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CN117940557A - 制备经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在过继性细胞治疗中的应用 - Google Patents

制备经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在过继性细胞治疗中的应用 Download PDF

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CN117940557A
CN117940557A CN202280026986.2A CN202280026986A CN117940557A CN 117940557 A CN117940557 A CN 117940557A CN 202280026986 A CN202280026986 A CN 202280026986A CN 117940557 A CN117940557 A CN 117940557A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tils
population
til
amplification
days
Prior art date
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Pending
Application number
CN202280026986.2A
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English (en)
Inventor
张永亮
R·库巴斯
F·G·福格特
M·法尔迪
C·沙尔蒂尔库托
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Iovance Biotherapeutics Inc
Original Assignee
Iovance Biotherapeutics Inc
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Publication date
Application filed by Iovance Biotherapeutics Inc filed Critical Iovance Biotherapeutics Inc
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Abstract

本文提供用于使用经修饰的TIL治疗癌症的组合物和方法，其中经修饰的TIL包含与其细胞表面缔合的一种以上免疫调节剂(例如，细胞因子)。与TIL缔合的免疫调节剂提供局部免疫刺激作用，其可有利地增强患者接受者中的TIL存活率、增殖和/或抗肿瘤活性。因此，本文公开的组合物和方法提供有效癌症疗法。

Description

制备经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在过继性细胞 治疗中的应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月29日提交的美国临时申请第63/143,736号、2021年2月5日提交的美国临时申请第63/146,486号、2021年7月21日提交的美国临时申请第63/224,360号、2021年11月9日提交的美国临时申请第63/277,571号和2021年12月3日提交的美国临时申请第63/285,956号的优先权，它们均以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
利用通过快速扩增方案(REP)离体培养的TIL的过继性细胞疗法已在患有癌症的患者的宿主免疫抑制之后产生成功的过继性细胞疗法。然而，在一些情况下，经转移的TIL的存活率和抗肿瘤活性可在转移至患者后降低。
已研究施用支持性免疫刺激剂(例如，细胞因子)以增强T细胞疗法。然而，此类免疫刺激剂需要高全身性剂量，其可引起不期望的毒性。
因此，仍需要经改善的用于治疗癌症的TIL疗法。
发明内容
本文提供了使用经修饰的TIL治疗癌症的组合物和方法，其中，经修饰的TIL包含与其细胞表面缔合的一种以上免疫调节剂(例如，细胞因子)。与TIL缔合的免疫调节剂提供局部免疫刺激作用，其可有利地增强患者接受者中的TIL存活率、增殖和/或抗肿瘤活性。因此，本文公开的组合物和方法提供有效的癌症疗法。
一方面，本文提供了治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，可选地，其中，该患者或受试者已接受至少一种先前疗法，TIL的一部分为经修饰的TIL，使得该经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
一方面，本文提供了治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，该方法包括以下步骤：
(a)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，以产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)在施用(h)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
一方面，本文提供了治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，该方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，该方法包括以下步骤：
(a)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)在施用(h)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
一方面，本文提供了治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，该方法包括以下步骤：
(a)由手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自患者或受试者的癌症获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)在施用(h)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
另一方面，本文提供了治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，该方法包括以下步骤：
(a)自受试者或患者切除肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群体，可选地，通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自癌症获得含有肿瘤及TIL细胞的混合物的样本的其他方式进行；
(b)将肿瘤处理成多个肿瘤碎片并将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向患有癌症的受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)在施用(h)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
在其他方面，本文提供了治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，该方法包括以下步骤：
(a)由手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体；
(c)使第一TIL群体与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中进行第一TIL群体的初始扩增(或起始第一扩增(primingfirst expansion))，获得第二TIL群体，其中，第一细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3(抗CD3抗体)和可选的抗原呈递细胞(APC)，起始第一扩增进行1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速第二扩增，获得第三TIL群体；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和APC；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，快速第二扩增可在快速第二扩增开始之后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有癌症的受试者或患者施用治疗有效部分的第三TIL群体；以及
(h)在施用(g)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜结合的免疫调节组合物。
另一方面，本文提供了治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，其包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，该方法包括以下步骤：
(a)自受试者或患者的癌症切除肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群体，可选地，通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自癌症获得含有肿瘤及TIL细胞的混合物的样本的其他方式进行；
(b)将肿瘤破碎成肿瘤碎片；
(c)使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中进行第一TIL群体的初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第一细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3(抗CD3抗体)和可选的抗原呈递细胞(APC)，其中，起始第一扩增进行1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速第二扩增，获得第三TIL群体；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和APC；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，快速第二扩增可在快速第二扩增开始之后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有癌症的受试者或患者施用治疗有效部分的第三TIL群体；以及
(i)在施用(g)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
一方面，本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：
(a)通过将自肿瘤获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片来获得和/或接受来自从受试者的癌症切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)从步骤(a)中的第一TIL群体选择PD-l阳性TIL，获得富含PD-l的TIL群体；
(c)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第一细胞培养基中培养富含PD-l的TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增在具有第一透气表面区域的容器中进行，起始第一扩增进行约1至7天或约1至8天的第一时间段，获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(d)通过在包含IL-2、OKT-3和APC的第二培养基中培养第二TIL群体来进行快速第二扩增，产生治疗性TIL群体，其中，在快速第二扩增中添加的APC的数目为在步骤(b)中添加的APC的数目的至少两倍，快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得治疗性TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，快速第二扩增在具有第二透气表面区域的容器中进行；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，以及
(g)在该方法期间的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过将自肿瘤获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片来获得和或接受来自从受试者或患者的癌症切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(g)在步骤(f)中的转移至输注袋之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过将自肿瘤获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片来获得来自从受试者的癌症切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至步骤(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(g)在步骤(f)中的转移至输注袋之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
另一方面，本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)由手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从患者或受试者的癌症获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至步骤(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(g)在步骤(f)中的转移之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
一方面，本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)自受试者或患者的癌症切除肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群体，可选地，通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自癌症获得含有肿瘤及TIL细胞的混合物的样本的其他方式进行；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3天至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至步骤(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(g)在步骤(f)中的转移之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
在本文提供的方法的一些实施例中，第一扩增分为第一步骤和第二步骤，其中，所述方法还包括通过在含有IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增的第一步骤，产生自肿瘤碎片或样本脱出的TIL，将肿瘤碎片或样本中剩余的TIL与从肿瘤碎片或样本脱出的TIL分离，可选地，消化肿瘤碎片或样本以产生肿瘤消化物，通过在细胞培养基中培养肿瘤碎片或样本或肿瘤消化物中的剩余TIL来进行第一扩增的第二步骤，产生第二TIL群体。
一方面，本文提供了用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)由手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于从受试者或患者的癌症获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式获得和/或接受第一TIL群体；
(b)使第一TIL群体与第一细胞培养基接触；
(c)在第一细胞培养基中进行第一TIL群体的初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第一细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3(抗CD3抗体)和可选的抗原呈递细胞(APC)，起始第一扩增进行1至8天的时间段；
(d)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速第二扩增，获得第三TIL群体；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和APC，快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，快速第二扩增可在快速第二扩增开始之后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(e)收集第三TIL群体；以及
(f)在步骤(f)中的收集之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
一方面，本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)自受试者或患者的癌症切除肿瘤，该肿瘤包含第一TIL群体，可选地通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于获得含有肿瘤及TIL细胞的混合物的肿瘤样本的其他方式进行；
(b)将肿瘤破碎成肿瘤碎片；
(c)使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中进行第一TIL群体的初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第一细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3(抗CD3抗体)和可选的抗原呈递细胞(APC)，起始第一扩增进行1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速第二扩增，获得第三TIL群体；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和APC，快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，快速第二扩增可在快速第二扩增开始之后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；以及
(g)在步骤(f)中的收集之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
一方面，本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：
(a)通过将自肿瘤获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从受试者的癌症切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)通过在包含IL-2、可选的OKT-3和可选的包含抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约1至7天或约1至8天的第一时间段，获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(c)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段，获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；
(d)收集自步骤(c)获得的治疗性TIL群体；以及
(e)在步骤(d)中的收集之前或之后的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
在此方法的一些实施例中，步骤(b)中的细胞培养基还包含抗原呈递细胞(APC)，步骤(c)中的培养基中的APC的数目大于步骤(b)中的培养基中的APC的数目。
一方面，本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：
(a)通过在包含IL-2、可选的OKT-3和可选的抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，该第一TIL群体可通过将来自从受试者的癌症切除的肿瘤的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得；其中，起始第一扩增在具有第一透气表面区域的容器中进行，起始第一扩增进行约1至7天或约1至8天的第一时间段，获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(b)通过使第二TIL群体与第二TIL群体的具有额外的IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增中的APC的数目为步骤(a)中的APC的数目的至少两倍，快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，快速第二扩增在具有第二透气表面区域的容器中进行；
(c)收集自步骤(b)获得的治疗性TIL群体；以及
(d)在步骤(c)中的收集之前或之后的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
一方面，本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：
(a)通过在包含IL-2、可选的OKT-3和可选的包含抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约1至7天或约1至8天的第一时间段，获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(b)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段，获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；
(c)收集自步骤(b)获得的治疗性TIL群体；以及
(d)在步骤(c)中的收集之前或之后的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
在此方法的一些实施例中，步骤(a)中的细胞培养基还包含抗原呈递细胞(APC)，其中，步骤(c)中的培养基中的APC的数目大于步骤(b)中的培养基中的APC的数目。
在本文提供的方法的一些实施例中，起始第一扩增分为第一步骤和第二步骤，其中，所述方法还包括通过在含有IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增的第一步骤，产生从肿瘤碎片或样本脱出的TIL，将肿瘤碎片或样本中剩余的TIL与自肿瘤碎片或样本脱出的TIL分离，可选地，消化肿瘤碎片或样本以产生肿瘤消化物，通过在细胞培养基中培养肿瘤碎片或样本或肿瘤消化物中的剩余TIL来进行起始第一扩增的第二步骤，产生第二TIL群体。
一方面，本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：
(a)通过将肿瘤样本在包含IL-2的第一细胞培养基中培养约3天来获得和/或接受来自肿瘤样本的第一TIL群体，该肿瘤样本由来自受试者的癌症的肿瘤的一次以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或、针吸活体组织切片获得；
(b)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增在具有第一透气表面区域的容器中进行，起始第一扩增进行约7或8天的第一时间段，获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(c)通过用额外的IL-2、OKT-3和APC补充第二TIL群体的第二细胞培养基来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，在快速第二扩增中添加的APC的数目为在步骤b)中添加的APC的数目的至少两倍，快速第二扩增进行约11天的第二时间段，获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，快速第二扩增在具有第二透气表面区域的容器中进行；
(d)收集自步骤(c)获得的治疗性TIL群体；
(e)将来自步骤(d)的所收集的TIL群体转移至输注袋；以及
(f)在步骤(e)中的转移至输注袋之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
另一方面，本文提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：
(a)通过将肿瘤样本在包含IL-2的第一细胞培养基中培养约3天来获得和/或接受来自肿瘤样本的第一TIL群体，该肿瘤样本由来自受试者的癌症的肿瘤的一次以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或、针吸活体组织切片获得；
(b)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约7或8天的第一时间段，获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(c)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的第三细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约11天的第二时间段，获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；
(d)收集自步骤(c)获得的治疗性TIL群体；以及
(e)在步骤(f)中的收集之前或之后的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
在本文提供的方法的一些实施例中，癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
一方面，本文提供了扩增T细胞的方法，其包括：
(a)通过培养第一T细胞群体以实现生长及启动第一T细胞群体的活化来进行自供体获得的第一T细胞群体的起始第一扩增；
(b)在步骤(a)中启动的第一T细胞群体的活化开始衰减之后，通过培养第一T细胞群体以实现生长及增强第一T细胞群体的活化来进行第一T细胞群体的快速第二扩增，获得第二T细胞群体；
(c)收集第二T细胞群体；以及
(d)在步骤(c)中的收集之前或之后的任何时间修饰T细胞的一部分，使得经修饰的T细胞中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
另一方面，本文提供了扩增T细胞的方法，其包括：
(a)通过培养第一T细胞群体以实现生长及启动第一T细胞群体的活化来进行来自肿瘤样本的第一T细胞群体的起始第一扩增，该肿瘤样本自供体中的肿瘤的一次以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或针吸活体组织切片获得；
(b)在步骤(a)中启动的第一T细胞群体的活化开始衰减之后，通过培养第一T细胞群体以实现生长及增强第一T细胞群体的活化来进行第一T细胞群体的快速第二扩增，获得第二T细胞群体；
(c)收集第二T细胞群体；以及
(d)在步骤(e)中的收集之前或之后的任何时间修饰T细胞的一部分，使得经修饰的T细胞中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
一方面，本文提供了扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法，该方法包括以下步骤：
(a)自患者的外周血获得外周血单核细胞(PBMC)的样本；
(b)将所述PBMC在包含第一细胞培养基的培养物中培养选自如下的时间段：约9天、约10天、约11天、约12天、约13天以及约14天，从而实现来自所述PBMC的外周血淋巴细胞(PBL)的扩增，第一细胞培养基具有IL-2、抗CD3/抗CD28抗体和第一抗生素组合；
(c)自步骤(b)中的培养物收集PBL；以及
(d)在步骤(c)中的收集之前或之后的任何时间修饰PBL的一部分，使得经修饰的PBL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
在一些实施例中，患者已用依鲁替尼(ibrutinib)或另一种白介素-2诱导型T细胞激酶(ITK)抑制剂预治疗。在某些实施例中，患者对用依鲁替尼或另一种ITK抑制剂的治疗而言是难治性的。
在一些实施例中，免疫调节组合物包含一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白，所述膜锚定的免疫调节融合蛋白各自包含一种以上免疫调节剂和细胞膜锚部分。
在示例性实施例中，一种以上免疫调节剂包含一种以上细胞因子。在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-2。在一些实施例中，IL-2为人IL-2。在示例性实施例中，人IL-2具有SEQ ID NO：272的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-12。在某些实施例中，IL-12包含连接至人IL-12p40亚基的人IL-12p35亚基。在某些实施例中，人IL-12p35亚基具有SEQ ID NO：267的氨基酸序列，人IL-12p40亚基具有SEQ ID NO：268的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-15。在一些实施例中，IL-15为人IL-15。在示例性实施例中，人IL-15具有SEQ ID NO：258的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-18。在一些实施例中，IL-18为人IL-18。在某些实施例中，人IL-18具有SEQ ID NO：269或SEQ ID NO：270的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-21。在某些实施例中，IL-21为人IL-21。在一些实施例中，人IL-21具有SEQ ID NO：251的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-15和IL-21。在一些实施例中，IL-15为人IL-15，IL-21为人IL-21。在某些实施例中，人IL-15具有SEQ ID NO：258的氨基酸序列，人IL-21具有SEQ ID NO：271的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上免疫调节剂包含CD40激动剂。在某些实施例中，CD40激动剂为抗CD40结合结构域或CD40L。在示例性实施例中，CD40激动剂为包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的CD40结合结构域。在一些实施例中，CD40结合结构域的VH和VL选自以下：a)具有SEQ ID NO：274的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：275的氨基酸序列的VL；b)具有SEQ ID NO：277的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的VL；c)具有SEQ ID NO：280的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：281的氨基酸序列的VL；以及d)具有SEQ ID NO：283的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：284的氨基酸序列的VL。在示例性实施例中，CD40结合结构域为scFv。
在一些实施例中，CD40激动剂为具有SEQ ID NO：273的氨基酸序列的人CD40L。
在一些实施例中，一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端独立地根据下式：S-IA-L-C，式中，S为信号肽，IA为免疫调节剂，L为接头，C为细胞膜锚部分。
在一些实施例中，细胞膜锚部分包含CD8a跨膜-胞内结构域、B7-1跨膜结构域、B7-2跨膜结构域或CD8a跨膜结构域。在示例性实施例中，细胞膜锚部分包含细胞因子B7-1跨膜结构域。在一些实施例中，细胞膜锚部分具有SEQ ID NO：239的氨基酸序列。
在一些实施例中，免疫调节组合物包含两种或更多种不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白，其中，不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白中的每一种各自包含不同的免疫调节剂。在一些实施例中，不同的免疫调节剂选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF、GCSF或它们的变体，以及CD40激动剂。在一些实施例中，不同的免疫调节剂选自：IL-12和IL-15、IL-15和IL-18、IL-15和IL-21、CD40L和IL-15、IL-15和IL-21，以及IL-2和IL-12。
在一些实施例中，经修饰的TIL包含第一膜锚定的免疫调节融合蛋白和第二膜锚定的免疫调节融合蛋白。
在一些实施例中，第一膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-15，第二膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-21。
在示例性实施例中，第一膜锚定的免疫调节融合蛋白和第二膜锚定的免疫调节融合蛋白的表达由经修饰的TIL中的NFAT启动子控制。
在示例性实施例中，一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端独立地根据下式：S-IA-L-C，式中，S为信号肽，IA为免疫调节剂，L为接头，C为细胞膜锚部分。在一些实施例中，IA为细胞因子。在示例性实施例中，IA选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。在一些实施例中，IA为IL-2。在某些实施例中，IA为IL-12。在一些实施例中，IA为IL-15。在某些实施例中，IA为IL-21。
例如，一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端独立地根据下式：S1-IA1-L1-C1-L2-S2-IA2-L3-C2，式中，S1和S2各自独立地为信号肽，IA1和IA2各自独立地为免疫调节剂，L1-L3各自独立地为接头，C1和C2各自独立地为细胞膜锚部分。在一些实施例中，S1与S2相同。在某些实施例中，C1与C2相同。在一些实施例中，L2为可裂解接头。在示例性实施例中，L2为弗林蛋白酶(furin)可裂解接头。在一些实施例中，IA1和IA2各自独立地为细胞因子。
在一些实施例中，IA1和IA2各自独立地选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。在一些实施例中，IA1和IA2各自独立地选自IL-2和IL-12，其限制条件为IA1和IA2中的一个为IL-2，另一个为IL-12。在一些实施例中，IA1和IA2各自独立地选自：IL-15和IL-21，其限制条件为IA1和IA2中的一个为IL-15，另一个为IL-21。
在某些实施例中，修饰包括将编码融合蛋白的异源核酸引入TIL的一部分中并在经修饰的TIL的表面上表达融合蛋白。
在某些实施例中，修饰包括将编码融合蛋白之异源核酸引入TIL的一部分中并在经修饰的TIL的表面上表达融合蛋白。在一些实施例中，使用选自以下的一种以上方法将异源核酸引入经修饰的TIL的基因组中：CRISPR方法、TALE方法、锌指方法和它们的组合。
在一些实施例中，免疫调节组合物包含融合蛋白，该融合蛋白包含连接至TIL表面抗原结合结构域的一种以上免疫调节剂。在一些实施例中，一种以上免疫调节剂包含一种以上细胞因子。在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-12。在某些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-15。在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-21。在某些实施例中，TIL表面抗原结合结构域包含抗体重链可变结构域和轻链可变结构域。在一些实施例中，TIL表面抗原结合结构域包含抗体或其片段。在一些实施例中，TIL表面抗原结合结构域对以下TIL表面抗原中的一种以上具有亲和力：CD45、CD4、CD8、CD3、CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD25、CD127、CD19、CD20、CD22、HLA-DR、CD197、CD38、CD27、CD196、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CD84、CD229、CCR1、CCR5、CCR4、CCR6、CCR8、CCR10、CD 16、CD56、CD 137、OX40或GITR。在某些实施例中，修饰包括将融合蛋白与TIL的一部分在允许融合蛋白与TIL的一部分结合的条件下孵育。
在一些实施例中，免疫调节组合物包含纳米颗粒，该纳米颗粒包含多种免疫调节剂。在一些实施例中，多种免疫调节剂通过可降解接头共价连接在一起。在某些实施例中，纳米颗粒包含在纳米颗粒表面上的至少一种聚合物、阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。在某些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-12。在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-15。在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-21。在一些实施例中，纳米颗粒为脂质体、蛋白纳米凝胶、核苷酸纳米凝胶、聚合物纳米颗粒或固态纳米颗粒。在一些实施例中，纳米颗粒为纳米凝胶。在某些实施例中，纳米颗粒还包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域结合以下抗原中的一种以上：CD45、CDlla(整合素α-L)、CD18(整合素β-2)、CD1lb、CD1lc、CD25、CD8或CD4。在一些实施例中，修饰包括将免疫调节组合物连接至TIL的一部分的表面。
在本文提供的方法的某些实施例中，对来自第一扩增的TIL或来自第二扩增的TIL或其两者进行修饰。在某些实施例中，对来自起始第一扩增的TIL或来自快速第二扩增的TIL或其两者进行修饰。
在本文提供的方法的一些实施例中，在第一扩增之后并在第二扩增之前进行修饰。在一些实施例中，在起始第一扩增之后并在快速第二扩增之前进行修饰，或在这两个时间点时进行修饰。在某些实施例中，在第二扩增之后进行修饰。在一些实施例中，在快速第二扩增之后进行修饰。在一些实施例中，在收集之后进行修饰。
在某些实施例中，第一扩增进行约11天的时间段。在一些实施例中，起始第一扩增进行约11天的时间段。
在本文提供的方法的一些实施例中，在第一扩增中，IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于细胞培养基中。在某些实施例中，IL-2在起始第一扩增中的细胞培养基中以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在。
在一些实施例中，在第二扩增步骤中，IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在且OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。在一些实施例中，在快速第二扩增步骤中，IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在且OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
在一些实施例中，使用透气容器进行第一扩增。在某些实施例中，使用透气容器进行起始第一扩增。在一些实施例中，使用透气容器进行第二扩增。在某些实施例中，使用透气容器进行快速第二扩增。
在本文提供的方法的一些实施例中，第一扩增的细胞培养基还包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和它们的组合。在某些实施例中，起始第一扩增的细胞培养基还包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和它们的组合。在一些实施例中，第二扩增的细胞培养基还包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和它们的组合。在某些实施例中，快速第二扩增的细胞培养基还包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和它们的组合。
在本文提供的治疗方法的一些实施例中，方法还包括在向患者施用TIL之前用非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案治疗患者的步骤。在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨(fludarabine)三天。在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。在某些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨一天。在某些实施例中，将环磷酰胺与美司钠(mesna)一起施用。
在本文提供的治疗方法的一些实施例中，方法还包括在向患者施用TIL之后第二天开始用IL-2方案治疗患者的步骤。在本文提供的治疗方法的一些实施例中，方法还包括在向患者施用TIL的同一天开始用IL-2方案治疗患者的步骤。在一些实施例中，IL-2方案为包含600,000或720,000IU/kg阿地白介素(aldesleukin)或其生物类似物或变体的高剂量IL-2方案，其以每八小时一次15分钟推注的静脉内输注形式施用直至耐受。
在本文提供的方法的一些实施例中，施用治疗有效的TIL群体，该治疗有效的TIL群体包含约2.3×1010至约13.7×1010个TIL。
在本文提供的方法的一些实施例中，起始第一扩增和快速第二扩增进行21天以下的时间段。在一些实施例中，起始第一扩增和快速第二扩增进行16或17天以下的时间段。在某些实施例中，起始第一扩增进行7或8天以下的时间段。在一些实施例中，快速第二扩增进行11天以下的时间段。
在本文提供的方法的一些实施例中，步骤(c)中的第一扩增和步骤(d)中的第二扩增各自单独地在11天的时间段内进行。在本文提供的方法的一些实施例中，步骤(a)至(f)进行约10天至约22天。
在本文提供的方法的一些实施例中，经修饰的TIL还包含基因修饰，该基因修饰导致至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达的沉默或减少。在一些实施例中，一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。在某些实施例中，一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ和PKA。
在一些实施例中，经修饰的TIL还包含基因修饰，该基因修饰导致至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达的增强，该一种以上免疫检查点基因选自：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。在某些实施例中，使用可编程核酸酶进行基因修饰，该可编程核酸酶介导一种以上免疫检查点基因处的双链或单链断裂的产生。在一些实施例中，使用选自如下的一种以上方法进行基因修饰：CRISPR方法、TALE方法、锌指方法和它们的组合。在某些实施例中，使用CRISPR方法进行基因修饰。在一些实施例中，CRISPR方法为CRISPR/Cas9方法。在某些实施例中，使用TALE方法进行基因修饰。在一些实施例中，使用锌指方法进行基因修饰。
在一些实施例中，经修饰的TIL被修饰以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白，其中，各融合蛋白包含一种以上免疫调节剂和细胞膜锚部分。
在示例性实施例中，一种以上免疫调节剂包含一种以上细胞因子。在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-2。在一些实施例中，IL-2为人IL-2。在示例性实施例中，人IL-2具有SEQ ID NO：272的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-12。在某些实施例中，IL-12包含连接至人IL-12p40亚基的人IL-12p35亚基。在某些实施例中，人IL-12p35亚基具有SEQ ID NO：267的氨基酸序列，人IL-12p40亚基具有SEQ ID NO：268的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-15。在一些实施例中，IL-15为人IL-15。在示例性实施例中，人IL-15具有SEQ ID NO：258的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-18。在一些实施例中，IL-18为人IL-18。在某些实施例中，人IL-18具有SEQ ID NO：269或SEQ ID NO：270的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-21。在某些实施例中，IL-21为人IL-21。在一些实施例中，人IL-21具有SEQ ID NO：271的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上细胞因子包括IL-15和IL-21。在一些实施例中，IL-15为人IL-15，IL-21为人IL-21。在某些实施例中，人IL-15具有SEQ ID NO：258的氨基酸序列，人IL-21具有SEQ ID NO：271的氨基酸序列。
在一些实施例中，一种以上免疫调节剂包含CD40激动剂。在某些实施例中，CD40激动剂为抗CD40结合结构域或CD40L。在示例性实施例中，CD40激动剂为包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的CD40结合结构域。在一些实施例中，CD40结合结构域的VH和VL选自：a)具有SEQ ID NO：274的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：275的氨基酸序列的VL；b)具有SEQ ID NO：277的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：278的氨基酸序列的VL；c)具有SEQ ID NO：280的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：281的氨基酸序列的VL；和d)具有SEQ ID NO：283的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：284的氨基酸序列的VL。在示例性实施例中，CD40结合结构域为scFv。
在一些实施例中，CD40激动剂为具有SEQ ID NO：273的氨基酸序列的人CD40L。在一些实施例中，膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端根据下式：S-IA-L-C，式中，S为信号肽，IA为免疫调节剂，L为接头，C为细胞膜锚部分。
在一些实施例中，细胞膜锚部分包含CD8a跨膜-胞内结构域、B7-1跨膜结构域、B7-2跨膜结构域或CD8a跨膜结构域。在示例性实施例中，细胞膜锚部分包含B7-1跨膜结构域。在一些实施例中，细胞膜锚部分具有SEQ ID NO：239的氨基酸序列。
在一些实施例中，免疫调节组合物包含两种或更多种不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白，其中，不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白中的每一种各自包含不同的免疫调节剂。在一些实施例中，不同的免疫调节剂选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF、GCSF或它们的变体，以及CD40激动剂。在一些实施例中，不同的免疫调节剂选自：IL-12和IL-15、IL-15和IL-18、CD40L、IL-15和IL-21，和IL-15，以及IL-2和IL-12。
在一些实施例中，经修饰的TIL通过用编码融合蛋白的核酸转染TIL来修饰以在细胞表面上瞬时表达融合蛋白，该融合蛋白包含一种以上免疫调节剂和细胞膜锚部分。在一些实施例中，核酸为RNA。在一些实施例中，RNA为mRNA。在一些实施例中，通过电穿孔用mRNA转染TIL。在一些实施例中，在第一扩增之后并在第二扩增之前通过电穿孔用mRNA转染TIL。在一些实施例中，在第一扩增之前通过电穿孔用mRNA转染TIL。在一些实施例中，该方法还包括：在用mRNA转染TIL之前，通过用抗CD3激动剂孵育来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂为OKT-3。在一些实施例中，在用mRNA转染TIL之前，通过用抗CD3激动剂孵育TIL与约1至3天来活化TIL。
在一些实施例中，经修饰的TIL通过使用微流体装置暂时性破坏TIL的细胞膜来用编码融合蛋白的核酸转染，从而实现核酸的转染。
在一些实施例中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替APC。在一些实施例中，aAPC包括表达HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和CD58的细胞。在一些实施例中，aAPC包括MOLM-14细胞。在一些实施例中，aAPC包括MOLM-13细胞。在一些实施例中，aAPC包括MOLM-14细胞，该MOLM-14细胞内源性表达HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和CD58。在一些实施例中，aAPC包括MOLM-14细胞，该MOLM-14细胞内源性表达HLA-A/B/C、CD64、CD80、ICOS-L和CD58，该MOLM-14细胞经永久性基因编辑以表达CD86。在一些实施例中，用一种以上病毒载体转导MOLM-14细胞，其中，该一种以上病毒载体包含编码CD86的核酸序列和编码4-1BBL的核酸序列，MOLM-14细胞表达CD86和4-1BBL。在一些实施例中，aAPC经瞬时性基因编辑以在细胞表面上瞬时表达包含免疫调节融合蛋白的免疫调节组合物。在一些实施例中，aAPC在细胞表面上瞬时表达免疫调节融合蛋白，该融合蛋白包含与细胞因子融合的膜锚。在一些实施例中，aAPC在细胞表面上瞬时表达与选自如下的细胞因子融合的膜锚：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15和IL-21。在一些实施例中，aAPC在细胞表面上瞬时表达与选自如下的细胞因子融合的膜锚：IL-2、IL-12、IL-15和IL-21。在一些实施例中，aAPC在细胞表面上瞬时表达与选自如下的细胞因子融合的膜锚：IL-12、IL-15和IL-21。
在一些实施例中，经修饰的TIL经基因修饰以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白，该一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白各自包含一种以上免疫调节剂和细胞膜锚部分。在一些实施例中，一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-2。在某些实施例中，一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-15。在示例性实施例中，一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-18。在一些实施例中，一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-21。
在某些实施例中，经修饰的TIL包含第一膜锚定的免疫调节融合蛋白和第二膜锚定的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，第一膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-15，第二膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-21。在一些实施例中，第一膜锚定的免疫调节融合蛋白和第二免疫调节融合蛋白的表达由经修饰的TIL中的NFAT启动子控制。
在一些实施例中，一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端独立地根据下式：S-IA-L-C，式中，S为信号肽，IA为免疫调节剂，L为接头，C为细胞膜锚部分。在一些实施例中，IA为细胞因子。在示例性实施例中，IA选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。在一些实施例中，IA为IL-2。在某些实施例中，IA为IL-12。在一些实施例中，IA为IL-15。在某些实施例中，IA为IL-21。在一些实施例中，L为CD8a跨膜-胞内结构域、B7-1跨膜结构域、B7-2跨膜结构域或CD8a跨膜结构域。在某些实施例中，L为B7-1跨膜结构域。在一些实施例中，L具有SEQ ID NO：239的氨基酸序列。
在示例性实施例中，一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端独立地根据下式：S1-IA1-L1-C1-L2-S2-IA2-L3-C2，式中，S1和S2各自独立地为信号肽，IA1和IA2各自独立地为免疫调节剂，L1-L3各自独立地为接头，C1和C2各自独立地为细胞膜锚部分。在一些实施例中，S1与S2相同。在示例性实施例中，C1与C2相同。在一些实施例中，L2为可裂解接头。在某些实施例中，L2为弗林蛋白酶可裂解接头。
在一些实施例中，IA1和IA2各自独立地为细胞因子。在一些实施例中，IA1和IA2各自独立地选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。在一些实施例中，IA1和IA2各自独立地选自IL-2和IL-12，其限制条件为IA1和IA2中的一个为IL-2，另一个为IL-12。在一些实施例中，IA1和IA2各自独立地选自：IL-15和IL-21，其限制条件为IA1和IA2中的一个为IL-15，另一个为IL-21。
在示例性实施例中，C1和C2各自独立地为CD8a跨膜-胞内结构域、B7-1跨膜结构域、B7-2跨膜结构域或CD8a跨膜结构域。在一些实施例中，C1和C2各自为B7-1跨膜结构域。在一些实施例中，C1和C2各自具有SEQ ID NO：239的氨基酸序列。
在某些实施例中，经修饰的TIL在NFAT启动子的控制下表达一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，经修饰的TIL用逆转录病毒载体转导以表达一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，经修饰的TIL用慢病毒载体转导以表达一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白。
附图说明
图1：示例性Gen 2(过程2A)图表提供了步骤A至F的概述。
图2A至图2C：用于TIL制造的Gen 2(过程2A)的实施例的过程流程图。
图3：显示冷冻保存的TIL示例性制造过程(约22天)的实施例的图示。
图4：显示Gen 2(过程2A，即，用于TIL制造的22天过程)的实施例的图。
图5：过程1C和用于TIL制造的Gen 2(过程2A)的示例性实施例的步骤A至F的比较表。
图6：过程1C的实施例和用于TIL制造的Gen 2(过程2A)的实施例的详细比较。
图7：示例性Gen 3型TIL制造过程。
图8A至图8D：A)显示2A过程(约22天的过程)与用于TIL制造的Gen 3过程(约14天至16天的过程)的实施例之间的比较。B)示例性Gen 3过程图表提供了步骤A至F的概述(约14天至16天的过程)。C)提供三种示例性Gen 3过程的图表，概述了三种过程变型中每一种的步骤A至F(约14天或16天的过程)。D)示例性经修改的类Gen 2过程，提供了步骤A至F的概述(约22天的过程)。
图9：提供Gen 2(过程2A)与Gen 3过程之间的可比较性的实验流程图。
图10：显示各种Gen 2(过程2A)与Gen 3.1过程实施例之间的比较。
图11：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3.0过程的实施例的各种特征的表。
图12：Gen 3过程(称为Gen 3.1)的实施例的培养基条件的概述。
图13：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3.0过程的实施例的各种特征的表。
图14：比较Gen 2和Gen 3.0过程的实施例的各种特征的表。
图15：提供所描述的扩增过程的各种实施例中的培养基用途的表。
图16：Gen 3过程(16天的过程)的示例性实施例的示意图。
图17：使用Gen 3扩增平台扩增来自造血系统恶性肿瘤的T细胞的方法的示例性实施例的示意图。
图18：提供结构I-A和I-B。圆柱体指单独的多肽结合结构域。结构I-A和I-B包含三个线性连接的来源于例如4-1BBL或结合4-1BB的抗体的TNFRSF结合结构域，其折叠形成三价蛋白，该三价蛋白然后通过IgG1-Fc(包含CH3和CH2结构域)与第二三价蛋白连接，该IgG1-Fc随后通过二硫键(小长椭圆形)将两个三价蛋白连接在一起，从而稳定结构并提供能够将六个受体的胞内信号传导结构域与信号蛋白集合在一起以形成信号传导复合体的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合结构域可为包含例如由接头连接的VH和VL链的scFv结构域，该接头可包含亲水性残基和提供柔性的Gly与Ser序列以及提供溶解性的Glu与Lys。
图19：Gen 3过程(16天的过程)的示例性实施例的示意图。
图20：提供Gen 3.1过程(16天的过程)的示例性实施例的过程概述。
图21：Gen 3.1测试过程(16天至17天的过程)的示例性实施例的示意图。
图22：Gen 3过程(16天的过程)的示例性实施例的示意图。
图23：示例性Gen 2和示例性Gen 3过程的比较表。
图24：Gen 3过程(16天至17天的过程)制备时间线的示例性实施例的示意图。
图25：Gen 3过程(14天至16天的过程)的示例性实施例的示意图。
图26A至图26B：Gen 3过程(16天的过程)的示例性实施例的示意图。
图27：Gen 3过程(16天的过程)的示例性实施例的示意图。
图28：Gen 2、Gen 2.1与Gen 3过程(16天的过程)的实施例的比较。
图29：Gen 2、Gen 2.1与Gen 3过程(16天的过程)的实施例的比较。
图30：Gen 3实施例组分。
图31：Gen 3实施例流程图比较(Gen 3.0、Gen 3.1对照、Gen 3.1测试)。
图32：显示Gen 3过程(16天至17天的过程)的示例性实施例的组分。
图33：验收准则表。
图34：包括与基因编辑过程(包括如本文所述的TALEN、锌指核酸酶和CRISPR方法)一起使用的电穿孔步骤的TIL制造过程的一些实施例的描述。
图35：包括与基因编辑过程(包括如本文所述的TALEN、锌指核酸酶和CRISPR方法)一起使用的电穿孔步骤的TIL制造过程的实施例的描述。
图36：本文所述的TIL中可包含的示例性膜锚定的免疫调节融合蛋白。
图37：本文所述的TIL中可包含的示例性膜锚定的免疫调节融合蛋白。
图38：用于评估膜结合IL-15/IL-21转导的预REP TIL的表达和信号传导的研究的概述。
图39：用于评估经mIL-15/IL-21转导的REP TIL中的mIL-15/IL21以及CD8和CD4 T细胞亚群的表达的研究的概述。
图40：用于评估经mIL-15/IL-21转导的CD8+REP TIL的表型的研究的概述。
图41：用于评估经mIL-15/IL-21转导的CD4+的表型的研究的概述。
序列表的简要说明
SEQ ID NO：1为莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2为莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3为重组人IL-2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4为阿地白介素(aldesleukin)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5为IL-2形式。
SEQ ID NO：6为奈瓦纽金α(nemvaleukin alfa)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7为IL-2形式。
SEQ ID NO：8为粘蛋白结构域多肽。
SEQ ID NO：9为重组人IL-4蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10为重组人IL-7蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11为重组人IL-15蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12为重组人IL-21蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13为IL-2序列。
SEQ ID NO：14为IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO：15为IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO：16为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2。
SEQ ID NO：17为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2。
SEQ ID NO：18为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3。
SEQ ID NO：19为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2kabat。
SEQ ID NO：20为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 kabat。
SEQ ID NO：21为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 kabat。
SEQ ID NO：22为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2clothia。
SEQ ID NO：23为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 clothia。
SEQ ID NO：24为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 clothia。
SEQ ID NO：25为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2IMGT。
SEQ ID NO：26为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 IMGT。
SEQ ID NO：27为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 IMGT。
SEQ ID NO：28为IgG.IL2R67A.H1的VH链。
SEQ ID NO：29为IgG.IL2R67A.H1的重链。
SEQ ID NO：30为IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 kabat。
SEQ ID NO：31为IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 kabat。
SEQ ID NO：32为IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 kabat。
SEQ ID NO：33为IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 chothia。
SEQ ID NO：34为IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 chothia。
SEQ ID NO：35为IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 chothia。
SEQ ID NO：36为VL链。
SEQ ID NO：37为轻链。
SEQ ID NO：38为轻链。
SEQ ID NO：39为轻链。
SEQ ID NO：40为人4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41为鼠4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO：42为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(utomilumab)(PF-05082566)的重链。
SEQ ID NO：43为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链。
SEQ ID NO：44为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：45为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：46为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR1。
SEQ ID NO：47为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR2。
SEQ ID NO：48为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的重链CDR3。
SEQ ID NO：49为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：50为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：51为4-1BB激动剂单克隆抗体乌图木单抗(PF-05082566)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：52为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)(BMS-663513)的重链。
SEQ ID NO：53为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链。
SEQ ID NO：54为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：55为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：56为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR1。
SEQ ID NO：57为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR2。
SEQ ID NO：58为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的重链CDR3。
SEQ ID NO：59为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：60为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：61为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(BMS-663513)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：62为TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO：63为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：64为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：65为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：66为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：67为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：68为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：69为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：70为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：71为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：72为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：73为TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO：74为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：75为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：76为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO：77为4-1BB配体(4-1BBL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：78为4-1BBL多肽的可溶部分。
SEQ ID NO：79为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：80为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：81为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：82为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：83为4-1BB激动剂抗体H39E3-2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：84为4-1BB激动剂抗体H39E3-2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：85为人OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO：86为鼠OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO：87为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)的重链。
SEQ ID NO：88为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链。
SEQ ID NO：89为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：90为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：91为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR1。
SEQ ID NO：92为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR2。
SEQ ID NO：93为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR3。
SEQ ID NO：94为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR1。
SEQ ID NO：95为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR2。
SEQ ID NO：96为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR3。
SEQ ID NO：97为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链。
SEQ ID NO：98为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链。
SEQ ID NO：99为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：100为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：101为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR1。
SEQ ID NO：102为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR2。
SEQ ID NO：103为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR3。
SEQ ID NO：104为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1。
SEQ ID NO：105为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2。
SEQ ID NO：106为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3。
SEQ ID NO：107为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链。
SEQ ID NO：108为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链。
SEQ ID NO：109为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：110为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：111为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR1。
SEQ ID NO：112为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR2。
SEQ ID NO：113为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR3。
SEQ ID NO：114为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1。
SEQ ID NO：115为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2。
SEQ ID NO：116为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3。
SEQ ID NO：117为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：118为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：119为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR1。
SEQ ID NO：120为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2。
SEQ ID NO：121为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3。
SEQ ID NO：122为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1。
SEQ ID NO：123为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2。
SEQ ID NO：124为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3。
SEQ ID NO：125为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：126为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：127为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR1。
SEQ ID NO：128为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2。
SEQ ID NO：129为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3。
SEQ ID NO：130为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1。
SEQ ID NO：131为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2。
SEQ ID NO：132为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3。
SEQ ID NO：133为OX40配体(OX40L)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：134为OX40L多肽的可溶部分。
SEQ ID NO：135为OX40L多肽的替代性可溶部分。
SEQ ID NO：136为OX40激动剂单克隆抗体008的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：137为OX40激动剂单克隆抗体008的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：138为OX40激动剂单克隆抗体011的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：139为OX40激动剂单克隆抗体011的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：140为OX40激动剂单克隆抗体021的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：141为OX40激动剂单克隆抗体021的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：142为OX40激动剂单克隆抗体023的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：143为OX40激动剂单克隆抗体023的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：144为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：145为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：146为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：147为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：148为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：149为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：150为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：151为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：152为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：153为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：154为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：155为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：156为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO：157为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO：158为PD-1抑制剂纳武单抗(nivolumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：159为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：160为PD-1抑制剂纳武单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：161为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：162为PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：163为PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：164为PD-1抑制剂纳武单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：165为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：166为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：167为PD-1抑制剂纳武单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：168为PD-1抑制剂帕博利珠单抗(pembrolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：169为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：170为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：171为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：172为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：173为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：174为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：175为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：176为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：177为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：178为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗(durvalumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：179为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：180为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：181为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：182为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：183为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：184为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：185为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：186为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：187为PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：188为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗(avelumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：189为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：190为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：191为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：192为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：193为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：194为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：195为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：196为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：197为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：198为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗(atezolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：199为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：200为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：201为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：202为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：203为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：204为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：205为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：206为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：207为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：208为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗(ipilimumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：209为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：210为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：211为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：212为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：213为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：214为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：215为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：216为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：217为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：218为CTLA-4抑制剂曲美单抗(tremelimumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：219为CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：220为CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：221为CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：222为CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：223为CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：224为CTLA-4抑制剂曲美单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：225为CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：226为CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：227为CTLA-4抑制剂曲美单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：228为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗(zalifrelimab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO：229为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO：230为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO：231为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO：232为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：233为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：234为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：235为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO：236为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO：237为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO：238为CD8a跨膜结构域。
SEQ ID NO：239为B7-1跨膜-胞内结构域。
SEQ ID NO：240至245为适用于本文所述的免疫调节融合蛋白的示例性甘胺酸-丝氨酸接头。
SEQ ID NO：246为适用于本文所述的免疫调节融合蛋白的示例性接头。
SEQ ID NO：247为2A肽C末端序列。
SEQ ID NO：248为猪捷申病毒1型2A肽。
SEQ ID NO：249为马甲型鼻炎病毒2A肽。
SEQ ID NO：250为手足口病病毒2A肽。
SEQ ID NO：251为示例性弗林蛋白酶可裂解2A肽。
SEQ ID NO：252和253为人IgE信号肽序列。SEQ ID NO：254为人IL-2信号肽序列。
SEQ ID NO：255为6X NFAT IL-2最小启动子。
SEQ ID NO：256为NFAT应答元件。
SEQ ID NO：557为人IL-2启动子序列。
SEQ ID NO：258为人IL-15(N72D突变体)。
SEQ ID NO：259为人IL-15R-α-Su/Fc结构域。
SEQ ID NO：260为人IL-15R-α-Su(65aa截短的胞外结构域)。
SEQ ID NO：261为人IL-15异构体(isoform)2。
SEQ ID NO：262为人IL-15异构体1。
SEQ ID NO：263为人IL-15(不具有信号肽)。
SEQ ID NO：264为人IL-15R-α(85aa截短的胞外结构域)。
SEQ ID NO：265为人IL-15R-α(182aa截短的胞外结构域)。
SEQ ID NO：266为人IL-15R-α。
SEQ ID NO：267为人IL-12p35亚基。
SEQ ID NO：268为人IL-12p40亚基。
SEQ ID NO：269为人IL-18。
SEQ ID NO：270为人IL-18变体。
SEQ ID NO：271为人IL-21。
SEQ ID NO：272为人IL-2。
SEQ ID NO：273为人CD40L。
SEQ ID NO：274为激动性抗人CD40 VH(索替加利单抗(Sotigalimab))。
SEQ ID NO：275为激动性抗人CD40 VL(索替加利单抗)。
SEQ ID NO：276为激动性抗人CD40 scFv(索替加利单抗)。
SEQ ID NO：277为激动性抗人CD40 VH(达西珠单抗(Dacetuzumab))。
SEQ ID NO：278为激动性抗人CD40 VL(达西珠单抗)。
SEQ ID NO：279为激动性抗人CD40 scFv(达西珠单抗)。
SEQ ID NO：280为激动性抗人CD40 VH(卢卡妥珠单(Lucatutuzumab))。
SEQ ID NO：281为激动性抗人CD40 VL(卢卡妥珠单抗)。
SEQ ID NO：282为激动性抗人CD40 scFv(卢卡妥珠单抗)。
SEQ ID NO：283为激动性抗人CD40 VH(塞鲁单抗(Selicrelumab))。
SEQ ID NO：284为激动性抗人CD40 VL(塞鲁单抗)。
SEQ ID NO：285为激动性抗人CD40 scFv(塞鲁单抗)。
SEQ ID NO：286为目标PD-1序列。
SEQ ID NO：287为目标PD-1序列。
SEQ ID NO：288为重复PD-1左重复序列。
SEQ ID NO：289为重复PD-1右重复序列。
SEQ ID NO：290为重复PD-1左重复序列。
SEQ ID NO：291为重复PD-1右重复序列。
SEQ ID NO：292为PD-1左TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO：293为PD-1右TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO：294为PD-1左TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO：295为PD-1右TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO：296为编码SEQ ID NO：328的拴系(tethered)IL-15的核酸序列。
SEQ ID NO：297为编码SEQ ID NO：的拴系IL-21融合蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO：298为编码SEQ ID NO：328的拴系IL-15融合蛋白和SEQ ID NO：331的拴系IL-21融合蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO：299为编码SEQ ID NO：303的拴系IL-12融合蛋白的核酸序列。核酸序列包含NFAT启动子。
SEQ ID NO：300为编码SEQ ID NO：328的拴系IL-15融合蛋白的核酸序列。核酸序列包含NFAT启动子。
SEQ ID NO：301为编码SEQ ID NO：XX的拴系IL-21融合蛋白的核酸序列。核酸序列包含NFAT启动子。
SEQ ID NO：302为编码SEQ ID NO：328的拴系IL-15融合蛋白和SEQ ID NO：331的拴系IL-21融合蛋白的核酸序列。核酸序列包含NFAT启动子。
SEQ ID NO：303为示例性拴系IL-12(拴系IL-12-Lr1-Ar2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：304为编码SEQ ID NO：303的拴系IL-12的核酸序列。
SEQ ID NO：305为示例性拴系IL-18(拴系IL-18-Lr1-Ar2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：306为编码SEQ ID NO：305的拴系IL-18的核酸序列。
SEQ ID NO：307为示例性拴系IL-18变体(拴系DR-IL-18(6-27变体)-Lr1-Ar2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：308为编码SEQ ID NO：307的拴系IL-18变体的核酸序列。
SEQ ID NO：309为示例性拴系IL-12/IL-15的氨基酸序列。
SEQ ID NO：310为编码SEQ ID NO：309的拴系IL-12/IL-15的核酸序列。
SEQ ID NO：311为示例性拴系IL-18/IL-15的氨基酸序列。
SEQ ID NO：312为编码SEQ ID NO：311的拴系IL-18/IL-15的核酸序列。
SEQ ID NO：313为示例性拴系抗CD40scFV(APX005M)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：314为编码SEQ ID NO：313的拴系抗CD40scFV(APX005M)的核酸序列。
SEQ ID NO：315为示例性拴系抗CD40scFV(达西珠单抗)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：316为编码SEQ ID NO：315的拴系抗CD40scFV(达西珠单抗)的核酸序列。
SEQ ID NO：317为示例性拴系抗CD40scFV(卢卡妥珠单抗)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：318为编码SEQ ID NO：317的拴系抗CD40scFV(卢卡妥珠单抗)的核酸序列。
SEQ ID NO：319为示例性拴系抗CD40scFV(塞鲁单抗)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：320为编码SEQ ID NO：319的拴系抗CD40scFV(塞鲁单抗)的核酸序列。
SEQ ID NO：321为编码SEQ ID NO：273的CD40L的核酸序列。
SEQ ID NO：322为示例性拴系CD40L/IL-15的氨基酸序列。
SEQ ID NO：323为编码SEQ ID NO：311的拴系CD40L/IL-15的核酸序列。
SEQ ID NO：324为示例性拴系IL-2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：325为编码SEQ ID NO：313的拴系IL-2的核酸序列。
SEQ ID NO：326为示例性拴系IL-12的氨基酸序列。
SEQ ID NO：327为编码SEQ ID NO：315的拴系IL-12的核酸序列。
SEQ ID NO：328为示例性拴系IL-15的氨基酸序列。
SEQ ID NO：329为编码SEQ ID NO：317的拴系IL-15的核酸序列。
SEQ ID NO：330为编码GFP的核酸序列。
具体实施方式
I.引言
利用TIL的过继性细胞疗法为在各种癌症(包括白血病和黑色素瘤)中引起肿瘤消退的有效方法。已发现使用包括免疫刺激剂的佐剂可增强过继细胞疗法并将此类疗法扩展至其他实体瘤。然而，细胞因子(例如白介素)等免疫调节剂的共同施用可因所需的高剂量而引起不期望的毒性。因此，在正确的时间和位点提供此类佐剂对于避免此类不期望的作用而言显得至关重要。
本文提供了使用经修饰的TIL治疗癌症的组合物和方法，其中，经修饰的TIL包含与其细胞表面缔合的一种以上免疫调节剂(例如，细胞因子)。与TIL缔合的免疫调节剂提供局部免疫刺激作用，其可有利地增强患者接受者中的TIL存活率和/或抗肿瘤活性。因此，本文所公开的组合物和方法提供有效的癌症疗法。
II.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文所提及的所有专利和出版物均以全文引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“共同施用”、“共同给药”、“与……组合施用”、“与……联合施用”、“同时”和“同期”涵盖向受试者施用两种以上活性药物成分(在本发明的优选实施例中，例如多个TIL)，使得活性药物成分和/或其代谢物两者同时存在于受试者中。共同施用包括以分开的组合物同时施用、以分开的组合物在不同时间施用或以其中存在两种以上活性药物成分的组合物的形式施用。优选地，以分开的组合物同时施用和以其中存在两种试剂的组合物的形式施用。
术语“体内”指发生于受试者体内的事件。
术语“体外”指发生于受试者体外的事件。体外测定涵盖采用活细胞或死细胞的基于细胞的测定，也可涵盖不采用完整细胞的不含细胞的测定。
术语“离体”指涉及对已自受试者身体移除的细胞、组织和/或器官进行治疗或执行程序的事件。适当地，细胞、组织和/或器官可利用手术或治疗方法返回至受试者体内。
术语“快速扩增”指抗原特异性TIL的数目在一周时间内增加至少约3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更优选地，在一周时间内增加至少约10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，或最优选地，在一周时间内增加至少约100倍。本文中描述了多种快速扩增方案。
本文中“肿瘤浸润性淋巴细胞”或“TIL”指最初作为已离开受试者血流且迁移至肿瘤中的白细胞而获得的细胞群体。TIL包括(但不限于)CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括初代TIL和继代TIL两者。“初代TIL”是如本文所述的自患者组织样本获得的TIL(有时称为“新鲜收集”)，“继代TIL”是任何如本文所述的经扩增或增殖的TIL细胞群体，包括(但不限于)主体TIL(bulkTIL)和经扩增的TIL(“REP TIL”或“REP后TIL”)。TIL细胞群体可包含经基因修饰的TIL。
本文中的“细胞群体”(包含TIL)指许多具有共同特质的细胞。通常，群体的数目在1×106至1×1010的范围内，其中，不同的TIL群体包含不同数目。例如，初代TIL在IL-2的存在下的初始生长产生约1×108个细胞的主体TIL群体。一般进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞群体用于输注。
本文中“冷冻保存的TIL”指在约-150℃至-60℃的范围内处理且储存TIL，无论是初代的、主体的或经扩增的(REP TIL)。用于冷冻保存的通用方法也描述于本文别处，包括在实例中描述。为了清楚起见，“冷冻保存的TIL”可与可用作初代TIL来源的冷冻组织样本区分。
本文中“解冻的冷冻保存的TIL”指先前经冷冻保存且随后处理以恢复至室温或更高温度(包括但不限于细胞培养温度或可向患者施用TIL的温度)的TIL群体。
TIL通常可使用生物化学(使用细胞表面标记物)或功能性(根据其浸润肿瘤和实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达以下生物标记物中的一种以上来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外和替代性地，TIL可通过重新引入患者中后浸润实体瘤的能力来进行功能性定义。
术语“冷冻保存培养基”或“冻存培养基”指可用于冷冻保存细胞的任何培养基。此类培养基可包括包含7％至10％ DMSO的培养基。示例性培养基包括CryoStor CS10、HypoThermosol以及它们的组合。术语“CS10”指获自Stemcell Technologies或BiolifeSolutions的冷冻保存培养基。CS10培养基可以商品名“CS10”来指代。CS10培养基为包含DMSO的无血清、无动物成分的培养基。
术语“中枢记忆T细胞”指在人类中为CD45R0+且组成型表达CCR7(CCR7hi)和CD62L(CD62hi)的T细胞子集。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。中枢记忆T细胞在TCR引发之后主要分泌IL-2和CD40L作为效应分子。中枢记忆T细胞主要存在于血液的CD4隔室中，在人类中按比例富集于淋巴结和扁桃体中。
术语“效应记忆T细胞”指人或哺乳动物T细胞的子集，例如中枢记忆T细胞，为CD45R0+，但已经失去对CCR7的组成型表达(CCR7lo)并且对于CD62L表达而言为异质的或低的(CD62Llo)。中枢记忆T细胞的表面表型也包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激之后快速分泌高含量炎性细胞因子，包括干扰素-γ、IL4-和IL-5。效应记忆T细胞主要存在于血液的CD8隔室中，在人类中按比例富集于肺、肝脏和肠道中。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔蛋白。
术语“密闭系统”指对外部环境密闭的系统。适用于细胞培养方法的任何密闭系统均可用于本发明的方法。密闭系统包括例如(但不限于)密闭G容器。一旦将肿瘤碎片添加至密闭系统中，该系统不对外部环境开放，直至TIL准备好向患者施用。
如本文所用，术语“破碎”、“碎片”和“破碎的”描述将肿瘤破坏的过程，包括机械破碎方法，例如压碎、切片、分割和粉碎肿瘤组织，以及任何其他用于破坏肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“外周血单核细胞”和“PBMC”指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。当用作抗原呈递细胞(PBMC为一种类型的抗原呈递细胞)时，外周血单核细胞优选地是经辐照的同种异体外周血单核细胞。
术语“外周血淋巴细胞”和“PBL”指自外周血扩增的T细胞。在一些实施例中，PBL从来自供体的全血或单采(apheresis)产物中分离出。在一些实施例中，PBL通过正向或负向选择T细胞表型(例如CD3+CD45+的T细胞表型)而与来自供体的全血或单采产物分离。
术语“抗CD3抗体”指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，且包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、鼠或哺乳动物抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizuma)和维西珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(在本文中也被称为“OKT3”)指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物类似物或变体，包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或鼠抗体，包括市售形式，例如OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3纯，美国加利福尼亚州圣地亚哥美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotech,Inc))和莫罗单抗或其变体、保守氨基酸取代、糖型或生物类似物。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQ ID NO：1和SEQID NO：2)。能够产生OKT-3的杂交瘤保存于美国菌种保藏中心且所分配的ATCC登录号为CRL8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保存于欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC)且所分配的目录号为86022706。
表1：莫罗单抗(示例性OKT-3抗体)的氨基酸序列
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)指称为白介素-2的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及其变体。IL-2描述于例如Nelson的《免疫学杂志(J.Immunol.)》2004,172,3983-88和Malek,《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》2008,26,453-79，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的重组人IL-2的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：SEQ ID NO：3)。例如，术语IL-2涵盖人重组形式的IL-2，例如阿地白介素(PROLEUKIN，可购自多个供应商，每单次使用小瓶含22百万IU)以及由美国新罕布什尔州次茅斯的CellGenix,Inc.(CELLGRO GMP)或美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-209-b)供应的重组IL-2形式和来自其他供应商的其他商业等效物。阿地白介素(去丙胺酰基-1，丝氨酸-125人IL-2)为分子量约15kDa的非糖基化人重组形式的IL-2。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO：4)。术语IL-2也涵盖如本文所述的聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前药贝培阿地白介素(bempegaldesleukin)(NKTR-214，如SEQ IDNO：4中所示的聚乙二醇化人重组IL-2，其中平均6个赖氨酸残基是经[(2,7-双{[甲基聚(氧乙烯)]氨基甲酰基}-9H-芴-9-基)甲氧基]羰基取代的N6)，其可购自美国加利福尼亚州南旧金山的Nektar Therapeutics，或可通过本领域中已知的方法制备，例如国际专利申请公开第WO 2018/132496 A1号的实例19中描述的方法或美国专利申请公开第US2019/0275133A1号的实例1中描述的方法，这些公开的公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的贝培阿地白介素(NKTR-214)及其他聚乙二醇化IL2分子描述于美国专利申请公开第US2014/0328791 A1号和国际专利申请公开第WO 2012/065086 A1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的替代形式的缀合IL-2描述于美国专利第4,766,106号、第5,206,344号、第5,089,261号和第4,902,502号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利第6,706,289号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，适合用于本发明的IL-2形式为可购自Synthorx,Inc.的THOR-707。THOR-707和适用于本发明的另外替代形式的IL-2的制备和特性描述于美国专利申请公开第US2020/0181220 A1号和第US2020/0330601 A1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为白介素2(IL-2)缀合物，其包含：分离和纯化的IL-2多肽；以及在选自以下的氨基酸位置结合分离和纯化的IL-2多肽的缀合部分：K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107，其中，氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO：5。在一些实施例中，氨基酸位置选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107。在一些实施例中，氨基酸位置选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、P65、V69、L72和Y107。在一些实施例中，氨基酸位置选自T37、T41、F42、F44、Y45、P65、V69、L72和Y107。在一些实施例中，氨基酸位置选自R38和K64。在一些实施例中氨基酸位置选自E61、E62和E68。在一些实施例中，氨基酸位置在E62。在一些实施例中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸残基进一步突变成赖氨酸、半胱氨酸或组氨酸。在一些实施例中，氨基酸残基突变成半胱氨酸。在一些实施例中，氨基酸残基突变成赖氨酸。在一些实施例中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸残基进一步突变成非天然氨基酸。在一些实施例中，非天然氨基酸包含N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-侧氧基壬酸、2-氨基-8-侧氧基辛酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-侧氧基壬酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对溴苯基丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、磷酰基酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-磷丝氨酸、磷酰基丝氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苯甲氧基)-3-侧氧基丙基)氨基)乙基)硒烷基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒烷基)丙酸或硒半胱氨酸。在一些实施例中，相对于野生型IL-2多肽，IL-2缀合物与IL-2受体α(IL-2Rα)亚基的亲和力降低。在一些实施例中，相对于野生型IL-2多肽，降低的亲和力是与IL-2Rα的结合亲和力降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在一些实施例中，相对于野生型IL-2多肽，降低的亲和力是约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或更大。在一些实施例中，缀合部分削弱或阻断IL-2与IL-2Rα的结合。在一些实施例中，缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施例中，另外的缀合部分包含水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶性聚合物各自独立地包含聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷氮烯、聚恶唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施例中，水溶性聚合物各自独立地包含PEG。在一些实施例中，PEG为线性PEG或支化PEG。在一些实施例中，水溶性聚合物各自独立地包含多糖。在一些实施例中，多糖包含聚葡萄糖、聚唾液酸(PSA)、玻尿酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些实施例中，水溶性聚合物各自独立地包含聚糖。在一些实施例中，水溶性聚合物各自独立地包含多胺。在一些实施例中，缀合部分包含蛋白质。在一些实施例中，另外的缀合部分包含蛋白质。在一些实施例中，蛋白质各自独立地包含白蛋白、转铁蛋白(transferrin)或运甲状腺素蛋白(transthyretin)。在一些实施例中，蛋白质各自独立地包含Fc部分。在一些实施例中，蛋白质各自独立地包含IgG的Fc部分。在一些实施例中，缀合部分包含多肽。在一些实施例中，另外的缀合部分包含多肽。在一些实施例中，多肽各自独立地包含XTEN肽、富甘氨酸高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白(GLK)聚合物。在一些实施例中，分离和纯化的IL-2多肽通过谷氨酰胺化修饰。在一些实施例中，缀合部分直接结合至分离和纯化的IL-2多肽。在一些实施例中，缀合部分通过接头间接结合至分离和纯化的IL-2多肽。在一些实施例中，接头包含同型双官能接头。在一些实施例中，同型双官能接头包含罗曼特氏试剂(Lomant's reagent)二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3'3'-二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基DST)、糖基双(琥珀酰亚胺基丁二酸)亚乙酯(EGS)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)、碳酸N,N'-二琥珀酰亚胺酯(DSC)、二亚胺代二酸二甲酯(DMA)、庚二亚胺酸二甲酯(DMP)、辛二亚胺酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫代双丙酰亚胺酸酯(DTBP)、1,4-二(3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双顺丁烯二酰亚胺基己烷(BMH)、含有芳基卤化物的化合物(DFDNB)(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨基酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3'-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α'-对二氨基联苯、二碘-对二甲苯磺酸、N,N'-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N'-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。在一些实施例中，接头包含异型双官能接头。在一些实施例中，异型双官能接头包含3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(sPDP)、长链3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(LC-sPDP)、水溶性长链3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(sIAB)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸琥珀酰亚胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIACX)、碘乙酸对硝苯酯(NPIA)、羰基反应性和硫氢基反应性交联剂，例如4-(4-N-顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酰基酰肼(PDPH)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮水杨基酰胺基己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮水杨基酰胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基丁二酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、(4-叠氮苯基)-1,3'-二硫丙酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sADP)、4-(对叠氮苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀酰亚胺酯(sAED)、7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAMCA)、重氮丙酮酸对硝苯酯(ρNPDP)、对硝苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(对叠氮基水杨基酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、对叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)、4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁胺(AsBA)或对叠氮苯基乙二醛(APG)。在一些实施例中，接头包含可裂解接头，可选地包含二肽接头。在一些实施例中，二肽接头包含Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些实施例中，接头包含不可裂解接头。在一些实施例中，接头包含顺丁烯二酰亚胺基，可选地包含顺丁烯二酰亚胺基己酰基(mc)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些实施例中，接头进一步包含间隔子。在一些实施例中，间隔子包含对氨基苯甲基醇(PAB)、对氨基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或类似物。在一些实施例中，缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施例中，另外的缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为本文所述本文所述的任一种IL-2形式的片段。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为如美国专利申请公开US2020/0181220 A1号和美国专利申请公开US2020/0330601A1号中所公开地聚乙二醇化。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ ID NO：5中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施例中，IL-2多肽包含相对于SEQ ID NO：5的一个残基的N末端缺失。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式缺乏IL-2Rα链接合，但保持与中间亲和力IL-2Rβ-γ信号复合体的正常结合。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和参照SEQ ID NO：5中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ ID NO：5中的氨基酸位置对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，其包含：IL-2多肽，其包含N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接至包含聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少98％序列同一性的氨基酸序列；以及参照SEQ ID NO：5中的氨基酸位置，对于位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。
在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为奈瓦纽金α(也称为ALKS-4230(SEQID NO：6)，其可购自阿尔凯默斯公司(Alkermes,Inc.))。奈瓦纽金α也被称为人白介素2片段(1-59)变体(Cys125>Ser51)，其通过肽基接头(60GG61)融合至人白介素2片段(62-132)，该片段通过肽基接头(133GSGGGS138)融合至人白介素2受体α链片段(139-303)，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，经糖基化；人白介素2(IL-2)(75-133)-肽[Cys125(51)>Ser]-突变体(1-59)，其通过G2肽接头(60-61)融合至人白介素2(IL-2)(4-74)-肽(62-132)且通过GSG3S肽接头(133-138)融合至人白介素2受体α链(IL2R亚基α、IL2Rα、IL2RA)(1-165)-肽(139-303)，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，糖型α。奈瓦纽金α的氨基酸序列以SEQ ID NO：6提供。在一些实施例中，奈瓦纽金α具有以下翻译后修饰：在以下位置处的二硫桥键：31-116、141-285、184-242、269-301、166-197或166-199、168-199或168-197(使用SEQ ID NO：6中的编号)，以及在以下位置处的糖基化位点：N187、N206、T212(使用SEQ ID NO：6中的编号)。奈瓦纽金α的制备和特性以及适用于本发明的IL-2的其他替代形式描述于美国专利申请公开第US 2021/0038684A1号和美国专利第10,183,979号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为与SEQ ID NO：6具有至少80％、至少90％、至少95％或至少90％序列同一性的蛋白质。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式具有SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列或其保守性氨基酸取代。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为包含SEQ ID NO：7的氨基酸24-452或其变体、变体或衍生物的融合蛋白。在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为包含与SEQ ID NO：7的氨基酸24-452或其变体、片段或衍生物具有至少80％、至少90％、至少95％或至少90％序列同一性的氨基酸序列的融合蛋白。适用于本发明的其他IL-2形式描述于美国专利第10,183,979号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。可选地，在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式为包含第一融合伴侣的融合蛋白，第一融合伴侣通过粘蛋白结构域多肽接头连接至第二融合伴侣，其中，第一融合伴侣为IL-1Rα或与IL-1Rα具有至少98％的氨基酸序列同一性且具有IL-Rα的受体拮抗剂活性的蛋白质，第二融合伴侣包含全部或部分包含Fc区的免疫球蛋白，其中，粘蛋白结构域多肽接头包含SEQ ID NO：8或与SEQ ID NO：8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，与第一融合伴侣在没有粘蛋白结构域多肽接头的情况下与第二融合伴侣的融合相比，融合蛋白的半衰期有所改良。
表2：白介素的氨基酸序列。
在一些实施例中，适用于本发明的IL-2形式包括抗体细胞因子移植蛋白，该抗体细胞因子移植蛋白包含：重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；以及的IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；以及IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中，该IL-2分子为突变蛋白，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施例中，IL-2方案包括施用美国专利申请公开第US2020/0270334 A1号中所描述的抗体，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含：重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；以及IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中，该IL-2分子为突变蛋白，其中，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞，该抗体还包含选自如下的IgG类重链和IgG类轻链：包含SEQ ID NO：39的IgG类轻链和包含SEQ IDNO：38的IgG类重链；包含SEQ ID NO：37的IgG类轻链和包含SEQ ID NO：29的IgG类重链；包含SEQ ID NO：39的IgG类轻链和包含SEQ ID NO：29的IgG类重链；以及包含SEQ ID NO 37的IgG类轻链和包含SEQ ID NO：38的IgG类重链。
在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR1中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR2中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR3中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR1中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR2中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施例中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR3中，其中IL-2分子为突变蛋白。
IL-2分子的插入可在CDR的N末端区域处或附近，在CDR的中间区域中，或在CDR的C末端区域处或附近。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL2序列不会将CDR序列框移。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含并入CDR中的IL-2分子，其中IL-2序列置换CDR序列的全部或一部分。IL-2分子置换可在CDR的N末端区域处，在CDR的中间区域中，或在CDR的C末端区域处或附近。IL-2分子置换可少至CDR序列或整个CDR序列的一或两个氨基酸。
在一些实施例中，IL-2分子直接移植至无肽接头的CDR中，在CDR序列与IL-2序列之间没有另外的氨基酸。在一些实施例中，IL-2分子间接移植至具有肽接头的CDR中，其中CDR序列与IL-2序列之间存在一个以上另外的氨基酸。
在一些实施例中，本文所述的IL-2分子为IL-2突变蛋白。在一些情况下，IL-2突变蛋白包含R67A取代。在一些实施例中，IL-2突变蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：14或SEQID NO：15。在一些实施例中，IL-2突变蛋白包含美国专利申请公开第US 2020/0270334 A1号中表1中的氨基酸序列，该公开的公开内容以引用的方式并入本文。
在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO25的HCDR1。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16的HCDR1。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自如下的HCDR1：选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：26的HCDR2。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含选自SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：27的HCDR3。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含VH区，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含VL区，其包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含轻链，其包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含VH区，其包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列；和VL区，其包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链区，其包含SEQ ID NO29的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链区，其包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链区，其包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链区，其包含SEQ ID NO：38的基酸序列；以及轻链区，其包含SEQ IDNO：39的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号的IgG.IL2F71A.H1或IgG.IL2R67A.H1或其变体、衍生物或片段，或其保守氨基酸取代，或与其具有至少80％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的蛋白质。在一些实施例中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白的抗体组分包含帕利珠单抗的免疫球蛋白序列、框架序列或CDR序列。在一些实施例中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如(但不限于)阿地白介素或可比分子)长。在一些实施例中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白具有如表3中所述的序列。
表3：示例性帕利珠单抗抗体-IL-2移植蛋白的序列
术语“IL-4”(在本文中也称为“IL4”)指被称为白介素4的细胞因子，其由Th2 T细胞和嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和肥大细胞产生。IL-4调节初始辅助T细胞(Th0细胞)分化成Th2 T细胞。Steinke和Borish，《呼吸研究(Respir.Res.)》2001,2,66-70。在由IL-4活化后，Th2 T细胞随后以正反馈回路产生另外IL-4。IL-4也刺激B细胞增殖和II类MHC表达，诱导来自B细胞的类别转换为IgE和IgG1表达。适用于本发明的重组人IL-4可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-211)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific，Inc.)(人IL-15重组蛋白，目录号Gibco CTP0043)。适用于本发明的重组人IL-4的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：9)。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)指称为白介素7的糖基化的组织衍生性细胞因子，其可获自基质和上皮细胞以及树突状细胞。Fry和Mackall，《血液(Blood)》2002，99，3892-904。IL-7可以刺激T细胞的发育。IL-7与IL-7受体(一种由IL-7受体α和共同γ链受体组成的异二聚体)结合，其属于对于T细胞在胸腺内的发育和在外周内的存活而言重要的一系列信号。适用于本发明的重组人IL-7可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-254)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人IL-15重组蛋白，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人IL-7的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：10)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)指称为白介素-15的T细胞生长因子，包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及其变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri的《血液》2001,97,14-32中，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-15与IL-2共用β和γ信号受体亚基。重组人IL-15为分子质量为12.8kDa的含有114个氨基酸(和N末端甲硫氨酸)的单一非糖基化多肽链。重组人IL-15可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-230-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人IL-15的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：11)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)指称为白介素-21的多效性细胞因子蛋白，包括所有形式的IL-21，包括人和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及其变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard，《自然综述：药物发现(Nat.Rev.Drug.Disc.)》2014,13,379-95，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-21主要通过自然杀伤T细胞和经活化的人CD4+T细胞产生。重组人IL-21为分子质量为15.4kDa之含有132个氨基酸的单一非糖基化多肽链。重组人IL-21可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-408-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人IL-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人IL-21的氨基酸序列在表2中给出(SEQ ID NO：12)。
当指示“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，本发明的组合物的待施用的精确量可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和病状的个体差异来确定。通常说明本文所述的包含肿瘤浸润性淋巴细胞(例如继代TIL或基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)的药物组合物可以104至1011个细胞/kg体重(例如，105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011或109至1010个细胞/kg体重)的剂量施用,包括在那些范围内的所有整数值。TIL(在一些情况下包括经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)组合物也可以这些剂量多次施用。TIL(在一些情况下包括经基因工程改造的TIL)可通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(参见例如Rosenberg等人，《新英格兰医学杂志(New Eng.J.of Med.)》1988,319,1676)。特定患者的最佳剂量和治疗方案可容易地由所属医药领域的技术人员通过监测患者的疾病病征且相应地调整治疗来确定。
术语“造血系统恶性肿瘤”、“造血系统恶性病”或有相关意义的术语指哺乳动物造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的癌症和肿瘤。造血系统恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。造血系统恶性肿瘤包括(但不限于)急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。术语“B细胞恶性血液肿瘤”指影响B细胞的造血系统恶性肿瘤。
术语“液体肿瘤”指性质上为流体的异常细胞团块。液体肿瘤癌症包括(但不限于)白血病、骨髓瘤和淋巴瘤，以及其他造血系统恶性肿瘤。获自液体肿瘤的TIL在本文中也可称为骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。获自液体肿瘤(包括在外周血中循环的液体肿瘤)的TIL在本文中也可称为PBL。术语MIL、TIL和PBL在本文中可互换使用且仅基于衍生细胞的组织类型而有所不同。
如本文所用，术语“微环境”可指作为整体的实体或血液肿瘤微环境或可指在微环境内的个别细胞子集。如本文所用，肿瘤微环境指以下复杂混合物：“促进赘生性转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤不受宿主免疫力影响、鼓励治疗抗性且提供显性转移茁壮成长的生态栖位(niche)的细胞、可溶因子、信号分子、细胞外基质和机械信号”，如Swartz等人，《癌症研究(Cancer Res.)》,2012,72,2473中所描述。尽管肿瘤表达应由T细胞识别的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统清除肿瘤的情况是罕见的。
在一些实施例中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中，患者在输注根据本发明的TIL之前经非骨髓清除式化疗预治疗。在一些实施例中，可提供TIL群体，其中，患者在输注根据本发明的TIL之前经非骨髓清除式化疗预治疗。在一些实施例中，非骨髓清除式化疗为环磷酰胺60mg/kg/d 2天(在TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/d5天(在TIL输注前第27至23天)。在一些实施例中，在根据本发明的非骨髓清除式化疗和TIL输注之后(第0天)，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2的静脉内输注以达到生理耐受。
实验发现表明，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，淋巴细胞耗竭通过消除调节性T细胞且竞争免疫系统的元件(“细胞因子库”)在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施例在引入本发明的TIL之前在患者身上采用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
术语“有效量”或“治疗有效量”指如本文所述的化合物或化合物组合的量，其足以实现所预期应用，包括(但不限于)疾病治疗。治疗有效量可视预期应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病病状(例如，受试者的体重、年龄和性别)、疾病病状的严重程度或施用方式而变化。该术语也适用于将诱发目标细胞中的特定反应(例如血小板粘附和/或细胞迁移减少)的剂量。特定剂量将视以下而变化：所选特定化合物、所依循的给药方案、化合物是否与其他化合物组合施用、施用时间、其所施用的组织及其中携带化合物的物理递送系统。
