除权利要求中指定的要素、步骤或材料以外的任何要素、步骤或材料，并且在后一情况中排除与指定材料一般相关的杂质。术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限于所指定要素、步骤或材料和实质上不影响所要求保护的发明的基础和新颖特征的要素、步骤或材料。在替代实施方案中，本文所描述的体现本发明的所有组合物、方法和试剂盒可由任何过渡术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”更具体地定义。
术语“抗体(antibody)”和其复数形式“抗体(antibodies)”是指完整的免疫球蛋白和任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”进一步是指包含通过二硫键连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个域构成：CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域构成：CL。抗体的VH和VL区可进一步细分成高变区，其称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)，并且其可穿插有更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与一个或多个抗原表位相互作用的结合域。抗体恒定区可介导免疫球蛋白结合于宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
术语“抗原”是指诱导免疫反应的物质。在一些实施方案中，如果通过主要组织相容复合体(MHC)分子呈递，则抗原为能够与抗体或TCR结合的分子。如本文所用，术语“抗原”也涵盖T细胞表位。抗原另外能够由免疫系统识别。在一些实施方案中，抗原能够诱导使得B淋巴细胞和/或T淋巴细胞活化的体液免疫反应或细胞免疫反应。在一些情况下，这可能需要抗原含有或连接至Th细胞表位。抗原也可具有一个或多个表位(例如，B表位和T表位)。在一些实施方案中，抗原优选将通常以高度特异性并且选择性方式与其对应抗体或TCR反应，并且不与可由其他抗原诱导的多种其他抗体或TCR反应。
术语“单克隆抗体”、“mAb”、“单克隆抗体组合物”或其复数形式是指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。对某些受体具有特异性的单克隆抗体可使用以下技术中的知识和技术制得，即向测试受试者注射适合抗原，然后分离表达具有所需序列或功能特征的抗体的杂交瘤。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序分离并测序(例如，通过使用能够特异性结合于编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。DNA一旦经分离，则可置放于表达载体中，接着转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组产生将在下文更详细地描述。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称“抗体部分”或“片段”)是指保持特异性结合于抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已显示，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”范围内所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即一种二价片段，其包含在铰链区通过二硫桥键连接的两个Fab片段；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)域抗体(dAb)片段(Ward等人,Nature,1989,341,544-546)，其可由一个VH或一个VL域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个域VL和VH是由独立基因编码，但其可使用重组方法，通过合成接头接合，所述合成接头能够将其制造成VL与VH区配对形成单价分子的单一蛋白质链，称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人,Science 1988,242,423-426；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988,85,5879-5883)。此类scFv抗体也旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式来筛选供使用的片段。
如本文所用，术语“人类抗体”旨在包括具有其中框架区和CDR区都来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性突变诱发或通过体内体细胞突变引入的突变)。如本文所用，术语“人类抗体”并不旨在包括来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植于人类框架序列上的抗体。
术语“人类单克隆抗体”是指显示单一结合特异性并且具有可变区的抗体，其中框架区与CDR区都来源于人类种系免疫球蛋白序列。在一些实施方案中，人类单克隆抗体是由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的从转基因非人类动物(例如，转基因小鼠)获得的B细胞，其具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“重组人类抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，所述人类抗体例如(a)从对于人类免疫球蛋白基因而言为转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(在下文进一步描述)分离的抗体；(b)从经转化以表达人类抗体的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体；(c)从重组、组合人类抗体文库分离的抗体；以及(d)通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人类抗体具有其中框架区和CDR区来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，此类重组人类抗体可经历体外突变诱发(或当使用人类Ig序列的转基因动物时为体内体细胞突变诱发)，并且因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样一类序列，所述序列虽然来源于人类种系VH和VL序列并且与其相关，但可能并非在体内天然存在于人类抗体种系谱系内的序列。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合于抗原的抗体”互换使用。
术语“人类抗体衍生物”是指人类抗体的任何经修饰形式，包括抗体与另一种活性药物成分或抗体的缀合物。术语“缀合物”、“抗体-药物缀合物”、“ADC”或“免疫缀合物”是指与另一治疗部分缀合的抗体或其片段，所述治疗部分可使用本领域中可用的方法与本文所描述的抗体缀合。
术语“人源化抗体(humanized antibody/humanized antibodies)”和“人源化”旨在是指来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植于人类框架序列上的抗体。在人类框架序列中可进行额外的框架区修饰。非人类(例如鼠类)抗体的人源化形式为含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体为人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自例如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种(供体抗体)的15个高变区的残基代替。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应非人类残基代替。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能。一般来说，人源化抗体将包含基本上所有至少一个并且通常两个可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白的那些区域并且所有或基本上所有FR区为人类免疫球蛋白序列的那些区域。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常，人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于其他细节，参见Jones等人,Nature 1986,321,522-525；Riechmann等人,Nature 1988,332,323-329；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.1992,2,593-596。本文所描述的抗体也可经修饰以采用已知赋予效应物功能和/或FcR结合改进(例如降低)的任何Fc变体。Fc变体可包括例如以下所公开的氨基酸取代中的任一者：国际专利申请公开第WO 1988/07089 A1号、第WO 1996/14339 A1号、第WO 1998/05787 A1号、第WO 1998/23289 A1号、第WO 1999/51642 A1号、第WO 99/58572 A1号、第WO 2000/09560 A2号、第WO 2000/32767 A1号、第WO 2000/42072 A2号、第WO 2002/44215 A2号、第WO 2002/060919 A2号、第WO 2003/074569 A2号、第WO2004/016750 A2号、第WO 2004/029207 A2号、第WO 2004/035752 A2号、第WO 2004/063351A2号、第WO 2004/074455 A2号、第WO 2004/099249 A2号、第WO 2005/040217 A2号、第WO2005/070963 A1号、第WO 2005/077981 A2号、第WO 2005/092925 A2号、第WO 2005/123780A2号、第WO 2006/019447 A1号、第WO 2006/047350 A2号和第WO 2006/085967 A2号；和美国专利第5,648,260号；第5,739,277号；第5,834,250号；第5,869,046号；第6,096,871号；第6,121,022号；第6,194,551号；第6,242,195号；第6,277,375号；第6,528,624号；第6,538,124号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,998,253号；和第7,083,784号；其公开内容通过引用并入本文。
术语“嵌合抗体”旨在是指可变区序列来源于一个物种并且恒定区序列来源于另一物种的抗体，例如可变区序列来源于小鼠抗体并且恒定区序列来源于人类抗体的抗体。
“双功能抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗体片段。片段包含连接至同一多肽链(VH-VL或VL-VH)中的轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)。通过使用过短以使得同一链上的两个可变域之间不能配对的接头，迫使可变域与另一条链的互补域配对并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体更完全地描述于例如欧洲专利第EP 404,097号；国际专利公开第WO93/11161号；和Bolliger等人,PNAS1993,90,6444-6448中。
术语“糖基化”是指抗体的经修饰的衍生物。非糖基化抗体缺乏糖基化。糖基化可经改变以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，使得排除一个或多个可变区框架糖基化位点，由此消除所述位点处的糖基化。改变的糖基化可增加抗体对抗原的亲和力，如美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中所描述。另外或替代地，可产生糖基化类型改变的抗体，例如海藻糖基残基量减少的低海藻糖基化抗体或二分GlcNac结构增加的抗体。此类经改变的糖基化模式已证实会增加抗体的能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞已描述于本领域中并且可用作表达本发明的重组抗体以由此产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏海藻糖基转移酶基因、FUT8(α(1,6)海藻糖基转移酶)，使得Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏海藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系是通过使用两种置换载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而产生(参见例如美国专利公开第2004/0110704号或Yamane-Ohnuki等人,Biotechnol.Bioeng.,2004,87,614-622)。作为另一实例，欧洲专利第EP 1,176,195号描述了一种具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，所述FUT8基因编码海藻糖基转移酶，使得此类细胞系中表达的抗体通过减少或消除α1,6键相关酶而表现出低海藻糖基化，并且也描述如下细胞系，所述细胞系具有用于将海藻糖添加至结合至抗体Fc区的N-乙酰基葡糖胺的低酶活性或不具有酶活性，例如细胞系为大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。国际专利公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系，即Lec 13细胞，其具有将海藻糖连接至Asn(297)-连接的碳水化合物的降低能力，也导致表达于所述宿主细胞中的抗体的低海藻糖基化(也参见Shields等人,J.Biol.Chem.2002,277,26733-26740。国际专利公开WO 99/54342描述了经工程化以表达糖蛋白修饰型糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得工程化细胞系内所表达的抗体表现出增加的二分GlcNac结构，导致抗体的ADCC活性增加(也参见Umana等人,Nat.Biotech.1999,17,176-180)。或者，抗体的海藻糖残基可使用海藻糖苷酶切割开。例如，海藻糖苷酶α-L-海藻糖苷酶从抗体中去除海藻糖基残基，如Tarentino等人,Biochem.1975,14,5516-5523中所描述。
“聚乙二醇化”是指经修饰的抗体或其片段，其通常在一个或多个PEG基团连接至抗体或抗体片段的条件下与聚乙二醇(PEG)，如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。聚乙二醇化可例如增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。优选地，聚乙二醇化是经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖用于衍生其他蛋白质的任何PEG形式，例如单(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体可为无糖基化抗体。聚乙二醇化方法是本领域中已知的并且可应用于本发明的抗体，如欧洲专利第EP 0154316号和欧洲专利第EP 0401384号和美国专利第5,824,778号中所描述，其各自的公开内容通过引用并入本文。
术语“生物类似物”意指这样一种生物产品，包括单克隆抗体或蛋白质，尽管其在临床非活性组分中存在少量差异，但其与美国核准的参考生物产品高度类似，并且生物产品与参考产品之间在产品的安全性、纯度和效力方面不存在临床意义的差异。此外，类似生物或“生物类似物”药物是一种与已被欧洲药物管理局授权使用的另一生物药物相似的生物药物。术语“生物类似物”也被其他国家和地区监管机构以同义使用。生物产品或生物药物为由生物来源(例如细菌或酵母)制成或衍生的药物。其可由相对较小分子(例如人类胰岛素或红细胞生成素)或复合分子(例如单克隆抗体)组成。例如，如果参考IL-2蛋白为阿地白介素(PROLEUKIN)，则由药物监管机构批准的参考阿地白介素的蛋白质为阿地白介素的“生物类似物”或为阿地白介素的“其生物类似物”。在欧洲，类似生物或“生物类似物”药物是一种与已被欧洲药物管理局(European Medicines Agency；EMA)授权使用的另一生物药物相似的生物药物。欧洲类似生物应用的相关法律依据为法规(EC)第726/2004号第6条和指令2001/83/EC第10(4)条，经修订并且因此在欧洲，生物类似物可根据法规(EC)第726/2004号第6条和指令2001/83/EC第10(4)条进行授权、批准的授权或授权申请的对象。经授权的原始生物医药产品在欧洲可被称为“参考医药产品”。关于类似生物医药产品的CHMP指南中概述了产品被视为生物类似物的一些要求。此外，产品特定指南(包括与单克隆抗体生物类似物相关的指南)是由EMA逐项产品提供并且发布在其网站上。如本文所描述的生物类似物可借助于质量特征、生物活性、作用机制、安全概况和/或功效与参考医药产品类似。另外，生物类似物可用于或旨在用于治疗与参考医药产品相同的疾患。因此，可认为如本文所描述的生物类似物具有与参考医药产品类似或高度类似的质量特征。替代地或另外，可认为如本文所描述的生物类似物具有与参考医药产品类似或高度类似的生物活性。替代地或另外，可认为如本文所描述的生物类似物具有与参考医药产品类似或高度类似的安全概况。替代地或另外，可认为如本文所描述的生物类似物具有与参考医药产品类似或高度类似的功效。如本文所描述，欧洲生物类似物与已由EMA授权的参考医药产品进行比较。然而，在一些情况下，生物类似物在某些研究中可与在欧洲经济区以外许可的生物医药产品(非EEA许可的“比较物”)进行比较。此类研究包括例如某些临床和体内非临床研究。如本文所用，术语“生物类似物”也关于已与或可与非EEA许可的比较物比较的生物医药产品。某些生物类似物为蛋白质，如抗体、抗体片段(例如，抗原结合部分)和融合蛋白。蛋白质生物类似物可具有氨基酸序列，所述氨基酸序列在氨基酸结构中具有少量修饰(包括例如氨基酸的缺失、添加和/或取代)，其不显著影响多肽的功能。生物类似物可包含与其参考医药产品的氨基酸序列具有97％或更高序列同一性的氨基酸序列，例如97％、98％、99％或100％。生物类似物可包含一个或多个翻译后修饰，例如但不限于糖基化、氧化、脱酰胺和/或截短，其不同于参考医药产品的翻译后修饰，条件是差异不会引起医药产品的安全性和/或功效变化。生物类似物可具有与参考医药产品相同或不同的糖基化模式。特别是，虽然不排他性地，但如果差异解决或旨在解决与参考医药产品相关的安全问题，则生物类似物可具有不同糖基化模式。另外，生物类似物可在例如其强度、医药形式、制剂、赋形剂和/或呈现方式等方面不同于参考医药产品，只要所述医药产品的安全性和功效不受影响。相比于参考医药产品，生物类似物可包含例如药物动力学(PK)和/或药效学(PD)概况的差异，但仍视为与参考医药产品充分类似，从而待授权或视为适合于授权。在某些情况下，生物类似物表现出与参考医药产品不同的结合特征，其中所述不同结合特征被监管机构(例如EMA)认为并非类似生物产品获得许可的障碍。术语“生物类似物”也被其他国家和地区监管机构以同义使用。
III.TALEN基因编辑和扩增过程
A.概述：TIL扩增+TALEN基因编辑
本发明的实施方案涉及用于扩增TIL群体的方法，所述方法包括通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸(例如mRNA)引入TIL中而对至少一部分TIL进行TALEN基因编辑的一个或多个步骤，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列，以便增强其治疗效果。如本文所用，“TALEN基因编辑”、“基因编辑”和“基因组编辑”是指一种类型的基因修饰，其中在细胞的基因组中永久性修饰DNA，例如在细胞的基因组内插入、缺失、修饰或置换DNA。在一些实施方案中，TALEN基因编辑引起DNA序列的表达沉默(有时称为基因敲除)或抑制/降低(有时称为基因敲低)。在其他实施方案中，TALEN基因编辑引起DNA序列的表达增强(例如，通过引起过表达)。根据本发明的实施方案，使用TALEN基因编辑技术以增强治疗性TIL群体的有效性。
本发明的经基因修饰的TIL包含TIL群体，其至少一部分通过将编码一种或多种针对通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TLS中而经基因修饰，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对包含SEQ ID NO:175的核酸序列的核酸序列的TALE核酸酶，所述TIL群体可根据如本文图7中所描述或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述的方法的任何实施方案扩增成治疗性群体。
B.在TIL扩增期间TALEN基因编辑的时序
根据一些实施方案，本发明提供一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤片段来获得来源于从所述患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和任选地OKT-3(例如，OKT-3可在扩增过程的开始日开始存在于培养基中)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-14天以获得所述第二TIL群体，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，并且其中从步骤(c)至步骤(d)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(e)收获从步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中从步骤(d)至步骤(e)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(f)将从步骤(e)收获的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(e)至(f)的转移是在不开放系统的情况下发生；以及
(g)在步骤(f)中的转移至输注袋之前的方法期间的任何时间处，通过将编码一种或多种针对通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(任选地，mRNA)引入TIL细胞中而使至少一部分TIL细胞经受基因编辑，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对包含SEQ ID NO:175的核酸序列的核酸序列的TALE核酸酶。
如上文所描述的实施方案的步骤(g)中所陈述，可在步骤(f)中的转移至输注袋之前的TIL扩增方法期间的任何时间处进行基因编辑过程，其意指可在扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后对TIL进行基因编辑；例如，在以上方法中所概述的步骤(a)至(f)中的任一者期间或在以上方法中所概述的步骤(a)至(e)中的任一者之前或之后。根据某些实施方案，在扩增方法期间收集TIL(例如，对至少一部分TIL“暂停”扩增方法)并且使所收集的TIL经受基因编辑过程，并且在一些情况下，随后再引入回扩增方法中(例如，引入回培养基中)以继续扩增过程，使得至少一部分最终转移至输注袋的治疗性TIL群体经永久性基因编辑。在一些实施方案中，可通过激活TIL、对经活化的TIL进行基因编辑步骤和根据本文中所描述的方法扩增经基因编辑的TIL而在扩增之前进行基因编辑过程。
应注意，扩增过程的替代性实施方案可与以上显示的方法不同；例如，替代性实施方案可能不具有相同步骤(a)至(g)，或者可能具有不同数目的步骤。与特定实施方案无关，可在TIL扩增方法期间的任何时间处进行基因编辑过程。例如，替代性实施方案可包括超过两次扩增，并且有可能在第三次或第四次扩增等期间对TIL进行基因编辑。
根据一个实施方案，对来自第一群体、第二群体和第三群体中的一者或多者的TIL进行基因编辑过程。例如，可对第一TIL群体或对从第一群体收集的一部分TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程后，可随后将所述TIL置放回扩增过程中(例如，置放回培养基中)。或者，可对来自第二或第三群体的TIL或对分别从第二或第三群体收集的一部分TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程后，可随后将所述TIL置放回扩增过程中(例如，置放回培养基中)。根据其他实施方案，在TIL仍位于培养基中时和在扩增正在进行时进行基因编辑，即，无需从扩增“去除”TIL即可进行基因编辑。
根据其他实施方案，对来自第一次扩增的TIL或来自第二次扩增的TIL或其两者进行基因编辑过程。例如，在第一次扩增或第二次扩增期间，可对从培养基收集的TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程后，可随后将所述TIL置放回扩增方法中，例如通过将其再引入回培养基中。