术语“治疗”、“医治”、“处理”及其类似术语指获得所要的药理学和/或生理学效应。该效应就完全或部分预防疾病或其症状而言可具预防性，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不良影响而言可具治疗性。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物、尤其人的疾病的任何治疗，包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断出患有该疾病的受试者中出现该疾病；(b)抑制疾病，即，遏制其发展或进展；以及(c)缓解疾病，即，促使疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”也意在涵盖递送试剂以便提供药理学效应，即使在不存在疾病或病状的情况下也如此。例如，“治疗”涵盖可在不存在疾病病状的情况下(例如在疫苗的情况下)引发免疫反应或赋予免疫性的组合物的递送。
当参考核酸或蛋白质的部分使用时，术语“异源”表示核酸或蛋白质包含两个以上在自然界中发现彼此之间没有相同关系的子序列。例如，通常以重组方式产生核酸，其具有两个以上来自无关基因的经布置以制造新的功能性核酸序列的序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区或来自不同来源的编码区。类似地，异源蛋白表示蛋白包含两个以上在自然界中未发现彼此呈相同关系的子序列(例如融合蛋白)。
在两个以上核酸或多肽的上下文中，术语“序列同一性”、“同一性百分比”以及“序列同一性百分比”(或其同义词，例如“99％同一性”)指两个以上序列或子序列在进行比较和比对(视需要引入间隔)以达到最大对应性且不将任何保守氨基酸取代视为序列同一性的部分时，该两个以上序列或子序列是相同的或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。所属领域中已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件。用以确定序列同一性百分比的适合的程序包括例如可购自美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站的BLAST程序套装。两个序列之间的比较可使用BLASTN或BLASTP算法进行。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(美国加利福尼亚州南旧金山的基因泰克(Genentech))或MegAlign(可购自DNASTAR)是另外的可用于比对序列的可供大众使用的软件程序。本领域技术人员可以通过特定的比对软件来确定用于最大比对的适当参数。在某些实施例中，使用比对软件的默认参数。
如本文所用，术语“变体”涵盖(但不限于)包含与参考抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列的抗体或融合蛋白，不同之处在于在参考抗体的氨基酸序列之内或相邻的某些位置有一个以上取代、缺失和/或添加。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体可以在其氨基酸序列中包含一个以上保守取代。保守取代可涉及例如类似带电或不带电氨基酸的取代。变体保留与参考抗体的抗原特异性结合的能力。术语变体也包括聚乙二醇化抗体或蛋白质。
本文中“肿瘤浸润性淋巴细胞”或“TIL”指最初作为已离开受试者血流且迁移至肿瘤中的白细胞而获得的细胞群体。TIL包括(但不限于)CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括初代TIL和继代TIL两者。“初代TIL”是如本文所述的自患者组织样本获得的细胞(有时称为“新鲜收集”)，“继代TIL”是任何如本文所述的经扩增或增殖的TIL细胞群体，包括(但不限于)本文所述主体TIL和经扩增的TIL(“REP TIL”)以及“reREP TIL”)。reREP TIL可包括例如第二扩增TIL或第二额外扩增TIL(例如图8的步骤D中所描述的TIL，包括称为reREP TIL的TIL)。
TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标记物)或功能性(根据其浸润肿瘤和实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达以下生物标记物中的一种以上分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外以及替代地，TIL可通过其重新引入患者中后浸润实体瘤的能力来进行功能性定义。TIL可进一步通过效力表征-例如若例如干扰素(IFN)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则TIL可视为强效的。若例如干扰素(IFNγ)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL、大于约300pg/mL、大于约400pg/mL、大于约500pg/mL、大于约600pg/mL、大于约700pg/mL、大于约800pg/mL、大于约900pg/mL、大于约1000pg/mL，则TIL可视为强效的。
术语“脱氧核糖核苷酸”涵盖天然的和合成的、未经修饰的和经修饰的脱氧核糖核苷酸。修饰包括改变糖部分、碱基部分和/或寡核苷酸中的脱氧核糖核苷酸之间的连接。
术语“RNA”定义包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”定义在b-D-呋喃核糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。术语RNA包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA、基本上纯RNA、合成RNA、以重组方式产生的RNA)以及通过一个以上核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而不同于天然存在的RNA的经改变的RNA。本文所述的RNA分子中的核苷酸也可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”意在包括任何及全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，以及惰性成分。此类药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂用于活性药物成分的用途为本领域所熟知。除非任何常规药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则考虑其在本发明的治疗性组合物中的用途。例如其他药物的额外活性药物成分也可并入所描述的组合物和方法中。
术语“约”或“大约”指在值的统计学上有意义的范围内。此范围可在给定值或范围的一个数量级内，优选50％内，更优选20％内，再更优选10％内，甚至更优选5％内。由术语“约”或“大约”涵盖的允许差值取决于研究下的特定系统，可由所属领域中具有通常知识者容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”指尺寸、大小、制剂、参数、形状和其他数量以及特征并不精确且不需要精确，而可以视需要为近似值和/或更大或更小，反映出公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域的技术人员已知的其他因素。一般而言，无论是否如此明确说明，尺寸、大小、制剂、参数、形状或其他数量或特征均为“约”或“约”的。应注意，大小、形状和尺寸非常不同的实施例可采用所描述的设置。
当以原始和修改形式用于所附权利要求中时，过渡术语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”相对于未叙述的另外的权利要求要素或步骤(若存在)被排除在权利要求的范围之外来定义权利要求范围。术语“包含”意在为包括性的或开放性的，不排除任何另外的、未叙述的要素、方法、步骤或材料。术语“由…组成”不包括除权利要求中指定的要素、步骤或材料以外的任何要素、步骤或材料，在后一情况中排除与指定材料一般相关的杂质。术语“基本上由…组成”将权利要求的范围限于所指定要素、步骤或材料以及基本上不影响所主张发明的基础和新颖特征的要素、步骤或材料。在替代实施例中，本文所述的体现本发明的所有组合物、方法和套件可由任何过渡术语“包含”、“基本上由…组成”以及“由…组成”更具体地定义。
术语“抗体(antibody)”及其复数形式“抗体(antibodies)”指完整的免疫球蛋白以及任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”也指包括通过二硫键连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。各重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。各轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。抗体的VH和VL区可进一步细分成高变区，其称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)，其可穿插有更保守的区域，称为框架区(FR)。各VH和VL由自氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与一个以上抗原表位相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
术语“抗原”指诱导免疫反应的物质。在一些实施例中，若通过主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递，则抗原为能够与抗体或TCR结合的分子。如本文所用，术语“抗原”也涵盖T细胞表位。抗原另外能够被免疫系统识别。在一些实施例中，抗原能够诱导使得B淋巴细胞和/或T淋巴细胞活化的体液免疫反应或细胞免疫反应。在一些情况下，这可能需要抗原含有或连接至Th细胞表位。抗原也可具有一个以上表位(例如B表位和T表位)。在一些实施例中，抗原优选将通常以高度特异性且选择性方式与其对应抗体或TCR反应，而不与可由其他抗原诱导的多种其他抗体或TCR反应。
术语“单克隆抗体”、“mAb”、“单克隆抗体组合物”或其复数形式指单一分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。对某些受体具有特异性的单克隆抗体可使用以下技术中的知识和技术制得：即向测试受试者注射适合抗原，然后分离表达具有所需序列或功能特征的抗体的杂交瘤。编码单克隆抗体的DNA容易使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。DNA一经分离，则可放置于表达载体中，然后转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中达成单克隆抗体的合成。抗体的重组产生将在下文更详细地描述。
如本文所用，术语抗体(或简言之，“抗体部分”或“片段”)的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个以上片段。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种二价片段，其包含铰链区处通过二硫桥键连接的两个Fab片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)结构域抗体(dAb)片段(Ward等人，《自然(Nature)》,1989,341,544-546),其可由一个VH或一个VL结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由独立基因编码，但其可使用重组方法通过合成接头接合，该合成接头能够将该两个结构域制造成VL与VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等人，《科学(Science)》1988,242,423-426；以及Huston等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》1988,85,5879-5883)。此类scFv抗体也意在涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，以与完整抗体相同的方式来筛选使用的片段。在一些实施例中，scFv蛋白结构域包含VH部分和VL部分。scFv分子在VL结构域是scFv分子的N末端部分的情况下表示为VL-L-VH，或在VH结构域是scFv分子的N末端部分的情况下表示为VH-L-VL.用于制备scFv分子和设计适合的肽接头的方法描述于美国专利第4,704,692号；美国专利第4,946,778号；R.Raag和M.Whitlow，Single Chain Fvs.，《美国实验生物学学会联合会(FASEB)》，第9卷:73-80(1995)；以及R.E.Bird和B.W.Walker，Single Chain Antibody Variable Regions,《生物技术趋势(TIBTECH)》,第9卷:132-137(1991)中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“人抗体”意在包括具有其中框架区和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，若抗体含有恒定区，则该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。如本文所用，术语“人抗体”不意在包括其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植至人框架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”指具有可变区的呈现单一结合特异性的抗体，在可变区中框架和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。在一些实施例中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与永生化细胞融合的自转基因非人动物(例如，转基因小鼠)获得的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的全部人抗体，例如(a)自对于人免疫球蛋白基因而言为转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(在下文进一步描述)分离的抗体；(b)自经转化以表达人抗体的宿主细胞，例如自转染瘤分离的抗体；(c)自重组、组合人抗体库分离的抗体；以及(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有框架区和CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施例中，此类重组人抗体可进行体外突变(或当使用人Ig序列的转基因动物时，为体内体细胞突变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为虽然来源于人种系VH和VL序列且与其相关，但体内可不天然存在于人抗体种系谱系内的序列。
如本文所用，“同种型(isotype)”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”指人抗体的任何经修饰形式，包括抗体与另一活性药物成分或抗体的缀合物。术语“缀合物”、“抗体-药物缀合物”、“ADC”或“免疫缀合物”指与另一治疗部分缀合的抗体或其片段，该治疗部分可使用本领域中可用的方法与本文所述的抗体缀合。
术语“人源化抗体”、“人源化的抗体”以及“人源化”意指其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植至人框架序列上的抗体。可在人框架序列中进行其他框架区修饰。非人(例如鼠)抗体的人源化形式为含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基经来自例如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的非人物种(供体抗体)的15个高变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基置换为相应非人残基。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体效能。一般而言，人源化抗体将包含基本全部的至少一个、通常两个可变结构域，其中，全部或基本全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，全部或基本全部FR区为人免疫球蛋白序列的FR区。可选地，人源化抗体也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常，人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于其他细节，参见Jones等人,《自然》1986,321,522-525；Riechmann等人,《自然》1988,332,323-329；以及Presta,《结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)》1992,2,593-596。本文所述的抗体也可经修饰以使用已知赋予效应功能和/或FcR结合的改良(例如降低)的任何Fc变体。Fc变体可包括例如下所公开的氨基酸取代中的任一者：国际专利申请公开第WO 1988/07089A1号、第WO 1996/14339A1号、第WO 1998/05787A1号、第WO 1998/23289A1号、第WO1999/51642A1号、第WO 99/58572A1号、第WO 2000/09560A2号、第WO 2000/32767A1号、第WO2000/42072A2号、第WO 2002/44215A2号、第WO 2002/060919 A2号、第WO 2003/074569 A2号、第WO 2004/016750A2号、第WO 2004/029207 A2号、第WO 2004/035752 A2号、第WO2004/063351 A2号、第WO 2004/074455 A2号、第WO 2004/099249 A2号、第WO 2005/040217A2号、第WO 2005/070963A1号、第WO 2005/077981 A2号、第WO 2005/092925 A2号、第WO2005/123780A2号、第WO 2006/019447 A1号、第WO 2006/047350 A2号和第WO 2006/085967A2号；以及美国专利第5,648,260号；第5,739,277号；第5,834,250号；第5,869,046号；第6,096,871号；第6,121,022号；第6,194,551号；第6,242,195号；第6,277,375号；第6,528,624号；第6,538,124号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,998,253号；以及第7,083,784号；其公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“嵌合抗体”意指可变区序列来源于一个物种且恒定区序列来源于另一物种的抗体，例如可变区序列来源于小鼠抗体且恒定区序列来源于人抗体的抗体。
“双功能抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗体片段。片段包含重链可变结构域(VH)，其连接至相同多肽链(VH-VL或VL-VH)中的轻链可变结构域(VL)。通过使用过短以使得同一链上的两个域结构之间不能配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双功能抗体更详细地描述于例如欧洲专利第EP 404,097号，国际专利公开第WO 93/11161号；以及Bolliger等人,《美国国家科学院院刊》1993,90,6444-6448中。
术语“糖基化”指抗体的经修饰的衍生物。非糖基化抗体缺乏糖基化。糖基化可经改变以例如提高抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个以上糖基化位点来完成。例如，可进行一个以上氨基酸取代，以消除一个以上可变区框架糖基化位点，从而消除该位点处的糖基化。去糖基化可增加抗体对抗原的亲和力，如美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中所描述。另外地或替代地，可产生糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖基残基量降低的低岩藻糖基化抗体或平分型GlcNac结构增加的抗体。已证明此类经改变的糖基化模式会提高抗体的能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中已有描述且可用作表达本发明的重组抗体以由此产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因、FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，使得表达于Ms704、Ms705和Ms709细胞系中的抗体缺乏在其碳水化合物上的岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系通过使用两种置换载体对CHO/DG44细胞中的FUT8基因的靶向断裂而形成(参见美国专利公开第2004/0110704号或Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》,2004,87,614-622)。作为另一实例，欧洲专利第EP 1,176,195号描述一种具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，该FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得此类细胞系中表达的抗体通过减少或消除α1,6键相关酶而展现出低岩藻糖基化，也描述如下细胞系：具有用于将岩藻糖添加至与抗体的Fc区结合的N-乙酰基葡糖胺的低酶活性或不具有酶活性，例如细胞系为大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。国际专利公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系，即Lec 13细胞，其具有降低的将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力，也导致表达于宿主细胞中的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》2002,277,26733-26740。国际专利公开WO 99/54342描述了经工程改造以表达糖蛋白修饰型糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得表达于经工程改造的细胞系中的抗体展现出增加的平分型GlcNac结构，从而提高抗体的ADCC活性(也参见Umana等人,《自然·生物技术(Nat.Biotech.)》1999,17,176-180)。可替代地，可使用岩藻糖苷酶使抗体的岩藻糖残基裂解开。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中移除岩藻糖基残基，如Tarentino等人,《生物化学(Biochem.)》1975,14,5516-5523中所描述。
“聚乙二醇化”指经修饰的抗体或其片段，其通常在一个以上PEG基团连接至抗体或抗体片段的条件下与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。例如，聚乙二醇化可增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。优选地，聚乙二醇化通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”意在涵盖已用于衍生其他蛋白质的PEG的任何形式，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体为去糖基化抗体。聚乙二醇化方法是本领域中已知的且可应用于本发明的抗体，例如欧洲专利第EP 0154316号和欧洲专利第EP 0401384号和美国专利第5,824,778号中所描述的，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“生物类似物”指以下生物产品(包括单克隆抗体或蛋白质)：尽管存在临床非活性成分的少量差异，但与美国许可的参考生物产品高度相似，该生物产品与参考产品之间在产品的安全性、纯度和效能方面不存在临床上有意义的差异。此外，类似生物或“生物类似物”药物为与已被欧洲药物管理局授权使用的另一种生物药物类似的生物药物。术语“生物类似物”也由其他国家和地区监管机构同义地使用。生物产品或生物药物是由生物来源(例如细菌或酵母)制得或衍生的药物。其可由相对较小分子(例如人胰岛素或红细胞生成素)或复杂分子(例如单克隆抗体)组成。例如，若参考IL-2蛋白为阿地白介素(PROLEUKIN)，则由药物监管机构批准的参考阿地白介素的蛋白为“阿地白介素生物类似物”或为“阿地白介素的生物类似物”。在欧洲，类似生物或“生物类似物”药物为与已被欧洲药物管理局(EMA)授权使用的另一种生物药物类似的生物药物。欧洲类似生物应用的相关法律依据是法规(EC)第726/2004号第6条和指令2001/83/EC第10(4)条，经修订且因此在欧洲，生物类似物是可根据法规(EC)第726/2004号第6条和指令2001/83/E的第10(4)条而授权、批准的授权或授权申请的对象。经授权的原始生物药物产品在欧洲可被称为”参考药品”。CHMP关于类似生物药物产品的指南中概述了产品被视为生物类似物的一些要求。此外，产品特定指南，包括与单克隆抗体生物类似物相关的指南，由EMA以逐项产品的方式提供且发布在其网站上。如本文所述的生物类似物可在质量特征、生物活性、作用机制、安全性概况和/或功效方面与参考药品类似。另外，生物类似物可用于或意在用于治疗与参考药品相同的病况。因此，可认为如本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的质量特征。替代地或另外，可认为如本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的生物活性。替代地或另外，可认为如本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的安全性概况。替代地或另外，可认为如本文所述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的功效。如本文所述，在欧洲，已将生物类似物与由EMA授权的参考药品相比较。然而，在一些情况下，在某些研究中，可将生物类似物与在欧洲经济区以外获得授权的生物药品(非EEA授权的“比较物”)相比较。此类研究包括例如某些临床以及体内非临床研究。如本文所用，术语“生物类似物”也涉及已与或可以与非EEA授权的比较物相比较的生物药品。某些生物类似物是蛋白质，例如抗体、抗体片段(例如，抗原结合部分)和融合蛋白。蛋白生物类似物可具有氨基酸序列，其在氨基酸结构中具有不显著影响多肽功能的少量修饰(包括例如氨基酸的缺失、添加和/或取代)。生物类似物可包含与其参考药品的氨基酸序列具有97％或更高(例如97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列。生物类似物可包含与参考药品的翻译后修饰不同的一个以上翻译后修饰，例如(但不限于)糖基化、氧化、去酰胺和/或截短，其限制条件为这些差异不会导致药品的安全性和/或功效的变化。生物类似物可具有与参考药品相同或不同的糖基化模式。特定地，虽然不排他性地，但若差异解决或意在解决与参考药品相关的安全性问题，则生物类似物可具有不同糖基化模式。另外，生物类似物可在例如其强度、药物形式、制剂、赋形剂和/或呈现方式方面与参考药品不同，限制条件为不损害药品的安全性和功效。与参考药品相比，生物类似物可包含例如药物动力学(PK)和/或药效动力学(PD)概况的差异，但仍视为与参考药品充分类似，从而可待授权或视为适于授权。在某些情况下，生物类似物显示出与参考药品相比不同的结合特征，其中，监管机构(例如EMA)未将这些不同结合特征视为类似生物产品获得授权的障碍。术语“生物类似物”也由其他国家和地区监管机构同义地使用。
III.免疫调节剂相关的肿瘤浸润性淋巴细胞
本文提供了经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其包括与TIL细胞表面结合的一种以上免疫调节剂。在一些实施例中，本发明的经修饰的TIL在患者接受者中展现出增强的体内存活率、增殖和/或抗肿瘤作用。
可使用任何适合的方法将免疫调节剂连接至本文公开的TIL(例如，本文提供的治疗性TIL)。在一些实施例中，该一种以上免疫调节剂为连接至TIL细胞表面的免疫调节融合蛋白的一部分。在一些实施例中，该一种以上免疫调节剂作为与TIL细胞表面结合的纳米颗粒的一部分而被包括。免疫调节剂可以为任何促进患者接受者中的TIL存活率、增殖和/或抗肿瘤作用的免疫调节剂。在一些实施例中，免疫调节剂为细胞因子(例如，白介素)。在示例性实施例中，TIL包含IL-12、IL-15和/或IL-21。
任何适合的TIL群体(包括使用本文所述的制造方法制备的TIL)可经修饰以产生本发明的组合物本文所述。在一些实施例中，经修饰的TIL来源于在本文公开的过程2A方法(参见例如图2-图6)的任何步骤期间产生的TIL。在示例性实施例中，经修饰的TIL来源于在本文公开的GEN 3方法(参见例如图7)的任何步骤期间产生的TIL。在一些实施例中，TIL为来源于本文公开的方法的PD-1阳性TIL。
本文进一步详细描述了本发明的经修饰的TIL的方面。
A.免疫调节融合蛋白
在一些实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含免疫调节融合蛋白，其包括免疫调节剂(例如，细胞因子)，该免疫调节剂连接至促进免疫调节剂拴系至TIL的表面的部分。在一些实施例中，融合蛋白包含细胞膜锚部分(跨膜结构域)。在某些实施例中，融合蛋白包含与TIL表面抗原结合的TIL表面抗原结合部分。下文进一步详细讨论了这些融合蛋白的方面。
1.膜锚定的免疫调节融合蛋白
在一些实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含膜锚定的免疫调节融合蛋白。膜锚定的免疫调节融合蛋白包含连接至细胞膜锚部分的免疫调节剂(例如，细胞因子)中的一种以上。在此类实施例中，膜锚定的免疫调节剂通过细胞膜锚部分拴系至TIL表面膜，由此允许免疫调节剂以靶向方式发挥其作用。
免疫调节剂可以是任何适合的免疫调节剂，包括例如本文提供的任何免疫调节剂。在一些实施例中，免疫调节剂为促进抗肿瘤反应的白介素。在一些实施例中，免疫调节剂为细胞因子。在特定实施例中，免疫调节剂为IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或CD40激动剂(例如，CD40L或激动性抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv))或它们的生物活性变体。在某些实施例中，两种以上不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白表达于TIL表面上。在示例性实施例中，TIL包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白。
免疫调节剂连接至将免疫调节剂拴系至TIL细胞表面的细胞膜锚部分。适合的细胞膜锚部分包括例如内源性TIL细胞表面蛋白的跨膜结构域及其片段。可用于本发明的融合蛋白的示例性跨膜结构域包括例如B7-1、B7-2和CD8a跨膜结构域以及它们的片段。在一些实施例中，细胞膜锚部分还包括内源性TIL细胞表面蛋白的跨膜和胞内结构域或其片段。在一些实施例中，细胞膜锚部分为B7-1、B7-2或CD8a跨膜-胞内结构域或其片段。在某些实施例中，细胞膜锚部分为具有IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO：238)的氨基酸序列的CD8a跨膜结构域。在某些实施例中，细胞膜锚部分为具有LLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV(SEQ ID NO：239)的氨基酸序列的B7-1跨膜-胞内结构域。在某些实施例中，细胞膜锚部分为非肽细胞膜锚部分。在示例性实施例中，非肽细胞膜锚部分为糖磷脂酰肌醇(GPI)锚。GPI锚具有包含磷酸乙醇胺接头、聚糖核心和磷脂尾的结构。在一些实施例中，聚糖核心具有一个以上侧链修饰。在一些实施例中，聚糖核心具有以下侧链中的一个以上修饰：磷酸乙醇氨基团、甘露糖、半乳糖、唾液酸或其他糖。
膜锚定的免疫调节融合蛋白包括实现膜锚定的免疫调节融合蛋白的组分(例如，免疫调节剂与细胞膜锚部分)的连接的接头。适合的接头包括长度为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基的接头。在一些实施例中，接头的长度为5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、45-50、50-60个氨基酸。适合的接头包括但不限于：可裂解接头、不可裂解接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋接头或非螺旋接头。在一些实施例中，接头为肽接头，可选地，其包含Gly和Ser。在某些实施例中，肽接头利用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n(SEQ ID NO：240)、(GSGGS)n(SEQ ID NO：241)、(GGGS)n(SEQ ID NO：242)、(GGGGS)n(SEQ ID NO：243)、(GGGGGS)n(SEQ ID NO：244)和(GGGGGGS)n(SEQ ID NO：245)，其中n为至少一的整数(且通常为3至10)。可与本发明的组合物和方法一起使用的其他接头描述于美国专利公开第US2006/0074008号、第US 20050238649号和第US2006/0024317号中，其各自以全文(尤其与接头有关的相关部分)引用的方式并入本文中。在一些实施例中，肽接头为SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ(SEQ ID NO：246)。
在一些实施例中，接头为可裂解接头。在示例性实施例中，可裂解接头允许将免疫调节剂释放至肿瘤微环境中。可裂解接头也适用于两个膜锚定的免疫调节融合蛋白在同一TIL中共表达的实施例(参见例如图36以及表58和表59)。在示例性实施例中，接头为自裂解2A肽。参见例如Liu等人,《科学报导(Sci.Rep.)》7(1):2193(2017)，其与2A肽有关的相关部分以引用的方式本文中。2A肽为病毒寡肽，其介导真核细胞翻译期间的多肽的裂解。在一些实施例中，2A肽包括具有氨基酸序列GDVEXiNPGP(SEQ ID NO：247)的C末端，其中Xi为任何天然存在的氨基酸残基。在某些实施例中，2A肽为猪捷申病毒-1 2A肽(GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP，SEQ ID NO：248)。在一些实施例中，2A肽为马鼻炎A病毒2A肽(GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP，SEQ ID NO：249)。在某些实施例中，2A肽为口蹄疫病毒2A肽：(GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP，SEQ ID NO：250)。在一些实施例中，可裂解接头包括弗林蛋白酶可裂解序列。示例性弗林蛋白酶可裂解序列描述于例如Duckert等人,《蛋白工程改造、设计和选择(Protein Engineering,Design&Selection)》17(1):107-112(2004)以及美国专利第8,871,906号中，其各自以引用的方式并入本文中，尤其与弗林蛋白酶可裂解序列有关的相关部分。在一些实施例中，接头包括2A肽和弗林蛋白酶可裂解序列。在示例性实施例中，弗林蛋白酶可裂解2A肽包括氨基酸序列RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：251)。
在一些实施例中，免疫调节剂通过可降解接头(例如，二硫键接头)连接在膜锚定的免疫调节融合蛋白中，使得接头在生理条件下降解，从而释放免疫调节剂。在一些实施例中，免疫调节剂通过可降解接头可逆地连接至官能基团，使得接头在生理条件下降解并释放免疫调节剂。适合的可降解接头包括但不限于：对生物培养基中存在的一种以上酶敏感的蛋白酶敏感性接头，该一种以上酶为例如肿瘤微环境中的蛋白酶、例如肿瘤微环境或发炎组织中存在的基质金属蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶2(MMP2)或基质金属蛋白酶9(MMP9))。
在其他实施例中，膜锚定的免疫调节融合蛋白的组分由酶敏感性接头连接。示例性可裂解接头包括由以下酶中的一种识别的可裂解接头：金属蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、纤维蛋白溶酶、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、半胱天冬蛋白酶半胱天冬蛋白酶-1、半胱天冬蛋白酶-2、半胱天冬蛋白酶-3、半胱天冬蛋白酶-4、半胱天冬蛋白酶-5、半胱天冬蛋白酶-6、半胱天冬蛋白酶-7、半胱天冬蛋白酶-8、半胱天冬蛋白酶-9、半胱天冬蛋白酶-10、半胱天冬蛋白酶-11、半胱天冬蛋白酶-12、半胱天冬蛋白酶-13、半胱天冬蛋白酶-14和TACE。参见例如美国专利第8,541,203号和第8,580,244号，其全部内容及与可裂解接头有关的相关部分各自以引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，膜锚定的免疫调节融合蛋白包含信号肽，其促进融合蛋白易位至TIL细胞膜。可使用任何适合的促进融合蛋白定位至TIL细胞膜的信号肽。在一些实施例中，信号肽不干扰免疫调节剂的生物活性。示例性信号肽序列包括(但不限于)：人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、受体信号序列、人催乳素信号序列和人IgE信号序列。在某些实施例中，融合蛋白包含人IgE信号序列。在示例性实施例中，人IgE信号序列具有氨基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：252)。在一些实施例中，人IgE信号序列包括氨基酸序列NIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP(SEQ ID NO：253)。在一些实施例中，信号肽序列为具有氨基酸序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO：254)的IL-2信号序列。
在一些实施例中，膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端根据下式：
S-IA-L-C，
式中，S为信号肽，IA为免疫调节剂，L为接头，C为细胞膜锚部分。
在一些实施例中，信号肽S为SEQ ID NO：252-254中的任一者。在一些实施例中，细胞膜锚部分为SEQ ID NO：277。在示例性实施例中，免疫调节剂为IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或CD40激动剂(例如，本文所述的CD40L或抗CD40 scFv)。在一些实施例中，C为B7-1跨膜-胞内结构域(例如，SEQ ID NO：239)。根据上式的示例性膜锚定的免疫调节融合蛋白描绘于图36和图37中。
在一些实施例中，TIL包含两种以上不同的自N末端至C末端根据下式的膜锚定的免疫调节融合蛋白：S-IA-L-C，式中，不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白中的每一种包含不同的免疫调节剂。在一些实施例中，两种以上不同的免疫调节剂选自：IL-12和IL-15、IL-15和IL-18、CD40L和IL-15、IL-15和IL-21以及IL-2和IL-12。
在包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白的一些实施例中，膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端根据下式排列：
S1-IA1-L1-C1-L2-S2-IA2-L3-C2，
式中，S1和S2各自为信号肽，IA1和IA2各自为免疫调节剂，L1-L3各自为接头，C1和C2各自为细胞膜锚部分。在一些实施例中，IA1和IA2为相同的免疫调节剂。在某些实施例中，IA1和IA2为不同的免疫调节剂。适合的免疫调节剂包括本文所述的任何免疫调节剂。在一些实施例中，IA1和IA2独立地选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、CD40激动剂(例如，CD40L或激动性抗CD40结合结构域(例如抗CD40 scFv))或它们的生物活性变体。在一些实施例中，IA1和IA2选自：IL-12和IL-15、IL-15和IL-18、CD40L和IL-15、IL-15和IL-21以及IL-2和IL-12。在一些实施例中，L1至L3中的一个以上为可裂解接头。在一些实施例中，L1至L3中的两个以上为不同的接头。在示例性实施例中，L2为可裂解接头。在一些实施例中，L2为弗林蛋白酶可裂解P2A接头(例如，SEQ ID NO：251)。在一些实施例中，C1和C2独立地为跨膜结构域和/或跨膜-胞内结构域。在某些实施例中，C1与C2是相同的。在示例性实施例中，C1和C2各自为B7-1跨膜-胞内结构域(例如，SEQ ID NO：239)。在示例性实施例中，C1和C2是不同的。包含两个根据上式的膜锚定的免疫调节融合蛋白的示例性构建体描绘于图36以及表58和表59中。
可通过基因修饰TIL群体以包含编码融合蛋白的核酸来制备包含与表面结合的细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白的经修饰的TIL。可使用任何适合的基因修饰方法以产生此类经修饰的TIL，包括例如本文所述的CRISPR、TALE和锌指方法。
任何适合的TIL群体可经基因修饰以产生本发明的经修饰的TIL组合物。在一些实施例中，在本发明的过程2A方法(参见例如图2至图6)的任何步骤期间产生的TIL群体经基因修饰以产生本发明的经修饰的TIL。在示例性实施例中，在本发明的GEN 3方法(参见例如图7)的任何步骤期间产生的TIL群体经基因修饰以产生本发明的经修饰的TIL。在示例性实施例中，由本文提供的过程2A方法中的第二步骤和/或GEN 3方法中的快速扩增步骤产生的TIL经基因修饰以产生本发明的经修饰的TIL。在一些实施例中，已使用本文所述的方法预先选择的PD-1阳性TIL经基因修饰以产生本发明的经修饰的TIL。
任何适合的TIL群体可经瞬时修饰以产生本发明的经瞬时修饰的TIL组合物。在一些实施例中，在本发明的过程2A方法(参见例如图2至图6)的任何步骤期间产生的TIL群体经编码细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸转染，以在本发明的经瞬时修饰的TIL中瞬时表达细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白。在示例性实施例中，在本发明的GEN 3方法(参见例如图7)的任何步骤期间产生的TIL群体经编码细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸转染，以在本发明的经瞬时修饰的TIL中瞬时表达细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白。在示例性实施例中，由本文提供的过程2A方法中的第一扩增步骤和/或GEN 3方法中的起始扩增步骤产生的TIL经编码细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸转染，以在本发明的经瞬时修饰的TIL中瞬时表达细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白。在示例性实施例中，由本文提供的过程2A方法中的第二扩增步骤和/或GEN 3方法中的快速扩增步骤产生的TIL经编码细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸转染，以在本发明的经瞬时修饰的TIL中瞬时表达细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，已使用本文所述的方法预先选择的PD-1阳性TIL经编码细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸转染，以在本发明的经瞬时修饰的TIL中瞬时表达细胞膜锚定的免疫调节融合蛋白。
本文还提供了编码膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸、包含此类核酸的表达载体和包含核酸或表达载体的宿主细胞。任何适合的启动子均可用于膜锚定的免疫调节融合蛋白的表达。在示例性实施例中，启动子为诱导性启动子。编码示例性膜锚定的免疫调节融合蛋白和此类融合蛋白的组分的示例性核酸描绘于图36和图37以及表58和表59中。
在一些实施例中，编码膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸为mRNA。在示例性实施例中，mRNA具有一种以上改善mRNA的细胞内稳定性和/或翻译效率的修饰。在一些实施例中，mRNA具有改善mRNA半衰期的5'帽(cap)或帽类似物。示例性帽结构包括(但不限于)ARCA、mCAP、m7GpppN(帽0)、m7GpppNm(帽1)和m7GpppNmpNm(帽2)帽。在一些实施例中，5'帽为根据下式：m7Gppp[N2'Ome]n[N]m，式中，m7G为N7-甲基化鸟苷或任何鸟苷类似物，N为任何天然、经修饰或非天然核苷，n可为0至4的任何整数，m可为1至9的整数。示例性5'帽公开于美国专利第10,703,789号和WO2017053297中，其以全文(尤其与5'帽和帽类似物相关的公开内容)引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，编码膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸为mRNA，其还包含3'非翻译区(UTR)或经修饰的UTR。已知3'UTR具有腺苷和尿苷的延伸部分。这些富含AU的标记在具有高转化率的基因中尤其普遍。基于其序列特征和功能特性，富含AU的元件(ARE)可分为三类(Chen等人,1995)：I类ARE在富含U的区域内含有若干分散的AUUUA基序的拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个以上重叠UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有此类型的ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III类ARE的定义不太明确。这些富含U的区域不含AUUUA基序。c-Jun和成肌素(myogenin)为此类别的两个充分研究的实例。已知大部分与ARE结合的蛋白质使信使去稳定化，而已记录ELAV家族成员(最显著地，HuR)提高mRNA的稳定性。HuR与所有三种类别的ARE结合。将HuR特异性结合位点工程改造至核酸分子的3'UTR中将导致HuR结合，因此引起体内信息的稳定。
3'UTR富含AU的元件(ARE)的引入、移除或修饰可用于调节本文所述的核酸的稳定性。当工程改造特定核酸时，可引入ARE的一个以上拷贝以使本发明的多核苷酸更不稳定从而减少翻译以及减少所得蛋白质的产生。类似地，可识别ARE并将其移除或使其突变以提高胞内稳定性，由此增加所得蛋白质的翻译和产生。可在相关细胞系中使用核酸进行转染实验，可在转染后的各时间点分析蛋白质的产生。例如，可以用不同的ARE工程改造分子转染细胞，通过使用针对相关蛋白质的ELISA试剂盒在转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天分析所产生的蛋白质。
在一些实施例中，编码膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸可操作地连接至活化T细胞核因子(NFAT)启动子或其功能部分或功能变体。如本文中所使用的“NFAT启动子”指一个以上连接至由T细胞表达的任何基因的最小启动子的NFAT应答元件。优选地，由T细胞表达的基因的最小启动子为最小人IL-2启动子。NFAT应答元件可包含例如NFATl、NFAT2、NFAT3和/或NFAT4应答元件。NFAT启动子(或其功能部分或功能变体)可包含任何数目的结合基序，例如至少两个、至少三个、至少四个、至少五个，或至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或至多十二个结合基序。
表4：NFAT启动子相关序列
在优选实施例中，NFAT启动子包含六个NFAT结合基序。参见例如美国专利第8,556,882号，其以全文(尤其与NFAT启动子有关的相关部分)引用的方式并入本文中。在一些实施例中，NFAT启动子系统控制包含本文所述的任何免疫调节剂的免疫调节融合蛋白的表达。在某些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv))或它们的生物活性变体。编码可操作地连接至NFAT启动子的本发明的示例性膜锚定的免疫调节融合蛋白的示例性核酸描绘于表59中。在一些实施例中，NFAT启动子系统控制包含IL-15的免疫调节融合蛋白的表达。在一些实施例中，NFAT启动子系统控制包含IL-21的免疫调节融合蛋白的表达。在一些实施例中，NFAT启动子系统控制包含IL-15和IL-21的免疫调节融合蛋白的表达。
在一些实施例中，本发明提供一种TIL，其经基因修饰以包含编码可操作地连接至NFAT启动子的免疫调节融合蛋白的DNA。在一些实施例中，NFAT启动子控制编码包含本文所述的任何免疫调节剂的免疫调节融合蛋白的DNA的表达。在某些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv))或它们的生物活性变体。在一些实施例中，NFAT启动子控制编码包含IL-15的免疫调节融合蛋白的DNA的表达。在一些实施例中，NFAT启动子控制编码包含IL-21的免疫调节融合蛋白的DNA的表达。在一些实施例中，NFAT启动子控制编码包含IL-15和IL-21的免疫调节融合蛋白的DNA的表达。
在一些实施例中，本发明提供一种TIL，其经基因修饰以包含编码可操作地连接至NFAT启动子的免疫调节融合蛋白的DNA，其中，免疫调节融合蛋白自N末端至C末端根据下式排列：
S1-IA1-L1-C1-L2-S2-IA2-L3-C2，
式中，S1和S2各自为信号肽，IA1和IA2各自为免疫调节剂，L1至L3各自为接头，C1和C2各自为细胞膜锚部分。在一些实施例中，IA1和IA2为相同的免疫调节剂。在某些实施例中，IA1和IA2为不同的免疫调节剂。适合的免疫调节剂包括本文所述的任何免疫调节剂。在一些实施例中，IA1和IA2独立地选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、CD40激动剂(例如，CD40L或激动性抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv))或它们的生物活性变体。在一些实施例中，IA1和IA2选自：IL-12和IL-15、IL-15和IL-18、CD40L和IL-15、IL-15和IL-21以及IL-2和IL-12。在一些实施例中，IA1和IA2独立地选自IL-15和IL-21。在一些实施例中，IA1为IL-15，IA2为IL-21。在一些实施例中，IA1为IL-21，IA2为IL-15。在一些实施例中，L1至L3中的一个以上为可裂解接头。在一些实施例中，L1至L3中的两个以上为不同的接头。在示例性实施例中，L2为可裂解接头。在一些实施例中，L2为弗林蛋白酶可裂解P2A接头(例如，SEQID NO：251)。在一些实施例中，C1和C2独立地为跨膜结构域和/或跨膜-胞内结构域。在某些实施例中，C1与C2是相同的。在示例性实施例中，C1和C2各自为B7-1跨膜-胞内结构域(例如，SEQ ID NO：239)。在示例性实施例中，C1和C2是不同的。包含两个根据上式的膜锚定的免疫调节融合蛋白的示例性构建体描绘于图36中。
可使用任何适合的方法将编码本发明的膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸引入TIL群体中，以产生表达膜锚定的免疫调节融合蛋白的经瞬时修饰或经基因修饰的TIL。在一些实施例中，使用微流体平台将编码膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸引入TIL群体中。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。参见例如国际专利申请公开第WO2013/059343A1号、第WO 2017/008063A1号或第WO 2017/123663A1号或美国专利申请公开第US2014/0287509A1号、第US2018/0201889A1号或第US2018/0245089A1号，其均以全文(尤其关于用于核酸递送的微流体平台的公开内容)引用的方式并入本文中。在SQZ平台中，通过微流体收缩来暂时性破坏用于修饰的细胞(例如，TIL)的细胞膜，从而实现将编码膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸递送至细胞中。
在一些实施例中，编码膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸为mRNA，使用微流体平台(例如，SQZ无载体微流体平台)将mRNA递送至TIL中以产生经瞬时修饰的TIL。在一些实施例中，编码膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸为DNA，使用微流体平台(例如，SQZ无载体微流体平台)将DNA递送至TIL中以产生稳定的经基因修饰的TIL。可使用微流体平台(例如，SQZ无载体微流体平台)将核酸递送至在本发明的过程2A方法(参见例如图2至图6)或本发明的GEN 3方法(参见例如图7)的任何步骤期间产生的任何TIL群体中，以产生经修饰的TIL。在一些实施例中，膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、CD40激动剂(例如，CD40L或激动性抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv))或它们的任何组合。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-15。在一些实施例中，第二免疫调节剂为IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、CD40L或抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv)。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为CD40L。在一些实施例中，第二免疫调节剂为IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、CD40激动剂(例如，CD40L或激动性抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv))或它们的生物活性变体。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-12。在一些实施例中，第二免疫调节剂为IL-2、IL-15、IL-18、IL-21、CD40L或抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv)。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-18。在一些实施例中，第二免疫调节剂为IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、CD40L或抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv)。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-21。在一些实施例中，第二免疫调节剂为IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、CD40L或抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv)。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-2。在一些实施例中，第二免疫调节剂为IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、CD40L或抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv)。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-2，第二免疫调节剂为IL-12。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-2，第二免疫调节剂为IL-15。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-2，第二免疫调节剂为IL-18。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-2，第二免疫调节剂为IL-21。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-2，第二免疫调节剂为CD40L或抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv)。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-12，第二免疫调节剂为IL-15。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-12，第二免疫调节剂为IL-18。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-12，第二免疫调节剂为IL-21。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-12，第二免疫调节剂为CD40L或抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv)。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-15，第二免疫调节剂为IL-18。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-15，第二免疫调节剂为IL-21。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-15，第二免疫调节剂为CD40L或抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv)。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-18，第二免疫调节剂为IL-21。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-18，第二免疫调节剂为CD40L或抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv)。
在示例性实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含两个膜锚定的免疫调节融合蛋白，其各自包含不同的免疫调节剂(即，第一和第二免疫调节剂)，其中，第一免疫调节剂为IL-21，第二免疫调节剂为CD40L或抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv)。
可包含于本文提供的经修饰的TIL中的其他膜锚定的免疫调节融合蛋白描述于WO2019/157130A1中，其以全文(尤其与膜锚定的免疫调节融合蛋白有关的相关部分)引用的方式并入本文中。
包含于本文提供的经修饰的TIL中的示例性膜锚定的免疫调节融合蛋白描绘于图36和图37以及表58和表59中。
在一些实施例中，编码上文所描述的任何膜锚定的免疫调节融合蛋白的核酸可操作地连接至NFAT启动子或其功能部分或功能变体。
2.免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白
在一些实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含免疫调节融合蛋白，其中，此类融合蛋白包含一种以上连接至TIL抗原结合结构域(ABD)的免疫调节剂。在一些实施例中，在TIL ABD结合至TIL表面抗原后，一种以上免疫调节剂被拴系至TIL表面膜。
TIL抗原结合结构域包含抗体重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。在一些实施例中，TIL抗原结合结构域为全长抗体，其包含根据式VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链和根据式VL-CL的轻链，其中，VH为重链可变结构域，CH1、CH2、CH3为重链恒定结构域，VL为轻链可变结构域，CL为轻链恒定结构域。在一些实施例中，TIL抗原结合结构域为抗体片段。在某些实施例中，TIL抗原结合结构域为Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)2、可变片段(Fv)、结构域抗体(dAb)或单链可变片段(scFv)。
TIL抗原结合结构域可结合任何适合的可实现免疫调节剂-TIL ABD融合蛋白与TIL的表面的连接的TIL抗原。在示例性实施例中，TIL抗原结合结构域能够结合TIL表面抗原。TIL表面抗原包括(但不限于)D16、CD45、CD4、CD8、CD3、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、LFA-1、CD25、CD127、CD56、CD19、CD20、CD22、HLA-DR、CD197、CD38、CD27、CD137、OX40、GITR、CD56、CD196、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CD84、CD229、CCR1、CCR5、CCR4、CCR6、CCR8和/或CCR10。在一些实施例中，ABD结合CD45。在特定实施例中，ABD结合选自CD45RA、CD45RB、CD45RC或CD45Rβ的CD45异构体。在特定实施例中，ABD结合主要表达于T细胞上的CD45。
在某些实施例中，ABD结合检查点抑制剂。示例性检查点抑制剂包括(但不限于)PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3和CTLA-4(参见例如Qin等人,《分子癌症(Molecular Cancer)》18:155(2019))。在一些实施例中，ABD结合表达于免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)上的检查点抑制剂。示例性抗PD-1抗体公开于例如美国专利第US 7,695,715号、第US 7,332,582号、第US 9,205,148号、第US 8,686,119号、第US 8,735,553号、第US 7,488,802号、第US 8,927,697号、第US 8,993,731号和第US 9,102,727号中，其以全文(尤其与抗PD-1抗体有关的相关部分)引用的方式并入本文中。示例性抗PD-L1抗体公开于美国专利第US 8,217,149号、第US 8,779,108号、第US 8,168,179号、第US 8,552,154号、第US 8,460,927号和第US 9,175,082号中，其以全文(尤其与抗PD-L1抗体有关的相关部分)引用的方式并入本文中。示例性抗LAG-3抗体公开于美国专利第US 9,244,059号、第US 9,244,059号、第US9,505,839号中，其以全文(尤其与抗LAG-3抗体有关的相关部分)引用的方式并入本文中。示例性TIM-3抗体公开于WO 2016/161270、US 8,841,418和US 9,163,087中，其以全文(尤其与抗TIM-3抗体有关的相关部分)引用的方式并入本文中。示例性CTLA-4抗体公开于US6,984,720和US 7,411,057中，其以全文(尤其与抗CTLA-4抗体有关的相关部分)引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，ABD为抗CD45抗体或其片段。在某些实施例中，抗CD45抗体为人抗CD45抗体、人源化抗CD45抗体或嵌合抗CD45抗体。在示例性实施例中，ABD包含抗CD45抗体BC8的vhCDR1-3和vlCDR1-3(参见US20170326259，其以引用的方式并入本文中，尤其与抗CD45抗体序列有关的相关部分)。在一些实施例中，ABD包含抗CD45抗体BC8的重链可变结构域和可变结构域。在一些实施例中，ABD包含以下抗CD45抗体中的一种的VhCDR1-3和vlCDR1-3或VH和VL：10G10、UCHL1、9.4、4B2或GAP8.3(参见Spertini等人,《免疫学(Immunology)》113(4):441-452(2004)，Buzzi等人,《癌症研究(Cancer Research)》52:4027-4035(1992))。
免疫调节融合蛋白可为任何适合的免疫调节剂，包括例如本文提供的任何免疫调节剂。在一些实施例中，免疫调节剂为促进抗肿瘤反应的白介素。在一些实施例中，免疫调节剂为细胞因子。在特定实施例中，免疫调节剂为IL-2、IL-12、IL-15、IL-21或它们的生物活性变体。在某些实施例中，融合蛋白包含超过一种免疫调节剂。在示例性实施例中，融合蛋白包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的免疫调节剂。
使用任何适合的接头将TIL抗原结合结构域连接至免疫调节剂。适合的接头包括(但不限于)：可裂解接头、不可裂解接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋接头或非螺旋接头。在一些实施例中，接头为肽接头，其可选地包含Gly和Ser。适合的接头包括长度为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基的接头。在一些实施例中，接头的长度为5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、45-50或50-60个氨基酸。在某些实施例中，肽接头为(GGGS)n或(GGGGS)n接头，其中n指示基序的重复数且为选自1至10的整数。在一些实施例中，接头为抗体铰链结构域或其片段。在某些实施例中，接头为人免疫球蛋白(Ig)铰链结构域(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE、IgM或IgA铰链)或其片段。在一些实施例中，免疫调节剂直接与TIL偶合而不存在接头。
免疫调节剂可在不妨碍融合蛋白与TIL的结合的适当位置连接至TIL抗原结合结构域。在抗原结合结构域为全长抗体的一些实施例中，免疫调节剂连接至重链或轻链的C末端或N末端。在抗原结合结构域为scFv的一些实施例中，免疫调节剂连接至重链可变结构域或轻链可变结构域的C末端或N末端。在抗原结合结构域为Fab的一些实施例中，免疫调节剂连接至重链可变结构域或轻链可变结构域的C末端或N末端。在抗原结合结构域为Fab'的一些实施例中，免疫调节剂连接至重链可变结构域或轻链可变结构域的C末端或N末端。在抗原结合结构域为Fab'2的一些实施例中，免疫调节剂连接至重链可变结构域或轻链可变结构域的C末端或N末端。
在融合蛋白包含两种以上免疫调节剂的一些实施例中，使用本文所述的任何使免疫调节剂互相连接。在一些实施例中，两种以上免疫调节剂连接至抗原结合结构域的不同位置。例如，在TIL抗原结合结构域为全长抗体的一些实施例中，两种以上免疫调节剂在以下位置连接：(i)重链上的不同位置，(ii)轻链上的不同位置，或(iii)重链和/或轻链上的不同位置。
可使用任何适合的方法制备本发明的免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白。一方面，本文提供了编码本发明的融合蛋白的核酸、包含此类核酸的表达载体和包含表达载体的宿主细胞。在用于融合蛋白的表达的条件下培养包含编码本发明的融合蛋白的表达载体的宿主细胞，然后分离和纯化融合蛋白。在一些实施例中，然后将经纯化的融合蛋白与TIL群体一起在实现融合蛋白与TIL的结合的条件下孵育。
在一些实施例中，本发明的免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白连接至在本发明的过程2A方法(参见例如图2至图6)的任何步骤期间产生的TIL。在示例性实施例中，融合蛋白连接至在本发明的GEN 3方法(参见例如图7)的任何步骤期间产生的TIL。在示例性实施例中，融合蛋白连接至由本文提供的过程2A方法中的第一扩增步骤和/或GEN 3方法中的起始扩增步骤产生的TIL。在示例性实施例中，融合蛋白连接至由本文提供的过程2A方法中的第二扩增步骤和/或GEN 3方法中的快速扩增步骤产生的TIL。在一些实施例中，TIL为已使用本文所述的方法预先选择的PD-1阳性TIL。
可使用任何适合的方法将编码本发明的免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白的核酸引入TIL群体中，以产生表达本发明的免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白的经瞬时修饰或经基因修饰的TIL。在一些实施例中，使用微流体平台将编码本发明的免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白的核酸引入TIL群体中。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。参见例如国际专利申请公开第WO 2013/059343A1号、第WO 2017/008063A1号或第WO 2017/123663A1号或美国专利申请公开第US2014/0287509A1号、第US2018/0201889A1号或第US2018/0245089A1号，其均以全文(尤其关于用于核酸递送之微流体平台的公开内容)引用的方式并入本文中。在SQZ平台中，通过微流体收缩来暂时性破坏用于修饰的细胞(例如，TIL)的细胞膜，从而实现将编码免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白的核酸递送至细胞中。
在一些实施例中，编码本发明的免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白的核酸为mRNA，使用微流体平台(例如SQZ无载体微流体平台)将mRNA递送至TIL中以产生经瞬时修饰的TIL。在一些实施例中，编码本发明的免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白的核酸为DNA，使用微流体平台(例如SQZ无载体微流体平台)将核酸递送至TIL中以产生稳定的经基因修饰的TIL。可使用微流体平台(例如SQZ无载体微流体平台)将核酸递送至在本发明的过程2A方法(参见例如图2至图6)或本发明的GEN 3方法(参见例如图7)的任何步骤期间产生的任何TIL群体中，以产生经修饰的TIL。在一些实施例中，膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-2、IL-12、IL-15、IL-21或它们的组合(例如，IL-15和IL-21)。
适用于本文提供的组合物和方法的示例性免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白也描述于例如美国专利申请公开第20200330514号中，其全部内容及与免疫调节剂-TIL抗原结合结构域融合蛋白有关的相关部分以引用的方式并入本文中。
B.纳米颗粒组合物
在一些实施例中，本文提供的本发明的经修饰的TIL包含一种以上纳米颗粒，这些纳米颗粒包含一种以上免疫调节剂。在一些实施例中，本文提供的纳米颗粒包含互相和/或与颗粒的第二组分偶合(例如，通过可降解接头可逆地连接)的两种以上蛋白质中的多种。在一些实施例中，纳米颗粒的蛋白质存在于聚合物或二氧化硅中。在某些实施例中，纳米颗粒包括纳米壳。本文提供的纳米颗粒包含一种以上免疫调节剂。在一些实施例中，免疫调节剂为IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、CD40激动剂(例如，CD40L或激动性抗CD40结合结构域(例如，抗CD40 scFv))或它们的生物活性变体。使用本文所述的任何适合的技术将纳米颗粒连接至TIL的表面。
用于本文提供的本发明的经修饰的TIL中的示例性纳米颗粒包括(但不限于)脂质体、蛋白纳米凝胶、核苷酸纳米凝胶、聚合物纳米颗粒或固态纳米颗粒。在一些实施例中，纳米颗粒包括脂质体。在示例性实施例中，纳米颗粒包括免疫调节剂纳米凝胶。在特定实施例中，纳米颗粒为具有多种互相共价连接的免疫调节剂(例如细胞因子)的免疫调节剂纳米凝胶。在一些实施例中，纳米颗粒包含纳米颗粒表面上的至少一种聚合物、阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。可用于本文提供的组合物中的示例性纳米颗粒公开于例如美国专利第9,283,184号和第9,603,944号中，其全部内容及与纳米颗粒有关的相关部分各自以引用的方式并入本文中。
免疫调节剂可以为任何适合的免疫调节剂，包括例如本文提供的任何免疫调节剂。在一些实施例中，免疫调节剂为促进抗肿瘤反应的白介素。在一些实施例中，免疫调节剂为细胞因子。在特定实施例中，免疫调节剂为IL-2、IL-12、IL-15、IL-21或它们的生物活性变体。在某些实施例中，融合蛋白包含超过一种免疫调节剂。在示例性实施例中，融合蛋白包含2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的免疫调节剂。
在一些实施例中，纳米颗粒包含互相和/或与第二组分(例如，可降解接头)共价交联的蛋白质。在一些实施例中，纳米颗粒包含通过可降解接头连接至官能基团或聚合物或“经可逆修饰”的免疫调节剂。在一些实施例中，纳米颗粒为纳米凝胶，其包含多种通过可降解接头互相交联的免疫调节剂(参见美国专利第9,603,944号)。在示例性实施例中，纳米凝胶的蛋白质与聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))交联。在一些实施例中，聚合物与纳米凝胶表面交联。
在一些实施例中，纳米颗粒的免疫调节剂通过可降解接头(例如，二硫键接头)互相可逆地连接，使得接头在生理条件下降解，从而释放免疫调节剂。在一些实施例中，纳米颗粒的免疫调节剂通过可降解接头可逆地连接至官能基团，使得接头在生理条件下降解并释放免疫调节剂。适合的可降解接头包括(但不限于)：通过柔性的含有二硫键的接头接合在一起的两个N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基团，该接头对还原性生理环境敏感；对酸性生理环境(pH<7，例如，4至5、5至6或6至小于7，例如，6.9的pH值)敏感的可水解接头，或对生物培养基中存在的一种以上酶(例如肿瘤微环境中的蛋白酶，例如肿瘤微环境或发炎组织中存在的基质金属蛋白酶(例如，基质金属蛋白酶2(MMP2)或基质金属蛋白酶9(MMP9)))敏感的蛋白酶敏感性接头。对还原性生理环境敏感的交联剂为例如具有含有二硫键的接头的交联剂，其将通过存在NHS基团而与蛋白质上的氨基反应，从而使蛋白质交联成高密度蛋白纳米凝胶。在一些实施例中，可降解交联剂包括双[2-(N-丁二酰亚氨基-氧基羰基氧基)乙基]二硫化物。
在一些实施例中，可降解接头包含至少一种N-羟基琥珀酰亚胺酯。在一些实施例中，可降解接头为氧化还原反应性接头。在一些实施例中，氧化还原反应性接头包含二硫键。在一些实施例中，本文提供的可降解接头包含至少一种N-羟基琥珀酰亚胺酯，其能够与蛋白质在中性pH值(例如，约6至约8，或约7)下反应而基本上不会使蛋白质变性。在一些实施例中，可降解接头为“氧化还原反应性”接头，指其在存在还原剂(例如，谷胱甘肽、GSH)的情况下，在生理条件(例如，20至40℃和/或pH 4至8)下降解，从而使与其可逆地连接的完整蛋白质自化合物释放。在一些实施例中，纳米颗粒的蛋白质通过末端或内部-NH2官能基团(例如，赖氨酸的侧链)连接至可降解接头。
在其他实施例中，纳米颗粒的蛋白质通过酶敏感性接头连接。示例性可裂解接头包括由以下酶种的一种识别的可裂解接头：金属蛋白酶MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、纤维蛋白溶酶、PSA、PSMA、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、半胱天冬蛋白酶-1、半胱天冬蛋白酶-2、半胱天冬蛋白酶-3、半胱天冬蛋白酶-4、半胱天冬蛋白酶-5、半胱天冬蛋白酶-6、半胱天冬蛋白酶-7、半胱天冬蛋白酶-8、半胱天冬蛋白酶-9、半胱天冬蛋白酶-10、半胱天冬蛋白酶-11、半胱天冬蛋白酶-12、半胱天冬蛋白酶-13、半胱天冬蛋白酶-14和TACE。参见例如美国专利第8,541,203号和第8,580,244号，其全部内容和与可裂解接头有关的相关部分各自以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，纳米颗粒为纳米凝胶，其包括单分散的多种免疫调节剂(例如，细胞因子)。在一些实施例中，纳米凝胶的免疫调节剂与聚合物交联。在某些实施例中，聚合物与纳米凝胶的表面交联。在特定实施例中，纳米凝胶包括：a)一种以上通过可降解接头而互相可逆共价交联的免疫调节剂；和b)与纳米凝胶的表面暴露的蛋白质交联的聚合物。此类纳米凝胶可通过使一种以上免疫调节剂与可降解接头在以下条件下接触来制备：允许免疫调节剂通过可降解接头而互相可逆地共价交联以形成多种免疫调节剂纳米凝胶。然后，使免疫调节剂纳米凝胶与聚合物(例如，聚乙二醇)在允许聚合物与免疫调节剂纳米凝胶的免疫调节剂交联的条件下接触，从而产生多种免疫调节剂-聚合物纳米凝胶。
在一些实施例中，纳米颗粒包含一种以上聚合物。示例性聚合物包括(但不限于)：脂肪族聚酯、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸与乙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚酸酐、聚(邻)酯(poly(ortho)ester)、聚氨基甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯)，和天然聚合物(例如褐藻酸盐和其他多糖(包括聚葡萄糖和纤维素)、胶原蛋白、它们的化学衍生物(包括化学基团(例如烷基、伸烷基)的取代、添加；羟基化；氧化；和本领域技术人员常规进行的其他修饰)、白蛋白和其他亲水性蛋白质、玉米蛋白和其他谷醇溶蛋白和疏水性蛋白质，它们的共聚物和混合物)。在一些实施例中，纳米颗粒的免疫调节剂连接至亲水性聚合物。示例性亲水性聚合物包括(但不限于)：聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇-b-聚赖氨酸(PEG-PLL)和/或聚乙二醇-b-聚精氨酸(PEG-PArg)。
在一些实施例中，纳米颗粒(例如，纳米凝胶)在其表面上包含一种以上聚阳离子。用于本发明的纳米颗粒的示例性聚阳离子包括(但不限于)聚赖氨酸(聚-L-赖氨酸和/或聚-D-赖氨酸)、聚(精氨酸甘油基丁二酸酯)(PAGS，基于精氨酸的聚合物)、聚乙二亚胺、聚组氨酸、聚精氨酸、鱼精蛋白硫酸酯、聚乙二醇-b-聚赖氨酸(PEG-PLL)和聚乙二醇-g-聚赖氨酸。
在一些实施例中，纳米颗粒通过对TIL静电引力而与TIL表面缔合。在某些实施例中，纳米颗粒包含对TIL的表面分子(例如，表面蛋白质、碳水化合物和/或脂质)具有亲和力的配体。
在特定实施例中，纳米颗粒包含结合如本文所述的TIL表面抗原的抗原结合结构域。在一些实施例中，抗原结合结构域为抗体或其片段。在示例性实施例中，TIL表面抗原为CD45、LFA-1、CD 11a(整合素α-L)、CD 18(整合素β-2)、CD11b、CD11c、CD25、CD8或CD4。在示例性实施例中，抗原结合结构域(ABD)为抗CD45抗体或其片段。在某些实施例中，抗CD45抗体为人抗CD45抗体、人源化抗CD45抗体或嵌合抗CD45抗体。在示例性实施例中，ABD包含抗CD45抗体BC8的vhCDR1-3和vlCDR1-3(参见US20170326259，其以引用的方式并入本文中，尤其与抗CD45抗体序列有关的相关部分)。在一些实施例中，ABD包含抗CD45抗体BC8的重链可变结构域和可变结构域。在一些实施例中，ABD包含以下抗CD45抗体中的一种的VhCDR1-3和vlCDR1-3或VH和VL：10G10、UCHL1、9.4、4B2或GAP8.3(参见Spertini等人,《免疫学(Immunology)》113(4):441-452(2004)，Buzzi等人,《癌症研究(Cancer Research)》52:4027-4035(1992))。在此类实施例中，通过在存在纳米颗粒的情况下，在纳米颗粒结合至TIL的表面的条件下孵育TIL来使纳米颗粒连接至TIL群体的表面。
在一些实施例中，纳米颗粒通过静电引力与TIL细胞表面结合。在一些实施例中，纳米颗粒与TIL共价结合。在其他实施例中，纳米颗粒不与TIL共价结合。
在一些实施例中，本发明的纳米颗粒连接至在本发明的过程2A方法(参见例如图2至图6)的任何步骤期间产生的TIL。在示例性实施例中，本发明的纳米颗粒连接至在本发明的GEN 3方法(参见例如图7)的任何步骤期间产生的TIL。在示例性实施例中，本发明的纳米颗粒连接至由本文提供的过程2A方法中的第一扩增步骤和/或GEN 3方法中的起始扩增步骤产生的TIL。在示例性实施例中，本发明的纳米颗粒连接至由本文中所提供的过程2A方法中的第二扩增步骤和/或GEN 3方法中的快速扩增步骤产生的TIL。在一些实施例中，TIL为已使用本文所述的方法预先选择的PD-1阳性TIL。
其他适用于本文提供的经修饰的TIL中的纳米颗粒公开于美国专利申请公开第US20200131239号和第WO2020205808号中，其全部内容及与纳米颗粒有关的相关部分各自以引用的方式并入本文中。
C.免疫调节剂
本文提供的经修饰的TIL包含一种以上连接至其表面的免疫调节剂。可将免疫调节剂并入本文所述的任何免疫调节融合蛋白中，包括例如本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白。本发明的经修饰的TIL中可包含任何适合的免疫调节剂。在一些实施例中，在转移至患者中后，免疫调节剂增强TIL存活率和/或抗肿瘤活性。示例性免疫调节剂包括例如细胞因子。在一些实施例中，经修饰的TIL包含以下细胞因子中的一种以上：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-4、IL-1α、IL-1β、IL-5、IFNγ、TNFα(TNFa)、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的生物活性变体。在一些实施例中，免疫调节剂为共刺激分子。在特定实施例中，共刺激分子为以下中的一种：OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3，或CD137的激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂为CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。示例性免疫调节剂进一步详细论述于下文中。
1.IL-15
在一些实施例中，本文提供的经修饰的TIL包含IL-15。在示例性实施例中，IL-15作为如本文所述的免疫调节融合蛋白(例如，膜锚定的免疫调节融合蛋白)的一部分而被包含。
如本文所用，“白介素15”、“IL-15”和“IL15”均指结合由IL-15特异性受体α链(IL-15Rα)、IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同γ链(γ-C，CD132)构成的复合体并通过该复合体进行信号传导的白介素(例如Genbank登录号：NM_00000585、NP_000576和NP_751915(人)；以及NM_001254747和NP_001241676(小鼠))。已显示IL-15刺激肿瘤内的T细胞增殖。IL-15也能够提高效应记忆CD8+T细胞的存活能力并对于NK细胞的发育是重要的。因此，不受任何特定操作理论约束，认为与本文所述的IL-15缔合的经修饰的TIL展现出增强的存活率和/或抗肿瘤作用。
IL-15在体内具有小于40分钟的短半衰期。对IL-15单体进行的修饰可改善其在治疗癌症时的体内药物动力学。这些修饰通常集中于通过IL-15受体的α亚基(即IL-15Rα)来改善IL-15的反式呈递。此类修饰包括：1)IL-15与其可溶性受体a-亚基-Fc融合物预先缔合，以形成IL-15:IL-15Rα-Fc复合体(参见例如Rubinstein等人,《美国国家科学院院刊》103:9166-71(2006))；2)超激动剂IL-15-sIL-15Rα-sushi蛋白的表达(参见例如Bessard等人,《分子癌症治疗剂(Molecular cancer therapeutics)》8:2736-45(2009))；以及3)人IL-15突变体IL-15N72D与IL-15Rα-Fc sushi-Fc融合物复合体的预先缔合(参见例如Zhu等人,《免疫学杂志》183:3598-6007(2009))。
在一些实施例中，与经修饰的TIL缔合的IL-15为全长IL-15、IL-15的片段或变体。在一些实施例中，IL-15为人IL-15或人IL-15的变体。在示例性实施例中，IL-15为生物活性人IL-15变体。在一些实施例中，IL-15与野生型IL-15相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变。在某些实施例中，IL-15与野生型人IL-15相比包含N72D突变。在一些实施例中，变体IL-15展现出IL-15Rα结合活性。
在一些实施例中，免疫调节剂包含IL-15和IL-15Rα的胞外结构域。在某些实施例中，免疫调节剂包括IL-15和与Fc域融合的IL-15Rα(IL-15Rα-Fc)。
表5：IL-15的相关序列。
在一些实施例中，免疫刺激性蛋白为超激动剂IL-15(IL-15SA)，其包括人IL-15与可溶性人IL-15Rα的复合体。人IL-15与可溶性人IL-15Rα的组合形成IL-15SA复合体，其具有比单独的人IL-15更高的生物活性。本领域中已描述了可溶性人IL-15Rα以及胞外结构域的截短版本(Wei等人,2001《免疫学杂志》167:277-282)。人IL-15Rα的氨基酸序如SEQ IDNO：266所示。在一些实施例中，IL-15SA包括人IL-15与可溶性人的复合体。IL-15Rα包含全部或一部分胞外结构域且不具有跨膜或细胞质域。在一些实施例中，IL-15SA包括人IL-15与可溶性人IL-15Rα的复合体，该可溶性人IL-15Rα包括完全胞外结构域或胞外结构域的保留IL-15结合活性的截短形式。
在一些实施例中，IL-15SA包括人IL-15与可溶性人IL-15Rα的复合体，该可溶性人IL-15Rα包括胞外结构域的保留IL-15结合活性的截短形式。在一些实施例中，可溶性人IL-15Rα包括人IL-15Rα的氨基酸1至60、1至61、1至62、1至63、1至64或1至65。在一些实施例中，可溶性人IL-15Rα包括人IL-15Rα的氨基酸1至80、1至81、1至82、1至83、1至84或1至85。在一些实施例中，可溶性人IL-15Rα包括人IL-15Rα的氨基酸1至180、1至181或1至182。
在一些实施例中，免疫调节剂为包含人IL-15与可溶性人IL-15Rα的复合体的IL-15SA，该可溶性人IL-15Rα包含胞外结构域的保留IL-15结合活性且包含sushi结构域的截短形式。在本领域中，IL-15Rα的sushi结构域被描述为长度为约60个氨基酸且包含4个半胱氨酸(Wei等人,2001)。可溶性人IL-15Rα的保留IL-15活性且包含sushi结构域的截短形式适用于本公开的IL-15SA。
在一些实施例中，免疫调节剂包括复合体，其包含与IL-15一起作为融合蛋白(例如本文所述的Fc融合(例如，人IgG1 Fc))表达的可溶性人IL-15Rα本文所述。在一些实施例中，IL-15SA包含二聚人IL-15RαFc融合蛋白(例如，人IgG1 Fc)与两个人IL-15分子的复合体。
在一些实施例中，免疫调节剂为IL-15SA细胞因子复合体，其包含IL-15分子，其包含SEQ ID NO：258、SEQ ID NO：261、SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：263所示的氨基酸序列。在一些实施例中，IL-15SA细胞因子复合体包含可溶性IL-15Rα分子，其包含SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：264或SEQ ID NO：265的序列。
在一些实施例中，免疫调节剂为IL-15SA细胞因子复合体，其包括二聚IL-15RαFc融合蛋白与两个IL-15分子的复合体。在一些实施例中，IL-15-SA包含二聚IL-15RαSu(sushi结构域)/Fc(SEQ ID NO：259)和两个IL-15N72D分子(SEQ ID NO：258)(也称为ALT-803)，如US20140134128中所描述的，其以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc分子(SEQ ID NO：259)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：261)。在一些实施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc分子(SEQ ID NO：259)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：262)。在一些实施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc分子(SEQ ID NO：259)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：263)。
在一些实施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc分子(SEQ ID NO：259)和两个具有选自SEQ ID NO：258、258、262和263的氨基酸序列的IL-15分子。
在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：260)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：258)。在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ IDNO：260)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：261)。在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：260)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：262)。在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：260)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：263)。
在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：264)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：258)。在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：264)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：261)。在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：264)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：262)。在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：264)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：261)。
在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：265)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：258)。在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：265)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：261)。在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：265)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：262)。在一些实施例中，IL-15SA包含可溶性IL-15Rα分子(SEQ ID NO：265)和两个IL-15分子(SEQ ID NO：263)。
在一些实施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc(SEQ ID NO：269)分子和两个IL-15分子(SEQ ID NO：262)。在一些实施例中，IL-15SA包含二聚IL-15RαSu/Fc(SEQ IDNO：259)分子和两个IL-15分子(SEQ ID NO：263)。
在一些实施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO：259和SEQ ID NO：260。在一些实施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO：261或SEQ ID NO：262。在一些实施例中，IL-15SA包含SEQ IDNO：261和SEQ ID NO：259。在一些实施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO：262和SEQ ID NO：259。在一些实施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO：263和SEQ ID NO：259。在一些实施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO：261和SEQ ID NO：260。在一些实施例中，IL-15SA包含SEQ ID NO：262和SEQID NO：260。
在一些实施例中，TIL组合物包含免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物，该免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物包含IL-15或其生物活性变体的。包含IL-15的示例性融合蛋白描绘于图36和图37以及表58和表59中。
在示例性实施例中，本文提供的TIL组合物包含编码包含IL-15的免疫调节融合蛋白的核酸，其中，核酸可操作地连接至NFAT启动子，如本文所述。用于包含IL-15的免疫调节融合蛋白的表达的示例性NFAT启动子驱动的构建体描绘于表59中。
2.IL-12
在一些实施例中，经修饰的TIL与IL-12或其变体缔合。在示例性实施例中，IL-12作为如本文所述的免疫调节融合蛋白(例如，膜锚定的免疫调节融合蛋白)的一部分而被包含。
如本文所用，“白介素12”、“IL-12”和“IL12”均指一种白介素，其为由IL-12A和IL-12B基因编码的异二聚细胞因子(Genbank登录号：NM_000882(IL-12A)和NM_002187(IL-12B))。IL-12由一束四个α螺旋构成且参与幼稚T细胞分化成TH1细胞。其由两种独立基因IL-12A(p35)和IL-12B(p40)编码。在蛋白质合成后形成活性异二聚体(称为p70)和p40同二聚体。IL-12结合IL-12受体，其为由IL-12R-β1和IL-12R-β2形成的异二聚受体。IL-12称为T细胞刺激因子，其可刺激T细胞的生长和功能。特别地，IL-12可刺激自T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)且降低IL-4介导的IFN-γ抑制。IL-12也可介导NK细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性活性的增强。此外IL-12通过增加干扰素γ的产生也可具有抗血管生成活性，增加干扰素γ的产生又增加趋化因子诱导蛋白-10(IP-10或CXCL10)的产生，然后，IP-10介导此抗血管生成作用。因此，不受任何特定操作理论约束，认为IL-12可增加本文提供的TIL组合物的存活率和/或抗肿瘤作用。
在一些实施例中，与经修饰的TIL缔合的IL-12为全长IL-12、IL-12的片段或变体。在一些实施例中，IL-12为人IL-12或人IL-12的变体。在示例性实施例中，IL-12为生物活性人IL-12变体。在一些实施例中，IL-12与野生型IL-12相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变。
在一些实施例中，经修饰的TIL组合物中所包含的IL-12包含IL-12p35亚基或其变体。在一些实施例中，IL-12p35亚基为人IL-12p35亚基。在一些实施例中，IL-12p35亚基具有氨基酸序列。在某些实施例中，经修饰的TIL组合物中所包含的IL-12包含IL-12p40亚基或其变体。在某些实施例中，IL-12为单链IL-12多肽，其包含连接至IL-12p40亚基的IL-12p35亚基。此类IL-12单链多肽有利地保留野生型IL-12的一种以上生物活性。在一些实施例中，本文所述的单链IL-12多肽自N末端至C末端根据式(p40)-(L)-(p35)，式中，“p40”为IL-12p40亚基，“p35”为IL-12p35亚基，L为接头。在其他实施例中，单链IL-12自N末端至C末端根据式(p35)-(L)-(p40)。单链IL-12多肽可使用任何适合的接头，包括本文所述的接头。适合的接头可包括例如具有氨基酸序列(GGGGS)x的接头，其中x为1至10的整数。其他适合的接头包括例如氨基酸序列GGGGGGS。可与本发明的单链IL-12多肽一起使用的示例性单链IL-12接头也描述于Lieschke等人,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》15:35-40(1997)中，其以全文(尤其关于IL-12多肽接头的教导内容)引用的方式并入本文中。在示例性实施例中，单链IL-12多肽为单链人IL-12多肽(即，其包含人p35亚基和p40 IL-12亚基)。
表6：IL-12的相关序列
在一些实施例中，TIL组合物包含免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物，该免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物包含IL-12或其生物活性变体。
在示例性实施例中，本文提供的TIL组合物包含编码包含IL-12的免疫调节融合蛋白的核酸，其中，核酸可操作地连接至NFAT启动子，如本文所述。参见例如美国专利第8,556,882号，其以全文(尤其与用于IL-12表达的NFAT启动子有关的相关部分)引用的方式并入本文中。包含IL-12的示例性融合蛋白描绘于图36和图37以及表58中。
3.IL-18
在一些实施例中，经修饰的TIL与IL-18或其变体缔合。在示例性实施例中，IL-18作为如本文所述的免疫调节融合蛋白(例如，膜锚定的免疫调节融合蛋白)的一部分而被包含。
如本文中所使用，“白介素18”、“IL-18”、“IL18”、“IGIF”、“IL-1g”、“干扰素-γ诱导因子”和“IL1F4”均指一种白介素，其为由IL-18基因编码的异二聚细胞因子(例如，Genbank登录号：NM_001243211、NM_001562和NM_001386420)。IL-18(在结构上与IL-1β类似)为细胞因子的IL-1超家族的成员。此细胞因子由许多人淋巴和非淋巴细胞表达，在炎症过程中具有重要作用。IL-18与IL-12的组合可活化细胞毒性T细胞(CTL)以及自然杀伤(NK)细胞以产生IFN-γ，因此有助于肿瘤免疫性。因此，不受任何特定操作理论约束，认为IL-18可增强本文提供的TIL组合物的抗肿瘤作用。
在一些实施例中，与经修饰的TIL缔合的IL-18为全长IL-18、IL-18的片段或变体。在一些实施例中，IL-18为人IL-18或变体人IL-18。在示例性实施例中，IL-18为生物活性人IL-18变体。在一些实施例中，IL-18与野生型IL-18相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变。在一些实施例中，变体IL-18具有氨基酸序列：
表7：IL-18相关序列
在一些实施例中，TIL组合物包含免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物，该免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物包含IL-18或其生物活性变体。包含IL-18的示例性融合蛋白描绘于图36中。
在示例性实施例中，本文提供的TIL组合物包含编码包含IL-18的免疫调节融合蛋白的核酸，其中，核酸可操作地连接至NFAT启动子，如本文所述。用于包含IL-21的免疫调节融合蛋白的表达的示例性NFAT启动子驱动的构建体描绘于表59中。
4.IL-21
在一些实施例中，经修饰的TIL与IL-21或其变体缔合。在示例性实施例中，IL-21作为如本文所述的免疫调节融合蛋白(例如，膜锚定的免疫调节融合蛋白)的一部分而被包含。
在某些实施例中，细胞因子-ABD包含IL-21分子或其片段。如本文所用，“白介素21”、“IL-21”和“IL21”(例如，Genbank登录号：NM_001207006和NP_001193935(人)；以及NM_0001291041和NP_001277970(小鼠))均指细胞因子的成员，其结合IL-21受体并对免疫系统的细胞(包括自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性细胞)具有强效调节作用，并且结合可破坏被病毒感染的细胞或癌细胞的IL-21受体。因此，不受任何特定操作理论约束，认为IL-21可增加本文提供的TIL组合物的存活率和/或抗肿瘤作用。
在一些实施例中，IL-21为人IL-21。在一些实施例中，与经修饰的TIL缔合的IL-21为全长IL-21、IL-21的片段或变体。在一些实施例中，IL-21为人IL-21或人IL-21的变体。在示例性实施例中，IL-21为生物活性人IL-21变体。在一些实施例中，IL-21与野生型IL-21相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变。
表8：IL-21的相关序列。
在一些实施例中，TIL组合物包含免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物，该免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物包含IL-21或其生物活性变体。包含IL-21的示例性融合蛋白描绘于图36和图37以及表58和表59中。
在示例性实施例中，本文提供的TIL组合物包含编码包含IL-21的免疫调节融合蛋白的核酸，其中，核酸可操作地连接至NFAT启动子，如本文所述。
5.IL-2
在一些实施例中，经修饰的TIL与IL-2或其变体缔合。在示例性实施例中，IL-2作为如本文所述的免疫调节融合蛋白(例如，膜锚定的免疫调节融合蛋白)的一部分而被包含。
在某些实施例中，细胞因子-ABD包含IL-2分子或其片段。如本文所用，“白介素2”、“IL-2”、“IL2”和“TCGF”(例如Genbank登录号：NM_000586和NP_000577(人))均指结合IL-2受体的细胞因子的成员。IL-2增强活化诱导的细胞死亡(AICD)。当初始T细胞也受抗原刺激时，IL-2也促进T细胞分化成效应T细胞和记忆T细胞，由此帮助身体抵抗感染。IL-2与其他细胞因子一起刺激幼稚CD4+T细胞分化为Th1和Th2淋巴细胞并阻止分化为Th17和滤泡Th淋巴细胞。IL-2也增加自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞的细胞杀伤活性。因此，不受任何特定操作理论约束，认为IL-2可增加本文提供的TIL组合物的存活率和/或抗肿瘤作用。
在一些实施例中，IL-2为人IL-2。在一些实施例中，与经修饰的TIL缔合的IL-2为全长IL-2、IL-2的片段或变体。在一些实施例中，IL-2为人IL-2或人IL-2变体。在示例性实施例中，IL-2为生物活性人IL-2变体。在一些实施例中，IL-2与野生型IL-2相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变。
表9：IL-2的相关序列
在一些实施例中，TIL组合物包含免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物，该免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物包含IL-2或其生物活性变体。包含IL-2的示例性融合蛋白描绘于图36和图37中。
在示例性实施例中，本文提供的TIL组合物包含编码包含IL-2的免疫调节融合蛋白的核酸，其中，核酸可操作地连接至NFAT启动子，如本文所述。
6.CD40激动剂
在一些实施例中，经修饰的TIL与CD40激动剂结合。在示例性实施例中，CD40激动剂作为如本文所述的免疫调节融合蛋白(例如，膜锚定的免疫调节融合蛋白)的一部分而被包含。
分化簇40(即CD40)为在抗原呈递细胞(APC)上发现的共刺激蛋白并且是APC活化所需的。T辅助细胞上的CD40L(CD154)与CD40的结合可活化抗原呈递细胞(例如树突状细胞)和诱导各种下游作用。不受任何特定操作理论约束，认为添加一种以上活化抗原呈递细胞上的CD40的免疫调节剂(即，CD40激动剂)可增强本文提供的TIL组合物的抗肿瘤作用。CD40激动剂包括例如激动性结合CD40的CD40L及其抗体或抗体片段(例如scFV)。在一些实施例中，TIL组合物包含免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物，该免疫调节融合蛋白或纳米颗粒组合物包含CD40L或其生物活性变体。在一些实施例中，TIL组合物包含免疫调节融合蛋白，其包含激动性抗CD40结合结构域(例如，scFv)。示例性CD40激动剂的序列描绘于下表中。
可使用本领域中已知的任何适合的方法测量CD40激动剂的活性。例如，DC上的CD40的接合(ligation)可诱导增加的共刺激性和MHC分子的表面表达、促炎性细胞因子的产生和增强的T细胞触发。静息B细胞上的CD40接合可增加抗原呈递功能和增殖。在示例性实施例中，CD40激动剂能够活化人树突状细胞。
在一些实施例中，TIL组合物包含激动性抗CD40结合结构域，其具有表10中所描绘的抗CD40 scFv的VH和VL序列或它们的生物活性变体。在一些实施例中，抗CD40结合结构域包含与表10中所描绘的VH序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的VH序列。在一些实施例中，激动性抗CD40结合结构域包含与表10中所描绘的VH序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代的VH序列。在一些实施例中，抗CD40结合结构域包含与表10中所描绘的VL序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的VL序列。在一些实施例中，抗CD40结合结构域包含与表10中所描绘的VL序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代的VL序列。在示例性实施例中，抗CD40结合结构域为选自表10中的SEQ ID NO：276、279、282和285的抗CD40 scFv。
在一些实施例中，抗CD40结合结构域为表10中的抗CD40 scFv的变体，其能够结合人CD40。在示例性实施例中，抗CD40 scFv的变体与选自表10中的SEQ ID NO：276、279、282和285的抗CD40 scFv具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。
可使用本领域中已知的任何适合的测定法测量CD40结合结构域结合的评估，包括(但不限于)：Biacore、表面等离子共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉法，例如Octet测定法)测定法。
其他适合用作免疫调节剂的CD40结合结构域(VH和VL)包括美国专利第US6,838,261号、第US 6,843,989号、第US 7,338,660号、第US 8,7778,345号中所描述的CD40结合结构域，其以引用的方式并入本文中，尤其关于抗CD40抗体以及VH、VL和CDR序列的教导内容。
在一些实施例中，CD40激动剂为CD40配体(CD40L)。在示例性实施例中，CD40L为人CD40L(SEQ ID NO：270)。在一些实施例中，CD40L为人CD40L的变体，其与SEQ ID NO：253具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在一些实施例中，CD40L为人CD40L的变体，其与SEQ ID NO：273相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。
包含CD40激动剂的示例性融合蛋白描绘于图36和图37中。
在示例性实施例中，本文提供的TIL组合物包含编码包含CD40激动剂的免疫调节融合蛋白的核酸，其中，核酸可操作地连接至NFAT启动子，如本文所述。
表10：CD40激动剂的相关序列
IV.基因编辑过程
A.概述：TIL扩增+基因编辑+瞬时基因编辑
在本发明的关于扩增TIL群体的方法的一些实施例中，这些方法包括对TIL的至少一部分进行基因编辑以增强其治疗效果的一个以上步骤。如本文所用，“基因编辑”、“基因的编辑”和“基因组编辑”指一种基因修饰，其中，在细胞的基因组中永久性修饰DNA，例如在细胞的基因组内插入、删除、修饰或置换DNA。在一些实施例中，基因编辑导致DNA序列的表达的沉默(有时称为基因敲除)或抑制/降低(有时称为基因敲减)。在其他实施例中，基因编辑导致DNA序列的表达的增强(例如，通过引起过度表达)。根据本发明的实施例，使用基因编辑技术以增强治疗性TIL群体的有效性。
可根据本文所述的方法(例如，称为过程2A的示例性TIL扩增方法描述于下文中)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法还包括对TIL的至少一部分进行基因编辑。根据其他实施例，根据美国专利第10,517,894号、美国专利申请公开第2020/0121719A1号或美国专利第10,894,063号中所描述的方法的任何实施例进行将TIL扩增为治疗性TIL群体的方法，这些文献以全文引用的方式并入本文中，其中，该方法还包括对TIL的至少一部分进行基因编辑。因此，本发明的一些实施例提供已根据本文所述的任何实施例扩增的治疗性TIL群体，其中，治疗性群体的至少一部分已被基因编辑，例如转移至输注袋的治疗性TIL群体至少一部分被永久性基因编辑。
在本发明的关于扩增TIL群体的方法的一些实施例中，方法包括将用于免疫调节蛋白(例如，包含与膜锚融合的免疫调节蛋白的免疫调节融合蛋白)的瞬时表达的核酸(例如，mRNA)引入TIL的至少一部分中的一个以上步骤，以产生具有(i)当在培养物中扩增时，对细胞因子的依赖性降低，和/或(ii)增强的治疗效果的经修饰的TIL。如本文所用，“瞬时基因编辑”、“瞬时的基因编辑”“瞬时表型改变”、“瞬时表型修饰”、“暂时性表型改变”、“暂时性表型修饰”、“瞬时细胞变化”、“瞬时细胞修饰”、“暂时性细胞改变”、“暂时性细胞修饰”、“瞬时表达”、“表达的瞬时改变”、“蛋白质表达的瞬时改变”、“瞬时修饰”、“瞬时的表型改变”、“非永久性表型改变”、“瞬时地修饰”、“暂时地修饰”、“非永久地修饰”、“瞬时地改变”、“暂时地改变”、前述中的任一个的语法变化形式和具有类似含义的任何表述指一种细胞修饰或表型变化，其中，将核酸(例如，mRNA)引入细胞中，例如通过电穿孔、磷酸钙转染、病毒转导等将核酸转移至细胞中，并在细胞中表达(例如，免疫调节蛋白(例如包含与膜锚融合的免疫调节蛋白的免疫调节融合蛋白)的表达)，以在细胞中实现瞬时或非永久性表型改变，例如细胞表面上的膜锚定的免疫调节融合蛋白的瞬时展示。根据本发明的实施例，使用瞬时表型改变技术以降低在TIL扩增时对培养物中的细胞因子的依赖性和/或增强治疗性TIL群体的有效性。
在一些实施例中，使用微流体平台进行本文提供的编码融合蛋白的核酸的细胞内递送。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。SQZ平台能够将核酸和蛋白质递送至各种原代人细胞，包括T细胞(Sharei等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》2013，以及Sharei等人,《科学公共图书馆综合卷(PLOS ONE)》2015以及Greisbeck等人,《免疫学杂志》,第195卷,2015)。在SQZ平台中，通过微流体收缩来暂时性破坏用于修饰的细胞(例如，TIL)的细胞膜，从而实现将编码免疫调节融合蛋白的核酸递送至细胞中。如国际专利申请公开第WO 2013/059343A1号、第WO 2017/008063A1号或第WO 2017/123663A1号或美国专利申请公开第US2014/0287509A1号、第US2018/0201889A1号或第US2018/0245089A1号中所描述的此类方法可用于本发明以将编码本发明的免疫调节融合蛋白的核酸递送至TIL群体。在一些实施例中，所递送的核酸允许经修饰的TIL中的免疫调节融合蛋白的瞬时蛋白表达。在一些实施例中，使用SQZ平台将所递送的编码免疫调节融合蛋白的核酸稳定地并入TIL细胞基因组中。
B.在TIL扩增期间的基因编辑/瞬时表型变化的时间
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3(例如，OKT-3可在扩增过程的起始日开始存在于培养基中)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增，第一扩增进行约3至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(g)在步骤(f)中的转移至输注袋之前的方法期间的任何时间，对TIL细胞的至少一部分进行基因编辑以在TIL细胞的表面上表达包含免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)的免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
如上文所描述的实施例的步骤(g)所述，可在步骤(f)中的转移至输注袋之前的TIL扩增方法期间的任何时间进行基因编辑过程，其指可在扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后对TIL进行基因编辑，例如，在以上方法中所概述的步骤(a)至(f)中的任一者期间或在以上方法中所概述的步骤(a)至(e)中的任一者之前或之后。根据某些实施例，在扩增方法期间收集TIL(例如，“暂停”TIL的至少一部分的扩增方法)并对所收集的TIL进行基因编辑过程，在一些情况下，然后再引回扩增方法中(例如，引回培养基中)以继续扩增过程，使得最终转移至输注袋的治疗性TIL群体被永久性基因编辑。在一些实施例中，可通过活化TIL、对经活化的TIL进行基因编辑步骤以及根据本文所述的方法扩增经基因编辑的TIL来在扩增之前进行基因编辑过程。在一些实施例中，使用微流体平台将用于基因编辑的核酸递送至TIL。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，在第一TIL扩增步骤之后进行基因编辑过程。在一些实施例中，在第一TIL扩增步骤之后以及在第二扩增步骤之前进行基因编辑过程。在一些实施例中，在TIL活化之后进行基因编辑过程。在一些实施例中，在第一扩增步骤之后以及在TIL活化之后，但在第二扩增步骤之前进行基因编辑过程。在一些实施例中，在第一扩增步骤之后以及在TIL活化之后进行基因编辑过程，并在基因编辑之后以及在第二扩增步骤之前将TIL静置。在一些实施例中，在基因编辑之后以及在第二扩增步骤之前将TIL静置约1至2天。在一些实施例中，通过暴露于抗CD3激动剂以及抗CD28激动剂来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂为抗CD3激动剂抗体，抗CD28激动剂为抗CD28激动剂抗体。在一些实施例中，抗CD3激动剂抗体为OKT-3。在一些实施例中，通过暴露于抗CD3激动剂抗体和抗CD28激动剂抗体缀合的珠子来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂抗体和抗CD28激动剂抗体缀合的珠子为Miltenyi的TransActTM产品。在一些实施例中，通过病毒转导来进行基因编辑过程。在一些实施例中，通过逆转录病毒转导来进行基因编辑过程。在一些实施例中，通过慢病毒转导来进行基因编辑过程。在一些实施例中，免疫调节组合物为膜锚定的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含IL-15。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含IL-21。在一些实施例中，免疫调节组合物包含两种以上不同的膜结合的融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节组合物包含：包含IL-15的第一免疫调节蛋白和包含IL-21的第二免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达免疫调节组合物。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-15的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-21的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-15的第一免疫调节融合蛋白和包含IL-21的第二免疫调节融合蛋白。
在一些实施例中，通过病毒转导来进行基因编辑过程。在一些实施例中，通过逆转录病毒转导来进行基因编辑过程。在一些实施例中，通过慢病毒转导来进行基因编辑过程。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3(例如，OKT-3可在扩增过程的起始日开始存在于培养基中)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增，其第一扩增进行约3至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)对第二TIL群体中的至少一部分TIL细胞进行基因编辑，在TIL细胞的表面上表达包含免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)的免疫调节组合物。
(e)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(g)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，在基因编辑步骤之后以及在第二扩增步骤之前将TIL静置。在一些实施例中，在基因编辑步骤之后以及在第二扩增步骤之前将TIL静置约1至2天。在一些实施例中，通过暴露于抗CD3激动剂和抗CD28激动剂来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂为抗CD3激动剂抗体，抗CD28激动剂为抗CD28激动剂抗体。在一些实施例中，抗CD3激动剂抗体为OKT-3。在一些实施例中，通过暴露于抗CD3激动剂抗体和抗CD28激动剂抗体缀合的珠子来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂抗体和抗CD28激动剂抗体缀合的珠子为Miltenyi的TransActTM产品。在一些实施例中，通过病毒转导来进行基因编辑过程。在一些实施例中，通过TIL的逆转录病毒转导来进行基因编辑过程，可选地进行约2天。在一些实施例中，通过TIL的慢病毒转导来进行基因编辑过程，可选地进行约2天。在一些实施例中，免疫调节组合物为膜锚定的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含IL-15。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含IL-21。在一些实施例中，免疫调节组合物包含两种以上不同的膜结合的融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节组合物包含：包含IL-15的第一免疫调节蛋白和包含IL-21的第二免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达免疫调节组合物。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-15的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-21的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-15的第一免疫调节融合蛋白和包含IL-21的第二免疫调节融合蛋白。
应注意，扩增过程的替代性实施例可与以上显示的方法不同；例如，替代性实施例可以不具有相同的步骤(a)至(g)，可以具有不同数目的步骤。与特定实施例无关，可在TIL扩增方法期间的任何时间进行基因编辑过程。例如，替代性实施例可包括超过两次扩增，可以在第三或第四扩增等期间对TIL进行基因编辑。
根据其他实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3(例如，OKT-3可在扩增过程的起始日开始存在于培养基中)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增，第一扩增进行约3至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(g)在步骤(f)中的转移至输注袋之前的方法期间的任何时间将瞬时表型改变引入TIL细胞的至少一部分中以在TIL细胞的表面上表达包含免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)的免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台将用于瞬时表型改变的核酸递送至TIL。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
如上文所描述的实施例的步骤(g)所述，可在步骤(f)中的转移输注袋之前的TIL扩增方法期间的任何时间进行瞬时表型改变过程，其指可在扩增方法中的任何步骤之前、期间或之后对TIL进行瞬时表型改变，例如，在以上方法中所概述的步骤(a)至(f)中的任一者期间或在以上方法中所概述的步骤(a)至(e)中的任一者之前或之后。根据某些实施例，在扩增方法期间收集TIL(例如，“暂停”TIL的至少一部分的扩增方法)并对所收集的TIL进行瞬时修饰过程，在一些情况下，然后再引回扩增方法中(例如，引回培养基中)以继续扩增过程，使得最终转移至输注袋中的治疗性TIL群体至少一部分被瞬时改变以在TIL细胞的表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，可通过活化TIL、对经活化的TIL进行瞬时表型改变步骤以及根据本文所述的方法扩增经修饰的TIL来在扩增之前进行瞬时细胞修饰过程。
应注意，扩增过程的替代性实施例可与以上显示的方法不同；例如，替代性实施例可以不具有相同的步骤(a)至(g)，可以具有不同数目的步骤。与特定实施例无关，可以在TIL扩增方法期间的任何时间进行瞬时细胞修饰过程。例如，替代性实施例可以包括超过两次扩增，可以在第三或第四扩增等期间对TIL进行瞬时细胞修饰过程。
根据一些实施例，对来自第一群体、第二群体和第三群体中的一或多者的TIL进行基因编辑过程。例如，可对第一TIL群体或来自第一群体的所收集的TIL的一部分进行基因编辑，在基因编辑过程之后，可然后将这些TIL放回扩增过程中(例如，放回培养基中)。或者，可对来自第二或第三群体的TIL或分别来自第二或第三群体的所收集的TIL的一部分进行基因编辑，在基因编辑过程之后，可然后将这些TIL放回扩增过程中(例如，放回培养基中)。根据其他实施例，在TIL仍位于培养基中时以及在扩增正在进行时进行基因编辑，即，无需自扩增“移出”TIL即可进行基因编辑。
根据一些实施例，对来自第一群体、第二群体和第三群体中的一或多者的TIL进行瞬时细胞修饰过程。例如，可对第一TIL群体或来自第一群体的所收集的TIL的一部分进行瞬时细胞修饰，在基因编辑过程之后，可然后将这些经瞬时修饰的TIL放回扩增过程中(例如，放回培养基中)。或者，可对来自第二或第三群体的TIL或分别来自第二或第三群体的所收集的TIL的一部分进行瞬时细胞修饰，在瞬时细胞修饰过程之后，可然后将这些经修饰的TIL放回扩增过程中(例如，放回培养基中)。根据其他实施例，在TIL仍位于培养基中时以及在扩增正在进行时进行瞬时细胞修饰，即，无需自扩增“移出”TIL即可实现瞬时细胞修饰。
根据其他实施例，对来自第一扩增的TIL或来自第二扩增的TIL或其两者进行基因编辑过程。例如，在第一扩增或第二扩增期间，可对自培养基收集的TIL进行基因编辑，在基因编辑过程之后，可然后将这些TIL放回扩增方法中，例如通过将其再引回培养基中。
根据其他实施例，对来自第一扩增的TIL或来自第二扩增的TIL或其两者进行瞬时细胞修饰过程。例如，在第一扩增或第二扩增期间，可对自培养基收集的TIL进行瞬时细胞修饰，在瞬时细胞修饰过程之后，可然后将这些经修饰的TIL放回扩增方法中，例如通过将其再引回培养基中。
根据其他实施例，在第一扩增之后并在第二扩增之前对TIL的至少一部分进行基因编辑过程。例如，在第一扩增之后，可对自培养基收集的TIL进行基因编辑，在基因编辑过程后，可然后将这些TIL放回扩增方法中(例如通过将其再引回培养基中)以进行第二扩增。
根据其他实施例，在第一扩增之后并在第二扩增之前对TIL的至少一部分进行瞬时细胞修饰过程。例如，在第一扩增之后，可对自培养基收集的TIL进行瞬时细胞修饰，在瞬时细胞修饰过程后，可然后将这些经修饰的TIL放回扩增方法中(例如通过将其再引回培养基中)以进行第二扩增。
根据替代性实施例，在步骤(c)之前(例如，在步骤(a)至(b)中的任一者之前、期间或之后)、在步骤(d)之前(例如，在步骤(a)至(c)中的任一者之前、期间或之后)、在步骤(e)之前(例如，在步骤(a)至(d)中的任一者之前、期间或之后)或在步骤(f)之前(例如，在步骤(a)至(e)中的任一者之前、期间或之后)进行基因编辑过程。
根据替代性实施例，在步骤(c)之前(例如，在步骤(a)至(b)中的任一者之前、期间或之后)、在步骤(d)之前(例如，在步骤(a)至(c)中的任一者之前、期间或之后)、在步骤(e)之前(例如，在步骤(a)至(d)中的任一者之前、期间或之后)或在步骤(f)之前(例如，在步骤(a)至(e)中的任一者之前、期间或之后)进行瞬时细胞修饰过程。
应注意，关于OKT-3，根据某些实施例，细胞培养基可在第一扩增的起始日(第0天)或第1天开始包含OKT-3，使得在第0天和/或第1天，在TIL已暴露于细胞培养基中的OKT-3之后对其进行基因编辑或瞬时细胞修饰。根据其他实施例，细胞培养基在第一扩增期间和/或在第二扩增期间包含OKT-3，在将OKT-3引入细胞培养基中之前进行基因编辑或瞬时细胞修饰。或者，细胞培养基可在第一扩增期间和/或在第二扩增期间包含OKT-3，在将OKT-3引入细胞培养基中之后进行基因编辑或瞬时细胞修饰。
也应注意，关于4-1BB激动剂，根据某些实施例，细胞培养基可在第一扩增的起始日(第0天)或第1天开始包含4-1BB激动剂，使得在第0天和/或第1天，在TIL已暴露于细胞培养基中的4-1BB激动剂之后对其进行基因编辑或瞬时细胞修饰。根据其他实施例，细胞培养基在第一扩增期间和/或在第二扩增期间包含4-1BB激动剂，在将4-1BB激动剂引入细胞培养基中之前进行基因编辑或瞬时细胞修饰。或者，细胞培养基可在第一扩增期间和/或在第二扩增期间包含4-1BB，在将4-1BB引入细胞培养基中之后进行基因编辑或瞬时细胞修饰。
也应注意，关于IL-2，根据某些实施例，细胞培养基可在第一扩增的起始日(第0天)或第1天开始包含IL-2，使得在第0天和/或第1天，在TIL已暴露于细胞培养基中的IL-2之后对其进行基因编辑或瞬时细胞修饰。根据其他实施例，细胞培养基在第一扩增期间和/或在第二扩增期间包含IL-2，在将IL-2引入细胞培养基中之前进行基因编辑或瞬时细胞修饰。或者，细胞培养基可在第一扩增期间和/或在第二扩增期间包含IL-2，在将IL-2引入细胞培养基中之后进行基因编辑或瞬时细胞修饰。
如上文所述，细胞培养基可在第一扩增的第0天或第1天开始包含OKT-3、4-1BB激动剂和IL-2中的一种以上。根据一些实施例，细胞培养基在第一扩增的第0天或第1天开始包含OKT-3，和/或细胞培养基在第一扩增的第0天或第1天开始包含4-1BB激动剂，和/或细胞培养基在第一扩增的第0天或第1天开始包含IL-2。根据其他实例，细胞培养基在第一扩增的第0天或第1天开始包含OKT-3和4-1BB激动剂。根据其他实例，细胞培养基在第一扩增的第0天或第1天开始包含OKT-3、4-1BB激动剂和IL-2。当然，可在扩增过程期间的一个以上其他时间点将OKT-3、4-1BB激动剂和IL-2中的一种以上添加至细胞培养基中，如本文所述的各种实施例中所述。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至2天来活化第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体中的至少一部分TIL细胞进行基因编辑以在TIL细胞的表面上表达包含免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)的免疫调节组合物；
(f)可选地，将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，其中，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，在基因编辑步骤之后以及在第二扩增步骤之前将TIL静置。在一些实施例中，在基因编辑步骤之后以及在第二扩增步骤之前将TIL静置约1至2天。在一些实施例中，通过暴露于抗CD3激动剂和抗CD28激动剂约2天来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂为抗CD3激动剂抗体，抗CD28激动剂为抗CD28激动剂抗体。在一些实施例中，抗CD3激动剂抗体为OKT-3。在一些实施例中，通过暴露于抗CD3激动剂抗体和抗CD28激动剂抗体缀合的珠子来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂抗体和抗CD28激动剂抗体缀合的珠子为Miltenyi的TransActTM产品。在一些实施例中，通过病毒转导来进行基因编辑过程。在一些实施例中，通过TIL的逆转录病毒转导来进行基因编辑过程，可选地进行约2天。在一些实施例中，通过TIL的慢病毒转导来进行基因编辑过程，可选地进行约2天。在一些实施例中，免疫调节组合物为膜锚定的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含IL-15。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含IL-21。在一些实施例中，免疫调节组合物包含两种以上不同的膜结合的融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节组合物包含：包含IL-15的第一免疫调节蛋白和包含IL-21的第二免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达免疫调节组合物。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-15的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-21的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-15的第一免疫调节融合蛋白和包含IL-21的第二免疫调节融合蛋白。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑器转移至第二TIL群体的一部分细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行，
其中，将至少一种基因编辑物(editor)无菌电穿孔至第二TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
根据其他实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种核酸分子转移至第二TIL群体的一部分细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行，
其中，将至少一种核酸分子无菌电穿孔至第二TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体的一部分细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行，
其中，将至少一种基因编辑物无菌电穿孔至第二TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体的一部分细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，其中，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行，
其中，递送至第二TIL群体的一部分细胞中的至少一种基因编辑物修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
根据其他实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种核酸分子转移至第二TIL群体的一部分细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行，
其中，递送至第二TIL群体的一部分细胞中的至少一种核酸分子修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体的一部分细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；以及
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行，
其中，递送至第二TIL群体的一部分细胞中的至少一种基因编辑物修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)对第三TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物无菌电穿孔至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)对第二TIL群体中的至少一部分TIL细胞进行基因编辑以在TIL细胞的表面上表达包含免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)的免疫调节组合物；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，在基因编辑步骤之后以及在第二扩增步骤之前将TIL静置。在一些实施例中，在基因编辑步骤之后以及在第二扩增步骤之前将TIL静置约1至2天。在一些实施例中，通过暴露于抗CD3激动剂和抗CD28激动剂约2天来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂为抗CD3激动剂抗体，抗CD28激动剂为抗CD28激动剂抗体。在一些实施例中，抗CD3激动剂抗体为OKT-3。在一些实施例中，通过暴露于抗CD3激动剂抗体和抗CD28激动剂抗体缀合的珠子来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂抗体和抗CD28激动剂抗体缀合的珠子为Miltenyi的TransActTM产品。在一些实施例中，通过病毒转导来进行基因编辑过程。在一些实施例中，通过TIL的逆转录病毒转导来进行基因编辑过程，可选地进行约2天。在一些实施例中，通过TIL的慢病毒转导来进行基因编辑过程，可选地进行约2天。在一些实施例中，免疫调节组合物为膜锚定的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含IL-15。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含IL-21。在一些实施例中，免疫调节组合物包含两种以上不同的膜结合的融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节组合物包含：包含IL-15的第一免疫调节蛋白和包含IL-21的第二免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达免疫调节组合物。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-15的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-21的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-15的第一免疫调节融合蛋白和包含IL-21的第二免疫调节融合蛋白。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)对第三TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，递送至第三TIL群体的一部分细胞中的至少一种核酸分子修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(d)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(e)对第二TIL群体中的至少一部分TIL细胞进行基因编辑，以在TIL细胞的表面上表达包含免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)的免疫调节组合物；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，在基因编辑步骤之后以及在第二扩增步骤之前将TIL静置。在一些实施例中，在基因编辑步骤之后以及在第二扩增步骤之前将TIL静置约1至2天。在一些实施例中，通过暴露于抗CD3激动剂以及抗CD28激动剂约2天来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂为抗CD3激动剂抗体，抗CD28激动剂为抗CD28激动剂抗体。在一些实施例中，抗CD3激动剂抗体为OKT-3。在一些实施例中，通过暴露于抗CD3激动剂抗体和抗CD28激动剂抗体缀合的珠子来活化TIL。在一些实施例中，抗CD3激动剂抗体和抗CD28激动剂抗体缀合的珠子为Miltenyi的TransActTM产品。在一些实施例中，通过病毒转导来进行基因编辑过程。在一些实施例中，通过TIL的逆转录病毒转导来进行基因编辑过程，可选地进行约2天。在一些实施例中，通过TIL的慢病毒转导来进行基因编辑过程，可选地进行约2天。在一些实施例中，免疫调节组合物为膜锚定的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含IL-15。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含IL-21。在一些实施例中，免疫调节组合物包含两种以上不同的膜结合的融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节组合物包含：包含IL-15的第一免疫调节蛋白和包含IL-21的第二免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达免疫调节组合物。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-15的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-21的免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，对TIL进行基因编辑以在NFAT启动子的控制下表达包含IL-15的第一免疫调节融合蛋白和包含IL-21的第二免疫调节融合蛋白。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(d)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(e)对第三TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物无菌电穿孔至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(d)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(e)对第三TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，递送至第三TIL群体的一部分细胞中的至少一种核酸分子修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(d)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(e)暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(d)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(e)暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中调节该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，修改任何前述方法，使得由以下步骤置换培养第四TIL群体的步骤：
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约1至7天，产生第五TIL群体的培养物；以及
(g)使第五TIL群体的培养物分流(split)为多个传代培养物，在包含IL-2的第三细胞培养基中培养该多个传代培养物中的每一个约3至7天，合并该多个传代培养物以得到经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约2至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约3至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约4至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约5至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约6至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约1至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约1至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约1至4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约1至3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约1至2天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约2至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约3至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约4至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约5至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约3至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约3至4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约2至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约2至4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约2至3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约4至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约1天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化第二TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施例中，本文提供用于制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体的一部分细胞中，产生第三TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第三TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物无菌电穿孔至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种核酸分子转移至第二TIL群体的一部分细胞中，产生第三TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第三TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种核酸分子无菌电穿孔至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(d)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体的一部分细胞中，产生第三TIL群体；和
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第三TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物无菌电穿孔至第二TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，细胞因子选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，细胞因子选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在一些实施例中，细胞因子选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(d)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种核酸分子转移至第二TIL群体的一部分细胞中，产生第三TIL群体；和
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第三TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种核酸分子无菌电穿孔至第二TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体的一部分细胞中，产生第三TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第三TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种核酸分子转移至第二TIL群体的一部分细胞中，产生第三TIL群体；以及
(d)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第三TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(d)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体的一部分细胞中，以产生第三TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第三TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(d)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种核酸分子转移至第二TIL群体的一部分细胞中，产生第三TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第三TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种核酸分子转移至第二TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，培养第三TIL群体的步骤通过以下来进行：将第三TIL群体在第二细胞培养基中培养约1至7天的第一时间段，在第一时间段结束时，将培养物分流为多个传代培养物，将该多个传代培养物中的每一个在包含IL-2的第三培养基中培养约3至7天的第二时间段，在第二时间段结束时，合并该多个传代培养物以得到经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约5至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约6至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约7至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约8至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约9至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约10至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约5至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约6至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约7至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约8至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约9至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约4至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约5至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约6至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约7至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约8至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约3至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约3至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约3至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约3至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约3至4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约4至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约4至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约4至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约4至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约5至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约5至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约5至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约6至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约6至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约7至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约4至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第一细胞培养基中培养第一TIL群体的步骤进行约11天。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3天，产生第二TIL群体；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养第二TIL群体2至4天，产生第三TIL群体；
(d)对第三TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物无菌电穿孔至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3天，产生第二TIL群体；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养第二TIL群体2至4天，产生第三TIL群体；
(d)对第三TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种核酸分子无菌电穿孔至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3天，产生第二TIL群体；
(d)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养第二TIL群体2至4天，产生第三TIL群体；
(e)对第三TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养第四TIL群体约5-15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物无菌电穿孔至第三TIL群体的一部分细胞中调节该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3天，产生第二TIL群体；
(d)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养第二TIL群体2至4天，产生第三TIL群体；
(e)对第三TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种核酸分子无菌电穿孔至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3天，产生第二TIL群体；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养第二TIL群体2至4天，产生第三TIL群体；
(d)暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3天，产生第二TIL群体；
(c)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养第二TIL群体2至4天，产生第三TIL群体；
(d)暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(e)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3天，产生第二TIL群体；
(d)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养第二TIL群体2至4天，产生第三TIL群体；
(e)暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种基因编辑物转移至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3天，产生第二TIL群体；
(d)在包含IL-2和OKT-3的第二细胞培养基中培养第二TIL群体2至4天，产生第三TIL群体；
(e)暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中，产生第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第三细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL，
其中，将至少一种核酸分子转移至第三TIL群体的一部分细胞中修饰该部分中的多个细胞，以在细胞表面上瞬时表达免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，培养第四TIL群体的步骤通过以下来进行：将第四TIL群体在第三细胞培养基中培养约1至7天的第一时间段，在第一时间段结束时，将培养物分流为多个传代培养物，将该多个传代培养物中的每一个在包含IL-2的第四培养基中培养约3至7天的第二时间段，在第二时间段结束时，合并该多个传代培养物以得到经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，在第一培养基中培养第一TIL群体的步骤中，第一培养基还包含抗CD3和抗CD28珠子或抗体。
在一些实施例中，抗CD3和抗CD28珠子或抗体包含第一培养基中的OKT-3。
在一些实施例中，在第二培养基中培养第二TIL群体的步骤中，第二培养基还包含抗CD3和抗CD28珠子或抗体。
在一些实施例中，抗CD3和抗CD28珠子或抗体包含第二培养基中的OKT-3。
根据一些实施例，前述方法进一步包括使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体。在一些实施例中，冷冻保存培养基为基于二甲亚砜的冷冻保存培养基。在其他实施例中，冷冻保存培养基为CS10。
在一些实施例中，本发明提供在适当时经修改的以上任何前述段落中所描述的方法，使得在第二培养基中培养第二TIL群体的步骤进行约2至3天。
在一些实施例中，本发明提供在适当时经修改的以上任何前述段落中所描述的方法，使得在第二培养基中培养第二TIL群体的步骤进行约3至4天。
在一些实施例中，本发明提供在适当时经修改的以上任何前述段落中所描述的方法，使得在第二培养基中培养第二TIL群体的步骤进行约2天。
在一些实施例中，本发明提供在适当时经修改的以上任何前述段落中所描述的方法，使得在第二培养基中培养第二TIL群体的步骤进行约3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二培养基中培养第二TIL群体的步骤进行约4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在适当时，在可适用的第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约7至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约8至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约9至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约10至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约11至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约12至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约13至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约14至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约7至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约8至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约9至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约10至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约11至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约12至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约13至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约7至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约7至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约7至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约7至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约7至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约7至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约8至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约8至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约8至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约8至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约8至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约9至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约9至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约9至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约9至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约10至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约10至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约10至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约11至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约11至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约12至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得在第二或第三细胞培养基中培养第三或第四TIL群体的步骤进行约15天。
根据一些实施例，可使用任何前述方法提供自体收集的TIL群体以用于治疗患有癌症的人受试者。
C.基因编辑方法
如上文所述，本发明的实施例提供肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其通过基因编辑而被基因修饰(例如，其细胞表面上的免疫调节融合蛋白的表达)，以增强其治疗效果。本发明的实施例涵盖通过核苷酸(RNA或DNA)插入TIL群体中进行的基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达及抑制一种以上蛋白质的表达以及其组合。本发明的实施例也提供将TIL扩增为治疗性群体的方法，其中这些方法包括对TIL进行基因编辑。存在若干种可用于基因修饰TIL群体的基因编辑技术，这些基因编辑技术适合于根据本发明使用。
在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括稳定地并入用于产生一种以上蛋白的基因的步骤。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括逆转录病毒转导的步骤。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括慢病毒转导的步骤。慢病毒转导系统为本领域中已知的且描述于例如Levine等人,《美国国家科学院院刊》2006,103,17372-77；Zufferey等人,《自然生物技术学》1997,15,871-75；Dull等人,《病毒学杂志》1998,72,8463-71以及美国专利第6,627,442号中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括γ-逆转录病毒转导的步骤。γ-逆转录病毒转导系统为本领域中已知的且描述于例如Cepko和Pear,《分子生物学中的当前方案(Cur.Prot.Mol.Biol.)》1996,9.9.1-9.9.16中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括转座子介导的基因转移的步骤。转座子介导的基因转移系统为本领域中已知的，且包括其中转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白提供，使得转座子的长期表达不发生在转基因细胞中，例如作为mRNA(例如包含帽和聚A尾的mRNA)提供的转座酶。包括鲑鱼型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶(例如SB10、SB11和SB100x))以及经工程改造的酶活性增加的酶的合适的转座子介导的基因转移系统描述于例如以下中：Hackett等人,《分子疗法(Mol.Therapy)》2010,18,674-83和美国专利第6,489,458号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括稳定地并入用于产生或抑制(例如沉默)一种以上蛋白的基因的步骤。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法为本领域中已知的，且描述于例如以下中：Tsong,《生物物理杂志》1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如下中描述的电穿孔方法：美国专利第5,019,034号、第5,128,257号、第5,137,817号、第5,173,158号、第5,232,856号、第5,273,525号、第5,304,120号、第5,318,514号、第6,010,613号和第6,078,490号，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或导致TIL中限定的和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中的两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中的两个的第二脉冲间隔不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定的和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定的和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定的和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，第一组该至少三个脉冲中两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中两个的第二脉冲间隔不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中孔形成的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中的两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中的两个的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时间段，并维持TIL的存活率。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包被和胞吞作用)为本领域已知的，描述于以下中：Graham和vander Eb,《病毒学》1973,52,456-467；Wigler等人,《美国国家科学院院刊》1979,76,1373-1376；以及Chen和Okayarea,《分子细胞生物学》1987,7,2745-2752；以及美国专利第5,593,875号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用在过滤水中的阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域中已知的且描述于如下中：Rose等人,《生物技术》1991,10,520-525和Felgner等人,《美国国家科学院院刊》,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括使用以下中描述的方法进行转染步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
根据一些实施例，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导一个以上免疫检查点基因处的双链或单链断裂的产生。此类可编程核酸酶通过在特定基因组基因座处引入断裂而能够进行精确基因组编辑，即其依赖于识别基因组内的特定DNA序列以将核酸酶结构域靶向此位置并介导在目标序列处产生双链断裂。DNA中的双链断裂随后将内源性修复体系(machinery)募集至断裂位点，以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来介导基因组编辑。因此，断裂的修复可导致引入扰乱(例如沉默、抑制或增强)目标基因产物的插入/缺失突变。
经开发而使得能够进行位点特异性基因组编辑的核酸酶的主要类别包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样核酸酶(TALEN)和CRISPR相关核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。这些核酸酶系统可基于其DNA识别模式而大致分类为两类：ZFN和TALEN通过蛋白-DNA相互作用达成特定DNA结合，而CRISPR系统(例如Cas9)通过与目标DNA直接碱基配对的短RNA向导分子和通过蛋白-DNA相互作用而靶向特定DNA序列。参见例如Cox等人,《自然医学(NatureMedicine)》,2015,第21卷,第2期。
可根据本发明的TIL扩增方法使用的基因编辑方法的非限制性实例包括CRISPR方法、TALE方法和ZFN方法，其实施例在下文中更详细地描述。根据一些实施例，用于将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如过程2A)的任何实施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述进行，其中，该方法进一步包含通过CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中的一种以上基因编辑TIL的至少一部分，以产生可提供增强的治疗效果的TIL。根据一些实施例，可通过比较经基因编辑的TIL与未经修饰的TIL，例如通过评估相较于未经修饰的TIL的体外效应功能、细胞因子概况等，来评估经基因编辑的TIL的改善的治疗效果。
在本发明的一些实施例中，使用电穿孔来递送基因编辑系统，例如CRISPR、TALEN和ZFN系统。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统为流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施例的合适的流式电穿孔系统的实例为市售MaxCyte STX系统。有若干种可适用于本发明的替代性市售电穿孔仪器，例如可获自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(龙沙(Lonza)/Amaxa)、GenePulser MXcell(伯乐(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统为如本文所述的脉冲电穿孔系统，并与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。
在一些实施例中，使用微流体平台递送基因编辑系统。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
D.瞬时细胞修饰
在一些实施例中，本发明的经扩增的TIL在扩增步骤之前、期间或之后，包括在密闭无菌制造过程期间(各如本文所提供)经进一步操作，以用瞬时方式改变蛋白表达。在一些实施例中，本发明包括通过核苷酸插入(例如通过核糖核酸(RNA)插入，包括插入信使RNA(mRNA))至TIL群体中来进行瞬时细胞修饰，以促进一种以上蛋白质的表达或抑制一种以上蛋白质的表达以及同时促进一组蛋白质与抑制另一组蛋白质的组合。
在一些实施例中，本发明的经扩增的TIL经历蛋白质表达的瞬时改变。在一些实施例中，在第一次扩增之前，在主体TIL群体中进行蛋白质表达的瞬时改变。在一些实施例中，在第一扩增之后进行蛋白质表达的瞬时改变。在一些实施例中，在第二扩增之前，在主体TIL群体中进行蛋白质表达的瞬时改变。在一些实施例中，在第二扩增之后进行蛋白质表达的瞬时改变。
在一些实施例中，蛋白质表达的瞬时改变引起免疫调节组合物的瞬时表达。在一些实施例中，免疫调节组合物为免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含与免疫调节剂融合的膜锚。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在一些实施例中，免疫调节剂为选自如下的白介素：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂为选自如下的白介素：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
如本文所述，本发明的实施例提供肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其已通过蛋白质表达的瞬时改变而被瞬时修饰以增强其治疗效果。本发明的实施例涵盖通过将核苷酸(例如RNA)插入TIL群体中以用于免疫调节组合物的表达的瞬时修饰。本发明的实施例也提供将TIL扩增为治疗性群体的方法，其中这些方法包括瞬时修饰TIL。存在若干种可用于瞬时修饰TIL群体的基因编辑技术，这些基因编辑技术适合于根据本发明使用。
在一些实施例中，瞬时改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括使TIL与编码免疫调节组合物的核酸(例如mRNA)接触，然后对细胞进行电穿孔步骤。电穿孔方法为本领域中已知的，其描述于例如以下中：Tsong,《生物物理杂志》1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如下中描述的电穿孔方法：美国专利第5,019,034号、第5,128,257号、第5,137,817号、第5,173,158号、第5,232,856号、第5,273,525号、第5,304,120号、第5,318,514号、第6,010,613号和第6,078,490号，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包含用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定的及受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同；及(3)第一组该至少三个脉冲中的两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中的两个的第二脉冲间隔不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定的及受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定的及受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定及受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，第一组该至少三个脉冲中的两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中的两个的第二脉冲间隔不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中孔形成的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中两个的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时间段，并维持TIL的存活率。
在一些实施例中，瞬时改变TIL群体中蛋白质表达的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙核酸沉淀、细胞表面包被和胞吞作用)为本领域已知的且描述于如下中：Graham和van der Eb,《病毒学(Virology)》1973,52,456-467；Wigler等人,《美国国家科学院院刊》1979,76,1373-1376；以及Chen和Okayarea,《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》1987,7,2745-2752；以及美国专利第5,593,875号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，瞬时改变TIL群体中蛋白质表达的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用在过滤水中的阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域已知的且描述于如下中：Rose等人,《生物技术》1991,10,520-525和Felgner等人,《美国国家科学院院刊》,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，瞬时改变TIL群体中蛋白质表达的方法包括使用以下中描述的方法的转染步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。TIL可为如本文所述的第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。
在一些实施例中，使用SQZ无载体微流体平台进行瞬时改变蛋白质表达。参见例如国际专利申请公开第WO 2013/059343A1号、第WO 2017/008063A1号或第WO 2017/123663A1号或美国专利申请公开第US2014/0287509A1号、第US2018/0201889A1号或第US2018/0245089A1号，其均以全文(尤其关于用于核酸递送之微流体平台的公开内容)引用的方式并入本文中。在SQZ平台中，通过微流体收缩来暂时性破坏用于修饰的TIL的细胞膜，从而实现递送编码瞬时表达的蛋白的核酸。TIL可为如本文所述的第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。
E.免疫检查点
根据本发明的特定实施例，TIL群体经基因编辑以在TIL群体中的TIL细胞的细胞表面表达一种以上免疫调节组合物以及对TIL群体中一种以上的免疫检查点基因进行基因修饰。换言之，除了在细胞表面表达一种以上免疫调节组合物的TIL群体的修饰以外，TIL内编码TIL的一个以上的免疫检查点的DNA序列在TIL的基因组中被永久性修饰，例如插入、缺失或置换。免疫检查点为由淋巴细胞表达的分子，其通过抑制性或刺激性通路来调节免疫反应。在癌症的情况下，免疫检查点通路通常被活化以抑制抗肿瘤反应，即，由恶性细胞表达的某些免疫检查点抑制抗肿瘤免疫性且有利于癌细胞生长。参见例如Marin-Acevedo等人,《血液学和肿瘤学杂志(Journal of Hematology&Oncology)》(2018)11:39。因此，某些抑制性检查点分子充当本发明的免疫疗法的靶标。根据特定实施例，TIL经基因编辑以阻断或刺激某些免疫检查点通路，从而增强身体对抗肿瘤的免疫活性。
如本文所用，免疫检查点基因包含编码免疫检查点分子的DNA序列。根据本发明的特定实施例，在TIL扩增方法期间基因编辑TIL可导致至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因表达的沉默或减少。例如，基因编辑可导致抑制性受体(例如PD-1或CTLA-4)的表达的沉默或减少，从而增强免疫反应。
最广泛研究的检查点包括程序性细胞死亡受体-1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关分子-4(CTLA-4)，其为免疫细胞上的抑制性受体，其在与抑制性配体相互作用时抑制重要效应功能(例如，活化、增殖、细胞因子释放、细胞毒性等)。除PD-1和CTLA-4以外，许多检查点分子已成为免疫疗法的潜在靶标，如下文中更详细地论述。
可通过永久性基因编辑本发明的TIL而沉默或抑制的免疫检查点基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、BAFF(BR3)、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。例如，可在本发明的TIL中沉默或抑制的免疫检查点基因可选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、Cish、CBL-B、TIGIT、TET2、TGFβ和PKA。BAFF(BR3)描述于正在出版中的Bloom等人,《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》,2018中。根据另一实例，可在本发明的TIL中沉默或抑制的免疫检查点基因可选自：PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的第三TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包括递送至少一种选自如下的基因编辑物系统：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，其中，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面上的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制选自如下分子的表达：PD-1、LAG-3、TIM-3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PRA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
1.PD-1
针对诱导检查点阻断而研究最多的靶标之一为程序性死亡受体(PD1或PD-1，也称为PDCD1)，其为T细胞调节物的CD28超家族的成员。其配体PD-L1和PD-L2表达于各种肿瘤细胞(包括黑色素瘤)上。PD-1与PD-L1的相互作用可抑制T细胞效应功能，导致慢性刺激环境下的T细胞耗竭并诱导肿瘤微环境中的T细胞凋亡。PD1也可在肿瘤特异性逃离免疫监视中起作用。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中PD1的表达沉默或减少。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包括通过沉默或抑制PD1的表达来基因编辑TIL的至少一部分。如下文更详细地描述，基因编辑过程可涉及使用可编程核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如PD1)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法使TIL中PD1的表达沉默或减少。
2.CTLA-4
在T细胞活化时诱导活化的T细胞上CTLA-4的表达，并与抗原呈递细胞活化的抗原CD80和CD86竞争结合。CTLA-4与CD80或CD86的相互作用可引起T细胞抑制并用于维持免疫反应的平衡。然而，抑制CTLA-4与CD80或CD86的相互作用可延长T细胞活化并因此提高针对癌症抗原的免疫反应的水平。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中CTLA-4的表达沉默或减少。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包含基因编辑TIL的至少一部分以在细胞表面上表达至少一种免疫调节组合物以及沉默或抑制TIL中CTLA-4的表达。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如CTLA-4)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中CTLA-4的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
3.LAG-3
在II类组织相容性复合体(MHC)接合之后，由T细胞和自然杀伤(NK)细胞表达淋巴细胞活化基因-3(LAG-3，CD223)。尽管机制尚不明确，但对其进行调节可引起对T细胞功能的负调节作用，防止组织损伤和自体免疫。LAG-3和PD-1通常在TIL上共表达及上调，引起免疫耗竭及和肿瘤生长。因此，LAG-3阻断可改善抗肿瘤反应。参见例如Marin-Acevedo等人,《血液学和肿瘤学杂志》(2018)11:39。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中LAG-3的表达沉默或减少。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包括基因编辑TIL的至少一部分以在细胞表面上表达至少一种免疫调节组合物以及沉默或抑制TIL中的LAG-3的表达。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如LAG-3)处的双链或单链断裂的产生。根据特定实施例，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中LAG-3的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
4.TIM-3
T细胞免疫球蛋白-3(TIM-3)为T细胞的直接负调节物并表达于NK细胞和巨噬细胞上。TIM-3通过诱导髓系来源抑制细胞(MDSC)的扩增来间接地促进免疫抑制。发现其在功能障碍和耗竭的T细胞上的含量特定地升高，表明在恶性肿瘤中的重要作用。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中TIM-3的表达沉默或减少。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包括基因编辑TIL的至少一部分以在细胞表面上表达至少一种免疫调节组合物以及沉默或抑制TIL中TIM-3的表达。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如TIM-3)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中TIM-3的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
5.Cish
Cish，细胞因子信号抑制子(SOCS)家族的成员，由CD8+T细胞中的TCR刺激诱导并抑制其针对肿瘤的功能性亲合力。CD8+T细胞中的Cish的基因缺失可增强其扩增、功能性亲合力和细胞因子多功能性，引起现有肿瘤的明显和持久的消退。参见例如Palmer等人,《实验医学杂志(Journal of Experimental Medicine)》,212(12):2095(2015)。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中Cish的表达沉默或减少。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包括基因编辑TIL的至少一部分以在细胞表面上表达至少一种免疫调节组合物以及沉默或抑制TIL中Cish的表达。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包含使用可编程核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如Cish)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中Cish的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
6.TGFβ
TGFβ信号传导通路在调节细胞生长、分化、细胞凋亡、活动性和侵袭、细胞外基质产生、血管生成和免疫反应方面具有多种功能。TGFβ信号传导失调在肿瘤中是常见的，并在肿瘤发生、发展和转移中具有重要作用。在微环境水平下，TGFβ通路在所有癌发生中有助于产生有利于肿瘤生长和转移的微环境。参见例如Neuzillet等人,《药理学和治疗剂(Pharmacology&Therapeutics)》,第147卷,第22-31页(2015)。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中TGFβ的表达沉默或减少。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包括基因编辑TIL的至少一部分以在细胞表面上表达至少一种免疫调节组合物以及沉默或抑制TIL中TGFβ的表达。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如TGFβ)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中TGFβ的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
在一些实施例中，可使用本领域中已知的方法，通过使用CRISPR/Cas9系统沉默TGFβR2或通过使用TGFβR2显性负胞外捕捉器(trap)来抑制TGFβR2(TGFβ受体2)。
7.PKA
蛋白激酶A(PKA)为熟知的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶超家族的成员。PKA，也称为cAMP依赖性蛋白激酶，为多单元蛋白激酶，通过其在cAMP结合时的活化来介导G蛋白偶联受体的信号转导。其涉及自代谢至离子通道活化、细胞生长和分化、基因表达和细胞凋亡的多种细胞过程的控制。重要的是，PKA与许多肿瘤的发生和发展有关。参见例如Sapio等人,《实验和临床科学杂志(EXCLI Journal)》；2014；13:843-855。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中PKA的表达沉默或减少。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包括基因编辑TIL的至少一部分以在细胞表面上表达至少一种免疫调节组合物以及沉默或抑制TIL中PKA的表达。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如PKA)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中PKA的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
8.CBLB
CBLB(或CBL-B)为E3泛素-蛋白连接酶并且为T细胞活化的负调节剂。Bachmaier等人,《自然(Nature)》,2000,403,211-216；Wallner等人,《临床和发展免疫学(Clin.Dev.Immunol.)》2012,692639。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中CBLB的表达沉默或减少。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包括基因编辑TIL的至少一部分以在细胞表面上表达至少一种免疫调节组合物和沉默或抑制TIL中CBLB的表达。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如CBLB)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中PKA的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，使用TALEN基因敲除使CBLB沉默。在一些实施例中，使用TALE-KRAB转录抑制剂基因敲入使CBLB沉默。关于这些方法的更多细节可见于Boettcher和McManus,《分子细胞综述(Mol.Cell Review)》,2015,58,575-585中。
9.TIGIT
具有Ig和ITIM(免疫受体基于酪氨酸的抑制基序)结构域或TIGIT的T细胞免疫受体为跨膜糖蛋白受体，其在其胞质结构域中具有Ig样V型结构域和ITIM。Khalil等人,《癌症研究进展(Advances in Cancer Research)》,2015,128,1-68；Yu等人,《自然免疫学(Nature Immunology)》,2009,第10卷,第1号,48-57。TIGIT由一些T细胞和自然杀伤细胞表达。此外，已显示TIGIT在抗原特异性CD8+T细胞和CD8+TIL(尤其来自患有黑色素瘤的受试者)上过度表达。研究已显示TIGIT通路有助于肿瘤免疫逃避且已显示TIGIT抑制可增加应答于多克隆和抗原特异性刺激的T细胞活化和增殖。Khalil等人,《癌症研究进展》,2015,128,1-68。此外，在小鼠模型中，用PD-1或TIM3共阻断TIGIT显示出针对实体瘤的协同作用。同上；也参见Kurtulus等人,《临床研究杂志(The Journal of ClinicalInvestigation)》,2015,第125卷,第11号,4053-4062。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中之TIGIT的表达沉默或减少。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包括基因编辑TIL的至少一部分以在细胞表面上表达至少一种免疫调节组合物以及沉默或抑制TIL中TIGIT的表达。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如TIGIT)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中TIGIT的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
10.TOX
胸腺细胞选择相关高迁移率组(high mobility group)(HMG)盒(TOX)为包含HMG盒DNA结合结构域的转录因子。TOX为HMG盒超家族的成员，认为其以非序列依赖性，但以结构依赖性的方式与DNA结合。
已鉴定TOX为肿瘤特异性CD8+T细胞功能失调或T细胞耗竭的重要调节剂且发现其以转录和表观遗传的方式安排CD8+T细胞耗竭，如例如Scott等人,《自然》,2019,571,270-274以及Khan等人,《自然》,2019,571,211-218中所描述，其均以全文引用的方式并入本文中。也发现TOX为慢性感染期间T细胞功能失调的发展和T细胞耗竭的维持的重要因子，如Alfei等人,《自然》,2019,571,265-269中所描述，其以全文引用的方式并入本文中。TOX在来自肿瘤和慢性病毒感染的功能失调或耗竭的T细胞中大量表达。TOX在体外效应T细胞中的异位表达诱导与T细胞耗竭相关的转录程序，而T细胞中TOX的缺失消除T耗竭程序。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中TOX的表达沉默或减少。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包括基因编辑TIL的至少一部分以在细胞表面上表达至少一种免疫调节组合物以及沉默或抑制TOX的表达。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，其介导免疫检查点基因(例如TOX)处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法沉默或抑制TIL中TOX的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
F.共刺激受体或粘附分子的过度表达
根据其他实施例，在TIL扩增方法期间对TIL进行基因编辑可引起细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，引起至少一部分治疗性TIL群体中的一种以上共刺激受体、粘附分子和/或细胞因子的表达增强。例如，基因编辑可引起共刺激受体、粘附分子或细胞因子的表达增强，即，与未经基因修饰的共刺激受体、粘附分子或细胞因子的表达相比过度表达。可通过本发明的永久性基因编辑TIL展现出增强的表达的共刺激受体、粘附分子或细胞因子基因的非限制性实例包括某些趋化因子受体和白介素，例如CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、IL-21、NOTCH 1/2胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
1.CCR
为了使过继性T细胞免疫疗法有效，需要通过趋化因子使T细胞适当地迁移至肿瘤中。由肿瘤细胞分泌的趋化因子、外周中存在的趋化因子和由T细胞表达的趋化因子受体之间的匹配对于T细胞成功迁移至肿瘤床中而言是重要的。
根据特定实施例，本发明的基因编辑方法可用于增加TIL中某些趋化因子受体(例如CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3和CX3CR1中的一种以上)的表达。CCR的过表达可有助于促进TIL在过继性转移之后的效应功能和增殖。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法使TIL中CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3和CX3CR1中的一种以上的表达增强。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包含基因编辑TIL的至少一部分以在细胞表面上表达至少一种免疫调节组合物以及增强TIL中CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3和CX3CR1中的一种以上的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，其介导趋化因子受体基因处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法增强TIL中某些趋化因子受体的表达。
在一些实施例中，使用如本文所述的γ-逆转录病毒或慢病毒方法将CCR4和/或CCR5粘附分子插入TIL群体中。在一些实施例中，使用如下所述的γ-逆转录病毒或慢病毒方法将CXCR2粘附分子插入TIL群体中：Forget等人,《前沿免疫学(FrontiersImmunology)》2017,8,908或Peng等人,《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》2010,16,5458，其公开内容以引用的方式并入本文中。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，以获得第二TIL群体，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的第三TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包括递送至少一种选自如下的基因编辑物系统：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，其中，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面上的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制PD-1和可选地存在的LAG-3的表达，此外，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面处的CXCR2粘附分子的表达或通过γ逆转录病毒或慢病毒方法将CXCR2粘附分子插入第一TIL群体、第二TIL群体或所收集的TIL群体中。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的第三TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包含递送至少一种选自如下的基因编辑物系统：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，其中，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面上的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制PD-1和可选地存在的LAG-3的表达，此外，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面处的CCR4和/或CCR5粘附分子的表达或通过γ逆转录病毒或慢病毒方法将CXCR2粘附分子插入第一TIL群体、第二TIL群体或所收集的TIL群体中。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括含：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，以获得第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天，其中，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的第三TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包含递送至少一种选自如下的基因编辑物系统：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，其中，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面上的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制PD-1和可选地存在的LAG-3的表达，此外，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面处的选自CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和它们的组合的粘附分子的表达或通过γ逆转录病毒或慢病毒方法将粘附分子插入第一TIL群体、第二TIL群体或所收集的TIL群体中。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
2.白介素
根据其他实施例，本发明的基因编辑方法可用于增加某些白介素(例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18和IL-21中的一种以上)的表达。已证明某些白介素可增强T细胞的效应功能并介导肿瘤控制。
根据特定实施例，本发明的组合物和方法增强TIL中的IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18和IL-21中的一种以上的表达。例如，可根据本文所述的方法(例如，过程2A、过程Gen 3或图34和图35中所显示的方法)的任何实施例进行将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其中，该方法包括通过增强IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18和IL-21中的一种以上的表达来基因编辑TIL的至少一部分。如下文更详细地描述，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，其介导白介素基因处的双链或单链断裂的产生。例如，可使用CRISPR方法、TALE方法或锌指方法增强TIL中的某些白介素的表达。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，以获得第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现至少一种基因编辑物的转移；
(f)将第二TIL群体静置约1天，成为第二TIL群体中的多个细胞；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包含递送至少一种选自如下的基因编辑物系统：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活因子样效应物(TALE)系统或锌指系统，其中，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面上的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制PD-1和可选地存在的LAG-3的表达，此外，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面处的选自IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、IL-21和它们的组合的白介素的表达或通过γ逆转录病毒或慢病毒方法将白介素插入第一TIL群体、第二TIL群体或所收集的TIL群体中。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的细胞因子。在一些实施例中，细胞因子选自：IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。
3.基因编辑方法
如上文所述，本发明的实施例提供通过基因编辑而被基因修饰以增强其治疗效果的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，包括通过瞬时基因编辑而被修饰以瞬时改变经修饰的TIL中蛋白质表达的TIL。本发明的实施例涵盖通过核苷酸(RNA或DNA)插入TIL群体中进行的基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达和抑制一种以上蛋白质的表达以及它们的组合。本发明的实施例也提供用于将TIL扩增为治疗性群体的方法，其中，这些方法包括基因编辑TIL，或其中这些方法包括瞬时基因编辑TIL以瞬时改变经修饰的TIL中蛋白质的表达。存在若干种可用于基因修饰TIL群体的基因编辑技术，包括用于瞬时改变TIL群体中蛋白质表达的瞬时基因编辑技术，其适合根据本发明使用。
在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括稳定地并入用于产生一种以上蛋白的基因的步骤。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括逆转录病毒转导的步骤。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括慢病毒转导的步骤。慢病毒转导系统为本领域中已知的且描述于例如下中：Levine等人,《美国国家科学院院刊》2006,103,17372-77；Zufferey等人,《自然生物技术学(Nat.Biotechnol.)》1997,15,871-75；Dull等人,《病毒学杂志(J.Virology)》1998,72,8463-71以及美国专利第6,627,442号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括γ-逆转录病毒转导的步骤。γ-逆转录病毒转导系统为本领域中已知的且描述于例如Cepko和Pear,《分子生物学中之当前方案》1996,9.9.1-9.9.16，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括转座子介导的基因转移的步骤。转座子介导的基因转移系统为本领域中已知的，且包括其中转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得转座酶的长期表达不发生在转基因细胞中，例如作为mRNA(例如包含帽和聚A尾的mRNA)提供的转座酶。包括鲑鱼型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶(例如SB10、SB11和SB100x))和经工程改造的酶活性增加的酶的合适的转座子介导的基因转移系统描述于例如如下中：Hackett等人,《分子疗法(Mol.Therapy)》2010,18,674-83和美国专利第6,489,458号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括稳定地并入用于产生或抑制(例如，沉默)一种以上蛋白质的基因的步骤。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法(例如通过瞬时改变蛋白质表达来进行瞬时基因修饰的方法)包括电穿孔步骤。电穿孔方法为本领域中已知的，且描述于例如以下中：Tsong,《生物物理杂志》1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如以下中描述的电穿孔方法：美国专利第5,019,034号、第5,128,257号、第5,137,817号、第5,173,158号、第5,232,856号、第5,273,525号、第5,304,120号、第5,318,514号、第6,010,613号和第6,078,490号，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定的和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中的两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中的两个的第二脉冲间隔不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定的和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上互相不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定的和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中限定的和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，第一组该至少三个脉冲中的两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中的两个的第二脉冲间隔不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中孔形成的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中的两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中的两个的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时间段，并维持TIL的存活率。
在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法(例如通过瞬时改变蛋白表达来进行瞬时基因修饰的方法)包括磷酸钙转染步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包被和胞吞作用)为本领域中已知的且描述于以下中：Graham和van der Eb,《病毒学》1973,52,456-467；Wigler等人,《美国国家科学院院刊》1979,76,1373-1376；以及Chen和Okayarea,《分子细胞生物学》1987,7,2745-2752；以及美国专利第5,593,875号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法(例如通过瞬时改变蛋白质表达来进行瞬时基因修饰的方法)包括脂质体转染步骤。脂质体转染方法，例如采用在过滤水中的阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域已知的且描述于如下中：Rose等人,《生物技术》1991,10,520-525和Felgner等人,《美国国家科学院院刊》,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法(例如通过瞬时改变蛋白质表达来进行瞬时基因修饰的方法)包括使用美国专利第5,766,902号；第6,025,337号；第6,410,517号；第6,475,994号；和第7,189,705号中所描述的方法的转染步骤，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
根据一些实施例，基因编辑过程可包括使用可编程核酸酶，该可编程核酸酶介导一个以上免疫检查点基因处的双链或单链断裂的产生。此类可编程核酸酶通过在特定基因组基因座处引入断裂而能够进行精确的基因组编辑，即其依赖于识别基因组内的特定DNA序列以将核酸酶结构域靶向此位置并介导在靶序列处产生双链断裂。DNA中的双链断裂随后将内源性修复机理体系募集至断裂位点，以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来介导基因组编辑。因此，断裂的修复可导致引入扰乱(例如沉默、抑制或增强)靶基因产物的插入/缺失突变。
经开发而使得能够进行位点特异性基因组编辑的核酸酶的主要类别包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样核酸酶(TALEN)和CRISPR相关核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。这些核酸酶系统可基于其DNA识别模式而大致分类为两类：ZFN和TALEN通过蛋白-DNA相互作用达成特定DNA结合，而CRISPR系统(例如Cas9)通过与靶标DNA直接碱基配对的短RNA向导分子和通过蛋白-DNA相互作用而靶向特定DNA序列。参见例如Cox等人,《自然医学(NatureMedicine)》,2015,第21卷,第2期。
可根据本发明的TIL扩增方法使用的基因编辑方法的非限制性实例包括CRISPR方法、TALE方法和ZFN方法，其实施例在下文中更详细地描述。根据一些实施例，将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如过程2A)的任何实施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述进行，其中，该方法进一步包括通过CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中的一种以上基因编辑TIL的至少一部分，以产生可提供增强的治疗效果的TIL。根据一些实施例，可通过比较经基因编辑的TIL与未经修饰的TIL，例如通过评估相较于未经修饰的TIL的体外效应功能、细胞因子概况等，来评估经基因编辑的TIL的改善的治疗效果。
在本发明的一些实施例中，使用电穿孔来递送基因编辑系统，例如CRISPR、TALEN和ZFN系统。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统为流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施例的合适的流式电穿孔系统的实例为市售MaxCyte STX系统。有若干种可适用于本发明的替代性市售电穿孔仪器，例如可获自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(龙沙(Lonza)/Amaxa)、GenePulser MXcell(伯乐(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统为如本文所述的脉冲电穿孔系统，且与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。
a.CRISPR方法
用于将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如过程2A)的任何实施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述的进行，其中，该方法进一步包括通过CRISPR方法(例如，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)基因编辑TIL的至少一部分。根据特定实施例，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法可引起至少一部分治疗性TIL群体的细胞表面处的一种以上免疫调节组合物的表达，可选地引起一种以上免疫检查点基因的沉默或减少。或者，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法可引起至少一部分治疗性TIL群体的细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，可选地引起一种以上免疫检查点基因的增强。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
CRISPR代表“成簇规律间隔短回文重复序列”。使用CRISPR系统进行基因编辑的方法在本文中也称为CRISPR方法。CRISPR系统可分为两种主要类别，即第1类和第2类，其进一步分为不同类型和亚型。CRISPR系统的分类基于能够裂解特定核酸的效应Cas蛋白。在第1类CRISPR系统中，效应模块由多蛋白复合体组成，而第2类系统仅使用一种效应蛋白。第1类CRISPR包括第I、III和IV型，第2类CRISPR包括第II、V和VI型。尽管可根据本发明使用这些类型的CRISPR系统中的任一种，但根据本发明使用的优选为包括RNA和Cas蛋白的三种类型的的CRISPR系统：I型(由Cas3示例)、II(型由Cas9示例)和III型(由Cas10示例)。II型CRISPR为最充分表征的系统之一。
CRISPR技术改编自细菌和古菌(单细胞微生物的域)之天然防御机制。这些生物体使用CRISPR衍生的RNA和各种Cas蛋白(包括Cas9)，通过切碎和破坏外来入侵者的DNA来阻止病毒和其他外来体的攻击。CRISPR为具有两个独特特征的DNA特化区：存在核苷酸重复序列和间隔子。核苷酸的重复序列分布在整个CRISPR区中，其中短外来DNA区段(间隔子)穿插在重复序列中。在II型CRISPR/Cas系统中，间隔子整合于CRISPR基因组基因座内并且转录并加工成短CRISPR RNA(crRNA)。这些crRNA退火成反式活化crRNA(tracrRNA)，引导Cas蛋白进行序列特异性裂解和沉默病原性DNA。Cas9蛋白进行的目标识别需要crRNA内的“种子”序列和crRNA结合区上游的含有二核苷酸的保守原间隔序列相邻基序(PAM)序列，因此CRISPR/Cas系统可通过重新设计crRNA而重新靶向以裂解几乎任何DNA序列。因此，根据某些实施例，Cas9充当RNA引导的DNA核酸内切酶，其在crRNA-tracrRNA识别时使DNA裂解。原生系统中的crRNA和tracrRNA可简化为约100个核苷酸的单向导RNA(sgRNA)以用于基因工程改造。sgRNA为合成RNA，其包括Cas结合所必需的支架序列和使用者定义的约17-至20-核苷酸间隔子，该间隔子定义待修饰的基因组靶标。因此，使用者可通过改变sgRNA中存在的目标序列来改变Cas蛋白的基因组靶标。通过共同递送表达Cas9核酸内切酶和RNA组分(例如，sgRNA)的质粒使人细胞可直接携带CRISPR/Cas系统。可使用不同的Cas蛋白变体来减少靶向限制(例如Cas9的异种同源物，例如Cpf1)。
根据一些实施例，经工程改造、可编程、非天然存在的II型CRISPR-Cas系统包含Cas9蛋白和至少一种向导RNA，该至少一种向导RNA靶向TIL中的DNA分子的靶序列且与其杂交，其中DNA分子编码并且TIL表达至少一种免疫检查点分子，Cas9蛋白使DNA分子裂解，从而改变该至少一种免疫检查点分子的表达；该Cas9蛋白和该向导RNA并非天然地共同存在。根据一些实施例，改变两种以上免疫检查点分子的表达。根据一些实施例，向导RNA包含与tracr序列融合的引导序列。例如，向导RNA可包含crRNA-tracrRNA或sgRNA。根据本发明的方面，术语“向导RNA”、“单一向导RNA”和“合成向导RNA”可互换使用且指包含向导序列的多核苷酸序列，其为指定靶标位点的向导RNA内约17-20bp的序列。
根据本发明的实施例，也可使用与Cas9相比具有改善的靶特异性的Cas9变体。此类变体可称为高保真Cas-9。根据一些实施例，可利用双切口酶方法，其中，靶向反向DNA链的两个切口酶产生在靶标DNA内的DSB(通常称为双切口或双切口酶CRISPR系统)。例如，此方法可涉及两个Cas9核酸酶域中的一个的突变，使Cas9自核酸酶转变为切口酶。高保真Cas9的非限制性实例包括eSpCas9、SpCas9-HF1和HypaCas9。此类变体可减少或消除非靶标DNA位点处的不期望的变化。参见例如Slaymaker IM等人,《科学(Science)》.2015年12月1日，Kleinstiver BP等人,《自然》.2016年1月6日，和Ran等人,《自然实验手册(NatProtoc.)》2013年11月；8(11):2281-2308，其公开内容以引用的方式并入本文中。
此外，根据特定实施例，可使用改善向细胞中基因递送Cas9和改善中靶特异性的Cas9支架，例如美国专利申请公开第2016/0102324号中所公开的支架，其以引用的方式并入本文中。例如，Cas9支架可包括如由(D-[I/L]-G-X-X-S-X-G-W-A)定义的RuvC基序和/或由(Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D-X-S)定义的HNH基序，其中，X表示20种天然存在的氨基酸中的任一种，[I/L]表示异亮氨酸或亮氨酸。HNH结构域负责切开靶标dsDNA的一条链，RuvC结构域涉及dsDNA的另一条链的裂解。因此，这些结构域中的每一个切割紧邻PAM的前间隔子(protospacer)内靶标DNA的一条链，引起DNA的平端裂解(blunt cleavage)。这些基序可互相组合以产生更紧密和/或特异性更高的Cas9支架。此外，基序可用于产生分成两个单独的RuvC和HNH结构域的分裂(split)Cas9蛋白(即，Cas9蛋白或Cas9变体的减少或截短形式，其包含RuvC域或HNH域)，这些结构域可共同或单独地处理靶标DNA。
根据特定实施例，CRISPR方法包括通过引入Cas9核酸酶和向导RNA(例如crRNA-tracrRNA或sgRNA)来沉默或降低TIL中一种以上免疫检查点基因的表达，该向导RNA含有特异性针对免疫检查点基因的靶标DNA序列的约17至20个核苷酸的序列。可以以RNA形式或通过转化具有启动子下的向导RNA编码序列的质粒来递送向导RNA。基于sgRNA定义的靶序列，CRISPR/Cas酶在特定位置引入双链断裂(DSB)。可通过非同源末端连接(NHEJ，一种通常引起DNA中的插入或缺失(插入/缺失)的机制)来修复细胞中的DSB。插入/缺失通常引起移码，产生功能失去的等位基因；例如，通过在靶基因的开放阅读框架(ORF)内引起早熟终止密码子。根据某些实施例，结果为靶标免疫检查点基因内的功能丧失突变。
或者，代替NHEJ，可通过同源定向修复(HDR)来修复由CRISPR/Cas酶诱导的DSB。尽管NHEJ介导的的SB修复通常破坏基因的开放阅读框架，但可使用同源定向修复(HDR)来产生在单一核苷酸变化至大型插入范围内的特定核苷酸变化。根据一些实施例，使用HDR通过将含有所需序列的DNA修复模板递送至具有sgRNA和Cas9或Cas9切口酶的TIL中来基因编辑免疫检查点基因。修复模板优选含有紧邻靶基因的上游和下游的需要编辑以及其他同源序列(通常称为左和右同源臂)。
根据特定实施例，可使Cas9的酶促非活性版本(deadCas9或dCas9)靶向转录起始位点以通过阻断起始来抑制转录。因此，可在不使用DSB的情况下抑制靶标免疫检查点基因。dCas9分子保留基于sgRNA靶向序列结合靶标DNA的能力。根据本发明的一些实施例，CRISPR方法包含通过抑制或阻止靶基因的转录来沉默或降低一种以上免疫检查点基因的表达。例如，CRISPR方法可包括使转录抑制子结构域(例如Kruppel相关盒(KRAB)结构域)与Cas9的酶促非活性版本融合，从而形成例如dCas9-KRAB，其靶向免疫检查点基因的转录起始位点，引起抑制或阻止基因的转录。优选地，使抑制子结构域靶向转录起始位点下游(例如下游约500bp处)的窗口。此方法(其可称为CRISPR干扰(CRISPRi))通过靶标RNA的转录减少而引起稳定的基因敲减。
根据特定实施例，可使Cas9的酶促非活性版本(deadCas9或dCas9)靶向转录起始位点以活化转录。此方法可称为CRISPR活化(CRISPRa)。根据一些实施例，CRISPR方法通过活化靶基因的转录来增加一种以上免疫检查点基因的表达。根据此类实施例，可在不使用DSB的情况下活化靶标免疫检查点基因。CRISPR方法可包括使转录活化结构域靶向转录起始位点；例如，通过使转录活化因子(例如VP64)与dCas9融合，从而形成例如dCas9-VP64，其靶向免疫检查点基因的转录起始位点，引起基因转录的活化。优选地，使活化因子域靶向转录起始位点上游，例如下游约50至400bp处的窗口。
本发明的其他实施例可利用经开发以用于哺乳动物细胞中的靶基因的强效活化的活化策略。非限制性实例包括与经表位标记的dCas9和抗体-活化因子效应蛋白(例如，SunTag系统)、与多个不同的串联的活化结构域融合的dCas9(例如，dCas9-VPR)的共同表达，或dCas9-VP64与具有经修饰的支架gRNA和其他RNA结合辅助活化因子(例如，SAM活化因子)的共同表达。
根据其他实施例，可根据本发明的实施例使用称为CRISPR辅助合理蛋白质工程改造(CARPE)的CRISPR介导的基因组编辑方法，如美国专利第9,982,278号中所公开，其以引用的方式并入本文中。CARPE涉及产生“供体”和“靶标”库，其将来自单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)编辑盒的定向突变直接并入基因组中。供体库的构建涉及将合理设计的编辑寡核苷酸和与靶标DNA序列杂交的向导RNA(gRNA)共同转型至细胞中。编辑的寡核苷酸经设计以使PAM的缺失或突变与相邻基因中的一个以上所需密码子的突变偶合。这使得能够在单一转化中产生整个供体库。使用来自编辑的寡核苷酸的合成特征，即，在基因的3'端同时并入的第二PAM缺失或突变，通过重组染色体的扩增(例如通过PCR反应)来检索供体库。这使针对PAM缺失的密码子靶标突变共价偶合。然后，将供体库与靶标gRNA载体共同转化至细胞中以产生表达合理设计的蛋白库的细胞群体。
根据其他实施例，可根据本发明的实施例使用称为通过可追踪的富含CRISPR的重组工程进行的基因组工程改造(GEn-TraCER)的用于使用CRISPR介导的系统进行可追踪、精确基因组编辑的方法，如美国专利第9,982,278号中所公开，其以引用的方式并入本文中。GEn-TraCER方法和载体在单一载体上组合编辑盒与编码gRNA的基因。该盒含有所需突变和PAM突变。将也可编码Cas9的载体引入细胞或细胞群体中。此活化细胞或细胞群体中的CRISPR系统的表达，引起gRNA将Cas9募集至靶标区域，在该靶标区域中发生dsDNA断裂，实现PAM突变的整合。
可通过CRISPR方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过CRISPR方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、IL-21、NOTCH 1/2细胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
用于通过CRISPR方法改变靶基因序列的表达和可根据本发明的实施例使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第8,697,359号；第8,993,233号；第8,795,965号；第8,771,945号；第8,889,356号；第8,865,406号；第8,999,641号；第8,945,839号；第8,932,814号；第8,871,445号；第8,906,616号；和第8,895,308号中，其以引用的方式并入本文中。用于进行CRISPR方法之资源，例如用于表达CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1的质粒，可购自公司，例如金斯瑞(GenScript)。
在一些实施例中，可使用如美国专利第US 9,790,490号中所描述的CRISPR/Cpf1系统进行如本文所述的TIL群体的基因修饰，其公开内容以引用的方式并入本文中。CRISPR/Cpf1系统在功能上与CRISPR-Cas9系统的不同之处在于，无需额外的tracrRNA即可将Cpf1相关CRISPR阵列(array)处理为成熟crRNA。CRISPR/Cpf1系统中使用的crRNA具有间隔子或向导序列和直接重复序列。使用此方法形成的Cpf1p-crRNA复合体本身即足以使靶标DNA裂解。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，其中，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；和
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包括递送至少一种选自如下的基因编辑物系统：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统和CRISPR/Cpf1系统，其中，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面上的至少一种免疫调节组合物的表达，调节至少一种检查点蛋白质的表达。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3且培养约1至3天来刺激第二TIL群体，以获得第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；和
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包括递送至少一种选自如下的基因编辑物系统：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统和CRISPR/Cpf1系统，其中，该至少一种基因编辑物系统实现第二TIL群体中的多个细胞的细胞表面上的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制PD-1和LAG-3的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
b.TALE方法
可根据本文所述的方法(例如，过程2A)的任何实施例或如WO2018081473、WO2018129332或WO2018182817中的描述来进行用于将TIL扩增为治疗性群体的方法，其中，该方法进一步包括通过TALE方法基因编辑TIL的至少一部分。根据特定实施例，在TIL扩增过程期间使用TALE方法可引起细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，可选地引起至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达的沉默或降低。或者，在TIL扩增过程期间使用TALE方法可引起细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，可选地引起至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达的增强。
TALE代表“转录激活因子样效应物”蛋白，其包括TALEN(“转录激活因子样效应物核酸酶”)。使用TALE系统来进行基因编辑的方法在本文中也称为TALE方法。TALE为来自植物病原细菌黄单孢菌属(Xanthomonas)的天然存在的蛋白，其含有由一系列各自识别单碱基对的33至35个氨基酸的重复结构域构成的DNA结合结构域。TALE特异性地通过被称为重复可变二残基(RVD)的两个高变氨基酸确定。模块化的TALE重复序列连接在一起以识别连续DNA序列。DNA结合结构域中的特异性RVD识别靶基因座中的碱基，从而提供结构特征以组装可预测的DNA结合结构域。将TALE的DNA结合结构域与IIS型FokI核酸内切酶的催化结构域融合，以制备可靶向的TALE核酸酶。为了诱导位点特异性突变，由14至20个碱基对间隔区域分开的两个单独TALEN臂将FokI单体拉近以二聚化并产生靶向的双链断裂。
若干个利用各种组装方法的大的系统性研究指示，可并入TALE重复序列以识别几乎任何使用者定义的序列。能够实现定制TALE阵列的快速组装的策略包括Golden Gate分子克隆、高通量固相组装和非连接依赖性克隆技术。定制设计的TALE阵列也由CellectisBioresearch(法国巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals(美国肯塔基州列克星敦)和Life Technologies(美国纽约州格兰德岛)市售。此外，可使用基于网络的工具(例如TAL效应子-核苷酸靶标2.0(TAL Effector-Nucleotide Target 2.0))，其能够设计用于所需靶标的定制TAL效应子重复序列阵列和提供所预测的TAL效应子结合位点。参见Doyle等人,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,2012,第40卷,W117-W122。适用于本发明的TALE和TALEN方法的实例描述于美国专利申请公开第US2011/0201118 A1号、第US 2013/0117869A1号、第US2013/0315884 A1号、第US2015/0203871 A1号和第US 2016/0120906A1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
根据本发明的一些实施例，TALE方法包括通过抑制或阻止靶基因的转录来沉默或降低一种以上免疫检查点基因的表达。例如，TALE方法可包括利用KRAB-TALE，其中，该方法包括将转录Kruppel相关盒(KRAB)结构域与靶向基因的转录起始位点的DNA结合结构域融合，导致抑制或阻止基因的转录。
根据其他实施例，TALE方法包括通过在靶基因中引入突变来沉默或降低一种以上免疫检查点基因的表达。例如，TALE方法可包括使核酸酶效应子结构域(例如Fokl)与TALEDNA结合结构域融合，产生TALEN。Fokl在作为二聚体时具有活性；因此，该方法包括构建TALEN对以将FOKL核酸酶结构域定位至相邻基因组靶标位点，这些结构域在这些靶标位点处引入DNA双链断裂。可在Fokl正确定位和二聚化之后完成双链断裂。在引入双链断裂之后，可通过两种不同机制实现DNA修复：高保真同源重组对(HRR)(也称为同源定向修复或HDR)或易错非同源末端连接(NHEJ)。通过NHEJ进行的双链断裂的修复优选引起DNA靶标位点缺失、插入或取代，即，NHEJ通常引起在断裂位点处引入小型插入和缺失，通常诱导敲除基因功能的移码。根据特定实施例，使TALEN对靶向基因的大部分5'外显子，促进早期移码突变或早熟终止密码子。由TALEN引入的基因突变优选为永久性的。因此，根据一些实施例，该方法包括通过利用二聚化的TALEN诱导位点特异性双链断裂，引起靶标免疫检查点基因中的一个以上突变来沉默或降低免疫检查点基因的表达，该位点特异性双链断裂通过易错NHEJ修复。
根据其他实施例，使用TALEN以通过HRR来引入基因变化，例如非随机点突变、靶标缺失或DNA片段的添加。引入DNA双链断裂使得能够在存在适合的供体DNA的情况下，通过同源重组进行基因编辑。根据一些实施例，该方法包括共同递送二聚化的TALEN和携带基因座特异性同源臂的供体质粒，以诱导位点特异性双链断裂和将一个以上转基因整合至DNA中。
根据其他实施例，可根据本发明的实施例使用TALEN，该TALEN为来源于FokI和AvrXa7的杂交蛋白，如美国专利公开第2011/0201118号中所公开。此TALEN保留对AvrXa7的靶标核苷酸的识别特异性和FokI的双链DNA裂解活性。可使用相同方法制备具有不同识别特异性的其他TALEN。例如，可通过工程改造具有不同RVD集合的核心TALE支架以改变DNA结合特异性以及靶向特异性单一dsDNA靶序列来产生紧密的(compact)TALEN。参见美国专利公开第2013/0117869号。可将所选择的催化结构域连接至支架以实现DNA处理，其可经工程改造以确保当与核心TALE支架融合时，催化结构域能够处理单一dsDNA靶序列附近的DNA。肽接头也可经工程改造以使催化结构域与支架融合，从而产生由单一多肽链制成的紧密的TALEN，其无需用于靶向特异性单一dsDNA序列的二聚化作用。核心TALE支架也可通过使催化结构域(其可为TAL单体)与其N末端融合，实现此催化结构域可与另一个与另一TAL单体融合的催化结构域相互作用的可能性，从而产生可能处理靶序列附近的DNA的催化实体而被修饰。参见美国专利公开第2015/0203871号。此架构仅允许靶向一条DNA链，其并非经典TALEN架构的选项。
根据本发明的一些实施例，可使用常规RVD以产生能够显著降低基因表达的TALEN。在一些实施例中，使用四种RVD(即NI、HD、NN和NG)以分别靶向腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。这些常规RVD可用于例如产生靶向PD-1基因的TALEN。使用常规RVD的TALEN的实例包括Gautron等人,《分子疗法：核酸(Molecular Therapy:Nucleic Acids)》,2017年12月,第9卷:312-321(Gautron)中所公开的T3v1和T1 TALEN，其以引用的方式并入本文中。T3v1和T1 TALEN靶向PD-L1结合位点所位于的PDCD1基因座的第二外显子且能够显著减少PD-1产生。在一些实施例中，T1 TALEN通过使用靶标SEQ ID NO：256来达成此目的，T3v1TALEN通过使用靶标SEQ ID NO：257来达成此目的。
根据其他实施例，使用非常规RVD修饰TALEN以改善其针对靶基因的活性和特异性，例如Gautron中所公开。天然存在的RVD仅涵盖高变氨基酸位置的潜在多样性谱系的一小部分。非常规RVD提供天然RVD的替代物且具有新颖的固有靶向特异性特征，其可用于排除TALEN靶向位点外靶标(基因组内相对于靶序列含有少数错配的序列)。可通过产生并筛选在阵列的既定位置处的两个高变氨基酸位置处含有替代性氨基酸组合的TALEN的集合来鉴别非常规RVD，如Juillerat等人,《科学报导(Scientific Reports)》5,编号8150(2015)中所公开，其以引用的方式并入本文中。然后，可选择能够区分错配位置处存在的核苷酸的非常规RVD，其可防止位点外序列处的TALEN活性，同时仍允许靶标位置的适当处理。然后可使用所选择的非常规RVD置换TALEN中的常规RVD。其中常规RVD已由非常规RVD置换的TALEN的实例包括由Gautron产生的T3v2和T3v3 PD-1TALEN。这些TALEN与使用常规RVD的TALEN相比具有增加的特异性。
根据其他实施例，TALEN可用于引入基因变化以沉默或降低两种基因的表达。例如，可产生两种独立的TALEN以靶向两种不同的基因然后共同使用。由两种TALEN在其各自基因座和潜在脱靶位点处产生的分子事件可由高通量DNA测序表征。这实现了脱靶位点的分析和可能因使用两种TALEN而产生的位点的识别。基于此信息，可选择适当的常规和非常规RVD以工程改造TALEN，其即使在共同使用时也具有增加的特异性和活性。例如，Gautron公开了组合使用T3v4 PD-1和TRAC TALEN以产生保持强效体外抗肿瘤功能的双重基因敲除CAR T细胞。
在一些实施例中，可使用Gautron的方法或本文所述的其他方法基因编辑TIL，然后可通过本文所述的任何程序扩增这些TIL。在一些实施例中，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化珠子或抗体将自肿瘤获得的第一TIL群体活化1至5天，该肿瘤自患者切除；
(b)使用转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸的电穿孔来基因编辑第一TIL群体的至少一部分，获得第二TIL群体，其中，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第二TIL群体的一部分细胞中的至少一种免疫检查点蛋白质的表达；
(c)可选地，培养第二TIL群体；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群体来进行第一扩增，产生第三TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增，第一扩增进行约3至14天以获得第三TIL群体；
(e)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第三TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第四TIL群体，其中，第二扩增进行约7至14天以获得第四TIL群体，第四TIL群体为治疗性TIL群体；
(f)收集自步骤(e)获得的治疗性TIL群体；
(g)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(h)其中，在密闭、无菌系统中进行步骤(a)至(g)中的一个以上。
在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化珠子或抗体将自肿瘤获得的第一TIL群体活化1至5天，该肿瘤自患者切除；
(b)在细胞穿孔(cytoporation)培养基中使用转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸的电穿孔来基因编辑第一TIL群体的至少一部分，获得第二TIL群体，其中，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第二TIL群体的一部分细胞中的至少一种免疫检查点蛋白质的表达；
(c)可选地，培养第二TIL群体；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群体来进行第一扩增，产生第三TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增，第一扩增进行约6至9天以获得第三TIL群体；
(e)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第三TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第四TIL群体，其中，第二扩增进行约9至11天以获得第四TIL群体，第四TIL群体为治疗性TIL群体；
(f)收集自步骤(e)获得的治疗性TIL群体；
(g)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(h)其中，在密闭、无菌系统中进行步骤(a)至(g)中的一个以上。
在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化珠子或抗体将自肿瘤获得的第一TIL群体活化1至5天，该肿瘤自患者切除；
(b)在细胞穿孔培养基中使用转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸的电穿孔来基因编辑第一TIL群体的至少一部分，获得第二TIL群体，其中，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第二TIL群体的一部分细胞中的至少一种免疫检查点蛋白质的表达；
(c)可选地，培养第二TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群体来进行第一扩增，产生第三TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增，第一扩增进行约6至9天以获得第三TIL群体；
(e)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第三TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第四TIL群体，其中，第二扩增进行约9至11天以获得第四TIL群体，第四TIL群体为治疗性TIL群体；
(f)收集自步骤(e)获得的治疗性TIL群体；
(g)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(h)其中，在密闭、无菌系统中进行步骤(a)至(g)中的一个以上。
在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)在细胞穿孔培养基中使用转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸的电穿孔来基因编辑第三TIL群体的至少一部分，获得第四TIL群体，其中，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达；
(e)可选地，培养第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在酶培养基中消化肿瘤组织以产生肿瘤消化物；
(c)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(d)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(e)在细胞穿孔培养基中使用转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸的电穿孔来基因编辑第三TIL群体的至少一部分，获得第四TIL群体，其中，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达；
(f)可选地，培养第四TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；以及
(g)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)通过暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜来基因编辑第三TIL群体，实现将转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸转移至第三TIL群体中，从而获得第四TIL群体，其中，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达；
(e)可选地，培养第四TIL群体；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)通过暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜来基因编辑第三TIL群体，实现将转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸转移至第三TIL群体中，从而获得第四TIL群体，其中，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达；
(e)可选地，培养第四TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。
在一些实施例中，培养第四TIL群体的步骤通过以下来进行：将第四TIL群体在第二细胞培养基中培养约1至7天的第一时间段，在第一时间段结束时，将培养物分流为多个传代培养物，将该多个传代培养物中的每一个在包含IL-2的第三培养基中培养约3至7天的第二时间段，在第二时间段结束时，合并该多个传代培养物以得到经扩增的数目的TIL。
根据其他实施例，TALEN可经特定设计，从而实现能够靶向特定选择的基因的靶细胞内的DSB事件的较高发生率。参见美国专利公开第2013/0315884号。使用此类稀有切割(rare cutting)核酸内切酶可增加实现经转染的细胞中的靶基因的双重失活的几率，实现产生经工程改造的细胞，例如T细胞。此外，可将其他催化结构域与TALEN一起引入以增加突变诱发和增强靶基因失活。成功地使用美国专利公开第2013/0315884号中所描述的TALEN工程改造T细胞以使其适用于免疫疗法。TALEN也可用于使T细胞中的各种免疫检查点基因失活，包括使单一T细胞中的至少两个基因失活。参见美国专利公开第2016/0120906号。此外，TALEN可用于使编码免疫抑制剂和T细胞受体的靶基因失活，如美国专利公开第2018/0021379号中所公开，其以引用的方式并入本文中。此外，TALEN可用于抑制β2-微球蛋白(B2M)和/或II类组织相容性复合体反式活化因子(CIITA)的表达，如美国专利公开第2019/0010514号中所公开，其以引用的方式并入本文中。
可通过TALE方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
靶向PD-1基因的TALE-核酸酶的非限制性实例提供于下表中。在这些实例中，靶基因组序列含有由15-bp间隔子(以小写字母显示)分隔的两个17-碱基对(bp)长序列(称为半靶标，以大写字母显示)。每个半靶标由表11中所列的半TALE-核酸酶的重复序列识别。因此，根据特定实施例，本发明的TALE-核酸酶识别选自如下的靶序列并使其裂解：SEQ IDNO：286和SEQ ID NO：287。TALEN序列和基因编辑方法也描述于Gautron,如上文所述。
表11：TALEN PD-1序列。
在一些实施例中，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化珠子或抗体将自肿瘤获得的第一TIL群体活化1至5天，该肿瘤自患者切除；
(b)基因编辑第一TIL群体的至少一部分，其中，基因编辑包括在细胞穿孔培养基中使用靶向PD-1的转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸的电穿孔获得第二TIL群体，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第二TIL群体的一部分细胞中PD-1的表达；
(c)可选地，培养第二TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群体来进行第一扩增，产生第三TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增，其中，第一扩增进行约6至9天以获得第三TIL群体；
(e)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第三TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第四TIL群体，其中，第二扩增进行约9至11天以获得第四TIL群体，第四TIL群体为治疗性TIL群体；
(f)收集自步骤(e)获得的治疗性TIL群体；
(g)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；和
(h)其中，在密闭、无菌系统中进行步骤(a)至(g)中的一个以上。
在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(b)基因编辑第三TIL群体的至少一部分，其中，基因编辑包括在细胞穿孔培养基中使用靶向PD-1的转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸的电穿孔获得第四TIL群体，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第三TIL群体的一部分细胞中PD-1的表达；
(e)可选地，培养第四TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)通过暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜来基因编辑第三TIL群体的至少一部分，以实现将靶向PD-1的转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸转移至第三TIL群体中，获得第四TIL群体，其中，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第三TIL群体的一部分细胞中PD-1的表达；
(e)可选地，培养第四TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化珠子或抗体将自肿瘤获得的第一TIL群体活化1至5天，该肿瘤自患者切除；
(b)基因编辑第一TIL群体的至少一部分，其中，基因编辑包括在细胞穿孔培养基中使用靶向SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：150的转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸的电穿孔获得第二TIL群体，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第二TIL群体的一部分细胞中PD-1的表达；
(c)可选地，培养第二TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群体来进行第一扩增，产生第三TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增，第一扩增进行约6至9天以获得第三TIL群体；
(e)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第三TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第四TIL群体，其中，第二扩增进行约9至11天以获得第四TIL群体，第四TIL群体为治疗性TIL群体；
(f)收集自步骤(e)获得的治疗性TIL群体；
(g)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(h)其中，在密闭、无菌系统中进行步骤(a)至(g)中的一个以上。
在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)基因编辑第三TIL群体的至少一部分，其中，基因编辑包括在细胞穿孔培养基中使用靶向SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：150的转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸的电穿孔获得第四TIL群体，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第三TIL群体的一部分细胞中PD-1的表达；
(e)可选地，培养第四TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)通过暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜来基因编辑第三TIL群体的至少一部分，以实现将靶向SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：150的转录激活因子样效应物核酸酶编码核酸转移至第三TIL群体中，获得第四TIL群体，其中，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第三TIL群体的一部分细胞中PD-1的表达；
(e)可选地，培养第四TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括以下步骤：
(a)使用CD3和CD28活化珠子或抗体将自肿瘤获得的第一TIL群体活化1至5天，该肿瘤自患者切除；
(b)基因编辑第一TIL群体的至少一部分，其中，基因编辑包括在细胞穿孔培养基中使用SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158或SEQ ID NO：153和SEQ ID NO：154的转录激活因子样效应物核酸酶编码mRNA的电穿孔获得第二TIL群体，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第二TIL群体的一部分细胞中PD-1的表达；
(c)可选地，培养第二TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；
(d)通过在包含IL-2和可选的OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群体来进行第一扩增，产生第三TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增，第一扩增进行约6至9天以获得第三TIL群体；
(e)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第三TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第四TIL群体，其中，第二扩增进行约9至11天以获得第四TIL群体，第四TIL群体为治疗性TIL群体；
(f)收集自步骤(e)获得的治疗性TIL群体；
(g)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(h)其中，在密闭、无菌系统中进行步骤(a)至(g)中的一个以上。
在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供用于制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)基因编辑至少一部分第三TIL群体，其中，基因编辑包括在细胞穿孔培养基中使用SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158或SEQ ID NO：153和SEQ ID NO：154的转录激活因子样效应物核酸酶编码mRNA的电穿孔获得第四TIL群体，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第三TIL群体的一部分细胞中PD-1的表达；
(e)可选地，培养第四TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；以及
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本文提供用于制备经扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法，其包括：
(a)获得和/或接受来自从受试者或患者切除的肿瘤组织的第一TIL群体；
(b)在包含IL-2的第一细胞培养基中培养第一TIL群体约3至9天，产生第二TIL群体；
(c)使用抗CD3和抗CD28珠子或抗体活化第二TIL群体1至7天，产生第三TIL群体；
(d)通过暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜来基因编辑第三TIL群体的至少一部分，实现将SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158或SEQ ID NO：153和SEQ ID NO：154的转录激活因子样效应物核酸酶编码mRNA转移至第三TIL群体中，获得第四TIL群体，其中，基因编辑实现细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制第三TIL群体的一部分细胞中PD-1的表达；
(e)可选地，培养第四TIL群体，其中，在约30至40℃和约5％ CO2下进行培养；和
(f)在包含抗原呈递细胞(APC)、OKT-3和IL-2的第二细胞培养基中培养第四TIL群体约5至15天，产生经扩增的数目的TIL。
在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。在一些实施例中，免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
可通过TALE方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的其他非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
用于通过TALE方法来改变靶基因序列的表达和可根据本发明的实施例使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第8,586,526号中，其以引用的方式并入本文中。这些公开的实例包括使用具有两个以上TALE-重复单元的非天然存在的DNA结合多肽，该TALE-重复单元含有重复RVD、由TALE蛋白的残基制成的N帽多肽和由TALE蛋白的全长C末端区域域的片段制成的C帽多肽。
可用于有效进行TALEN介导的基因整合和失活以及可根据本发明的实施例使用的TALEN设计和设计策略、活性评估、筛选策略和方法的实例描述于Valton等人,《方法(Methods)》,2014,69,151-170中，其以引用的方式并入本文中。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包括递送TALE核酸酶系统，其实现第二TIL群体的多个细胞的细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，调节至少一种免疫检查点蛋白和/或粘附分子的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，转移至少一种基因编辑物的步骤包含递送TALE核酸酶系统，其实现第二TIL群体的多个细胞的细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，调节至少一种免疫检查点蛋白和/或粘附分子的表达。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，以获得第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔步骤，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；。以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包括递送TALE核酸酶系统，其实现第二TIL群体的多个细胞的细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制PD-1和LAG-3的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的细胞因子。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，以获得第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，其中，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，转移至少一种基因编辑物的步骤包括递送TALE核酸酶系统，其实现第二TIL群体的多个细胞的细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制PD-1和LAG-3的表达。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
c.锌指方法
用于将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如，过程2A)的任何实施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中的描述进行，其中，该方法进一步包括通过锌指或锌指核酸酶方法基因编辑TIL的至少一部分。根据特定实施例，在TIL扩增过程期间使用锌指方法可引起细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，可选地引起至少一部分治疗性TIL群体中一种以上的免疫检查点基因的表达的沉默或降低。或者，在TIL扩增过程期间使用锌指方法可引起细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，可选地引起至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达的增强。
单独锌指含有呈保守ββα构造的约30个氨基酸。α-螺旋表面上的几个氨基酸通常以不同的选择性水平接触DNA大沟中的3bp。锌指具有两个蛋白结构域。第一结构域为DNA结合结构域，其包括真核转录因子且含有锌指。第二结构域为核酸酶结构域，其包括FokI限制性内切酶并负责催化裂解DNA。
单独ZFN的DNA结合结构域通常含有介于三个与六个之间的单独锌指重复且各自可识别介于9个与18个之间的碱基对。若锌指结构域对其预期靶位点具有特异性，则甚至一对识别总共18个碱基对的3指ZFN理论上可靶向哺乳动物基因组中的单个基因座。一个产生新的锌指阵列的方法为组合具有已知特异性的较小锌指“模块”。最常见的模块组装过程涉及组合三个分开的可各自识别3个碱基对DNA序列的锌指，以产生可识别9个碱基对靶位点的3指阵列。替代性地，可使用基于选择的方法(例如寡聚池工程改造(oligomerized poolengineering；OPEN))从随机库选择新的锌指阵列，这些随机库考虑介于邻近指之间的背景依赖性相互作用(context-dependent interaction)。工程改造的锌指为可商购的；Sangamo Biosciences(美国加利福尼亚州里奇蒙)已与西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯)合作开发一种用于锌指构建的专用平台
可通过锌指方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过锌指方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、IL-21、NOTCH 1/2胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
通过锌指方法来改变靶基因序列的表达和可根据本发明的实施例使用的系统、方法和组合物的实例描述于以下中：美国专利第6,534,261号、第6,607,882号、第6,746,838号、第6,794,136号、第6,824,978号、第6,866,997号、第6,933,113号、第6,979,539号、第7,013,219号、第7,030,215号、第7,220,719号、第7,241,573号、第7,241,574号、第7,585,849号、第7,595,376号、第6,903,185号和第6,479,626号，其以引用的方式并入本文中。
通过锌指方法来改变靶基因序列的表达和可根据本发明的实施例使用的系统、方法和组合物的其他实例描述于Beane等人,《分子疗法》,2015,23 1380-1390中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3且培养约1至3天来刺激第二TIL群体，以获得第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包括递送锌指核酸酶系统，其实现第二TIL群体的多个细胞的细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达以及，调节至少一种免疫检查点蛋白和/或粘附分子的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3且培养约1至3天来刺激第二TIL群体，以获得第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，转移至少一种基因编辑物的步骤包括递送锌指核酸酶系统，其实现第二TIL群体的多个细胞的细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达以及，调节至少一种免疫检查点蛋白和/或粘附分子的表达。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)对第二TIL群体进行无菌电穿孔，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，电穿孔步骤包括递送锌指核酸酶系统，其实现第二TIL群体的多个细胞的细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制PD-1和LAG-3的表达。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
根据一些实施例，将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法包括：
(a)通过将自患者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从患者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选地包含OKT-3和/或4-1BB激动剂抗体的细胞培养基中培养第一TIL群体约3至11天来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行第一扩增；
(d)通过添加OKT-3并培养约1至3天来刺激第二TIL群体，其中，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)暂时性破坏第二TIL群体的细胞膜，以实现将至少一种基因编辑物转移至第二TIL群体中的多个细胞中；
(f)将第二TIL群体静置约1天；
(g)通过用额外的IL-2、可选的OKT-3抗体、可选的OX40抗体和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，其中，在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行第二扩增，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(g)获得的治疗性TIL群体以得到所收集的TIL群体，其中，自步骤(g)至步骤(h)的转变在不打开系统的情况下进行，所收集的TIL群体为治疗性TIL群体；
(i)将所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(h)至(i)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(j)可选地，使用冷冻保存培养基来冷冻保存所收集的TIL群体，
其中，转移至少一种基因编辑物的步骤包含递送锌指核酸酶系统，其实现第二TIL群体的多个细胞的细胞表面处的至少一种免疫调节组合物的表达，抑制PD-1和LAG-3的表达。在一些实施例中，使用微流体平台暂时性破坏第三TIL群体的细胞膜。在一些实施例中，微流体平台为SQZ无载体微流体平台。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤通过如下进行：培养第三或第四TIL群体或进行第二扩增约1至7天的第一时间段，在第一时间段结束时，将培养物分流为多个传代培养物，将该多个传代培养物中的每一个与额外的IL-2一起培养约3至7天的第二时间段，在第二时间段结束时，合并该多个传代培养物以得到经扩增的数目的TIL或治疗性TIL群体。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约5至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约6至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约7至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约8至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约9至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约10至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约5至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约6至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约7至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约8至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约9至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约5至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约6至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约7至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约8至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约3至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约3至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约3至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约3至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约3至4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约5至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约5至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约5至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约6至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约6至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约7至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第一TIL群体的步骤或第一扩增步骤进行约11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约2至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约3至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约4至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约5至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约6至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约1至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约1至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约1至4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约1至3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约1至2天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约2至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约3至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约4至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约5至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约3至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约3至4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约2至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约2至4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约2至3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约4至5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约1天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约2天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约4天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得活化步骤进行约7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得刺激步骤进行约1天、2天或3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得刺激步骤进行约1至2天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得刺激步骤进行约2至3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得刺激步骤进行约1天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得刺激步骤进行约2天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得刺激步骤进行约3天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约6至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约7至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约8至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约9至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约10至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约11至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约12至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约13至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约14至15天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约6至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约7至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约8至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约9至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约10至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约11至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约12至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约13至14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5至6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约6至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约6至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约6至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约6至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约6至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约6至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约6至7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约7至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约7至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约7至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约7至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约7至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约7至8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约8至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约8至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约8至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约8至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约8至9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约9至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约9至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约9至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约9至10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约10至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约10至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约10至11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约11至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约11至12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约12至13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约5天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约6天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约7天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约8天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约9天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约10天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约11天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约12天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约13天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约14天。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，使得培养第三或第四TIL群体的步骤或第二扩增步骤进行约15天。
V.扩增包括外周血(PBL)和/或骨髓(MIL)的治疗性T细胞的方法的实施例
A.扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法
PBL方法1。在本发明的一些实施例中，PBL使用本文所述的方法扩增。在本发明的一些实施例中，该方法包括获得来自全血的PBMC样本。在一些实施例中，该方法包括通过使用非CD19+级分的负向选择以从PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。在第0天，以1:1的比率(珠子:细胞)将纯T细胞与抗CD3/抗CD28抗体以及3000IU/mL IL-2一起培养。在第4天，将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第7天，再用抗CD3/抗CD28抗体以1:1的比率(珠子:细胞)刺激培养物，将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第14天收集PBL，移除珠子并对PBL进行计数和表型分析。在一些实施例中，该方法包括通过使用非CD19+级分的基于磁珠的负向选择以从PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。
在本发明的一些实施例中，PBL方法1如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻，计算PBMC的数目。使用人泛T细胞分离试剂盒与LS柱(美天旎生物技术)分离T细胞。对经分离的T细胞进行计数并在GRex24孔板中以5×105个细胞/孔接种，并以1:1的比率与(抗CD3/抗CD28)和3000IU/mL IL-2一起在每孔总共8ml CM2培养基中共同培养。在第4天，将各孔中的培养基由CM2更换成具有新鲜的3000IU/mL IL-2的AIM-V。在第7天，收集经扩增的细胞，计数，然后在GRex I0M瓶中以每瓶15×106个细胞，以1:1的比率(珠子:细胞)与和3000IU/mL IL-2一起在总共100ml AIM-V培养基中培养。在第11天，将培养基更换成补充有新鲜的3000IU/mL IL-2的CM-4培养基。在第14天，使用DynaMag磁体(DynaMagTM-15)移除对细胞进行计数。
在本发明的一些实施例中，PBL方法1如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻，计算PBMC的数目。使用人泛T细胞分离试剂盒与LS柱(美天旎生物技术)分离T细胞。对经分离的T细胞进行计数，在GRex24孔板中以5×105个细胞/孔接种，以1:1的比率与(抗CD3/抗CD28)和3000IU/mL IL-2一起在每孔总共8ml CM2培养基中共同培养。在第4天，将各孔中的培养基由CM2更换成具有新鲜的3000IU/mL IL-2的AIM-V。在第7天，收集PBL，计数，然后在新的GRex-24孔板中以1×106个细胞/孔，以1:1的比率(珠子:细胞)与和3000IU/mL IL-2一起在总共8ml AIM-V培养基中再接种。在第11天，将培养基更换成补充有新鲜的3000IU/mL IL-2的CM-4培养基。在第14天，使用DynaMag磁体(DynaMagTM-15)移除并对细胞进行计数。
PBL方法2。在本发明的一些实施例中，PBL使用PBL方法2扩增，该方法包括获得来自全血的PBMC样本。通过在37℃下培养PBMC至少三小时并然后分离非贴壁细胞来富集来自PBMC的T细胞。与PBL方法1类似地扩增非贴壁细胞，即，在第0天，以1:1的比率(珠子:细胞)将非贴壁细胞与抗CD3/抗CD28抗体和3000IU/mL IL-2一起培养。在第4天，将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第7天，再用抗CD3/抗CD28抗体以1:1的、比率(珠子:细胞)刺激培养物，并将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第14天收集PBL，移除珠子并对PBL进行计数和表型分析。
在本发明的一些实施例中，PBL方法2如下进行：在第0天，将经冷冻保存的PMBC样本解冻，将PBMC细胞以每孔6百万个细胞接种于6孔板中的CM-2培养基中，在37℃下培养3小时。3小时后，移除非贴壁细胞(其为PBL)并计算其数目。在GRex24孔板的各孔中，以1×106个细胞/孔，以1:1的珠子:细胞比率将PBL与抗CD3/抗CD28和3000IU/mL IL-2一起在总共7ml CM-2培养基中培养。在第4天，将各孔中的培养基更换成AIM-V培养基和新鲜的3000IU/mL IL-2。在第7天，收集经扩增的细胞，计数，然后在GRex I0M瓶中以每瓶15×106个细胞，以1:1的比率(T细胞:珠子)与和3000IU/mL IL-2一起在总共100mlAIM-V培养基中培养。在第11天，将培养基更换成CM-4培养基且补充新鲜的IL-2(3000IU/mL)。在第14天，使用DynaMagTM磁体(DynaMagTM-15)移除DynaBeads并对细胞进行计数。
在本发明的一些实施例中，PBL方法2如下进行：在第0天，将经冷冻保存的PMBC样本解冻，将PBMC细胞以每孔6百万个细胞接种于6孔板中的CM-2培养基中，在37℃下培养3小时。3小时后，移除非贴壁细胞(其为PBL)并计算其数目。在GRex24孔板的各孔中，以1×106个细胞/孔，以1:1的珠子:细胞比率将PBL与抗CD3/抗CD28和3000IU/mL IL-2一起在总共7ml CM-2培养基中培养。在第4天，将各孔中的培养基更换成AIM-V培养基和新鲜的3000IU/mL IL-2。在第7天，收集经扩增的细胞，计数，然后在新的GRex24孔板中，以1×106个细胞/孔，以1:1的比率(T细胞:珠子)与和3000IU/mL IL-2一起在总共8mlAIM-V培养基中培养。在第11天，将培养基更换成CM-4培养基且补充新鲜的IL-2(3000IU/mL)。在第14天，使用DynaMagTM磁体(DynaMagTM-15)移除DynaBead并对细胞进行计数。
PBL方法3。在本发明的一些实施例中，PBL使用PBL方法3扩增，该方法包括获得来自外周血的PBMC样本。B细胞使用CD19+选择分离，T细胞使用负向选择PBMC样本的非CD19+级分来选择。在第0天，以1:1的比率(珠子:细胞)将T细胞和B细胞与抗CD3/抗CD28抗体和3000IU/mL IL-2共同培养。在第4天，将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第7天，再用抗CD3/抗CD28抗体以1:1的比率(珠子:细胞)刺激培养物，将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第14天收集PBL，移除珠子并对PBL进行计数和表型分析。