根据其他实施方案，在第一次扩增之后并且在第二次扩增之前对至少一部分TIL进行基因编辑过程。例如，在第一次扩增之后，可对从培养基收集的TIL进行基因编辑，并且在基因编辑过程后，可随后将所述TIL置放回扩增方法中(例如，通过将其再引入回培养基中)以进行第二次扩增。
根据替代性实施方案，在步骤(c)之前(例如，在步骤(a)至(b)中的任一者之前、期间或之后)、在步骤(d)之前(例如，在步骤(a)至(c)中的任一者之前、期间或之后)、在步骤(e)之前(例如，在步骤(a)至(d)之前、期间或之后)或在步骤(f)之前(例如，在步骤(a)至(e)中的任一者之前、期间或之后)进行基因编辑过程。
应注意，关于OKT-3，根据某些实施方案，细胞培养基可在第一次扩增的开始日(第0天)或第1天开始包含OKT-3，使得在第0天和/或第1天，在TIL已暴露于细胞培养基中的OKT-3之后对其进行基因编辑。根据其他实施方案，细胞培养基在第一次扩增期间和/或在第二次扩增期间包含OKT-3，并且在将OKT-3引入细胞培养基中之前进行基因编辑。或者，细胞培养基可在第一次扩增期间和/或在第二次扩增期间包含OKT-3，并且在将OKT-3引入细胞培养基中之后进行基因编辑。
还应注意，关于4-1BB激动剂，根据某些实施方案，细胞培养基可在第一次扩增的开始日(第0天)或第1天开始包含4-1BB激动剂，使得在第0天和/或第1天，在TIL已暴露于细胞培养基中的4-1BB激动剂之后对其进行基因编辑。根据其他实施方案，细胞培养基在第一次扩增期间和/或在第二次扩增期间包含4-1BB激动剂，并且在将4-1BB激动剂引入细胞培养基中之前进行基因编辑。或者，细胞培养基可在第一次扩增期间和/或在第二次扩增期间包含4-1BB，并且在将4-1BB引入细胞培养基中之后进行基因编辑。
应注意，关于IL-2，根据某些实施方案，细胞培养基可在第一次扩增的开始日(第0天)或第1天开始包含IL-2，使得在第0天和/或第1天，在TIL已暴露于细胞培养基中的IL-2之后对其进行基因编辑。根据其他实施方案，细胞培养基在第一次扩增期间和/或在第二次扩增期间包含IL-2，并且在将IL-2引入细胞培养基中之前进行基因编辑。或者，细胞培养基可在第一次扩增期间和/或在第二次扩增期间包含IL-2，并且在将IL-2引入细胞培养基中之后进行基因编辑。
如上文所论述，OKT-3、4-1BB激动剂和IL-2中的一者或多者可在第一次扩增的第0天或第1天开始包括于细胞培养基中。根据一个实施方案，OKT-3在第一次扩增的第0天或第1天开始包括于细胞培养基中，和/或4-1BB激动剂在第一次扩增的第0天或第1天开始包括于细胞培养基中，和/或IL-2在第一次扩增的第0天或第1天开始包括于细胞培养基中。根据一个实例，细胞培养基在第一次扩增的第0天或第1天开始包含OKT-3和4-1BB激动剂。根据另一实例，细胞培养基在第一次扩增的第0天或第1天开始包含OKT-3、4-1BB激动剂和IL-2。当然，可在扩增过程期间的一个或多个额外的时间点处将OKT-3、4-1BB激动剂和IL-2中的一者或多者添加至细胞培养基中，如本文中所描述的各种实施方案中所阐述。
根据一些实施方案，用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将从患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤片段来获得来源于从所述患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过将所述第一TIL群体在包含IL-2并且任选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养约3至11天来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激所述第二TIL群体，其中从步骤(c)至步骤(d)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(e)对所述第二TIL群体进行无菌电穿孔以实现将编码一种或多种针对通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的一种或多种核酸(任选地，mRNA)转移至第二TIL群体的一部分细胞中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对包含SEQ ID NO:175的核酸序列的核酸序列的TALE核酸酶；
(f)将所述第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、任选地OKT-3抗体、任选地OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充所述第二TIL群体的细胞培养基来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，其中所述第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，并且其中从步骤(f)至步骤(g)的转变是在不开放系统的情况下发生；
(h)收获从步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到收获的TIL群体，其中从步骤(g)至步骤(h)的转变是在不开放系统的情况下发生，其中所述收获的TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(i)将所述收获的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(h)至(i)的转移是在不开放系统的情况下发生，
其中将一种或多种核酸无菌电穿孔至第二TIL群体的部分细胞中修饰了多个细胞以降低CISH在细胞中的表达。
在一些实施方案中，所述核酸为DNA。在一些实施方案中，所述核酸为RNA。在一些实施方案中，所述核酸为mRNA。
根据一些实施方案，前述方法还包括使用冷冻保存培养基来冷冻保存收获的TIL群体。在一些实施方案中，所述冷冻保存培养基为基于二甲亚砜的冷冻保存培养基。在其他实施方案中，所述冷冻保存培养基为CS10。
1.CISH
CISH(细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)家族的成员)是由CD8+T细胞中的TCR刺激诱导并且抑制其针对肿瘤的功能亲合力。CD8+T细胞中的CISH的基因缺失可增强其扩增、功能亲合力和细胞因子多功能性，引起现有肿瘤的明显和持久消退。参见例如Palmer等人,Journal of Experimental Medicine,212(12):2095(2015)。
根据特定实施方案，根据本发明的组合物和方法，使用如图7中所示描述为Gen 2或Gen 3的方法，CISH在TIL中的表达沉默或降低，并且其中经基因修饰的TIL是通过将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(任选地，mRNA)引入TIL中来产生，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对包含SEQ ID NO:175的核酸序列的核酸序列的TALE核酸酶，其中所述方法包括通过沉默或抑制CISH的表达对至少一部分TIL进行TALEN基因编辑。
2.PD-1
针对诱导检查点阻断而研究最多的目标之一为计划性死亡受体(PD1或PD-1，也称为PDCD1)，其为T细胞调节子的CD28超家族的成员。其配体PD-L1和PD-L2表达于各种肿瘤细胞(包括黑色素瘤)上。PD-1与PD-L1的相互作用可抑制T细胞效应物功能，引起慢性刺激环境下的T细胞耗竭并诱导肿瘤微环境中的T细胞凋亡。PD1也可在肿瘤特异性逃避免疫监视中起作用。
根据特定实施方案，本发明提供一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述扩增可根据如图7中所示描述为Gen 2的方法进行，其中经基因修饰的TIL是通过将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(任选地，mRNA)引入TIL中来产生，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对包含SEQ ID NO:175的核酸序列的CISH的基因目标序列中的一者的TALE核酸酶，并且其中所述方法任选地还包括通过沉默或抑制PD1的表达对至少一部分TIL进行TALEN基因编辑。例如，此TALE方法可用于沉默或降低PD1在TIL中的表达，除CISH以外。在一些实施方案中，靶向PD-1基因的TALEN为描述于WO 2013/176915 A1、WO 2014/184744A1、WO 2014/184741 A1、WO 2018/007263 A1和WO 2018/073391 A1中的那些，包括描述于WO 2013/176915 A1的第62-63页上的表10中的PD-1 TALEN中的任一者、描述于WO 2014/184744 A1的第78页上的表11中的PD-1 TALEN中的任一者、描述于WO 2014/184741 A1的第75页上的表11中的PD-1 TALEN中的任一者、描述于WO 2018/007263 A1的第48-52页上的表3中的PD-1 TALEN中的任一者和描述于WO 2018/073391 A1的第62-68页上的表4和/或第73-99页上的表5中的PD-1 TALEN中的任一者。
C.TALE基因编辑方法
已开发出使得能够进行位点特异性基因组编辑的主要种类的核酸酶包括转录激活因子样核酸酶(TALEN)，其经由蛋白质-DNA相互作用实现特异性DNA结合。参见例如Cox等人,Nature Medicine,2015,第21卷,第2期。TALE方法(其实施方案更详细地描述于下文中)可用作本发明的基因编辑方法。
如上文所论述，本发明的实施方案提供经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，以增强其治疗效果。本发明的实施方案涵盖将此类基因编辑的TIL扩增成TIL群体的方法。本发明的实施方案还提供了用于将此类基因编辑的TIL扩增成治疗性群体的方法。
在一些实施方案中，本发明提供一种通过用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL来基因修饰TIL群体的方法，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶。电穿孔方法是本领域中已知的，并且描述于例如以下中：Tsong,Biophys.J.1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237 A1号，其中的每一者的公开内容通过引用并入本文。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如以下中描述的所述电穿孔方法：美国专利第5,019,034号、第5,128,257号、第5,137,817号、第5,173,158号、第5,232,856号、第5,273,525号、第5,304,120号、第5,318,514号、第6,010,613号和第6,078,490号，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；和(3)第一组至少三个脉冲中的两者的第一脉冲间隔与第二组至少三个脉冲中的两者的第二脉冲间隔不同。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中第一组至少三个脉冲中的两者的第一脉冲间隔与第二组至少三个脉冲中的两者的第二脉冲间隔不同。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中的孔形成的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；和(3)第一组至少三个脉冲中的两者的第一脉冲间隔与第二组至少三个脉冲中的两者的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时段，并且使得维持TIL的存活率。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包被和胞吞作用)是本领域中已知的并且描述于以下中：Graham和van der Eb,Virology 1973,52,456-467；Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.1979,76,1373-1376；和Chen和Okayarea,Mol.Cell.Biol.1987,7,2745-2752；和美国专利第5,593,875号，其中的每一者的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)于过滤水中的1:1(w/w)脂质体制剂的方法是本领域中已知的并且描述于以下中：Rose等人,Biotechniques 1991,10,520-525和Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号，其中的每一者的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括使用以下中描述的方法进行转染的步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，其中的每一者的公开内容通过引用并入本文。
在本发明的一些实施方案中，电穿孔用于递送所需编码TALEN的核酸，包括编码TALEN的RNA和/或DNA。在本发明的一些实施方案中，所述电穿孔系统为流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施方案的适合流式电穿孔系统的实例为市售MaxCyte STX系统。有若干种可能适用于本发明的替代性市售电穿孔仪器，例如可获自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施方案中，所述电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施方案中，所述电穿孔系统为如本文中所描述的脉冲电穿孔系统，并且与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。
任何适合方法可用于扩增经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰的TIL：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ IDNO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在本发明的一些方法中，将此类基因编辑的TIL扩增成治疗性群体可根据如本文图7中所描述或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述的方法的任何实施方案进行。
TALE代表“转录激活因子样效应”蛋白，其包括TALEN(“转录激活因子样效应物核酸酶”)。使用TALE系统进行基因编辑的方法在本文中也称为TALE方法。TALE是来自植物病原细菌黄单孢菌属(Xanthomonas)的天然存在蛋白质，并且含有由一系列各自识别单碱基对的33-35个氨基酸的重复域构成的DNA结合域。TALE特异性由通过被称为重复可变二残基(repeat-variabledi-residue；RVD)的两个高变氨基酸来确定。模块化TALE重复序列连接在一起以识别连续DNA序列。DNA结合域中的特异性RVD识别目标基因座中的碱基，从而提供结构特征以组装可预测的DNA结合域。将TALE的DNA结合域与IIS型FokI核酸内切酶的催化域融合，以制备可靶向的TALE核酸酶(TALEN)。TALE核酸酶是极具特异性的试剂，因为其需要在必然异二聚体形式下成对结合DNA以获得切割域Fok-1的二聚。左杂二聚体和右杂二聚体成员各自识别约14至20bp的不同核酸序列，一起跨越30至50bp总体特异性的目标序列。为了诱导位点特异性突变，由14-20个碱基对间隔区域分开的两个个别TALEN臂将FokI单体拉近以二聚合并产生靶向的双链断裂。
若干个利用各种组装方法的大的系统性研究指示，可组合TALE重复序列以识别几乎任何使用者定义的序列。能够实现定制TALE阵列的快速组装的策略包括Golden Gate分子克隆、高通量固相组装和非连接依赖性克隆技术。定制设计的TALE阵列也由CellectisBioresearch(法国巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals(美国肯塔基州列克星敦(Lexington,KY,USA))和Life Technologies(美国纽约州格兰德岛(Grand Island,NY,USA))市售。另外，可使用基于网络的工具，如TAL效应子-核苷酸目标2.0(TAL Effector-Nucleotide Target 2.0)，其能够设计用于所需目标的定制TAL效应子重复序列阵列并且还提供所预测的TAL效应子结合位点。参见Doyle等人,Nucleic Acids Research,2012,第40卷,W117-W122。适用于本发明的TALE和TALEN方法的实例描述于美国专利申请公开第US2011/0201118 A1号、第US 2013/0117869 A1号、第US 2013/0315884 A1号、第US 2015/0203871 A1号和第US 2016/0120906 A1号中，其公开内容通过引用并入本文。
根据本发明的一些实施方案，TALE方法包括通过抑制或阻止目标基因的转录来沉默或降低一个或多个基因的表达。例如，TALE方法可包括利用KRAB-TALE，其中所述方法包括将转录Kruppel相关盒(KRAB)域与靶向基因的转录起始位点的DNA结合域融合，使得抑制或阻止基因的转录。
根据其他实施方案，TALE方法包括通过在靶向基因中引入突变来沉默或降低一个或多个基因的表达。例如，TALE方法可包括使核酸酶效应子域(例如Fokl)与TALE DNA结合域融合，产生TALEN。Fokl在作为二聚体时具有活性；因此，所述方法包括构建TALEN对以将FOKL核酸酶域定位至相邻基因组目标位点，所述域在所述目标位点处引入DNA双链断裂。可在Fokl的正确定位和二聚化之后完成双链断裂。一旦引入双链断裂，就可经由两种不同机制实现DNA修复：高保真同源重组对(HRR)(也称为同源定向修复或HDR)或易错非同源末端接合(NHEJ)。经由NHEJ进行的双链断裂的修复优选引起DNA目标位点缺失、插入或取代，即，NHEJ通常引起在断裂位点处引入小型插入和缺失，通常诱导敲除基因功能的移码。根据特定实施方案，使TALEN对靶向基因的大部分5'外显子，促进早期移码突变或早熟终止密码子。由TALEN引入的基因突变优选为永久性的。因此，根据一些实施方案，所述方法包括通过利用二聚化TALEN诱导经由易错NHEJ修复的位点特异性双链断裂来沉默或降低目标基因的表达，从而引起目标基因中的一个或多个突变。
根据其他实施方案，可根据本发明的实施方案使用TALEN，所述TALEN是衍生自FokI和AvrXa7的杂交蛋白质，如美国专利公开第2011/0201118号中所公开。此TALEN保留对AvrXa7的目标核苷酸的识别特异性和FokI的双链DNA切割活性。可使用相同方法制备具有不同识别特异性的其他TALEN。例如，可通过工程改造具有不同RVD集合的核心TALE骨架以改变DNA结合特异性和靶向特异性单一dsDNA目标序列来产生紧密的TALEN。参见美国专利公开第2013/0117869号。可将所选择的催化域连接至骨架以实现DNA处理，其可经工程化以确保当与核心TALE骨架融合时，催化域能够处理单一dsDNA目标序列附近的DNA。肽接头也可经工程化以使催化域与骨架融合，从而产生由单一多肽链制成的紧密的TALEN，其无需二聚以靶向特异性单一dsDNA序列。核心TALE骨架也可通过使催化域(其可为TAL单体)与其N端融合，实现此催化域可与另一个与另一TAL单体融合的催化域相互作用的可能性，由此产生可能处理目标序列附近的DNA的催化实体而经修饰。参见美国专利公开第2015/0203871号。此架构仅允许靶向一个DNA链，其并非经典TALEN架构的选择方案。
根据本发明的一些实施方案，可使用常规RVD以产生能够显著降低基因表达的TALEN。在一些实施方案中，使用四种RVD，即NI、HD、NN和NG，以分别靶向腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。这些常规RVD可用于例如产生靶向PD-1基因的TALEN。使用常规RVD的TALEN的实例包括Gautron等人,Molecular Therapy:Nucleic Acids,2017年12月,第9卷:312-321(Gautron)中所公开的T3v1和T1 TALEN，其通过引用并入本文。T3v1和T1 TALEN靶向PD-L1结合位点所位于的PDCD1基因座的第二外显子并且能够显著减少PD-1产生。在一些实施方案中，T1 TALEN通过使用目标SEQ ID NO:127如此进行并且T3v1 TALEN通过使用目标SEQ ID NO:128以及实施例1中描述的所述序列如此进行。在一些实施方案中，靶向PD-1基因的TALEN为描述于WO 2013/176915 A1、WO 2014/184744A1、WO 2014/184741 A1、WO2018/007263 A1和WO 2018/073391 A1中的那些，包括描述于WO 2013/176915 A1的第62-63页上的表10中的PD-1 TALEN中的任一者、描述于WO 2014/184744 A1的第78页上的表11中的PD-1 TALEN中的任一者、描述于WO 2014/184741A1的第75页上的表11中的PD-1 TALEN中的任一者、描述于WO 2018/007263 A1的第48-52页上的表3中的PD-1 TALEN中的任一者和描述于WO 2018/073391 A1的第62-68页上的表4和/或第73-99页上的表5中的PD-1TALEN中的任一者。
根据其他实施方案，使用非常规RVD修饰TALEN以改进其针对目标基因的活性和特异性，例如Gautron中所公开。天然存在的RVD仅涵盖高变氨基酸位置的潜在多样性谱系的一小部分。非常规RVD提供天然RVD的替代物并且具有新颖的固有靶向特异性特征，其可用于排除TALEN靶向位点外目标(基因组内的相对于目标序列含有少数错配的序列)。可通过产生和筛选在阵列的既定位置处的两个高变氨基酸位置处含有替代性氨基酸组合的TALEN的集合来鉴定非常规RVD，如Juillerat等人,Scientific Reports 5,文章编号8150(2015)中所公开，其通过引用并入本文。接着，可选择能够区分错配位置处存在的核苷酸的非常规RVD，其可防止位点外序列处的TALEN活性，同时仍允许目标位置的适当处理。然后可使用所选择的非常规RVD置换TALEN中的常规RVD。其中常规RVD已由非常规RVD置换的TALEN的实例包括由Gautron产生的T3v2和T3v3PD-1 TALEN。这些TALEN与使用常规RVD的TALEN相比具有增加的特异性。
根据其他实施方案，TALEN可经特定设计，从而允许能够靶向基因的特定选择的目标细胞内的DSB事件的较高发生率。参见美国专利公开第2013/0315884号。使用此类罕见的切割核酸内切酶可增加实现经转染细胞中的目标基因的双重灭活的几率，从而允许产生工程化细胞，如T细胞。此外，可将其他催化域与TALEN一起引入以增加突变诱发并增强目标基因灭活。成功地使用美国专利公开第2013/0315884号中所描述的TALEN来工程改造T细胞以使其适用于免疫疗法。TALEN也可用于灭活T细胞中的各种免疫检查点基因，包括灭活单一T细胞中的至少两个基因。参见美国专利公开第2016/0120906号。另外，TALEN可用于灭活编码免疫抑制剂和T细胞受体的目标的基因，如美国专利公开第2018/0021379号中所公开，其通过引用并入本文。此外，TALEN可用于抑制β2-微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容复合物反式激活因子(CIITA)的表达，如美国专利公开第2019/0010514号中所公开，其通过引用并入本文。
靶向PD-1基因的TALE核酸酶的实例提供于下表以及实施例1中的表5和WO 2018/007263 A1中。在这些实例中，目标基因组序列含有由15-bp间隔子(以小写字母显示)分隔的两个17-碱基对(bp)长序列(称为半目标，以大写字母显示)。每对右半和左半目标由表中所列的对应对右半和左半TALE核酸酶的重复序列识别。因此，根据特定实施方案，根据本发明的TALE核酸酶识别选自由以下组成的组的目标序列并将其切割：SEQ ID NO:127和SEQID NO:128。TALEN序列和基因编辑方法也描述于上文所论述的Gautron中。
表3：TALEN序列
另外，靶向PD-1基因的TALE核酸酶的实例提供于WO 2013/176915 A1、WO 2014/184744 A1、WO 2014/184741 A1、WO 2018/007263 A1和WO 2018/073391 A1中，包括描述于WO 2013/176915 A1的第62-63页上的表10中的PD-1 TALEN中的任一者、描述于WO 2014/184744 A1的第78页上的表11中的PD-1 TALEN中的任一者、描述于WO 2014/184741 A1的第75页上的表11中的PD-1 TALEN中的任一者、描述于WO 2018/007263 A1的第48-52页上的表3中的PD-1 TALEN中的任一者和描述于WO 2018/073391 A1的第62-68页上的表4和/或第73-99页上的表5中的PD-1 TALEN中的任一者。