在本发明的一些实施例中，PBL方法3如下进行：在第0天，将来源于外周血的冷冻保存的PBMC解冻并计算其数目。使用人CD19 Multisort试剂盒(美天旎生物技术)分选CD19+B细胞。在非CD19+细胞级分中，使用人泛T细胞分离试剂盒和LS柱(美天旎生物技术)纯化T细胞。在Grex24孔板中，在存在约3000IU/ml IL-2的情况下，在约8ml CM2培养基中以不同比率共同培养T细胞(PBL)和B细胞。B细胞:T细胞比率为0.1:1、1:1和10:1。用抗CD3/抗CD28抗体以1:1的比率(珠子:细胞)刺激T细胞/B细胞共同培养物。在第4天，将培养基由CM2更换成AIM-V培养基，将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第7天，收集细胞，进行计数，在新的Grex24孔板中，在AIM-V培养基中以约1.5×105至约4×105个细胞/孔的范围再接种，以1:1的比率(珠子:细胞)用抗CD3/抗CD28抗体和3000IU/ml的额外IL-2刺激。在第14天，使用DynaMagTM磁体(DynaMagTM-15)移除DynaBead，对细胞进行计数。
在一些实施例中，PBMC自全血样本分离。在一些实施例中，使用PBMC样本作为扩增PBL的起始材料。在一些实施例中，样本在扩增过程之前经冷冻保存。在其他实施例中，使用新鲜样本作为扩增PBL的起始材料。在本发明的一些实施例中，使用本领域中已知的方法自PBMC分离T细胞。在一些实施例中，使用人泛T细胞分离试剂盒和LS柱分离T细胞。在本发明的一些实施例中，使用本领域中已知的抗体选择方法(例如CD19负向选择)自PBMC分离T细胞。
在本发明的一些实施例中，该过程进行经约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。在其他实施例中，该过程进行约7天。在其他实施例中，该过程进行约14天。
在本发明的一些实施例中，将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体一起培养。在一些实施例中，任何可用的抗CD3/抗CD28产品均可用于本发明中。在本发明的一些实施例中，所使用的可商购产品为在一些实施例中，将与PBMC以1:1(珠子:细胞)的比率一起培养。在其他实施例中，抗体为与PBMC以1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1(珠子:细胞)的比率一起培养的在本发明的一些实施例中，抗体培养步骤和/或用抗体再刺激细胞的步骤进行约2至约6天、约3至约5天或约4天的时间段。在本发明的一些实施例中，抗体培养步骤进行约2天、3天、4天、5天或6天的时间段。
在一些实施例中，将PBMC样本与IL-2一起培养。在本发明的一些实施例中，用于自PBMC扩增PBL的细胞培养基包含IL-2，该IL-2的浓度选自如下：约100IU/mL、约200IU/mL、约300IU/mL、约400IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约500IU/mL、约600IU/mL、约700IU/mL、约800IU/mL、约900IU/mL、约1,000IU/mL、约1,100IU/mL、约1,200IU/mL、约1,300IU/mL、约1,400IU/mL、约1,500IU/mL、约1,600IU/mL、约1,700IU/mL、约1,800IU/mL、约1,900IU/mL、约2,000IU/mL、约2,100IU/mL、约2,200IU/mL、约2,300IU/mL、约2,400IU/mL、约2,500IU/mL、约2,600IU/mL、约2,700IU/mL、约2,800IU/mL、约2,900IU/mL、约3,000IU/mL、约3,100IU/mL、约3,200IU/mL、约3,300IU/mL、约3,400IU/mL、约3,500IU/mL、约3,600IU/mL、约3,700IU/mL、约3,800IU/mL、约3,900IU/mL、约4,000IU/mL、约4,100IU/mL、约4,200IU/mL、约4,300IU/mL、约4,400IU/mL、约4,500IU/mL、约4,600IU/mL、约4,700IU/mL、约4,800IU/mL、约4,900IU/mL、约5,000IU/mL、约5,100IU/mL、约5,200IU/mL、约5,300IU/mL、约5,400IU/mL、约5,500IU/mL、约5,600IU/mL、约5,700IU/mL、约5,800IU/mL、约5,900IU/mL、约6,000IU/mL、约6,500IU/mL、约7,000IU/mL、约7,500IU/mL、约8,000IU/mL、约8,500IU/mL、约9,000IU/mL、约9,500IU/mL和约10,000IU/mL。
在本发明的一些实施例中，用于扩增过程的PBMC的起始细胞数目为约25,000至约1,000,000、约30,000至约900,000、约35,000至约850,000、约40,000至约800,000、约45,000至约800,000、约50,000至约750,000、约55,000至约700,000、约60,000至约650,000、约65,000至约600,000、约70,000至约550,000，优选约75,000至约500,000、约80,000至约450,000、约85,000至约400,000、约90,000至约350,000、约95,000至约300,000、约100,000至约250,000、约105,000至约200,000或约110,000至约150,000。在本发明的一些实施例中，PBMC的起始细胞数目为约138,000、140,000、145,000或更多。在其他实施例中，PBMC的起始细胞数目为约28,000。在其他实施例中，PBMC的起始细胞数目为约62,000。在其他实施例中，PBMC的起始细胞数目为约338,000。在其他实施例中，PBMC的起始细胞数目为约336,000。
在本发明的一些实施例中，使细胞在GRex24孔板中生长。在本发明的一些实施例中，使用类似的孔板。在一些实施例中，用于扩增的起始材料为约5×105个T细胞/孔。在本发明的一些实施例中，存在1×106个细胞/孔。在本发明的一些实施例中，每孔的细胞数目足以接种该孔并扩增T细胞。
在本发明的一些实施例中，PBL的扩增倍数为约20％至约100％、25％至约95％、30％至约90％、35％至约85％、40％至约80％、45％至约75％、50％至约100％或25％至约75％。在本发明的一些实施例中，扩增倍数为约25％。在本发明的其他实施例中，扩增倍数为约50％。在其他实施例中，扩增倍数为约75％。
在本发明的一些实施例中，可在整个过程中的一或多天将额外的IL-2添加至培养物中。在本发明的一些实施例中，在第4天添加额外的IL-2。在本发明的一些实施例中，在第7天添加额外的IL-2。在本发明的一些实施例中，在第11天添加额外的IL-2。在另一实施例中，在第4天、第7天和/或第11天添加额外的IL-2。在本发明的一些实施例中，可在细胞培养过程中的一或多天更换细胞培养基。在一些实施例中，在过程中的第4天、第7天和/或第11天更换细胞培养基。在本发明的一些实施例中，将PBL与额外的IL-2一起培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的时间段。在本发明的一些实施例中，在每次添加IL-2之后，将PBL培养3天的时间段。
在一些实施例中，在该方法期间，将细胞培养基更换至少一次。在一些实施例中，在添加额外的IL-2的同时更换细胞培养基。在其他实施例中，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中的至少一天更换细胞培养基。在本发明的一些实施例中，在整个方法期间使用的细胞培养基可相同或不同。在本发明的一些实施例中，细胞培养基为CM-2、CM-4或AIM-V。
在本发明的一些实施例中，可在整个14天扩增过程中的一或多天用抗CD3/抗CD28抗体再刺激T细胞。在一些实施例中，在第7天再刺激T细胞。在一些实施例中，使用GRex10M瓶进行再刺激步骤。在本发明的一些实施例中，使用类似的瓶。
在本发明的一些实施例中，使用DynaMagTM磁体移除对细胞计数，并使用如下实例中进一步描述的表型和功能分析来分析细胞。在本发明的一些实施例中，使用本领域中已知的方法将抗体自PBL或MIL分离。在任何前述实施例中，使用基于磁珠进行的TIL、PBL或MIL的选择。
在本发明的一些实施例中，PBMC样本在可有效鉴别非贴壁细胞的所需温度下培养一段时间。在本发明的一些实施例中，培养时间为约3小时。在本发明的一些实施例中，温度为约37℃。然后使用上文所描述的过程扩增非贴壁细胞。
在本发明的一些实施例中，PBMC从已用依鲁替尼或另一种ITK或激酶抑制剂治疗的患者获得，此类ITK和激酶抑制剂如本文中别处所描述。在本发明的一些实施例中，ITK抑制剂为共价且不可逆地结合ITK的共价ITK抑制剂。在本发明的一些实施例中，ITK抑制剂为结合ITK的别构ITK抑制剂。在本发明的一些实施例中，PBMC自如下患者获得：在获得用于与任何前述方法(包括PBL方法1、PBL方法2或PBL方法3)一起使用的PBMC样本之前，该患者已用依鲁替尼或其他ITK抑制剂(包括如本文中别处所描述的ITK抑制剂)治疗。在本发明的一些实施例中，已施用ITK抑制剂治疗至少1次、至少2次或至少3次或更多次。在本发明的一些实施例中，自已用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者扩增的PBL中所包含的LAG3+、PD-1+细胞少于自未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者扩增的PBL。在本发明的一些实施例中，与自未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者扩增的PBL相比，自已用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者扩增的PBL中所包含的IFNγ产量的水平有所增加。在本发明的一些实施例中，与自未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者扩增的PBL，自已用依鲁替尼或其他ITK抑制剂治疗的患者扩增的PBL在较低的效应物:靶细胞比率下包含增加的裂解活性。在本发明的一些实施例中，已用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者与未经治疗的患者相比具有更高的倍数扩增。
在本发明的一些实施例中，该方法包括将ITK抑制剂添加至细胞培养物中的步骤。在一些实施例中，在过程中的第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中的一或多天添加ITK抑制剂。在一些实施例中，在该方法期间的更换细胞培养基之日添加ITK抑制剂。在一些实施例中，在第0天和在更换细胞培养基时添加ITK抑制剂。在一些实施例中，在该方法期间在添加IL-2时添加ITK抑制剂。在一些实施例中，在该方法的第0天、第4天、第7天和可选地第11天添加ITK抑制剂。在本发明的一些实施例中，在该方法的第0天和第7天添加ITK抑制剂。在本发明的一些实施例中，ITK抑制剂是本领域中已知的ITK抑制剂。在本发明的一些实施例中，ITK抑制剂是本文中别处所描述的ITK抑制剂。
在本发明的一些实施例中，该方法中所使用之ITK抑制剂的浓度为约0.1nM至约5μM。在一些实施例中，该方法中所使用的ITK抑制剂的浓度为约0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、1μM、2μM、3μM、4μM或5μM。
在本发明的一些实施例中，该方法包括当PBMC来源于先前未暴露于ITK抑制剂治疗(例如依鲁替尼)的患者时，添加ITK抑制剂的步骤。
在一些实施例中，PBMC样本来自可选地已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施例中，肿瘤样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施例中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者，其已进行治疗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或1年或更长时间。在其他实施例中，PBMC来源于当前进行ITK抑制剂方案(例如伊布替尼(ibrutinib))的患者。
在一些实施例中，PBMC样本来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗且对激酶抑制剂或ITK抑制剂(例如伊布替尼)的治疗而言是难治性的的受试者或患者。
在一些实施例中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗的受试者或患者。在一些实施例中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗并且尚未进行治疗达至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年或更长的受试者或患者。在其他实施例中，PBMC来源于先前暴露于ITK抑制剂但在至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少1年内尚未经治疗的患者。
在本发明的一些实施例中，在第0天，针对CD19+选择细胞并据此分选。在本发明的一些实施例中，使用抗体结合珠子进行选择。在本发明的一些实施例中，在第0天自PBMC分离纯T细胞。在本发明的一些实施例中，在第0天，将CD19+B细胞和纯T细胞与抗CD3/抗CD28抗体共同培养至少4天。在本发明的一些实施例中，在第4天，将IL-2添加至培养物中。在本发明的一些实施例中，在第7天，用抗CD3/抗CD28抗体和额外的IL-2再刺激培养物。在本发明的一些实施例中，在第14天，收集PBL。
在本发明的一些实施例中，对于未用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，10-15ml白膜层(Buffy Coat)将产生约5×109个PBMC，其在扩增过程结束时又将产生约5.5×107个起始细胞材料和约11×109个PBL。在本发明的一些实施例中，约54×106个PBMC将产生约6×105个起始材料和约1.2×108个MIL(约205倍扩增)。
在本发明的一些实施例中，对于用依鲁替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，扩增过程将产生约20×109个PBL。在本发明的一些实施例中，40.3×106个PBMC将产生约4.7×105个起始细胞材料和约1.6×108个PBL(约338倍扩增)。
在本发明的一些实施例中，对于慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者，适用的本发明中的PBL的临床剂量为约0.1×109至约15×109个PBL、约0.1×109至约15×109个PBL、约0.12×109至约12×109个PBL、约0.15×109至约11×109个PBL、约0.2×109至约10×109个PBL、约0.3×109至约9×109个PBL、约0.4×109至约8×109个PBL、约0.5×109至约7×109个PBL、约0.6×109至约6×109个PBL、约0.7×109至约5×109个PBL、约0.8×109至约4×109个PBL、约0.9×109至约3×109个PBL或约1×109至约2×109个PBL。
在任何前述实施例中，PBMC可来源于全血样本，通过单采获得，来源于白膜层，或自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
B.扩增来自骨髓衍生的PBMC的骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)的方法
MIL方法1。在本发明的一些实施例中，描述扩增来自骨髓衍生的PBMC的MIL的方法。在本发明的一些实施例中，该方法进行14天。在一些实施例中，该方法包括获得骨髓PBMC和冷冻保存PBMC。在第0天，以1:1的比率(珠子:细胞)将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体和3000IU/mL IL-2一起培养。在第4天，将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第7天，再用抗CD3/抗CD28抗体以1:1的比率(珠子:细胞)刺激培养物，将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第14天收集MIL，移除珠子，并可选地对MIL进行计数和表型分析。
在本发明的一些实施例中，如下进行MIL方法1：在第0天，将冷冻保存的来源于骨髓的PBMC样本解冻，对PBMC进行计数。在GRex24孔板中，在存在3000IU/ml IL-2的情况下，以5×105个细胞/孔将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体以1:1的比率在每孔约8mlCM-2细胞培养基(包含RPMI-1640、人AB血清、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)、AIM-V培养基)中共同培养。在第4天，将细胞培养基更换成补充有3000IU/ml的额外IL-2之AIM-V。在第7天，对经扩增的MIL进行计数。将1×106个细胞/孔转移至新的GRex24孔板中，在存在3000IU/ml IL-2的情况下，以1:1的比率与抗CD3/抗CD28抗体一起在每孔约8ml AIM-V培养基中培养。在第11天，将细胞培养基自AIM-V更换成CM-4(包含AIM-V培养基、2mM Glutamax和3000IU/mL IL2)。在第14天，使用DynaMag磁体(DynaMagTM15)移除并对MIL进行计数。
MIL方法2。在本发明的一些实施例中，该方法进行7天。在一些实施例中，该方法包括获得来源于骨髓的PBMC和冷冻保存PBMC。在第0天，以3:1比率(珠子:细胞)将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体和3000IU/mL IL-2一起培养。在第7天收集MIL，移除珠子，并可选地对MIL进行计数和表型分析。
在本发明的一些实施例中，如下进行MIL方法2：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻，对PBMC进行计数。在GRex24孔板中，在存在3000IU/ml IL-2的情况下，以5×105个细胞/孔将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体以1:1的比率在每孔约8ml CM-2细胞培养基(包含RPMI-1640、人AB血清、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、硫酸庆大霉素、AIM-V培养基)中共同培养。在第7天，使用DynaMag磁体(DynaMagTM15)移除对MIL进行计数。
MIL方法3。在本发明的一些实施例中，该方法包括获得来自骨髓的PBMC。在第0天，针对CD3+/CD33+/CD20+/CD14+选择PBMC，分选，将非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+细胞级分进行超声处理，将一部分经超声处理的细胞级分添加回所选细胞级分中。将3000IU/ml IL-2添加至细胞培养物中。在第3天，以1:1的比率(珠子:细胞)将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体和3000IU/ml IL-2一起培养。在第4天，将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第7天，再用抗CD3/抗CD28抗体以1:1的比率(珠子:细胞)刺激培养物，将3000IU/mL的额外IL-2添加至培养物中。在第11天，将3000IU/ml IL-2添加至培养物中。在第14天收集MIL，移除珠子，可选地对MIL进行计数和表型分析。
在本发明的一些实施例中，MIL方法3如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻，计算PBMC的数目。将细胞用CD3、CD33、CD20和CD14抗体染色，使用S3e细胞分选器(Bio-Rad)分选。将细胞分选成两种级分：免疫细胞级分(MIL部分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)和AML胚细胞(blast cell)级分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。将数目大致等于来自待接种于Grex24孔板上的免疫细胞级分(或MIL级分)的细胞的数目的来自AML胚细胞级分的细胞悬浮于100μl培养基中，进行超声处理。在此实例中，获取约2.8×104至约3.38×105个来自AML胚细胞级分的细胞，使其悬浮于100μl CM2培养基中，然后超声处理30秒。在Grex24孔板中，将100μl经超声处理的AML胚细胞级分添加至免疫细胞级分中。在存在6000IU/ml IL-2的情况下，免疫细胞以约2.8×104至约3.38×105个细胞/孔的量存在于每孔约8ml CM-2细胞培养基中，与该部分AML胚细胞级分一起培养约3天。在第3天，将抗CD3/抗CD28抗体以1:1的比率添加至各孔中，培养约1天。在第4天，将细胞培养基更换成补充有3000IU/ml的额外IL-2之AIM-V。在第7天，对经扩增的MIL进行计数。将约1.5×105至4×105个细胞/孔转移至新的GRex24孔板中，在存在3000IU/ml IL-2的情况下，以1:1的比率与抗CD3/抗CD28抗体一起在每孔约8ml AIM-V培养基中培养。在第11天，将细胞培养基自AIM-V更换成CM-4(补充有3000IU/ml IL-2)。在第14天，使用DynaMag磁体(DynaMagTM15)移除可选地对MIL进行计数。
在本发明的一些实施例中，PBMC自骨髓获得。在一些实施例中，PBMC通过单采、吸取、针吸活体组织切片或本领域中已知的其他类似方式自骨髓获得。在一些实施例中，PBMC为新鲜的。在其他实施例中，PBMC经冷冻保存。
在本发明的一些实施例中，该方法进行经约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。在其他实施例中，该方法进行约7天。在其他实施例中，该方法进行约14天。
在本发明的一些实施例中，将PBMC与抗CD3/抗CD28抗体一起培养。在一些实施例中，任何可用的抗CD3/抗CD28产品均可用于本发明中。在本发明的一些实施例中，所使用的可商购产品为在一些实施例中，将与PBMC以1:1(珠子:细胞)的比率一起培养。在其他实施例中，抗体为与PBMC以1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1(珠子:细胞)的比率一起培养的在任何前述实施例中，使用基于磁珠进行的免疫细胞级分(或MIL级分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)或AML胚细胞级分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)的选择。在本发明的一些实施例中，抗体培养步骤和/或用抗体再刺激细胞的步骤进行约2至约6天、约3至约5天或约4天的时间段。在本发明的一些实施例中，抗体培养步骤进行约2天、3天、4天、5天或6天的时间段。
在本发明的一些实施例中，来自AML胚细胞级分的细胞的数目与来自免疫细胞级分(或MIL级分)的细胞的数目的比率为约0.1:1至约10:1。在其他实施例中，该比率为约0.1:1至约5:1、约0.1:1至约2:1，或约1:1。在本发明的一些实施例中，可选地破坏AML胚细胞级分以打破细胞聚集。在一些实施例中，使用超声处理、均质化、细胞裂解、涡旋或振动来破坏AML胚细胞级分。在其他实施例中，使用超声处理破坏AML胚细胞级分。在本发明的一些实施例中，使用适合的裂解方法(包括高温裂解、化学裂解(例如有机醇)、酶裂解和本领域中已知的其他细胞裂解方法)裂解非CD3+、非CD33+、非CD20+、非CD14+细胞级分(AML胚细胞级分)。
在本发明的一些实施例中，使来自AML胚细胞级分的细胞以每100μL约0.2×105至约2×105个细胞的浓度悬浮，与免疫细胞级分一起添加至细胞培养物中。在其他实施例中，该浓度为每100μL约0.5×105至约2×105个细胞、每100μL约0.7×105至约2×105个细胞、每100μL约1×105至约2×105个细胞或每100μL约1.5×105至约2×105个细胞。
在一些实施例中，将PBMC样本与IL-2一起培养。在本发明的一些实施例中，用于扩增MIL的细胞培养基包含IL-2，该IL-2的浓度选自如下：约100IU/mL、约200IU/mL、约300IU/mL、约400IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约100IU/mL、约500IU/mL、约600IU/mL、约700IU/mL、约800IU/mL、约900IU/mL、约1,000IU/mL、约1,100IU/mL、约1,200IU/mL、约1,300IU/mL、约1,400IU/mL、约1,500IU/mL、约1,600IU/mL、约1,700IU/mL、约1,800IU/mL、约1,900IU/mL、约2,000IU/mL、约2,100IU/mL、约2,200IU/mL、约2,300IU/mL、约2,400IU/mL、约2,500IU/mL、约2,600IU/mL、约2,700IU/mL、约2,800IU/mL、约2,900IU/mL、约3,000IU/mL、约3,100IU/mL、约3,200IU/mL、约3,300IU/mL、约3,400IU/mL、约3,500IU/mL、约3,600IU/mL、约3,700IU/mL、约3,800IU/mL、约3,900IU/mL、约4,000IU/mL、约4,100IU/mL、约4,200IU/mL、约4,300IU/mL、约4,400IU/mL、约4,500IU/mL、约4,600IU/mL、约4,700IU/mL、约4,800IU/mL、约4,900IU/mL、约5,000IU/mL、约5,100IU/mL、约5,200IU/mL、约5,300IU/mL、约5,400IU/mL、约5,500IU/mL、约5,600IU/mL、约5,700IU/mL、约5,800IU/mL、约5,900IU/mL、约6,000IU/mL、约6,500IU/mL、约7,000IU/mL、约7,500IU/mL、约8,000IU/mL、约8,500IU/mL、约9,000IU/mL、约9,500IU/mL和约10,000IU/mL。
在本发明的一些实施例中，可在整个方法中的一或多天将额外IL-2添加至培养物中。在本发明的一些实施例中，在第4天添加额外的IL-2。在本发明的一些实施例中，在第7天添加额外的IL-2。在本发明的一些实施例中，在第11天添加额外的IL-2。在其他实施例中，在第4天、第7天和/或第11天添加额外的IL-2。在本发明的一些实施例中，将MIL与额外的IL-2一起培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的时间段。在本发明的一些实施例中，在每次添加IL-2之后，将MIL培养3天的时间段。
在一些实施例中，在该方法期间，将细胞培养基更换至少一次。在一些实施例中，在添加额外的IL-2的同时更换细胞培养基。在其他实施例中，在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天中的至少一天更换细胞培养基。在本发明的一些实施例中，在整个方法期间使用的细胞培养基可以相同或不同。在本发明的一些实施例中，细胞培养基为CM-2、CM-4或AIM-V。在本发明的一些实施例中，在第11天的细胞培养基交换步骤是可选的。在本发明的一些实施例中，用于扩增过程的PBMC的起始细胞数目为约25,000至约1,000,000、约30,000至约900,000、约35,000至约850,000、约40,000至约800,000、约45,000至约800,000、约50,000至约750,000、约55,000至约700,000、约60,000至约650,000、约65,000至约600,000、约70,000至约550,000，优选约75,000至约500,000、约80,000至约450,000、约85,000至约400,000、约90,000至约350,000、约95,000至约300,000、约100,000至约250,000、约105,000至约200,000或约110,000至约150,000。在本发明的一些实施例中，PBMC的起始细胞数目为约138,000、140,000、145,000或更多。在其他实施例中，PBMC的起始细胞数目为约28,000。在其他实施例中，PBMC的起始细胞数目为约62,000。在其他实施例中，PBMC的起始细胞数目为约338,000。在其他实施例中，PBMC的起始细胞数目为约336,000。
在本发明的一些实施例中，MIL的扩增倍数为约20％至约100％、25％至约95％、30％至约90％、35％至约85％、40％至约80％、45％至约75％、50％至约100％或25％至约75％。在本发明的一些实施例中，扩增倍数为约25％。在本发明的其他实施例中，扩增倍数为约50％。在其他实施例中，扩增倍数为约75％。
在本发明的一些实施例中，MIL自10-50ml骨髓抽吸物扩增。在本发明的一些实施例中，自患者获得10ml骨髓抽吸物。在其他实施例中，自患者获得20ml骨髓抽吸物。在其他实施例中，自患者获得30ml骨髓抽吸物。在其他实施例中，自患者获得40ml骨髓抽吸物。在其他实施例中，自患者获得50ml骨髓抽吸物。
在本发明的一些实施例中，由约10-50ml骨髓抽吸物产生的PBMC的数目为约5×107至约10×107个PBMC。在其他实施例中，所产生的PMBC的数目为约7×107个PBMC。
在本发明的一些实施例中，约5×107至约10×107个PBMC产生约0.5×106至约1.5×106个扩增起始细胞材料。在本发明的一些实施例中，产生约1×106个扩增起始细胞材料。
在本发明的一些实施例中，在扩增周期结束时所收集的MIL的总数为约0.01×109至约1×109、约0.05×109至约0.9×109、约0.1×109至约0.85×109、约0.15×109至约0.7×109、约0.2×109至约0.65×109、约0.25×109至约0.6×109、约0.3×109至约0.55×109、约0.35×109至约0.5×109或约0.4×109至约0.45×109。
在本发明的一些实施例中，来源于骨髓抽吸物之12×106个PBMC产生约1.4×105个起始细胞材料，其在扩增过程结束时产生约1.1×107个MIL。
在本发明的一些实施例中，与使用MIL方法1或MIL方法2扩增的MIL相比，使用上文所描述的MIL方法3自骨髓PBMC扩增的MIL包含较高比例的CD8+细胞以及较少数目的LAG3+和PD1+细胞。在本发明的一些实施例中，与使用MIL方法1或MIL方法2扩增的PBL相比，使用上文所描述的MIL方法3自血液PBMC扩增的PBL包含较高比例的CD8+细胞和增加的IFNγ产量。
在本发明的一些实施例中，适用于急性骨髓性白血病(AML)患者的MIL的临床剂量在约4×108至约2.5×109个MIL的范围内。在其他实施例中，本发明的药物组合物中所提供的MIL的数目为9.5×108个MIL。在其他实施例中，本发明的药物组合物中所提供的MIL的数目为4.1×108。在其他实施例中，本发明的药物组合物中所提供的MIL的数目为2.2×109。
在任何前述实施例中，PBMC可来源于全血样本、骨髓、通过单采获得，来源于白膜层，或自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
VI.Gen 2TIL制造过程
图1和图2中描绘了称为Gen 2(也被称为过程2A)的示例性TIL程序系列，其含有这些特征中的一些。Gen 2的实施例显示于图2中。
如本文所述，本发明可包括与再刺激经冷冻保存的TIL以在移植至患者中之前提高其代谢活性并因此提高相对健康状况相关的步骤，以及测试该代谢健康状况的方法。如本文大体上概述，TIL通常自患者样本获得并在移植至患者中之前经操作以扩增其数目。在一些实施例中，TIL可选地经基因操作，如下文所述。
在一些实施例中，TIL可经冷冻保存。在解冻后，其也可在输注至患者中之前经再刺激以增加其代谢。
在一些实施例中，将第一扩增(包括称为预REP的过程以及图1中所示的作为步骤A的过程)缩短为3至14天，并将第二扩增(包括称为REP的过程以及图1中所示的作为步骤B的过程)缩短为7至14天，如下文以及实例和图示中所详细论述。在一些实施例中，将第一扩增(例如图1中步骤B描述的扩增)缩短为11天，将第二扩增(例如图1中步骤D中描述的扩增)缩短为11天。在一些实施例中，将第一扩增和第二扩增的组合(例如，在图1中描述为步骤B和步骤D的扩增)缩短为22天，如下文以及实例和图示中所详细论述。
下文中的“步骤”标示A、B、C等参考图1和参考本文所述的某些实施例。下文和图1中的步骤的顺序为示例性的，本申请和本文中所公开的方法涵盖步骤的任何组合或顺序，以及额外步骤、步骤的重复和/或步骤的省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样本
一般而言，TIL最初自患者肿瘤样本获得，随后扩增为用于如本文所述的进一步操作、可选地如本文所概述的再刺激、冷冻保存以及可选地评估作为TIL健康状况的指标的表型和代谢参数的更大的群体。
患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，通常通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式获得。在一些实施例中，使用多病灶取样。在一些实施例中，手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式包括多病灶取样(即，自患者中的一个以上肿瘤位点和/或位置以及在相同位置或紧密相邻的一个以上肿瘤处获得样本)。一般而言，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可为液体肿瘤，例如获自造血系统恶性肿瘤的肿瘤。实体肿瘤可以为肺组织。在一些实施例中，适用的TIL获自非小细胞肺癌(NSCLC)。实体肿瘤可以为皮肤组织。在一些实施例中，适用的TIL获自黑色素瘤。
一旦获得，肿瘤样本通常使用锐器分割破碎成1mm3至约8mm3之间的小块，其中约2至3mm3为尤其适用的。在一些实施例中，使用酶肿瘤消化物从这些碎片培养TIL。此类肿瘤消化物可通过在酶培养基(例如罗斯威尔公园癌症研究所(Roswell Park MemorialInstitute；RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素(gentamicine)、30单位/mLDNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中培养，然后进行机械解离(例如使用组织解离器)来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤放置于酶培养基中，机械解离肿瘤约1分钟，随后在37℃下在5％ CO2中培养30分钟，随后在前述条件下重复机械解离和培养循环，直至仅存在小组织块。在此过程结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用FICOLL支化亲水性多糖的密度梯度分离以移除这些细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开第2012/0244133A1号中所描述的方法，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。任何前述方法可用于本文所述的任何实施例中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
肿瘤解离酶混合物可包含一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何混合或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶(hyaluronidase)、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰蛋白酶(trypsin)、酪蛋白酶(caseinase)、弹性蛋白酶(elastase)、木瓜酶(papain)、XIV型蛋白酶(链蛋白酶(pronase))、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，以及它们的任何组合。
在一些实施例中，解离酶由冻干酶复原(reconstitute)。在一些实施例中，冻干酶在一定量的无菌缓冲液(例如HBSS)中复原。
在一些情况下，胶原蛋白酶(例如无动物源1型胶原蛋白酶)在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度可为每小瓶2892PZ U。在一些实施例中，胶原蛋白酶在5mL至15mL缓冲液中复原。在一些实施例中，在复原后，胶原蛋白酶储备液的范围为约100PZU/mL至约400PZ U/mL，例如，约100PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL至约350PZ U/mL、约100PZ U/mL至约300PZ U/mL、约150PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZU/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230 PZ U/mL、约240PZU/mL、约250PZU/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZ U/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施例中，中性蛋白酶在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度可为每小瓶175DMC U。在一些实施例中，在复原后，中性蛋白酶储备液的范围为100DMC/mL至约400DMC/mL，例如，约100DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL至约350DMC/mL、约100DMC/mL至约300DMC/mL、约150DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施例中，DNA酶I在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施例中，在复原后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施例中，酶的储备液是可变的且可能需要确定浓度。在一些实施例中，可检验冻干储备液的浓度。在一些实施例中，添加至消化混合物中的酶的最终量基于所确定的储备液浓度调节。
在一些实施例中，酶混合物包含约4.7mL无菌HBSS中的约10.2μl中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μL胶原蛋白酶(1.2PZ/mL)和250μl DNA酶I(200U/mL)。
如上文所指出，在一些实施例中，TIL来源于实体肿瘤。在一些实施例中，实体肿瘤未经破碎。在一些实施例中，实体肿瘤未经破碎且以全肿瘤进行酶消化。在一些实施例中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化。在一些实施例中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％ CO2下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％ CO2、旋转下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在恒定旋转下消化过夜。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％ CO2、恒定旋转下消化过夜。在一些实施例中，完整肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施例中，在无菌缓冲液中用冻干酶复原肿瘤。在一些实施例中，缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施例中，酶混合物包含胶原蛋白酶。在一些实施例中，胶原蛋白酶为胶原蛋白酶IV。在一些实施例中，胶原蛋白酶的工作储备液为100mg/mL的10X工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施例中，DNA酶的工作储备液为10,000IU/mL的10X工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含玻尿酸酶。在一些实施例中，玻尿酸酶的工作储备液为10mg/mL的10X工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含10mg/mL的胶原蛋白酶、1000IU/mL的DNA酶和1mg/mL的玻尿酸酶。
在一些实施例中，酶混合物包含10mg/mL的胶原蛋白酶、500IU/mL的DNA酶和1mg/mL的玻尿酸酶。
一般而言，经收集的细胞悬浮液被称为“初代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施例中，破碎包括物理破碎，包括例如分割以及消化。在一些实施例中，破碎为物理破碎。在一些实施例中，破碎为分割。在一些实施例中，破碎是通过消化。在一些实施例中，TIL最初可自酶肿瘤消化物和肿瘤碎片培养，这些酶肿瘤消化物和肿瘤碎片由消化或破碎获自患者的肿瘤样本获得。
在一些实施例中，当肿瘤为实体肿瘤时，肿瘤在例如步骤A(如图1中所提供)中获得肿瘤样本之后，经历物理破碎。在一些实施例中，破碎进行在冷冻保存之前。在一些实施例中，破碎进行在冷冻保存之后。在一些实施例中，破碎在获得肿瘤之后并在不进行任何冷冻保存的情况下进行。在一些实施例中，将肿瘤破碎，将10、20、30、40个以上碎片或碎块置于各容器中以进行第一扩增。在一些实施例中，将肿瘤破碎，将30或40个碎片或碎块置于各容器中以进行第一扩增。在一些实施例中，将肿瘤破碎，将40个碎片或碎块置于各容器中以进行第一扩增。在一些实施例中，多个碎片包含约4个至约50个碎片，各碎片的体积为约27mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约30个至约60个碎片，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约50个碎片，其总体积为约1350mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约50个碎片，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施例中，多个碎片包含约4个碎片。
在一些实施例中，TIL获自肿瘤碎片。在一些实施例中，肿瘤碎片通过锐器分割获得。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与8mm3之间。在一些实施例中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施例中，肿瘤为1-4mm×1-4mm×1-4mm。在一些实施例中，肿瘤为1mm×1mm×1mm。在一些实施例中，肿瘤为2mm×2mm×2mm。在一些实施例中，肿瘤为3mm×3mm×3mm。在一些实施例中，肿瘤为4mm×4mm×4mm。
在一些实施例中，肿瘤经切除以使各块上出血性、坏死性和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经切除以使各块上出血性组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经切除以使各块上的坏死性组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经切除以使各块上之脂肪组织的量减至最小。
在一些实施例中，进行肿瘤破碎以维持肿瘤内部结构。在一些实施例中，在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行肿瘤破碎。在一些实施例中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施例中，通过在酶培养基(例如(但不限于)RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离约1分钟。随后可将溶液在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟，并然后再次机械破坏约1分钟。在37℃下在5％ CO2中再培养30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏约1分钟。在一些实施例中，如果在第三次机械破坏后若大块组织仍存在，则向样本施加1或2次另外的机械解离，不论是否再在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟。在一些实施例中，在最终培养结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可使用Ficoll进行密度梯度分离以移除这些细胞。
在一些实施例中，将第一扩增步骤之前收集的细胞悬浮液称为“初代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施例中，细胞可以可选地在样本收集之后冷冻并在进入步骤B(其在下文进一步详细描述以及图1和图8中示例)中所描述的扩增之前冷冻储存。
1.胸腔积液T细胞和TIL
在一些实施例中，样本为胸膜液样本。在一些实施例中，根据本文所述的过程的用于扩增的T细胞或TIL的来源为胸膜液样本。在一些实施例中，样本为源于胸腔积液的样本。在一些实施例中，根据本文所述的过程的用于扩增的T细胞或TIL的来源为来源于胸腔积液的样本。参见例如美国专利公开号US2014/0295426中所描述的方法，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，可以采用疑似和/或含有TIL的任何胸膜液或胸腔积液。此类样本可来源于原发性或转移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。在一些实施例中，样本可衍生自来源于另一器官(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺)的继发转移性癌细胞。在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜渗出物(pleural exudate)。在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜溢出物(pleural transudate)。其他生物样本可包括含有TIL的其他浆液，包括例如来自腹部的腹水液或胰囊肿液。腹水液和胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部和肺两者在相同的恶性肿瘤事件中于胸腔和腹腔中均具有间皮细胞系和流体形式，在一些实施例中，此类流体含有TIL。在所公开的方法利用胸膜液的一些实施例中，可使用含有TIL的腹水或其他囊肿液进行相同的方法以得到类似结果。
在一些实施例中，胸膜液呈未经处理的形式直接自患者移除。在一些实施例中，在进一步处理步骤之前，将未经处理的胸膜液放置于标准血液收集管(例如EDTA或肝素管)中。在一些实施例中，在进一步处理步骤之前，将未经处理的胸膜液放置于标准管(Veridex)中。在一些实施例中，在自患者收集之后立即将样本置于CellSave管中，以避免活TIL的数目减少。若保留在未经处理的胸膜液中，即使在4℃下，活TIL的数目可能在24小时内显著降低。在一些实施例中，样本在自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。在一些实施例中，样本在4℃下自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。
在一些实施例中，可以稀释来自所选受试者的胸膜液样本。在一些实施例中，稀释度为1:10胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:9胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:8胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:5胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:2胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:1胸膜液比稀释剂。在一些实施例中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施例中，样本在自患者收集和稀释之后立即置于CellSave管中，以避免活TIL减少，若保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL可能在24至48小时内显著减少。在一些实施例中，胸膜液样本在自患者移除且稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。在一些实施例中，胸膜液样本在自患者移除并在4℃下稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。
在另外其他实施例中，在进一步处理步骤之前，通过常规方式浓缩胸膜液样本。在一些实施例中，在胸膜液必须冷冻保存以便运送至进行该方法的实验室或用于后续分析(例如，在收集后24至48小时之后)的情形下，对胸膜液进行预处理是优选的。在一些实施例中，通过在将胸膜液样本自受试者中取出后将其离心并将离心液或沉淀物再悬浮于缓冲液中来制备胸膜液样本。在一些实施例中，对胸膜液样本进行多次离心和再悬浮，随后将其冷冻保存以用于运输或以后的分析和/或处理。
在一些实施例中，在进一步的处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样本。在一些实施例中，在进一步处理中使用的胸膜液样本通过将流体通过含有已知且基本上均匀的孔径的过滤器过滤而制备，该孔径允许胸膜液通过膜但保留肿瘤细胞。在一些实施例中，膜中的孔的直径可为至少4μM。在其他实施例中，孔径可为5μM以上，并在其他实施例中，可为6μM、7μM、8μM、9μM或10μM中的任一者。过滤之后，可将被膜保留的细胞(包括TIL)自膜上冲出至适合的生理学上可接受的缓冲液中。然后可将以此方式浓缩的细胞(包括TIL)用于该方法的进一步处理步骤中。
在一些实施例中，使胸膜液样本(包括例如未经处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或再悬浮的细胞沉淀物与裂解试剂接触，该裂解试剂差异性地裂解样本中存在的无核红细胞。在一些实施例中，在胸膜液含有大量RBC的情形下，此步骤在进一步的处理步骤之前进行。适合的裂解试剂包括单一裂解试剂或裂解试剂和淬灭试剂，或裂解试剂、淬灭试剂和固定试剂。适合的裂解系统为市售的，包括BD Pharm LyseTM系统(碧迪医疗公司(BectonDickenson))。其他裂解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(碧迪医疗公司)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Inc.))或氯化铵系统。在一些实施例中，裂解试剂可随主要需求而变化，主要需求为红细胞的有效裂解和TIL的保守性和胸膜液中TIL的表型特性。除使用单一试剂用于裂解以外，适用于本文所述的方法的裂解系统可包括第二试剂，例如在该方法的剩余步骤期间淬灭或延迟裂解试剂的作用的第二试剂，例如StabilyseTM试剂(贝克曼库尔特公司)。视裂解试剂的选择或该方法的优选实施而定，也可采用常规固定试剂。
在一些实施例中，在约-140℃的温度下冷冻保存如上文所描述的未经处理、稀释或多次离心或处理的胸膜液样本，随后如本文所提供进行进一步处理和/或扩增。
B.步骤B：第一扩增
在一些实施例中，本发明的方法提供获得年轻TIL，其与更老TIL(即，在向受试者/患者施用之前进一步经历更多轮复制的TIL)相比，在向受试者/患者施用时能够实现增加的复制循环且因此可提供额外治疗益处。年轻TIL的特征已描述于文献中，例如Donia等人，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》2012,75,157-167；Dudley等人，《临床癌症研究》2010,16,6122-6131；Huang等人，《免疫学杂志》2005,28,258-267；Besser等人，《临床癌症研究》2013,19,OF1-OF9；Besser等人，《免疫学杂志》2009,32:415-423；Robbins等人，《免疫学杂志》2004,173,7125-7130；Shen等人，《免疫学杂志》2007,30,123-129；Zhou等人，《免疫学杂志》2005,28,53-62；以及Tran等人，《免疫学杂志》2008,31,742-751，其各自以引用的方式并入本文中。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供一种用于产生展现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施例中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文中提供的方法以外的其他方法制备的TIL，通过本发明的方法获得的TIL显示出增加到T细胞贮库多样性，其他方法包括例如除图1中实施的方法以外的方法。在一些实施例中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用如图5和/或图6中示例的称为过程1C的方法制备的TIL，通过本发明的方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，在第一扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，增加多样性为增加免疫球蛋白的多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施例中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施例中，多样性存在于选自α、β、γ和δ受体的T细胞受体中的一者中。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施例中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在例如图1的步骤A中所描述的肿瘤碎片的解剖或消化之后，所得细胞在含有IL-2的血清中在相对于肿瘤和其他细胞有利于TIL生长的条件下培养。在一些实施例中，在2mL孔中在包含具有6000IU/mL IL-2的灭活人AB血清的培养基中孵育肿瘤消化物。将此初代细胞群体培养数天的时间段，通常3至14天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养7至14天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养10至14天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养约11天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。
在一些实施例中，TIL的扩增可使用如下文和本文所述的初始主体TIL扩增步骤(例如图1的步骤B中所描述的那些步骤，其可包括称为预REP的过程)进行，然后进行如下文步骤D和本文所述的第二扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后进行可选的冷冻保存，然后进行如下文和本文所述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可以可选地针对如本文所述的表型特征和代谢参数进行表征。
在TIL培养在24孔板中起始的实施例中，例如，使用Costar 24孔细胞培养簇，平底(Corning Incorporated，Corning，NY，各孔可接种有在具有IL-2(6000IU/mL；ChironCorp.,Emeryville,CA)的2mL完全培养基(CM)中的1×106个肿瘤消化物细胞或一个肿瘤碎片。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。
在一些实施例中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施例中，步骤B的CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI1640组成。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气培养瓶(例如，G-REX-10；Wilson WolfManufacturing,New Brighton,MN)中起始培养的实施例中，各培养瓶装载有含有10-40×106个活肿瘤消化物细胞或5至30个肿瘤碎片和IL-2的10-40mL CM。G-REX-10和24孔板均在湿气培养箱中在37℃、5％ CO2下培养，在培养起始后5天，移除一半培养基，更换为新鲜的CM和IL-2，在之后第5天，每2至3天更换一半培养基。
在一些实施例中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基之批次间变化所致的实验变化。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，基础细胞培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)。
在一些实施例中，血清补充剂或血清替代物包括(但不限于)以下中的种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上抗生素和一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，该常规生长培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，以无血清或确定成分培养基的总体积计，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1LCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇于培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(也即，)。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约2mM的谷氨酰胺(也即，)。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，以引用的方式并入本文中的国际PCT公开第WO/1998/030679号中所描述的确定成分培养基可用于本发明。在该公开中，描述无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素和一种以上抗生素。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白取代物和一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施例中，基础细胞培养基选自如下：达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，确定成分培养基中甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5至500mg/L，硫胺素的浓度为约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1至200mg/L，铁饱和运铁蛋白的浓度为约1至50mg/L，胰岛素的浓度为约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001至0.0001mg/L，且白蛋白(例如I)的浓度为约5000至50,000mg/L。
在一些实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以下表12中的标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表12中的标题“1X培养基的优选实施例”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施例中，确定成分培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在这些实施例的一些中，无血清补充剂包含以下表12中的类型和标题“补充剂的优选实施例”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
表12：非微量元素部分成分的浓度
在一些实施例中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施例中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施例中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施例中，Smith等人，《临床与转化免疫学(Clin Transl Immunology)》4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的确定成分培养基适用于本发明。简言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％ CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在制备肿瘤碎片之后，所得细胞(即，碎片)在含有IL-2的血清中，在相对于肿瘤和其他细胞有利于TIL生长的条件下培养。在一些实施例中，将肿瘤消化物在包含灭活人AB血清(或在一些情况下，如本文所述，在存在APC细胞群体的情况下)和6000IU/mL IL-2的培养基中在2mL孔中孵育。将此初代细胞群体培养数天的时间段，通常10至14天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，生长培养基在第一扩增期间包含IL-2或其变体。在一些实施例中，IL为重组人IL-2(rhIL-2)。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20至30×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，IL-2储备液具有4至8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备液具有5至7×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备溶液如实例5中所描述的制备。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mLIL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或约8000IU/mL的IL-2。
在一些实施例中，第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mLIL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约400IU/mLIL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施例中，第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mLIL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mLIL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，第一扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施例中，细胞培养基包含抗CD3激动剂抗体，例如OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间、和50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施例中，OKT-3抗体为莫罗单抗。参见例如表1。
在一些实施例中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂在细胞培养基中。在一些实施例中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施例中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，其中，一种以上TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施例中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施例中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施例中，CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气培养瓶(例如，G-REX10；Wilson Wolf Manufacturing,New Brighton,MN)中开始培养的实施例中，各培养瓶装载有含10至40×106个活肿瘤消化物细胞或5至30个肿瘤碎片的具有IL-2的10至40mL CM。G-REX10和24孔板均在湿气培养箱中在37℃、5％CO2下培养，在培养开始后5天，移除一半培养基，更换为新鲜的CM和IL-2，在之后第5天，每2至3天更换一半培养基。在一些实施例中，CM为实例中所描述的CM1，参见实例1。在一些实施例中，第一扩增发生在初始细胞培养基或第一细胞培养基中。在一些实施例中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2。
在一些实施例中，第一扩增(包括例如描述于图1的步骤B中的那些过程的过程，其可包括有时被称为预REP的那些过程)缩短至3至14天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，第一扩增(包括例如图1的步骤B中所描述的nx过程，其可包括有时被称为预REP的那些过程)缩短至7至14天，如实例中所述以及图4和图5中所示，以及包括例如图1的步骤B中所描述的扩增。在一些实施例中，步骤B的第一扩增缩短为10至14天。在一些实施例中，第一扩增缩短至11天，例如，如图1的步骤B中所描述的扩增中所述。
在一些实施例中，第一TIL扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行1天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行3天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行4天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行5天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行6天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行7天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行8天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行9天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行10天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行11天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行12天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行13天至14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行14天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行1天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行2天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行3天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行4天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行5天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行6天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行7天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行8天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行9天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行10天至11天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行11天。
在一些实施例中，使用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第一扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及它们的任何组合可包括在第一扩增期间，包括例如在根据图1以及本文所述的步骤B过程期间。在一些实施例中，使用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第一扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-15和IL-21以及它们的任何组合可包括在根据图1以及如本文所述的步骤B过程期间。
在一些实施例中，如实例和图示中所述，第一扩增(包括被称为预REP的过程；例如，根据图1的步骤B)过程缩短至3至14天。在一些实施例中，步骤B的第一扩增缩短至7至14天。在一些实施例中，步骤B的第一扩增缩短至10至14天。在一些实施例中，第一扩增缩短至11天。
在一些实施例中，在密闭系统生物反应器中进行第一扩增，例如根据图1的步骤B。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，使用单一生物反应器。在一些实施例中，所使用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施例中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
1.细胞因子和其他添加剂
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子的组合来进行TIL的快速扩增和/或第二扩增也是可能的，如美国专利申请公开第US2017/0107490 A1号中所描述，使用IL-2、IL-15和IL-21的组合中的两种以上，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21和IL-2，或IL-15和IL-21，后者在许多实施例中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基中添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文中别处所描述。在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文中别处所描述。在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基中添加OX-40激动剂，如本文中别处所描述。在其他实施例中，可在步骤B期间在培养基中使用添加剂，例如过氧物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如美国专利申请公开第US2019/0307796 A1号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
C.步骤C：第一扩增至第二扩增的转变
在一些情况下，自第一扩增获得的主体TIL群体，包括例如自例如图1中所示的步骤B获得的TIL群体，可使用下文所述的方案立即冷冻保存。或者，获自第一扩增的TIL群体(称为第二TIL群体)可经历第二扩增(其可包括有时称为REP的扩增)，然后如下文所述冷冻保存。类似地，在经基因修饰的TIL将用于疗法的情况下，第一TIL群体(有时称为主体TIL群体)或第二TIL群体(其在一些实施例中可包括称为REP TIL群体的群体)可在扩增之前或在第一扩增之后和在第二扩增之前进行基因修饰以用于适合的治疗。
在一些实施例中，储存获自第一扩增(例如，来自如图1中所指示的步骤B)的TIL直至进行用于选择的表型分析。在一些实施例中，获自第一扩增(例如，来自如图1中所指示的步骤B)的TIL未经储存且直接继续进行至第二扩增。在一些实施例中，获自第一扩增的TIL在第一扩增之后并在第二扩增之前未经冷冻保存。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后约3天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后约4天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后约4天至约10天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后约7天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后约14天进行。
在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后1天至14天进行。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后3天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后4天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后5天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后6天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后7天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后8天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后9天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后10天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后11天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后12天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后13天至14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后14天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后1天至11天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后2天至11天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后3天至11天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后4天至11天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后5天至11天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后6天至11天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后7天至11天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后8天至11天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后9天至11天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后10天至11天进行。在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变在当破碎进行后11天进行。
在一些实施例中，TIL在第一扩增之后并在快速第二扩增之前未经储存，TIL直接进行第二扩增(例如在一些实施例中，在如图1中所示的步骤B至步骤D的转变期间未进行储存)。在一些实施例中，转变在如本文所述的密闭系统中进行。在一些实施例中，来自第一扩增的TIL(第二TIL群体)直接进行第二扩增而无转变期。
在一些实施例中，第一扩增至第二扩增的转变(例如根据图1的步骤C)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用单一生物反应器。在一些实施例中，所使用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100生物反应器。在一些实施例中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
D.步骤D：第二扩增
在一些实施例中，TIL细胞群体在收集和初始批量处理之后的数目扩增，例如在步骤A和步骤B以及称为步骤C的转变之后，如图1中所指示。此进一步扩增在本文中称为第二扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(REP)的扩增过程；以及如图1的步骤D中所指示的过程。第二扩增通常使用包含多种组分(包括饲养细胞、细胞因子来源和抗CD3抗体)的培养基在透气容器中完成。
在一些实施例中，第二扩增或第二TIL扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图1的步骤D中所指示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL培养瓶或容器进行。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约7天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约8天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约9天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约10天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约11天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约12天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约13天至约14天。在一些实施例中，第二TIL扩增可进行约14天。
在一些实施例中，第二扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图1的步骤D中所指示的过程)进行。例如，TIL可在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/mL OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本市的美天旎生物技术公司)或UHCT-1(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市的BioLegend)。TIL可通过在第二扩增期间包括一种以上癌症的抗原(包括其抗原部分，例如表位)来扩增以诱导进一步TIL体外刺激，该抗原可以可选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下可选地由载体表达，该载体为例如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μMMART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他适合的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或其抗原部分。TIL也可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原进行再刺激而快速扩增。替代地，TIL可进一步用例如实例经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施例中，再刺激作为第二扩增的部分进行。在一些实施例中，第二扩增在经照射的自体淋巴细胞或经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2存在下进行。
在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间、或8000IU/mL的IL-2。
在一些实施例中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间、和50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施例中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施例中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂在细胞培养基中。在一些实施例中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施例中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，其中，一种以上TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施例中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以和它们的任何组合可包括在第二扩增期间，包括例如在根据图1以及本文所述的步骤D过程期间。在一些实施例中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-15和IL-21以及它们的任何组合可包括在根据图1以及如本文所述的步骤D过程期间。
在一些实施例中，第二扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞且可选地包含TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施例中，第二扩增在补充细胞培养基中进行。在一些实施例中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施例中，第二扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中进行。
在一些实施例中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mLIL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约400IU/mLIL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施例中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mLIL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mLIL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中，TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400或约1：500。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1：50与1：300之间。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1：100与1：200之间。
在一些实施例中，REP和/或第二扩增在培养瓶中进行，其中，在150mL培养基中混合主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mLIL-2。进行培养基更换(通常通过抽吸用新鲜培养基进行2/3培养基更换)直至细胞转移至替代生长箱室。替代生长箱室包括G-REX培养瓶和透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施例中，第二扩增(其可包括称为REP过程的过程)缩短至7至14天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，第二扩增缩短至11天。
在一些实施例中，REP和/或第二扩增可以使用如先前描述的T-175培养瓶和透气袋(Tran等人，《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》2008,31,742-51；Dudley等人，《免疫疗法杂志》2003,26,332-42)或透气性培养器皿(G-REX培养瓶)进行。在一些实施例中，第二扩增(包括称为快速扩增的扩增)在T-175培养瓶中进行，可将悬浮于150mL培养基中的约1×106个TIL添加至各T-175培养瓶中。TIL可在补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3的CM与AIM-V培养基的1:1混合物中培养。T-175培养瓶可在37℃、5％ CO2下孵育。可在第5天使用具有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施例中，在第7天，可将来自两个T-175培养瓶的细胞在3L袋中合并，将300mL AIM V与5％人AB血清和3000IU/mL IL-2添加至300mL TIL悬浮液中。每天或每两天对各袋中的细胞数目进行计数，添加新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5与2.0×106个细胞/mL之间。
在一些实施例中，第二扩增(其可包括称为REP的扩增，以及在图1的步骤D中提及的那些扩增)可在500mL容量的具有100cm透气硅底的透气培养瓶(G-REX 100，可购自美国明尼苏达州新布赖顿市的威尔逊狼制造公司(Wilson Wolf ManufacturingCorporation))中进行，5×106或10×106个TIL可与PBMC一起在400mL补充有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-REX-100培养瓶可在37℃下在5％ CO2中孵育。在第5天，可将250mL上清液移除，放入离心瓶中以1500rpm(491×g)离心10分钟。TIL离心块可用150mL具有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2的新鲜培养基再悬浮，添加回初始G-REX 100培养瓶中。当TIL在G-REX 100培养瓶中连续扩增时，在第7天，各G-REX 100中的TIL可悬浮于各培养瓶中存在的300mL养基中，细胞悬浮液可分成可用于接种3个G-REX 100培养瓶的3份100mL等分试样。随后可将150mL具有5％人AB血清和3000IU/mLIL-2的AIM-V添加至各培养瓶中。G-REX 100培养瓶可在37℃、5％ CO2下孵育并在4天之后，可将具有3000IU/mL IL-2的150mL AIM-V添加至各G-REX 100培养瓶中。可在培养第14天收集细胞。
在一些实施例中，第二扩增(包括称为REP的扩增)在培养瓶中进行，其中，在150mL培养基中将主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2混合。在一些实施例中，替换培养基直至细胞转移至替代生长箱室。在一些实施例中，用新鲜培养基通过抽吸来置换2/3的培养基。在一些实施例中，替代生长箱室包括G-REX培养瓶和透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施例中，进行第二扩增(包括称为REP的扩增)，其进一步包括其中选择具有优异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开第2016/0010058A1号(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述的方法可用于选择具有优异肿瘤反应性的TIL。
可选地，细胞存活率(viability)分析可在第二扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后使用本领域中已知的标准分析进行。例如，可在主体TIL样本上进行台盼蓝排除分析，其选择性标记死细胞且允许存活率评估。在一些实施例中，TIL样本可使用Cellometer K2自动化细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯市的Nexcelom Bioscience)计算及确定存活率。在一些实施例中，存活率根据标准Cellometer K2 Image Cytometer自动化细胞计数器方案确定。
在一些实施例中，TIL的第二扩增(包括称为REP的扩增)可使用如先前所描述的T-175培养瓶和透气袋(Tran等人，2008,《免疫疗法杂志》,31,742-751，和Dudley等人，2003,《免疫疗法杂志》,26,332-342)或透气G-REX培养瓶进行。在一些实施例中，使用培养瓶进行第二扩增。在一些实施例中，使用透气G-REX培养瓶进行第二扩增。在一些实施例中，第二扩增在T-175培养瓶中进行，将约1×106个TIL悬浮于约150mL培养基中，将其添加至各T-175培养瓶中。TIL与作为“饲养”细胞的经照射(50Gy)的同种异体PBMC以1:100的比率一起培养，细胞在补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3的CM与AIM-V培养基的1:1混合物(50/50培养基)中培养。T-175培养瓶在37℃、5％ CO2下孵育。在一些实施例中，在第5天使用具有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施例中，在第7天，在3L袋中将来自2个T-175培养瓶的细胞合并将具有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的300mL AIM-V添加至300mL TIL悬浮液中。可每天或每两天对各袋中的细胞数目进行计数，且可添加新鲜培养基以使细胞计数保持在约0.5与约2.0×106个细胞/mL之间。
在一些实施例中，第二扩增(包括称为REP的扩增)在500mL的具有100cm2透气硅底的培养瓶(G-REX-100，Wilson Wolf)中进行，将约5×106或10×106个TIL与经照射的同种异体PBMC以1:100的比率在400mL补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3的50/50培养基中培养。G-REX-100培养瓶在37℃、5％ CO2下孵育。在一些实施例中，在第5天，将250mL上清液移除且放入离心瓶中且以1500rpm(491g)离心10分钟。TIL离心块可随后用具有3000IU/mLIL-2的150mL新鲜50/50培养基再悬浮且添加回初始G-REX-100培养瓶中。在TIL在G-REX-100培养瓶中连续扩增的实施例中，在第7天，将各G-REX-100中的TIL悬浮于各培养瓶中存在的300mL培养基中，并将细胞悬浮液分成可用于接种3个G-REX-100培养瓶的三个100mL等分试样。随后将150mL具有5％人AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至各培养瓶中。G-REX-100培养瓶在37℃、5％ CO2下孵育并在4天之后，将具有3000IU/mL IL-2的150mL AIM-V添加至各G-REX-100培养瓶中。在培养的第14天收集细胞。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供一种用于产生展现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施例中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，在第二扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施例中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施例中，多样性存在于选自α、β、γ和δ受体的T细胞受体中的一者中。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施例中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在一些实施例中，第二扩增培养基(例如，有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更详细论述的抗原呈递饲养细胞(APC)。
在一些实施例中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，基础细胞培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，血清补充剂或血清替代物包括(但不限于)以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上抗生素和一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，该常规生长培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，以无血清或确定成分培养基的总体积计，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1LCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即，)。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约2mM的谷氨酰胺(即，)。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，以引用的方式并入本文中的国际PCT公开第WO/1998/030679号中所描述的确定成分培养基可用于本发明。在该公开中，描述无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素和一种以上抗生素。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白取代物和一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施例中，基础细胞培养基选自如下：达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，确定成分培养基中甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5至500mg/L，硫胺素的浓度为约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1至200mg/L，铁饱和运铁蛋白的浓度为约1至50mg/L，胰岛素的浓度为约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001至0.0001mg/L，且白蛋白(例如I)的浓度为约5000至50,000mg/L。
在一些实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表12中的标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表12中的标题“1X培养基的优选实施例”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施例中，确定成分培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施例中，无血清补充剂包含表12中的类型和标题“补充剂的优选实施例”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
在一些实施例中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施例中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施例中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施例中，Smith等人,《临床与转化免疫学》4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的确定成分培养基适用于本发明。简言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％ CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施例中，在密闭系统生物反应器中进行第二扩增，例如根据图1的步骤D。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用单一生物反应器。在一些实施例中，所使用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施例中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大(scale up)：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速扩增或第二扩增；然后(b)实现将小规模培养中的TIL转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500-MCS容器)中，在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的TIL约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大(scale out)：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速扩增或第二扩增；然后(b)实现将来自第一小规模培养的TIL转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相等的第二容器中，在各第二容器中，经转移至此类第二容器中的来自第一小规模培养的TIL部分在第二小规模培养中培养约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2至5个TIL亚群中。
在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速规模的或第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的TIL转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约5天的时间段来进行快速扩增或第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的TIL转移并分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约6天的时间段。
在一些实施例中，在快速扩增或第二扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL。在一些实施例中，在快速扩增或第二扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施例中，各第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2至5个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2、3、4或5个亚群中。
在一些实施例中，在完成快速扩增或第二扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增或第二扩增后，将一个以上TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增后，各TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施例中，在分流成多个步骤之前，快速扩增或第二扩增进行约3至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的分流在快速扩增或第二扩增开始后约第3天、第4天、第5天、第6天或第7天进行。
在一些实施例中，快速扩增或第二扩增的分流在第一扩增(即，预REP扩增)开始后约第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天、第17天或第18天进行。在一个示例性实施例中，快速扩增或第二扩增的分流在第一扩增开始后约第16天进行。
在一些实施例中，在分流之后，快速扩增或第二扩增进一步进行约7至11天的时间段。在一些实施例中，在分流之后，快速扩增或第二扩增进一步进行约5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含与在分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含与在分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施例中，在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施例中，在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC的新鲜细胞培养基置换第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基置换第一扩增中的细胞培养基而产生。
在一些实施例中，在分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含IL-2和可选的OKT-3。在一些实施例中，在分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施例中，在分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和可选的OKT-3的新鲜培养基置换在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流后用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜培养基置换在分流前用于快速扩增或第二扩增的细胞培养基而产生。
在一些实施例中，快速扩增的分流在密闭系统中进行。
在一些实施例中，在快速扩增或第二扩增期间的TIL培养规模纵向扩大包括向TIL培养物中添加新鲜细胞培养基(也称为喂养TIL)。在一些实施例中，喂养包括频繁地向TIL培养物中添加新鲜细胞培养基。在一些实施例中，喂养包括以规则时间间隔将新鲜细胞培养基添加至TIL培养物中。在一些实施例中，新鲜细胞培养基通过恒定流动而供应至TIL。在一些实施例中，使用例如Xuri W25之自动细胞扩增系统进行快速扩增和喂养。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一些实施例中，本文所述的第二扩增程序(例如包括例如图1的步骤D中所描述的扩增以及称为REP的扩增)在REP TIL扩增期间和/或在第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施例中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，如实例中所描述用于REP程序，其提供用于评估经照射的同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施例中，若第14天活细胞总数小于在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。
在一些实施例中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目相比未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目相比未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在5至60ng/mL OKT3抗体和1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在10至50ng/mL OKT3抗体和2000至5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在20至40ng/mL OKT3抗体和2000至4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在25至35ng/mL OKT3抗体和2500至3500IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400或约1：500。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1：50与1：300之间。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1：100与1：200之间。
在一些实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞:约100×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞:约50×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞:约25×106个TIL的比率。
在一些实施例中，本文所述的第二扩增程序在第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施例中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施例中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，用于本文所述的TIL扩增程序，包括图示和实例中所描述的示例性程序。
在一些实施例中，在第二扩增中使用人工抗原呈递细胞来替代PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子和其他添加剂
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子的组合来进行TIL的快速扩增和/或第二扩增也是可能的，如美国专利申请公开第US2017/0107490 A1号中所描述，使用IL-2、IL-15和IL-21组合中的两种以上，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，后者在许多实施例中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施例中，步骤D也可包括向培养基中添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文中别处所描述。在一些实施例中，步骤D也可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文中别处所描述。在一些实施例中，步骤D也可包括向培养基中添加OX-40激动剂，如本文中别处所描述。此外，可在步骤D期间在培养基中使用添加剂，例如过氧物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如在美国专利申请公开第US2019/0307796 A1号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
E.步骤E：收集TIL
在第二扩增步骤之后，可收集细胞。在一些实施例中，在例如图1中所提供的一、二、三、四个以上扩增步骤之后收集TIL。在一些实施例中，在两个扩增步骤之后收集TIL，例如图1中所提供。
TIL可以任何适当和无菌方式收集，包括例如离心。用于收集TIL的方法为本领域中熟知的且任何此类已知方法均可与本发明的过程一起使用。在一些实施例中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如费森尤斯卡比(Fresenius Kabi)、Tomtec Life Science、珀金埃尔默(Perkin Elmer)和InotechBiosystems International,Inc.。本发明方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施例中，细胞收集器和/或细胞处理系统为基于膜的细胞收集器。在一些实施例中，细胞收集通过细胞处理系统，例如LOVO系统(由费森尤斯卡比制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动和细胞处理以移除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施例中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施例中，收集，例如根据图1的步骤E，在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用单一生物反应器。在一些实施例中，所使用的单一生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施例中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
在一些实施例中，根据图1的步骤E根据本文所述的过程进行。在一些实施例中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施例中，采用如实例中所描述的密闭系统。
在一些实施例中，根据实例中所描述的方法收集TIL。在一些实施例中，第1天和第11天之间的TIL使用如本文提及的步骤中所描述的方法收集，例如实例中的第11天TIL收集。在一些实施例中，第12和第24天之间的TIL使用如本文提及的步骤中所描述的方法收集，例如实例中的第22天TIL收集。在一些实施例中，第12和第22天之间的TIL使用如本文提及的步骤中所描述的方法收集，例如实例中的第22天TIL收集。
F.步骤F：最终配制和转移至输注容器
在如图1中以示例性顺序提供且如上文和本文中所详细概述的步骤A至E完成之后，将细胞转移至容器中以用于向患者施用，例如输注袋或无菌小瓶。在一些实施例中，一旦使用上文所描述的扩增方法获得治疗足够数目的TIL后，将其转移至容器以用于向患者施用。
在一些实施例中，使用本公开的APC扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一些实施例中，药物组合物为TIL于无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施例中，T细胞以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
VII.Gen 3TIL制造过程
在不受任何特定理论限制的情况下，认为如本发明方法中所描述的启动T细胞活化的起始第一扩增和随后的加强T细胞活化的快速第二扩增，允许制备保留“较年轻”表型的经扩增T细胞，因此预期本发明的经扩增T细胞相较于通过其他方法扩增的T细胞可对癌细胞展现较高细胞毒性。特别地，认为如本发明方法所教导的通过暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)、IL-2和可选的抗原呈递细胞(APC)来启动T细胞的活化，然后通过后续暴露于另外的抗CD-3抗体(例如OKT-3)、IL-2和APC来加强，其限制或避免培养基中T细胞的成熟，从而产生具有较不成熟表型的T细胞群体，该T细胞因培养扩增而耗竭较少并对癌细胞展现较高的细胞毒性。在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下达成培养规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二扩增；然后(b)实现将小规模培养中的T细胞转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的T细胞约4天至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的第一小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二扩增；然后(b)将来自第一小规模培养中的T细胞转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相同的第二容器中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分在第二小规模培养中培养约4天至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二扩增；然后(b)将来自小规模培养的T细胞转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分在较大规模培养中培养约4天至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约4天的时间段来进行快速第二扩增；然后(b)将来自小规模培养的T细胞转移并分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在一些实施例中，在快速扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL。在一些实施例中，在快速扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施例中，各第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2至5个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2、3、4或5个亚群中。
在一些实施例中，在完成快速扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增后，将一个以上TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增后，各TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施例中，在分成多个步骤之前将快速扩增进行约1至5天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的分流在快速扩增开始后约第1天、第2天、第3天、第4天或第5天进行。
在一些实施例中，快速扩增的分流在第一扩增(即，预REP扩增)开始后约第8天、第9天、第10天、第11天、第12天或第13天进行。在一个示例性实施例中，快速扩增的分流进行在起始第一扩增开始后约第10天进行。在另一示例性实施例中，快速扩增的分流进行在起始第一扩增开始后约第11天进行。
在一些实施例中，在分流之后，快速扩增进一步进行约4至11天的时间段。在一些实施例中，在分流之后，快速扩增进一步进行约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，在分流前用于快速扩增的细胞培养基包含与在分流后用于快速扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增的细胞培养基包含与在分流后用于快速扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施例中，在分流前用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施例中，在分流前用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流前用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。
在一些实施例中，在分流后用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2和可选的OKT-3。在一些实施例中，在分流后用于快速扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施例中，在分流后用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和可选的OKT-3的新鲜培养基来替换在分流前用于快速扩增的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流后用于快速扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜培养基来替换在分流前用于快速扩增的细胞培养基而产生。
在一些实施例中，快速扩增的分流进行在密闭系统中。
在一些实施例中，在快速扩增期间TIL培养规模纵向扩大包括向TIL培养物中添加新鲜细胞培养基(也称为喂养TIL)。在一些实施例中，喂养包括频繁地向TIL培养物中添加新鲜细胞培养基。在一些实施例中，喂养包括以规则时间间隔将新鲜细胞培养基添加至TIL培养物中。在一些实施例中，新鲜细胞培养基通过恒定流动供应至TIL。在一些实施例中，使用例如Xuri W25的自动细胞扩增系统进行快速扩增和喂养。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增所实现的T细胞活化开始降低、趋缓、衰退或消退之后进行。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低刚好或约(at or about)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％之后进行。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增所实现的T细胞活化已降低刚好或约1％至100％的范围中的百分比之后进行。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低刚好或约1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至100％的范围中之百分比之后进行。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低在至少刚好或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％之后进行。
在一些实施例中，快速第二扩增在通过起始第一扩增实现的T细胞活化已降低至多刚好或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％之后进行。
在一些实施例中，通过起始第一扩增实现的T细胞活化的降低通过T细胞响应于抗原刺激而释放的干扰素γ的量的减少来确定。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行至多刚好或约7天或约8天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行至多刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的快速第二扩增进行至多刚好或约11天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的快速第二扩增进行至多刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的快速第二扩增进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行在刚好或约1天至刚好或约7天的时间段且T细胞的快速第二扩增进行刚好或约1天至刚好或约11天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行至多刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段，且T细胞的快速第二扩增进行至多刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行在刚好或约1天至刚好或约8天的时间段，且T细胞的快速第二扩增进行刚好或约1天至刚好或约9天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行8天的时间段，且T细胞的快速第二扩增在9天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行刚好或约1天至处于或约7天的时间段，且T细胞的快速第二扩增进行处于或约1天至处于或约9天的时间段。
在一些实施例中，T细胞的起始第一扩增进行7天的时间段，且T细胞的快速第二扩增进行9天的时间段。
在一些实施例中，T细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在一些实施例中，T细胞为骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。
在一些实施例中，T细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。
在一些实施例中，T细胞获自患有癌症的供体。
在一些实施例中，T细胞为获自患有癌症的患者所切除的肿瘤的TIL。
在一些实施例中，T细胞为获自患有造血系统恶性肿瘤的患者的骨髓的MIL。
在一些实施例中，T细胞为获自供体的外周血单核细胞(PBMC)的PBL。在一些实施例中，供体患有癌症。在一些实施例中，癌症为选自如下的癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施例中，癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施例中，供体患有肿瘤。在一些实施例中，肿瘤为液体肿瘤。在一些实施例中，肿瘤为实体肿瘤。在一些实施例中，供体患有造血系统恶性肿瘤。
在本发明的某些方面中，免疫效应细胞(例如T细胞)可使用本领域技术人员已知的任何数目的技术(例如FICOLL分离)自收集自受试者的血液单元获得。在一个优选方面中，通过单采获得来自受试者的循环血液的细胞。单采产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、颗粒细胞、B细胞、其他成核白细胞、红细胞和血小板。在一方面中，通过单采收集的细胞可经洗涤以移除血浆级分，可选地将细胞置于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施例中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一替代实施例中，洗涤溶液缺乏钙，可能缺乏镁或可能缺乏许多(若并非全部)二价阳离子。在一个方面中，通过溶解红细胞和例如通过PERCOLL梯度离心或通过逆流离心洗脱耗竭单核细胞，自外周血淋巴细胞分离T细胞。
在一些实施例中，T细胞为自供体的全血或富含淋巴细胞的单采产物分离的PBL。在一些实施例中，供体患有癌症。在一些实施例中，癌症选自如下：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施例中，癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施例中，供体患有肿瘤。在一些实施例中，肿瘤为液体肿瘤。在一些实施例中，肿瘤为实体肿瘤。在一些实施例中，供体患有造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，PBL通过使用正向或负向选择方法自全血或富含淋巴细胞的单采产物分离，即，使用T细胞表型的标记物(例如，CD3+CD45+)移除PBL，或移除非T细胞表型细胞而留下PBL。在其他实施例中，PBL通过梯度离心分离。在自供体组织分离PBL后，PBL的起始第一扩增可根据本文所述的任何方法的起始第一扩增步骤，通过将适合数目的经分离PBL(在一些实施例中，约1×107个PBL)接种在起始第一扩增培养物中来开始。
含有这些特征中的一些的称为过程3(在本文中也称为Gen 3)的示例性TIL过程描绘于图8(特别地，例如图8B和/或图8C和/或图8D)中，本发明的此实施例在Gen 2中的一些优势描述于图1、图2、图8、图30和图31(特别地，例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中。Gen 3的实施例显示于图1、图8和图30(特别地，例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中。过程2A或Gen 2或Gen 2A也描述于美国专利公开第2018/0280436号中，其以全文引用的方式并入本文中。Gen 3过程也描述于国际专利公开WO 2020/096988中。
如本文所述和大体上概述，TIL取自患者样本，使用本文所述且称为Gen 3的TIL扩增过程操作以在移植至患者中之前扩增其数目。在一些实施例中，TIL可以可选地如下文所述经基因操作。在一些实施例中，TIL可在扩增之前或之后冷冻保存。在解冻后，其也可经再刺激以在输注至患者中之前增加其代谢。
在一些实施例中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤B的过程)缩短至1至8天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤D的过程)缩短至1至9天，如下和实例和图示中所详细论述。在一些实施例中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤B的过程)缩短至1至8天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤D的过程)缩短至1至8天，如下和实例和图示中所详细论述。在一些实施例中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤B的过程)缩短至1至7天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤D的过程)缩短至1至9天，如下和实例和图示中所详细论述。在一些实施例中，起始第一扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图1B和/或图8C)中示为步骤B的过程)为1至7天，快速第二扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤D的过程)为1至10天，如下和实例和图示中所详细论述。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短至8天，快速第二扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为7至9天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为8天，快速第二扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为8至9天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短至7天，快速第二扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为7至8天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为8天，快速第二扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为8天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为8天，快速第二扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为9天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为8天，快速第二扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为10天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为7天，快速第二扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为7至10天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为7天，快速第二扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为8至10天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为7天，快速第二扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为9至10天。在一些实施例中，起始第一扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短至7天，快速第二扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为7至9天。在一些实施例中，起始第一扩增和快速第二扩增(例如，在图8(特别是例如图1B和/或图8C)中描述为步骤B和步骤D的扩增)的组合为14至16天，如下文以及实例和图示中所详细论述。特定地，认为本发明的某些实施例包含起始第一扩增步骤，其中TIL通过在IL-2存在下暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)或在至少IL-2和抗CD3抗体(例如OKT-3)存在下暴露于抗原而活化。在某些实施例中，在如上文所描述的起始第一扩增步骤中活化的TIL为第一TIL群体，即，其为初代细胞群体。
下文中的“步骤”标识A、B、C等参考图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的非限制性实例及参考本文所述的某些非限制性实施例。以下和图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤顺序为示例性的，本申请和本文中所公开的方法涵盖步骤的任何组合或顺序，以及另外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样本
通常，TIL最初获自患者肿瘤样本(“初代TIL”)或获自循环淋巴细胞(例如外周血淋巴细胞，包括具有TIL样特征的外周血淋巴细胞)，然后扩增成较大群体以进行如本文所述的进一步操作，可选地经冷冻保存且可选地评估表型和代谢参数作为TIL健康的指标。
患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，通常通过手术切除、针吸活体组织切片或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式获得。一般而言，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可为液体肿瘤，例如获自造血系统恶性肿瘤的肿瘤。实体肿瘤可为任何癌症类型，包括(但不限于)乳腺癌、胰脏癌、前列腺癌、大肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括(但不限于)鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施例中，癌症选自宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(GBM)、胃肠癌、卵巢癌、肉瘤、胰脏癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。在一些实施例中，癌症为黑色素瘤。在一些实施例中，适用的TIL获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为报告指出这些肿瘤具有特别高含量的TIL。
一旦获得，肿瘤样本通常使用锐器分割破碎成1mm3至约8mm3之间的小块，其中约2至3mm3尤其适用。TIL自这些碎片使用酶肿瘤消化物培养。此类肿瘤消化物可通过在酶培养基(例如罗斯威尔公园癌症研究所(RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30单位/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，然后进行机械解离(例如使用组织解离器)来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤放置于酶培养基中且机械解离肿瘤约1分钟，随后在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟，随后在前述条件下重复机械解离和孵育循环，直至仅存在小组织块。在此过程结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用FICOLL支化亲水性多糖的密度梯度分离以移除这些细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开第2012/0244133A1号中所描述的方法，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。任何前述方法可用于本文所述的任何实施例中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
如上文所指出，在一些实施例中，TIL来源于实体肿瘤。在一些实施例中，实体肿瘤未经破碎。在一些实施例中，实体肿瘤未经破碎且以完整肿瘤进行酶消化。在一些实施例中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化。在一些实施例中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％ CO2下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％ CO2、旋转下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和玻尿酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施例中，肿瘤在恒定旋转下消化过夜。在一些实施例中，肿瘤在37℃、5％ CO2、恒定旋转下消化过夜。在一些实施例中，整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施例中，在无菌缓冲液中用冻干酶复原肿瘤。在一些实施例中，缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施例中，酶混合物包含胶原蛋白酶。在一些实施例中，胶原蛋白酶为胶原蛋白酶IV。在一些实施例中，胶原蛋白酶的工作储备液为100mg/mL 10X工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施例中，DNA酶的工作储备液为10,000IU/mL 10X工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含玻尿酸酶。在一些实施例中，玻尿酸酶的工作储备液为10mg/mL 10X工作储备液。
在一些实施例中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、1000IU/mL DNA酶和1mg/mL玻尿酸酶。
在一些实施例中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、500IU/mL DNA酶和1mg/mL玻尿酸酶。
一般而言，获自肿瘤的细胞悬浮液称为“初代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。在某些实施例中，新鲜获得的TIL细胞群体暴露于包含抗原呈递细胞、IL-12和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施例中，破碎包括物理破碎，包括例如分割以及消化。在一些实施例中，破碎为物理破碎。在一些实施例中，破碎为分割。在一些实施例中，破碎通过消化。在一些实施例中，TIL最初可自获自患者的酶肿瘤消化物和肿瘤碎片培养。在一些实施例中，TIL最初可自获自患者的酶肿瘤消化物和肿瘤碎片培养。
在一些实施例中，当肿瘤为实体肿瘤时，在例如步骤A(如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供)中获得肿瘤样本之后，对肿瘤进行物理破碎。在一些实施例中，破碎进行在冷冻保存之前进行。在一些实施例中，破碎进行在冷冻保存之后进行。在一些实施例中，破碎在获得肿瘤之后并在不进行任何冷冻保存的情况下进行。在一些实施例中，破碎步骤是体外或离体过程。在一些实施例中，将肿瘤破碎并将10、20、30、40以上碎片或块置于各容器中进行起始第一扩增。在一些实施例中，将肿瘤破碎并将30或40个碎片或块置于各容器中进行起始第一扩增。在一些实施例中，将肿瘤破碎并将40个碎片或块置于各容器中进行起始第一扩增。在一些实施例中，多个碎片包含约4个至约50个碎片，其中各碎片的体积为约27mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约30个至约60个碎片，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约50个碎片，其总体积为约1350mm3。在一些实施例中，多个碎片包含约50个碎片，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施例中，多个碎片包含约4个碎片。
在一些实施例中，TIL获自肿瘤碎片。在一些实施例中，肿瘤碎片通过锐器分割获得。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与8mm3之间。在一些实施例中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施例中，肿瘤碎片为1至4mm×1至4mm×1至4mm。在一些实施例中，肿瘤碎片为1mm×1mm×1mm。在一些实施例中，肿瘤碎片为2mm×2mm×2mm。在一些实施例中，肿瘤碎片为3mm×3mm×3mm。在一些实施例中，肿瘤碎片为4mm×4mm×4mm。
在一些实施例中，肿瘤经破碎以使各块上出血性、坏死和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经破碎以使各块上出血性组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经破碎以使各块上坏死组织的量减至最小。在一些实施例中，肿瘤经破碎以使各块上脂肪组织的量减至最小。在某些实施例中，肿瘤破碎步骤是体外或离体方法。
在一些实施例中，进行肿瘤破碎以维持肿瘤内部结构。在一些实施例中，在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行肿瘤破碎。在一些实施例中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施例中，通过在酶培养基(例如(但不限于)RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中培养，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离约1分钟。随后可将溶液在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟，其然后再次机械破坏约1分钟。在37℃下在5％ CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏约1分钟。在一些实施例中，若在第三次机械破坏后若大块组织仍存在，则可向样本施加1或2次另外机械解离，不论是否再在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟。在一些实施例中，若在最终培养结束时，细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用Ficoll的密度梯度分离以移除这些细胞。
在一些实施例中，将起始第一扩增步骤之前的细胞悬浮液称为“初代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。
在一些实施例中，细胞可以可选地在样本分离之后(例如，在获得肿瘤样本后和/或在自肿瘤样本获得细胞悬浮液后)冷冻，在进入步骤B中所描述的扩增之前冷冻储存，步骤B进一步详细描述于下文且示例于图8(特别是例如图8B)中。
1.粗针/小活体组织切片衍生的TIL
在一些实施例中，TIL最初获自通过粗针活体组织切片或类似程序获得的患者肿瘤样本(“初代TIL”)且随后扩增成较大群体以进行如本文所述的进一步操作，可选地经冷冻保存且可选地评估表型和代谢参数。
在一些实施例中，患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，通常通过小活体组织切片、粗针活体组织切片、针吸活体组织切片或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式获得。一般而言，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可为液体肿瘤，例如获自造血系统恶性肿瘤的肿瘤。在一些实施例中，样本可来自多个小肿瘤样本或活体组织切片。在一些实施例中，样本可包含来自同一患者的单一肿瘤的多个肿瘤样本。在一些实施例中，样本可包含来自同一患者的一个、两个、三个或四个肿瘤的多个肿瘤样本。在一些实施例中，样本可包含来自同一患者的多个肿瘤的多个肿瘤样本。实体肿瘤可为肺癌和/或非小细胞肺癌(NSCLC)。
一般而言，获自肿瘤核心或碎片的细胞悬浮液称为“初代细胞群体”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群体。在某些实施例中，新鲜获得的TIL细胞群体暴露于包含抗原呈递细胞、IL-2和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施例中，若肿瘤为转移性肿瘤并在过去已有效治疗/移除原发性病灶，则可能需要移除一个转移性病灶。在一些实施例中，若可用，微创方法是移除皮肤病灶或颈部或腋窝区域上的淋巴结。在一些实施例中，移除皮肤病灶或移除其小活体组织切片。在一些实施例中，移除淋巴结或其小活体组织切片。在一些实施例中，肿瘤为黑色素瘤。在一些实施例中，黑色素瘤的小活体组织切片包含黑痣或其一部分。
在一些实施例中，小活体组织切片为穿孔活体组织切片。在一些实施例中，穿孔活体组织切片以圆形刀片压入皮肤中获得。在一些实施例中，穿孔活体组织切片以圆形刀片压入可疑黑痣周围的皮肤中获得。在一些实施例中，穿孔活体组织切片以圆形刀片压入皮肤中获得，并且移除一块圆形皮肤。在一些实施例中，小活体组织切片为穿孔活体组织切片并移除圆形部分的肿瘤。
在一些实施例中，小活体组织切片为切除式活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为切除式活体组织切片且移除整个黑痣或生长物。在一些实施例中，小活体组织切片为切除式活体组织切片且连同小边缘的正常外观皮肤移除整个黑痣或生长物。
在一些实施例中，小活体组织切片为切开式活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为切开式活体组织切片且仅采集最不规则部分的黑痣或生长物。在一些实施例中，小活体组织切片为切开式活体组织切片，且该切开式活体组织切片在其他技术无法完成时使用，例如当可疑黑痣非常大时使用。
在一些实施例中，小活体组织切片为肺活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片通过支气管镜检获得。一般而言，支气管镜检在患者麻醉下使小工具通过鼻或口、下至咽喉且进入支气管通道，其中，小工具用于移除一些组织。在一些实施例中，在无法通过支气管镜检达到肿瘤或生长物的情况下，可以采用经胸针吸活体组织切片。一般而言，对于经胸针吸活体组织切片，患者也处于麻醉下并将针穿过皮肤直接插入可疑位点以移除小样本的组织。在一些实施例中，经胸针吸活体组织切片可能需要介入性放射线学(例如使用X射线或CT扫描引导针头)。在一些实施例中，小活体组织切片通过针吸活体组织切片获得。在一些实施例中，小活体组织切片经内视镜超声波获得(例如，内视镜附灯且经口置于食道中)。在一些实施例中，小活体组织切片经手术获得。
在一些实施例中，小活体组织切片为头颈活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为切开式活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为切开式活体组织切片，其中自外观异常区域切除一小块组织。在一些实施例中，若容易接近异常区，则无需住院即可采集样本。在一些实施例中，若肿瘤在口腔或咽喉内部较深处，则活体组织切片可能需要在手术室全身麻醉进行。在一些实施例中，小活体组织切片为切除式活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为切除式活体组织切片，其中移除整个区域。在一些实施例中，小活体组织切片为细针抽吸(FNA)。在一些实施例中，小活体组织切片为细针抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器的非常细的针头自肿瘤或肿块抽取(抽吸)细胞。在一些实施例中，小活体组织切片为穿孔活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为穿孔活体组织切片，其中使用穿孔镊移除一块可疑区域。
在一些实施例中，小活体组织切片为子宫颈活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片通过阴道镜获得。通常，阴道镜方法采用附接至双目放大镜的附灯放大仪器(阴道镜)，然后用于对一小部分的子宫颈进行活体组织切片检查。在一些实施例中，小活体组织切片为子宫颈锥状切除/锥状活体组织切片。在一些实施例中，小活体组织切片为子宫颈锥状切除/锥状活体组织切片，其中可能需要门诊手术以自子宫颈移除较大块组织。在一些实施例中，除了有助于确诊之外，锥状活体组织切片也可以用作初始治疗。
术语“实体肿瘤”指通常不含囊肿或液体区域的异常组织团块。实体肿瘤可为良性或恶性的。术语“实体肿瘤癌症”指恶性、赘生性或癌性实体肿瘤。实体肿瘤癌症包括肺癌。在一些实施例中，癌症为黑色素瘤。在一些实施例中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。实体肿瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和有癌细胞分散其中且可提供支持性微环境的支持性基质细胞。
在一些实施例中，来自肿瘤的样本以细针抽吸物(FNA)、粗针活体组织切片、小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)形式获得。在一些实施例中，先将样本放置于G-REX-10中。在一些实施例中，当存在1个或2个粗针活体组织切片和/或小活体组织切片样本时，先将样本置于G-REX-10中。在一些实施例中，当存在3、4、5、6、8、9或10个以上粗针活体组织切片和/或小活体组织切片样本时，先将样本放置于G-REX-100中。在一些实施例中，当存在3、4、5、6、8、9或10个以上粗针活体组织切片和/或小活体组织切片样本时，先将样本放置于G-REX-500中。
FNA可获自皮肤肿瘤，包括例如黑色素瘤。在一些实施例中，FNA获自皮肤肿瘤，例如来自患有转移性黑色素瘤的患者的皮肤肿瘤。在一些情况下，患有黑色素瘤的患者先前已经受手术治疗。
FNA可获自肺肿瘤，包括例如NSCLC。在一些实施例中，FNA获自肺肿瘤，例如来自非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肺肿瘤。在一些情况下，NSCLC患者先前已经受手术治疗。
本文所述的TIL可获自FNA样本。在一些情况下，FNA样本使用在18号针头至25号针头范围中的细口径针头自患者获得或分离。细口径针头可为18号、19号、20号、21号、22号、23号、24号或25号。在一些实施例中，来自患者的FNA样本可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。
在一些情况下，本文所述的TIL获自粗针活体组织切片样本。在一些情况下，粗针活体组织切片样本使用在11号针头至16号针头范围中的外科或医用针头自患者获得或分离。针头可为11号、12号、13号、14号、15号或16号。在一些实施例中，来自患者的粗针活体组织切片样本可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。
一般而言，经收集的细胞悬浮液被称为“初代细胞群体”或“新鲜收集的”细胞群体。
在一些实施例中，TIL并非获自肿瘤消化物。在一些实施例中，实体肿瘤核心未经破碎。
在一些实施例中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施例中，通过在酶培养基(例如(但不限于)RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离约1分钟。随后可将溶液在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟，其然后再次机械破坏约1分钟。在37℃下在5％CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏约1分钟。在一些实施例中，若在第三次机械破坏后若大块组织仍存在，则可向样本施加1或2次另外机械解离，不论是否再在37℃下在5％ CO2中孵育30分钟。在一些实施例中，若在最终孵育结束时，细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用Ficoll的密度梯度分离以移除这些细胞。
在一些实施例中，获得第一TIL群体包含多病灶取样方法。
肿瘤解离酶混合物可包含一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何混合或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶(链蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，和它们的任何组合。
在一些实施例中，解离酶由冻干酶复原。在一些实施例中，冻干酶在一定量的无菌缓冲液，例如汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中复原。
在一些情况下，胶原蛋白酶(例如无动物源1型胶原蛋白酶)在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度可为每小瓶2892PZ U。在一些实施例中，胶原蛋白酶在5mL至15mL缓冲液中复原。在一些实施例中，在复原后，胶原蛋白酶储备液的范围为约100PZU/mL至约400PZ U/mL，例如约100PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL至约350PZ U/mL、约100PZ U/mL至约300PZ U/mL、约150PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZ U/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZ U/mL、约250PZU/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZ U/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施例中，中性蛋白酶在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度可为每小瓶175DMC U。在一些实施例中，在复原后，中性蛋白酶储备液的范围为100DMC/mL至约400DMC/mL，例如，约100DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL至约350DMC/mL、约100DMC/mL至约300DMC/mL、约150DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施例中，DNA酶I在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中复原。冻干储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施例中，在复原后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施例中，酶储备液会发生变化，因此验证冻干储备液的浓度并相应地修改添加至消化混合物中的酶的最终量。
在一些实施例中，酶混合物包含约4.7mL无菌HBSS中的约10.2μl中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μl胶原蛋白酶(1.2PZ/mL)和250μl DNA酶I(200U/mL)。
2.胸腔积液T细胞和TIL
在一些实施例中，样本为胸膜液样本。在一些实施例中，根据本文所述的过程的用于扩增的T细胞或TIL的来源为胸膜液样本。在一些实施例中，样本为源于胸腔积液的样本。在一些实施例中，根据本文所述的过程的用于扩增的T细胞或TIL的来源为胸腔积液衍生的样本。参见例如美国专利公开US2014/0295426中所描述的方法，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，可以采用疑似和/或含有TIL的任何胸膜液或胸腔积液。此类样本可来源于原发性或转移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。在一些实施例中，样本可为来源于另一器官(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺)的继发转移性癌细胞。在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜渗出物。在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法中的样本为胸膜溢出物。其他生物样本可包括含有TIL的其他浆液，包括例如来自腹部的腹水液或胰囊肿液。腹水液和胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部和肺两者在相同的恶性肿瘤事件中于胸腔和腹腔中均具有间皮细胞系和流体形式，在一些实施例中，此类流体含有TIL。在本发明示例胸膜液的一些实施例中，可以使用含有TIL的腹水或其他囊肿液进行相同的方法以得到类似结果。
在一些实施例中，胸膜液呈未经处理的形式直接自患者移除。在一些实施例中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准血液收集管(例如EDTA或肝素管)中。在一些实施例中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准管(Veridex)中。在一些实施例中，在自患者收集之后立即将样本置于CellSave管中，以避免活TIL的数目减少。若保留在未经处理的胸膜液中，即使在4℃下，活TIL的数目可能在24小时内显著降低。在一些实施例中，样本在自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。在一些实施例中，样本在4℃下自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。
在一些实施例中，可以稀释来自所选受试者的胸膜液样本。在一些实施例中，稀释度为1:10胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:9胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:8胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:5胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:2胸膜液比稀释剂。在其他实施例中，稀释度为1:1胸膜液比稀释剂。在一些实施例中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施例中，样本在自患者收集和稀释之后立即置于CellSave管中，以避免活TIL减少，若保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL可能在24至48小时内显著减少。在一些实施例中，胸膜液样本在自患者移除且稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。在一些实施例中，胸膜液样本在自患者移除并在4℃下稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。
在其他实施例中，在进一步处理步骤之前，通过常规方式浓缩胸膜液样本。在一些实施例中，在胸膜液必须冷冻保存以便运送至进行该方法的实验室或用于后续分析(例如，在收集后24至48小时之后)的情形下，对此胸膜液进行预处理是优选的。在一些实施例中，通过在将胸膜液样本自受试者中取出后将其离心并将离心液或沉淀物再悬浮于缓冲液中来制备胸膜液样本。在一些实施例中，对胸膜液样本进行多次离心和再悬浮，随后将其冷冻保存以用于运输或以后的分析和/或处理。
在一些实施例中，在进一步的处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样本。在一些实施例中，在接触步骤中使用的胸膜液样本通过将流体通过含有已知且基本均匀的孔径的过滤器过滤而制备，该孔径允许胸膜液通过膜但保留肿瘤细胞。在一些实施例中，膜中的孔的直径可为至少4μM。在其他实施例中，孔径可为5μM以上，并在其他实施例中，可为6μM、7μM、8μM、9μM或10μM中的任一者。过滤之后，可将被膜保留的细胞(包括TIL)自膜上冲出至适合的生理学上可接受的缓冲液中。然后可以将以此方式浓缩的细胞(包括TIL)用于该方法的接触步骤中。
在一些实施例中，使胸膜液样本(包括例如未经处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或再悬浮的细胞沉淀物与裂解试剂接触，该裂解试剂差异性地裂解样本中存在的无核红细胞。在一些实施例中，在胸膜液含有大量RBC的情形下，此步骤在进一步的处理步骤之前进行。适合的裂解试剂包括单一裂解试剂或裂解试剂和淬灭试剂，或裂解试剂、淬灭试剂和固定试剂。适合的裂解系统为市售的，包括BD Pharm LyseTM系统(碧迪医疗公司)。其他裂解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(碧迪医疗公司)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(贝克曼库尔特公司)或氯化铵系统。在一些实施例中，裂解试剂可随主要需求而变化，主要需求为红细胞的有效裂解和TIL的保守性和胸膜液中TIL的表型特性。除使用单一试剂用于裂解以外，适用于本文所述的方法的裂解系统可包括第二试剂，例如在该方法的剩余步骤期间淬灭或延迟裂解试剂的作用的第二试剂，例如StabilyseTM试剂(贝克曼库尔特公司)。视裂解试剂的选择或该方法的优选实施而定，也可采用常规固定试剂。
在一些实施例中，在约-140℃的温度下冷冻保存如上文所描述的未经处理、稀释或多次离心或处理的胸膜液样本，随后如本文所提供进行进一步处理和/或扩增。
3.扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法
PBL方法1。在本发明的一些实施例中，PBL使用本文所述的方法扩增。在本发明的一些实施例中，该方法包括获得来自全血的PBMC样本。在一些实施例中，该方法包括通过使用非CD19+级分的负向选择以自PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。在一些实施例中，该方法包括通过使用非CD19+级分的基于磁珠的负向选择以自PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。
在本发明的一些实施例中，PBL方法1如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻，计算PBMC的数目。使用人泛T细胞分离试剂盒与LS柱(美天旎生物技术)分离T细胞。
PBL方法2。在本发明的一些实施例中，PBL使用PBL方法2扩增，该方法包括获得来自全血的PBMC样本。通过在37℃下孵育PBMC至少三小时，然后分离非贴壁细胞来富集来自PBMC的T细胞。
在本发明的一些实施例中，PBL方法2如下进行：在第0天，将经冷冻保存的PMBC样本解冻，将PBMC细胞以每孔6百万个细胞接种于CM-2培养基中的6孔板中，在37℃下孵育3小时。3小时后，移除非贴壁细胞(其为PBL)并计算其数目。
PBL方法3。在本发明的一些实施例中，PBL使用PBL方法3扩增，该方法包括获得来自外周血的PBMC样本。B细胞使用CD19+选择分离，T细胞使用负向选择PBMC样本的非CD19+级分来选择。
在本发明的一些实施例中，PBL方法3如下进行：在第0天，将来源于外周血的冷冻保存的PBMC解冻，计算其数目。使用人CD19Multisort试剂盒(美天旎生物技术)分选CD19+B细胞。在非CD19+细胞级分中，使用人泛T细胞分离试剂盒和LS柱(美天旎生物技术)纯化T细胞。
在一些实施例中，PBMC自全血样本分离。在一些实施例中，使用PBMC样本作为扩增PBL的起始材料。在一些实施例中，样本在扩增过程之前经冷冻保存。在其他实施例中，使用新鲜样本作为扩增PBL的起始材料。在本发明的一些实施例中，使用本领域中已知的方法自PBMC分离T细胞。在一些实施例中，使用人泛T细胞分离试剂盒和LS柱分离T细胞。在本发明的一些实施例中，使用本领域中已知的抗体选择方法(例如CD19负向选择)自PBMC分离T细胞。
在本发明的一些实施例中，PBMC样本在有效鉴别非贴壁细胞的所需温度下孵育一段时间。在本发明的一些实施例中，孵育时间为约3小时。在本发明的一些实施例中，温度为约37℃。然后使用上文所描述的过程扩增非贴壁细胞。
在一些实施例中，PBMC样本来自可选地已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施例中，肿瘤样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施例中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者，其已进行治疗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或1年或更长。在其他实施例中，PBMC来源于当前进行ITK抑制剂方案(例如伊布替尼(ibrutinib))的患者。
在一些实施例中，PBMC样本来自已用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗且难以用激酶抑制剂或ITK抑制剂(例如伊布替尼)治疗的受试者或患者。
在一些实施例中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗的受试者或患者。在一些实施例中，PBMC样本来自已经用包含激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗并且尚未进行治疗达至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年或更长的受试者或患者。在其他实施例中，PBMC来源于先前暴露于ITK抑制剂但在至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少1年内尚未经治疗的患者。
在本发明的一些实施例中，在第0天，针对CD19+选择细胞且据此分选。在本发明的一些实施例中，使用抗体结合珠子进行选择。在本发明的一些实施例中，在第0天自PBMC分离纯T细胞。
在本发明的一些实施例中，对于未经伊布替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，10至15mL白膜层将产生约5×109个PBMC，其又将产生约5.5×107个PBL。
在本发明的一些实施例中，对于经伊布替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，扩增过程将产生约20×109个PBL。在本发明的一些实施例中，40.3×106个PBMC将产生约4.7×105个PBL。
在任何前述实施例中，PBMC可来源于全血样本，通过单采获得，来源于白膜层，或自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
在一些实施例中，PBL使用美国专利申请公开第US2020/0347350 A1号中所描述的方法制备，其公开内容以引用的方式并入本文中。
4.扩增来自骨髓衍生的PBMC的骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)的方法
MIL方法3。在本发明的一些实施例中，该方法包括获得来自骨髓的PBMC。在第0天，针对CD3+/CD33+/CD20+/CD14+选择PBMC，分选，对非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+细胞级分进行超声处理，将一部分经超声处理的细胞级分添加回所选细胞级分中。
在本发明的一些实施例中，MIL方法3如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻，计算PBMC的数目。将细胞用CD3、CD33、CD20和CD14抗体染色且使用S3e细胞分选器(Bio-Rad)分选。将细胞分选成两种级分：免疫细胞级分(MIL部分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)和AML胚细胞级分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。
在本发明的一些实施例中，PBMC获自骨髓。在一些实施例中，PBMC通过单采、抽吸、针吸活体组织切片或本领域中已知的其他类似方式获自骨髓。在一些实施例中，PBMC为新鲜的。在其他实施例中，PBMC经冷冻保存。
在本发明的一些实施例中，MIL自10至50mL骨髓抽吸物扩增。在本发明的一些实施例中，自患者获得10mL骨髓抽吸物。在其他实施例中，自患者获得20mL骨髓抽吸物。在其他实施例中，自患者获得30mL骨髓抽吸物。在其他实施例中，自患者获得40mL骨髓抽吸物。在其他实施例中，自患者获得50mL骨髓抽吸物。
在本发明的一些实施例中，自约10至50mL骨髓抽吸物产生的PBMC的数目为约5×107至约10×107个PBMC。在其他实施例中，产生的PMBC的数目为约7×107个PBMC。
在本发明的一些实施例中，约5×107至约10×107个PBMC产生约0.5×106至约1.5×106个MIL。在本发明的一些实施例中，产生约1×106个MIL。
在本发明的一些实施例中，来源于骨髓抽吸物的12×106个PBMC产生约1.4×105个MIL。
在任何前述实施例中，PBMC可来源于全血样本、骨髓、通过单采获得，来源于白膜，或自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
在一些实施例中，使用美国专利申请公开第US2020/0347350 A1号中所描述的方法制备MIL，其公开内容以引用的方式并入本文中。
B.步骤B：起始第一扩增
在一些实施例中，本发明方法提供较年轻TIL，较年轻TIL相较于较老TIL(即，在向受试者/患者施用之前已进一步进行更多次复制的TIL)可能提供额外治疗益处。年轻TIL的特征已描述于文献中，例如Donia等人，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》2012,75,157-167；Dudley等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》2010,16,6122-6131；Huang等人，《免疫学杂志》2005,28,258-267；Besser等人，《临床癌症研究》2013,19,OF1-OF9；Besser等人，《免疫学杂志》2009,32,415-423；Robbins等人，《免疫学杂志》2004,173,7125-7130；Shen等人，《免疫学杂志》2007,30,123-129；Zhou等人，《免疫学杂志》2005,28,53-62；以及Tran等人，《免疫学杂志》2008,31,742-751，其中的每一者以引用的方式并入本文中。
在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C)的步骤A中所描述的肿瘤碎片和/或肿瘤碎片的分割或消化之后，将所得细胞在有利于TIL但不利于肿瘤和其他细胞生长的条件下培养在含有IL-2、OKT-3和饲养细胞(例如抗原呈递饲养细胞)的血清中。在一些实施例中，IL-2、OKT-3和饲养细胞在培养起始时(例如在第0天)与肿瘤消化物和/或肿瘤碎片一起添加。在一些实施例中，肿瘤消化物和/或肿瘤碎片以每容器至多60个碎片且与6000IU/mL IL-2孵育于容器中。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养通常1至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养通常1至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，起始第一扩增进行1至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，起始第一扩增进行1至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增进行5至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增进行5至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增进行约6至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增进行约6至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增进行约7至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增进行约7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，此起始第一扩增进行约8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。
在一些实施例中，TIL的扩增可使用如下文和本文所述的起始第一扩增步骤(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些步骤，其可包括称为预REP或初始REP的过程，其自第0天和/或自培养开始含有饲养细胞)进行，然后进行如下文在步骤D中和本文所述的快速第二扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后进行可选的冷冻保存，然后进行如下文和本文所述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可以可选地针对如本文所述的表型特征和代谢参数进行表征。在一些实施例中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。
在一些实施例中，第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施例中，步骤B的CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI1640组成。
在一些实施例中，有少于或等于240个肿瘤碎片。在一些实施例中，有少于或等于240个肿瘤碎片被放入少于或等于4个容器中。在一些实施例中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施例中，少于或等于60个肿瘤碎片被放入1个容器中。在一些实施例中，各容器包含少于或等于500mL培养基/容器。在一些实施例中，培养基包含IL-2。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，培养基包含抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在一些实施例中，培养基包含2.5×108个抗原呈递饲养细胞/容器。在一些实施例中，培养基包含OKT-3。在一些实施例中，培养基包含30ng/mL OKT-3/容器。在一些实施例中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞/容器。
在制备肿瘤碎片之后，将所得细胞(即，为初代细胞群体的碎片)在有利TIL但不利肿瘤和其他细胞生长的条件下培养在含有IL-2、抗原呈递饲养细胞和OKT-3的培养基中，其允许自第0天培养起开始TIL启动和加速生长。在一些实施例中，肿瘤消化物和/或肿瘤碎片与6000IU/mL IL-2以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3一起孵育。将此初代细胞群体培养数天的时间段，通常1至8天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，在起始第一扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3。在一些实施例中，将此初代细胞群体培养数天的时间段，通常1至7天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群体。在一些实施例中，在起始第一扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3。在一些实施例中，IL-2为重组人IL-2(rhIL-2)。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20至30×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，1mg小瓶的IL-2储备液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施例中，IL-2储备液具有4至8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备液具有5至7×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施例中，IL-2储备液如实例C中所描述制备。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mL IL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含1000至2000IU/mL、2000至3000IU/mL、3000至4000IU/mL、4000至5000IU/mL、5000至6000IU/mL、6000至7000IU/mL、7000至8000IU/mL或约8000IU/mL IL-2。
在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL以及约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间、以及50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含15ng/mL至30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，OKT-3抗体为莫罗单抗。参见例如表1。
在一些实施例中，起始第一扩增细胞培养基在细胞培养基中包含一种以上TNFRSF激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施例中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，起始第一扩增细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，其中，一种以上TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施例中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，起始第一扩增细胞培养基进一步包含初始浓度约6000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，其中，一种以上TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施例中，起始第一扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施例中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施例中，CM由补充有10％人AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX之RPMI 1640组成。在一些实施例中，CM为实例中所描述的CM1。在一些实施例中，起始第一扩增在初始细胞培养基或第一细胞培养基中进行。在一些实施例中，起始第一扩增培养基或初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为饲养细胞)。
在一些实施例中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，基础细胞培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，血清补充剂或血清替代物包括(但不限于)以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上抗生素和一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，该常规生长培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，以无血清或确定成分培养基的总体积计，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合，其在使用之前混合在一起。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55μM 2-巯基乙醇。
在一些实施例中，确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1LCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合，其在使用之前混合在一起。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即，)。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约2mM的谷氨酰胺(即，)。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM，或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，培养基中的2-巯基乙醇的最终浓度为55μM。
在一些实施例中，以引用的方式并入本文中的国际PCT公开第WO/1998/030679号中所描述的确定成分培养基可用于本发明。在该公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素和一种以上抗生素。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白取代物和一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+及Zr4+的化合物。在一些实施例中，基础细胞培养基选自：达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，确定成分培养基中甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5至500mg/L，硫胺素的浓度为约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1至200mg/L，铁饱和运铁蛋白的浓度为约1至50mg/L，胰岛素的浓度为约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001至0.0001mg/L，且白蛋白(例如I)的浓度为约5000至50,000mg/L。
在一些实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表12中的标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表12中的标题“1X培养基的优选实施例”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施例中，确定成分培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施例中，无血清补充剂包含表12中的的类型和标题“补充剂的优选实施例”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
在一些实施例中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施例中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施例中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施例中，Smith等人,《临床转化免疫学》,4(1),2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中描述的确定成分培养基可用于本发明。简言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％ CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为1至8天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为2至8天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为3至8天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为4至8天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为5至8天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为6至8天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图1(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为7至8天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为8天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为1至7天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为2至7天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为3至7天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为4至7天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为5至7天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为6至7天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，起始第一扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为7天，如实例和图示中所述。
在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行1天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行1天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行2天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行2天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行3天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行3天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行4天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行4天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行5天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行5天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行6天至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行6天至7天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行7至8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行8天。在一些实施例中，起始第一TIL扩增可在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后进行7天。
在一些实施例中，TIL的起始第一扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行1天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行1天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行2天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行2天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行3天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行3天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行4天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行4天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行5天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行5天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行6天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行6天至7天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行7天至8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行8天。在一些实施例中，第一TIL扩增可进行7天。
在一些实施例中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在起始第一扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及它们的任何组合可包括在起始第一扩增期间，包括例如在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及本文所述的步骤B过程期间。在一些实施例中，采用IL-2、IL-15及IL-21的组合作为在起始第一扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-15和IL-21以及它们的任何组合可包括在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及如本文所述的步骤B过程期间。
在一些实施例中，起始第一扩增(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用生物反应器。在一些实施例中，采用生物反应器作为容器。在一些实施例中，所采用的生物反应器为例如G-REX-10或G-REX-100。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-10。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第4至8天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第4至7天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第5至8天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第5至7天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第6至8天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第6至7天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第7或8天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第7天期间的任何时间添加。在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而在起始第一扩增期间第8天期间的任何时间添加。
在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8B)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时和起始第一扩增期间需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在许多实施例中，饲养细胞获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施例中，起始第一扩增期间使用2.5×108个饲养细胞。在一些实施例中，起始第一扩增期间使用每容器2.5×108个饲养细胞。在一些实施例中，起始第一扩增期间使用每GREX-10 2.5×108个饲养细胞。在一些实施例中，起始第一扩增期间使用每GREX-100 2.5×108个饲养细胞。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，如实例中所描述用于REP程序，其提供用于评估经照射的同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施例中，若第14天活细胞总数小于在起始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。
在一些实施例中，若第7天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在起始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，若第7天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在起始第一扩增第0天放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在5至60ng/mL OKT3抗体和1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在10至50ng/mL OKT3抗体和2000至5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在20至40ng/mL OKT3抗体和2000至4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在25至35ng/mL OKT3抗体和2500至3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在15ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在15ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400或约1：500。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1：50与1：300之间。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1：100与1：200之间。
在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序需要约2.5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的起始第一扩增程序需要约2.5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在其他实施例中，本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞。在其他实施例中，起始第一扩增所需的饲养细胞数目为用于快速第二扩增的饲养细胞数目的四分之一、三分之一、十二分之五或二分之一。
在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基包含每容器2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施例中，培养基包含每容器30ng OKT-3。在一些实施例中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器每2.5×108个抗原呈递饲养细胞500mL培养基和15μg OKT-3。在一些实施例中，培养基包含每容器500mL培养基和15μgOKT-3。在一些实施例中，容器为GREX100 MCS培养瓶。在一些实施例中，培养基包含500mL培养基、6000IU/mL IL-2、30ng/mLOKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器500mL培养基、6000IU/mL IL-2、15μg OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器每2.5×108个抗原呈递饲养细胞500mL培养基和15μg OKT-3。
在一些实施例中，本文所述的起始第一扩增程序在第二扩增期间需要多于TIL的过量饲养细胞。在许多实施例中，饲养细胞获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施例中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，用于本文所述的TIL扩增程序，包括图示和实例中所描述的示例性程序。
在一些实施例中，在起始第一扩增中使用人工抗原呈递细胞来替代PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子和其他添加剂
本文所述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子与以下的组合进行TIL的起始第一扩增也是可能的：如美国专利申请公开第US2017/0107490 A1号中所描述的IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，后者在许多实施例中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是其中所描述的T细胞。参见例如表2。
在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基中添加OKT-3抗体或莫罗单抗，如本文中别处所描述。在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文中别处所描述。在一些实施例中，步骤B也可包括向培养基中添加OX-40激动剂，如本文中别处所描述。此外，可在步骤B期间在培养基中使用添加剂，例如过氧物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如在美国专利申请公开第US2019/0307796 A1号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
C.步骤C：起始第一扩增至快速第二扩增的转变
在一些情况下，获自起始第一扩增(其可包括有时称为预REP的扩增)的主体TIL群体，包括例如获自例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B的TIL群体，可经历快速第二扩增(其可包括有时称为快速扩增方案(REP)的扩增)，然后如下文所述冷冻保存。类似地，在经基因修饰的TIL将用于疗法的情况下，来自起始第一扩增的经扩增TIL群体或来自快速第二扩增的经扩增TIL群体可在扩增步骤之前或在起始第一扩增之后并在快速第二扩增之前进行基因修饰以用于合适治疗。
在一些实施例中，获自起始第一扩增(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B)的TIL经储存直至为了选择而测定表型。在一些实施例中，获自起始第一扩增(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B)的TIL未经储存且直接进行快速第二扩增。在一些实施例中，获自起始第一扩增的TIL在起始第一扩增之后并在快速第二扩增之前不经冷冻保存。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在肿瘤破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约3天至7天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约3天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约4天至7天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约4天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约5天至7天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约5天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约6天至7天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约6天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约7天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约7天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后约8天进行。
在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后1天至7天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后1天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后2天至7天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后2天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后3天至7天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后3天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后4天至7天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后4天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后5天至7天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后5天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后6天至7天进行在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后6天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后7天至8天进行。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后7天进行在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变在破碎进行后和/或第一起始扩增步骤开始后8天进行。
在一些实施例中，TIL在初级第一扩增(primary first expansion)之后并在快速第二扩增之前未经储存，TIL直接进行快速第二扩增(例如在一些实施例中，在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所显示的步骤B至步骤D的转变期间未经储存)。在一些实施例中，转变在如本文所述的密闭系统中进行。在一些实施例中，来自起始第一扩增的TIL(第二TIL群体)直接进行快速第二扩增而无转变期。
在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤C)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用单一生物反应器。在一些实施例中，所采用的单一生物反应器为例如GREX-10或GREX-100。在一些实施例中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。在一些实施例中，起始第一扩增至快速第二扩增的转变涉及容器大小的规模纵向扩大。在一些实施例中，起始第一扩增与快速第二扩增相比在较小容器中进行。在一些实施例中，起始第一扩增在GREX-100中进行且快速第二扩增在GREX-500中进行。
D.步骤D：快速第二扩增
在一些实施例中，TIL细胞群体在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的收集和起始第一扩增(步骤A和步骤B)和称为步骤C的转变之后进一步扩增数目。此进一步扩增在本文中称为快速第二扩增或快速扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(快速扩增方案或REP)的扩增过程；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所指示的过程。快速第二扩增通常使用包含多种组分(包括饲养细胞、细胞因子来源及抗CD3抗体)的培养基在透气容器中完成。在一些实施例中，在快速第二扩增开始后1天、2天、3天或4天(即，在整体Gen3过程的第8、9、10或11天)，将TIL转移至较大体积容器。
在一些实施例中，TIL的快速第二扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所指示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL培养瓶或容器进行。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约1天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约1天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约2天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约2天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约3天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约3天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约4天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约4天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约5天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约5天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约6天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约6天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约7天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约7天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约8天至约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约8天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约9天至约10天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约1天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约2天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约3天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约4天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约5天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约6天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约7天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约8天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约9天。在一些实施例中，第二TIL扩增可在快速第二扩增开始后进行约10天。
在一些实施例中，快速第二扩增可在透气容器中使用本发明的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所指示的过程)进行。在一些实施例中，TIL在快速第二扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)存在下扩增。在一些实施例中，TIL在快速第二扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞存在下扩增，其中将饲养细胞添加至最终浓度，该最终浓度为存在于开始第一扩增中的饲养细胞浓度的2倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。例如，TIL可在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/mL OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本市的美天旎生物技术公司)或UHCT-1(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市的BioLegend)。TIL可通过在第二扩增期间包括一种以上癌症的抗原(包括其抗原部分，例如表位)来扩增以诱导进一步TIL体外刺激，该抗原可以可选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下可选地由载体表达，该载体例如为人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-1:26-35(27L)或gpl00:209-217(210M)。其他适合的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或其抗原部分。TIL也可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激而快速扩增。替代地，TIL可进一步用例如实例经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施例中，再刺激作为第二扩增的部分进行。在一些实施例中，第二扩增在经照射的自体淋巴细胞或经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2存在下进行。
在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间、或8000IU/mL的IL-2。
在一些实施例中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间、和50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含15ng/mL至30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含30ng/mL至60ng/mL OKT-3抗体。在一些实施例中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3。在一些实施例中，细胞培养基包含约60ng/mLOKT-3。在一些实施例中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含每容器7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和30μg OKT-3。在一些实施例中，容器为G-REX-100MCS培养瓶。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2、60ng/mL OKT-3和7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器500mL培养基和6000IU/mLIL-2、30μg OKT-3和7.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施例中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，培养基包含每容器5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和30μg OKT-3。在一些实施例中，容器为G-REX-100MCS培养瓶。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2、60ng/mL OKT-3和5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，快速第二扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和6000IU/mL IL-2、30μg OKT-3和5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在一些实施例中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂于细胞培养基中。在一些实施例中，TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，4-1BB激动剂选自如下：乌瑞鲁单抗、乌图木单抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物以及它们的组合。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成0.1μg/mL与100μg/mL之间的浓度。在一些实施例中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达成20μg/mL与40μg/mL之间的浓度。
在一些实施例中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，其中，一种以上TNFRSF激动剂包含4-1BB激动剂。
在一些实施例中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及它们的任何组合可包括在第二扩增期间，包括例如在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及本文所述的步骤D过程期间。在一些实施例中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二扩增期间的组合。在一些实施例中，IL-2、IL-15和IL-21以及它们的任何组合可包括在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及如本文所述的步骤D过程期间。
在一些实施例中，第二扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞且可选地包含TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施例中，第二扩增在补充细胞培养基中进行。在一些实施例中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施例中，第二扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中进行。
在一些实施例中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mLIL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约400IU/mLIL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-15。在一些实施例中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施例中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mLIL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，第二扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含IL-21。在一些实施例中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1：10、约1：15、约1：20、约1：25、约1：30、约1：35、约1：40、约1：45、约1：50、约1：75、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400或约1：500。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1：50与1：300之间。在一些实施例中，在快速扩增和/或第二扩增中TIL与PBMC的比率介于1：100与1：200之间。
在一些实施例中，REP和/或快速第二扩增在培养瓶中进行，其中，主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30ng/mL OKT3抗CD3抗体和6000IU/mL IL-2在150ml培养基中混合，饲养细胞浓度是起始第一扩增中的饲养细胞浓度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X、2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。替换培养基(通常通过抽取2/3用过的培养基并用相等体积的新鲜培养基替换来替换2/3培养基)直至细胞转移至替代生长箱室。替代生长箱室包括G-REX培养瓶和透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施例中，快速第二扩增(其可包括称为REP过程的过程)为7至9天，如实例和图示中所述。在一些实施例中，第二扩增为7天。在一些实施例中，第二扩增为8天。在一些实施例中，第二扩增为9天。
在一些实施例中，第二扩增(其可包括称为REP的扩增，以及在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中提及的那些)可在500mL容量的具有100cm透气硅底的透气培养瓶(G-REX-100，可购自美国明尼苏达州新布赖顿市的威尔逊狼制造公司(Wilson Wolf Manufacturing Corporation))中进行，5×106或10×106个TIL可与PBMC一起在400mL的补充有5％人AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/ml抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-REX-100培养瓶可在37℃下在5％ CO2中孵育。在第5天，可将250mL上清液移除，放入离心瓶中且以1500rpm(491×g)离心10分钟。可将TIL沉淀物用150mL的含有5％人AB血清、6000IU/mL IL-2的新鲜培养基再悬浮，添加回原始GREX-100培养瓶中。当TIL在GREX-100培养瓶中连续扩增时，在第10或11天可将TIL移至较大培养瓶，例如GREX-500。可在培养第14天收集细胞。细胞可在培养的第15天收集。细胞可在培养的第16天收集。在一些实施例中，替换培养基直至细胞转移至替代生长箱室。在一些实施例中，通过抽取用过的培养基并用相等体积的新鲜培养基替换来替换2/3培养基。在一些实施例中，替代生长箱室包括GREX培养瓶和透气容器，如下文更充分论述。
在一些实施例中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或确定成分培养基。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，无血清或确定成分培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施例中，基础细胞培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，血清补充剂或血清替代物包括(但不限于)以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上抗生素和一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，该常规生长培养基包括(但不限于)CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，以无血清或确定成分培养基的总体积计，无血清或确定成分培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约3％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约5％。在一些实施例中，总血清替代物浓度为无血清或确定成分培养基的总体积的约10％。
在一些实施例中，无血清或确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合，其在使用之前混合在一起。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施例中，确定成分培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1LCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基与26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂的组合，其在使用之前混合在一起。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，进一步包含约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约3000IU/mL IL-2。在一些实施例中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％ CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，进一步包含约6000IU/mL IL-2。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即，)。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约2mM的谷氨酰胺(即，)。
在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM，或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施例中，无血清培养基或确定成分培养基补充有浓度为约55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施例中，国际专利申请公开第WO 1998/030679号和美国专利申请公开第US 2002/0076747A1号中所描述的确定成分培养基(其以引用的方式并入本文中)适用于本发明中。在该公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包含一种以上选自如下的成分，或通过组合一种以上选自如下的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白取代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素和一种以上抗生素。在一些实施例中，确定成分培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白或白蛋白取代物和一种以上选自如下的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上运铁蛋白或运铁蛋白取代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素取代物、一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在一些实施例中，确定成分培养基包含白蛋白和一种以上选自如下的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和运铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施例中，基础细胞培养基选自如下：达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基及伊斯科夫氏改良达尔伯克氏培养基。
在一些实施例中，确定成分培养基中甘氨酸的浓度在约5至200mg/L的范围内，L-组氨酸的浓度为约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5至500mg/L，硫胺素的浓度为约1至20mg/L，还原谷胱甘肽的浓度为约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1至200mg/L，铁饱和运铁蛋白的浓度为约1至50mg/L，胰岛素的浓度为约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001至0.0001mg/L，且白蛋白(例如I)的浓度为约5000至50,000mg/L。
在一些实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表12中的标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施例中，确定成分培养基中的非微量元素部分成分以表12中的标题“1X培养基的优选实施例”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施例中，确定成分培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施例中，无血清补充剂包含表12中的类型和标题“补充剂的优选实施例”栏中列出的浓度的非微量部分成分。
在一些实施例中，确定成分培养基的渗透压介于约260与350mOsmol之间。在一些实施例中，渗透压介于约280与310mOsmol之间。在一些实施例中，确定成分培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。确定成分培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施例中，Smith等人，《临床与转化免疫学》4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的确定成分培养基适用于本发明。简言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％ CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施例中，进行快速第二扩增(包括称为REP的扩增)，其进一步包含其中选择具有优异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开第2016/0010058A1号(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述的方法可用于选择具有优异肿瘤反应性的TIL。
可选地，可在快速第二扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后使用本领域中已知的标准分析来进行细胞存活率分析。例如，可在主体TIL样本上进行台盼蓝排除分析，其选择性标记死细胞且允许存活率评定。在一些实施例中，TIL样本可使用Cellometer K2自动化细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯市的Nexcelom Bioscience)计算和确定存活率。在一些实施例中，存活率根据标准Cellometer K2 Image Cytometer自动化细胞计数器方案确定。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了一种用于产生展现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施例中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，在第二扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施例中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施例中，多样性存在于选自α、β、γ和δ受体的T细胞受体中的一者中。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施例中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在一些实施例中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更详细论述的抗原呈递饲养细胞(APC)。在一些实施例中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30μg/培养瓶OKT-3以及如下文更详细论述的7.5×108个抗原呈递饲养细胞(APC)。在一些实施例中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更详细论述的抗原呈递饲养细胞(APC)。在一些实施例中，快速第二扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30μg/培养瓶OKT-3以及如下文更详细论述的5×108个抗原呈递饲养细胞(APC)。
在一些实施例中，快速第二扩增(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用生物反应器。在一些实施例中，采用生物反应器作为容器。在一些实施例中，所采用的生物反应器为例如G-REX-100或G-REX-500。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-500。
在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速第二扩增；然后(b)实现将小规模培养中的TIL转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500-MCS容器)并在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的TIL约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的第一小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自第一小规模培养的TIL转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器相等的第二容器中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的TIL部分在第二小规模培养中培养约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2至5个TIL亚群中。
在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约3天至7天的时间段来进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养中的TIL转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分在较大规模培养中培养约4天至7天的时间段。
在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX-100MCS容器)中的小规模培养中培养TIL约5天的时间段来进行快速扩增或第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养中的TIL转移并分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的TIL部分于较大规模培养中培养约6天的时间段。
在一些实施例中，在快速第二扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL。在一些实施例中，在快速或第二扩增分流时，各第二容器包含至少108个TIL、至少109个TIL或至少1010个TIL。在一个示例性实施例中，各第二容器包含至少1010个TIL。
在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2至5个亚群中。在一些实施例中，将第一小规模TIL培养物分配至多个约2、3、4或5个亚群中。
在一些实施例中，在完成快速第二扩增后，多个亚群包含治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增或第二扩增后，将一个以上TIL亚群合并在一起以产生治疗有效量的TIL。在一些实施例中，在完成快速扩增后，各TIL亚群包含治疗有效量的TIL。
在一些实施例中，在分成多个步骤之前将快速第二扩增进行约3至7天的时间段。在一些实施例中，快速第二扩增的分流在快速扩增或第二扩增开始后约第3天、第4天、第5天、第6天或第7天进行。
在一些实施例中，快速第二扩增的分流在第一扩增(即预REP扩增)开始后约第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天或第16天、第17天或第18天进行。在一个示例性实施例中，快速扩增或第二扩增的分流在第一扩增开始后约第16天进行。
在一些实施例中，在分流之后，快速第二扩增进一步进行约7至11天的时间段。在一些实施例中，在分流之后，快速第二扩增进一步进行约5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段。
在一些实施例中，在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基包含与分流后用于快速第二扩增的细胞培养基相同的组分。在一些实施例中，在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基包含与分流后用于快速第二扩增的细胞培养基不同的组分。
在一些实施例中，在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施例中，在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和进一步可选的APC。在一些实施例中，在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2、OKT-3和APC。
在一些实施例中，在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜培养基来补充第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、可选的OKT-3和进一步可选的APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。在一些实施例中，在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2、OKT-3和APC的新鲜细胞培养基来替换第一扩增中的细胞培养基而产生。
在一些实施例中，分流后用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2和可选的OKT-3。在一些实施例中，分流后用于快速第二扩增的细胞培养基包含IL-2和OKT-3。在一些实施例中，分流后用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和可选的OKT-3的新鲜培养基来替换在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基而产生。在一些实施例中，分流后用于快速第二扩增的细胞培养基通过用包含IL-2和OKT-3的新鲜培养基来替换在分流前用于快速第二扩增的细胞培养基而产生。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一些实施例中，本文所述的快速第二扩增程序(例如包括如下扩增，例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所描述的那些扩增以及称为REP的那些扩增)在REP TIL扩增期间和/或在快速第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施例中，饲养细胞获自健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，如实例中所描述用于REP程序，其提供用于评估经照射的同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施例中，若第7或14天活细胞总数小于在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即，第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。
在一些实施例中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在60ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在60ng/mLOKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二扩增的第0天(即第二扩增的起始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所述的TIL扩增程序。在一些实施例中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体和1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体和2000至5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体和2000至4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体和2500至3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施例中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施例中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一些实施例中，第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1：10、约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400或约1：500。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1：50与1：300之间。在一些实施例中，在第二扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率介于1：100与1：200之间。
在一些实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在一些实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在其他实施例中，本文所述的第二扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在其他实施例中，快速第二扩增需要快速第二扩增的2倍数目的饲养细胞。在其他实施例中，当本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞时，快速第二扩增需要约5×108个饲养细胞。在其他实施例中，当本文所述的起始第一扩增需要约2.5×108个饲养细胞时，快速第二扩增需要约7.5×108个饲养细胞。在其他实施例中，快速第二扩增需要起始第一扩增的2倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X数目的饲养细胞。
在一些实施例中，本文所述的快速第二扩增程序在快速第二扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施例中，饲养细胞获自同种异体健康血液供体的标准全血单位的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施例中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。在一些实施例中，PBMC以添加至起始第一扩增的PBMC浓度的2倍添加至快速第二扩增。
一般而言，同种异体PBMC通过照射或热处理灭活，用于本文所述的TIL扩增程序，包括图示和实例中所描述的示例性程序。
在一些实施例中，在快速第二扩增中使用人工抗原呈递细胞来替代PBMC或与PBMC组合使用。
2.细胞因子和其他添加剂
本文所述的快速第二扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，使用细胞因子的组合来快速第二扩增TIL也是可能的，如美国专利申请公开第US2017/0107490A1号中所描述，使用两种以上IL-2、IL-15和IL-21的组合，其公开内容以引用的方式并入本文中。因此，可能组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，后者在许多实施例中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，且特别是如其中所描述的T细胞。
在一些实施例中，步骤D(特别是来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)也可包括将OKT-3抗体或莫罗单抗添加至培养基中，如本文中别处所描述。在一些实施例中，步骤D也可包括向培养基中添加4-1BB激动剂，如本文中别处所描述。在一些实施例中，步骤D(特别是来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)也可包括将OX-40激动剂添加至培养基中，如本文中别处所描述。此外，可在步骤D(特别是来自例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)期间在培养基中使用添加剂，例如过氧物酶体增殖物活化受体γ共活化剂I-α激动剂，包括增殖物活化受体(PPAR)-γ激动剂，例如噻唑啶二酮化合物，如在美国专利申请公开第US2019/0307796 A1号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。
E.步骤E：收集TIL
在快速第二扩增步骤之后，可收集细胞。在一些实施例中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的一、二、三、四个以上扩增步骤之后收集TIL。在一些实施例中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的两个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施例中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的两个扩增步骤(一个起始第一扩增和一个快速第二扩增)之后收集TIL。
TIL可以任何适当且无菌的方式收集，包括例如离心。收集TIL的方法为本领域中熟知的且任何此类已知方法均可与本发明过程一起使用。在一些实施例中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如费森尤斯卡比(Fresenius Kabi)、Tomtec Life Science、珀金埃尔默(Perkin Elmer)和InotechBiosystems International,Inc.。本发明的方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施例中，细胞收集器和/或细胞处理系统为基于膜的细胞收集器。在一些实施例中，细胞收集通过细胞处理系统，例如LOVO系统(由费森尤斯卡比制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动和细胞处理以移除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施例中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施例中，快速第二扩增(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施例中，采用密闭系统进行如本文所述的TIL扩增。在一些实施例中，采用生物反应器。在一些实施例中，采用生物反应器作为容器。在一些实施例中，所采用的生物反应器为例如G-REX-100或G-REX-500。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-100。在一些实施例中，所采用的生物反应器为G-REX-500。
在一些实施例中，根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤E系根据本文所述的过程进行。在一些实施例中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施例中，采用如本文所述的密闭系统。
在一些实施例中，根据本文所述的方法收集TIL。在一些实施例中，使用如本文所述的方法收集第14与16天之间的TIL。在一些实施例中，使用如本文所述的方法在第14天收集TIL。在一些实施例中，使用如本文所述的方法在第15天收集TIL。在一些实施例中，使用如本文所述的方法在第16天收集TIL。
F.步骤F：最终配制和转移至输注容器
在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中以示例性顺序提供且如上文和本文所述的步骤A至E完成之后，将细胞转移至容器中以用于向患者施用，例如输注袋或无菌小瓶。在一些实施例中，一旦使用上文所描述的扩增方法获得治疗足够数目的TIL后，将其转移至容器以用于向患者施用。
在一些实施例中，使用本公开的方法扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一些实施例中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。如本文所公开的扩增的TIL可通过如本领域中已知的任何合适途径施用。在一些实施例中，TIL以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
VIII.其他Gen 2、Gen 3和其他TIL制造过程实施例
A.PBMC饲养细胞比率
在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法(参见例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D))的培养基包括抗CD3抗体，例如OKT-3。抗CD3抗体与IL-2的组合在TIL群体中诱导T细胞活化和细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab和F(ab')2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人,《免疫学杂志》1985,135,1719，特此以全文引用的方式并入。
在一些实施例中，PBMC饲养细胞层的数目如下计算：
A.T细胞体积(直径10μm)：V＝(4/3)πr3＝523.6μm3
B.具有40μm(4个细胞)高度的G-REX-100(M)体积：V＝(4/3)πr3＝4×1012μm3
C.填满体积B所需的细胞数目：4×1012μm3/523.6μm3＝7.6×108μm3*0.64＝4.86×108
D.可在4D空间中经最佳活化的细胞数目：4.86×108/24＝20.25×106
E.外推至G-REX-500的饲养细胞和TIL数目：TIL：100×106和饲养细胞：2.5×109
在此计算中，使用在具有100cm2基底的圆柱体中提供TIL活化的二十面体几何学所需的单核细胞近似数目。计算导出的T细胞临界值活化的实验结果为约5×108，其与NCI实验资料密切相关，如Jin等人,《免疫疗法杂志》2012,35,283-292中所描述。在(C)中，乘数(0.64)是等效球体的随机填充密度，由Jaeger和Nagel，《科学》,1992,255,1523-3计算得出。在(D)中，除数24是4维空间中可接触类似物体的等效球体的数目或“牛顿数”，如Musin,《俄罗斯数学评论(Russ.Math.Surv.)》2003,58,794-795中所描述。
在一些实施例中，在起始第一扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞数目约为在快速第二扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞数目的一半。在某些实施例中，方法包括在相较于快速第二扩增的细胞培养基包含约50％较少抗原呈递细胞的细胞培养基中进行起始第一扩增。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞(APC)数目大于在起始第一扩增期间外源供应的APC数目。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约20:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率是刚好或约2:1。
在其他实施例中，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目与在起始第一扩增期间外源供应的APC数目的比率是刚好或约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施例中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目是刚好或约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目是刚好或约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC。
在其他实施例中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约1.5×108个APC至刚好或约3×108个APC的范围，在快速第二扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约4×108个APC至刚好或约7.5×108个APC的范围。
在其他实施例中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约2×108个APC至刚好或约2.5×108个APC的范围，并在快速第二扩增期间外源供应的APC数目选自刚好或约4.5×108个APC至刚好或约5.5×108个APC的范围。
在其他实施例中，在起始第一扩增期间外源供应的APC数目是刚好或约2.5×108个APC，并在快速第二扩增期间外源供应的APC数目是刚好或约5×108个APC。
在一些实施例中，在起始第一扩增第0天添加的APC(包括例如PBMC)数目在起始第一扩增第7天(例如方法的第7天)添加的PBMC数目的约一半。在某些实施例中，方法包括在起始第一扩增第0天添加抗原呈递细胞至第一TIL群体并在第7天添加抗原呈递细胞至第二TIL群体，其中，在第0天添加的抗原呈递细胞的数目在起始第一扩增第7天(例如方法的第7天)添加的抗原呈递细胞数目的约50％。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目大于在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约2×106个APC/cm2至刚好或约3×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以刚好或约2×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以刚好或约1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106或4.5×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6.0×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增外源供应的APC以刚好或约2.5×106个APC/cm2、2.6×106个APC/cm2、2.7×106个APC/cm2、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106、4.5×106、4.6×106、4.7×106、4.8×106、4.9×106、5×106、5.1×106、5.2×106、5.3×106、5.4×106、5.5×106、5.6×106、5.7×106、5.8×106、5.9×106、6×106、6.1×106、6.2×106、6.3×106、6.4×106、6.5×106、6.6×106、6.7×106、6.8×106、6.9×106、7×106、7.1×106、7.2×106、7.3×106、7.4×106或7.5×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以刚好或约1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106或4.5×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中，在快速第二扩增外源供应的APC以刚好或约2.5×106个APC/cm2、2.6×106个APC/cm2、2.7×106个APC/cm2、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106、4.5×106、4.6×106、4.7×106、4.8×106、4.9×106、5×106、5.1×106、5.2×106、5.3×106、5.4×106、5.5×106、5.6×106、5.7×106、5.8×106、5.9×106、6×106、6.1×106、6.2×106、6.3×106、6.4×106、6.5×106、6.6×106、6.7×106、6.8×106、6.9×106、7×106、7.1×106、7.2×106、7.3×106、7.4×106或7.5×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以选自刚好或约2×106个APC/cm2至刚好或约3×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中，在快速第二扩增外源供应的APC以选自刚好或约4×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2的范围的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在起始第一扩增外源供应的APC以刚好或约2×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中，在快速第二扩增外源供应的APC以刚好或约4×106个APC/cm2的密度接种在培养瓶中。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约20:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的PBMC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率是刚好或约2:1。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率是刚好或约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施例中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目是刚好或约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC(包括例如PBMC)，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目是刚好或约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC(包括例如PBMC)。
在其他实施例中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约1×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约3.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约3.5×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约1×109个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施例中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约1.5×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约3×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约4×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约7.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施例中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约2×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约2.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自刚好或约4.5×108个APC(包括例如PBMC)至刚好或约5.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围。
在其他实施例中，在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目是刚好或约2.5×108个APC(包括例如PBMC)，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目是刚好或约5×108个APC(包括例如PBMC)。
在一些实施例中，在起始第一扩增第0天添加的APC(包括例如PBMC)层数是在快速第二扩增第7天添加的APC(包括例如PBMC)层数的约一半。在某些实施例中，方法包括在起始第一扩增第0天添加抗原呈递细胞层至第一TIL群体并在第7天添加抗原呈递细胞层至第二TIL群体，其中，在第0天添加的抗原呈递细胞层的数目是在第7天添加的抗原呈递细胞层的数目的约50％。
在其他实施例中，在快速第二扩增第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数大于在起始第一扩增第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约4个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，且快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1个细胞层至刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约2个细胞层至刚好或约3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在平均厚度刚好或约1、2或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在平均厚度刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:10的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:8的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:7的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:6的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:5的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:4的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:3的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:2的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.2至刚好或约1:8的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.3至刚好或约1:7的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.4至刚好或约1:6的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.5至刚好或约1:5的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.6至刚好或约1:4的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.7至刚好或约1:3.5的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.8至刚好或约1:3的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.9至刚好或约1:2.5的范围。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率是刚好或约1:2。
在其他实施例中，起始第一扩增的第0天在具有等于第一APC(包括例如PBMC)层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，快速第二扩增的第7天在具有等于第二APC(包括例如PBMC)层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下进行，其中，第一APC(包括例如PBMC)层数与第二APC(包括例如PBMC)层数的比率选自刚好或约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些实施例中，起始第一扩增中的APC数目选自约1.0×106个APC/cm2至约4.5×106个APC/cm2的范围，快速第二扩增中的APC数目选自约2.5×106个APC/cm2至约7.5×106个APC/cm2的范围。
在一些实施例中，起始第一扩增中的APC数目选自约1.5×106个APC/cm2至约3.5×106个APC/cm2的范围，快速第二扩增中的APC数目选自约3.5×106个APC/cm2至约6.0×106个APC/cm2的范围。
在一些实施例中，起始第一扩增中的APC数目选自约2.0×106个APC/cm2至约3.0×106个APC/cm2的范围，快速第二扩增中的APC数目选自约4.0×106个APC/cm2至约5.5×106个APC/cm2的范围。
A.可选的细胞培养基组分
1.抗CD3抗体
在一些实施例中，用于本文所述的扩增方法(参见例如图1和图8(特别是例如图8B))的培养基包括抗CD3抗体。抗CD3抗体与IL-2的组合在TIL群体中诱导T细胞活化和细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab和F(ab')2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人,《免疫学杂志》1985,135,1719，特此以全文引用的方式并入。
如本领域技术人员将了解，一些合适的抗人CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆和单克隆抗体，包括(但不限于)鼠、人、灵长类动物、大鼠和犬科动物抗体。在一些实施例中，使用OKT3抗CD3抗体莫罗单抗(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil公司或加利福尼亚州奥本市的美天旎生物技术公司)。参见表1。
如本领域技术人员将了解，一些合适的抗人CD3抗体可用于本发明，包括来自各种哺乳动物的抗人CD3多克隆和单克隆抗体，包括(但不限于)鼠、人、灵长类动物、大鼠和犬科动物抗体。在一些实施例中，使用OKT3抗CD3抗体莫罗单抗(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil公司或加利福尼亚州奥本市的美天旎生物技术公司)。
2.4-1BB(CD137)激动剂
在一些实施例中，起始第一扩增和/或快速第二扩增的细胞培养基包含TNFRSF激动剂。在一些实施例中，TNFRSF激动剂为4-1BB(CD137)激动剂。4-1BB激动剂可为本领域已知的任何4-1BB结合分子。4-1BB结合分子可为能够与人或哺乳动物4-1BB结合的单克隆抗体或融合蛋白。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的免疫球蛋白重链。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可具有重链和轻链。如本文所使用，术语结合分子也包括抗体(包括全长抗体)；单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)；多克隆抗体；多特异性抗体(例如双特异性抗体)；人、人源化或嵌合抗体；以及抗体片段，例如Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、任何上述者的表位结合片段，以及与4-1BB结合的抗体的经工程改造形式，例如scFv分子。在一些实施例中，4-1BB激动剂为一种完全人抗体的抗原结合蛋白。在一些实施例中，4-1BB激动剂为一种人源化抗体的抗原结合蛋白。在一些实施例中，用于本发明所公开的方法和组合物中的4-1BB激动剂包括抗4-1BB抗体、人抗4-1BB抗体、小鼠抗4-1BB抗体、哺乳动物抗4-1BB抗体、单克隆抗4-1BB抗体、多克隆抗4-1BB抗体、嵌合抗4-1BB抗体、抗4-1BB阿德奈汀(adnectin)、抗4-1BB结构域抗体、单链抗4-1BB片段、重链抗4-1BB片段、轻链抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白，及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。已知激动性抗4-1BB抗体诱导强烈免疫反应。Lee等人,《公共科学图书馆·综合(PLOS One)》2013,8,e69677。在一些实施例中，4-1BB激动剂为激动性抗4-1BB人源化或完全人单克隆抗体(即，来源于单一细胞系的抗体)。在一些实施例中，4-1BB激动剂为EU-101(Eutilex Co.Ltd.)、乌图木单抗或乌瑞鲁单抗或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一些实施例中，4-1BB激动剂为乌图木单抗或乌瑞鲁单抗或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。
在一些实施例中，4-1BB激动剂或4-1BB结合分子也可为融合蛋白。在一些实施例中，相较于通常具有两个配体结合结构域的激动性单克隆抗体，多聚4-1BB激动剂，例如三聚或六聚4-1BB激动剂(具有三个或六个配体结合结构域)可诱导优良受体(4-1BBL)聚类和内部细胞信号复合体形成。包含三个TNFRSF结合结构域和IgG1-Fc且可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白的三聚(三价)或六聚(或六价)或更大融合蛋白描述于例如Gieffers等人,《分子癌症治疗学(Mol.Cancer Therapeutics)》2013,12,2735-47中。
已知激动性4-1BB抗体和融合蛋白诱导强烈免疫反应。在一些实施例中，4-1BB激动剂是以足以减少毒性的方式与4-1BB抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(例如NK细胞细胞毒性)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，4-1BB激动剂是消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，4-1BB激动剂是消除Fc区功能性的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施例中，4-1BB激动剂的特征在于以高亲和力和激动活性与人4-1BB(SEQIDNO：40)结合。在一些实施例中，4-1BB激动剂为与人4-1BB(SEQ ID NO：40)结合的结合分子。在一些实施例中，4-1BB激动剂为与鼠4-1BB(SEQ ID NO：41)结合的结合分子。4-1BB激动剂或结合分子所结合的4-1BB抗原的氨基酸序列概述于表13中。
表13：4-1BB抗原的氨基酸序列。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约100pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约90pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约80pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约70pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约60pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约50pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、以约40pM以下的KD结合人或鼠4-1BB、或以约30pM以下的KD结合人或鼠4-1BB。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约8×105l/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合、或以约1×1061/M·s或更快的kassoc与人或鼠4-1BB结合。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.3×10-51/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、或以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.8×10-51/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合、或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠4-1BB结合。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程和方法包括4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约10nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约9nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约8nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约7nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约6nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约5nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约4nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约3nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、以约2nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合、或以约1nM以下的IC50与人或鼠4-1BB结合。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为乌图木单抗(也称为PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌图木单抗可购自辉瑞公司(Pfizer,Inc.)。乌图木单抗为免疫球蛋白G2-λ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(完全人)单克隆抗体。乌图木单抗的氨基酸序列阐述于表14中。乌图木单抗包含位于Asn59和Asn292的糖基化位点；位于位置22-96(VH-VL)、143-199(CH1-CL)、256-316(CH2)和362-420(CH3)的重链链内二硫键；位于位置22'-87'(VH-VL)和136'-195'(CH1-CL)的轻链链内二硫键；位于IgG2A异构体位置218-218、219-219、222-222和225-225、位于IgG2A/B异构体位置218-130、219-219、222-222和225-225和位于IgG2B异构体位置219-130(2)、222-222和225-225的链间重链-重链二硫键；以及位于IgG2A异构体位置130-213'(2)、IgG2A/B异构体位置218-213'和130-213'和位于IgG2B异构体位置218-213'(2)的链间重链-轻链二硫键。乌图木单抗及其变体及片段的制备和性质描述于美国专利第8,821,867、8,337,850和9,468,678号和国际专利申请公开第WO 2012/032433 A1号中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。乌图木单抗的临床前特征描述于Fisher等人,《癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunolog.&Immunother.)》2012,61,1721-33中。目前乌图木单抗在多种血液和实体肿瘤适应症的临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066和NCT02554812。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含SEQ ID NO：42所示的重链和SEQ ID NO：43所示的轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含乌图木单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：44所示的序列，且4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：45所示的序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少99％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少98％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少97％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少96％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少95％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含：包含VH和VL区的scFv抗体，这些区各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45中所示序列具有至少99％同一性。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQID NO：48中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为药物管理机构参考乌图木单抗批准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，该4-1BB抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其与该参考药品或参考生物产品相比包含一个以上翻译后修饰，参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中4-1BB激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为乌图木单抗。
表14；与乌图木单抗相关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为单克隆抗体乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513和20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌瑞鲁单抗可购自百时美施贵宝公司和Creative Biolabs,Inc.。乌瑞鲁单抗为免疫球蛋白G4-κ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(完全人)单克隆抗体。乌瑞鲁单抗的氨基酸序列阐述于表15中。乌瑞鲁单抗包含位于位置298(和298”)的N-糖基化位点；位于位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、262-322(CH2)和368-426(CH3)(和位于位置22”-95”、148”-204”、262”-322”和368”-426”)的重链链内二硫键；位于位置23'-88'(VH-VL)和136'-196'(CH1-CL)(和位于位置23”'-88”'和136”'-196”')的轻链链内二硫键；位于位置227-227”和230-230”的链间重链-重链二硫键；和位于135-216'和135”-216”'的链间重链-轻链二硫键。乌瑞鲁单抗及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利第7,288,638和8,962,804号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。乌瑞鲁单抗的临床前和临床特征描述于Segal等人,《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》2016,请访问http:/dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前乌瑞鲁单抗在多种血液和实体肿瘤适应症的临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992和NCT01471210。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含SEQ ID NO：52所示的重链和SEQ ID NO：53所示的轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含乌瑞鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：54所示的序列，且4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：55所示的序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少99％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少98％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少97％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少96％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含VH和VL区，其各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少95％同一性。在一些实施例中，4-1BB激动剂包含有包含VH和VL区的scFv抗体，这些区各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55中所示序列具有至少99％同一性。
在一些实施例中，4-1BB激动剂包含分别具有SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57和SEQID NO：58中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为药物管理机构参考乌瑞鲁单抗批准的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含4-1BB抗体，该4-1BB抗体包含与参考药品或参考生物学产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中4-1BB激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为乌瑞鲁单抗。
表15：与乌瑞鲁单抗相关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施例中，4-1BB激动剂选自：1D8、3Elor、4B4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(赛默飞世尔MS621PABX)、145501(LeincoTechnologies B591)、通过保存为ATCC第HB-11248号的细胞系产生且美国专利第6,974,863号中公开的抗体、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen 559446)、美国专利申请公开第US2005/0095244号中公开的抗体、美国专利第7,288,638号中公开的抗体(例如20H4.9-IgGl(BMS-663031))、美国专利第6,887,673号中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利第7,214,493号中公开的抗体、美国专利第6,303,121号中公开的抗体、美国专利第6,569,997号中公开的抗体、美国专利第6,905,685号中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利第6,362,325号中公开的抗体(例如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、美国专利第6,974,863号中公开的抗体(例如53A2)；美国专利第6,210,669号中公开的抗体(例如1D8、3B8或3El)、美国专利第5,928,893号中描述的抗体、美国专利第6,303,121号中公开的抗体、美国专利第6,569,997号中公开的抗体、国际专利申请公开第WO 2012/177788、WO 2015/119923和WO 2010/042433号中公开的抗体，及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物，其中前述专利或专利申请公开中的每一者的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为以下中描述的4-1BB激动融合蛋白：国际专利申请公开第WO 2008/025516 A1号、第WO 2009/007120 A1号、第WO 2010/003766 A1号、第WO2010/010051A1号和第WO 2010/078966A1号；美国专利申请公开第US2011/0027218A1号、第US2015/0126709 A1号、第US2011/0111494 A1号、第US2015/0110734 A1号和第US2015/0126710 A1号；和美国专利第9,359,420号、第9,340,599,8,921,519号和第8,450,460号，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为如结构I-A(C末端Fc抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N末端Fc抗体片段融合蛋白)中所描绘的4-1BB激动融合蛋白，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物(参见图18)。在结构I-A和I-B中，圆柱指单独多肽结合结构域。结构I-A和I-B包含三个线性连接的TNFRSF结合结构域，该TNFRSF结合结构域来源于例如4-1BBL(4-1BB配体、CD137配体(CD137L)或肿瘤坏死因子超家族成员9(TNFSF9)或结合4-1BB的抗体，该TNFRSF结合结构域折叠以形成三价蛋白，然后该三价蛋白通过IgG1-Fc(包括CH3和CH2域)与第二三价蛋白连接，随后该IgG1-Fc用于通过二硫键(细长小椭圆)将两个三价蛋白连接在一起，从而使结构稳定且提供能够将六个受体的细胞内信号结构域放在一起且信号蛋白以形成信号复合体的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合结构域可为包含例如由接头连接的VH和VL链的scFv结构域，该接头可包含亲水性残基和提供柔性的Gly与Ser序列以及提供溶解性的Glu与Lys。可使用任何scFv结构域设计，例如以下中描述的那些scFv结构域：deMarco,《微生物细胞工厂(Microbial Cell Factories)》,2011,10,44；Ahmad等人,《临床和发育免疫学(Clin.&Dev.Immunol.)》2012,980250；Monnier等人,《抗体(Antibodies)》,2013,2,193-208；或本文中别处并入的参考文献。此形式的融合蛋白结构描述于美国专利第9,359,420号、第9,340,599号、第8,921,519号和第8,450,460号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
图18中给出的结构I-A的其他多肽结构域的氨基酸序列见于表16中。Fc结构域优选包含完整恒定结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸17-230)、完整铰链结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO：62的氨基酸4-16)。用于连接C末端Fc抗体的优选的接头可选自SEQ ID NO：63至SEQ ID NO：72中所示的实施例，包括适合于融合其他多肽的接头。
表16：具有C末端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-A)的TNFRSF激动剂融合蛋白(包括4-1BB激动剂融合蛋白)的氨基酸序列
图18中给出的结构I-B的其他多肽结构域的氨基酸序列见于表17中。若Fc抗体片段如在结构I-B中与TNRFSF融合蛋白的N末端融合，则Fc模块的序列优选为SEQ ID NO：73中所示的序列，接头序列优选选自SED ID NO:74至SEQ ID NO：76中所示的那些实施例。
表17：具有N末端Fc-抗体片段融合蛋白设计(结构I-B)的TNFRSF激动剂融合蛋白(包括4-1BB激动剂融合蛋白)的氨基酸序列。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上选自如下的4-1BB结合结构域：乌图木单抗的可变重链和可变轻链、乌瑞鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌图木单抗的可变重链和可变轻链、选自表18中所描述的可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、前述可变重链和可变轻链的任何组合，以及其片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上含有4-1BBL序列的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包含根据SEQ ID NO：77的序列的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上含有可溶性4-1BBL序列的4-1BB结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上包含根据SEQ ID NO：78的序列的4-1BB结合结构域。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该一个以上4-1BB结合结构域为包含各自分别与SEQ ID NO：44和SEQ IDNO：45所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区的scFv结构域，VH和VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该一个以上4-1BB结合结构域为包含各自分别与SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区的scFv结构域，VH和VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包含一个以上4-1BB结合结构域，该一个以上4-1BB结合结构域为包含各自与表18中给出的VH和VL序列具有至少95％同一性的VH和VL区的scFv结构域，VH和VL域由接头连接。
表18：适合用作融合蛋白中的4-1BB结合结构域或适合用作scFv 4-1BB激动剂抗体的其他多肽结构域
在一些实施例中，4-1BB激动剂为4-1BB激动单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性4-1BB结合结构域，(ii)第一肽接头，(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域，(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，进一步包含在N末端和/或C末端的另外结构域，其中，该另外结构域为Fab或Fc片段结构域。在一些实施例中，4-1BB激动剂为4-1BB激动单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB结合结构域，(ii)第一肽接头，(iii)第二可溶性4-1BB结合结构域，(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性4-1BB结合结构域，进一步包含在N末端和/或C末端的另外结构域，其中，该另外结构域为Fab或Fc片段域，其中，各可溶性4-1BB结构域缺乏茎区(其促成三聚作用且提供距离细胞膜的某一距离，但不是4-1BB结合结构域的一部分)，第一和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为4-1BB激动单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域，(ii)第一肽接头，(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域，(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子结构域，其中，各可溶性TNF超家族细胞因子结构域缺乏茎区且该第一和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度，各TNF超家族细胞因子结构域为4-1BB结合结构域。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为4-1BB激动scFv抗体，其包含与任一前述VL结构域连接的任一前述VH结构域。