通过TALE方法来改变目标基因序列的表达并且可根据本发明的实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第8,586,526号中，其通过引用并入本文。这些所公开的实例包括使用具有两个或更多个TALE重复单元的非天然存在的DNA结合多肽，所述TALE重复单元含有重复RVD、由TALE蛋白质的残基制成的N帽多肽和由TALE蛋白质的全长C端区域的片段制成的C帽多肽。
可用于有效进行TALEN介导的基因整合和灭活以及可根据本发明的实施方案使用的TALEN设计和设计策略、活性评估、筛选策略和方法的实例描述于Valton等人,Methods,2014,69,151-170中，其通过引用并入本文。
IV.TIL制造过程-2A(Gen2)
用于产生并扩增本发明的经基因修饰的TIL的示例性过程描绘于图7中，其中经扩增TIL是经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。如本文所论述，本发明可包括与再刺激经基因修饰的冷冻保存的TIL以增加其代谢活性并且因此在移植至患者中之前相对健康相关的步骤，和测试所述代谢健康的方法。如本文大体上概述，TIL一般是获自患者样本，其经基因修饰并且在移植至患者体内之前进行操作以扩增其数目。在一些实施方案中，可冷冻保存这些经基因修饰的TIL。一旦解冻，其也可经再刺激以在输注至患者中之前增加其代谢。
在一些实施方案中，如下文以及实施例和图7中详细论述，将制备这些经基因修饰的TIL的第一次扩增(包括被称为预REP的过程以及作为步骤B1显示于图7中的过程)缩短至3至14天并且将第二次扩增(包括被称为REP的过程以及作为步骤C显示于图7中的过程)缩短至7至14天，其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，将制备经基因修饰的TIL的第一次扩增(例如，作为步骤B1描述于图7中的扩增)缩短至11天并且将第二次扩增(例如，如图7中的步骤C中所描述的扩增)缩短至11天，其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，如下文和实施例和图7中详细论述，将第一次扩增和第二次扩增的组合(例如，作为步骤B1和步骤C描述于图7中的扩增)缩短至22天，其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。
以下“步骤”名称A、B、C等参照图7并且参照本文所描述的某些实施方案。以下步骤和图7中的步骤次序是示例性的，并且本申请和本文中所公开的方法涵盖步骤的任何组合或次序，以及额外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样本
一般来说，TIL最初获自患者肿瘤样本(“初代TIL”)并且然后扩增成较大群体以进行如本文中所描述的进一步操纵，任选地冷冻保存、如本文所概述的再刺激和任选地针对作为TIL健康的指示的表型和代谢参数进行评价，其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。
患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法，通常经由手术切除、穿刺活检、芯针活检、小型活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的手段获得。在一些实施方案中，使用多病灶取样。在一些实施方案中，手术切除、穿刺活检、芯针活检、小型活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的手段包括多病灶取样(即，从患者的一个或多个肿瘤部位和/或位置以及在同一位置或紧密相邻的一个或多个肿瘤处获得样本)。一般来说，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可为液体肿瘤，例如获自血液恶性病的肿瘤。实体肿瘤可为皮肤组织。在一些实施方案中，有用的TIL获自黑色素瘤。
一旦获得，肿瘤样本通常使用锐器分割破碎成1至约8mm3的小片，其中约2-3mm3是尤其适用的。在一些实施方案中，使用酶促肿瘤消化物从这些片段培养TIL。此类肿瘤消化物可通过在酶培养基(例如罗斯威尔公园癌症研究所(Roswell Park MemorialInstitute；RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素(gentamicine)、30单位/毫升DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中温育，接着进行机械解离(例如使用组织解离器)来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤置放于酶培养基中并且机械解离肿瘤大约1分钟，接着在37℃下在5％ CO2中温育30分钟，接着在前述条件下重复机械解离和温育循环，直至仅存在小组织片。在此过程结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用FICOLL支链亲水性多糖的密度梯度分离以去除这些细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开第2012/0244133 A1号中所描述的方法，所述公开的公开内容通过引用并入本文。任何前述方法可用于本文所描述的任何实施方案中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
如上文所指示，在一些实施方案中，TIL是衍生自实体肿瘤。在一些实施方案中，所述实体肿瘤未经破碎。在一些实施方案中，所述实体肿瘤未经破碎并且以全肿瘤经受酶促消化。在一些实施方案中，所述肿瘤是在包含胶原蛋白酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化。在一些实施方案中，所述肿瘤是在包含胶原蛋白酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方案中，所述肿瘤是在37℃、5％ CO2下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方案中，所述肿瘤是在37℃、5％CO2与旋转下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和中性蛋白酶的酶混合物中消化1-2小时。在一些实施方案中，所述肿瘤是在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，所述肿瘤是在37℃、5％ CO2与恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施方案中，在无菌缓冲液中用冻干酶重构肿瘤。在一些实施方案中，所述缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施方案中，所述酶混合物包含胶原蛋白酶。在一些实施方案中，所述胶原蛋白酶为胶原蛋白酶IV。在一些实施方案中，所述胶原蛋白酶的工作储备液为100mg/ml10X工作储备液。
在一些实施方案中，所述酶混合物包含DNA酶。在一些实施方案中，所述DNA酶的工作储备液为10,000IU/ml 10X工作储备液。
在一些实施方案中，所述酶混合物包含玻尿酸酶。在一些实施方案中，所述玻尿酸酶的工作储备液为10mg/ml 10X工作储备液。
在一些实施方案中，所述酶混合物包含10mg/ml胶原蛋白酶、1000IU/ml DNA酶和1mg/ml玻尿酸酶。
在一些实施方案中，所述酶混合物包含10mg/ml胶原蛋白酶、500IU/ml DNA酶和1mg/ml玻尿酸酶。
在一些实施方案中，所述酶混合物包含中性蛋白酶。在一些实施方案中，以175DMCU/mL的浓度重构中性蛋白酶的工作储备液。
在一些实施方案中，所述酶混合物包含中性蛋白酶、DNA酶和胶原蛋白酶。
在一些实施方案中，所述酶混合物包含10mg/ml胶原蛋白酶、1000IU/ml DNA酶和0.31DMC U/ml中性蛋白酶。在一些实施方案中，所述酶混合物包含10mg/ml胶原蛋白酶、500IU/ml DNA酶和0.31DMC U/ml中性蛋白酶。
一般来说，所收获细胞悬浮液被称为“初代细胞群体”或“新鲜收获的”细胞群体。
在一些实施方案中，破碎包括物理破碎，包括例如分割以及消化。在一些实施方案中，所述破碎为物理破碎。在一些实施方案中，所述破碎为分割。在一些实施方案中，所述破碎是通过消化进行。在一些实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶促肿瘤消化物和肿瘤片段培养。在一些实施方案中，TIL最初可在经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰之前从获自患者的酶促肿瘤消化物和肿瘤片段培养：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。
在一些实施方案中，在肿瘤为实体肿瘤时，所述肿瘤在例如步骤A(如图7中所提供)中获得肿瘤样本之后经历物理破碎。在一些实施方案中，所述破碎发生在冷冻保存之前。在一些实施方案中，所述破碎发生在冷冻保存之后。在一些实施方案中，所述破碎在获得肿瘤之后并且在不进行任何冷冻保存的情况下发生。在一些实施方案中，将肿瘤破碎并且将10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个片段或片置于每个容器中以进行第一次扩增。在一些实施方案中，将肿瘤破碎并且将30或40个片段或片置于每个容器中以进行第一次扩增。在一些实施方案中，将肿瘤破碎并且将40个片段或片置于每个容器中以进行第一次扩增。在一些实施方案中，多个片段包含约4个至约50个片段，其中每个片段的体积为约27mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约30个至约60个片段，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约50个片段，其总体积为约1350mm3。在一些实施方案中，多个片段包含约50个片段，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方案中，多个片段包含约4个片段。在一些实施方案中，多个片段包含约至约100个片段。
在一些实施方案中，所述TIL是获自肿瘤片段。在一些实施方案中，所述肿瘤片段是通过锐器分割获得。在一些实施方案中，所述肿瘤片段在约1mm3与10mm3之间。在一些实施方案中，所述肿瘤片段在约1mm3与8mm3之间。在一些实施方案中，所述肿瘤片段为约1mm3。在一些实施方案中，所述肿瘤片段为约2mm3。在一些实施方案中，所述肿瘤片段为约3mm3。在一些实施方案中，所述肿瘤片段为约4mm3。在一些实施方案中，所述肿瘤片段为约5mm3。在一些实施方案中，所述肿瘤片段为约6mm3。在一些实施方案中，所述肿瘤片段为约7mm3。在一些实施方案中，所述肿瘤片段为约8mm3。在一些实施方案中，所述肿瘤片段为约9mm3。在一些实施方案中，所述肿瘤片段为约10mm3。在一些实施方案中，所述肿瘤为1-4mm x 1-4mm x 1-4mm。在一些实施方案中，所述肿瘤为1mm x 1mm x 1mm。在一些实施方案中，所述肿瘤为2mmx 2mm x 2mm。在一些实施方案中，所述肿瘤为3mm x 3mm x 3mm。在一些实施方案中，所述肿瘤为4mm x 4mm x 4mm。
在一些实施方案中，所述肿瘤经切除以使每个片上出血性、坏死和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施方案中，所述肿瘤经切除以使每个片上出血性组织的量减至最小。在一些实施方案中，所述肿瘤经切除以使每个片上坏死组织的量减至最小。在一些实施方案中，所述肿瘤经切除以使每个片上脂肪组织的量减至最小。
在一些实施方案中，进行肿瘤破碎以便维持肿瘤内部结构。在一些实施方案中，在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行肿瘤破碎。在一些实施方案中，所述TIL是获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中温育，接着进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中后，可以机械方式将肿瘤解离大约1分钟。然后可将溶液在37℃下在5％ CO2中温育30分钟，并且然后再次机械破坏大约1分钟。在37℃下在5％CO2中再温育30分钟后，可将肿瘤第三次机械破坏大约1分钟。在一些实施方案中，在第三次机械破坏后如果大片组织仍存在，则向样本施加1或2次额外的机械解离，不论是否在37℃下在5％ CO2中温育额外30分钟。在一些实施方案中，在最终温育结束时，如果细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用Ficoll的密度梯度分离以去除这些细胞。
在一些实施方案中，将第一次扩增步骤之前收获的细胞悬浮液称为“初代细胞群体”或“新鲜收获的”细胞群体。
在一些实施方案中，细胞可任选地在样本收获之后冷冻并且在进入步骤B中所描述的扩增之前冷冻储存，所述步骤在下文进一步详细描述以及在图7中示例。
B.步骤B1：第一次扩增
在一些实施方案中，本发明方法提供获得年轻TIL，其能够在施用至受试者/患者时提供增加的复制循环并且因此可提供优于较老TIL(即，在施用至受试者/患者之前进一步经历更多轮复制的TIL)的额外治疗益处。年轻TIL的特征已在文献中描述，例如Donia等人,Scandinavian Journal of Immunology,75:157-167(2012)；Dudley等人,Clin CancerRes,16:6122-6131(2010)；Huang等人,J Immunother,28(3):258-267(2005)；Besser等人,Clin Cancer Res,19(17):OF1-OF9(2013)；Besser等人,J Immunother 32:415-423(2009)；Robbins等人,J Immunol 2004；173:7125-7130；Shen等人,J Immunother,30:123-129(2007)；Zhou等人,J Immunother,28:53-62(2005)；和Tran等人,J Immunother,31:742-751(2008)，其都通过引用整体并入本文。
T和B淋巴细胞的多样抗原受体是通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多样区)、J(接合区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供一种用于产生表现并增加T细胞组库多样性的经扩增的TIL的方法，其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的经扩增的TIL表现出T细胞组库多样性的增加，其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，与新鲜收获的TIL和/或使用除本文提供的所述方法以外的其他方法(包括例如除实施于图7中的所述方法以外的方法)制备的TIL相比，通过本发明方法获得的经扩增的TIL(其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中)表现出T细胞组库多样性的增加。在一些实施方案中，第一次扩增中获得的TIL表现出T细胞组库多样性的增加，其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，多样性的增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性的增加。在一些实施方案中，所述多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，所述多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，所述多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，所述多样性存在于选自由α、β、γ和δ受体组成的组的T细胞受体中的一者中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在例如图7的步骤A中所描述的肿瘤片段的分割或消化之后，所得细胞在含有IL-2的血清中在促进TIL生长超过肿瘤和其他细胞的条件下培养。在一些实施方案中，在2mL孔中在包含具有6000IU/mL IL-2的非活化人类AB血清的培养基中温育肿瘤消化物。将此初代细胞群体培养数天的时段，通常3至14天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体，其中经扩增的TIL已经或将经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，将此初代细胞群体培养7-14天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体，其中经扩增的TIL已经或将经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，将此初代细胞群体培养10至14天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，将此初代细胞群体培养约11天的时段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体，其中经扩增的TIL已经或将经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。
在一些实施方案中，TIL的扩增可使用如下文和本文所描述的初始主体TIL扩增步骤(例如，如描述于图7的步骤B1中的那些，其可包括被称为预REP的过程)来进行，其中经扩增的TIL已经或将经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。获自此过程的TIL可任选地针对如本文所描述的表型特征和代谢参数进行表征。
在例如使用平底Costar 24孔细胞培养簇(纽约康宁(Corning,NY)的CorningIncorporated)在24孔板中开始TIL培养的实施方案中，每个孔可在2mL具有IL-2(6000IU/mL；加利福尼亚州爱莫利维尔(Emeryville,CA)的Chiron Corp.)的完全培养基(CM)中接种有1×106个肿瘤消化物细胞或一个肿瘤片段，其中经扩增的TIL已经或将经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，所述肿瘤片段在约1mm3与10mm3之间。
在一些实施方案中，所述第一次扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，步骤B的CM由补充有10％人类AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气性烧瓶(例如，G-Rex10；明尼苏达州新布莱顿市(New Brighton,MN)的Wilson Wolf Manufacturing)中开始培养的实施方案中，每个烧瓶可装载有在10-40mL具有IL-2的CM中的10-40×106个活肿瘤消化物细胞或5-30个肿瘤片段。G-Rex10和24孔板两者可在加湿温育箱中在37℃在5％ CO2中温育并且在培养开始后5天，可去除一半培养基并且置换为新鲜的CM和IL-2，并且在第5天之后，每2-3天可更换一半培养基。
在制备肿瘤片段之后，在含有IL-2的血清中在促进TIL生长超过肿瘤和其他细胞的条件下培养所得细胞(即，片段)，其中其生长有利的TIL已经或将经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，将肿瘤消化物在2mL孔中，在包含非活化人类AB血清(或在一些情况下，如本文所概述，在存在APC细胞群体的情况下)和6000IU/mL IL-2的培养基中温育。将此初代细胞群体培养数天的时段，通常为10至14天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施方案中，所述生长培养基在第一次扩增期间包含IL-2或其变体。在一些实施方案中，所述IL为重组人类IL-2(rhIL-2)。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20-30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，所述IL-2储备液具有4-8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，所述IL-2储备液具有5-7×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，所述IL-2储备液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，如实施例5中所描述制备IL-2储备溶液。在一些实施方案中，所述第一次扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mL IL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，所述第一次扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，所述第一次扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，所述第一次扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，所述第一次扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约3000IU/mLIL-2。在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或约8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方案中，所述细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL或约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间和50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述OKT-3抗体为莫罗单抗(参见表1)。
在一些实施方案中，所述细胞培养基在细胞培养基中包含一种或多种TNFRSF激动剂。在一些实施方案中，所述TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施方案中，所述TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，并且所述4-1BB激动剂选自由以下组成的组：乌瑞鲁单抗(urelumab)、乌图木单抗(utomilumab)、EU-101、融合蛋白和其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方案中，所述TNFRSF激动剂以足以在细胞培养基中实现0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度添加。在一些实施方案中，所述TNFRSF激动剂以足以在细胞培养基中实现20μg/mL与40μg/mL之间的浓度添加。
在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF激动剂之外，所述细胞培养基还包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中所述一种或多种TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，所述第一次扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施方案中，CM由补充有10％人类AB血清、25mMHepes和10mg/mL庆大霉素的具有GlutaMAX的RPMI 1640组成。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气性烧瓶(例如，G-Rex10；明尼苏达州新布莱顿市的Wilson WolfManufacturing)中开始培养的实施方案中(图1)，每个烧瓶可装载有在10-40mL具有IL-2的CM中的10-40x106个活肿瘤消化物细胞或5-30个肿瘤片段。G-Rex10和24孔板两者都可在加湿温育箱中在37℃在5％ CO2中温育并且在培养开始后5天，可去除一半培养基并且置换为新鲜的CM和IL-2，并且在第5天后，每2-3天可更换一半培养基。在一些实施方案中，所述CM为实施例中所描述的CM1，参见实施例1。在一些实施方案中，所述第一次扩增发生在初始细胞培养基或第一细胞培养基中。在一些实施方案中，所述初始细胞培养基或所述第一细胞培养基包含IL-2。
在一些实施方案中，所述第一次扩增(包括例如描述于图7的步骤B1中的那些的过程，其可包括有时称为预REP的那些)缩短至3-14天，如实施例和附图中所论述。在一些实施方案中，将所述第一次扩增(包括例如描述于图7的步骤B1中的那些的过程，其可包括有时称为预REP的那些)缩短至7至14天，如实施例中所论述并且显示于图7的步骤B1中描述的扩增中。在一些实施方案中，将步骤B1的第一次扩增缩短至10-14天。在一些实施方案中，将所述第一次扩增缩短至11天，如例如图7的步骤B1中所描述的扩增中所论述。