在一些实施例中，4-1BB激动剂为BPS Bioscience 4-1BB激动剂抗体，目录号79097-2，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BPS Bioscience。在一些实施例中，4-1BB激动剂为Creative Biolabs 4-1BB激动剂抗体，目录号MOM-18179，可购自美国纽约州雪利市的Creative Biolabs。
3.OX40(CD134)激动剂
在一些实施例中，TNFRSF激动剂为OX40(CD134)激动剂。OX40激动剂可为本领域已知的任何OX40结合分子。OX40结合分子可以为能够与人或哺乳动物OX40结合的单克隆抗体或融合蛋白。OX40激动剂或OX40结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的免疫球蛋白重链。OX40激动剂或OX40结合分子可具有重链和轻链。如本文所用，术语结合分子还包括抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化或嵌合抗体和抗体片段，例如Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、任一上述的表位-结合片段和与OX40结合的抗体的经工程改造形式，例如scFv分子。在一些实施例中，OX40激动剂是一种完全人抗体的抗原结合蛋白。在一些实施例中，OX40激动剂是一种人源化抗体的抗原结合蛋白。在一些实施例中，用于本公开方法和组合物中的OX40激动剂包括抗OX40抗体、人抗OX40抗体、小鼠抗OX40抗体、哺乳动物抗OX40抗体、单克隆抗OX40抗体、多克隆抗OX40抗体、嵌合抗OX40抗体、抗OX40阿德奈汀、抗OX40结构域抗体、单链抗OX40片段、重链抗OX40片段、轻链抗OX40片段、抗OX40融合蛋白，及其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一些实施例中，OX40激动剂为激动性抗OX40人源化或完全人单克隆抗体(即，源自单个细胞系的抗体)。
在一些实施例中，OX40激动剂或OX40结合分子也可为融合蛋白。包含与OX40L融合的Fc结构域的OX40融合蛋白描述于例如Sadun等人,《免疫疗法杂志》2009,182,1481-89。在一些实施例中，相较于通常具有两个配体结合结构域的激动性单克隆抗体，多聚OX40激动剂，例如三聚或六聚OX40激动剂(具有三个或六个配体结合结构域)可诱导优良受体(OX40L)聚类和内部细胞信号复合体形成。包含三个TNFRSF结合结构域和IgG1-Fc且可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白的三聚(三价)或六聚(或六价)以上融合蛋白描述于例如Gieffers等人,《分子癌症治疗学》2013,12,2735-47中。
已知激动性OX40抗体和融合蛋白可诱导强烈免疫反应。Curti等人,《癌症研究》2013,73,7189-98。在一些实施例中，OX40激动剂为以足够减少毒性的方式与OX40抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，OX40激动剂为消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，例如NK细胞细胞毒性的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，OX40激动剂为消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，OX40激动剂为消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施例中，OX40激动剂为消除Fc区功能的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施例中，OX40激动剂的特征在于以高亲和力和激动性活性与人OX40(SEQID NO：85)结合。在一些实施例中，OX40激动剂为与人OX40(SEQ ID NO：85)结合的结合分子。在一些实施例中，OX40激动剂为与鼠OX40(SEQ ID NO：86)结合的结合分子。表19中概述与OX40激动剂或结合分子结合的OX40抗原的氨基酸序列。
表19：OX40抗原的氨基酸序列
在一些实施例中，所描述的组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约100pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约90pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约80pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约70pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约60pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约50pM以下的KD结合人或鼠OX40、以约40pM以下的KD结合人或鼠OX40或以约30pM以下的KD结合人或鼠OX40。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约8×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合或以约1×1061/M·s或更快的kassoc与人或鼠OX40结合。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc与与人或鼠OX40结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.3×10-51/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.8×10-51/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人或鼠OX40结合。
在一些实施例中，所描述的组合物、过程和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约10nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约9nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约8nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约7nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约6nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约5nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约4nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约3nM以下的IC50与人或鼠OX40结合、以约2nM以下的IC50与人或鼠OX40结合或以约1nM以下的IC50与人或鼠OX40结合。
在一些实施例中，OX40激动剂为塔沃西单抗，也称为MEDI0562或MEDI-0562。塔沃西单抗可获自阿斯利康公司(AstraZeneca，Inc.)的医学免疫(MedImmune)子公司。塔沃西单抗为免疫球蛋白G1-κ抗[智人TNFRSF4(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员4，OX40，CD134)]人源化和嵌合单克隆抗体。塔沃西单抗的氨基酸序列阐述于表20中。塔沃西单抗包含在位置301和301”处的N-糖基化位点，具有岩藻糖基化复合体二触角CHO型聚糖；在位置22-95(VH-VL)、148-204((CH1-CL)、265-325(CH2)和371-429(CH3)处(和在位置22”-95”、148”-204”、265”-325”和371”-429”处)的重链链内二硫键；在位置23'-88'(VH-VL)和134'-194'(CH1-CL)处(和在位置23”'-88”'和134”'-194”'处)的轻链链内二硫键；在位置230-230”和233-233”处的链间重链-重链二硫键；以及在224-214'和224”-214”'处的链间重链-轻链二硫键。塔沃西单抗在各种实体肿瘤适应症中的当前临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT02318394和NCT02705482。
在一些实施例中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：87所示的重链和SEQ ID NO：88所示的轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，OX40激动剂包含塔沃西单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：89中所示序列，且OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：90中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含scFv抗体，该scFv抗体包含各自分别与SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。
在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92和SEQID NO：93中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为药物管理机构参考塔沃西单抗批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为塔沃西单抗。
表20：与塔沃西单抗相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施例中，OX40激动剂为11D4，其为可获自辉瑞公司的完全人抗体。11D4的制备和特性描述于美国专利第7,960,515号、第8,236,930号和第9,028,824号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。11D4的氨基酸序列阐述于表21中。
在一些实施例中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：97所示的重链和SEQ ID NO：98所示的轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：98中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，OX40激动剂包含11D4的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：99中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：100中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ IDNO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102和SEQID NO：103中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为药物管理机构参考11D4批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为11D4。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一者种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为11D4。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为11D4。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为11D4。
表21：与11D4相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列
在一些实施例中，OX40激动剂为18D8，其为可获自辉瑞公司的完全人抗体。18D8的制备和特性描述于美国专利第7,960,515号、第8,236,930号和第9,028,824号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。18D8的氨基酸序列阐述于表22中。
在一些实施例中，OX40激动剂包含SEQ ID NO：107所示的重链和SEQ ID NO：108所示的轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107和SEQID NO：108中所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108中所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，OX40激动剂包含18D8的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：109中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：110中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110中所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110中所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110中所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQID NO：110中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112和SEQID NO：113中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为药物管理机构参考18D8批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为18D8。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为18D8。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为18D8。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为18D8。
表22：与18D8相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施例中，OX40激动剂为Hu119-122，其为可获自葛兰素史克公共有限公司(GlaxoSmithKline plc)的人源化抗体。Hu119-122的制备和特性描述于美国专利第9,006,399号和第9,163,085号以及国际专利公开第WO 2012/027328号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。Hu119-122的氨基酸序列阐述于表23中。
在一些实施例中，OX40激动剂包含Hu119-122的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：117中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：118中所示序列及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118中所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118中所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118中所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：117和SEQID NO：118中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120和SEQID NO：121中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：124中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为药物管理机构参考Hu119-122批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为Hu119-122。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为Hu119-122。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为Hu119-122。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为Hu119-122。
表23：与Hu119-122相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施例中，OX40激动剂为Hu106-222，其为可获自葛兰素史克共有有限公司的人源化抗体。Hu106-222的制备和特性描述于美国专利第9,006,399号和第9,163,085号以及国际专利公开第WO 2012/027328号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。Hu106-222的氨基酸序列阐述于表24中。
在一些实施例中，OX40激动剂包含Hu106-222的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，OX40激动剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：125中所示序列，OX40激动剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：126中所示序列，及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ IDNO：126中所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一些实施例中，OX40激动剂包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一些实施例中，OX40激动剂包含分别具有SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128和SEQID NO：129中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：132中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为药物管理机构参考Hu106-222批准的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物单克隆抗体包含OX40抗体，该OX40抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为Hu106-222。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为Hu106-222。OX40激动剂抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为Hu106-222。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为Hu106-222。
表24：与Hu106-222相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施例中，OX40激动剂抗体为MEDI6469(也称为9B12)。MEDI6469为鼠单克隆抗体。Weinberg等人,《免疫疗法杂志》2006,29,575-585。在一些实施例中，OX40激动剂为由9B12杂交瘤产生，由Biovest Inc.(美国马萨诸塞州马尔文(Malvern,MA,USA))保存的抗体，如Weinberg等人,《免疫疗法杂志》2006,29,575-585中所描述，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗体包含MEDI6469的CDR序列。在一些实施例中，抗体包含MEDI6469的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一些实施例中，OX40激动剂为L106 BD(Pharmingen，产品号340420)。在一些实施例中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen，产品号340420)的CDR。在一些实施例中，OX40激动剂包含抗体L106(BD Pharmingen，产品号340420)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一些实施例中，OX40激动剂为ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)。在一些实施例中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)的CDR。在一些实施例中，OX40激动剂包含抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一些实施例中，OX40激动剂为鼠单克隆抗体抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，可购自新罕布什尔州西黎巴嫩的BioXcell Inc的InVivoMAb。
在一些实施例中，OX40激动剂选自以下中描述的OX40激动剂：国际专利申请公开第WO 95/12673号、第WO 95/21925号、第WO 2006/121810号、第WO 2012/027328号、第WO2013/028231号、第WO 2013/038191号和第WO 2014/148895号；欧洲专利申请EP 0672141；美国专利申请公开第US2010/136030号、第US2014/377284号、第US 2015/190506号和第US2015/132288号(包括克隆20E5和12H3)；和美国专利第7,504,101号、第7,550,140号、第7,622,444号、第7,696,175号、第7,960,515号、第7,961,515号、第8,133,983号、第9,006,399号和第9,163,085号，它们各自的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，OX40激动剂为如结构I-A(C末端Fc-抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N末端Fc-抗体片段融合蛋白)中所描绘的OX40激动性融合蛋白，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。结构I-A和I-B的特性已在上文和美国专利第9,359,420号、第9,340,599号、第8,921,519号和第8,450,460号中描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。图18中给出的结构I-A的多肽结构域的氨基酸序列见于表16中。Fc结构域优选包含完整恒定结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸17-230)、完整铰链结构域(SEQ ID NO：62的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO：62的氨基酸4-16)。用于连接C末端Fc抗体的优选的接头可选自SEQ ID NO：63至SEQ ID NO：72中所示的实施例，包括适合于融合其他多肽的接头。同样，图18中给出的结构I-B的多肽结构域的氨基酸序列见于表17中。若Fc抗体片段如在结构I-B中与TNRFSF融合蛋白的N末端融合，则Fc模块的序列优选为SEQ ID NO：73中所示的序列，且接头序列优选选自SED ID NO:74至SEQ ID NO：76中所示的那些实施例。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上选自如下的OX40结合结构域：塔沃西单抗的可变重链和可变轻链、11D4的可变重链和可变轻链、18D8的可变重链和可变轻链、Hu119-122的可变重链和可变轻链、Hu106-222的可变重链和可变轻链、选自表25中描述的可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、前述的可变重链和可变轻链的任何组合，以及其片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上含有OX40L序列的OX40结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上含有根据SEQ ID NO：133的序列的OX40结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上含有可溶性OX40L序列的OX40结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上含有根据SEQID NO：134的序列的OX40结合结构域。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上含有根据SEQ ID NO：135的序列的OX40结合结构域。
在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQID NO：89和SEQ ID NO：90中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：100中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自分别与SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126中所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一些实施例中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包含一个以上OX40结合结构域，该一个以上OX40结合结构域为scFv结构域，该scFv结构域包含各自与表25中所提供的VH和VL序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。
表25：适合用作融合蛋白(例如结构I-A和I-B)中的OX40结合结构域或适合用作scFv OX40激动剂抗体的其他多肽结构域
在一些实施例中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性OX40结合结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性OX40结合结构域；(iv)第二肽接头；和(v)第三可溶性OX40结合结构域，其进一步包含在N末端和/或C末端处的另外结构域，且其中，该另外结构域为Fab或Fc片段结构域。在一些实施例中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性OX40结合结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性OX40结合结构域；(iv)第二肽接头；和(v)第三可溶性OX40结合结构域，其进一步包含在N末端和/或C末端处之另外结构域，其中，该另外结构域为Fab或Fc片段结构域，其中各可溶性OX40结合结构域缺乏茎区(其促成三聚作用且提供距离细胞膜的某一距离，但不为OX40结合结构域的一部分)，该第一和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度。
在一些实施例中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包含：(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子结构域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子结构域；(iv)第二肽接头；和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子域，其中各可溶性TNF超家族细胞因子结构域缺乏茎区，该第一和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度，其中TNF超家族细胞因子结构域为OX40结合结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为MEDI6383。MEDI6383为OX40激动性融合蛋白且可如美国专利第6,312,700号中所描述来制备，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，OX40激动剂为OX40激动性scFv抗体，其包含与任一前述VL结构域连接的任一前述VH结构域。
在一些实施例中，OX40激动剂为Creative Biolabs OX40激动剂单克隆抗体MOM-18455，可购自美国纽约州雪利市的Creative Biolabs，Inc.。
在一些实施例中，OX40激动剂为OX40激动性抗体克隆Ber-ACT35，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend,Inc.。
B.可选的细胞存活率分析
可选地，在起始第一扩增(有时称为初始主体扩增(initial bulk expansion))之后，可使用本领域已知的标准分析进行细胞存活率分析。因此，在某些实施例中，方法包括在起始第一扩增之后进行细胞存活率分析。例如，可对主体TIL样本进行台盼蓝排除分析，其选择性标记死细胞且允许存活率评定。其他用于测试存活率的分析可包括(但不限于)阿尔玛蓝(Alamar blue)分析和MTT分析。
1.细胞计数、存活率、流式细胞术
在一些实施例中，测量细胞计数和/或存活率。标记物(例如但不限于CD3、CD4、CD8和CD56以及本文所公开或描述的任何其他标记物)的表达可通过流式细胞术，使用FACSCantoTM流动式细胞仪(碧迪生物科学(BD Biosciences))，用抗体，例如(但不限于)可购自碧迪生物科学的那些(碧迪生物科学，加利福尼亚州圣荷西)来测量。细胞可使用一次性c-芯片血细胞计数器(VWR，伊利诺伊州巴达维亚)手动计算，存活率可使用本领域中已知的任何方法，包括(但不限于)台盼蓝染色评定。也可基于以全文引用的方式并入本文中的美国专利申请公开第2018/0282694号分析细胞存活率。也可基于美国专利申请公开第2018/0280436号或国际专利申请公开第WO/2018/081473号分析细胞存活率，其均出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在一些情况下，主体TIL群体可使用下文论述的方案立即冷冻保存。替代地，主体TIL群体可进行REP，然后如下文所述冷冻保存。类似地，在其中基因修饰的TIL将用于疗法中的情况下，主体或REP TIL群体可进行基因修饰以用于合适治疗。
2.细胞培养
在一些实施例中，用于扩增TIL的方法(包括上文所述以及图1和图8，特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D中示例的那些方法)可包括使用约5,000mL至约25,000mL细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL细胞培养基或约5,800mL至约8,700mL细胞培养基。在一些实施例中，培养基为不含血清培养基。在一些实施例中，起始第一扩增中的培养基不含血清。在一些实施例中，第二扩增中的培养基不含血清。在一些实施例中，起始第一扩增和第二扩增(也称为快速第二扩增)中的培养基均不含血清。在一些实施例中，扩增TIL数目使用不超过一种类型的细胞培养基。可使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM链霉素硫酸盐和10μM庆大霉素硫酸盐)细胞培养基(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州喀斯巴德。就此而言，本发明方法有利地减少扩增TIL数目所需的培养基的量和培养基类型的数目。在一些实施例中，扩增TIL数目可包含频繁性不超过每三或四天一次地喂养细胞。在透气容器中扩增细胞数目通过减少扩增细胞所需的喂养频率，简化扩增细胞数目所需的程序。
在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一些实施例中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME)。
在一些实施例中，方法期间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样本；在第一透气容器中培养肿瘤组织样本持续约1至8天的时间段，例如约7天作为起始第一扩增，约8天作为起始第一扩增，第一透气容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器并在第二透气容器中扩增TIL数目持续约7至9天(例如约7天、约8天或约9天)的时间段，第二透气容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施例中，方法期间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样本；在第一透气容器中培养肿瘤组织样本持续约1至7天(例如约7天)的时间段作为起始第一扩增，第一透气容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器并在第二透气容器中扩增TIL数目持续约7至14天或约7至9天(例如约7天、约8天、约9天、约10天或约11天)的时间段，第二透气容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施例中，方法期间包含获得来自哺乳动物的肿瘤组织样本；在第一透气容器中培养肿瘤组织样本持续约1至7天(例如约7天)的时间段作为起始第一扩增，第一透气容器含有包括IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器并在第二透气容器中扩增TIL数目持续约7至11天(例如约7天、约8天、约9天、约10天或约11天)的时间段，第二透气容器含有包括IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施例中，TIL在透气容器中扩增。已使用透气容器来扩增TIL，使用PBMC，使用本领域中已知的方法、组合物和装置，包括美国专利申请公开第2005/0106717A1号中描述的那些，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，TIL在透气袋中扩增。在一些实施例中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统(例如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare))扩增。在一些实施例中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统(例如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare))扩增。在一些实施例中，细胞扩增系统包括透气细胞袋，该透气细胞袋的容积选自如下：约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L。
在一些实施例中，TIL可在G-REX培养瓶(可购自威尔逊狼制造公司)中扩增。此类实施例允许细胞群体自约5×105个细胞/cm2扩增至在10×106与30×106个细胞/cm2之间。在一些实施例中，其为未进行喂养。在一些实施例中，其为未进行喂养，只要G-REX培养瓶中的培养基位于约10cm的高度。在一些实施例中，其为未进行喂养但添加一种以上细胞因子。在一些实施例中，细胞因子可以以推注添加，不需要将细胞因子与培养基混合。此类容器、装置和方法为本领域已知的且已用于扩增TIL，包括以下中描述的那些：美国专利申请公开第US2014/0377739A1号、国际公开第WO 2014/210036 A1号、美国专利申请公开第us 2013/0115617A1号、国际公开第WO 2013/188427 A1号、美国专利申请公开第US2011/0136228 A1号、美国专利第US 8,809,050 B2号、国际公开第WO 2011/072088 A2号、美国专利申请公开第US2016/0208216 A1号、美国专利申请公开第US2012/0244133 A1号、国际公开第WO2012/129201 A1号、美国专利申请公开第US2013/0102075 A1号、美国专利第US 8,956,860B2号、国际公开第WO 2013/173835 A1号、美国专利申请公开第US 2015/0175966A1号，其公开内容以引用的方式并入本文中。此类过程也描述于Jin等人,《免疫疗法杂志》,2012,35:283-292中。
C.TIL中可选的基因敲减或基因敲除
在一些实施例中，本发明的经扩增的TIL在扩增步骤之前、期间或之后，包括在密闭无菌制造过程期间(各自如本文所提供)经进一步操作，以用瞬时方式改变蛋白质表达。在一些实施例中，瞬时改变的蛋白质表达是因为瞬时基因编辑。在一些实施例中，本发明的经扩增的TIL用转录因子(TF)和/或其他能够瞬时改变TIL中的蛋白质表达的分子处理。在一些实施例中，TF和/或其他能够瞬时改变蛋白质表达的分子提供TIL群体中改变的肿瘤抗原表达和/或改变肿瘤抗原特异性T细胞的数目。
在某些实施例中，方法包括基因编辑TIL群体。在某些实施例中，方法包括基因编辑第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。
在一些实施例中，本发明包括通过核苷酸插入，例如通过核糖核酸(RNA)插入，包括插入信使RNA(mRNA)或小(或短)干扰RNA(siRNA)至TIL群体中进行基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达或抑制一种以上蛋白质的表达以及同时促进一组蛋白质与抑制另一组蛋白质的组合。
在一些实施例中，本发明的经扩增的TIL经历瞬时改变蛋白质表达。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达在第一扩增之前的主体TIL群体，包括例如获自例如如图8(特别是图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤A的TIL群体中进行。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达在第一扩增期间，包括例如获自例如如图8(例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B的TIL群体中进行。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达在第一扩增之后，包括例如在第一与第二扩增之间转变的TIL群体(例如如本文所述的第二TIL群体)、获自例如如图8中所指示的步骤B且包括于步骤C中的TIL群体中进行。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达在第二扩增之前的主体TIL群体中，包括例如在获自例如如图8中所指示的步骤C并在步骤D中其扩增之前的TIL群体中进行。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达在第二扩增期间，包括例如在例如如图8中所指示的步骤D中扩增的TIL群体(例如第三TIL群体)中。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达在第二扩增之后，包括例如在获自例如如图8中所指示的步骤D中的扩增的TIL群体中进行。
在一些实施例中，瞬时改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法为本领域已知的，描述于例如如下中：Tsong,《生物物理学杂志》1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，瞬时改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包被和胞吞作用)为本领域已知的且描述于以下中：Graham和van der Eb,《病毒学(Virology)》1973,52,456-467；Wigler等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》1979,76,1373-1376；以及Chen和Okayarea,《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》1987,7,2745-2752；以及美国专利第5,593,875号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，瞬时改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用在过滤水中的阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域已知的且描述于如下中：Rose等人,《生物技术(Biotechniques)》1991,10,520-525以及Felgner等人,《美国国家科学院院刊》,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，瞬时改变TIL群体中的蛋白质表达的方法包括使用以下中描述的方法的转染步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致记忆干T细胞(TSCM)增加。TSCM为抗原经历中枢记忆T细胞的早期前驱细胞。TSCM一般呈现定义干细胞的长期存活、自我更新和多效能能力，且一般为产生有效TIL产物所需的。在过继性细胞转移的小鼠模型中，已显示TSCM与其他T细胞亚群相比增强的抗肿瘤活性。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致具有包含高比例的TSCM的组成的TIL群体。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TSCM百分比增加至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TIL群体中的TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致具有至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％TSCM的TIL群体。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致具有至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％ TSCM的治疗性TIL群体。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致抗原经历T细胞复苏(rejuvenation)。在一些实施例中，复苏包括例如增加增殖、增加T细胞活化和/或增加抗原识别。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达改变一大部分T细胞的表达，以保留肿瘤衍生的TCR贮库。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达不改变肿瘤衍生的TCR贮库。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达维持肿瘤衍生的TCR贮库。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质导致改变特定基因的表达。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向包括(但不限于)以下的基因：PD-1(也称为PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受体(CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2ICD、CTLA-4、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺细胞选择相关高迁移率组(HMG)盒(TOX)、锚蛋白重复结构域11(ANKRD11)、BCL6共抑制子(BCOR)和/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向选自如下的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CTLA-4、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受体(CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TET2、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、胸腺细胞选择相关高迁移率组(HMG)盒(TOX)、锚蛋白重复结构域11(ANKRD11)、BCL6共抑制子(BCOR)和/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向PD-1。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向TGFBR2。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR4/5。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CTLA-4。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CBLB。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CISH。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR(嵌合共刺激受体)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向IL-2。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向IL-12。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向IL-15。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向IL-21。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向NOTCH 1/2ICD。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向TIM3。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向LAG3。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向TIGIT。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向TET2。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向TGFβ。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR1。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR2。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR4。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCR5。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CXCR1。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CXCR2。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CSCR3。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL2(MCP-1)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL3(MIP-1α)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL4(MIP1-β)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL5(RANTES)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CXCL1。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CXCL8。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL22。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CCL17。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向VHL。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向CD44。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向PIK3CD。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向SOCS1。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向胸腺细胞选择相关高迁移率组(HMG)盒(TOX)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向锚蛋白重复结构域11(ANKRD11)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向BCL6辅抑制物(BCOR)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达靶向cAMP蛋白激酶A(PKA)。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致趋化因子受体增加和/或过度表达。在一些实施例中，因瞬时蛋白质表达而过度表达的趋化因子受体包括具有配体的受体，该配体包括(但不限于)CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22和/或CCL17。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1、CTLA-4、CBLB、CISH、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TET2、TGFβR2和/或TGFβ的表达降低和/或减少(包括导致例如TGFβ通路阻断)。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CBLB(CBL-B)的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CISH的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM-3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG-3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TGFβR2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TGFβ的表达降低和/或减少。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致趋化因子受体增加和/或过度表达，以例如改善TIL运输或运动至肿瘤部位。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致嵌合共刺激受体(CCR)增加和/或过度表达。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致选自如下的趋化因子受体增加和/或过度表达：CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2和/或CSCR3。.
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致白介素增加和/或过度表达。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致选自如下的白介素增加和/或过度表达：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致NOTCH 1/2ICD增加和/或过度表达。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致VHL增加和/或过度表达。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CD44增加和/或过度表达。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PIK3CD增加和/或过度表达。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致SOCS1的增加和/或过度表达。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致cAMP蛋白激酶A(PKA)的表达降低和/或减少。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致选自如下的分子的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致选自如下的两种分子的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和选自如下的一种分子的表达降低和/或减少：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致以下的表达降低和/或减少：PD-1、CTLA-4、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3、TIGIT和它们的组合。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和以下中的一者的表达降低和/或减少：CTLA-4、LAG3、CISH、CBLB、TIM3、TIGIT、TET2和它们的组合。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和CTLA-4的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致PD-1和TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CTLA-4和TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG3和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG3和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG3和TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG3和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致LAG3和TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CISH和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CISH和TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CISH和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CISH和TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CBLB和TIM3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CBLB和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致CBLB和TET2的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和PD-1的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和TIGIT的表达降低和/或减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致TIM3和TET2的表达降低和/或减少。
在一些实施例中，选自CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和它们的组合的粘附分子通过γ逆转录病毒或慢病毒方法插入第一TIL群体、第二TIL群体或所收集TIL群体中(例如粘附分子的表达增加)。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致选自PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合的分子的表达降低和/或减少，以及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和它们的组合的表达增加和/或增强。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达导致选自PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、CISH、CBLB、TIGIT、TET2和它们的组合的分子的表达降低和/或减少，和CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1和它们的组合的表达增加和/或增强。
在一些实施例中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约80％。在一些实施例中，表达减少至少约85％。在一些实施例中，表达减少至少约90％。在一些实施例中，表达减少至少约95％。在一些实施例中，表达减少至少约99％。
在一些实施例中，表达增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达增加至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达增加至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达增加至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达增加至少约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达增加至少约80％。在一些实施例中，表达增加至少约85％。在一些实施例中，表达增加至少约90％。在一些实施例中，表达增加至少约95％。在一些实施例中，表达增加至少约99％。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达通过用转录因子(TF)和/或其他能够瞬时改变TIL中的蛋白质表达的分子处理TIL来诱导。在一些实施例中，采用无SQZ载体的微流体平台进行转录因子(TF)和/或其他能够瞬时改变蛋白质表达的分子的细胞内递送。此类方法证明了将包括转录因子在内的蛋白递送至包括T细胞在内的多种初代人细胞的能力，其已描述于美国专利申请公开第US2019/0093073 A1号、第US2018/0201889 A1号和第US2019/0017072A1号中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。此类方法可用于本发明中，以将TIL群体暴露于转录因子(TF)和/或其他能够诱导瞬时蛋白质表达的分子，其中该TF和/或其他能够诱导瞬时蛋白质表达的分子提供TIL群体中的肿瘤抗原的表达增加和/或肿瘤抗原特异性T细胞的数目增加，从而导致TIL群体重新编程和重新编程TIL群体的治疗功效相较于非重新编程TIL群体增加。在一些实施例中，重新编程导致相对于开始或先前TIL群体(即，在重新编程之前)，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞亚群增加，如本文所述。
在一些实施例中，转录因子(TF)包括(但不限于)TCF-1、NOTCH 1/2ICD和/或MYB。在一些实施例中，转录因子(TF)为TCF-1。在一些实施例中，转录因子(TF)为NOTCH 1/2ICD。在一些实施例中，转录因子(TF)为MYB。在一些实施例中，转录因子(TF)与诱导性多能干细胞培养物(iPSC)，例如市售KNOCKOUT血清替代品(Gibco/赛默飞世尔)一起施用，以诱导另外TIL重新编程。在一些实施例中，转录因子(TF)与iPSC混合物一起施用，以诱导另外TIL重新编程。在一些实施例中，转录因子(TF)不与iPSC混合物一起施用。在一些实施例中，重新编程导致TSCM的百分比增加。在一些实施例中，重新编程导致TSCM的百分比增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的TSCM。
在一些实施例中，如上文所描述的瞬时改变蛋白质表达的方法可与基因修饰TIL群体的方法组合，包括稳定并入基因以产生一种以上蛋白质的步骤。在某些实施例中，方法包括基因修饰TIL群体的步骤。在某些实施例中，方法包括基因修饰第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括逆转录病毒转导的步骤。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括慢病毒转导的步骤。慢病毒转导系统为本领域已知的并描述于例如如下中：Levine等人,《美国国家科学院院刊》2006,103,17372-77；Zufferey等人,《自然生物技术学》1997,15,871-75；Dull等人,《病毒学杂志》1998,72,8463-71和美国专利第6,627,442号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括γ-逆转录病毒转导的步骤。γ-逆转录病毒转导系统为本领域已知的并描述于例如Cepko和Pear,《分子生物学中的当前方案》1996,9.9.1-9.9.16，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括转座子介导的基因转移的步骤。转座子介导的基因转移系统为本领域中已知的，包括其中转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白提供，使得转座酶的长期表达不发生在转基因细胞中，例如作为mRNA(例如包含帽和多腺嘌呤尾的mRNA)提供的转座酶。包括鲑鱼型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶(例如SB10、SB11和SB100x))；和经工程改造的酶活性增加的酶的合适的转座子介导的基因转移系统描述于例如下中：Hackett等人,《分子疗法》2010,18,674-83和美国专利第6,489,458号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，瞬时改变TIL中的蛋白质表达是由小干扰RNA(smallinterfering RNA；siRNA)诱导，该小干扰RNA有时称为短干扰RNA或沉默RNA，其为双链RNA分子，长度一般为19-25个碱基对。siRNA用于RNA干扰(RNA interference；RNAi)中，其中，siRNA干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。
在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达为表达减少。在一些实施例中，瞬时改变蛋白质表达由自我递送RNA干扰(self-delivering RNAinterference；sdRNA)诱导，该自我递送RNA干扰为具有高百分比的2'-OH取代(通常氟或-OCH3)的化学上合成的不对称siRNA双螺旋，其包含20个核苷酸的反义(向导)链和使用四乙基乙二醇(TEG)接头在其3'端处与胆固醇缀合的13至15个碱基有义(随从)链。小干扰RNA(siRNA)，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，为双链RNA分子，长度一般为19至25个碱基对。siRNA用于RNA干扰(RNAi)中，其中，siRNA干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。sdRNA为进入细胞不需要递送媒介的共价和疏水性修饰的RNAi化合物。sdRNA一般为具有极小双链区的不对称化学修饰核酸分子。sdRNA分子通常含有单链区和双链区，且可在分子的单链和双链区内含有各种化学修饰。另外，如本文所述，sdRNA分子可与疏水性缀合物，例如常规和高级固醇型分子连接。sdRNA和制备此类sdRNA的相关方法也已广泛描述于例如如下中：美国专利申请公开第US2016/0304873 A1号、第US2019/0211337 A1号、第US2009/0131360A1号和第US2019/0048341A1号，和美国专利第10,633,654号和第10,913,948B2号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。为了优化sdRNA结构、化学性质、靶向位置、序列偏好等，已开发一种算法并将其用于sdRNA效能预测。基于这些分析，功能性sdRNA序列一般定义为在1μM浓度下表达减少超过70％，其中概率超过40％。
双链RNA(dsRNA)可通常用来定义包含一对互补RNA链，一般有义(随从)和反义(向导)链的任何分子，可包括单链突出端(overhang)区域。与siRNA不同，术语dsRNA一般指包括siRNA分子的序列的前体分子，siRNA分子通过裂解酶系统(包括Dicer)的作用自较大dsRNA分子释放。
在一些实施例中，方法包括瞬时改变TIL群体(包括经修饰以表达CCR的TIL)中的蛋白质表达，包括使用自我递送RNA干扰(sdRNA)，其为例如具有高百分比的2'-OH取代(通常氟或-OCH3)的化学上合成的不对称siRNA双螺旋，其包含20个核苷酸的反义(向导)链和使用四乙基乙二醇(TEG)接头在其3'端处与胆固醇缀合的13至15个碱基有义(随从)链。使用siRNA和sdRNA的方法已描述于以下中：Khvorova和Watts,《自然生物技术学(Nat.Biotechnol.)》2017,35,238-248；Byrne等人,《眼药理学与治疗学杂志(J.Ocul.Pharmacol.Ther.)》2013,29,855-864；和Ligtenberg等人,《分子疗法》2018,26,1482-93，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，siRNA的递送使用电穿孔或细胞膜破坏(例如挤压或SQZ法)来完成。在一些实施例中，递送sdRNA至TIL群体不需要使用电穿孔、SQZ或其他方法来完成，实际上使用1至3天时间段使TIL群体暴露于浓度为1μM/10,000个TIL在培养基中的sdRNA。在某些实施例中，方法包括递送siRNA或sdRNA至TIL群体，其包括将TIL群体暴露于浓度为1μM/10,000个TIL在培养基中的sdRNA持续1至3天之间的时间段。在一些实施例中，递送sdRNA至TIL群体使用1至3天时间段使TIL群体暴露于浓度为10μM/10,000个TIL在培养基中的sdRNA来完成。在一些实施例中，递送sdRNA至TIL群体使用1至3天时间段使TIL群体暴露于浓度为50μM/10,000个TIL在培养基中的sdRNA来完成。在一些实施例中，递送sdRNA至TIL群体使用1至3天时间段使TIL群体暴露于浓度为介于0.1μM/10,000个TIL与50μM/10,000个TIL之间在培养基中的sdRNA来完成。在一些实施例中，递送sdRNA至TIL群体使用1至3天时间段使TIL群体暴露于浓度为介于0.1μM/10,000个TIL与50μM/10,000个TIL之间在培养基中的sdRNA来完成，其中暴露于sdRNA通过添加新鲜sdRNA至培养基来进行两次、三次、四次或五次。其他合适过程描述于例如如下中：美国专利申请公开第US2011/0039914 A1号、第US2013/0131141 A1号和第US2013/0131142A1号，和美国专利第9,080,171号，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，在制造期间将siRNA或sdRNA插入TIL群体中。在一些实施例中，sdRNA编码干扰以下的RNA：NOTCH 1/2ICD、PD-1、CTLA-4TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白激酶A(PKA)、BAFF BR3、CISH和/或CBLB。在一些实施例中，表达减少基于例如通过流式细胞术和/或qPCR评定的基因沉默的百分比而确定。在一些实施例中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施例中，表达减少至少约80％。在一些实施例中，表达减少至少约85％。在一些实施例中，表达减少至少约90％。在一些实施例中，表达减少至少约95％。在一些实施例中，表达减少至少约99％。
基于化学修饰siRNA的自我可递送RNAi技术可用于本发明的方法中，以成功递送sdRNAs至如本文所述的TIL。主链修饰与不对称siRNA结构和疏水配体的组合(参见例如，Ligtenberg等人,《分子疗法》2018,26,1482-93和美国专利申请公开第2016/0304873A1号，其公开内容以引用的方式并入本文中)允许sdRNA通过简单地添加至培养基中，利用核酸酶稳定性或sdRNA而无需额外的制剂和方法即可渗透经培养的哺乳动物细胞。此稳定性允许仅通过维持sdRNA在培养基中的有效浓度，支持恒定含量的RNAi介导的靶基因活性减少。尽管不受理论束缚，但sdRNA的主链稳定化提供延长减少基因表达效应，其在非分裂细胞中可持续数月。
在一些实施例中，超过95％的TIL转染效率和靶标的表达减少通过各种特定siRNA或sdRNA进行。在一些实施例中，含有若干未经修饰的核糖残基的siRNA或sdRNA经完全修饰的序列置换，以增加RNAi效应的效能和/或寿命。在一些实施例中，表达减少效应维持12小时、24小时、36小时、48小时、5天、6天、7天或8天或更久。在一些实施例中，表达减少效应在siRNA或sdRNA处理TIL 10天或更久后降低。在一些实施例中，靶标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施例中，TIL中的靶标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施例中，PD-1/PD-L1通路中的表达减少允许TIL展现更强效的体内效应，在一些实施例中是因为避免PD-1/PD-L1通路的抑制效应。在一些实施例中，因siRNA或sdRNA的PD-1的表达减少导致增加TIL增殖。
在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列展现70％的靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列展现75％的靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列展现80％的靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列展现85％的靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列展现90％的靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列展现95％的靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列展现99％的靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.25μM至约4μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.25μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.5μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.75μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.0μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.25μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.5μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.75μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.0μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.25μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.5μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.75μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.0μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.25μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.5μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.75μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。在一些实施例中，本发明中使用的sdRNA序列当以约4.0μM的浓度递送时展现靶基因表达减少。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸剂包含一种以上修饰以增加治疗剂的稳定性和/或有效性和实现寡核苷酸至待治疗的细胞或组织的有效递送。此类修饰可包括2'-O-甲基修饰、2'-O-氟修饰、二硫代磷酸酯修饰、2'F修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的和/或2'脱氧核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸经修饰以包括一个以上疏水性修饰，包括例如固醇、胆固醇、维生素D、萘基、异丁基、苯甲基、吲哚、色氨酸和/或苯基。在一些实施例中，化学修饰的核苷酸为硫代磷酸酯、2'-O-甲基、2'脱氧、疏水性修饰和硫代磷酸酯的组合。在一些实施例中，糖可经修饰且经修饰的糖可包括(但不限于)D-核糖、2'-O-烷基(包括2'-O-甲基和2'-0-乙基)，即2'-烷氧基、2'-氨基、2'-S-烷基、2'-卤基(包括2'-氟)、T-甲氧基乙氧基、2'-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2'-炔丙基、2'-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基和氰基及其类似物。在一些实施例中，糖部分可为己糖且并入寡核苷酸中，如Augustyns等人,《核酸研究(Nucl.Acids.Res.)》1992,18,4711，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整个长度上为双链，即在分子的任一端处无突出单链序列，即为钝端。在一些实施例中，个别核酸分子可具有不同长度。换言之，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在其整个长度上不为双链。例如，当使用两个分开的核酸分子时，分子中的一者，例如包含反义序列的第一分子可比与其杂交的第二分子更长(留下一部分的分子为单链)。在一些实施例中，当使用单核酸分子时，在任一端处的一部分的分子可保持单链。
在一些实施例中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸含有错配和/或环或凸起，但在至少约70％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施例中，本发明的双链寡核苷酸在至少约80％的寡核苷酸长度上为双链的。在其他实施例中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在至少约90％-95％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施例中，本发明的双链siRNA或sdRNA寡核苷酸在至少约96％-98％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施例中，本发明的双链寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可例如通过修饰3'或5'键联而基本上保护其免受核酸酶的影响，如美国专利第5,849,902号和WO 98/13526中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。例如，寡核苷酸可通过纳入“阻断基团”而具有抗性。如本文所用的术语“阻断基团”指可作为用于合成的保护基或偶合基团与寡核苷酸或核单体连接的取代基(例如除OH基团以外)(例如FITC、丙基(CH2-CH2-CH3)、二醇(-O-CH2-CH2-O-)磷酸盐(PO3 2")、磷酸氢盐或氨基亚磷酸酯)。“阻断基团”也可包括“末端阻断基团”或“核酸外切酶阻断基团”，其保护寡核苷酸的5'和3'端，其包括经修饰的核苷酸和非核苷酸核酸外切酶抗性结构。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA内的至少一部分连续多核苷酸通过取代基键联，例如硫代磷酸酯键联连接。
在一些实施例中，化学修饰可导致至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500％的细胞摄取siRNA或sdRNA增强。在一些实施例中，C或U残基中的至少一者包括疏水性修饰。在一些实施例中，多个C和U含有疏水性修饰。在一些实施例中，至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的C和U可含有疏水性修饰。在一些实施例中，所有C和U均含有疏水性修饰。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA分子通过并入可质子化胺展现增强的胞内体释放。在一些实施例中，将可质子化胺并入有义链中(在RISC装载后被舍弃的分子部分中)。在一些实施例中，本发明的siRNA或sdRNA化合物包含不对称化合物，该不对称化合物包含双螺旋区(有效RISC进入所需，10至15个碱基长)和4-12个核苷酸长的单链区；具有13个核苷酸的双螺旋。在一些实施例中，采用6个核苷酸的单链区。在一些实施例中，siRNA或sdRNA的单链区包含2至12个硫代磷酸酯核苷酸间键联(称为硫代磷酸酯修饰)。在一些实施例中，采用6至8个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，本发明的siRNA或sdRNA化合物也包括独特的化学修饰模式，其提供稳定性且与RISC进入相容。例如，向导链也可通过任何证实稳定性而不干扰RISC进入的化学修饰来修饰。在一些实施例中，向导链中的化学修饰模式包括大部分为2'F修饰且5'端经磷酸化的C和U核苷酸。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA中至少30％的核苷酸为经修饰的。在一些实施例中，siRNA或sdRNA中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸为经修饰的。在一些实施例中，siRNA或sdRNA中100％的核苷酸为经修饰的。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA分子具有极少双链区。在一些实施例中，分子的双链区介于8至15个核苷酸长范围内。在一些实施例中，分子的双链区为8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长。在一些实施例中，双链区为13个核苷酸长。引导链与随从链之间可有100％互补性，或向导链与随从链之间可存在一个以上错配。在一些实施例中，在双链分子的一端上，分子为钝端或具有一个核苷酸的突出端。分子的单链区在一些实施例中为介于4至12个核苷酸长。在一些实施例中，单链区可为4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸长。在一些实施例中，单链区也可小于4个核苷酸或大于12个核苷酸长。在某些实施例中，单链区为6或7个核苷酸长。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA分子具有增加的稳定性。在一些情况下，化学修饰的siRNA或sdRNA分子在培养基中的半衰期长于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超过24小时，包括任何中间值。在一些实施例中，siRNA或sd-RNA在培养基中的半衰期超过12小时。
在一些实施例中，对siRNA或sdRNA进行优化以增加效能和/或减少毒性。在一些实施例中，向导链和/或随从链的核苷酸长度和/或向导链和/或随从链中硫代磷酸酯修饰的数目在一些方面中可影响RNA分子的效能，而用2'-O-甲基(2'OMe)修饰置换2'-氟(2'F)修饰在一些方面中可影响分子的毒性。在一些实施例中，预期减少分子的2'F含量将减少分子的毒性。在一些实施例中，RNA分子中硫代磷酸酯修饰的数目可影响摄取分子至细胞中，例如被动摄取分子至细胞中的效率。在一些实施例中，siRNA或sdRNA不具有2'F修饰，但其特征在于细胞摄取与组织渗透方面的功效相等。
在一些实施例中，向导链的长度为约18至19个核苷酸且具有约2至14个磷酸酯修饰。例如，向导链可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或超过14个经磷酸酯修饰的核苷酸。向导链可含有一个以上赋予增加的稳定性而不干扰RISC进入的修饰。磷酸酯修饰的核苷酸，例如硫代磷酸酯修饰的核苷酸，可在3'端、5'端或遍布于整个向导链中。在一些实施例中，向导链的3'端10个核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。向导链也可含有2'F和/或2'OMe修饰，其可位于整个分子中。在一些实施例中，向导链中位置一的核苷酸(向导链的最5'位置中的核苷酸)经2'OMe修饰和/或磷酸化。向导链内的C和U核苷酸可经2'F修饰。例如，19个核苷酸的向导链的位置2至10(或不同长度的向导链中的对应位置)中的C和U核苷酸可经2'F修饰。向导链内的C和U核苷酸也可经2'OMe修饰。例如，l9个核苷酸的向导链的位置11至18(或不同长度的向导链中的对应位置)中的C和U核苷酸可经2'OMe修饰。在一些实施例中，在向导链的最3'端处的核苷酸未经修饰。在某些实施例中，向导链内之大部分C和U经2'F修饰，向导链的5'端经磷酸化。在其他实施例中，位置1和位置11-18中的C或U经2'OMe修饰，向导链的5'端经磷酸化。在其他实施例中，位置1和位置11-18中的C或U经2'OMe修饰，向导链的5'端经磷酸化，且位置2至10中的C或U经2'F修饰。
自我可递送RNAi技术提供一种直接用RNAi剂(无论是siRNA、sdRNA或是其他RNAi剂)转染细胞而无需另外制剂或技术的方法。转染难以转染细胞系的能力、高体内活性和使用简单为该组合物和方法的特征，其相对于基于siRNA的传统技术存在显著的功能优势，因此在关于减少本发明的TIL中靶基因表达的方法的若干实施例中采用sdRNA方法。sdRNA方法允许直接递送化学合成化合物至广泛范围的离体和体内初代细胞和组织。在本文中本发明的一些实施例中描述的sdRNA可购自美国马萨诸塞州伍斯特的Advirna LLC。
siRNA和sdRNA可以疏水性修饰的siRNA-反义寡核苷酸杂交结构形成，公开于例如Byrne等人,《眼科药理学治疗杂志(J.Ocular Pharmacol.Therapeut.)》,2013,29,855-864中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA寡核苷酸可使用无菌电穿孔递送至本文所述的TIL。在某些实施例中，方法包括无菌电穿孔TIL群体以递送siRNA或sdRNA寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸可与跨膜递送系统组合递送至细胞。在一些实施例中，此跨膜递送系统包含脂质、病毒载体及其类似物。在一些实施例中，寡核苷酸剂为不需要任何递送剂的自我递送RNAi剂。在某些实施例中，方法包括使用跨膜递送系统来递送siRNA或sdRNA寡核苷酸至TIL群体。
使寡核苷酸和寡核苷酸组合物与本文所述的TIL接触(例如使其接触，在本文中也称为施用或递送至)且被摄入，包括通过TIL被动摄取。sdRNA可在以下时添加至如本文所述的TIL：在第一扩增期间(例如步骤B)、在第一扩增之后(例如在步骤C期间)、在第二扩增之前或期间(例如在步骤D之前或期间)、在步骤D之后并在步骤E中收集之前、在步骤F中收集期间或之后、在步骤F中最终配制和/或转移至输注袋之前或期间、以及在步骤F中任何可选的冷冻保存步骤之前。此外，siRNA或sdRNA可在由步骤F中任何冷冻保存步骤解冻之后添加。在一些实施例中，可将一个以上靶向如本文所述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2和CBLB)的sdRNA，以选自100nM至20mM、200nM至10mM、500nm至1mM、1μM至100μM和1μM至100μM的浓度，添加至包含TIL和其他试剂的细胞培养基。在一些实施例中，可将一个以上靶向如本文所述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2和CBLB)的sdRNA，以选自如下的量添加至包含TIL和其他试剂的细胞培养基：0.1μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.5μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.75μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.25μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.5μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、2μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、5μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基或10μM siRNA或sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基。在一些实施例中，可将一个以上靶向如本文所述的基因(包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH、CTLA-4、TIGIT、TET2和CBLB)的sdRNA，在预REP或REP阶段期间一天两次、一天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培养物。
本发明的寡核苷酸组合物，包括sdRNA，可在扩增过程期间，例如通过将高浓度sdRNA溶解于细胞培养基中和允许足够时间发生被动摄取而与如本文所述的TIL接触。在某些实施例中，本发明方法包括使TIL群体与如本文所述的寡核苷酸组合物接触。在某些实施例中，方法包括将寡核苷酸，例如sdRNA，溶解在细胞培养基中，使细胞培养基与TIL群体接触。TIL可为如本文所述的第一群体、第二群体和/或第三群体。
在一些实施例中，递送寡核苷酸至细胞中可通过合适的本领域公认方法增强，包括磷酸钙、DMSO、甘油或聚葡萄糖、电穿孔或通过转染，例如使用阳离子、阴离子或中性脂质组合物或脂质体，使用本领域中已知的方法，例如描述于以下的那些方法：美国专利第4,897,355号；第5,459,127号；第5,631,237号；第5,955,365号；第5,976,567号；第10,087,464号；和第10,155,945号；以及Bergan等人,《核酸评述(Nucl.Acids Res.)》1993,21,3567，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，使用超过一种siRNA或sdRNA来减少靶基因表达。在一些实施例中，靶向siRNA或sdRNA的PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2和/或CISH中的一种以上一起使用。在一些实施例中，PD-1siRNA或sdRNA与TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2和/或CISH中的一种以上一起使用，以减少超过一种基因靶标的表达。在一些实施例中，LAG3 siRNA或sdRNA与靶向siRNA或sdRNA的CISH组合使用，以减少两种靶基因表达。在一些实施例中，本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3、CTLA-4、TIGIT、TET2和/或CISH中的一种以上的siRNA或sdRNA可购自美国马萨诸塞州伍斯特的Advirna LLC。
在一些实施例中，siRNA或sdRNA靶向选自如下的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合。在一些实施例中，siRNA或sdRNA靶向选自以下的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，另一种siRNA或sdRNA靶向选自如下的基因：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)和它们的组合。在一些实施例中，siRNA或sdRNA靶向选自以下的基因：PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3、CTLA-4、TIGIT、TET2和它们的组合。在一些实施例中，siRNA或sdRNA靶向选自PD-1和以下中的一种的基因：LAG3、CISH、CBLB、TIM3和它们的组合。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CISH，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向PD-1。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向LAG3。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向CISH。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向CBLB。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIM3，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向CTLA-4，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。在一些实施例中，一种siRNA或sdRNA靶向TIGIT，一种siRNA或sdRNA靶向TET2。
如上文所述，本发明的实施例提供已通过基因编辑进行基因修饰以增强其治疗效果的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。本发明的实施例涵盖通过核苷酸插入(RNA或DNA)TIL群体中进行的基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达和抑制一种以上蛋白质的表达以及其组合本发明的实施例也提供用于将TIL扩增为治疗性群体的方法，其中该方法包括基因编辑TIL。存在若干种可用于基因修饰TIL群体的基因编辑技术，该基因编辑技术适合于根据本发明使用。此类方法包括下文所描述的方法以及本文别处所描述的病毒和转座子方法。在一些实施例中，基因修饰TIL、MIL或PBL以表达CCR的方法也可包括通过稳定基因敲除此类基因或暂时基因减弱此类基因来抑制基因表达的修饰。
在一些实施例中，方法包括基因修饰TIL群体的方法，该TIL群体为如本文所述的第一群体、第二群体和/或第三群体。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括稳定并入用于产生或抑制(例如沉默)一种以上蛋白质的基因的步骤。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法为本领域中已知的，描述于例如下中：Tsong,《生物物理学杂志》1991,60,297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如以下中描述的那些电穿孔方法：美国专利第5,019,034号、第5,128,257号、第5,137,817号、第5,173,158号、第5,232,856号、第5,273,525号、第5,304,120号、第5,318,514号、第6,010,613号和第6,078,490号，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或导致TIL中限定和受控制的永久性或瞬时瞬时改变的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中的两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中的两个的第二脉冲间隔不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包含用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或导致TIL中限定和受控制的永久性或瞬时瞬时改变的步骤，包含向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包含用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或导致TIL中限定和受控制的永久性或瞬时瞬时改变的步骤，包含向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包含用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或导致TIL中限定和受控制的永久性或瞬时瞬时改变的步骤，包含向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立程控的DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，第一组该至少三个脉冲中的两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中的两个的第二脉冲间隔不同。在一些实施例中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包含用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中孔形成的步骤，包含向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲(场强度等于或大于100V/cm)的步骤，其中，该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲振幅上互相不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两个在脉冲宽度上互相不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中的两个的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中的两个的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时间段，并维持TIL的存活率。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包被和胞吞作用)为本领域已知的且描述于如下中：Graham和van der Eb,《病毒学》1973,52,456-467；Wigler等人,《美国国家科学院院刊》1979,76,1373-1376；和Chen和Okayarea,《分子细胞生物学》1987,7,2745-2752；以及美国专利第5,593,875号，它们各自的公开内容它们各自的以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用在过滤水中的阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域已知的且描述于Rose等人,《生物技术》1991,10,520-525和Felgner等人,《美国国家科学院院刊》,1987,84,7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号中，它们各自的公开内容它们各自的以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，基因修饰TIL群体的方法包括使用以下中描述的方法进行转染的步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。TIL可为如本文所述的第一TIL群体、第二TIL群体和/或第三TIL群体。
根据一实施例，基因编辑方法可包括使用介导在一个以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂之可编程核酸酶。此类可编程核酸酶通过在特定基因组基因座处引入断裂而能够进行精确基因组编辑，即其依赖于识别基因组内的特定DNA序列以将核酸酶结构域靶向此位置且介导在靶序列处产生双链断裂。DNA中的双链断裂随后将内源性修复体系募集至断裂位点，以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来介导基因组编辑。因此，断裂的修复可导致引入扰乱(例如沉默、抑制或增强)靶基因产物的插入/缺失突变。
经开发而使得能够进行位点特异性基因组编辑的核酸酶之主要类别包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样核酸酶(TALEN)和CRISPR相关核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。这些核酸酶系统可基于其DNA识别模式而大致分类为两类：ZFN和TALEN通过蛋白-DNA相互作用达成特定DNA结合，而CRISPR系统，例如Cas9，通过与靶标DNA直接碱基配对之短RNA向导分子和通过蛋白-DNA相互作用而靶向特定DNA序列。参见例如Cox等人,《自然医学(NatureMedicine)》,2015,第21卷,第2期。
可根据本发明的TIL扩增方法使用的基因编辑方法的非限制性实例包括CRISPR方法、TALE方法和ZFN方法，这些方法在下文更详细地描述。根据一个实施例，将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如，Gen 2过程)的任何实施例或如美国专利申请公开第US2020/0299644 A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述进行，其中，该方法进一步包含通过CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中的一或多者基因编辑TIL的至少一部分，以产生可提供增强治疗效果的TIL。根据一实施例，可通过体外比较基因编辑的TIL与未经修饰的TIL，例如通过评估相较于未经修饰的TIL的体外效应功能、细胞因子概况等，来评估基因编辑的TIL的改善的治疗效果。在某些实施例中，方法包括使用CRISPR、TALE和/或ZFN方法来基因编辑TIL群体。
在本发明的一些实施例中，使用电穿孔来递送基因编辑系统，例如CRISPR、TALEN和ZFN系统。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统为流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施例的合适的流式电穿孔系统的实例为市售MaxCyte STX系统。有若干种可适用于本发明的替代性市售电穿孔仪器，例如可获自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(龙沙(Lonza)/Amaxa)、GenePulser MXcell(伯乐(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施例中，电穿孔系统为如本文所述的脉冲电穿孔系统，且与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。
用于将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如，Gen 2)的任何实施例或如美国专利申请公开第US2020/0299644 A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述进行，其中，该方法进一步包含通过CRISPR方法(例如，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)基因编辑TIL的至少一部分。根据特定实施例，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法导致至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法导致至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
CRISPR代表成簇规律间隔短回文重复序列。使用CRISPR系统进行基因编辑的方法在本文中也称为CRISPR方法。有三种类型的并入RNA和Cas蛋白且可根据本发明使用的CRISPR系统：I、II和III型。II型CRISPR(通过Cas9示例)为最充分表征的系统之一。
CRISPR技术系改编自细菌和古菌(单细胞微生物的域)之天然防御机制。这些生物体使用CRISPR衍生的RNA和各种Cas蛋白(包括Cas9)，通过切碎和破坏外来入侵者的DNA来阻止病毒和其他外来体的攻击。CRISPR为具有两个独特特征的DNA特化区：存在核苷酸重复序列和间隔子。核苷酸的重复序列分布在整个CRISPR区中，其中短外来DNA区段(间隔子)穿插在重复序列中。在II型CRISPR/Cas系统中，间隔子整合于CRISPR基因组基因座内且转录并加工成短CRISPR RNA(crRNA)。这些crRNA退火成反式活化crRNA(tracrRNA)，且引导Cas蛋白进行序列特异性裂解和沉默病原性DNA。Cas9蛋白进行的靶标识别需要crRNA内之“种子”序列和crRNA结合区上游之含有二核苷酸的保守原间隔序列相邻基序(PAM)序列。从而CRISPR/Cas系统可通过重新设计crRNA而重新靶向以裂解几乎任何DNA序列。原生系统中的CrRNA和tracrRNA可简化为约100个核苷酸的单向导RNA(sgRNA)以用于基因工程改造。CRISPR/Cas系统通过共同递送表达Cas9核酸内切酶和必需crRNA组分之质粒可直接携带入人细胞。可使用不同的Cas蛋白变体来减少靶向限制(例如Cas9的异种同源物，例如Cpf1)。
可通过CRISPR方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过CRISPR方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
用于通过CRISPR方法来改变靶基因序列的表达且可根据本发明的实施例使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第8,697,359号、第8,993,233号、第8,795,965号、第8,771,945号、第8,889,356号、第8,865,406号、第8,999,641号、第8,945,839号、第8,932,814号、第8,871,445号、第8,906,616号和第8,895,308号中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。用于进行CRISPR方法的资源，例如用于表达CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1的质粒，可购自公司，例如金斯瑞(GenScript)。
在一些实施例中，基因修饰如本文所述的TIL群体可使用如美国专利第US9790490号中所描述的CRISPR/Cpf1系统进行，其公开内容以引用的方式并入本文中。
用于将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法(例如，Gen 2)的任何实施例或如美国专利申请公开第US2020/0299644 A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述进行，其中，该方法进一步包括通过TALE方法基因编辑TIL的至少一部分。根据特定实施例，在TIL扩增过程期间使用TALE方法导致至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用TALE方法导致至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
TALE代表转录激活因子样效应蛋白，其包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。使用TALE系统来进行基因编辑的方法在本文中也称为TALE方法。TALE为来自植物病原细菌黄单孢菌属的天然存在的蛋白，其含有由一系列各自识别单碱基对的33至35个氨基酸的重复结构域构成的DNA结合结构域。TALE特异性通过被称为重复可变二残基(RVD)的两个高变氨基酸确定。模块化的TALE重复序列连接在一起以识别连续DNA序列。DNA结合结构域中之特异性RVD识别靶基因座中的碱基，从而提供结构特征以组装可预测的DNA结合结构域。将TALE的DNA结合结构域与IIS型FokI核酸内切酶的催化结构域融合，以制备可靶向的TALE核酸酶。为了诱导位点特异性突变，由14至20个碱基对间隔区域分开的两个单独TALEN臂将FokI单体拉近以二聚化并产生靶向的双链断裂。
若干个利用各种组装方法的大的系统性研究指示，可并入TALE重复序列以识别几乎任何使用者定义的序列。定制设计的TALE阵列也由Cellectis Bioresearch(法国巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals(美国肯塔基州列克星敦)和Life Technologies(美国纽约州格兰德岛)市售。适用于本发明的TALE和TALEN方法描述于美国专利申请公开第US2011/0201118A1号、第US2013/0117869 A1号、第US2013/0315884 A1号、第US 2015/0203871A1号和第US2016/0120906 A1号中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
可通过TALE方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过TALE方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
用于通过TALE方法来改变靶基因序列的表达及可根据本发明的实施例使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第8,586,526号中，其以引用的方式并入本文中。
用于将TIL扩增为治疗性群体的方法可根据本文所述的方法的任何实施例或如美国专利申请公开第US2020/0299644 A1号和第US2020/0121719 A1号以及美国专利第10,925,900号(其公开内容以引用的方式并入本文中)中所描述进行，其中，该方法进一步包括通过锌指或锌指核酸酶方法基因编辑TIL的至少一部分。根据特定实施例，在TIL扩增过程期间使用锌指方法导致至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用锌指方法导致至少一部分治疗性TIL群体中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
单独锌指含有呈保守ββα构造的约30个氨基酸。α-螺旋表面上的几个氨基酸通常以不同的选择性水平接触DNA大沟中的3bp。锌指具有两个蛋白结构域。第一结构域为DNA结合结构域，其包括真核转录因子且含有锌指。第二域为核酸酶结构域，其包括FokI限制性内切酶且负责催化裂解DNA。
单独ZFN的DNA结合结构域通常含有介于三个与六个之间的单独锌指重复且各自可识别介于9个与18个之间的碱基对。若锌指结构域对其预期靶位点具有特异性，则甚至一对识别总共18个碱基对的3指ZFN理论上可靶向哺乳动物基因组中的单个基因座。一个产生新的锌指阵列的方法为组合具有已知特异性的较小锌指“模块”。最常见的模块组装过程涉及组合三个分开的可各自识别3个碱基对DNA序列的锌指，以产生可识别9个碱基对靶位点的3指阵列。替代性地，可使用基于选择的方法(例如寡聚库工程改造)从随机库选择新的锌指阵列，这些随机库考虑介于邻近指之间的背景依赖性相互作用。工程改造的锌指可从Sangamo Biosciences(美国加利福尼亚州里奇蒙)和Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)购得。
可通过锌指方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
可通过锌指方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15、IL-18和IL-21。
用于通过锌指方法来改变靶基因序列的表达且可根据本发明的实施例使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第6,534,261号、第6,607,882号、第6,746,838号、第6,794,136号、第6,824,978号、第6,866,997号、第6,933,113号、第6,979,539号、第7,013,219号、第7,030,215号、第7,220,719号、第7,241,573号、第7,241,574号、第7,585,849号、第7,595,376号、第6,903,185号和第6,479,626号中，其各自以引用的方式并入本文中。
用于通过锌指方法来改变靶基因序列的表达且可根据本发明的其他实施例使用的系统、方法和组合物的实例描述于Beane等人,《分子疗法》,2015,23,1380-1390中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，TIL可选地经基因工程改造以包括其他功能性，该功能性包括(但不限于)高亲和力TCR，例如靶向肿瘤相关抗原(例如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)处的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系限制细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施例中，方法包括基因工程改造TIL群体以包含高亲和力TCR，例如靶向肿瘤相关抗原(例如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)处之TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系限制细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。适当地，TIL群体可为如本文所述的第一群体、第二群体和/或第三群体。
D.用于TIL制造的密闭系统
本发明提供在TIL培养过程期间使用密闭系统。此类密闭系统允许预防和/或减少微生物污染、允许使用较少培养瓶且允许成本降低。在一些实施例中，密闭系统使用两个容器。
此类密闭系统为本领域中熟知的且可见于例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm和https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm处。
无菌连接装置(STCD)在两件相容性管之间产生无菌熔接部分。此程序允许无菌连接多个容器和管直径。在一些实施例中，密闭系统包括如实例中所描述的鲁尔锁(luerlock)和热封系统。在一些实施例中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施例中，采用如实例中所描述的密闭系统。在一些实施例中，根据本文实例中所描述的方法，将TIL配制至最终产物配制容器中。
在一些实施例中，自获得肿瘤片段的时间至准备向患者施用TIL或冷冻保存，密闭系统使用一个容器。在一些实施例中，当使用两个容器时，第一容器为密闭G容器，在不打开第一密闭G容器的情况下离心TIL群体并将其转移至输注袋。在一些实施例中，当使用两个容器时，输注袋为含有HypoThermosol的输注袋。密闭系统或密闭TIL细胞培养系统的特征在于，一旦已添加肿瘤样本和/或肿瘤碎片，则系统自外部紧密密封以形成密闭环境，不受细菌、真菌和/或任何其他微生物污染入侵。
在一些实施例中，微生物污染减少介于约5％与约100％之间。在一些实施例中，微生物污染减少介于约5％与约95％之间。在一些实施例中，微生物污染减少介于约5％与约90％之间。在一些实施例中，微生物污染减少介于约10％与约90％之间。在一些实施例中，微生物污染减少介于约15％与约85％之间。在一些实施例中，微生物污染减少为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％。
密闭系统允许TIL在不存在微生物污染下和/或在微生物污染显著减少下生长。
此外，TIL细胞培养环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压各自随细胞培养而变化。因此，即使适合于细胞培养的培养基经循环，但密闭环境仍需要不断地维持为TIL增殖的最佳环境。为了此目的，合乎需要的是，借助于感测器监测密闭环境的培养液内的pH、二氧化碳分压和氧气分压的物理因素，其信号用于控制安设在培养环境的入口处的气体交换器，和根据培养液中的变化实时调整密闭环境之气体分压以便优化细胞培养环境。在一些实施例中，本发明提供密闭细胞培养系统，其在至密闭环境的入口处并入配备有测量密闭环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压的监测装置的气体交换器，且通过基于来自监测装置的信号自动调整气体浓度来优化细胞培养环境。
在一些实施例中，连续地或间歇地控制密闭环境内的压力。即，密闭环境中的压力可借助于例如压力维持装置来改变，从而确保空间在正压力状态下适合于TIL生长或促进在负压力状态下渗出流体且因此促进细胞增殖。此外，通过间歇性地施加负压力，有可能借助于暂时性缩小密闭环境的容积而均匀且有效地置换密闭环境中的循环液体。
在一些实施例中，可替换或添加TIL增殖的最佳培养物组分，可添加包括例如IL-2和/或OKT3及其组合的因子。
E.可选的TIL的冷冻保存
主体TIL群体(例如第二TIL群体)或经扩增的TIL群体(例如第三TIL群体)可以可选地进行冷冻保存。在一些实施例中，冷冻保存发生于治疗性TIL群体。在一些实施例中，冷冻保存发生于在第二扩增后收集的TIL。在一些实施例中，冷冻保存发生于图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的示例性步骤F中的TIL。在一些实施例中，TIL冷冻保存于输注袋中。在一些实施例中，TIL在置于输注袋中之前冷冻保存。在一些实施例中，冷冻保存TIL且不将其置于输注袋中。在一些实施例中，使用冷冻保存培养基进行冷冻保存。在一些实施例中，冷冻保存培养基含有二甲亚砜(DMSO)。此一般通过将TIL群体放置于冷冻溶液(例如85％补体灭活AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将溶液中的细胞放置于低温小瓶中且储存在-80℃下24小时，其中可选地转移至气态氮冷冻器用于冷冻保存。参见Sadeghi等人,《肿瘤学报(Acta Oncologica)》2013,52,978-986。
在适当时，自冷冻器取出细胞并在37℃水浴中解冻直至约4/5的溶液解冻。一般将细胞再悬浮于完全培养基中且可选地洗涤一次以上。在一些实施例中，可计算解冻的TIL且如本领域中已知的来评定存活率。
在一些实施例中，TIL群体使用CS10冷冻保存培养基(CryoStor 10，BioLifeSolutions)冷冻保存。在一些实施例中，TIL群体使用含有二甲亚砜(DMSO)的冷冻保存培养基冷冻保存。在一些实施例中，TIL群体使用1:1(vol:vol)比率的CS10与细胞培养基冷冻保存。在一些实施例中，TIL群体使用约1:1(vol:vol)比率的CS10与细胞培养基(进一步包含另外IL-2)冷冻保存。
如上文所述且如图1和/或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中提供的步骤A至E中所示例，冷冻保存可在TIL扩增过程中的多个点进行。在一些实施例中，在第一扩增之后(如例如根据步骤B所提供)经扩增的TIL群体或在根据图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D的一个以上第二扩增之后的经扩增的TIL群体可进行冷冻保存。冷冻保存一般可通过将TIL群体放置于冷冻溶液(例如85％补体灭活AB血清和15％二甲亚砜(DMSO))中来完成。将溶液中的细胞放置于低温小瓶中且储存在-80℃下24小时，其中可选地转移至气态氮冷冻器用于冷冻保存。参见Sadeghi等人,《肿瘤学报(Acta Oncologica)》2013,52,978-986。在一些实施例中，TIL冷冻保存于5％ DMSO中。在一些实施例中，TIL冷冻保存于细胞培养基加5％ DMSO中。在一些实施例中，TIL根据实例6中提供的方法冷冻保存。
在适当时，自冷冻器取出细胞并在37℃水浴中解冻直至约4/5的溶液解冻。一般将细胞再悬浮于完全培养基中且可选地洗涤一次以上。在一些实施例中，可计算解冻的TIL且如本领域中已知的来评定存活率。
在某些情况下，图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B的TIL群体可使用下文论述的方案立即冷冻保存。或者，主体TIL群体可经历来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤C和步骤D，然后在图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D之后进行冷冻保存。类似地，在其中基因修饰TIL将用于疗法中的情况下，来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B或步骤D的TIL群体可进行基因修饰以用于合适的治疗。
F.经扩增的TIL的表型特征
在一些实施例中，分析TIL在扩增后的多种表型标记物的表达，这些标记物包括本文和实例中所描述的那些。在一些实施例中，检查一种以上表型标记物的表达。在一些实施例中，在来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中的第一扩增之后分析TIL的表型特征。在一些实施例中，在来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤C中的转变期间分析TIL的表型特征。在一些实施例中，在来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤C中的转变期间并在冷冻保存之后分析TIL的表型特征。在一些实施例中，在来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中的第二扩增之后分析TIL的表型特征。在一些实施例中，在来自图1或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中的两次或更多次扩增之后分析TIL的表型特征。
在一些实施例中，标记物选自CD8和CD28。在一些实施例中，检查CD8的表达。在一些实施例中，检查CD28的表达。在一些实施例中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD8和/或CD28的表达更高。在一些实施例中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8B)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD8的表达更高。在一些实施例中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD28的表达更高。在一些实施例中，高CD28表达指示较年轻更持久的TIL表型。在一些实施例中，测量一种以上调节标记物的表达。
在一些实施例中，在用于扩增本文所述的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法的任一步骤期间，未基于CD8和/或CD28表达选择第一TIL群体、第二TIL群体、第三TIL群体或所收集TIL群体。
在一些实施例中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A)中提供的2A过程，根据本发明的过程产生的TIL的中枢记忆细胞的百分比更高。在一些实施例中，中枢记忆细胞的记忆标记物选自CCR7和CD62L。
在一些实施例中，CD4+和/或CD8+TIL记忆子集可分为不同记忆子集。在一些实施例中，CD4+和/或CD8+TIL包含初始(CD45RA+CD62L+)TIL。在一些实施例中，CD4+和/或CD8+TIL包含中枢记忆(CM；CD45RA-CD62L+)TIL。在一些实施例中，CD4+和/或CD8+TIL包含效应记忆(effector memory，EM；CD45RA-CD62L-)TIL。在一些实施例中，CD4+和/或CD8+TIL包含RA+效应记忆/效应(TEMRA/TEFF；CD45RA+CD62L+)TIL。
在一些实施例中，TIL表达一种以上选自如下的标记物：颗粒酶B、穿孔蛋白和颗粒溶解素。在一些实施例中，TIL表达颗粒酶B。在一些实施例中，TIL表达穿孔蛋白。在一些实施例中，TIL表达颗粒溶解素。
在一些实施例中，也可使用细胞因子释放分析，评估再刺激的TIL的细胞因子释放。在一些实施例中，可评估TIL的干扰素-γ(IFN-γ)分泌。在一些实施例中，IFN-γ分泌通过ELISA分析测量。在一些实施例中，IFN-γ分泌通过ELISA测定在快速第二扩增步骤之后，在如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的步骤D之后测量。在一些实施例中，TIL健康通过IFN-γ(IFN-γ)分泌测量。在一些实施例中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些实施例中，采用针对IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。IFN-γ产生可通过确定经抗CD3、CD28和CD137/4-1BB的抗体刺激的TIL培养基中的细胞因子IFN-γ的含量测量。来自这些受刺激TIL的培养基中的IFN-γ含量可通过测定IFN-γ释放测量。在一些实施例中，例如如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的Gen 3过程中步骤D的TIL相较于例如如图8(特别是例如图8A)中所提供的2A过程中步骤D的IFN-γ产生增加，指示步骤D TIL的细胞毒性潜力增加。在一些实施例中，IFN-γ分泌增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多。在一些实施例中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施例中，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施例中，IFN-γ之分泌增加三倍。在一些实施例中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施例中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施例中，使用Quantikine ELISA试剂盒测量IFN-γ。在一些实施例中，测量离体TIL中的IFN-γ。在一些实施例中，测量离体TIL中的IFN-γ，包括通过本发明的方法(包括例如图8B方法)产生的TIL。
在一些实施例中，能够分泌至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少多于一倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少多于两倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少多于三倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少多于四倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少多于五倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施例中，能够分泌至少100pg/mL至约1000pg/mL或更多的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，在能够分泌至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少550pg/mL、至少600pg/mL、至少650pg/mL、至少700pg/mL、至少750pg/mL、至少800pg/mL、至少850pg/mL、至少900pg/mL、至少950pg/mL或至少1000pg/mL或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少300pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少400pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少500pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少600pg/mLIFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少700pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少800pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少900pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少1000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少2000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少3000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少4000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少5000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少6000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少7000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少8000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少9000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少10,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少15,000pg/mLIFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少20,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少25,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少30,000pg/mLIFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少35,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少40,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少45,000pg/mLIFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少50,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施例中，能够分泌至少100pg/mL/5e5个细胞至约1000pg/mL/5e5个细胞或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞、至少250pg/mL/5e5个细胞、至少300pg/mL/5e5个细胞、至少350pg/mL/5e5个细胞、至少400pg/mL/5e5个细胞、至少450pg/mL/5e5个细胞、至少500pg/mL/5e5个细胞、至少550pg/mL/5e5个细胞、至少600pg/mL/5e5个细胞、至少650pg/mL/5e5个细胞、至少700pg/mL/5e5个细胞、至少750pg/mL/5e5个细胞、至少800pg/mL/5e5个细胞、至少850pg/mL/5e5个细胞、至少900pg/mL/5e5个细胞、至少950pg/mL/5e5个细胞或至少1000pg/mL/5e5个细胞或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少300pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少400pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少500pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少600pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少700pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少800pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少900pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少1000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少2000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少3000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少4000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少5000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少6000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少7000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少8000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少9000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少10,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少15,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少20,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少25,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少30,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少35,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少40,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少45,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少50,000pg/mL/5e5个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供了一种用于产生展现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施例中，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文中提供的方法以外的其他方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性，其他方法包括例如除图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中实施的方法以外的方法。在一些实施例中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用如图8(特别是例如图8A)中示例之称为Gen 2的方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，在第一扩增中获得的TIL展现增加的T细胞贮库多样性。在一些实施例中，增加多样性是增加免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施例中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施例中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施例中，多样性存在于选自α、β、γ和δ受体的T细胞受体中的一者中。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施例中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施例中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。在一些实施例中，如本文所述的过程(例如Gen 3过程)相较于其他过程(例如称为Gen 2的过程)，基于样本内独特肽CDR的数目，显示更高的克隆多样性。
在一些实施例中，TIL的活化和耗竭可通过检查一种以上标记物确定。在一些实施例中，活化和耗竭可使用多色流式细胞术确定。在一些实施例中，标记物的活化和耗竭包括(但不限于)一种以上选自如下的标记物：CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM-3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103和/或LAG-3)。在一些实施例中，标记物的活化和耗竭包括(但不限于)一种以上选自如下的标记物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIGIT和/或TIM-3。在一些实施例中，标记物的活化和耗竭包括(但不限于)一种以上选自如下的标记物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT和/或TIM-3。在一些实施例中，可确定和/或分析T细胞标记物(包括活化和耗竭标记物)以检查T细胞活化、抑制或功能。在一些实施例中，T细胞标记物可包括(但不限于)一种以上选自如下的标记物：TIGIT、CD3、FoxP3、Tim-3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG-3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4和/或CD59。
在一些实施例中，展现分泌高于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于3000pg/106个TIL、高于5000pg/106个TIL、高于7000pg/106个TIL、高于9000pg/106个TIL、高于11000pg/106个TIL、高于13000pg/106个TIL、高于15000pg/106个TIL、高于17000pg/106个TIL、高于19000pg/106个TIL、高于20000pg/106个TIL、高于40000pg/106个TIL、高于60000pg/106个TIL、高于80000pg/106个TIL、高于100000pg/106个TIL、高于120000pg/106个TIL、高于140000pg/106个TIL、高于160000pg/106个TIL、高于180000pg/106个TIL、高于200000pg/106个TIL、高于220000pg/106个TIL、高于240000pg/106个TIL、高于260000pg/106个TIL、高于280000pg/106个TIL、高于300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于3000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于5000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于7000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于9000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于11000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于13000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于15000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于17000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于19000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于20000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于40000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于60000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于80000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于100000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于120000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于140000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于160000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于180000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于200000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于220000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于240000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于260000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于280000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于300000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于3000pg/106个TIL、高于5000pg/106个TIL、高于7000pg/106个TIL、高于9000pg/106个TIL、高于11000pg/106个TIL、高于13000pg/106个TIL、高于15000pg/106个TIL、高于17000pg/106个TIL、高于19000pg/106个TIL、高于20000pg/106个TIL、高于40000pg/106个TIL、高于60000pg/106个TIL、高于80000pg/106个TIL、高于100000pg/106个TIL、高于120000pg/106个TIL、高于140000pg/106个TIL、高于160000pg/106个TIL、高于180000pg/106个TIL、高于200000pg/106个TIL、高于220000pg/106个TIL、高于240000pg/106个TIL、高于260000pg/106个TIL、高于280000pg/106个TIL、高于300000pg/106个TIL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于3000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于5000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于7000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于9000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于11000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于13000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于15000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于17000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于19000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于20000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于40000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于60000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于80000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于100000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于120000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于140000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于160000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于180000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于200000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于220000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于240000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于260000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于280000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于300000pg/106个TIL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。