在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天，其中经扩增的TIL已经或将经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行1天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行3天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行4天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行5天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行6天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行7天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行8天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行9天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行10天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行11天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行12天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行13天至14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行14天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行1天至11天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行2天至11天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行3天至11天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行4天至11天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行5天至11天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行6天至11天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行7天至11天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行8天至11天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行9天至11天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行10天至11天。在一些实施方案中，所述第一次TIL扩增可进行11天。
在一些实施方案中，在密闭系统生物反应器中进行第一次扩增，例如根据图7的步骤B1。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，所述密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
C.步骤B2：活化
在一些实施方案中，在预REP步骤(图7中的步骤B2)之后，TIL是通过将OKT-3添加至培养基中并培养约1至3天而经活化，其中所述TIL已经或将经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，使活化步骤(例如，图7中的步骤B2)进行约2天。
在一些实施方案中，通过在300ng/ml OKT-3存在下将TIL培养约1至3天来进行活化步骤(例如，图7中的步骤B2)。
在一些实施方案中，活化步骤(例如，图7中的步骤B2)中的细胞培养基包含约300ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，活化步骤(例如，图7中的步骤B2)中的细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约300ng/ml、约400ng/ml、约500ng/mL、约600ng/ml、约700ng/ml、约800ng/ml、约900ng/ml或约1μg/mLOKT-3抗体。在一些实施方案中，活化步骤(例如，图7中的步骤B2)中的细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间、50ng/mL与100ng/mL之间、100ng/ml与500ng/ml之间、200ng/ml与400ng/ml之间、250ng/ml与350ng/ml之间或275ng/ml与325ng/ml之间的OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述OKT-3抗体为莫罗单抗(参见表1)。
在一些实施方案中，通过在不开放系统的情况下将OKT-3添加至培养物中的TIL来进行活化步骤(例如，图7中的步骤B2)。
D.步骤B3：TALEN基因修饰步骤
在一些实施方案中，活化步骤(例如，图7中的步骤B3)之后为通过以下基因修饰TIL的步骤：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中(例如，图8中的步骤B3)。
在一些实施方案中，TALEN基因修饰步骤(例如，图7中的步骤B3)是通过基因修饰获自活化步骤(例如，图7中的步骤B2)的TIL通过以下来进行：用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL。
在一些实施方案中，TALEN基因修饰步骤(例如，图7中的步骤B3)是通过基因修饰获自活化步骤(例如，图7中的步骤B2)的TIL通过以下来进行：用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含具有包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的TALE核酸酶和具有包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL。
在一些实施方案中，TALEN基因修饰步骤(例如，图7中的步骤B3)是通过基因修饰获自活化步骤(例如，图7中的步骤B2)的TIL通过以下来进行：用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含具有包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的TALE核酸酶和具有包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL。
在一些实施方案中，TALEN基因修饰步骤(例如，图7中的步骤B3)是通过基因修饰获自活化步骤(例如，图7中的步骤B2)的TIL通过以下来进行：用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含具有包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的TALE核酸酶和具有包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL。
在一些实施方案中，TALEN基因修饰步骤(例如，图7中的步骤B3)是通过基因修饰获自活化步骤(例如，图7中的步骤B2)的TIL通过以下来进行：用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL，其中所需TALE核酸酶包含具有包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的TALE核酸酶和具有包含SEQ IDNO:166的氨基酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过用编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)电穿孔TIL。
在一些实施方案中，如上适用的前述段落中的任一者中描述的TALEN基因修饰步骤经修改以使得用于TIL电穿孔的核酸(例如mRNA)包括编码通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)。
在一些实施方案中，如上适用的前述段落中的任一者中描述的TALEN基因修饰步骤经修改以使得用于TIL电穿孔的核酸(例如mRNA)包括编码具有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)，并且进一步包括编码具有包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)。
在一些实施方案中，如上适用的前述段落中的任一者中描述的TALEN基因修饰步骤经修改以使得编码一种或多种选择性地灭活CISH基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)、编码一种或多种选择性地灭活PD-1基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)和电穿孔缓冲液掺合在一起，并且使TIL在掺合物存在下经受单一电穿孔步骤。
电穿孔方法是本领域中已知的，并且描述于例如以下中：Tsong,Biophys.J.1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237 A1号，其中的每一者的公开内容通过引用并入本文。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如以下中描述的那些电穿孔方法：美国专利第5,019,034号、第5,128,257号、第5,137,817号、第5,173,158号、第5,232,856号、第5,273,525号、第5,304,120号、第5,318,514号、第6,010,613号和第6,078,490号，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；和(3)第一组至少三个脉冲中的两者的第一脉冲间隔与第二组至少三个脉冲中的两者的第二脉冲间隔不同。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程序化的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中第一组至少三个脉冲中的两者的第一脉冲间隔与第二组至少三个脉冲中的两者的第二脉冲间隔不同。在一些实施方案中，所述电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中的孔形成的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中所述一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；和(3)第一组至少三个脉冲中的两者的第一脉冲间隔与第二组至少三个脉冲中的两者的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时段，并且使得维持TIL的存活率。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包被和胞吞作用)是本领域中已知的并且描述于以下中：Graham和van der Eb,Virology 1973,52,456-467；Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.1979,76,1373-1376；和Chen和Okayarea,Mol.Cell.Biol.1987,7,2745-2752；和美国专利第5,593,875号，其中的每一者的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)于过滤水中的1:1(w/w)脂质体制剂的方法是本领域中已知的并且描述于以下中：Rose等人,Biotechniques1991,10,520-525和Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号，其中的每一者的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，基因修饰TIL群体的方法包括使用以下中描述的方法进行转染的步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，其中的每一者的公开内容通过引用并入本文。
在本发明的一些实施方案中，电穿孔用于递送所需编码TALEN的核酸，包括编码TALEN的RNA和/或DNA。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统为流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施方案的适合流式电穿孔系统的实例为市售MaxCyte STX系统。有若干种可能适用于本发明的替代性市售电穿孔仪器，例如可获自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统为如本文中所描述的脉冲电穿孔系统，并且与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。
E.步骤B4：静置步骤
在一些实施方案中，基因修饰步骤(例如，图7中的步骤B3)之后为使TIL静置的步骤(例如，图8中的步骤B4)，其中静置TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，使TIL静置约1天。在一些实施方案中，紧接着在基因修饰步骤(例如，图7中的步骤B3)中的电穿孔之后，使TIL静置约16小时。在一些实施方案中，紧接着在基因修饰步骤(例如，图7中的步骤B3)中的电穿孔之后，使TIL重悬于CM1培养基中并且在37℃下温育一小时，接着在30℃下温育15小时。
F.步骤C：第一次扩增至第二次扩增的转变
在一些情况下，获自第一次扩增的经基因修饰的TIL群体(包括例如获自例如如图7中所指示的步骤B1的TIL群体)可使用以下本文中论述的方案立即冷冻保存，其中基因修饰包括通过以下进行TALEN基因编辑：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。或者，获自第一次扩增的TIL群体(被称为第二TIL群体)可如上文所描述在不进行临时冷冻保存的情况下经受基因修饰，接着为第二次扩增(其可包括有时称为REP的扩增)并且然后如下文所论述冷冻保存，其中所述基因修饰包括通过以下进行TALEN基因编辑：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。
G.步骤D：第二次扩增
在一些实施方案中，TIL细胞群体在初始批量处理、预REP扩增和基因修饰后数目扩增，例如，在步骤A和步骤B之后，以及称为步骤C的转变，如图7中所指示，其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。此进一步扩增在本文中称为第二次扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(REP；以及如图7的步骤D中所指示的过程)的扩增过程。第二次扩增通常使用包含多种组分(包括饲养细胞、细胞因子来源和抗CD3抗体)的培养基在透气容器中实现。
在一些实施方案中，TIL的第二次扩增或第二次TIL扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图7的步骤D中所指示的过程)可使用本领域的技术人员已知的任何TIL烧瓶或容器进行，其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，所述第二次TIL扩增可进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，所述第二次TIL扩增可进行约7天至约14天。在一些实施方案中，所述第二次TIL扩增可进行约8天至约14天。在一些实施方案中，所述第二次TIL扩增可进行约9天至约14天。在一些实施方案中，所述第二次TIL扩增可进行约10天至约14天。在一些实施方案中，所述第二次TIL扩增可进行约11天至约14天。在一些实施方案中，所述第二次TIL扩增可进行约12天至约14天。在一些实施方案中，所述第二次TIL扩增可进行约13天至约14天。在一些实施方案中，所述第二次TIL扩增可进行约14天。
在一些实施方案中，所述第二次扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如被称为REP的扩增；以及如图7的步骤D中所指示的过程)进行。例如，TIL可在白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。所述非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/ml OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦市(Raritan,NJ)的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本市(Auburn,CA)的美天旎生物技术公司)或UHCT-1(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市的BioLegend)。TIL可通过在第二次扩增期间包括一种或多种癌症的抗原(包括其抗原部分，例如表位)来扩增以诱导进一步TIL体外刺激，所述抗原可任选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下任选地从载体表达，所述载体如人类白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他适合抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或其抗原部分。TIL也可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激而快速扩增。或者，TIL可进一步用例如实例经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方案中，再刺激作为第二次扩增的部分发生。在一些实施方案中，第二次扩增在经照射的自体淋巴细胞或经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2存在下发生。
在一些实施方案中，所述细胞培养基还包含IL-2。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方案中，所述细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL或约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间和50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，所述OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施方案中，所述细胞培养基在细胞培养基中包含一种或多种TNFRSF激动剂。在一些实施方案中，所述TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施方案中，所述TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，并且所述4-1BB激动剂选自由以下组成的组：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白和其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方案中，所述TNFRSF激动剂以足以在细胞培养基中实现0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度添加。在一些实施方案中，所述TNFRSF激动剂以足以在细胞培养基中实现20μg/mL与40μg/mL之间的浓度添加。
在一些实施方案中，除了一种或多种TNFRSF激动剂之外，所述细胞培养基还包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，并且其中所述一种或多种TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一些实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL与PBMC的比率在1比50与1比300之间。在一些实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL与PBMC的比率在1比100与1比200之间。
在一些实施方案中，REP和/或第二次扩增在烧瓶中进行，其中主体TIL在150ml培养基中与100倍或200倍过量的非活化饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2混合。进行培养基置换(通常用新鲜培养基经由抽吸置换2/3培养基)，直至细胞转移至替代生长室中。替代生长室包括G-REX烧瓶和透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施方案中，如实施例和附图中所论述，将第二次扩增(其可包括被称为REP过程的过程)缩短至7-14天，其中通过此第二次扩增来扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，将第二次扩增缩短至11天。
在一些实施方案中，REP和/或第二次扩增可以使用先前描述的T-175烧瓶和透气袋(Tran等人，J.Immunother.2008,31,742-51；Dudley等人,J.Immunother.2003,26,332-42)或透气培养皿(G-Rex烧瓶)进行，其中通过此第二次扩增来扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，第二次扩增(包括称为快速扩增的扩增)是在T-175烧瓶中执行，并且可将悬浮于150mL培养基中的约1x 106个TIL添加至每个T-175烧瓶中。TIL可在补充有3000IU/mL IL-2和30ng/ml抗CD3的CM与AIM-V培养基的1:1混合物中培养。T-175烧瓶可在37℃下在5％ CO2中温育，其中通过此第二次扩增来扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。可在第5天使用具有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方案中，在第7天，可以将来自两个T-175烧瓶的细胞组合在3L袋中，并且将300mL AIM V与5％人类AB血清和3000IU/mL IL-2添加至300ml TIL悬浮液中。每天或每两天对每个袋中的细胞数目计数，并添加新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5与2.0×106个细胞/毫升之间。
在一些实施方案中，第二次扩增(其可包括被称为REP的扩增，以及图7的步骤D中提及的那些)可在具有100cm透气硅底的500mL容量透气烧瓶(G-Rex 100，可购自美国明尼苏达州新布莱顿市的Wilson Wolf Manufacturing Corporation)中进行，5×106或10×106个TIL可在400mL补充有5％人类AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/ml抗CD3(OKT3)的50/50培养基中与PBMC一起培养，其中通过此第二次扩增来扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将引入编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。G-Rex 100烧瓶可在37℃下在5％CO2中温育。在第5天，可将250mL上清液去除并放入离心瓶中并且以1500rpm(491×g)离心10分钟。TIL团粒可用150mL具有5％人类AB血清、3000IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬，并且添加回原始G-Rex 100烧瓶中。当在G-Rex 100烧瓶中连续扩增TIL时，在第7天，可使每个G-Rex 100中的TIL悬浮于每个烧瓶中存在的300mL培养基中，并且细胞悬浮液可分成3份100mL等分试样，所述等分试样可用于接种3个G-Rex100烧瓶。接着可将150mL具有5％人类AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至每个烧瓶中。可将G-Rex100烧瓶在37℃下于5％ CO2中温育并且在4天之后，可将150mL具有3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至每个G-Rex 100烧瓶中。可在培养的第14天收获细胞。
在一些实施方案中，第二次扩增(包括被称为REP的扩增)在烧瓶中进行，其中将主体TIL在150ml培养基中与100倍或200倍过量的非活化饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2混合。在一些实施方案中，进行培养基置换，直至细胞转移至替代生长室中，其中通过此第二次扩增来扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，通过抽吸用过的培养基，接着输注新鲜培养基来置换2/3培养基。在一些实施方案中，替代生长室包括G-REX烧瓶和透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施方案中，第二次扩增培养基(例如，有时被称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细论述。
在一些实施方案中，在密闭系统生物反应器中进行第二次扩增，例如根据图7的步骤D。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一些实施方案中，本文描述的第二次扩增程序(例如包括如描述于图7的步骤D中的那些以及被称为REP的那些的扩增)在REP TIL扩增期间和/或在第二次扩增期间需要过量饲养细胞，其中通过此第二次扩增程序扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在许多实施方案中，所述饲养细胞为获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。所述PBMC是使用标准方法如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
一般来说，同种异体PBMC经由照射或热处理为非活化的，并且如实施例中所描述用于REP程序，其提供用于评价经照射同种异体PBMC的复制非胜任的示例性方案。
在一些实施方案中，如果第14天活细胞总数小于在REP第0天和/或第二次扩增第0天(即第二次扩增的起始日)放入培养物中的初始活细胞数目，则认为PBMC为复制非胜任的并且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。
在一些实施方案中，如果第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP第0天和/或第二次扩增第0天(即第二次扩增的起始日)放入培养物中的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC为复制非胜任的并且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在30ng/ml OKT3抗体和3000IU/ml IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，如果第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP第0天和/或第二次扩增第0天(即第二次扩增的起始日)放入培养物中的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC为复制非胜任的并且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，所述PBMC在5-60ng/ml OKT3抗体和1000-6000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，所述PBMC在10-50ng/ml OKT3抗体和2000-5000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，所述PBMC在20-40ng/ml OKT3抗体和2000-4000IU/ml IL-2存在下培养。在一些实施方案中，所述PBMC在25-35ng/ml OKT3抗体和2500-3500IU/ml IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，所述抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施方案中，所述抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1比25、约1比50、约1比100、约1比125、约1比150、约1比175、约1比200、约1比225、约1比250、约1比275、约1比300、约1比325、约1比350、约1比375、约1比400或约1比500。在一些实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率在1比50与1比300之间。在一些实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率在1比100与1比200之间。
在一些实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约2.5x109个饲养细胞:约100x106个TIL的比率。在其他实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约2.5x109个饲养细胞:约50x106个TIL的比率。在又其他实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约2.5x109个饲养细胞:约25x106个TIL的比率。
在一些实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序在第二次扩增期间需要过量饲养细胞。在许多实施方案中，所述饲养细胞为获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。所述PBMC是使用标准方法如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方案中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
一般来说，同种异体PBMC经由照射或热处理为非活化的，并且用于本文所描述的TIL扩增程序，包括附图和实施例中所描述的示例性程序。
在一些实施方案中，在第二次扩增中使用人工抗原呈递细胞来代替PBMC或与PBMC组合使用。
H.步骤E：收获TIL
在第二次扩增步骤后，可收获细胞。在一些实施方案中，在例如图7中所提供的一、二、三、四个或更多个扩增步骤之后收获TIL。在一些实施方案中，在例如如图7中所提供的两个扩增步骤之后收获TIL，其中通过此扩增步骤扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。
TIL可以任何适当且无菌的方式收获，包括例如离心。用于收获TIL的方法是本领域中众所周知的并且任何此类已知方法均可与本发明工艺一起使用。在一些实施方案中，使用自动化系统收获TIL。
细胞收获器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer和Inotech Biosystems International,Inc.。本发明方法可采用任何基于细胞的收获器。在一些实施方案中，细胞收获器和/或细胞处理系统为基于膜的细胞收获器。在一些实施方案中，细胞收获是经由细胞处理系统，例如LOVO系统(由Fresenius Kabi制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也是指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动和细胞处理以去除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施方案中，细胞收获器和/或细胞处理系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施方案中，收获(例如根据图7的步骤E)是在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。在一些实施方案中，密闭系统是在无菌条件下经由注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。
I.步骤F：最终配制/转移至输注袋
在如以图7中的示例性顺序提供和如上文和本文详细概述的步骤A至E完成后，将经基因修饰的TIL转移至用于向患者施用的容器中，其中所述经基因修饰的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，一旦使用上文所描述的扩增方法获得治疗充足数目的经基因修饰的TIL，将其转移至用于向患者施用的容器中，其中经基因修饰的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。
在一些实施方案中，使用本公开的APC扩增的TIL是以药物组合物形式施用至患者，其中经扩增的TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，药物组合物为经基因修饰的TIL于无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的方法扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用，其中此类TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。在一些实施方案中，所述TIL是以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟，其中此类TIL已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴内。
IV.药物组合物、剂量和给药方案
在一些实施方案中，TIL以药物组合物形式施用至患者，所述TIL经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，并且使用本公开的方法扩增(在本文中被称作“CISH低或CISH低/PD-1低TIL”)。在一些实施方案中，药物组合物为CISH低或CISH低/PD-1低TIL于无菌缓冲液中的悬浮液。在一些实施方案中，使用本公开的PBMC扩增的CISH低或CISH低/PD-1低TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL是以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟。其他适合施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可施用任何适合剂量的CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL，平均约7.8×1010个CISH低/PD-1低TIL，尤其在癌症为黑色素瘤的情况下。在一些实施方案中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约3×1010至约12×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约4×1010至约10×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约5×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约6×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约7×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010个。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7.8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL，尤其在癌症为黑色素瘤的情况下。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的数目为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013个。在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的数目在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的浓度小于例如药物组合物的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的浓度在药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的浓度在药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的量等于或少于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的量超过0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL在广泛剂量范围内有效。准确剂量将取决于施用途径、化合物施用形式、待治疗受试者的性别和年龄、待治疗受试者的体重以及主治医师的偏好和经验。适当时也可使用CISH低或CISH低/PD-1低TIL的临床确定剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，例如CISH低或CISH低/PD-1低TIL的剂量将取决于所治疗的人类或哺乳动物、病症或疾患的严重程度、施用速率、活性药物成分的配置和开处方医师的判断。
在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL可以单一剂量施用。此类施用可通过例如静脉内注射的注射进行。在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL可以多次剂量施用。给药可为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。给药可为每月一次、每两周一次、一周一次或每隔一天一次。只要需要，可继续TIL的施用。
在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013个。在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL的有效剂量在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kg mg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。
在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL的有效剂量在1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg，或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg的范围内。
有效量的CISH低或CISH低/PD-1低TIL可通过施用具有类似效用的药剂的任一种公认模式，包括鼻内和透皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、非经肠、肌肉内、皮下、局部、通过移植或通过吸入，以单次或多次剂量施用。
在其他实施方案中，本发明提供了一种输注袋，其包含上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)组合物，其包含上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体和药学上可接受的载剂。
在其他实施方案中，本发明提供了一种输注袋，其包含上文前述段落中的任一者中描述的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物。
在其他实施方案中，本发明提供了一种上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体的冷冻保存制剂。
在其他实施方案中，本发明提供一种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物，其包含上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体和冷冻保存培养基。
在其他实施方案中，本发明提供了上文前述段落中的任一者中描述的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得冷冻保存培养基含有DMSO。
在其他实施方案中，本发明提供了上文前述段落中的任一者中描述的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得冷冻保存培养基含有7-10％ DMSO。
在其他实施方案中，本发明提供了一种上文前述段落中的任一者中描述的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物的冷冻保存制剂。
在一些实施方案中，使用本公开的方法扩增的CISH低或CISH低/PD-1低TIL是以药物组合物形式施用至患者。在一些实施方案中，药物组合物为CISH低或CISH低/PD-1低TIL于无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的CISH低或CISH低/PD-1低TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL是以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟。其他适合施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可施用任何适合剂量的CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL，平均约7.8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL，尤其在癌症为黑色素瘤的情况下。在一些实施方案中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约3×1010至约12×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约4×1010至约10×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约5×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约6×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，施用约7×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010个。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7.8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL，尤其在癌症为黑色素瘤的情况下。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个CISH低或CISH低/PD-1低TIL。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的数目为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013个。在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的数目在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的浓度小于例如药物组合物的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的浓度在药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的浓度在药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的量等于或少于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施方案中，提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的量超过0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
提供于本发明的药物组合物中的CISH低或CISH低/PD-1低TIL在广泛剂量范围内有效。准确剂量将取决于施用途径、化合物施用形式、待治疗受试者的性别和年龄、待治疗受试者的体重以及主治医师的偏好和经验。适当时也可使用CISH低或CISH低/PD-1低TIL的临床确定剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，例如CISH低或CISH低/PD-1低TIL的剂量将取决于所治疗的人类或哺乳动物、病症或疾患的严重程度、施用速率、活性药物成分的配置和开处方医师的判断。
在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL可以单一剂量施用。此类施用可通过例如静脉内注射的注射进行。在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL可以多次剂量施用。给药可为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。给药可为每月一次、每两周一次、一周一次或每隔一天一次。只要需要，可继续CISH低或CISH低/PD-1低TIL的施用。
在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013个。在一些实施方案中，TIL的有效剂量在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kg mg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。
在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL的有效剂量在1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg，或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg的范围内。
有效量的CISH低或CISH低/PD-1低TIL可通过施用具有类似效用的药剂的任一种公认模式，包括鼻内和透皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、非经肠、肌肉内、皮下、局部、通过移植或通过吸入，以单次或多次剂量施用。
V.治疗患者的方法
治疗方法始于原始TIL收集和TIL培养。此类方法均已描述于例如通过引用整体并入本文的Jin等人,J.Immunotherapy,2012,35(3):283-292的领域中。下文贯穿各个部分，包括实施例，描述了治疗方法的实施方案。
本发明的经扩增的CISH低或CISH低/PD-1低TIL可根据如本文图7中所描述或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述的方法的任何实施方案扩增，可用于治疗患有癌症的患者(例如，如Goff等人,J.Clinical Oncology,2016,34(20):2389-239以及补充内容中所描述，其通过引用全部并入本文)。在一些实施方案中，如先前描述从经切除转移性黑色素瘤保藏物生长TIL(参见通过引用整体并入本文的Dudley等人,J Immunother,2003,26:332-342)。
可通过针对表面标志物CD3、CD4、CD8、CCR7和CD45RA的流式细胞术(例如FlowJo)(BD BioSciences)以及通过本文所描述的任一种方法分析输注袋CISH低或CISH低/PD-1低TIL的冷冻保存样本的细胞表型。通过使用标准酶联免疫吸附分析技术测量血清细胞因子。血清IFN-γ的上升可定义为＞100pg/mL。
功效的量度可包括疾病控制率(DCR)以及总反应率(ORR)，如本领域已知以及本文所描述。
A.治疗癌症和其他疾病的方法
本文所描述的组合物和方法可用于治疗疾病的方法中。在一些实施方案中，它们用于治疗过度增生病症。它们也可用于治疗如本文和以下段落中所描述的其他病症。