在一些实施例中，展现分泌高于1000pg/mL至300000pg/mL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于1000pg/mL、高于2000pg/mL、高于3000pg/mL、高于4000pg/mL、高于5000pg/mL、高于6000pg/mL、高于7000pg/mL、高于8000pg/mL、高于9000pg/mL、高于10000pg/mL、高于20000pg/mL、高于30000pg/mL、高于40000pg/mL、高于50000pg/mL、高于60000pg/mL、高于70000pg/mL、高于80000pg/mL、高于90000pg/mL、高于100000pg/mL或更多颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于1000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于2000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于3000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于4000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于5000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于6000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于7000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于8000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于9000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于10000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于20000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于30000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于40000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于50000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于60000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于70000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于80000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于90000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现高于100000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于120000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于140000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于160000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于180000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于200000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于220000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于240000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于260000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于280000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施例中，展现分泌高于300000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。
在一些实施例中，本发明的扩增方法产生展现相较于非扩增TIL群体增加的体外颗粒酶B分泌的扩增TIL群体，包括例如如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D中提供的TIL。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少一倍至五十倍或更多。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，IFN-γ分泌增加至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍、至少五十倍或更多。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少一倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少两倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少三倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少四倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少五倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少六倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少七倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少八倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少九倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少十倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少二十倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少三十倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少四十倍。在一些实施例中，相较于非扩增TIL群体，本发明的扩增TIL群体的颗粒酶B分泌增加至少五十倍。
在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多含量的TNF-α(即，TNF-alpha)的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少一倍含量的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少两倍含量的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少三倍含量的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少四倍含量的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够相较于IFN-γ分泌而分泌低至少五倍含量的TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施例中，能够分泌至少200pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α(即，TNF-alpha)的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少500pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少1000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少2000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少3000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少4000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少5000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少6000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少7000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少8000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施例中，能够分泌至少9000pg/mL/5e5个细胞至约10,000pg/mL/5e5个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施例中，测量IFN-γ和颗粒酶B含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施例中，测量IFN-γ和TNF-α含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施例中，测量颗粒酶B和TNF-α含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施例中，测量IFN-γ、颗粒酶B和TNF-α含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。
在一些实施例中，表型特征在冷冻保存之后检查。
G.另外过程实施例
在一些实施例中，本发明提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包含：(a)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片来获得来自从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，其中，起始第一扩增进行约1至7天或约1至8天以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；(c)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约1至11天或约1至10天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；(d)收集自步骤(c)获得的治疗性TIL群体，以及(e)在步骤(d)之前或之后的任何时间基因编辑TIL细胞的至少一部分以在TIL细胞的表面上表达至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天或约2至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群体转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，其中，在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群体在较大规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分在第二小规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天或约2至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配至至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约5至7天的时间段。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
在一些实施例中，本发明提供用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包含：(a)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片来获得来自从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，其中，起始第一扩增进行约1至8天以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；(c)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约1至8天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；(d)收集自步骤(c)获得的治疗性TIL群体，以及(e)在步骤(d)之前或之后的任何时间基因编辑TIL细胞的至少一部分以在TIL细胞的表面上表达至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群体转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，其中，在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群体在较大规模培养中培养约4至8天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分在第二小规模培养中培养约4至6天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至6天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配至至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至5天的时间段。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
在一些实施例中，本发明提供了将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包含：(a)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片来获得来自从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，其中，起始第一扩增进行约1至7天以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；(c)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约1至11天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；(d)收集自步骤(c)获得的治疗性TIL群体，以及(e)在步骤(d)之前或之后的任何时间基因编辑TIL细胞的至少一部分以在TIL细胞的表面上表达至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群体转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，其中，在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群体在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群体部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施例中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群体约4天的时间段进行快速第二扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群体转移并分配至至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-g500MCS容器)中，在各第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群体部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。在一些实施例中，至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过使第一TIL群体与进一步包含外源性抗原呈递细胞(APC)的培养基接触来进行，其中，步骤(c)中培养基中的APC数目大于步骤(b)中培养基中的APC数目。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，培养基补充有另外外源性APC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约20:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约9:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约8:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约7:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约6:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约1.1:1至刚好或约2:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约10:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约5:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约4:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约3:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.9:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.8:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.7:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.6:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.5:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.4:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.3:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.2:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率选自刚好或约2:1至刚好或约2.1:1的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率为刚好或约2:1。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中快速第二扩增中添加的APC数目与步骤(b)中添加的APC数目的比率为刚好或约1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，初级第一扩增中添加的APC数目为刚好或约1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC，快速第二扩增中添加的APC数目为刚好或约3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，初级第一扩增中添加的APC数目选自刚好或约1×108个APC至刚好或约3.5×108个APC的范围，快速第二扩增中添加的APC数目选自刚好或约3.5×108个APC至刚好或约1×109个APC的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，初级第一扩增中添加的APC数目选自刚好或约1.5×108个APC至刚好或约3×108个APC的范围，快速第二扩增中添加的APC数目选自刚好或约4×108个APC至刚好或约7.5×108个APC的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，初级第一扩增中添加的APC数目选自刚好或约2×108个APC至刚好或约2.5×108个APC的范围，快速第二扩增中添加的APC数目选自刚好或约4.5×108个APC至刚好或约5.5×108个APC的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，刚好或约2.5×108个APC添加至初级第一扩增，且刚好或约5×108个APC添加至快速第二扩增。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中抗原呈递细胞为外周血单核细胞(PBMC)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个肿瘤碎片分布至多个分开的容器中，在各分开的容器中，第一TIL群体在步骤(a)中获得，第二TIL群体在步骤(b)中获得，第三TIL群体在步骤(c)中获得，将来自步骤(c)中多个容器的治疗性TIL群体合并以产生来自步骤(d)的经收集的TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个肿瘤均匀分布至多个分开的容器中。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个分开的容器包含至少两个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个分开的容器包含两个至二十个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个分开的容器包含两个至十五个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个分开的容器包含两个至十个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个分开的容器包含两个至五个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个分开的容器包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个分开的容器。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在各容器中对步骤(b)中的第一TIL群体进行起始第一扩增，在同一容器中对由此类第一TIL群体产生的第二TIL群体进行步骤(c)中的快速第二扩增。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中分开的容器中的各者包含第一透气表面区域。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个肿瘤碎片分布于单一容器中。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中单一容器包含第一透气表面区域。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中，APC以刚好或约一个细胞层至刚好或约三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，起始第一扩增在包含第一透气表面区域的第一容器中进行，在步骤(c)中，快速第二扩增在包含第二透气表面区域的第二容器中进行。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二容器大于第一容器。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，其中，在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中，APC以刚好或约一个细胞层至刚好或约三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第二透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，起始第一扩增在包含第一透气表面区域的第一容器中进行，在步骤(c)中，快速第二扩增在第一容器中进行。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中，APC以刚好或约一个细胞层至刚好或约三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约1.5个细胞层至刚好或约2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3个细胞层至刚好或约10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约4个细胞层至刚好或约8个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中，APC以刚好或约以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:10的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:9的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:8的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:7的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:6的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:5的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:4的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:3的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1至刚好或约1:2的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.2至刚好或约1:8的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.3至刚好或约1:7的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.4至刚好或约1:6的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.5至刚好或约1:5的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.6至刚好或约1:4的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.7至刚好或约1:3.5的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.8至刚好或约1:3的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.9至刚好或约1:2.5的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:2的范围。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，初级第一扩增通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群体的细胞培养基进行，步骤(c)中添加的APC数目大于步骤(b)中添加的APC数目，步骤(b)中层叠的APC的平均层数与步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自刚好或约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或约1.5:1至刚好或约100:1。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或约50:1。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或约25:1。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或约20:1。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体中的TIL数目与第一TIL群体中的TIL数目的比率为刚好或约10:1。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少刚好或约50倍。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二TIL群体在数目上比第一TIL群体大至少刚好或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中的第二时间段开始后刚好或约2天或刚好或约3天，对细胞培养基补充另外的IL-2。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，进一步包括通过冷冻保存过程，冷冻保存步骤(d)中的经收集的TIL群体的步骤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，包含在步骤(d)后进行将来自步骤(d)的经收集的TIL群体转移至可选地含有HypoThermosol的输注袋的另外步骤(e)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，包括通过冷冻保存过程，冷冻保存步骤(e)中的包含经收集的TIL群体的输注袋的步骤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中使用1:1的比率的经收集的TIL群体与冷冻保存培养基来进行冷冻保存过程。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中抗原呈递细胞为外周血单核细胞(PBMC)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中PBMC为经照射且同种异体的。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中添加至细胞培养物的APC总数为2.5×108个。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中添加至细胞培养物的APC总数为5×108个。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中APC为PBMC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中PBMC为经照射且同种异体的。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中抗原呈递细胞为人工抗原呈递细胞。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中使用基于膜的细胞处理系统来进行步骤(d)中的收集。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中使用LOVO细胞处理系统来进行步骤(d)中的收集。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约5至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约10至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约15至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约20至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约25至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约30至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约35至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约40至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约45至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约50至刚好或约60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含在步骤(b)中每容器刚好或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个碎片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中各碎片具有刚好或约27mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中各碎片具有刚好或约20mm3至刚好或约50mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中各碎片具有刚好或约21mm3至刚好或约30mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中各碎片具有刚好或约22mm3至刚好或约29.5mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中各碎片具有刚好或约23mm3至刚好或约29mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中各碎片具有刚好或约24mm3至刚好或约28.5mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中各碎片具有刚好或约25mm3至刚好或约28mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中各碎片具有刚好或约26.5mm3至刚好或约27.5mm3的体积。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中各碎片具有刚好或约以下的体积：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mm3。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含刚好或约30至刚好或约60个碎片，其中总体积是刚好或约1300mm3至刚好或约1500mm3。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含刚好或约50个碎片，总体积为刚好或约1350mm3。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中多个碎片包含刚好或约50个碎片，总质量为刚好或约1克至刚好或约1.5克。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中细胞培养基提供于G容器或Xuri细胞袋的容器中。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中细胞培养基中的IL-2浓度为约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中细胞培养基中的IL-2浓度为约6,000IU/mL。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中冷冻保存培养基包含二甲亚砜(DMSO)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中冷冻保存培养基包含7％至10％ DMSO。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)中的第一时间段在刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时间段内进行。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(c)中的第二时间段在刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段内进行。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段各自分别在刚好或约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时间段内进行。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段各自分别在刚好或约5天、6天或7天的时间段内进行。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段各自分别在刚好或约7天的时间段内进行。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约14天至刚好或约18天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约15天至刚好或约18天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约16天至刚好或约18天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约17天至刚好或约18天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约14天至刚好或约17天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约15天至刚好或约17天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约16天至刚好或约17天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约14天至刚好或约16天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约15天至刚好或约16天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约14天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约15天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约16天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约17天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约18天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约14天以下。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约15天以下。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约16天以下或更短中进行。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)至(d)总共进行刚好或约18天以下。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(d)中收集的治疗性TIL群体包含足以用于TIL的治疗有效剂量的TIL。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中足以用于治疗有效剂量的TIL数为刚好或约2.3×1010个至刚好或约13.7×1010个。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(c)中的第三TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，相较于通过长于16天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群体提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，相较于通过长于17天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群体提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，相较于通过长于18天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群体提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中相对于获自步骤(b)第二细胞群体的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，获自步骤(c)第三TIL群体的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞展现增加的CD8和CD28表达。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中引述的各容器为密闭容器。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中引述的各容器为G容器。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中引述的各容器为GREX-10。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中引述的各容器为GREX-100。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中引述的各容器为GREX-500。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，其中，至少一种免疫调节组合物包含与免疫调节剂融合的膜锚，该免疫调节剂选自如下：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-4、IL-1α、IL-1β、IL-5、IFNγ、TNFα(TNFa)、IFNα、IFNβ、GM-CSF、GCSF、CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)及它们的生物活性变体。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂。在一些实施例中，免疫调节剂为IL-12。在一些实施例中，免疫调节剂为IL-15。在一些实施例中，免疫调节剂为IL-18。在一些实施例中，免疫调节剂为IL-21。在一些实施例中，免疫调节剂为CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，其中，基因编辑物为瞬时基因编辑物，其中，瞬时基因编辑TIL以瞬时表达至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，免疫调节组合物包含免疫调节融合蛋白。在一些实施例中，免疫调节融合蛋白包含与免疫调节剂融合的膜锚。在一些实施例中，免疫调节剂为细胞因子。在一些实施例中，细胞因子选自：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在一些实施例中，细胞因子选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在一些实施例中，细胞因子选自：IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在一些实施例中，细胞因子为IL-12。在一些实施例中，细胞因子为IL-15。在一些实施例中，细胞因子为IL-18。在一些实施例中，细胞因子为IL-21。在一些实施例中，免疫调节剂为CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
在其他实施例中，本发明提供通过如上适用的任何前述段落中描述的方法制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体。
在其他实施例中，本发明提供由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)或OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性，治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。
在其他实施例中，本发明提供由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。
在其他实施例中，本发明提供由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。
在其他实施例中，本发明提供由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过其中TIL的第一扩增在无添加的抗原呈递细胞(APC)以及无添加的OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。
在其他实施例中，本发明提供由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过过程长于16天的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。
在其他实施例中，本发明提供由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过过程长于17天的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。
在其他实施例中，本发明提供由患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，相较于通过过程长于18天的过程制备的TIL，治疗性TIL群体提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，该治疗性TIL群体提供增加的干扰素-γ产生。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，该治疗性TIL群体提供增加的多克隆性。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，该治疗性TIL群体提供增加的功效。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于16天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于17天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于18天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文所述，例如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于16天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于17天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于18天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文所述，例如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所示)，使得TIL能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于16天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于17天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其中，相较于通过长于18天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。在一些实施例中，由于本文所述，例如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所示)，使得TIL能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的抗原呈递细胞(APC)的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，由于本文所述，例如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞群体能够产生至少多于一倍的干扰素-γ；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，由于本文所述，例如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供治疗性TIL群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的APC的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，由于本文所述，例如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所示)，使得TIL能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供治疗性TIL群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的OKT3之情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于两倍的干扰素-γ；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，由于本文所述，例如以文步骤A至F中或根据以文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所示)，使得TIL能够产生至少多于两倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供治疗性TIL群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的APC的情况下进行之过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，由于本文所述，例如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所示)，使得TIL能够产生至少多于一倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供治疗性TIL群体，相较于通过其中TIL的第一扩增在无任何添加的OKT3之情况下进行之过程制备的TIL，该治疗性TIL群体能够产生至少多于三倍的干扰素-γ；治疗性TIL群体中的多个细胞在细胞表面包括至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，由于本文所述，例如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所示)，使得TIL能够产生至少多于三倍的干扰素-γ。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，肿瘤碎片为小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，肿瘤碎片为粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，肿瘤碎片为细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，肿瘤碎片为小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，肿瘤碎片为芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得(i)该方法包括自一个以上来自受试者的肿瘤组织的小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得第一TIL群体；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时间段；(iii)该方法包括进行起始第一扩增约8天的时间段；以及(iv)该方法包括进行快速第二扩增约11天的时间段。在一些前述实施例中，方法的步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，使得(i)该方法包括自一个以上来自受试者的肿瘤组织的小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物获得第一TIL群体；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时间段；(iii)该方法包括进行起始第一扩增约8天的时间段；以及(iv)该方法包括通过以下方式进行快速第二扩增：培养第二TIL群体的培养物约5天，将培养物分成至多5个传代培养物，和培养该传代培养物约6天。在一些前述实施例中，在与在快速第二扩增中开始培养第二TIL群体的容器相同大小或更大的容器中，分别培养至多5个传代培养物。在一些前述实施例中，第二TIL群体的培养物平均分在至多5个传代培养物中。在一些前述实施例中，方法的步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织之细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织之细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得第一TIL群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得(i)该方法包括自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的粗针活体组织切片获得第一TIL群体；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时间段；(iii)该方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体约8天的时间段来进行起始第一扩增步骤，获得第二TIL群体；(iv)该方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基中培养第二TIL群体约11天的时间段来进行快速第二扩增步骤。在一些前述实施例中，方法的步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，以使得(i)该方法包括自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的粗针活体组织切片获得第一TIL群体；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时间段；(iii)该方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体约8天的时间段来进行起始第一扩增步骤，获得第二TIL群体；(iv)该方法包括通过以下方式进行快速第二扩增：在包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基中培养第二TIL群体的培养物约5天，将培养物分成至多5个传代培养物，以及在包含IL-2的细胞培养基中培养这些传代培养物中的每一者约6天。在一些前述实施例中，在与在快速第二扩增中开始培养第二TIL群体的容器相同大小或更大的容器中，分别培养至多5个传代培养物。在一些前述实施例中，第二TIL群体的培养物平均分在至多5个传代培养物中。在一些前述实施例中，方法的步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中(i)该方法包括自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的粗针活体组织切片获得第一TIL群体；(ii)该方法包括在进行起始第一扩增步骤之前进行以下步骤：在G-REX-100M培养瓶中在包含6000IU IL-2/mL的0.5L CM1培养基的细胞培养基中培养第一TIL群体约3天的时间段；(iii)该方法包括通过以下方式进行起始第一扩增：添加含有6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和约108个饲养细胞的0.5L CM1培养基，培养约8天的时间段；(iv)该方法包括通过以下方式进行快速第二扩增：(a)将第二TIL群体转移至含有具有3000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和5×109个饲养细胞的5L CM2培养基的G-REX-500MCS培养瓶中，培养约5天；(b)通过将109个TIL转移至含有具有3000IU/mL IL-2的5L AIM-V培养基的至多5个G-REX-500MCS培养瓶中的每一者中而将培养物分成至多5个传代培养物，培养该传代培养物约6天。在一些前述实施例中，方法的步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供扩增T细胞的方法，其包含：(a)通过培养第一T细胞群体以实现生长及启动第一T细胞群体的活化来进行自供体获得的第一T细胞群体的起始第一扩增；(b)在步骤(a)中启动的第一T细胞群体的活化开始衰减之后，通过培养第一T细胞群体以实现生长及增强第一T细胞群体的活化来进行第一T细胞群体的快速第二扩增，获得第二T细胞群体；(c)收集第二T细胞群体；以及(d)在步骤(c)之前或之后的任何时间基因编辑T细胞的一部分以在T细胞的表面上表达至少一种免疫调节组合物。在其他实施例中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移至大于第一容器的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)，在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的第一T细胞群体约4至7天的时间段。在其他实施例中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自第一小规模培养的第一T细胞群体转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群体部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时间段。在其他实施例中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约4至7天的时间段。在其他实施例中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配至至少2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，其中至少一种免疫调节组合物包含与膜锚融合的免疫调节剂(例如，本文所述的膜锚定的免疫调节融合蛋白)。在一些实施例中，免疫调节剂选自：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速第二扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移至大于第一容器的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在第二容器中的较大规模培养中培养来自小规模培养的第一T细胞群体约5至7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自第一小规模培养的第一T细胞群体转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群体部分在第二小规模培养中培养约5至7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约2至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5至7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5至6天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，其中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约5天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，其中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约6天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，其中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式达成培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-REX100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群体约3至4天的时间段进行快速第二扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群体转移并分配至2、3或4个大小比第一容器大的第二容器(例如G-REX-500MCS容器)中，在各第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群体部分在较大规模培养中培养约7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)的起始第一扩增进行至多7天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)的快速第二扩增进行至多8天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)的快速第二扩增进行至多9天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)的快速第二扩增进行至多10天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(b)的快速第二扩增进行至多11天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行7天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多9天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行7天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多10天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行7天或8天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多9天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行7天或8天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多10天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行8天的时间段，步骤(b)的快速第二扩增进行至多9天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，步骤(a)中的起始第一扩增进行8天的时间段，且步骤(b)的快速第二扩增进行至多8天的时间段。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含OKT-3和IL-2的第一培养基中培养。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3和IL-2。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一培养基包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第一T细胞群体在包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)的第二培养基中培养。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，第一培养基包含OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，第一APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第一APC群体层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中在第二培养基中培养，第二培养基包含OKT-3、IL-2和第二APC群体，第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第二APC群体层叠至第一透气表面上，第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，第一APC群体对于第一T细胞群体供体为外源性的，第一APC群体层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中在第二培养基中培养，第二培养基包含OKT-3、IL-2和第二APC群体，第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第二APC群体层叠至第一透气表面上，第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，第一培养基包含OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，第一APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第一APC群体层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中在第二培养基中培养，第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第二APC群体，第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第二APC群体层叠至第一透气表面上，第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一T细胞群体在包含第一透气表面的容器中在第一培养基中培养，第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群体，第一APC群体对于第一T细胞群体供体为外源性的，第一APC群体层叠至第一透气表面上，在步骤(b)中，第一T细胞群体在容器中在第二培养基中培养，第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第二APC群体，第二APC群体对于第一T细胞群体的供体为外源性的，第二APC群体层叠至第一透气表面上，第二APC群体比第一APC群体大。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第二APC群体中的APC的数目与第一APC群体中的APC的数目的比率为约2:1。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一APC群体中的APC的数目为约2.5×108，第二APC群体中的APC的数目为约5×108。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以2个APC层的平均厚度层叠至第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第二APC群体以选自4至8个APC层的范围内的平均厚度层叠至第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中层叠至第一透气表面上的APC层的平均数目与在步骤(a)中层叠至第一透气表面上的APC层的平均数目的比率为2:1。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约2.0×106个APC/cm2至刚好或约3.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以刚好或约2.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(b)中，第二APC群体以刚好或约4.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约1.0×106个APC/cm2至刚好或约4.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上，并在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约2.5×106个APC/cm2至刚好或约7.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约1.5×106个APC/cm2至刚好或约3.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约3.5×106个APC/cm2至刚好或约6.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以选自刚好或约2.0×106个APC/cm2至刚好或约3.0×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，第二APC群体以选自刚好或约4.0×106个APC/cm2至刚好或约5.5×106个APC/cm2的范围内的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(a)中，第一APC群体以刚好或约2.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上，在步骤(b)中，第二APC群体以刚好或约4.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中APC为外周血单核细胞(PBMC)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中PBMC经照射并对于第一T细胞群体的供体为外源性的。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中T细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中T细胞为骨髓浸润性淋巴细胞(MIL)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中T细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体通过自供体的全血分离而获得。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体通过自供体的单采产物分离而获得。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体通过T细胞表型的正向或负向选择自供体的全血或单采产物分离。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中T细胞表型为CD3+和CD45+。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在进行第一T细胞群体的起始第一扩增之前，自NK细胞分离T细胞。在其他实施例中，通过自第一T细胞群体移除CD3-CD56+细胞来将第一T细胞群体中的T细胞与NK细胞分离。在其他实施例中，通过使用移除CD3-CD56+细胞级分且回收阴性级分的门控策略对第一T细胞群体进行细胞分选，自第一T细胞群体移除CD3-CD56+细胞。在其他实施例中，前述方法用于以高百分比的NK细胞为特征的第一T细胞群体中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于以高百分比的CD3-CD56+细胞为特征的第一T细胞群体中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于以存在大量NK细胞为特征的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于以大量CD3-CD56+细胞为特征的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于自患有以存在大量NK细胞为特征的肿瘤的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于自患有以存在大量CD3-CD56+细胞为特征的肿瘤的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施例中，前述方法用于自患有卵巢癌的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，将刚好或约1×107个来自第一T细胞群体的T细胞接种在容器中，以开始此类容器中的初级第一扩增培养。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，将第一T细胞群体分布至多个容器中，在各容器中接种刚好或约1×107个来自第一T细胞群体的T细胞，以开始此类容器中的初级第一扩增培养。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在步骤(c)中收集的第二T细胞群体为治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自一个以上来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至20个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至10个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)、粗针活体组织切片、芯针活体组织切片或细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自一个以上来自供体的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至20个来自供体的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至10个来自供体的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织粗针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自一个以上来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至20个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至10个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织细针抽吸物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自一个以上来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至20个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至10个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织小活体组织切片(包括例如穿孔活体组织切片)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自一个以上来自供体的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至20个来自供体的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1至10个来自供体的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，第一T细胞群体获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织芯针活体组织切片。
在其他实施例中，本发明提供将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：i)通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养自受试者肿瘤的一个以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或穿刺活体组织切片获得的肿瘤样本约3天而由该肿瘤样本获得和/或接受第一TIL群体；(ii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增在具有第一透气表面区域的容器中进行，起始第一扩增进行约7或8天的第一时间段以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；(iii)通过用额外的IL-2、OKT-3和APC补充第二TIL群体的第二细胞培养基来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，在快速第二扩增中添加的APC的数目为在步骤(ii)中添加的APC的数目的至少两倍，快速第二扩增进行约11天的第二时间段以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，快速第二扩增在具有第二透气表面区域的容器中进行；(iv)收集自步骤(iii)获得的治疗性TIL群体；(v)将来自步骤(iv)的所收集的TIL群体转移至输注袋；以及(vi)在步骤(iv)之前或之后的任何时间基因编辑TIL细胞的至少一部分以在TIL细胞的表面上表达至少一种免疫调节组合物。
在其他实施例中，本发明提供将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，其包括：i)通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养自受试者肿瘤的一个以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或穿刺活体组织切片获得的肿瘤样本约3天而由该肿瘤样本获得和/或接受第一TIL群体；(ii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约7或8天的第一时间段以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；(iii)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的第三细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约11天的第二时间段以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，快速第二扩增在具有第二透气表面区域的容器中进行；(iv)收集自步骤(iii)获得的治疗性TIL群体；以及(v)在步骤(iv)之前或之后的任何时间基因编辑TIL细胞的至少一部分以在TIL细胞的表面上表达至少一种免疫调节组合物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在第二时间段的第5天后，将培养物分成2个以上传代培养物，向各传代培养物补充另外数量的第三培养基并且培养约6天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在第二时间段的第5天后，将培养物分成2个以上传代培养物，向各传代培养物补充包含IL-2的第四培养基并且培养约6天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，在第二时间段的第5天后，将培养物分成至多5个传代培养物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，方法中的所有步骤在约22天内完成。
在其他实施例中，本发明提供扩增T细胞的方法，其包括：(i)通过培养第一T细胞群体以实现生长及启动第一T细胞群体的活化来进行第一T细胞群体的起始第一扩增，该肿瘤样本自供体肿瘤的一个以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或穿刺活体组织切片获得；(ii)在步骤(a)中启动的第一T细胞群体的活化开始衰减之后，通过培养第一T细胞群体以实现生长及增强第一T细胞群体的活化来进行第一T细胞群体的快速第二扩增，获得第二T细胞群体；(iv)收集第二T细胞群体；以及(v)在步骤(iv)之前或之后的任何时间基因编辑T细胞的至少一部分以在T细胞的表面上表达至少一种免疫调节组合物。在一些实施例中，肿瘤样本自多个粗针活体组织切片获得。在一些实施例中，多个粗针活体组织切片选自：2、3、4、5、6、7、8、9和10个粗针活体组织切片。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的方法，其中至少一种免疫调节组合物包含与免疫调节剂融合的膜锚，该免疫调节剂选自如下：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IL-4、IL-1α、IL-1β、IL-5、IFNγ、TNFα(TNFa)、IFNα、IFNβ、GM-CSF、GCSF、CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)及其生物活性变体。在一些实施例中，细胞因子选自：IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在一些实施例中，细胞因子为IL-12。在一些实施例中，细胞因子为IL-15。在一些实施例中，细胞因子为IL-18。在一些实施例中，细胞因子为IL-21。在一些实施例中，免疫调节剂为CD40激动剂(例如，CD40L或激动性CD40结合结构域)。
在一些实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的方法，其中，T细胞或TIL自肿瘤消化物获得。在一些实施例中，通过在酶培养基(例如(但不限于)RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)孵育肿瘤，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术有限公司的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在一些实施例中，将肿瘤放置于肿瘤解离酶混合物中，该肿瘤解离酶混合物包含一种以上解离(消化)酶，例如(但不限于)胶原蛋白酶(包括任何混合物或类型的胶原蛋白酶)、AccutaseTM、AccumaxTM、玻尿酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜酶、蛋白酶型XIV(链蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，和它们的任何组合。在其他实施例中，将肿瘤放置于肿瘤解离酶混合物中，该肿瘤解离酶混合物包含胶原蛋白酶(包括任何混合物或类型的胶原蛋白酶)、中性蛋白酶(分散酶)和脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)。
IX.药物组合物、剂量和给药方案
在一些实施例中，使用本公开的方法扩增和/或基因修饰的TIL、MIL或PBL(包括基因修饰以表达CCR的TIL、MIL或PBL)作为药物组合物施用患者。在一些实施例中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施例中，T细胞以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可施用任何适合剂量的TIL。在一些实施例中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为NSCLC或黑色素瘤的情况下。在一些实施例中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施例中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施例中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施例中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010个。在一些实施例中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为黑色素瘤。在一些实施例中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为NSCLC。在一些实施例中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的数目为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的数目在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度小于例如药物组合物的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
提供于本发明的药物组合物中的TIL在广泛剂量范围内有效。准确剂量将视施用途径、化合物施用形式、待治疗受试者的性别和年龄、待治疗受试者的体重和主治医师的偏好和经验而定。适当时也可使用TIL的临床确定剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量将视所治疗的人或哺乳动物、病症或病状的严重程度、施用速率、活性药物成分的配置和开处方医师的判断而定。
在一些实施例中，TIL可以单次剂量施用。此类施用可通过例如静脉内注射的注射进行。在一些实施例中，TIL可以多次剂量施用。给药可为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。给药可为每月一次、每两周一次、一周一次或每隔一天一次。TIL的施用可视需要而继续。
在一些实施例中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施例中，TIL的有效剂量在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施例中，TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。
在一些实施例中，TIL的有效剂量在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg的范围内。
有效量的TIL可通过施用具有类似效用的药剂的任一种的接受模式，包括鼻内和经皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、非经肠、肌肉内、皮下、局部、通过移植或通过吸入，以单次或多次剂量施用。
在其他实施例中，本发明提供一种输注袋，其包含如上在任何前述段落中描述的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供一种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物，其包含如上在任何前述段落中描述的治疗性TIL群体和药学上可接受的载体。
在其他实施例中，本发明提供一种输注袋，其包含如上在任何前述段落中描述的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供一种如上在任何前述段落中描述的治疗性TIL群体的冷冻保存制剂。
在其他实施例中，本发明提供一种肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组合物，其包含如上在任何前述段落中描述的治疗性TIL群体和冷冻保存培养基。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上任何前述段落中描述的TIL组合物，其中，冷冻保存培养基含有DMSO。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上任何前述段落中描述的TIL组合物，其中，冷冻保存培养基含有7％至10％ DMSO。
在其他实施例中，本发明提供一种如上在任何前述段落中描述的TIL组合物的冷冻保存制剂。
在一些实施例中，使用本公开的方法扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一些实施例中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施例中，T细胞以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续约30至60分钟。其他适合的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可施用任何适合剂量的TIL。在一些实施例中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为NSCLC的情况下。在一些实施例中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施例中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施例中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施例中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010个。在一些实施例中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是癌症为NSCLC。在一些实施例中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施例中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施例中，提供在本发明的药物组合物中的TIL的数目为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的数目在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度小于例如药物组合物的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的浓度在药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v的范围内。
在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施例中，提供于本发明的药物组合物中的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
提供在本发明的药物组合物中的TIL在广泛剂量范围内有效。准确剂量将视施用途径、化合物施用形式、待治疗受试者的性别和年龄、待治疗受试者的体重和主治医师的偏好和经验而定。适当时也可使用TIL的临床确定剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量将视所治疗的人或哺乳动物、病症或病状的严重程度、施用速率、活性药物成分的配置和开处方医师的判断而定。
在一些实施例中，TIL可以单次剂量施用。此类施用可通过例如静脉内注射的注射进行。在一些实施例中，TIL可以多次剂量施用。给药可为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。给药可为每月一次、每两周一次、一周一次或每隔一天一次。TIL的施用可视需要而继续。
在一些实施例中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施例中，TIL的有效剂量在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施例中，TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。
在一些实施例中，TIL的有效剂量在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg的范围内。
有效量的TIL可通过施用具有类似效用的药剂的任一种的接受模式模式，包括鼻内和经皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、非经肠、肌肉内、皮下、局部、通过移植或通过吸入，以单次或多次剂量施用。
X.治疗患者的方法
治疗方法始于原始TIL收集和TIL培养。此类方法均已描述于例如以全文引用的方式并入本文中的Jin等人,《免疫疗法杂志》,2012,35(3):283-292的领域中。下文贯穿各个部分，包括实例，描述了治疗方法的实施例。
发现根据本文所述的方法，包括例如上文步骤A至F中所描述或根据上文步骤A至F(也如例如图1和/或图8中所示)而产生的扩增TIL在治疗癌症患者方面的特殊用途(例如，如以全文引用的方式并入本文中的Goff等人,《临床肿瘤学杂志》,2016,34(20):2389-239以及补充内容中所描述)。在一些实施例中，如先前描述自经切除转移性黑色素瘤保存物生长TIL(参见以全文引用的方式并入本文中的Dudley等人,《免疫疗法杂志》,2003,26:332-342)。可在无菌条件下分割新鲜肿瘤。可收集代表样本以用于正式病理分析。可使用2mm3至3mm3的单个碎片。在一些实施例中，自每位患者获得5、10、15、20、25或30个样本。在一些实施例中，自每位患者获得20、25或30个样本。在一些实施例中，自每位患者获得20、22、24、26或28个样本。在一些实施例中，自每位患者获得24个样本。可将样本置于24孔板的个别孔中，维持于含高剂量IL-2(6,000IU/mL)的生长培养基中，并监测肿瘤破坏和/或TIL增殖。如本文所述，可将在处理后剩余活细胞的任何肿瘤酶消化成单细胞悬浮液并冷冻保存。
在一些实施例中，可对成功生长的TIL进行取样以用于表型分析(CD3、CD4、CD8和CD56)，并在可用时针对自体肿瘤进行测试。若过夜共培养产生的干扰素-γ(IFN-γ)含量＞200pg/mL且为背景的两倍，则可认为TIL具反应性。(Goff等人,《免疫疗法杂志》,2010,33:840-847；其以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，可选择已证明具有自体反应性或充足生长模式的培养物用于第二扩增(例如根据图1和/或图8的步骤D中所提供的第二扩增)，包括有时称为快速扩增(REP)的第二扩增。在一些实施例中，选择具有高自体反应性(例如在第二扩增期间高度增殖)的经扩增TIL用于另外的第二扩增。在一些实施例中，选择具有高自体反应性(例如，在如图1和/或图8的步骤D中所提供的第二扩增期间高度增殖)的TIL用于根据图1和/或图8的步骤D的额外第二扩增。
可通过针对表面标记物CD3、CD4、CD8、CCR7和CD45RA的流式细胞术(例如FlowJo)(碧迪生物科学)以及通过本文所述的任一种方法分析输注袋TIL的冷冻保存样本的细胞表型。通过使用标准酶联免疫吸附分析技术测量血清细胞因子。血清IFN-g的升高定义为＞100pg/mL和大于43的基线水平。
在一些实施例中，通过本文所提供的方法，例如图1和/或图8中示例的方法产生的TIL实现对TIL临床功效的惊人改善。在一些实施例中，相较于通过除本文所述的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中示例的方法以外的方法)产生的TIL，通过本文所提供的方法，例如图1和/或图8中示例的方法产生的TIL显示出提高的临床功效。在一些实施例中，除本文所述的方法外的方法包括称为过程1C和/或第1代(Gen 1)的方法。在一些实施例中，通过DCR、ORR和/或其他临床反应测量增加的功效。在一些实施例中，相较于通过除本文所述的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中示例的方法以外的方法)产生的TIL，通过本文所提供的方法，例如图1中示例的方法产生的TIL显示出类似的反应时间和安全性概况。
在一些实施例中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施例中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施例中，采用针对IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。通过确定由本发明方法制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ水平，可测量IFN-γ产生，该方法包括如例如图1和/或图8中所描述的方法。在一些实施例中，IFN-γ增加指示对用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施例中，使用Quantikine ELISA试剂盒测量IFN-γ。在一些实施例中，测量用通过本发明方法，包括如例如图1和/或图8中所描述的方法制备的TIL治疗的受试者的离体TIL中的IFN-γ。在一些实施例中，测量用通过本发明方法，包括如例如图1和/或图8中所描述的方法制备的TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ。在一些实施例中，测量用通过本发明方法，包括如例如图1和/或图8中所描述的方法制备的TIL治疗的受试者的TIL血清中的IFN-γ。在一些实施例中，IFN-γ指示在治疗肿瘤中的治疗功效和/或增加的临床功效。
在一些实施例中，通过本发明的方法制备的TIL，包括如例如图1中所描述的那些TIL。在一些实施例中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施例中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施例中，采用针对IFN-γ产生的效力分析。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。通过测量由本发明方法制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ含量，可测量IFN-γ产生，该方法包括如例如图1和/或图8中所描述的方法。在一些实施例中，IFN-γ增加指示对用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图1和/或图8中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍IFN-γ。
在一些实施例中，通过本发明的方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL，相较于通过其他方法(包括未在图1和/或图8中示例的方法，包括例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL展现增加的多克隆性。在一些实施例中，显著提高的多克隆性和/或增加的多克隆性指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施例中，多克隆性指T细胞贮库多样性。在一些实施例中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施例中，相较于使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加1倍、2倍、10倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加2倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加10倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
功效的量度可包括疾病控制率(DCR)以及总反应率(ORR)，如本领域已知以及本文所述。
A.治疗癌症的方法
本文所述的组合物和方法可用于一种治疗疾病的方法中。在一些实施例中，其用于治疗成人患者或儿科患者中的过度增殖性病症，例如癌症。其也可用于治疗如本文和以下段落中所描述的其他病症。
在一些实施例中，过度增殖性病症为癌症。在一些实施例中，过度增殖性病症为实体肿瘤癌症。在一些实施例中，实体肿瘤癌症选自：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒(HPV)引起的癌症、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、宫颈癌(包括鳞状细胞宫颈癌、腺鳞状宫颈癌和宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
在一些实施例中，过度增殖性病症为造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，造血系统恶性肿瘤选自：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、被套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施例中，本发明包括治疗患有癌症的患者的方法，癌症为造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，癌症是造血系统恶性肿瘤。在一些实施例中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，癌症是造血系统恶性肿瘤。
在一些实施例中，癌症为前述癌症中的一者，包括实体肿瘤癌症和造血系统恶性肿瘤，其对于用至少一种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法或免疫疗法)治疗为复发性或难治性的。在一些实施例中，癌症对用至少两种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法)治疗为复发性或难治性的前述癌症之一。在一些实施例中，癌症对用至少三种先前疗法(包括化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法)治疗为复发性或难治性的前述癌症之一。
在一些实施例中，癌症为微卫星不稳定性高(MSI-H)或错配修复缺陷型癌症。MSI-H和dMMR癌症及其检测已描述于Kawakami等人，《当前肿瘤学的治疗选择(Curr.Treat.Options Oncol.)》2015,16,30中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中，该患者是人。在一些实施例中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中，该患者是非人。在一些实施例中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗患有癌症的患者的方法，其中，该患者是伴侣动物。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症难以用BRAF抑制剂和/或MEK抑制剂治疗。在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症难以用选自如下的BRAF抑制剂治疗：维罗非尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)、恩拉非尼(encorafenib)、索拉非尼(sorafenib)及其药学上可接受的盐或溶剂合物。在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症难以用选自如下的MEK抑制剂治疗：曲美替尼(trametinib)、考比替尼(cobimetinib)、贝美替尼(binimetinib)、司美替尼(selumetinib)、匹马色替尼(pimasertinib)、瑞法替尼(refametinib)及其药学上可接受的盐或溶剂合物。在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症难以用选自如下的BRAF抑制剂治疗：维罗非尼、达拉非尼、恩拉非尼、索拉非尼及其药学上可接受的盐或溶剂合物；且难以用选自如下的MEK抑制剂治疗：曲美替尼、考比替尼、贝美替尼、司美替尼、匹马色替尼、瑞法替尼及其药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症是儿科癌症。
在一些实施例中，本发明一种包括治疗患有癌症的患者的方法，其中，该癌症是葡萄膜黑色素瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该葡萄膜黑色素瘤是脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该儿科癌症是神经母细胞瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该儿科癌症是肉瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该肉瘤是骨肉瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该肉瘤是软组织肉瘤。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该软组织肉瘤是横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤或原始神经外胚层肿瘤(PNET)。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该儿科癌症为中枢神经系统(CNS)相关癌症。在一些实施例中，儿科癌症难以用化学疗法治疗。在一些实施例中，儿科癌症难以用放射疗法治疗。在一些实施例中，儿科癌症难以用地努图希单抗(dinutuximab)治疗。
在一些实施例中，本发明包括一种治疗患有癌症的患者的方法，其中，该CNS相关癌症为神经管胚细胞瘤、松果体母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤或神经胶母细胞瘤。
本文所述的组合物和方法可用于治疗癌症的方法，其中，癌症难以用抗PD-1或抗PD-L1抗体治疗或对预先治疗具有抗性。在一些实施例中，患者是抗PD-1或抗PD-L1抗体的原发性难治性患者。在一些实施例中，患者未显示出对抗PD-1或抗PD-L1抗体的先前反应。在一些实施例中，患者显示出对抗PD-1或抗PD-L1抗体的先前反应，随后患者的癌症进展。在一些实施例中，癌症难以用抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1或抗PD-L1抗体与至少一种化学治疗剂的组合治疗。在一些实施例中，先前化学治疗剂为卡铂、太平洋紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)和/或顺铂。在一些先前实施例中，化学治疗剂是铂双重化学治疗剂。在一些实施例中，铂双重疗法包含选自顺铂和卡铂的第一化学治疗剂，以及选自长春瑞滨(vinorelbine)、吉西他滨(gemcitabine)和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)或白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel))的第二化学治疗剂。在一些实施例中，铂双重化学治疗剂与培美曲塞组合。
在一些实施例中，NSCLC为PD-L1阴性和/或来自患有表达PD-L1且肿瘤比例评分(TPS)<1％的癌症的患者，如本文别处所描述。
在一些实施例中，NSCLC难以用包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体和铂双重疗法的组合疗法治疗，其中，该铂双重疗法包含：
i)第一化学治疗剂，其选自顺铂和卡铂，以及
ii)第二化学治疗剂，其选自如下：长春瑞滨、吉西他滨和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型紫杉醇)。
在一些实施例中，NSCLC难以用包含抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体、培美曲塞和铂双重疗法的组合疗法治疗，其中，该铂双重疗法包含：
i)第一化学治疗剂，其选自顺铂和卡铂，以及
ii)第二化学治疗剂，其选自：长春瑞滨、吉西他滨和紫杉烷(包括例如太平洋紫杉醇、多西他赛或白蛋白结合型紫杉醇)。
在一些实施例中，NSCLC已用抗PD-1抗体治疗。在一些实施例中，NSCLC已用抗PD-L1抗体治疗。在一些实施例中，NSCLC患者尚未接受治疗。在一些实施例中，NSCLC尚未用抗PD-1抗体治疗。在一些实施例中，NSCLC尚未用抗PD-L1抗体治疗。在一些实施例中，NSCLC先前已用化学治疗剂治疗。在一些实施例中，NSCLC先前已用化学治疗剂治疗，但目前不再用该化学治疗剂治疗。在一些实施例中，NSCLC患者未使用过抗PD-1/PD-L1。在一些实施例中，NSCLC患者具有低PD-L1表达。在一些实施例中，NSCLC患者未经NSCLC治疗或已接受化学治疗剂治疗，但未经PD-1/PD-L1治疗。在一些实施例中，NSCLC患者未经治疗或为化学疗法后治疗，但未经抗PD-1/PD-L1治疗且具有低PD-L1表达。在一些实施例中，NSCLC患者在基线时患有大块疾病。在一些实施例中，受试者在基线时患有大块疾病且具有低PD-L1表达。在一些实施例中，NSCLC患者不具有可检测的PD-L1表达。在一些实施例中，NSCLC患者未经治疗或接受化学治疗剂治疗后但未经抗PD-1/PD-L1治疗且不具有可检测的PD-L1表达。在一些实施例中，患者在基线时患有大块基线且不具有可检测的PD-L1表达。在一些实施例中，NSCLC患者具有未经治疗的NSCLC或接受化学疗法(例如，化学治疗剂)后但未经抗PD-1/PD-L1治疗，且该患者具有低PD-L1表达和/或在基线时具有大块疾病。在一些实施例中，当在横向或冠状面中测量的最大肿瘤直径大于7cm时指示为大块疾病。在一些实施例中，当存在具有20mm以上的短轴直径的肿胀淋巴结时指示为大块疾病。在一些实施例中，化学治疗剂包括NSCLC的标准护理治疗剂。
在一些实施例中，通过肿瘤比例评分确定PD-L1表达。在一些实施例中，患有难治性NSCLC肿瘤的受试者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施例中，患有难治性NSCLC肿瘤的受试者具有≥1％的TPS。在一些实施例中，患有难治性NSCLC的受试者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗并在该抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施例中，患有难治性NSCLC的受试者先前已用抗PD-L1抗体治疗并在该抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。
在一些实施例中，通过本发明的方法(包括如例如图1或图8中所描述的那些方法)制备的TIL，相较于通过其他方法(包括未在图1或图8中示例的那些方法，包括例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL展现增加的多克隆性。在一些实施例中，显著提高的多克隆性和/或增加的多克隆性指示对癌症治疗的治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施例中，多克隆性指T细胞贮库多样性。在一些实施例中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施例中，相较于使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加1倍、2倍、10倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加2倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加10倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施例中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1或图8中实施的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
在一些实施例中，使用如本文所述的一种以上测试方法通过肿瘤比例评分确定PD-L1表达。在一些实施例中，患有NSCLC肿瘤的受试者或患者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施例中，NSCLC肿瘤具有≥1％的TPS。在一些实施例中，患有NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗并在抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施例中，患有NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-L1抗体治疗并在该抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施例中，患有难治性或耐药性NSCLC肿瘤的受试者或患者具有<1％的肿瘤比例评分(TPS)。在一些实施例中，患有难治性或耐药性NSCLC肿瘤的受试者或患者具有≥1％的TPS。在一些实施例中，患有难治性或耐药性NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗并在抗PD-1和/或抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。在一些实施例中，患有难治性或耐药性NSCLC的受试者或患者先前已用抗PD-L1抗体治疗并在该抗PD-L1抗体治疗之前已确定肿瘤比例评分。
在一些实施例中，NSCLC是显示出肿瘤比例评分(TPS)的NSCLC，或在抗PD-1或抗PD-L1疗法之前自患者获取的活肿瘤细胞的百分比，在任何强度下展示部分或完全膜染色的PD-L1蛋白的百分比低于1％(TPS<1％)。在一些实施例中，NSCLC为显示出选自如下TPS的NSCLC：<50％、<45％、<40％、<35％、<30％、<25％、<20％、<15％、<10％、<9％、<8％、<7％、<6％、<5％、<4％、<3％、<2％、<1％、<0.9％、<0.8％、<0.7％、<0.6％、<0.5％、<0.4％、<0.3％、<0.2％、<0.1％、<0.09％、<0.08％、<0.07％、<0.06％、<0.05％、<0.04％、<0.03％、<0.02％和<0.01％。在一些实施例中，NSCLC为显示出选自如下TPS的NSCLC：约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％、约0.09％、约0.08％、约0.07％、约0.06％、约0.05％、约0.04％、约0.03％、约0.02％和约0.01％。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与1％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.9％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.8％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.7％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.6％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.5％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.4％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.3％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.2％之间的TPS的NSCLC。在一些实施例中，NSCLC是显示出0％与0.1％之间的TPS的NSCLC。TPS可通过本领域中已知的方法测量，例如描述于Hirsch等人,《胸肿瘤学期刊(J.Thorac.Oncol.)》2017,12,208-222中的那些方法或用于在使用帕博利珠单抗(pembrolizumab)或其他抗PD-1或抗PD-L1疗法治疗前确定TPS的那些方法。也可使用经美国食品药物管理局批准的用于测量TPS的方法。在一些实施例中，PD-L1是外泌体PD-L1。在一些实施例中，在循环肿瘤细胞上发现PD-L1。
在一些实施例中，部分膜染色包括1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多。在一些实施例中，完整膜染色包括约100％膜染色。
在一些实施例中，测试PD-L1可涉及测定患者血清中PD-L1的含量。在这些实施例中，患者血清中PD-L1的测量移除肿瘤异质性的不确定性和患者进行连续活体组织切片的不适。
在一些实施例中，相较于基线或标准水平升高的可溶性PD-L1与NSCLC的恶化的预后相关。参见例如Okuma等人，《临床肺癌(Clinical Lung Cancer)》,2018,19,410-417；Vecchiarelli等人，《肿瘤标靶(Oncotarget)》,2018,9,17554-17563。在一些实施例中，PD-L1是外泌体PD-L1。在一些实施例中，PD-L1在循环肿瘤细胞上表达。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其通过向有需要的受试者或患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，受试者或患者具有以下中的至少一者：
i.PD-L1的预定肿瘤比例评分(TPS)<1％，
ii.PD-L1的TPS分数为1％-49％，或
iii.一个以上驱动突变的预定缺失，
其中，驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变的MET信号、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变，其中，该方法包括：
(a)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从该受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，该第一扩增进行约3至14天以获得该第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开该系统的情况下进行；
(d)通过用额外IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充该第二TIL群体的该细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，该第二扩增进行约7天至14天以获得该第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开该系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；以及
(h)向该受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，该方法包括：
(a)测试该患者肿瘤的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试该患者不存在一个以上驱动突变，其中，该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变的MET信号、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变，
(c)确定该患者的PD-L1的TPS评分为约1％至约49％并确定该患者也无驱动突变，
(d)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至14天以获得第二TIL群体，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开系统的情况下进行；
(g)通过用额外IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得该第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(i)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(j)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；以及
(k)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，该方法包括：
(a)测试该患者肿瘤的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试该患者不存在一个以上驱动突变，其中，该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、EGFR外显子20突变、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变、RET融合、ERBB2突变、ERBB2扩增、BRCA突变、MAP2K1突变、PIK3CA、CDKN2A、PTEN突变、UMD突变、NRAS突变、KRAS突变、NF1突变、MET突变、MET剪接和/或改变的MET信号、TP53突变、CREBBP突变、KMT2C突变、KMT2D突变、ARID1A突变、RB1突变、ATM突变、SETD2突变、FLT3突变、PTPN11突变、FGFR1突变、EP300突变、MYC突变、EZH2突变、JAK2突变、FBXW7突变、CCND3突变和GNA11突变，
(c)确定该患者的PD-L1的TPS评分小于约1％并确定该患者也无驱动突变，
(d)通过将自该受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从该受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养该第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，该第一扩增进行约3至14天以获得该第二TIL群体，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开该系统的情况下进行；
(g)通过用额外IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得该第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开该系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(i)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(j)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；以及
(k)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的该第三TIL群体。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，该方法包括：
(a)测试该患者肿瘤的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试该患者不存在一个以上驱动突变，其中，该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变或RET融合，
(c)确定该患者的PD-L1的TPS评分为约1％至约49％并确定该患者也无驱动突变，
(d)通过将自该受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从该受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至14天以获得该第二TIL群体，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开该系统的情况下进行；
(g)通过用额外IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得该第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(i)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开该系统的情况下进行；
(j)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；以及
(k)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其通过向有需要的患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，该方法包括：
(a)测试该患者肿瘤的PD-L1表达和PD-L1的肿瘤比例评分(TPS)，
(b)测试该患者不存在一个以上驱动突变，其中，该驱动突变选自如下：EGFR突变、EGFR插入、KRAS突变、BRAF突变、ALK突变、c-ROS突变(ROS1突变)、ROS1融合、RET突变或RET融合，
(c)确定该患者的PD-L1的TPS评分小于约1％并确定该患者也无驱动突变，
(d)通过将自该受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(e)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(f)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至14天以获得第二TIL群体，自步骤(e)至步骤(f)的转变在不打开该系统的情况下进行；
(g)通过用额外IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7天至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(f)至步骤(g)的转变在不打开该系统的情况下进行；
(h)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开该系统的情况下进行；
(i)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开该系统的情况下进行；
(j)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；以及
(k)向受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的本文所述的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，在分别施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群体和TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，该方法进一步包括在向受试者施用TIL细胞之后次日开始用高剂量IL-2方案治疗受试者的步骤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为实体肿瘤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为黑色素瘤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为HNSCC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为宫颈癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为NSCLC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供经修改的用于治疗患有本文所述的癌症的受试者的方法，其中，癌症为儿科高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法中的本文所述的治疗性TIL群体，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法中的本文所述的TIL组合物，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或本文所述的TIL组合物，其中，在向受试者施用治疗有效剂量的本文所述的治疗性TIL群体或本文所述的TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其进一步包括在向患者施用TIL细胞之后当天开始用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为实体肿瘤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为黑色素瘤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为HNSCC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为宫颈癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为NSCLC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为神经胶母细胞瘤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供经修改的本文所述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为儿科高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体在治疗受试者的癌症的方法中的用途，其包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供本文所述的治疗性TIL群体或本文所述的TIL组合物在治疗患者的癌症的方法中的用途，该方法包括向患者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案，随后向受试者施用治疗有效剂量的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或治疗有效剂量的本文所述的TIL组合物。
1.与PD-1和PD-L1抑制剂的组合
在一些实施例中，向癌症患者提供的TIL疗法可包括单独用治疗性TIL群体治疗，或可包括组合治疗，该组合治疗包括TIL和一种以上PD-1和/或PD-L1抑制剂。
程序性死亡1(PD-1)为由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)T细胞、活化单核细胞和树突状细胞表达的288氨基酸跨膜免疫检查点受体蛋白。PD-1，也称为CD279，属于CD28家族，并在人类中由2号染色体上的PDcd1基因编码。PD-1由一个免疫球蛋白(Ig)超家族结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成，胞内结构域含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸切换基序(ITSM)。已知PD-1及其配体(PD-L1和PD-L2)在免疫耐受性中起重要作用，如Keir等人,《免疫学年度评论》2008,26,677-704中所描述。PD-1提供负向调节T细胞免疫反应的抑制信号。PD-L1(也称为B7-H1或CD274)和PD-L2(也称为B7-DC或CD273)表达于肿瘤细胞和基质细胞上，其可能遇到表达PD-1的活化T细胞，导致对T细胞的免疫抑制。PD-L1为由人9号染色体上的Cd274基因编码的290氨基酸跨膜蛋白。使用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和/或PD-L2抑制剂阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用，可克服免疫抗性，如近期临床研究，例如Topalian等人,《新英格兰医学杂志(N.Eng.J.Med.)》2012,366,2443-54中所描述的研究所显示。PD-L1表达在许多肿瘤细胞系上，而PD-L2主要表达在树突状细胞和一些肿瘤株上。除T细胞(其在活化后诱导性表达PD-1)以外，PD-1也表达于B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、活化单核细胞和树突状细胞上。
在一些实施例中，TIL和PD-1抑制剂作为用于治疗NSCLC的组合疗法或协同疗法施用。
在一些实施例中，NSCLC尚未经历先前疗法。在一些实施例中，将PD-1抑制剂作为一线疗法或初始疗法施用。在一些实施例中，将PD-1抑制剂作为一线疗法或初始疗法与如本文所述的TIL组合施用。
在一些实施例中，PD-1抑制剂可为本领域已知的任何PD-1抑制剂或PD-1阻断剂。详言之，其为在以下段落中更详细描述的PD-1抑制剂或阻断剂之一。关于PD-1抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的PD-1抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及PD-1抑制剂时也可指代小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为抗体(即抗PD-1抗体)、其片段，包括其Fab片段或单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，PD-1抑制剂为多克隆抗体。在一些实施例中，PD-1抑制剂为单克隆抗体。在一些实施例中，PD-1抑制剂竞争结合PD-1，和/或结合至PD-1上的表位。在一些实施例中，抗体竞争结合PD-1，和/或结合至PD-1上的表位。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约100pM以下的KD结合人PD-1、以约90pM以下的KD结合人PD-1、以约80pM以下的KD结合人PD-1、以约70pM以下的KD结合人PD-1、以约60pM以下的KD结合人PD-1、以约50pM以下的KD结合人PD-1、以约40pM以下的KD结合人PD-1、以约30pM以下的KD结合人PD-1、以约20pM以下的KD结合人PD-1、以约10pM以下的KD结合人PD-1，或以约1pM以下的KD结合人PD-1。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约7.5×105l/M·s或更快的kassoc结合人PD-1、以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-1、以约8×1051/M·s或更快的kassoc结合人PD-1、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-1、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-1、以约9.5×105l/M·s或更快的kassoc结合人PD-1，或以约1×106l/M·s或更快的kassoc结合人PD-1。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.2×10-51/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1，或以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.8×10-51/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1，或以约3×10-51/s或更慢的kdissoc结合人PD-1。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约10nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约9nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约8nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约7nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约6nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约5nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约4nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约3nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约2nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，或以约1nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗(可自百时美施贵宝公司以OPDIVO商购)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。纳武单抗为阻断PD-1受体的完全人IgG4抗体。在一些实施例中，抗PD-1抗体为免疫球蛋白G4κ抗(人CD274)抗体。纳武单抗经分配化学文摘社(CAS)登记号946414-94-4且也称为5C4、BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538。纳武单抗的制备和特性描述于美国专利第8,008,449号和国际专利公开第WO 2006/121168号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。纳武单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效已描述于Wang等人,《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res.)》2014,2,846-56；Page等人，《医学年评(Ann.Rev.Med.)》,2014,65,185-202；和Weber等人,《临床肿瘤学杂志》,2013,31,4311-4318中，其公开内容以引用的方式并入本文中。纳武单抗的氨基酸序列阐述于表26中。纳武单抗在22-96、140-196、254-314、360-418、22”-96”、140”-196”、254”-314”和360”-418”处具有重链内二硫键；在23'-88'、134'-194'、23”'-88”'和134”'-194”'处具有轻链内二硫键；在127-214'、127”-214”'处具有重链-轻链间二硫键；在219-219”和222-222”处具有重链-重链间二硫键；并在290、290”处具有N-糖基化位点(H CH284.4)。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含SEQ ID NO：158所示的重链和SEQ ID NO：159所示的轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159中所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含纳武单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：160中所示的序列，且PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：161中所示的序列及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：161中所示的序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160和SEQID NO：161中所示的序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：161中所示的序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：161中所示的序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：161中所示的序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163和SEQID NO：164中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166和SEQ ID NO：167中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为药物管理机构参考纳武单抗批准的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗PD-1抗体，该抗PD-1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化，氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-1抗体，其中，该抗PD-1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。抗PD-1抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为纳武单抗。