在一些实施方案中，所述过度增生病症为癌症。在一些实施方案中，所述过度增生病症为实体肿瘤癌症。在一些实施方案中，所述实体肿瘤癌症选自由以下组成的组：神经胶母细胞瘤(GBM)、胃肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，所述过度增生病症为血液恶性病。在一些实施方案中，所述实体肿瘤癌症选自由以下组成的组：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述癌症为高突变癌症表型。高突变癌症广泛描述于Campbell等人,(Cell,171:1042-1056(2017)；出于所有目的通过引用整体并入本文)中。在一些实施方案中，高突变肿瘤包含每兆碱基(Mb)9至10个突变。在一些实施方案中，小儿高突变肿瘤包含每兆碱基(Mb)9.91个突变。在一些实施方案中，成人高突变肿瘤包含每兆碱基(Mb)9个突变。在一些实施方案中，增强的高突变肿瘤包含每兆碱基(Mb)10至100个突变。在一些实施方案中，增强的小儿高突变肿瘤包含每兆碱基(Mb)10至100个突变。在一些实施方案中，增强的成人高突变肿瘤包含每兆碱基(Mb)10至100个突变。在一些实施方案中，超高突变肿瘤包含每兆碱基(Mb)大于100个突变。在一些实施方案中，小儿超高突变肿瘤包含每兆碱基(Mb)大于100个突变。在一些实施方案中，成人超高突变肿瘤包含每兆碱基(Mb)大于100个突变。
在一些实施方案中，所述高突变肿瘤具有复制修复途径的突变。在一些实施方案中，所述高突变肿瘤具有复制修复相关DNA聚合酶的突变。在一些实施方案中，所述高突变肿瘤具有微卫星不稳定性。在一些实施方案中，所述超高突变肿瘤具有复制修复相关DNA聚合酶的突变并且具有微卫星不稳定性。在一些实施方案中，肿瘤的高突变与对免疫检查点抑制剂的反应相关。在一些实施方案中，高突变肿瘤对免疫检查点抑制剂治疗具有抗性。在一些实施方案中，高突变肿瘤可使用本发明的TIL治疗。在一些实施方案中，肿瘤的高突变是由环境因素(外在暴露)引起。例如，UV光可为恶性黑色素瘤中大量突变的主要原因(参见例如Pfeifer,G.P.,You,Y.H.和Besaratinia,A.(2005).Mutat.Res.571,19-31.；Sage,E.(1993).Photochem.Photobiol.57,163-174.)。在一些实施方案中，肿瘤的高突变可归因于直接突变原暴露而由烟草烟雾中大于60种的肺和喉肿瘤以及其他肿瘤致癌物引起(参见例如Pleasance,E.D.,Stephens,P.J.,O'Meara,S.,McBride,D.J.,Meynert,A.,Jones,D.,Lin,M.L.,Beare,D.,Lau,K.W.,Greenman,C等人,(2010).Nature 463,184-190)。在一些实施方案中，肿瘤的高突变是由已显示在广泛范围的癌症中引起C至T转变量增加的催化性多肽样脂蛋白元B mRNA编辑酶(APOBEC)家族成员的失调引起(参见例如Roberts,S.A.,Lawrence,M.S.,Klimczak,L.J.,Grimm,S.A.,Fargo,D.,Stojanov,P.,Kiezun,A.,Kryukov,G.V.,Carter,S.L.,Saksena,G等人,(2013).Nat.Genet.45,970-976)。在一些实施方案中，肿瘤的高突变是由缺陷性DNA复制修复引起，所述缺陷性DNA复制修复是由损害主要复制酶Pol3和Pold1所进行的校对的突变造成。在一些实施方案中，肿瘤的高突变是由与结肠直肠癌、子宫内膜癌和其他癌症的高突变相关的DNA错配修复缺陷引起(参见例如Kandoth,C.,Schultz,N.,Cherniack,A.D.,Akbani,R.,Liu,Y.,Shen,H.,Robertson,A.G.,Pashtan,I.,Shen,R.,Benz,C.C等人,(2013).Nature 497,67-73.；Muzny,D.M.,Bainbridge,M.N.,Chang,K.,Dinh,H.H.,Drummond,J.A.,Fowler,G.,Kovar,C.L.,Lewis,L.R.,Morgan,M.B.,Newsham,I.F.等人；(2012).Nature 487,330-337)。在一些实施方案中，DNA复制修复突变也发现于癌症易感综合征，例如组成性或双等位基因错配修复缺陷(constitutional or biallelic mismatch repair deficiency；CMMRD)、林奇综合征(Lynch syndrome)和聚合酶校对相关息肉病(PPAP)中。
在一些实施方案中，本发明包括一种用CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体治疗癌症的方法，其中所述癌症为高突变癌症。在一些实施方案中，本发明包括一种用CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体治疗癌症的方法，其中所述癌症为增强的高突变癌症。在一些实施方案中，本发明包括一种用CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体治疗癌症的方法，其中所述癌症为超高突变癌症。
在一些实施方案中，本发明包括用CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本公开的CISH低或CISH低/PD-1低TIL之前用非清髓性化学疗法预治疗。在一些实施方案中，所述非清髓性化学疗法为环磷酰胺60毫克/千克/天持续2天(在CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之前第27天和第26天)和氟达拉滨25毫克/平方米/天持续5天(在CISH低/PD-1低TIL输注之前第27天至第23天)。在一些实施方案中，所述非清髓性化学疗法为环磷酰胺60毫克/千克/天持续2天(在CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之前第27天和第26天)和氟达拉滨25毫克/平方米/天持续3天(在CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之前第27天至第25天)。在一些实施方案中，所述非清髓性化学疗法为环磷酰胺60毫克/千克/天持续2天(在CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之前第27天和第26天)，接着为氟达拉滨25毫克/平方米/天持续3天(在CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之前第25天至第23天)。在一些实施方案中，在根据本公开的非清髓性化学疗法和CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之后(第0天)，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2的静脉内输注以达到生理耐受。
1.患者的任选的淋巴细胞耗尽预调节
在一些实施方案中，本发明包括一种用经基因修饰的TIL群体治疗癌症的方法，所述经基因修饰的TIL群体已经由TALEN基因编辑通过以下进行基因修饰：将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中所述一种或多种TALE核酸酶包含针对作为CISH基因目标序列的SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地通过将编码一种或多种通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的TALE核酸酶的核酸(例如mRNA)引入TIL中，其中患者在输注根据本公开的此类TIL之前用非清髓性化学疗法预治疗。在一些实施方案中，本发明包括用于治疗已用非清髓性化学疗法预治疗的患者的癌症的CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体。在一些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体用于通过输注施用。在一些实施方案中，所述非清髓性化学疗法为环磷酰胺60毫克/千克/天持续2天(在TIL输注之前第27天和第26天)和氟达拉滨25毫克/平方米/天持续5天(在TIL输注之前第27天至第23天)。在一些实施方案中，所述非清髓性化学疗法为环磷酰胺60毫克/千克/天持续2天(在CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之前第27天和第26天)和氟达拉滨25毫克/平方米/天持续3天(在CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之前第27天至第25天)。在一些实施方案中，所述非清髓性化学疗法为环磷酰胺60毫克/千克/天持续2天(在CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之前第27天和第26天)，接着为氟达拉滨25毫克/平方米/天持续3天(在CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之前第25天至第23天)。在一些实施方案中，在根据本公开的非清髓性化学疗法和CISH低或CISH低/PD-1低TIL输注之后(第0天)，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2(阿地白介素，可以PROLEUKIN商购)的静脉内输注以达到生理耐受。在某些实施方案中，CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体是用于与IL-2组合治疗癌症，其中所述IL-2是在此类TIL群体之后施用。
实验发现表明，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，淋巴细胞耗尽通过消除调节性T细胞并且竞争免疫系统的组件(‘细胞因子库(cytokine sink)’)在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的TIL之前在患者身上采用淋巴细胞耗尽步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
一般来说，使用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式被称为马磷酰胺(mafosfamide))和其组合的施用实现淋巴细胞耗尽。此类方法描述于Gassner等人,CancerImmunol.Immunother.2011,60,75-85，Muranski等人,Nat.Clin.Pract.Oncol.,2006,3,668-681，Dudley等人,J.Clin.Oncol.,2008,26,5233-5239，和Dudley等人,J.Clin.Oncol.,2005,23,2346-2357中，所有文献通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，氟达拉滨是以0.5μg/mL至10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，氟达拉滨是以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，将氟达拉滨治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方案中，氟达拉滨是以10毫克/千克/天、15毫克/千克/天、20毫克/千克/天、25毫克/千克/天、30毫克/千克/天、35毫克/千克/天、40毫克/千克/天或45毫克/千克/天的剂量施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗是以35毫克/千克/天施用2-7天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗是以35毫克/千克/天施用4-5天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗是以25毫克/千克/天施用4-5天。
在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺获得浓度为0.5μg/mL至10μg/mL的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺获得浓度为1μg/mL的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方案中，将环磷酰胺治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方案中，环磷酰胺是以100毫克/平方米/天、150毫克/平方米/天、175毫克/平方米/天、200毫克/平方米/天、225毫克/平方米/天、250毫克/平方米/天、275毫克/平方米/天或300毫克/平方米/天的剂量施用。在一些实施方案中，环磷酰胺是静脉内(即i.v.)施用的。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗是以35毫克/千克/天施用2-7天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗是以250毫克/平方米/天静脉内施用4-5天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗是以250毫克/平方米/天静脉内施用4天。
在一些实施方案中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺一起施用至患者进行淋巴细胞耗尽。在一些实施方案中，历经4天以25毫克/平方米/天静脉内施用氟达拉滨并且以250毫克/平方米/天静脉内施用环磷酰胺。
在一些实施方案中，通过以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天来进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天来进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺两天和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨，并且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺两天和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨三天来进行淋巴细胞耗尽，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨，并且其中在总计三天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约50毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨，并且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约50毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以约25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天来进行淋巴细胞耗尽，其中在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约50毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨三天来进行淋巴细胞耗尽，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨，并且其中在总计三天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约50毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约20毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨，并且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约50毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以约20毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天来进行淋巴细胞耗尽，其中在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约50毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约20毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨三天来进行淋巴细胞耗尽，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨，并且其中在总计三天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约40毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约20毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨，并且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约40毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以约20毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天来进行淋巴细胞耗尽，其中在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约40毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约20毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨三天来进行淋巴细胞耗尽，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨，并且其中在总计三天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约40毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约15毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗尽，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨，并且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约40毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以约15毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天来进行淋巴细胞耗尽，其中在总计五天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以约40毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约15毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨三天来进行淋巴细胞耗尽，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨，并且其中在总计三天中进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天来进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，通过以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续一天来进行淋巴细胞耗尽。
在一些实施方案中，环磷酰胺是与美司钠(mesna)一起施用。在一些实施方案中，美司钠是以15mg/kg施用。在输注美司钠的一些实施方案中，并且如果连续输注，则历经24小时，伴随每个环磷酰胺剂量开始，美司钠可经大约2小时与环磷酰胺一起输注(第-5天和/或第-4天)，然后在剩余22小时以3毫克/千克/小时的速率输注。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括在向患者施用CISH低/PD-1低TIL之后当天开始用IL-2方案治疗患者的步骤。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括在与向患者施用CISH低/PD-1低TIL的同一天开始用IL-2方案治疗患者的步骤。
在一些实施方案中，所述淋巴细胞耗尽包含5天的预调节治疗。在一些实施方案中，天数指示为第-5天至-1天，或第0天至第4天。在一些实施方案中，所述方案包含第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的环磷酰胺。在一些实施方案中，所述方案包含第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的静脉内环磷酰胺。在一些实施方案中，所述方案包含第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的60mg/kg静脉内环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺是与美司钠一起施用。在一些实施方案中，所述方案还包含氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含第-5天至第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，所述方案还包含第-5天至第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。
在一些实施方案中，所述非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天的步骤。
在一些实施方案中，所述非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天的步骤。
在一些实施方案中，所述非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天的步骤。
在一些实施方案中，所述非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天的步骤。
在一些实施方案中，所述非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续一天的步骤。
在一些实施方案中，所述非清髓性淋巴细胞耗尽方案是根据下表施用：
表4：耗尽方案。
2.IL-2方案
在一些实施方案中，IL-2方案包含高剂量IL-2方案，其中所述高剂量IL-2方案包含阿地白介素或其生物类似物或变体，其在施用治疗性CISH低/PD-1低TIL群体的治疗有效部分之后当天开始静脉内施用，其中阿地白介素或其生物类似物或变体是每八小时使用15分钟团注静脉内输注以0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者体重)的剂量施用直至耐受，最大为14次剂量。在休止9天后，可重复此时程再施用14次剂量，最多总计28次剂量。在一些实施方案中，IL-2是以1、2、3、4、5或6次剂量施用。在一些实施方案中，IL-2是以至多6次剂量的最大剂量施用。
在一些实施方案中，IL-2方案包含递减IL-2方案。递减IL-2方案已描述于O'Day等人,J.Clin.Oncol.,1999,17,2752-61和Eton等人,Cancer,2000,88,1703-9，其公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，递减IL-2方案包含历经6小时静脉内施用18×106IU/m2，接着历经12小时静脉内施用18×106IU/m2，接着历经24小时静脉内施用18×106IU/m2，接着历经72小时静脉内施用4.5×106IU/m2。此治疗周期可每28天重复，持续最多四个周期。在一些实施方案中，递减IL-2方案包含第1天18,000,000IU/m2、第2天9,000,000IU/m2以及第3天和第4天4,500,000IU/m2。
在一些实施方案中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天的剂量施用聚乙二醇化IL-2。
在一些实施方案中，IL-2方案包括施用移植至抗体主链上的IL-2片段。在一些实施方案中，IL-2方案包括施用结合IL-2低亲和力受体的抗体细胞因子移植蛋白。在一些实施方案中，所述抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中所述抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施方案中，所述抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中IL-2分子为突变蛋白，并且其中所述抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施方案中，IL-2方案包括施用美国专利申请公开第US 2020/0270334 A1号中所描述的抗体，所述公开的公开内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，所述抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中IL-2分子为突变蛋白，其中所述抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞，并且其中抗体还包含选自由以下组成的组的IgG类重链和IgG类轻链：包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号中的SEQ ID NO:69的IgG类轻链和包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号中的SEQ ID NO:53的IgG类重链；包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号中的SEQ ID NO:37的IgG类轻链和包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号中的SEQ ID NO:21的IgG类重链；包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号中的SEQ ID NO:69的IgG类轻链和包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:21的IgG类重链；以及包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号中的SEQ ID NO:37的IgG类轻链和包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号中的SEQ IDNO:53的IgG类重链。
在一些实施方案中，将IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR1中，其中所述IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，将IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR2中，其中所述IL2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，将IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR3中，其中所述IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，将IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR1中，其中所述IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，将IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR2中，其中所述IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，将IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR3中，其中所述IL-2分子为突变蛋白。
IL-2分子的插入可在CDR的N端区处或附近，在CDR的中间区中，或在CDR的C端区处或附近。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL2序列不会移码CDR序列。在一些实施方案中，抗体细胞因子移植蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL-2序列置换CDR序列的全部或一部分。IL-2分子置换可在CDR的N端区处，在CDR的中间区中，或在CDR的C端区处或附近。IL-2分子置换可少至CDR序列或整个CDR序列的一个或两个氨基酸。
在一些实施方案中，IL-2分子直接移植至无肽接头的CDR中，其中在CDR序列与IL-2序列之间没有额外的氨基酸。在一些实施方案中，IL-2分子间接移植至具有肽接头的CDR中，其中CDR序列与IL-2序列之间存在一个或多个额外的氨基酸。
在一些实施方案中，本文所描述的IL-2分子为IL-2突变蛋白。在一些情况下，所述IL-2突变蛋白包含R67A取代。在一些实施方案中，所述IL-2突变蛋白包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号中的氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，所述IL-2突变蛋白包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号中的表1中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体细胞因子移植蛋白包含选自由以下组成的组的HCDR1：美国专利申请公开第2020/0270334 A1号的SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，所述抗体细胞因子移植蛋白包含选自由美国专利申请公开第2020/0270334 A1号的SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:16组成的组的HCDR1和选自由美国专利申请公开第2020/0270334 A1号的SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17组成的组的HCDR2。在一些实施方案中，所述抗体细胞因子移植蛋白包含选自由美国专利申请公开第2020/0270334 A1号的SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16组成的组的HCDR1、选自由美国专利申请公开第2020/0270334 A1号的SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17组成的组的HCDR2和选自由美国专利申请公开第2020/0270334 A1号的SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18以下组成的组的HCDR3。在一些实施方案中，所述抗体细胞因子移植蛋白包含VH区，其包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号的SEQ IDNO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体细胞因子移植蛋白包含重链，其包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体细胞因子移植蛋白包含美国专利申请公开第2020/0270334 A1号的IgG.IL2R67A.H1。在一些实施方案中，本文所描述的抗体细胞因子移植蛋白的抗体组分包含帕利珠单抗(palivizumab)的免疫球蛋白序列、框架序列或CDR序列。
在一些实施方案中，本文所描述的抗体细胞因子移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如但不限于阿地白介素或可比分子)长。
表5：示例性帕利珠单抗抗体-IL-2移植蛋白的序列。
3.额外的治疗方法
在其他实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用上文前述段落中的任一者中描述的治疗有效剂量的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用上文前述段落中的任一者中描述的治疗有效剂量的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其经修改以使得在分别施用上文前述段落中的任一者中描述的治疗有效剂量的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体和CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物之前，已向所述受试者施用非清髓性淋巴细胞耗尽方案。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其经修改以使得非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天的步骤。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其经修改以使得非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其经修改以使得非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续一天的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其经修改以使得非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天的步骤。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其经修改以进一步包括在向受试者施用TIL细胞后当天开始用高剂量IL-2方案治疗受试者的步骤。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其经修改以使得高剂量IL-2方案包含每八小时以15分钟团注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其经修改以使得癌症为实体肿瘤。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其经修改以使得癌症为黑色素瘤。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其经修改以使得癌症为小儿高突变癌症。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的CISH低或CISH低/PD-1低TIL的治疗性TIL群体，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者描述的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或上文前述段落中的任一者中描述的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得在向受试者施用上文前述段落中的任一者中描述的治疗有效剂量的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或上文前述段落中的任一者中描述的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物之前，已向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗尽方案。
在其他实施方案中，本发明提供上文任何前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续五天的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供上文任何前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供上文任何前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺和以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续一天的步骤。
在一些实施方案中，本发明提供上文任何前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得非清髓性淋巴细胞耗尽方案包含以60毫克/平方米/天的剂量施用环磷酰胺持续两天，接着以25毫克/平方米/天的剂量施用氟达拉滨持续三天的步骤。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以进一步包括在向患者施用TIL细胞之后当天开始用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得高剂量IL-2方案包含每八小时以15分钟团注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得癌症为实体肿瘤。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得癌症为黑色素瘤。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得癌症为高突变癌症。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物，其经修改以使得癌症为小儿高突变癌症。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体在治疗受试者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物。
在其他实施方案中，本发明提供上文前述段落中的任一者中描述的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或上文前述段落中的任一者中描述的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗尽方案，并且接着向受试者施用上文前述段落中的任一者中描述的治疗有效剂量的治疗性CISH低或CISH低/PD-1低TIL群体或上文前述段落中的任一者中描述的治疗有效剂量的CISH低或CISH低/PD-1低TIL组合物。
实施例
现参考以下实施例描述本文中涵盖的实施方案。这些实施例仅出于说明的目的提供并且本文涵盖的公开内容决不应理解为限于这些实施例，而应理解为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化形式。
实施例1：利用CISH基因敲除制备TIL
此实施例描述了利用CISH基因敲除制备肿瘤浸润淋巴细胞(CISH KO TIL)的程序。此培养基可用于制备本申请和实施例中所描述的TIL中的任一者。
用于CISH KO TIL扩增的方案
预扩增设置：在具有IL-2的CM1中从每个G-REX 10烧瓶6至8个肿瘤片段开始预REP培养，持续11天。将预REP TIL以35e6个细胞/小瓶冷冻保存在CS10冷冻培养基中并且保存在-80℃下直至使用。
预扩增TIL解冻：在TIL经冷冻保存的示例性情况中，将冷冻保存的TIL解冻并且在24孔板中以2e6个细胞/孔在含有IL-2(3000IU/mL)的CM1中静置两天。
T细胞活化：将细胞用板结合的抗CD3以300ng/ml的浓度活化另外两天。
电穿孔：TIL用编码CISH TALEN的mRNA、编码PD-1 TALEN的mRNA、编码CISH TALEN的mRNA+编码PD-1 TALEN的mRNA电穿孔，或非电穿孔。对于每次电穿孔，将一百万个活化的TIL用细胞穿孔缓冲液T4洗涤两次。将细胞重悬于每组含有4μg TALEN mRNA的50μl细胞穿孔T4缓冲液中。将细胞转移至1mm Gap电穿孔光析槽中并且使用BTX AgilePulse电穿孔。紧接着在电穿孔之后，将细胞重悬于1ml CM1培养基中并涂于24孔板孔中。将细胞在37℃下温育一小时，接着在30℃下温育15小时。
扩增：非电穿孔和CISH KO TALEN mRNA电穿孔的TIL(1e5个细胞)通过在OKT3(30ng/ml，Miltenyi Biotec)、IL-2(6000IU/ml，CellGenix)和经照射PBMC(30e6个细胞)中培养11天使用快速扩增方案(REP)扩增。
扩增后TIL收获：收获细胞并如下处理。
在通过蛋白质印迹分析评估CISH蛋白和/或通过流式细胞术评估PD-1表达之前，用抗CD3再刺激扩增后TIL过夜。NE＝非电穿孔；过表达CISH蛋白的293T细胞用作阳性对照；来自蛋白质印迹分析的密度测定法数据用于计算相对倍数变化；NE用于基线计算。
表6：扩增后TIL中双重KO的评估
实验中所用的编码CISH KO TALEN的序列和其在CISH基因中的对应切割位点的描述提供于下表7中。
表7：实验中所用的CISH KO TALE核酸酶和人类CISH基因中的TALE核酸酶切割位点的序列的描述
实验中所用的PD-1 KO TALEN和其在PD-1基因中的对应切割位点的描述提供于下表8中。
表8：实验中所用的PD-1 KO TALE核酸酶和人类PD-1基因中的TALE核酸酶切割位点的序列的描述
实验结果
单一和双重CISH KO的效率分别为75％和40％(图2)。在通过蛋白质印迹分析评估CISH蛋白之前，用抗CD3再刺激扩增后TIL过夜。NE＝非电穿孔；+Ctrl＝过表达CISH蛋白的293T细胞；来自蛋白质印迹分析的密度测定法数据用于计算相对倍数变化；NE用于基线计算。
PD-1 KO效率在双重CISH/PD-1 KO TIL中范围为50％至75％(图3)。在通过流式细胞术评估PD-1表达之前，用抗CD3再刺激扩增后TIL过夜。KO效率的负值指示PD-1表达增加。
CISH KO TIL的倍数扩增相对于对照降低(图4)。对扩增后TIL进行计数并且评估细胞存活率。通过扩增后TIL的总细胞计数除以扩增第0天接种的细胞数目来计算倍数扩增。
就T细胞谱系和记忆子集而言，CISH KO TIL的表型与非电穿孔对照类似(图5)。针对CD3、CD4、CD8、CD45RA和CCR7对扩增后TIL进行染色。在BD FACSCantoTM上获取细胞并通过FlowJo分析。
就分化和活化/耗竭而言，CISH KO TIL的表型与非电穿孔对照类似(图6)。针对CD3、CD28、CD56、DNAM、TIGIT和TIM-3对扩增后TIL进行染色。在BD FACSCantoTM上获取细胞并通过FlowJo分析。
实施例2：CISH基因敲除效率
实验设计
用正向和反向引物(CISH-F1和CISH-RI)使用PCR扩增从九对CISH基因敲除和非电穿孔TIL中分离的基因组DNA。
通过NGS测序分析PCR产物。
使用CRISPresso 2进行数据分析。
引物、切割位点和CISH序列
CISH正向引物-CTGCACTGCTGATACCCGAA(SEQ ID NO:173)
CISH反向引物-GGGGTACTGTCGGAGGTAGT(SEQ ID NO:174)
切割位点：
TGCGCCTAGTGACCCAGCACTGCCTGCTCCTCCACCAGCCACTGCTGTA(SEQ ID NO:168)
CISH目标位点序列：
CTGCACTGCTGATACCCGAAGCGACAGCCCCGATCCTGCTCCCACCCCGGCCCTGCCTATGCCTAAGG AGGATGCGCCTAGTGACCCAGCACTGCCTGCTCCTCCACCAGCCACTGCTGTACACCTAAAACTGGTGCAGCCCTTTGTACGCAGAAGCAGTGCCCGCAGCCTGCAACACCTGTGCCGCCTTGTCATCAACCGTCTGGTGGCCGACGTGGACTGCCTGCCACTGCCCCGGCGCATGGCCGACTACCTCCGACAGTACCC(SEQ ID NO:175)。三个加底线区域对应于CISH序列上的特定位置。
表9：结果-CISH KO效率。
提供上述实施例以向本领域普通技术人员提供如何制得并使用本发明的组合物、系统和方法的实施方案的完整公开和描述，并且并不旨在限制本发明人定义其发明的范围。本领域技术人员显而易见的进行本发明的上述模式修改旨在处于以下权利要求的范围内。本说明书中提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的技能水平。
所有标题和章节名称仅用于清晰和参考目的，而不应视为以任何方式具限制性。例如，本领域技术人员应了解根据本文所描述的本发明的精神和范围按需要组合来自不同标题和章节的各种方面的有用性。
本文中引用的所有参考文献通过引用整体并且出于所有目的并入本文，其引用程度如同每个个别出版物或专利或专利申请经特定且个别地指示出于所有目的通过引用整体并入本文一般。
对本领域技术人员来说将显而易见的是，可在不偏离本申请的精神和范围的情况下对其进行许多修改和改变。本文所描述的特定实施方案和实施例仅作为实例提供，并且本申请仅受所附权利要求的各项以及权利要求授权的等同物的全部范围限制。

Claims (76)

1.一种制备包含降低的CISH和任选地PD-1表达的经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括：
(a)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入所述TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对SEQ ID NO:175的核酸序列的TALE核酸酶，并且任选地引入一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶；以及
(b)扩增所述TIL。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将编码所述一种或多种第一TALE核酸酶的核酸引入所述TIL中包括电穿孔步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中编码所述一种或多种第一TALE核酸酶的所述一种或多种核酸为RNA并且所述RNA是通过电穿孔引入所述TIL中。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述引入步骤之前，通过在存在OKT-3的情况下将所述TIL在细胞培养基中培养约1-3天来激活TIL的步骤。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述引入步骤之后并且在所述扩增步骤之前，使所述TIL在包含IL-2的细胞培养基中静置约1天的步骤。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述引入步骤之前，冷冻保存所述TIL，接着将所述TIL解冻并且在包含IL-2的细胞培养基中培养约1-3天的步骤。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述静置步骤中所述IL-2的浓度为约3000IU/ml。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶各自由第一半TALE核酸酶和第二半TALE核酸酶构成。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一半TALE核酸酶是由与第一核酸酶催化域融合的第一TALE核酸结合域构成的第一融合蛋白，并且所述第二半TALE核酸酶是由与第二核酸酶催化域融合的第二TALE核酸结合域构成的第二融合蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一TALE核酸结合域具有第一氨基酸序列并且所述第二TALE核酸结合域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列不同于所述第二氨基酸序列。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述第一核酸酶催化域具有第一氨基酸序列并且所述第二核酸酶催化域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列与所述第二氨基酸序列相同。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述第一核酸酶催化域和所述第二核酸酶催化域都具有Fok-I的氨基酸序列。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中所述第一半TALE核酸酶和所述第二半TALE核酸酶能够形成异二聚体DNA切割复合物以实现所述编码CISH的基因中的目标位点处的DNA切割，并且其中所述编码CISH的基因中的所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述第一半TALE核酸酶识别位于所述编码CISH的基因中的所述目标位点中的第一位置处的第一半目标，并且所述第二半TALE核酸酶识别位于不与所述第一位置重叠的所述编码CISH的基因中的所述目标位点中的第二位置处的第二半目标。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述TALE核酸酶包含与选自由SEQID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述TALE核酸酶包含选自由SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的序列。
17.根据权利要求8至15中任一项所述的方法，其中所述第一半TALE核酸酶包含与SEQID NO:165具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且所述第二半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:167具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列并且所述第二半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述经扩增TIL包含足够的TIL以供向有需要的受试者施用治疗有效剂量的所述TIL。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述治疗有效剂量的所述经扩增TIL包含约1×109至约9×1010个TIL。
21.一种经扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体，其包含降低的CISH和任选地PD-1表达，所述经扩增TIL群体可通过权利要求1至20中任一项所述的方法获得。
22.一种识别并实现编码CISH的基因中的目标位点处的DNA切割的转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)，其中所述TALE核酸酶包含与选自由SEQ ID NO:165和SEQ IDNO:167组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求22所述的TALE核酸酶，其中所述TALE核酸酶包含选自由SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的序列。
24.根据权利要求22所述的TALE核酸酶，其中所述TALE核酸酶由第一半TALE核酸酶和第二半TALE核酸酶构成，并且其中所述第一半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:165具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且所述第二半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:167具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
25.根据权利要求24所述的TALE核酸酶，其中所述第一半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列并且所述第二半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。
26.根据权利要求24或25所述的TALE核酸酶，其中所述第一半TALE核酸酶是由与第一核酸酶催化域融合的第一TALE核酸结合域构成的第一融合蛋白，并且所述第二半TALE核酸酶是由与第二核酸酶催化域融合的第二TALE核酸结合域构成的第二融合蛋白。
27.根据权利要求26所述的TALE核酸酶，其中所述第一TALE核酸结合域具有第一氨基酸序列并且所述第二TALE核酸结合域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列不同于所述第二氨基酸序列。
28.根据权利要求26或27所述的TALE核酸酶，其中所述第一核酸酶催化域具有第一氨基酸序列并且所述第二核酸酶催化域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列与所述第二氨基酸序列相同。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的TALE核酸酶，其中所述第一核酸酶催化域和所述第二核酸酶催化域都具有Fok-I的氨基酸序列。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的TALE核酸酶，其中所述第一半TALE核酸酶和所述第二半TALE核酸酶能够形成异二聚体DNA切割复合物以实现所述编码CISH的基因中的目标位点处的DNA切割，并且其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的TALE核酸酶，其中所述第一半TALE核酸酶识别位于所述编码CISH的基因中的所述目标位点中的第一位置处的第一半目标，并且所述第二半TALE核酸酶识别位于不与所述第一位置重叠的所述编码CISH的基因中的所述目标位点中的第二位置处的第二半目标。
32.一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增至包含降低的CISH和任选地PD-1表达的治疗性TIL群体中的方法，所述方法包括：
(a)通过将从受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤片段来获得和/或接收来源于从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将所述第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-14天以获得所述第二TIL群体，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；
(d)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入所述TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对所述编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列，并且任选地将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶的核酸引入所述TIL中；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养从步骤(d)获得的所述TIL来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行；以及
(f)收获从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体，其中从步骤(e)至步骤(f)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；
(g)将从步骤(f)收获的TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(f)至(g)的所述转移是在不开放所述系统的情况下发生。
33.一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增至包含降低的CISH和任选地PD-1表达的治疗性TIL群体中的方法，所述方法包括：
(a)通过将从受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤片段来获得来源于从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-11天以获得所述第二TIL群体，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；
(d)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入所述TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对所述编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列，并且任选地将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶的核酸引入所述TIL中；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养从步骤(d)获得的所述TIL来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约7-11天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行；
(f)收获从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体，其中从步骤(e)至步骤(f)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；以及
(g)将从步骤(f)收获的治疗性TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(f)至(g)的所述转移是在不开放所述系统的情况下发生。
34.一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增至包含降低的CISH和任选地PD-1表达的治疗性TIL群体中的方法，所述方法包括：
(a)由手术切除、穿刺活检、芯针活检、小型活检或其他用于获得含有来自受试者的黑色素瘤的肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的手段获得和/或接收第一TIL群体，
(b)将所述第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-14天以获得所述第二TIL群体，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；
(d)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入所述TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对所述编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列，并且任选地引入一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养从步骤(d)获得的所述TIL来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约7-14天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行；
(f)收获从步骤(e)获得的所述治疗性TIL群体，其中从步骤(e)至步骤(f)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；以及
(g)将从步骤(f)收获的治疗性TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(f)至(g)的所述转移是在不开放所述系统的情况下发生。
35.一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增至包含降低的CISH和任选地PD-1表达的治疗性TIL群体中的方法，所述方法包括：
(a)从受试者切除肿瘤，所述肿瘤包含第一TIL群体，任选地由手术切除、穿刺活检、芯针活检、小型活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的手段进行；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-11天以获得所述第二TIL群体，并且其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；
(d)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入所述TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对所述编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列，并且任选地引入一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶；
(e)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养从步骤(d)获得的所述TIL来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约7-11天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行；
(f)收获从步骤(e)获得的所述第三TIL群体，其中从步骤(e)至步骤(f)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；以及
(g)将从步骤(f)收获的第三TIL群体转移至输注袋，其中从步骤(f)至(g)的所述转移是在不开放所述系统的情况下发生。
36.一种用于将经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增至包含降低的CISH和任选地PD-1表达的治疗性TIL群体中的方法，所述方法包括：
(a)通过将从受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤片段来获得来源于从所述受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将所述肿瘤片段添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和任选地OKT-3的细胞培养基中培养所述第一TIL群体来进行第一次扩增，以产生第二TIL群体，其中所述第一次扩增是在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3-14天以获得所述第二TIL群体，其中从步骤(b)至步骤(c)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；
(d)将编码一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码CISH的基因的第一转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入所述TIL中，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶包含针对所述编码CISH的基因中的目标位点的TALE核酸酶，其中所述目标位点包含SEQ ID NO:175的核酸序列，并且任选地引入一种或多种能够通过DNA切割选择性地灭活编码PD-1的基因的第二TALE核酸酶；
(d)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养从步骤(d)获得的所述TIL来进行第二次扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第二次扩增进行约4-6天以获得所述第三TIL群体，其中所述第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中所述第二次扩增是在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行；
(e)将所述第三TIL群体分成第一多个2-5个TIL亚群，其中至少1.0×109个TIL存在于每个亚群中，其中从步骤(d)至步骤(e)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；
(f)通过用额外的IL-2、任选地OKT-3补充每个TIL亚群的所述细胞培养基来进行所述第一多个TIL亚群的第三次扩增，以产生第二多个TIL亚群，其中所述第三次扩增进行约5-7天，其中每个亚群的所述第三次扩增是在提供第三透气表面区域的密闭容器中进行，并且其中从步骤(e)至步骤(f)的转变是在不开放所述系统的情况下发生；以及
(g)收获从步骤(f)获得的所述第二多个TIL亚群；以及
(h)将从步骤(g)收获的TIL亚群转移至一个或多个输注袋，其中从步骤(g)至(h)的转变。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使用冷冻保存工艺冷冻保存所述收获的TIL的步骤。
38.根据权利要求32至37中任一项所述的方法，其中编码所述一种或多种第一TALE核酸酶的所述一种或多种核酸为RNA。
39.根据权利要求32至38中任一项所述的方法，其中引入编码所述一种或多种第一TALE核酸酶的所述一种或多种核酸是通过电穿孔引入所述TIL中。
40.根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述引入步骤之前，通过在存在OKT-3的情况下将所述TIL在细胞培养基中培养约1-3天来激活TIL的步骤。
41.根据权利要求40所述的方法，其中OKT-3的浓度为约300ng/ml。
42.根据权利要求32至41中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述引入步骤之后并且在所述第二次扩增步骤之前，使所述TIL在包含IL-2的细胞培养基中静置约1天的步骤。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述静置步骤中所述IL-2的浓度为约3000IU/ml。
44.根据权利要求32至43中任一项所述的方法，其中所述方法还包括冷冻保存所述TIL，接着将所述TIL解冻并在包含IL-2的细胞培养基中培养约1-3天。
45.根据权利要求32至44中任一项所述的方法，其中步骤(a)至(g)是在约13天至约29天，任选地约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天或约25天内进行。
46.根据权利要求32至45中任一项所述的方法，其中编码所述一种或多种第一TALE核酸酶的所述一种或多种核酸为RNA，并且所述RNA是通过电穿孔引入所述TIL中。
47.根据权利要求32至46中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第一TALE核酸酶各自由第一半TALE核酸酶和第二半TALE核酸酶构成。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述第一半TALE核酸酶是由与第一核酸酶催化域融合的第一TALE核酸结合域构成的第一融合蛋白，并且所述第二半TALE核酸酶是由与第二核酸酶催化域融合的第二TALE核酸结合域构成的第二融合蛋白。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述第一TALE核酸结合域具有第一氨基酸序列并且所述第二TALE核酸结合域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列不同于所述第二氨基酸序列。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述第一核酸酶催化域具有第一氨基酸序列并且所述第二核酸酶催化域具有第二氨基酸序列，并且其中所述第一氨基酸序列与所述第二氨基酸序列相同。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中所述第一核酸酶催化域和所述第二核酸酶催化域都具有Fok-I的氨基酸序列。
52.根据权利要求47至51中任一项所述的方法，其中所述第一半TALE核酸酶和所述第二半TALE核酸酶能够形成异二聚体DNA切割复合物以实现所述目标位点处的DNA切割。
53.根据权利要求47至52中任一项所述的方法，其中所述第一半TALE核酸酶识别位于所述目标位点中的第一位置处的第一半目标，并且所述第二半TALE核酸酶识别位于不与所述第一位置重叠的所述目标位点中的第二位置处的第二半目标。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述TALE核酸酶包含与选自由SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述TALE核酸酶包含选自由SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:167组成的组的序列。
56.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述第一半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:165具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且所述第二半TALE核酸酶包含与SEQ ID NO:167具有至少70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述第一半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列并且所述第二半TALE核酸酶包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。
58.根据权利要求32至57中任一项所述的方法，其中所述收获的TIL包含足够的TIL以供向有需要的受试者施用治疗有效剂量的所述TIL。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述治疗有效剂量的所述TIL包含约1×109至约9×1010个TIL。
60.根据权利要求32至59中任一项所述的方法，其中所述APC包含外周血单核细胞(PBMC)。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述PBMC是以约1:25TIL:PBMC的比率补充。
62.根据权利要求32至61中任一项所述的方法，其中所述治疗性TIL群体在向所述受试者施用时提供增加的功效、增加的干扰素-γ(IFN-γ)产生、增加的多克隆性、增加的平均IP-10和/或增加的平均MCP-1。
63.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述IL-2在所述第一次扩增中在所述细胞培养基中是以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在。
64.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中在所述第二次扩增步骤中，所述IL-2是以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在并且所述OKT-3抗体是以约30ng/mL的初始浓度存在。
65.如权利要求36所述的方法，其中在所述第二次和/或第三次扩增步骤中，所述IL-2是以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在，并且任选地，所述OKT-3抗体是以约30ng/mL的初始浓度存在。
66.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中所述第一次扩增是使用透气容器进行。
67.如权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述第二次扩增是使用透气容器进行。
68.如权利要求36所述的方法，其中所述第二次和/或第三次扩增是使用透气容器进行。
69.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中第一细胞培养基还包含选自由以下组成的组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和其组合。
70.如权利要求32至35中任一项所述的方法，其中第二细胞培养基还包含选自由以下组成的组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和其组合。
71.如权利要求36所述的方法，其中步骤中(d)和/或(f)中的所述细胞培养基还包含选自由以下组成的组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和其组合。
72.如权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述第二次扩增的所述细胞培养基还包含选自由以下组成的组的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和其组合。
73.如权利要求32至35中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述第一次扩增和/或步骤(e)中的所述第二次扩增是在11天的时段内单独地进行。
74.一种包含降低的CISH和/或PD-1表达的经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体或包含TIL的组合物，所述TIL群体或包含TIL的组合物可通过权利要求1至20和32至73中任一项所述的方法获得。
75.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含降低的CISH和/或CISH和PD-1表达的经基因修饰的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的治疗性群体，其中经基因修饰的TIL的所述治疗性群体可通过权利要求1至20和32至73中任一项所述的方法获得。
76.根据权利要求75所述的治疗癌症的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤)、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
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