表26：参考纳武单抗的PD-1抑制剂的氨基酸序列。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，纳武单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为纳武单抗或其生物类似物，每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用纳武单抗。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，每2周以约240mg进行施用。在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，且每4周以约480mg进行施用。在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，每3周于同一天施用约1mg/kg纳武单抗，然后施用3mg/kg伊匹木单抗，持续4次剂量，随后每2周施用240mg或每4周施用480mg纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，每2周以约3mg/kg施用纳武单抗且每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，每3周以约360mg施用纳武单抗，加上每6周1mg/kg伊匹木单抗与2个周期的含铂双重化疗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，每2周以约240mg或每4周以480mg施用纳武单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，每3周以约360mg施用纳武单抗且每6周施用1mg/kg伊匹木单抗，以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，以约3mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天以约1mg/kg施用伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用240mg纳武单抗，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，以约3mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天以约1mg/kg施用伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用240mg、每4周施用480mg纳武单抗，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗局部晚期或转移性尿道上皮癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗局部晚期或转移性尿道上皮癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗成人和小儿患者中的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，每2周以约3mg/kg施用纳武单抗以治疗<40kg的小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，以约3mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天施用1mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用240mg纳武单抗，以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，以约3mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天施用1mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每4周施用480mg纳武单抗，以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，以约1mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天施用3mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每2周施用纳武单抗240mg，以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，以约1mg/kg施用纳武单抗，然后每3周在同一天施用3mg/kg伊匹木单抗达4次剂量，随后每4周施用480mg纳武单抗，以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施例中，每2周以约240mg施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施例中，每4周以约480mg施用纳武单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始纳武单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包括帕博利珠单抗(可自美国新泽西州凯尼尔沃思之默克公司以KEYTRUDA商购)或抗原结合片段、缀合物或变体。帕博利珠单抗经分配CAS登记号1374853-91-4且也称为兰立珠单抗、MK-3475和SCH-900475。帕博利珠单抗具有免疫球蛋白G4抗(人蛋白PDCD1(程序性细胞死亡1))抗体，含(人小家鼠单克隆重链)二硫键与人小家鼠单克隆轻链二聚体结构。帕博利珠单抗的结构也可描述为免疫球蛋白G4抗(人计程序细胞死亡1)抗体；含人源化小鼠单克隆[228-L-脯氨酸(H10-S>P)]γ4重链(134-218')二硫键与人源化小鼠单克隆κ轻链二聚体(226-226”:229-229”)双二硫键。帕博利珠单抗的特性、用途和制备描述于国际专利公开第WO 2008/156712 A1号、美国专利第8,354,509号以及美国专利申请公开第US2010/0266617 A1号、第US2013/0108651 A1号和第US 2013/0109843A2号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。帕博利珠单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效描述于Fuerst,《肿瘤学时报(Oncology Times)》,2014,36,35-36；Robert等人,《柳叶刀(Lancet)》,2014,384,1109-17；和Thomas等人,《生物治疗专家意见(Exp.Opin.Biol.Ther.)》,2014,14,1061-1064中。帕博利珠单抗的氨基酸序列阐述于表27中。帕博利珠单抗包括以下二硫键：22-96、22”-96”、23'-92'、23”'-92”'、134-218'、134”-218”'、138'-198'、138”'-198”'、147-203、147”-203”、226-226”、229-229”、261-321、261”-321”、367-425和367”-425”；以及以下糖基化位点(N)：Asn-297和Asn-297”。帕博利珠单抗为在Fc区中含稳定化S228P突变的IgG4/κ同种型；IgG4铰链区中此突变的插入防止形成IgG4抗体通常观测到的半分子。帕博利珠单抗在各重链的Fc域内在Asn297处异质糖基化，使得完整抗体的分子量为约149kDa。帕博利珠单抗的主要糖型为岩藻糖基化去半乳糖基二触角聚糖形式(G0F)。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含SEQ ID NO：168所示的重链和SEQ ID NO：169所示的轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：169中所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含帕博利珠单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：170中所示的序列，PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：171中所示的序列及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171中所示的序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171中所示的序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171中所示的序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171中所示的序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171中所示的序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施例中，PD-1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173和SEQID NO：174中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：177中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为药物管理机构参考帕博利珠单抗批准的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗PD-1抗体，该抗PD-1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。在一些实施例中，该一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化，氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-1抗体，其中，该抗PD-1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。抗PD-1抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为帕博利珠单抗。
表27：参考帕博利珠单抗的PD-1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，帕博利珠单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，帕博利珠单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中帕博利珠单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，纳武单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，施用帕博利珠单抗以治疗小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗SCLC。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗SCLC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，施用帕博利珠单抗以治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗HNSCC。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗HNSCC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施例中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施例中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗尿道上皮癌。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗尿道上皮癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌。在一些实施例中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR癌。在一些实施例中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷大肠直肠癌(dMMR CRC)。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR CRC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗胃癌。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗胃癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗食道癌。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗食道癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗宫颈癌。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗宫颈癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗肝细胞癌(HCC)。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗HCC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，成人每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗默克氏细胞癌(MCC)。在一些实施例中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MCC。在一些实施例中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗MCC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗肾细胞癌(RCC)。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗且每天两次经口施用阿西替尼(axitinib)5mg以治疗RCC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗子宫内膜癌。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗且每天一次经口施用用于非MSI-H或dMMR肿瘤的乐伐替尼(lenvatinib)20mg以治疗子宫内膜癌。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，成人每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高肿瘤突变负荷(TMB-H)癌症。在一些实施例中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗TMB-H癌症。在一些实施例中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗TMB-H癌症。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗皮肤鳞状细胞癌(cSCC)。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗cSCC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施例中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗TNBC。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，若患者或受试者为成人，即治疗成人适应症，则可采用另外的每6周400mg的给药方案。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，在IL-2施用后1、2或3天开始帕博利珠单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为可商购的抗PD-1单克隆抗体，例如抗m-PD-1克隆J43(目录号BE0033-2)和RMP1-14(目录号BE0146)(美国新罕布夏州西黎巴嫩的Bio XCell,Inc.)。多种可商购的抗PD-1抗体为本领域一般技术人员所知。
在一些实施例中，PD-1抑制剂为公开于美国专利第8,354,509号或美国专利申请公开第2010/0266617A1号、第2013/0108651A1号、第2013/0109843A2号中的抗体，这些专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，PD-1抑制剂为描述于美国专利第8,287,856号、第8,580,247号和第8,168,757号以及美国专利申请公开第2009/0028857A1号、第2010/0285013A1号、第2013/0022600A1号和第2011/0008369A1号中的抗PD-1抗体，它们的教导内容以引用的方式并入本文中。在其他实施例中，PD-1抑制剂为公开于美国专利第8,735,553B1号中的抗PD-1抗体，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，PD-1抑制剂为皮立珠单抗，也称为CT-011，其描述于美国专利第8,686,119号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，PD-1抑制剂可为小分子或肽或肽衍生物，例如美国专利第8,907,053号、第9,096,642号和第9,044,442号以及美国专利申请公开第US2015/0087581号中所描述的小分子或肽或肽衍生物；1,2,4-恶二唑化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第2015/0073024号中所描述的1,2,4-恶二唑化合物和衍生物；环状肽模拟化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第US2015/0073042号中所描述的环状肽模拟化合物和衍生物；环状化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第US2015/0125491中所描述的环状化合物和衍生物；1,3,4-恶二唑和1,3,4-噻二唑化合物和衍生物，例如国际专利申请公开第WO2015/033301号中所描述的1,3,4-恶二唑和1,3,4-噻二唑化合物和衍生物；基于肽的化合物和衍生物，例如国际专利申请公开第WO 2015/036927号和第WO 2015/04490号中所描述的基于肽的化合物和衍生物；或基于肽的巨环化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第US2014/0294898号中所描述的基于肽的巨环化合物和衍生物；它们各自的公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，PD-1抑制剂是西米普利单抗(cemiplimab)，其可商购自再生元公司(Regeneron,Inc.)。
在一些实施例中，TIL和PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂以用于治疗NSCLC的组合疗法或协同疗法施用。
在一些实施例中，NSCLC尚未经历先前疗法。在一些实施例中，将PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂作为一线疗法或初始疗法施用。在一些实施例中，将PD-L1抑制剂或PD-L2抑制剂作为一线疗法或初始疗法与如本文所述的TIL组合施用。
在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂可为本领域已知的任何PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂。详言之，其为在以下段落中更详细描述的PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂之一。关于PD-L1和PD-L2抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的PD-L1或PD-L2抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及PD-L1或PD-L2抑制剂时也可指代化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
在一些实施例中，本文所述的组合物、过程和方法包括PD-L1或PD-L2抑制剂。在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂为小分子。在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂为抗体(即抗PD-1抗体)、其片段，包括其Fab片段或单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂为多克隆抗体。在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂为单克隆抗体。在一些实施例中，PD-L1或PD-L2抑制剂竞争结合PD-L1或PD-L2和/或结合至PD-L1或PD-L2上的表位。在一些实施例中，抗体竞争结合PD-L1或PD-L2，和/或结合至PD-L1或PD-L2上的表位。
在一些实施例中，本文提供的PD-L1抑制剂对PD-L1具有选择性，因为化合物与PD-L1结合或相互作用的浓度相比其与其他受体(包括PD-L2受体)结合或相互作用的浓度低得多。在某些实施例中，化合物结合PD-L1受体的结合常数比结合PD-L2受体高至少约2倍的浓度、高约3倍的浓度、高约5倍的浓度、高约10倍的浓度、高约20倍的浓度、高约30倍的浓度、高约50倍的浓度、高约100倍的浓度、高约200倍的浓度、高约300倍的浓度或高约500倍的浓度。
在一些实施例中，本文提供的PD-L2抑制剂对PD-L2具有选择性，因为化合物与PD-L2结合或相互作用的浓度相比其与其他受体(包括PD-L1受体)结合或相互作用的浓度低得多。在某些实施例中，化合物结合PD-L2受体的结合常数比结合PD-L1受体高至少约2倍的浓度、高约3倍的浓度、高约5倍的浓度、高约10倍的浓度、高约20倍的浓度、高约30倍的浓度、高约50倍的浓度、高约100倍的浓度、高约200倍的浓度、高约300倍的浓度或高约500倍的浓度。
不受任何理论束缚，认为肿瘤细胞表达PD-L1，T细胞表达PD-1。然而，肿瘤细胞对PD-L1的表达不为PD-1或PD-L1抑制剂或阻断剂的功效所需。在一些实施例中，肿瘤细胞表达PD-L1。在其他实施例中，肿瘤细胞不表达PD-L1。在一些实施例中，方法可包括PD-1和PD-L1抗体(例如本文所述的PD-1和PD-L1抗体)与TIL的组合。可同时或依序施用PD-1和PD-L1抗体与TIL的组合。
在一些实施例中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约100pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约90pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约80pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约70pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约60pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约50pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2、以约40pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2，或以约30pM以下的KD结合人PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施例中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2、以约8×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2、以约9.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2，或以约1×106 1/M·s或更快的kassoc结合人PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施例中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-L1或PD-L2、以约2.1×10-51/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-1、以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-L1或PD-L2，或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合人PD-L1或PD-L2。
在一些实施例中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约10nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约9nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约8nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约7nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约6nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约5nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约4nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约3nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合、以约2nM以下的IC50阻断或抑制人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合，或以约1nM以下的IC50阻断人PD-1或阻断人PD-L1或人PD-L2与人PD-1的结合。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为德瓦鲁单抗，也称为MEDI4736(其可＝自马里兰州盖瑟斯堡阿斯特捷利康制药公司子公司Medimmune,LLC商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一些实施例中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利第8,779,108号或美国专利申请公开第2013/0034559号中的抗体，它们的公开内容以引用的方式并入本文中。德瓦鲁单抗的临床功效已描述于Page等人,《年度医学评论》,2014,65,185-202；Brahmer等人,《临床肿瘤学杂志》2014,32,5s(增刊，摘要8021)；和McDermott等人,《癌症治疗评论(CancerTreatment Rev.)》,2014,40,1056-64中。德瓦鲁单抗的制备和特性描述于美国专利第8,779,108号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。德瓦鲁单抗的氨基酸序列阐述于表28中。德瓦鲁单抗单克隆抗体包括22-96、22”-96”、23'-89'、23”'-89”'、135'-195'、135”'-195”'、148-204、148”-204”、215'-224、215”'-224”、230-230”、233-233”、265-325、265”-325”、371-429和371”-429'处的二硫键；以及Asn-301和Asn-301”处的N-糖基化位点。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：178所示的重链和SEQ ID NO：179所示的轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179中所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179中所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179中所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：178和SEQ ID NO：179中所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：179中所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含德瓦鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：180中所示的序列，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：181中所示的序列及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181中所示的序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181中所示的序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181中所示的序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180和SEQ IDNO：181中所示的序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：181中所示的序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为药物管理机构参考德瓦鲁单抗批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。在一些实施例中，该一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化，氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中，该抗PD-L1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为德瓦鲁单抗。
表28：参考德瓦鲁单抗的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为阿维鲁单抗，也称为MSB0010718C(可自默克集团/雪兰诺商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。阿维鲁单抗的制备和特性描述于美国专利申请公开第US2014/0341917 A1号中，其公开内容特别以引用的方式并入本文中。阿维鲁单抗的氨基酸序列阐述于表29中。阿维鲁单抗具有22-96、147-203、264-324、370-428、22”-96”、147”-203”、264”-324”和370”-428”处的重链内二硫键(C23-C104)；22'-90'、138'-197'、22”'-90”'和138”'-197”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；223-215'和223”-215”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；229-229”和232-232”处的重链-重链内二硫键(h 11，h 14)；300、300”处的N-糖基化位点(H CH2 N84.4)；岩藻糖基化复合体二触角CHO类聚糖；以及450和450'处的H CHS K2 C末端赖氨酸裁剪。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：188所示的重链和SEQ ID NO：189所示的轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189中所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189中所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189中所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：188和SEQ ID NO：189中所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189中所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含阿维鲁单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：190中所示的序列，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：191中所示的序列及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191中所示的序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191中所示的序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191中所示的序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190和SEQ IDNO：191中所示的序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：191中所示的序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193和SEQ ID NO：194中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196和SEQ ID NO：197中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为药物管理机构参考阿维鲁单抗批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。在一些实施例中，该一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化，氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中，该抗PD-L1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为阿维鲁单抗。
表29：参考阿维鲁单抗的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为阿替利珠单抗，也称为MPDL3280A或RG7446(其可自瑞士巴塞尔罗氏的子公司基因泰克公司以TECENTRIQ商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一些实施例中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利第8,217,149号中的抗体，其公开内容特别以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利申请公开第2010/0203056A1号、第2013/0045200A1号、第2013/0045201A1号、第2013/0045202A1号或第2014/0065135A1号中的抗体，它们的公开内容特别以引用的方式并入本文中。阿替利珠单抗的制备和特性描述于美国专利第8,217,149号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。阿替利珠单抗的氨基酸序列阐述于表30中。阿替利珠单抗具有22-96、145-201、262-322、368-426、22”-96”、145”-201”、262”-322”和368”-426”处的重链内二硫键(C23-C104)；23'-88'、134'-194'、23”'-88”'和134”'-194”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；221-214'和221”-214”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；227-227”和230-230”处的重链-重链内二硫键(h 11，h 14)；以及298和298'处的N-糖基化位点(H CH2N84.4>A)。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含SEQ ID NO：198所示的重链和SEQ ID NO：199所示的轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199中所示的序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198和SEQ IDNO：199中所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199中所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199中所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：198和SEQ ID NO：199中所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：198和SEQ ID NO：199中所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含阿替利珠单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：200中所示的序列，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：201中所示的序列及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201中所示的序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ IDNO：200和SEQ ID NO：201中所示的序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201中所示的序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201中所示的序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201中所示的序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：204中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206和SEQ ID NO：207中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体为药物管理机构参考阿替利珠单抗批准的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。在一些实施例中，该一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化，氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中，该抗PD-L1抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。抗PD-L1抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为阿替利珠单抗。
表30：参考阿替利珠单抗的PD-L1抑制剂的氨基酸序列
在一些实施例中，PD-L1抑制剂包括美国专利申请公开第US2014/0341917 A1号中所描述的那些抗体，其公开内容以引用的方式并入本文中。在其他实施例中，也包括与这些抗体中的任一种竞争结合至PD-L1的抗体。在一些实施例中，抗PD-L1抗体为MDX-1105，也称为BMS-935559，其公开于美国专利第US 7,943,743号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗PD-L1抗体选自公开于美国专利第US 7,943,743号中的抗PD-L1抗体，该专利以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，PD-L1抑制剂为可商购单克隆抗体，例如INVIVOMAB抗m-PD-L1克隆10F.9G2(目录号BE0101，美国新罕布夏州西黎巴嫩的Bio X Cell,Inc.)。在一些实施例中，抗PD-L1抗体为可商购单克隆抗体，例如AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)。多种可商购抗PD-L1抗体为本领域一般技术人员所知。
在一些实施例中，PD-L2抑制剂为可商购单克隆抗体，例如BIOLEGEND 24F.10C12小鼠IgG2aκ同种型(目录号329602，加利福尼亚圣地亚哥Biolegend,Inc.)、SIGMA抗PD-L2抗体(目录号SAB3500395，密苏里州圣路易斯西格玛奥瑞奇公司)或本领域一般技术人员已知的其他可商购抗PD-L2抗体。
2.与CTLA-4抑制剂的组合
在一些实施例中，提供给癌症患者的TIL疗法可包括单独用治疗性TIL群体治疗，或可包括组合治疗，组合治疗包括TIL和一种以上CTLA-4抑制剂。
细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)为免疫球蛋白超家族成员且表达于辅助T细胞表面上。CTLA-4为CD28依赖性T细胞活化的负向调节因子且充当适应性免疫反应的检查点。类似于T细胞共刺激蛋白CD28，CTLA-4结合抗原在细胞上呈递CD80和CD86。CTLA-4将抑制子信号递送至T细胞，而CD28递送刺激信号。针对人CTLA-4的人抗体已描述为许多疾病病状的免疫刺激调节剂，例如治疗或预防病毒和细菌感染且治疗癌症(WO 01/14424和WO 00/37504)。已在临床试验中研究多种完全人抗人CTLA-4单克隆抗体(mAb)，用于治疗各种类型的实体肿瘤，这些抗体包括(但不限于)伊匹木单抗(MDX-010)和曲美单抗(CP-675,206)。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂可为本领域已知的任何CTLA-4抑制剂或CTLA-4阻断剂。详言之，其为在以下段落中更详细描述的CTLA-4抑制剂或阻断剂之一。关于CTLA-4抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的CTLA-4抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及CTLA-4抑制剂时也可指代小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
适用于本发明的方法的CTLA-4抑制剂包括(但不限于)抗CTLA-4抗体、人抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人源化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多克隆抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、MDX-010(伊匹木单抗)、曲美单抗、抗CD28抗体、抗CTLA-4阿德奈汀、抗CTLA-4结构域抗体、单链抗CTLA-4片段、重链抗CTLA-4片段、轻链抗CTLA-4片段、激动共刺激通路的CTLA-4抑制剂、公开于PCT公开第WO 2001/014424号中的抗体、公开于PCT公开第WO 2004/035607号中的抗体、公开于美国公开第2005/0201994号中的抗体和公开于授与欧洲专利第EP 1212422B1号中的抗体，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。另外的CTLA-4抗体描述于美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号和第6,984,720号中；PCT公开第WO 01/14424号和第WO 00/37504号中；以及美国公开第2002/0039581号和第2002/086014号中，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。可用于本发明方法中的其他抗CTLA-4抗体包括例如公开于以下中的抗体：WO 98/42752；美国专利第6,682,736号和第6,207,156号；Hurwitz等人,《美国国家科学院院刊》,95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人,《临床肿瘤学杂志》,22(145):摘要号2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人,《癌症研究》,58:5301-5304(1998)；以及美国专利第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号和第7,132,281号，它们各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
另外的CTLA-4抑制剂包括(但不限于)以下：通常由于经活化而能够破坏CD28抗原结合至其同源配体的能力、抑制CTLA-4结合至其同源配体的能力、增强通过共刺激通路的T细胞反应、破坏B7结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏B7活化共刺激通路的能力、破坏CD80结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏CD80活化共刺激通路的能力、破坏CD86结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏CD86活化共刺激通路的能力和破坏共刺激通路的任何抑制剂。此必定包括：CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激通路的其他成员的小分子抑制剂；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激通路的其他成员的抗体；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激通路的其他成员的反义分子；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激通路的其他成员的阿德奈汀；CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激通路的其他成员的RNAi抑制剂(单链和双链)；以及其他CTLA-4抑制剂。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂以如下Kd结合CTLA-4，该Kd为约10-6M或更小、10- 7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小，例如10-13M与10-16M之间，或在任两个前述值作为端点的任何范围内。在一些实施例中，当使用相同分析比较时，CTLA-4抑制剂结合至CTLA-4的Kd不超过伊匹木单抗的Kd的10倍。在一些实施例中，当使用相同分析比较时，CTLA-4抑制剂结合至CTLA-4的Kd与伊匹木单抗的Kd大约相同或更小(例如低至多10倍或低至多100倍)。在一些实施例中，当使用相同分析比较时，与CTLA-4分别与CD80或CD86结合的伊匹木单抗介导的抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值高不超过10倍。在一些实施例中，当使用相同分析比较时，与CTLA-4分别与CD80或CD86结合的伊匹木单抗介导的抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值大约相同或更小(例如，低至多10倍或低至多100倍)。
在一些实施例中，以如下量使用CTLA-4抑制剂，该量足以相对于适合的对照将CTLA-4的表达抑制和/或使CTLA-4的生物活性降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如50％与75％之间、75％与90％之间或90％与100％之间。在一些实施例中，以如下量使用CTLA-4通路抑制剂，该量足以通过使CTLA-4与CD80、CD86或两者的结合相对于适合的对照减少至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如相对于适合的对照减少50％与75％之间、75％与90％之间或90％与100％之间来降低CTLA-4之生物活性。在评定或量化所关注的药剂的效应的上下文中的适合对照通常为尚未暴露于所关注的药剂(例如CTLA-4通路抑制剂)或用该药剂处理的相当的生物系统(例如细胞或受试者)(或已暴露于可忽略量或用可忽略量进行处理)。在一些实施例中，生物系统可充当其自身的对照，例如可在暴露于药剂或用药剂处理之前评定生物系统并与开始或结束暴露或处理之后的状态进行比较。在一些实施例中，可使用历史对照。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗(可自百时美施贵宝公司以Yervoy商购)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。如本领域中已知，伊匹木单抗指抗CTLA-4抗体，一种来源于具有编码重链和轻链的人基因以产生功能性人谱系的转基因小鼠的完全人IgG1κ抗体。伊匹木单抗也可通过其CAS登记号477202-00-9和在PCT公开第WO 01/14424中提及，该公开出于所有目的以全文引用的方式并入。其以抗体10DI的形式公开。特别地，伊匹木单抗含有轻链可变区和重链可变区(具有包含SEQ ID NO：211的轻链可变区且具有包含SEQ ID NO：210的重链可变区)。伊匹木单抗的药物组合物包括含有伊匹木单抗和一种以上稀释剂、媒剂或赋形剂的所有药学上可接受的组合物。含有伊匹木单抗的药物组合物的实例描述于国际专利申请公开第WO 2007/67959号中。伊匹木单抗可静脉内(IV)施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO：208所示的重链和SEQ ID NO：209所示的轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209中所示的序列的重链和轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209中所示的序列具有至少99％的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209中所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209中所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQID NO：208和SEQ ID NO：209中所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：208和SEQ ID NO：209中所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含伊匹木单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：210中所示的序列，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：211中所示的序列及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211中所示的序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211中所示的序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211中所示的序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211中所示的序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：210和SEQ ID NO：211中所示的序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：214中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：217中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为药物管理机构参考伊匹木单抗批核准的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。伊匹木单抗的氨基酸序列阐述于表31中。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中，该抗CTLA-4抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为伊匹木单抗。
表31：伊匹木单抗的氨基酸序列
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，其中伊匹木单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，伊匹木单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施例中，在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，且每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用伊匹木单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施例中，每3周以约mg/kg施用伊匹木单抗，持续最多4次剂量以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施例中，每3周以约10mg/kg施用伊匹木单抗，持续4次剂量，然后每12周施用10mg/kg，持续至多3年，以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，每3周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，紧然后在同一天施用3mg/kg纳武单抗，持续4次剂量，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施例中，在完成组合的4次剂量之后，可根据标准给药方案针对晚期肾细胞癌和/或肾细胞癌以单一试剂形式施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，每3周经30分钟以约1mg/kg静脉内施用伊匹木单抗，紧然后在同一天经30分钟静脉内施用3mg/kg纳武单抗，持续4次剂量，以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌。在一些实施例中，在完成组合物的4次剂量之后，如根据标准给药方案所推荐针对高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性大肠直肠癌以单一试剂形式施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，每3周经30分钟以约3mg/kg静脉内施用伊匹木单抗，紧然后在同一天经30分钟静脉内施用1mg/kg纳武单抗，持续4次剂量，以治疗肝细胞癌。在一些实施例中，在完成组合的4次剂量之后，根据标准给药方案针对肝细胞癌以单一试剂形式施用纳武单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗且每2周施用3mg/kg纳武单抗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，加上每3周360mg纳武单抗与2个周期的含铂双重化疗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施例中，施用伊匹木单抗以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施例中，每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗且每3周施用360mg纳武单抗，以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
曲美单抗(也称为CP-675,206)为完全人IgG2单克隆抗体且CAS编号为745013-59-6。曲美单抗以抗体11.2.1形式公开于美国专利第6,682,736号(以引用的方式并入本文中)中。曲美单抗的重链和轻链的氨基酸序列分别阐述于SEQ IND NO:218和219中。已在临床试验中针对治疗包括黑色素瘤和乳腺癌的各种肿瘤研究了曲美单抗；其中每4或12周以0.01与15mg/kg之间的剂量范围呈单次剂量或多次剂量静脉内施用曲美单抗。在本发明提供的方案中，局部施用，尤其是皮内或皮下施用曲美单抗。皮内或皮下施用的曲美单抗的有效量通常在每人5-200毫克/剂的范围内。在一些实施例中，曲美单抗的有效量在每人每剂10-150毫克/剂的范围内。在一些特定实施例中，曲美单抗的有效量为每人约10、25、37.5、40、50、75、100、125、150、175或200毫克/剂。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO：218所示的重链和SEQ ID NO：219所示的轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：219中所示的序列的重链和轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：219中所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：219中所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：219中所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：219中所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：218和SEQ ID NO：219中所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含曲美单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：220中所示的序列，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：221中所示的序列及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：221中所示的序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：221中所示的序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：221中所示的序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：221中所示的序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：220和SEQ ID NO：221中所示的序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：223和SEQ ID NO：224中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226和SEQ ID NO：227中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为药物管理机构参考曲美单抗批准的抗CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。曲美单抗的氨基酸序列显示于表32中。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中，该抗CTLA-4抗体提供在一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为曲美单抗。
表32：曲美单抗的氨基酸序列。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美单抗施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，其中曲美单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，曲美单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施例中，在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美单抗施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为曲美单抗或其生物类似物，且每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用曲美单抗。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美单抗施用。在一些实施例中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美单抗施用。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为来自Agenus的泽弗利单抗或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。泽弗利单抗为完全人单克隆抗体。泽弗利单抗经分配化学文摘社(CAS)登记号2148321-69-9且也称为AGEN1884。泽弗利单抗的制备和特性描述于美国专利第10,144,779号和美国专利申请公开第US2020/0024350A1号中，它们的的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含SEQ ID NO：228所示的重链和SEQ ID NO：229所示的轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：228和SEQ ID NO：229中所示的序列的重链和轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228和SEQ ID NO：229中所示的序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228和SEQ ID NO：229中所示的序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228和SEQ ID NO：229中所示的序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228和SEQ ID NO：229中所示的序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：228和SEQ ID NO：229中所示的序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含泽弗利单抗的重链和轻链CDR或可变区(VR)。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包含SEQ ID NO：230中所示的序列，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO：231中所示的序列及其保守氨基酸取代。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231中所示的序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231中所示的序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231中所示的序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231中所示的序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含各自分别与SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231中所示的序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包含分别具有SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：233和SEQ ID NO：234中所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；以及分别具有SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：236和SEQ ID NO：237中所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一些实施例中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的表位。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为药物管理机构参考泽弗利单抗批准的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一些实施例中，生物类似物包含抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包含与参考药品或参考生物产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其相较于该参考药品或参考生物产品包含一个以上翻译后修饰，其中，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。在一些实施例中，一个以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。泽弗利单抗的氨基酸序列阐述于表33中。在一些实施例中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中，该抗CTLA-4抗体提供于一种与参考药品或参考生物产品的制剂不同的制剂中，其中，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。抗CTLA-4抗体可获得药物管理机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。在一些实施例中，生物类似物提供为进一步包含一种以上赋形剂的组合物，其中，该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物产品中包含的赋形剂相同或不同，其中，该参考药品或参考生物产品为泽弗利单抗。
表33：泽弗利单抗的氨基酸序列
另外的抗CTLA-4抗体的实例包括(但不限于)：AGEN1181、BMS-986218、BCD-145、ONC-392、CS1002、REGN4659和ADG116，其为本领域技术人员已知。
在一些实施例中，抗CTLA-4抗体为公开于以下专利公开中的任一者中的抗CTLA-4抗体：US2019/0048096 A1；US2020/0223907；US2019/0201334；US2019/0201334；US 2005/0201994；EP 1212422 B1；WO 2018/204760；WO 2018/204760；WO 2001/014424；WO 2004/035607；WO 2003/086459；WO 2012/120125；WO 2000/037504；WO 2009/100140；WO 2006/09649；WO2005092380；WO 2007/123737；WO 2006/029219；WO 2010/0979597；WO 2006/12168；以及WO1997020574，它们各自以引用的方式并入本文中。另外的CTLA-4抗体描述于以下中：美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号和第6,984,720号；PCT公开第WO 01/14424号和第WO 00/37504号；以及美国公开第2002/0039581号和第2002/086014号；和/或美国专利第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号和第7,132,281号，它们各自以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗CTLA-4抗体为例如公开于以下中的那些抗体：WO 98/42752；美国专利第6,682,736号和第6,207,156号；Hurwitz等人,《美国国家科学院院刊》,1998,95,10067-10071(1998)；Camacho等人,《临床肿瘤学杂志》2004,22,145(摘要第2505号(2004)(抗体CP-675206)；或Mokyr等人,《癌症研究(Cancer Res.)》,1998,58,5301-5304(1998)，它们各自以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为如WO 1996/040915(以引用的方式并入本文中)中所公开的CTLA-4配体。
在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为CTLA-4表达的核酸抑制剂。例如，抗CTLA-4RNAi分子可呈描述于以下的分子的形式：PCT公开第WO 1999/032619号和第WO 2001/029058号；美国公开第2003/0051263号、第2003/0055020号、第2003/0056235号、第2004/265839号、第2005/0100913号、第2006/0024798号、第2008/0050342号、第2008/0081373号、第2008/0248576号和第2008/055443号；和/或美国专利第6,506,559号、第7,282,564号、第7,538,095号和第7,560,438号(以引用的方式并入本文中)。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子呈在欧洲专利第EP 1309726号(以引用的方式并入本文中)中描述的双链RNAi分子形式。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子呈在美国专利第7,056,704号以及第7,078,196号(以引用的方式并入本文中)中描述的双链RNAi分子形式。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂为PCT公开第WO 2004/081021号(以引用的方式并入本文中)中所描述的适体。
在其他实施例中，本发明的抗CTLA-4RNAi分子为在美国专利第5,898,031号、第6,107,094号、第7,432,249号和第7,432,250号以及欧洲申请第EP 0928290号(以引用的方式并入本文中)中描述的RNA分子。
3.患者的淋巴细胞耗竭预调节
在一些实施例中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本公开的TIL之前经非骨髓清除式化疗预治疗。在一些实施例中，本发明包括用于治疗已用非骨髓清除式化疗预治疗的患者的癌症的TIL群体。在一些实施例中，TIL群体通过输注施用。在一些实施例中，非骨髓清除式化疗为环磷酰胺60mg/kg/天2天(在TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/天5天(在TIL输注前第27至23天)。在一些实施例中，在根据本公开的非骨髓清除式化疗和TIL输注(第0天)之后，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2(阿地白介素，可以PROLEUKIN商购)的静脉内输注以达到生理耐受。在某些实施例中，TIL群体用于与IL-2组合治疗癌症，其中，IL-2在TIL群体之后施用。
实验发现表明，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，淋巴细胞耗竭通过消除调节性T细胞且竞争免疫系统的元件(“细胞因子库”)在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施例在引入本发明的TIL之前在患者身上采用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
一般而言，使用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称为马磷酰胺)意及它们的组合的施用实现淋巴细胞耗竭。此类方法描述于Gassner等人,《癌症免疫学和免疫治疗》2011,60,75-85、Muranski等人,《自然临床实践肿瘤学》,2006,3,668-681、Dudley等人,《临床肿瘤学杂志》2008,26,5233-5239和Dudley等人,《临床肿瘤学杂志》2005,23,2346-2357中，所有文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，氟达拉滨以0.5μg/mL至10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施例中，氟达拉滨以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施例中，施用氟达拉滨治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施例中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施例中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施例中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用4至5天。在一些实施例中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天施用4至5天。
在一些实施例中，通过施用环磷酰胺获得浓度为0.5μg/mL至10μg/mL的环磷酰胺的活性形式马磷酰胺。在一些实施例中，通过施用环磷酰胺获得浓度为1μg/mL的环磷酰胺的活性形式马磷酰胺。在一些实施例中，施用环磷酰胺治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施例中，环磷酰胺以100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天或300mg/m2/天的剂量施用。在一些实施例中，环磷酰胺为静脉内(即i.v.)施用。在一些实施例中，环磷酰胺治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施例中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉内施用4至5天。在一些实施例中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉内施用4天。
在一些实施例中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺一起施用给患者进行淋巴细胞耗竭。在一些实施例中，经4天以25mg/m2/天静脉内施用氟达拉滨且以250mg/m2/天静脉内施用环磷酰胺。
在一些实施例中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施例中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天和以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭，其中，在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施例中，通过以约50mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭，其中，在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施例中，通过以约50mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约20mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭，其中，在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施例中，通过以约40mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约20mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭，其中，在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施例中，通过以约40mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天和以约15mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭，其中，在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施例中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天来进行淋巴细胞耗竭。
在一些实施例中，环磷酰胺与美司钠(mesna)一起施用。在一些实施例中，美司钠以15mg/kg施用。在一些实施例中，输注美司钠，若连续输注，则历经24小时，伴随各自环磷酰胺剂量开始，美司钠可经约2小时与环磷酰胺一起输注(第-5天和/或第-4天)，随后在剩余22小时以3mg/kg/小时的速率输注。
在一些实施例中，淋巴细胞耗竭包括以下步骤：在向患者施用第三TIL群体之后次日开始用IL-2方案治疗患者。
在一些实施例中，淋巴细胞耗竭包括以下步骤：在向患者施用第三TIL群体的同一天用IL-2方案治疗患者。
在一些实施例中，淋巴细胞耗竭包括5天的预调节治疗。在一些实施例中，天数指示为第-5天至第-1天，或第0天至第4天。在一些实施例中，该方案包含第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的环磷酰胺。在一些实施例中，该方案包含第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的静脉内环磷酰胺。在一些实施例中，该方案包含第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的60mg/kg静脉内环磷酰胺。在一些实施例中，环磷酰胺与美司钠一起施用。在一些实施例中，该方案进一步包含氟达拉滨。在一些实施例中，该方案进一步包含静脉内氟达拉滨。在一些实施例中，该方案进一步包含25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施例中，该方案进一步包含第-5天和第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施例中，该方案进一步包含第-5天和第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨(fludarabine)五天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨一天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案为根据表34施用。
表34：示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案根据表35施用。
表35：示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案
天 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案根据表36施用。
表36：示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案
天 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案根据表37施用。
表37：示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺60mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨25mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案根据表38施用。
表38：示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺300mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨30mg/m2/天 X X X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案根据表39施用。
表38：示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案根据表40施用。
表40：示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案
天 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺300mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨30mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案根据表41施用。
表41：示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案
天 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
环磷酰胺300mg/kg X X
美司钠(按需要) X X
氟达拉滨30mg/m2/天 X X X
TIL输注 X
在一些实施例中，与骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案的前述实施例一起使用的TIL输注可为本文所述的任何TIL组合物，以及添加IL-2方案和施用如本文所述的协同疗法(例如，PD-1和PD-L1抑制剂)。
4.IL-2方案
在一些实施例中，IL-2方案包括高剂量IL-2方案，其中，高剂量IL-2方案包括阿地白介素或其生物类似物或变体，其在施用治疗性TIL群体的治疗有效部分之后次日开始静脉内施用，阿地白介素或其生物类似物或变体是每八小时使用15分钟推注静脉内输注以0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者体重)的剂量施用直至耐受，最多为14个剂量。在休止9天后，可重复此时程再施用14次剂量，最多总计28次剂量。在一些实施例中，IL-2以1、2、3、4、5或6次剂量施用。在一些实施例中，IL-2以至多6次剂量的最大剂量施用。
在一些实施例中，IL-2方案包括递减IL-2方案。递减IL-2方案已描述于O'Day等人,《临床肿瘤学杂志》1999,17,2752-61和Eton等人,《癌症》2000,88,1703-9，它们的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，递减IL-2方案包括经6小时静脉内施用18×106IU/m2，然后经12小时静脉内施用18×106IU/m2，然后经24小时静脉内施用18×106IU/m2，然后经72小时静脉内施用4.5×106IU/m2的阿地白介素或其生物类似物或变体。此治疗周期可每28天重复，达最多四个周期。在一些实施例中，递减IL-2方案包括第1天18,000,000IU/m2，第2天9,000,000IU/m2以及第3天和第4天4,500,000IU/m2。
在一些实施例中，IL-2方案包括低剂量IL-2方案。可使用本领域中已知的任何低剂量IL-2方案，包括Dominguez-Villar和Hafler，《自然免疫学(Nat.Immunology)》2000,19,665-673；Hartemann等人,《柳叶刀糖尿病与内分泌学(Lancet DiabetesEndocrinol.)》2013,1,295-305；以及Rosenzwaig等人,《风湿病年鉴(Ann.Rheum.Dis.)》2019,78,209-217中所描述的低剂量IL-2方案，它们的的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，低剂量IL-2方案包括每24小时18×106IU/m2的阿地白介素或其生物类似物或变体，以连续输注形式施用5天；随后2至6天不施用IL-2疗法；可选地然后以每24小时连续输注18×106IU/m2的形式再静脉内施用阿地白介素或其生物类似物或变体5天；可选地在之后3周不施用IL-2疗法，随后可进行另外周期的施用。
在一些实施例中，IL-2以至多6次剂量的最大剂量施用。在一些实施例中，高剂量IL-2方案适用于小儿用途。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为600,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为500,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为400,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为500,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为300,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为200,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施例中，使用每8至12小时剂量为100,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。
在一些实施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用聚乙二醇化IL-2。在一些实施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用贝培阿地白介素或其片段、变体或生物类似物。
在一些实施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用THOR-707或其片段、变体或生物类似物。
在一些实施例中，IL-2方案包括在施用TIL之后施用奈瓦纽金α或其片段、变体或生物类似物。在某些实施例中，每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量向患者施用奈瓦纽金。
在一些实施例中，IL-2方案包括施用移植至抗体主链上的IL-2片段。在一些实施例中，IL-2方案包括施用结合IL-2低亲和力受体的抗体细胞因子移植蛋白。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施例中，抗体细胞因子移植蛋白包含重链可变区(VH)，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中，该IL-2分子为突变蛋白，该抗体细胞因子移植蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一些实施例中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用抗体或其片段、变体或生物类似物，该抗体包含选自SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：38的重链和选自SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39的轻链。
在一些实施例中，本文所述的抗体细胞因子移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如但不限于阿地白介素或可比分子)长。
在一些实施例中，与髓清除式淋巴细胞耗竭方案的前述实施例一起使用的TIL输注可为本文所述的任何TIL组合物，也可以包括代替TIL输注的MIL和PBL输注，以及添加IL-2方案和施用如本文所述的协同疗法(例如PD-1和/或PD-L1抑制剂和/或CTLA-4抑制剂)。
5.其他治疗方法
在其他实施例中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的如上适用的在任何前述段落中描述的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效剂量的如上适用的在任何前述段落中描述的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，在施用治疗有效剂量的如上适用的在任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或治疗有效剂量的如上适用的在任何前述段落中描述的TIL组合物的前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包含以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其进一步包含在向受试者施用TIL细胞之后次日开始用高剂量IL-2方案治疗受试者的步骤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为实体肿瘤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的在任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、大肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为黑色素瘤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为HNSCC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为宫颈癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为NSCLC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中，癌症为小儿高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用之用于治疗患有任何前述段落中所描述的癌症的受试者，其中，癌症选自：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒(HPV)引起的癌症、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、宫颈癌(包括鳞状细胞宫颈癌、腺鳞状宫颈癌和宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物，其中，在向受试者施用治疗有效剂量的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物，其进一步包含以下步骤：在向患者施用TIL细胞之后次日开始用高剂量IL-2方案治疗患者。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物，其中，癌症为实体肿瘤。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中所描述的治疗性TIL群体或经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的TIL组合物，其中，癌症为黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、大肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物，其中，癌症为黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物，其中，癌症为黑色素瘤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为HNSCC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为宫颈癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为NSCLC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物，其中，癌症为小儿高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中所描述的治疗性TIL群体或经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的TIL组合物，其中，癌症选自：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒(HPV)引起的癌症、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、宫颈癌(包括鳞状细胞宫颈癌、腺鳞状宫颈癌和宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案，随后向该受试者施用治疗有效剂量的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或治疗有效剂量的如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物，其中，在向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群体或治疗有效剂量的TIL组合物之前，已向受试者施用非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体的用途或如上适用的任何前述段落中描述的TIL组合物的用途，其进一步包含以下步骤：始于在向患者施用TIL细胞之后当天，用高剂量IL-2方案治疗患者。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为实体肿瘤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、大肠直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌或肾细胞癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为黑色素瘤。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为HNSCC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为宫颈癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为NSCLC。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为胃肠癌。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症为小儿高突变癌症。
在其他实施例中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中所描述的治疗性TIL群体或TIL组合物的用途，其中，癌症选自：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人乳头状瘤病毒(HPV)引起的癌症、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、宫颈癌(包括鳞状细胞宫颈癌、腺鳞状宫颈癌和宫颈腺癌)、大肠癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃交界处癌症、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
实例
现参考以下实例描述本文涵盖的实施例。这些实例仅出于说明的目的提供，本公开决不应理解为限于这些实例，而应理解为涵盖基于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化形式。
实例1：制备用于PRE-REP和REP过程的培养基
此实例描述用于制备适用于涉及来源于各种实体肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的培养的方案的组织培养基的程序。此培养基可用于制备本申请和实例中所描述的任何TIL。
制备CM1。自冷藏库取出以下试剂并使其在37℃水浴中升温：(RPMI1640、人AB血清、200mM L-谷氨酰胺)。根据下表42，通过将各成分添加至适用于待过滤体积的0.2μm过滤器单元的顶部来制备CM1培养基。在4℃下储存。
表42：制备CM1
使用当天，将所需量的CM1在37℃水浴中预热并添加6000IU/mL IL-2。
根据表43，可按需要进行额外补充。
表43：按需要对CM1的额外补充。
制备CM2
从冰箱取出已制备的CM1或制备新鲜CM1。从冰箱取出且通过在无菌培养基瓶中混合已制备的CM1与等体积来制备所需量的CM2。在使用当天向CM2培养基中添加3000IU/mL IL-2。在使用当天用3000IU/mL IL-2制成足够量的CM2。将CM2培养基瓶标记上名称、制备者名字缩写、过滤/制备日期、两周的过期日期，并在需要用于组织培养之前储存于4℃下。
制备CM3
在需要使用的当天制备CM3。CM3与培养基相同，但在使用当天补充3000IU/mL IL-2。通过向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2储备液，制备满足实验需求的量的CM3。通过轻微振荡进行充分混合。添加AIM-V之后，立即将瓶子标记上“3000IU/mL IL-2”若存在过量的CM3，则将其储存在处于4℃下的瓶子中，标记上培养基名称、制备者名字缩写、制备培养基的日期及其过期日期(制备后7天)。储存在4℃下7天后，舍弃补充有IL-2的培养基。
制备CM4
CM4与CM3相同，但另外补充2mM GlutaMAXTM(最终浓度)。每1L CM3添加10mL的200mM GlutaMAXTM。通过向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2储备液和GlutaMAXTM储备液，制备满足实验需求的量的CM4。通过轻微振荡进行充分混合。在添加至AIM-V中之后，立即将瓶子标记为“3000IL/mL IL-2和GlutaMAX”。若存在过量CM4，则将其在4℃下储存于瓶子中，标记上培养基名称、“GlutaMAX””及其过期日期(制备后7天)。在4℃下储存超过7天后，舍弃补充有IL-2的培养基。
实例2：IL-2、IL-15和IL-21细胞因子混合物的用途
此实例描述充当其他T细胞生长因子的IL-2、IL-15和IL-21细胞因子与本文中的任何实例的TIL过程组合的用途。
使用本文所述的过程，TIL可在实验的一个组中在存在IL-2的情况下自肿瘤生长，在开始培养时，在另一个组中用IL-2、IL-15和IL-21的组合代替IL-2。在预REP完成时，评定培养物的扩增、表型、功能(CD107a+和IFN-γ)和TCR Vβ谱系。IL-15和IL-21在本文中别处和Santegoets等人,《转化医学杂志(J.Transl.Med.)》,2013,11,37中描述。
结果可表明，相对于仅IL-2条件，可观测到在IL-2、IL-15和IL-21处理条件下，CD4+和CD8+细胞中的增强的TIL扩增(>20％)。相对于仅IL-2培养物，在从经IL-2、IL-15和IL-21处理的培养物获得的TIL中，出现了以CD8+群体为主的倾斜，TCRVβ谱系也有所倾斜。与仅经IL-2处理的TIL相比，经IL-2、IL-15和IL-21处理的TIL中的IFN-γ和CD107a升高。
实例3：对单个批次的γ照射的外周单核细胞进行鉴定
此实例描述用于鉴定在本文所述的示例性方法中用作同种异体饲养细胞的单个批次的经γ照射的外周单核细胞(PBMC，也称为单核细胞或MNC)的简化程序。
各经照射的MNC饲养细胞批次均由受试者供体制备。在存在经纯化的抗CD3(克隆OKT3)抗体和白介素-2(IL-2)的情况下，针对各批次或供体在REP中扩增TIL的能力进行单独筛选。此外，各批次的饲养细胞均在不添加TIL的情况下测试，以验证所接受的γ照射剂量足以使其复制机能不全。
TIL的REP需要经γ照射、生长停滞的MNC饲养细胞。饲养细胞MNC上的膜受体与抗CD3(克隆OKT3)抗体结合并与REP培养瓶中的TIL交联，刺激TIL扩增。饲养细胞批次由采集自受试者供体的全血的白细胞清除术制备。将白细胞清除术产物在Ficoll-Hypaque上进行离心、洗涤、照射并在GMP条件下冷冻保存。
重要的是，接受TIL疗法的患者不输注活饲养细胞，因为此可能导致移植物抗宿主病(GVHD)。因此，饲养细胞的生长受到γ照射抑制，导致双链DNA断裂和在重新培养时MNC细胞的细胞存活率的损失。
饲养细胞批次根据两个标准来评估：(1)其在共培养中使TIL扩增>100倍的能力，和(2)其复制机能不全。
利用在立式T25组织培养瓶中生长的两个主要预REP TIL株系，以微型REP(mini-REP)版本测试饲养细胞批次。饲养细胞批次针对两个不同的TIL株系进行测试，因为各TIL株系在其响应于REP中活化而增殖的能力方面是独特的。作为对照，与测试批次一起运行了许多历来已证明满足上述标准的经照射的MNC饲养细胞。
为确保在单一实验中测试的所有批次都接受等效测试，可使用相同预REP TIL株系的足够储备液来测试所有条件和所有饲养细胞批次。
对于所测试的各批次饲养细胞，总共存在六个T25培养瓶：预REP TIL株系#1(2个培养瓶)；预REP TIL株系#2(2个培养瓶)；和饲养细胞对照组(2个培养瓶)。含有TIL株系#1和#2的培养瓶用于评估饲养细胞批次扩增TIL的能力。饲养细胞对照组培养瓶评估了饲养细胞批次的复制机能不全。
A.实验方案
第-2/3天，将TIL株系解冻。制备CM2培养基并使CM2在37℃水浴中保温。制备40mL补充有3000IU/mL IL-2的CM2。保持温热直至使用。将20mL不含IL-2的预热的CM2放置于两个50mL锥形管中的每一者中，用所用TIL株系的名称标记。自LN2储存取出两个指定的预REPTIL株系并将小瓶转移至组织培养室。通过将小瓶放置在经密封的拉链储存袋内于37℃水浴中来解冻直至剩余少量冰。
使用无菌移液管，将各小瓶的内容物立即转移至所制备的经标记的50mL锥形管中的20mL CM2中。使用不含IL-2的CM2补足至40mL以洗涤细胞，并在400×CF下离心5分钟。抽吸上清液，再悬浮于补充有3000IU/mL IL-2的5mL温热的CM2中。
使用自动细胞计数器一式两份地移出小等分试样(20μL)用于细胞计数。记录计数。在计数时，将具有TIL细胞的50mL锥形管放置于37℃，5％ CO2湿式培养箱中，将盖松开以允许气体交换。测量细胞浓度，将TIL在补充有3000IU/mL IL-2的CM2中稀释至1×106个细胞/毫升。
在37℃湿式培养箱中，按需要在24孔组织培养板中的多个孔中以2毫升/孔进行培养，直至微型REP的第0天。不同的TIL株系在单独的24孔组织培养板中培养以避免混淆和潜在的交叉污染。
第0天，开始微型REP。针对待测试的饲养细胞批次的数目制备足够的CM2培养基。(例如，为了一次测试4个饲养细胞批次，制备800mL CM2培养基)。将上述制备的CM2的一部分等分，其补充3000IU/mL IL-2用于细胞培养。(例如，为了一次测试4个饲养细胞批次，制备具有3000IU/mL IL-2的500mL CM2培养基)。
用各TIL株系独立地操作以防止交叉污染，自培养箱取出具有TIL培养物的24孔板，转移至BSC。
使用无菌移液管或100-1000μL移液器和吸头，自待使用的TIL的各孔中取出约1mL的培养基，将其置于24孔组织培养板的未使用的孔中。
使用新鲜的无菌移液管或100-1000μL移液器和吸头，将剩余培养基与孔中的TIL混合以再悬浮细胞，随后将细胞悬浮液转移至标记有TIL批次名称的50mL锥形管中，记录体积。
用保留的培养基清洗孔，将该体积转移至相同的50mL锥形管中。以400×CF旋转细胞以收集细胞沉淀物。抽吸培养基上清液，将细胞沉淀物再悬浮在2至5mL含有3000IU/mLIL-2的CM2培养基中，所使用的体积基于所收集的孔的数目和沉淀物的大小，即，体积应足以确保浓度>1.3×106个细胞/mL。
使用血清移液管，将细胞悬浮液充分混合，记录体积。取出200μL以使用自动细胞计数器进行细胞计数。在计数时，将装有TIL细胞的50mL锥形管放置于5％ CO2，37℃湿式培养箱中，将盖松开以允许气体交换。记录计数。
自培养箱取出含有TIL细胞的50mL锥形管，将其中的细胞以1.3×106个细胞/mL的浓度再悬浮在补充有3000IU/mL IL-2的温热的CM2中。将50mL锥形管放回培养箱中并将盖子松开。
对于第二TIL株系，重复以上步骤。
仅在将TIL接种至用于实验的T25培养瓶中之前，如下所示将TIL以1:10稀释至最终浓度为1.3×105个细胞/mL。
制备MACS GMP CD3纯(OKT3)工作溶液。自4℃冰箱中取出OKT3的储备溶液(1mg/mL)，放置于BSC中。在微型REP的培养基中使用最终浓度为30ng/mL的OKT3。
在用于实验的各T25培养瓶中，每20mL需要600ng OKT3；此相当于每20mL需要60μL的10μg/mL溶液，或各饲养细胞批次的全部6个测试培养瓶需要360μL。
对于各测试的饲养细胞批次，制备400μL 1:100稀释度的1mg/mL OKT3，工作浓度为10μg/mL(例如，一次测试4个饲养细胞批次，制备1600μL 1:100稀释度的1mg/mL OKT3：16μL 1mg/mL OKT3+1.584mL具有3000IU/mL IL-2的CM2培养基)。
制备T25培养瓶。在制备饲养细胞之前，用CM2培养基标记各培养瓶和经填充的培养瓶。将培养瓶放置于37℃、5％ CO2湿式培养箱中以保持培养基温热，同时等待添加其余组分。在制备饲养细胞后，将组分添加至各培养瓶中的CM2中。
其他信息提供于表44中。
表44.溶液信息
制备饲养细胞。对于此方案，所测试的每个批次需要最少78×106个饲养细胞。由SDBB冷冻的各1mL小瓶在冷冻时具有100×106个活细胞。假设自液态N2储存解冻后的回收率为50％，建议每批次至少解冻两个1mL小瓶的饲养细胞，从而在各REP中使用估计100×106个活细胞。或者，若供应在1.8mL小瓶中，则仅一个小瓶提供足够的饲养细胞。
在将饲养细胞解冻之前，对于待测试的各饲养细胞批次，预温热约50mL不含IL-2的CM2。自LN2储存器取出指定饲养细胞批次小瓶，放置于拉链储存袋中，放置于冰上。小瓶在密闭的拉链储存袋中通过浸没于37℃水浴中来解冻。自拉链袋取出小瓶，用70％EtOH喷涂或擦拭，并转移至BSC。
使用移液管，将饲养细胞小瓶的内容物立即转移至50mL锥形管中的30mL温热的CM2中。用小体积的CM2洗涤小瓶以移除小瓶中的任何残余细胞，在400×CF下离心5分钟。抽吸上清液，再悬浮在4mL温热的CM2加3000IU/mL IL-2中。取出200μL以使用自动细胞计数器进行细胞计数。记录计数。
将细胞以1.3×107个细胞/mL再悬浮于外加3000IU/mL IL-2的温热CM2中。将TIL细胞自1.3×106个细胞/mL稀释至1.3×105个细胞/mL。
建立共培养物。将TIL细胞自1.3×106个细胞/mL稀释至1.3×105个细胞/mL。将4.5mL CM2培养基添加至15mL锥形管中。自培养箱取出TIL细胞并使用10mL血清移液管充分再悬浮。自1.3×106个细胞/mLTIL悬浮液取出0.5mL细胞且添加至15mL锥形管中的4.5mL培养基中。将TIL储备液瓶放回培养箱中。充分混合。对第二TIL株系进行重复。
将装有预温热培养基的培养瓶自培养箱转移至BSC中用于单次饲养细胞批次。通过用1mL移液器吸头向上和向下移液若干次来混合饲养细胞，然后将1mL(1.3×107个细胞)转移至用于该饲养细胞批次的各培养瓶中。向各培养瓶中添加60μL OKT3工作储备液(10μg/mL)。将两个对照瓶放回培养箱中。
将1mL(1.3×105)各TIL批次转移至经相应标记的T25培养瓶中。将培养瓶放回培养箱中，直立培养。直到第5天开始进行干预。对测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
第5天，培养基更换。制备具有3000IU/mL IL-2的CM2。各培养瓶需要10mL。通过10mL移液管，将具有3000IU/mL IL-2的10mL温热的CM2转移至各培养瓶。将瓶放回培养箱中，直立培养至第7天。对所有测试的饲养细胞批次进行重复。
第7天，收集。自培养箱取出且，瓶且转移至BSC，注意以免干扰瓶底部的细胞层。在不干扰瓶底部上生长的细胞的情况下，自各测试瓶取出10mL培养基，自各对照瓶中取出15mL培养基。
使用10mL血清移液管，将细胞再悬浮在剩余的培养基中，充分混合以打散任何细胞凝集块。在通过移液充分混合细胞悬浮液之后，取出200μL以用于细胞计数。结合自动细胞计数器设备使用适当标准操作程序对TIL进行计数。在第7天记录计数。对测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
评估饲养细胞对照瓶的复制机能不全，自第0天开始评估含有TIL的培养瓶的扩增倍数。
第7天，饲养细胞对照瓶继续至第14天。在第7天完成饲养细胞对照瓶的计数之后，将15mL含有3000IU/mL IL-2的新鲜CM2培养基添加至对照瓶中的每一个。将对照瓶放回培养箱中，以直立位置培养至第14天。
第14天，延长非增殖的饲养细胞对照瓶。自培养箱取出培养瓶，转移至BSC，注意以免干扰瓶底部的细胞层。在不干扰瓶底部生长的细胞的情况下，自各对照瓶取出约17mL培养基。使用5mL血清移液管，将细胞再悬浮于中剩余的培养基中，充分混合以打散任何细胞凝集块。记录各培养瓶的体积。
在通过移液充分混合细胞悬浮液之后，取出200μL以进行细胞计数。结合自动细胞计数器设备使用适当标准操作程序对TIL进行计数且记录计数。对测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
B.结果和验收准则方案
结果。γ照射的剂量足以使饲养细胞复制机能不全。预期所有批次符合评定准则，且也显示相比于第0天，在REP培养第7天剩余的饲养细胞的总活细胞数目减少。预计到REP培养的第7天，所有饲养细胞批次都将满足TIL增长100倍的评定准则。预计第14天的饲养对照瓶计数将持续第7天所看到的非增殖趋势。
验收准则。针对各批次的饲养细胞测试的各TIL株系复本符合以下验收准则。验收准则为两倍，如下表45中所示。
表45.验收准则准则准则准则则准准则的实施例。
当在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养时，评定照射剂量是否足以使MNC饲养细胞复制机能不全。如通过在REP的第7天和第14天通过自动细胞计数测量的总活细胞计数(TVC)来评定复制机能不全。
验收准则为“无生长”，指从REP第0天投入培养的初始活细胞数目，在第7天和第14天总活细胞数目没有增加。
评定饲养细胞支持TIL扩增的能力。根据活细胞自REP的第0天开始的培养至REP的第7天的扩增倍数来测量TIL生长。在第7天，如通过自动细胞计数所评估，TIL培养物达成最小100倍扩增(即，超过在REP第0天投入培养的总活TIL细胞数的100倍)。
不符合验收准则的MNC饲养细胞批次的应急测试。在MNC饲养细胞批次不满足以上概述的验收准则中的任一个的情况下，将进行以下步骤以重新测试批次，以排除简单的实验者错误作为其原因。
若存在批次的两个以上剩余卫星测试小瓶(satellite testing vial)，则再测试该批次。若批次存在一个或不存在剩余卫星测试小瓶，则根据上文所列的验收准则，该批次不合格。
为了合格，所讨论的批次和对照批次必须达成以上验收准则。在符合这些准则之后，准许使用该批次。
实例4：制备IL-2储备溶液
此实例描述将经纯化的冻干重组人白介素-2溶解于适合用于其他组织培养方案(包括本申请和实例中所描述的所有那些方案)的储备样本中的过程，包括涉及使用rhIL-2的那些过程。
程序。制备0.2％乙酸溶液(HAc)。将29mL无菌水转移至50mL锥形管中。向50mL锥形管中添加1mL 1N乙酸。通过倒转管2至3次进行充分混合。通过使用Steriflip过滤器进行过滤对HAc溶液灭菌。
制备含1％ HAS的PBS。在150mL无菌过滤器单元中，向96mL PBS中添加4mL 25％HSA储备溶液。过滤溶液。储存于4℃下。针对制备的每小瓶rhIL-2，填写表格。
制备rhIL-2储备液(6×106IU/mL最终浓度)。每一批次的rhIL-2不同，所需信息见于制造商的分析证书(COA)，例如：1)每小瓶rhIL-2的质量(mg)、2)rhIL-2的比活性(IU/mg)和3)推荐0.2％ HAc复原体积(mL)。
使用以下公式计算rhIL-2批次所需的1％ HSA的体积：
例如，根据rhIL-2批次10200121(Cellgenix)的COA，1mg小瓶的比活性为25×106IU/mg。推荐在2mL 0.2％ HAc中复原rhIL-2。
用酒精擦拭物擦拭IL-2小瓶的橡胶塞。使用连接于3mL注射器的16G针，将推荐体积的0.2％ HAc注入小瓶中。请小心不要在拔出针头时取开塞子。将小瓶倒转3次，旋动直至所有粉末溶解。小心地取下塞子并搁置于酒精擦拭物上。向小瓶中添加所计算体积的
1％HSA。
储存rhIL-2溶液。对于短期储存(<72小时)，将小瓶储存于4℃下。对于长期储存(>72小时)，将小瓶等分成较小体积，并在准备使用之前储存于-20℃下的冷冻小瓶中。避免冷冻/解冻循环。在制备日期之后6个月过期。Rh-IL-2标签包括供应商和目录号、批号、过期日期、操作员首字母缩写、浓度和等分体积。
实例5：冷冻保存过程
此实例描述使用7454型CryoMed受控速率冷冻器(Thermo Scientific)的用于根据本文所述的程序制备的TIL的冷冻保存过程方法。
所使用的设备如下：铝制卡盒支架(与CS750冷冻袋相容)、用于750mL袋的冷冻盒、低压(22psi)液氮罐、冰箱、热电偶感测器(带式袋)和CryoStore CS750冷冻袋(OriGenScientific)。
冷冻过程在自成核至-20℃之间提供0.5℃速率，在至-80℃终点温度之间提供1℃/分钟的冷却速率。程序参数如下：步骤1：在4℃下等待；步骤2：1.0℃/min(样本温度)达至-4℃；步骤3：20.0℃/min(箱室温度)达至-45℃；步骤4：10.0℃/min(箱室温度)达至-10.0℃；步骤5：0.5℃/min(箱室温度)达至-20℃；且步骤6：1.0℃/min(样本温度)达至-80℃。
实例6：使用确定成分培养基进行的肿瘤扩增过程
可用相应的确定成分培养基(例如，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM，赛默飞世尔，包括例如DM1和DM2)替代CM1和CM2培养基来进行以上公开的过程。
实例7：冷冻保存的TIL细胞疗法的示例性GEN 2制备
此实例描述一种根据当前组织优良操作规范(current Good Tissue Practices)和当前优良制造规范(current Good Manufacturing Practices)在G-Rex瓶中进行艾欧凡斯生物治疗公司的TIL细胞疗法过程的cGMP制造。此实例描述一种根据当前组织优良操作规范和当前优良制造规范在G-Rex培养瓶中进行TIL细胞疗法过程的示例性cGMP制造。
表46：过程扩增示例性计划。
表47：培养瓶体积
第0天，CM1培养基制备。在BSC中，向RPMI 1640培养基瓶添加试剂。添加以下试剂t，每瓶添加：加热灭活人AB血清(100.0mL)；GlutaMaxTM(10.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(1.0mL)；2-巯基乙醇(1.0mL)。
自BSC取出不必要的材料。自BSC分发培养基试剂，将硫酸庆大霉素和HBSS保留在BSC以用于配制洗涤培养基制备。
解冻IL-2等分试样。解冻一个1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化。记录IL-2：批号和有效期。
将IL-2储备液转移至培养基中。在BSC中，将1.0mL IL-2储备液转移至准备的CM1第0天培养基瓶中。添加CM1第0天培养基1瓶和IL-2(6×106IU/mL)1.0mL。
将G-REX100MCS传递至BSC中。将G-REX100MCS(W3013130)无菌传递至BSC中。
将所有完全CM1第0天培养基泵吸至G-REX100MCS培养瓶中。组织碎片锥形管或G-REX100MCS。
第0天，肿瘤洗涤培养基制备。在BSC中，将5.0mL庆大霉素(W3009832或W3012735)添加至1×500mL HBSS培养基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS(500.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(5.0mL)。通过1L 0.22微米过滤器单元(W1218810)制备含有庆大霉素的经过滤HBSS。
第0天肿瘤处理。获得肿瘤试样，立即转移至2-8℃下的套件中进行处理。等分肿瘤洗涤培养基。使用8”镊子(W3009771)进行肿瘤洗涤1。自试样瓶移出肿瘤，转移至所制备的“洗涤1”培养皿中。此随后为肿瘤洗涤2和肿瘤洗涤3。测量且评估肿瘤。评定是否观测到整个肿瘤面积的>30％坏死和/或为脂肪组织。在适用时清洁解剖。若肿瘤较大且观测到>30％组织外表坏死/为脂肪，则通过使用解剖刀和/或镊子的组合移除坏死/脂肪组织并同时保留肿瘤内部结构来进行“清除分割”。解剖肿瘤。使用解剖刀和/或镊子的组合，将肿瘤试样切割成偶数个适当大小的碎片(至多6个中间碎片)。转移中间肿瘤碎片。将肿瘤碎片分割成大小大致为3×3×3mm的块。储存中间碎片以防脱水。重复中间碎片分割。测量收集的块数目。若仅保留所需组织，则自“有利中间碎片”6孔板选择另外的有利肿瘤碎块来填充最多50个块的液滴。
准备锥形管。将肿瘤碎块转移至50mL锥形管中。制备用于G-REX100MCS的BSC。自培养箱取出G-REX100MCS。将G-REX100MCS培养瓶无菌传递至BSC中。将肿瘤碎片添加至G-REX100MCS培养瓶中。使碎块均匀分布。
按以下参数使G-REX100MCS保温：使G-REX培养瓶保温：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。计算：保温时间；下限＝保温时间+252小时；上限＝保温时间+276小时。
过程完成后，舍弃所有剩余已升温培养基，解冻IL-2的等分试样。
第11天-培养基制备监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。
在培养箱中使3×1000mL RPMI 1640培养基(W3013112)瓶和3×1000mL AIM-V(W3009501)瓶升温≥30分钟。自培养箱取出RPMI 1640培养基瓶。准备RPMI 1640培养基瓶。过滤培养基。解冻3×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)。自培养箱中取出AIM-V培养基。将IL-2添加至AIM-V中。将10L Labtainer袋和中继泵转移装置无菌转移至BSC中。
准备10L Labtainer培养基袋。准备Baxa泵。准备10L Labtainer培养基袋。将培养基泵吸至10L Labtainer中。自Labtainer袋取下自动泵吸管。
混合培养基。轻缓地揉按袋子以进行混合。依据取样计划对培养基进行取样。取出20.0mL培养基，置于50mL锥形管中。制备细胞计数稀释液管。在BSC中，向四个的15mL锥形管中添加4.5mL已标记有“用于细胞计数稀释”和批号的AIM-V培养基。将试剂自BSC转移至2至8℃下。准备1L转移包。在BSC外部，将1L转移包熔接(依据过程注释5.11)至附接于所准备的“完全CM2第11天培养基”袋的转移装置上。准备饲养细胞转移包。孵育完全CM2第11天培养基。
第11天-TIL收集预处理表格。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。自培养箱取出G-REX100MCS。准备300mL转移包。将转移包熔接至G-REX100MCS。
准备用于TIL收集的培养瓶，开始TIL收集。收集TIL。使用GatheRex，透过血液过滤器将细胞悬浮液转移至300mL转移包中。检查膜上的贴壁细胞。
冲洗培养瓶膜。闭合G-REX100MCS上的夹子。确保所有夹子闭合。热封TIL和“上清液”转移包。计算TIL悬浮液的体积。准备用于取样的上清液转移包。
抽取Bac-T样本。在BSC中，自1L“上清液”转移包中吸取约20.0mL上清液，分配至无菌的50mL锥形管中。
依据取样计划接种BacT。使用适当大小的注射器自准备的标记有BacT的50mL锥形管取出1.0mL样本且接种于厌氧瓶。
孵育TIL。在需要之前将TIL转移包置于培养箱中。进行细胞计数和演算。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。存活率÷2。活细胞浓度÷2。测定计数的上限和下限。下限：活细胞浓度平均值×0.9。上限：活细胞浓度平均×1.1。确认两个计数在可接受界限内。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。
调整TIL悬浮液的体积：计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积(A)。取出的细胞计数样本的体积(4.0mL)(B)经调整TIL细胞总体积C＝A-B。
计算活TIL细胞总数。平均活细胞浓度*：总体积；活细胞总数：C＝A×B。
流式细胞术的计算：若活TIL细胞总计数为≥4.0×107，则计算获得用于流式细胞术样本的1.0×107个细胞的体积。
流式细胞术所需的活细胞总数：1.0×107个细胞。流式细胞术所需的细胞体积：活细胞浓度除以1.0×107个细胞A。
计算等于2.0×108个活细胞的TIL悬浮液的体积。按需要，计算待取出的过量TIL细胞体积，取出过量TIL并按需要将TIL置于培养箱中。计算按需要取出的过量TIL总量。
将以供冷冻的靶标细胞浓度添加至过量TIL细胞的CS-10培养基的计算量为1.0×108个细胞/mL。按需要使过量TIL离心。观测锥形管并添加CS-10。
填充小瓶。将1.0mL细胞悬浮液等分至适当大小的冷冻小瓶中。将剩余体积等分至适当大小的冷冻小瓶中。如果体积≤0.5mL，将CS10添加至小瓶中，直至体积为0.5mL。
计算获得用于冷冻保存的1×107个细胞所需的细胞体积。取出样本以进行冷冻保存。将TIL置于培养箱中。
样本的冷冻保存。观测锥形管，缓慢添加CS-10，记录添加0.5mL CS10的体积。
第11天-饲养细胞。获得饲养细胞。自LN2冷冻机获得至少两个不同批号的3袋饲养细胞。在准备解冻之前将细胞保存于干冰上。准备水浴或cryotherm。在37.0±2.0℃水浴或cytotherm处解冻饲养细胞约3至5分钟或直至冰刚好消失。自培养箱取出培养基。合并解冻的饲养细胞。将饲养细胞添加至转移包。将饲养细胞自注射器分配至转移包中。对合并饲养细胞进行混合，标记转移包。
计算转移包中的饲养细胞悬浮液的总体积。取出细胞计数样本。针对各样本使用单独的3mL注射器，使用非必要注入口自饲养细胞悬浮液转移包抽吸4×1.0mL细胞计数样本。将每个样本等分至经标记的冷冻小瓶中。进行细胞计数，确定乘数，选定方案，输入乘数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限，确认其在界限内。
调整饲养细胞悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。计算活饲养细胞总数。按需要获得另外的饲养细胞。按需要解冻另外的饲养细胞。将第4饲养细胞袋置于拉链袋中，在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解冻约3至5分钟，合并另外的饲养细胞。测量体积。测量注射器中饲养细胞的体积，记录在下面(B)。计算饲养细胞的新的总体积。将饲养细胞添加至转移包。
按需要制备稀释液，将4.5mL AIM-V培养基添加至四个15mL锥形管中。准备细胞计数。针对各样本使用单独的3mL注射器，使用非必要注入口自饲养细胞悬浮液转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。进行细胞计数和计算。根据进行的所有四次计数测定平均活细胞浓度。调整饲养细胞悬浮液的体积，计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。饲养细胞总体积减去取出的4.0mL。计算获得5x109个活饲养细胞所需的饲养细胞悬浮液的体积。计算过量饲养细胞体积。计算待取出的过量饲养细胞的体积。取出过量饲养细胞。
使用1.0mL注射器和16G针头，吸取0.15mL OKT3，添加OKT3。热封饲养细胞悬浮液转移包。
第11天-G-REX填充和接种设置G-REX-500MCS。自培养箱取出“完全CM2第11天培养基”，将培养基泵吸至G-REX500MCS中。将4.5L培养基泵吸至G-REX500MCS中，填充至培养瓶上标示的线处。按需要热封并使培养瓶保温。将饲养细胞悬浮液转移包熔接至G-REX500MCS。将饲养细胞添加至G-REX500MCS。热封。将TIL悬浮液转移包熔接至培养瓶。将TIL添加至G-REX500MCS。热封。将G-REX500MCS在37.0±2.0℃下保温，CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。
计算保温范围。进行计算以确定在第16天自培养箱取出G-REX500MCS的适当时间。下限：保温时间+108小时。上限：保温时间+132小时。
第11-天过量TIL冷冻保存。适用：冷冻过量TIL小瓶。确证在冷冻前已设定CRF。进行冷冻保存。将小瓶自速率受控冷冻机转移至适当储存件中。完成冷冻后，将小瓶自CRF转移至适当储存容器。将小瓶转移至适当储存。记录在LN2中的储存位置。
第16天-培养基制备预热AIM-V培养基。针对培养基袋1、2和3计算使培养基升温的时间。确保所有袋子已升温12至24小时的持续时间。设定用于上清液的10L Labtainer。使用鲁尔接头将流体泵转移装置的较大直径端附接至10L Labtainer袋的一个凹形端口。设定用于上清液的10L Labtainer并进行标记。设定用于上清液的10L Labtainer。确保在自BSC之前取出前闭合所有夹子。注意：在TIL收集期间使用上清液袋，该TIL收集可与培养基制备并行地进行。
解冻IL-2。每袋CTS AIM V培养基解冻5×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化。等分100.0mL GlutaMaxTM。向GlutaMaxTM中添加IL-2。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。准备用于配制的CTS AIM V培养基袋。多级Baxa泵。准备配制培养基。将GlutaMaxTM+IL-2泵吸至袋中。监测参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％ CO2。使完全CM4第16天培养基升温。制备稀释液。
第16天REP分瓶。监测培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。自培养箱取出G-REX500MCS。准备1L转移包，标记为TIL悬浮液，称重1L。
G-REX-500MCS的体积减少。将约4.5L培养上清液自G-REX-500MCS转移至10LLabtainer。
准备用于TIL收集的培养瓶。取出上清液后，闭合通向红色管线的所有夹子。
开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以使细胞剥离，确保所有细胞剥落。
TIL收集。松开通向TIL悬浮液转移包的所有夹子。使用GatheREX，将细胞悬浮液转移至TIL悬浮液转移包中。注意：确保维持边缘倾斜，直至收集到所有细胞和培养基。检查膜上的贴壁细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-REX500MCS上的夹子。热封含有TIL的转移包。热封含有上清液的10L Labtainer。记录含细胞悬浮液的转移包的重量，计算悬浮液体积。准备用于样本取出的转移包。自细胞上清液取出测试样本。
无菌和BacT测试取样。自制备的15mL锥形标记的BacT取出1.0mL样本。取出细胞计数样本。在BSC中，针对各样本使用单独的3mL注射器，自“TIL悬浮液”转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。
取出支原体样本。使用3mL注射器，自TIL悬浮液转移包取出1.0mL并置于准备的标记有“支原体稀释液”的15mL锥形管中。
准备用于接种的转移包。将TIL置于培养箱中。自BSC取出细胞悬浮液，在需要之前置于培养箱中。进行细胞计数和计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至准备的4.5mLAIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释，得到稀释度为1:10。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。注意：稀释可以根据预期的细胞浓度进行调整。自进行的所有四次计数中确定平均活细胞浓度。调整TIL悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积减去取出以用于测试的5.0mL。
计算活TIL细胞总数。计算待接种的培养瓶的总数目。注意：待接种的G-REX-500MCS培养瓶的最大数目为五。若计算的待接种培养瓶的数目超过五，则使用可用的所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。
计算用于传代培养的培养瓶数目。计算除所准备的袋子以外还需要的培养基袋的数目。按计算需要每两个G-REX-500M培养瓶准备一个10L“CM4第16天培养基”袋。继续接种第一GREX-500M培养瓶，同时准备另外的培养基并使其升温。准备确定的所计算数目的其他培养基袋并使其升温。填充G-REX500MCS。准备泵吸培养基并将4.5L培养基泵吸至G-REX500MCS中。热封。重复填充。使培养瓶保温。计算待添加至新G-REX500MCS培养瓶中的TIL悬浮液的靶标体积。若计算的培养瓶数目超过五，则使用所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。准备用于接种的培养瓶。自培养箱取出G-REX500MCS。准备用于泵吸的G-REX500MCS。除较大过滤器管线外，闭合所有夹子。自培养箱取出TIL。制备用于接种的细胞悬浮液。将“TIL悬浮液”转移包无菌熔接(依据过程注释5.11)至泵入口管线。将TIL悬浮液袋置于称上。
用TIL悬浮液接种培养瓶。泵吸所计算体积的TIL悬浮液至培养瓶中。热封。填充剩余培养瓶。
监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。使培养瓶保温。
测定在第22天自培养箱取出G-REX500MCS的时间范围。
第22天洗涤缓冲液制备。准备10L Labtainer袋。在BSC中，通过鲁尔接头将4”血浆转移装置附接至10L Labtainer袋。准备10L Labtainer袋。在转移出BSC之前，闭合所有夹子。注意：为待进行收集的每两个G-REX500MCS培养瓶准备一个10L Labtainer袋。将Plasmalyte泵吸至3000mL袋中，通过翻转泵和操控袋子的位置从3000mL Origen袋去除空气。将25％的人白蛋白添加至3000mL袋中。获得最终体积为120.0mL的人白蛋白25％。
制备IL-2稀释液。使用10mL注射器，使用LOVO洗涤缓冲液袋上之无针注入口取出5.0mL LOVO洗涤缓冲液。将LOVO洗涤缓冲液分配至50mL锥形管中。
等分CRF空白袋LOVO洗涤缓冲液。使用100mL注射器，自无针注入口吸取70.0mLLOVO洗涤缓冲液。
解冻一份1.1mL IL-2(6×106IU/mL)，直至所有冰融化。将50μL IL-2储备液(6×106IU/mL)添加至标记为“IL-2稀释液”的50mL锥形管中。
冷冻保存准备。将5个冷冻盒置于2至8℃下，以对其进行预处理，以便用于最终产物冷冻保存。
制备细胞计数稀释液。在BSC中，向4个15mL锥形管中添加4.5mL已标记有“用于细胞计数稀释”和批号的AIM-V培养基。准备细胞计数。将4个冷冻小瓶标记上小瓶编号(1至4)。将小瓶保存在BSC以供使用。
第22天TIL收集。监测培养箱。培养箱参数：温度LED显示器：37±2.0℃，CO2百分比：5％±1.5％。自培养箱中取出G-REX500MCS培养瓶。准备TIL收集袋并进行标记。封闭额外的接头。体积减少：将约4.5L上清液自G-REX500MCS转移至上清液袋。
准备用于TIL收集的培养瓶。开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以剥离细胞。确保所有细胞已剥落。开始TIL收集。松开通向TIL悬浮液收集袋的所有夹子。TIL收集。使用GatheRex，将TIL悬浮液转移至3000mL收集袋中。检查膜上的贴壁细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-REX500MCS上的夹子，确保闭合所有夹子。将细胞悬浮液转移至LOVO来源袋中。闭合所有夹子。热封。取出4×1.0mL细胞计数样本。
进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至准备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释。得到1:10稀释度。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度和总成核细胞浓度。测定计数的上限和下限。测定进行细胞计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度和总成核细胞浓度。称量LOVO来源袋。计算活TIL细胞总数。计算成核细胞总数。
制备支原体稀释剂。通过鲁尔样本口自一个上清液袋移除10.0mL并置于15mL锥形管中。
进行“TIL G-REX收集”方案并测定最终产物靶标体积。装载一次性试剂盒。取出滤液袋。输入滤液容量。将滤液容器置于实验台上。附接PlasmaLyte。确证已附接PlasmaLyte，观测到PlasmaLyte正在移动。将来源容器附接至导管，确证已附接来源容器。确认PlasmaLyte正在移动。
最终配制和填充。靶标体积/袋子计算。计算待配制于空白袋中的CS-10和LOVO洗涤缓冲液的体积。准备CRF空白袋。
计算待添加至最终产物的IL-2的体积。所需最终IL-2浓度(IU/mL)：300IU/mL。IL-2工作储备：6×104IU/mL。组装连接设备。将4S-4M60无菌熔接至CC2单元接头。将CS750冷冻袋无菌熔接至制备的线束上。将CS-10袋熔接至4S-4M60的尖端上。用IL-2制备TIL。使用适当大小的注射器，自“IL-2 6×104”等分试样取出所测定量的IL-2。标记经配制TIL袋。将经配制TIL袋添加至设备。添加CS10。切换注射器。将约10mL空气吸取至100mL注射器中并替换设备上的60mL注射器。添加CS10。准备CS-750袋。分配细胞。
自最终产物袋移除空气并获得保留物。一旦已填充最后一个最终产物袋，即闭合所有夹子。将10mL空气吸取至新的100mL注射器中，更换设备上的注射器。将保留物分配至50mL锥形管中，并将管标记为“保留物”和批号。针对每个袋子重复空气移除步骤。
准备用于冷冻保存的最终产物，包括目视检查。在冷冻保存之前将冷冻袋保存于降温包上或2至8℃下。
取出细胞计数样本。使用适当大小的移液管，取出2.0mL保留物，置于15mL锥形管中以用于细胞计数。进行细胞计数和计算。注意：仅将一个样本稀释至适当稀释度以验证稀释度足够的。将另外的样本稀释至适当稀释因数并继续进行计数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。注意：可根据预期细胞浓度调整稀释度。测定活细胞浓度平均值和存活率平均值。测定计数的上限和下限。计算IFN-γ。热封最终产物袋。
依据以下示例性取样计划标记并收集样本。
表48：样本计划。
样本 容器数目 每次添加的样本体积 容器类型
*支原体 1 1.0mL 15mL锥形管
内毒素 2 1.0mL 2mL冷冻小瓶
革兰氏染色 1 1.0mL 2mL冷冻小瓶
IFN-γ 1 1.0mL 2mL冷冻小瓶
流式细胞术 1 1.0mL 2mL冷冻小瓶
**Bac-T无菌性 2 1.0mL Bac-T瓶
QC保留物 4 1.0mL 2mL冷冻小瓶
卫星小瓶 10 0.5mL 2mL冷冻小瓶
无菌和BacT测试。测试取样。在BSC中，自使用适当大小的注射器收集的保留细胞悬浮液中取出1.0mL样本，并接种厌氧瓶。对好氧瓶重复以上操作。
最终产物冷冻保存准备速率受控冷冻机(CRF)。确证已设定CRF。设定CRF探针。将最终产物和样本置于CRF中。测定要达至4℃±1.5℃所需的时间并继续进行CRF运行。完成CRF并储存。完成运行后停止CRF。自CRF取出盒子和小瓶。将盒子和小瓶转移至气相LN2进行储存。记录储存位置。
最终药品的处理和分析包括以下测试：(第22天)通过流式细胞术测定第22天REP天的CD3+细胞；(第22天)革兰氏染色方法(GMP)；(第22天)通过凝胶凝块LAL分析(GMP)进行细菌内毒素测试；(第16天)BacT无菌性分析(GMP)；(第16天)TD-PCR(GMP)检测支原体DNA；可接受外观特质；(第22天)BacT无菌分析(GMP)(第22天)；(第22天)IFN-γ分析。如本文所述的其他效力分析也用于分析TIL产物。
实例8：GEN 3扩增平台的示例性实施例
第0天
制备肿瘤洗涤培养基。培养基在开始前加热。将5mL庆大霉素(50mg/mL)添加至500mL HBSS瓶中。将5mL肿瘤洗涤培养基添加至15mL锥形瓶中，用于OKT3稀释。准备饲养细胞袋。将饲养细胞无菌转移至饲养细胞袋并在37℃下储存直至使用或冷冻。若在37℃下，则对饲养细胞进行计数。若冷冻，则解冻并然后对饲养细胞进行计数。
饲养细胞浓度的最佳范围在5×104与5×106个细胞/mL之间。制备具有4.5mL AIM-V的四个锥形管。添加0.5mL细胞级分对于各细胞计数。若总活饲养细胞数≥1×109个细胞，则进行调节饲养细胞浓度。计算自第一饲养细胞袋取出的饲养细胞体积，以便将1×109个细胞添加至第二饲养细胞袋中。
使用p1000微量移液管，将900μL的肿瘤洗涤培养基转移至OKT3等分试样(100μL)中。使用注射器和无菌技术，抽取0.6mL OKT3且添加至第二饲养细胞袋中。将培养基体积调整至2L的总体积。将第二饲养细胞袋转移至培养箱中。
OKT3制剂详情：OKT3可等分且冷冻于100μL等分试样中的小瓶(1mg/mL)的原始储备浓度中。每个1mL小瓶约10X等分试样。在-80℃下储存。第0天：15μg/培养瓶，即，30ng/mL在500mL中-至多约60μL～1个等分试样。
向标记为多余肿瘤碎块的6孔板的所有孔中添加5mL肿瘤洗涤培养基。保存肿瘤洗涤培养基，以进一步用于在分割期间保持肿瘤水分。将50mL肿瘤洗涤培养基添加至各100mm皮氏培养皿中。
在解剖培养皿盖下用直尺作为参考，将肿瘤分割成约27mm3碎片(3×3×3mm)。解剖中间碎片，直至达到60个碎片。对最终碎片的总数进行计数，根据所产生的最终碎片的数目来准备G-REX100MCS培养瓶(通常为60个碎片/培养瓶)。
在标记为碎片管1至碎片管4的锥形管中保留有利的组织碎片。根据发起的碎片管的数目，计算用饲养细胞悬浮液接种的G-REX100MCS培养瓶的数目。
自培养箱取出饲养细胞袋，接种G-REX100MCS。标记为D0(第0天)。
在G-REX100 MCS中向培养物中添加肿瘤碎片。在无菌条件下，拧开标记有肿瘤碎片培养物(D0)1的G-REX100MCS和标记有碎片管的50mL锥形管的盖子。旋转打开的碎片管1，同时略微抬起G-REX100MCS的盖子。在旋转的同时将培养基和碎片一起添加至G-REX100MCS中。记录转移至G-REX100MCS中的碎片的数目。
一旦碎片位于G-REX瓶的底部，吸取7mL培养基，创建七个1mL等分试样，5mL用于扩增表征，2mL用于无菌样本。将用于扩增表征的5个等分试样(最终碎片培养物上清液)储存在-20℃下，直至需要。
分别用1mL最终碎片培养物上清液接种一个厌氧BacT/Alert瓶和一个好氧BacT/Alert瓶。对进行取样的各培养瓶进行重复。
在第7-8天
准备饲养细胞袋。在冷冻的情况下，将饲养细胞袋在37℃水浴中解冻3-5分钟。若冷冻，则对饲养细胞进行计数。饲养细胞浓度的最佳范围在5×104与5×106个细胞/mL之间。制备具有4.5mL AIM-V的四个锥形管。将各细胞计数0.5mL细胞级分添加至新的冷冻小瓶管中。将样本充分混合且进行细胞计数。
若活饲养细胞总数≥2×109个细胞，则进行下一个步骤以调节饲养细胞浓度。计算自第一饲养细胞袋取出的饲养细胞的体积，以便将2×109个细胞添加至第二饲养细胞袋中。
使用p1000微量移液管，将900μL HBSS转移至100μL OKT3等分试样中。通过向上和向下移液3次进行混合。制备两个等分试样。
OKT3制剂详情：可以100μL等分试样形式，以来自小瓶之原始储备液浓度(1mg/mL)将OKT3等分和冷冻。每个1mL小瓶约10×等分试样。在-80℃下储存。第7/8天：30μg/培养瓶，即，60ng/mL在500mL中-至多120μl～2个等分试样。
使用注射器和无菌技术，抽取0.6mL OKT3且添加至饲养细胞袋中，确保全部添加。将培养基体积调节至2L的总体积。对第二OKT3等分试样进行重复，并添加至饲养细胞袋中。将第二饲养细胞袋转移至培养箱中。
制备具有饲养细胞悬浮液的G-REX100MCS培养瓶。根据第0天产生的G-REX瓶的数目记录待处理的G-REX100MCS培养瓶的数目。自培养箱中取出G-REX培养瓶，自培养箱中取出第二饲养细胞袋。
在添加饲养细胞悬浮液之前取出上清液。将一个10mL注射器连接至G-REX100培养瓶并抽取5mL培养基。创建五个1mL等分试样，5mL用于扩增表征，并将用于扩增表征的5个等分试样(最终碎片培养物上清液)储存在-20℃下，直至发起人提出要求。对各G-REX100培养瓶进行标记并进行重复。
5-20×1mL样本用于表征，取决于培养瓶的数目：
●5mL ＝1个培养瓶
●10mL ＝2个培养瓶
●15mL＝3个培养瓶
●20mL＝4个培养瓶
继续将饲养细胞接种至G-REX100 MCS中，对各G-REX100 MCS培养瓶进行重复。使用无菌转移方法，将500mL第二饲养细胞袋按重量(假设1g＝1mL)通过重力转移至各G-REX100MCS培养瓶中，记录转移量。标记为第7天培养物，对各G-REX100瓶进行重复。将G-REX100MCS培养瓶转移至培养箱中。
第10-11天
取出第一个G-REX100MCS培养瓶，在无菌条件下使用10mL注射器取出7mL预处理培养物上清液。创建七个1mL等分试样，5mL用于扩增表征，2mL用于无菌样本。
小心地混合培养瓶，使用新10mL注射器取出10mL上清液，转移至标记为D10/11支原体上清液的15mL管中。
小心地混合培养瓶，使用新注射器根据待处理的培养瓶的数量取出以下体积：
●1个培养瓶＝40mL
●2个培养瓶＝20mL/培养瓶
●3个培养瓶＝13.3mL/培养瓶
●4个培养瓶＝10mL/培养瓶
应自所有瓶抽吸总共40mL，，汇集在标有“第10/11天QC样本”的50mL锥形管中，储存在培养箱中直至需要。进行细胞计数并分配细胞。
将用于扩增表征的5个等分试样(预处理培养物上清液)储存在≤-20℃下，直至需要。分别用1mL预处理培养物上清液接种一个厌氧BacT/Alert瓶和一个好氧BacT/Alert瓶。
继续将细胞悬浮液转移至G-REX-500MCS并对各G-REX100MCS进行重复。使用无菌条件，将各G-REX100MCS的内容物转移至G-REX-500MCS中，每次监测约100mL液体转移。当G-REX100MCS的体积降低至500mL时，停止转移。
在转移步骤期间，使用10mL注射器且自G-REX100MCS抽吸10mL细胞悬浮液至注射器中。根据培养瓶的数目按照说明书进行操作。若仅1个培养瓶：总共使用两个注射器取出20mL。若2个培养瓶：每个培养瓶取出10mL。若3个培养瓶：每个培养瓶取出7mL。若4个培养瓶：每个培养瓶取出5mL。将细胞悬浮液转移至一个常规50mL锥形管。保持在培养箱中直至细胞计数步骤和QC样本。QC所需的细胞总数为约20e6个细胞：4×0.5mL细胞计数(细胞计数首先未稀释)。
分析所需的细胞量如下：
1.至少10×106个细胞用于效力分析，例如本文所述的那些分析，或用于IFN-γ或颗粒酶B分析
2.1×106个细胞用于支原体
3.5×106个细胞用于CD3+/CD45+的流式细胞术
将G-REX-500MCS培养瓶转移至培养箱。
制备QC样本。在此实施例中，分析需要至少15×108个细胞。分析包括：细胞计数和存活率；支原体(1×106个细胞/平均存活浓度)流式细胞术(5×106个细胞/平均存活浓度；)和IFN-g分析(5×106个细胞-1×106个细胞；IFN-γ分析需要8-10×106个细胞。
计算在10×106个细胞/mL下冷冻保存的细胞级分的体积，并计算需准备的小瓶的数目。
第16-17天
洗涤缓冲液制备(1％ HSA Plasmalyte A)。将HSA和Plasmalyte转移至5L袋中以制备LOVO洗涤缓冲液。使用无菌条件将总体积为125mL的25％ HSA转移至5L袋中。将10mL或40mL洗涤缓冲液取出，转移至“IL-2 6×104IU/mL管”中(若IL-2预先制备，则为10mL，或若IL-2为新鲜制备，则为40mL)。
计算添加至Plasmalyte+1％ HSA中的经复原的IL-2的体积：经复原的IL-2的体积＝(IL-2的最终浓度×最终体积)/IL-2的比活性(基于标准分析)。IL-2的最终浓度为6×104IU/mL。最终体积为40mL。
取出复原IL-2所需的IL-2的计算初始体积，转移至“IL-2 6×104IU/mL”管中。将来自预先制备的等分试样的100μL IL-2 6×106IU/mL添加至含有10mL LOVO洗涤缓冲液的标记为『IL-2 6×104IU/mL』的管中。
自G-REX-500MCS培养瓶取出约4500mL上清液。旋转剩余的上清液并将细胞转移至细胞收集池袋中。对所有G-REX-500MCS培养瓶进行重复。
取出60mL上清液且添加至上清液管中以用于品质对照分析，包括支原体检测。储存在+2-8℃下。
细胞收集。对细胞进行计数。制备四个具有4.5mL AIM-V的15mL锥形管。这些锥形管可预先制备。最佳范围＝介于5×104与5×106个细胞/mL之间。(推荐1:10稀释度)。对于1:10稀释度，向先前制备的4500μL AIM V中添加500μL CF。记录稀释因数。
计算预LOVO(存活+死亡)的TC(总细胞)＝平均总细胞浓度(预LOVO TC浓度)(存活+死亡)X源袋的体积
计算预LOVO(存活)的TVC(总活细胞)＝平均总活细胞浓度(预LOVO TVC)(存活)XLOVO源袋的体积
当总细胞(TC)数目>5×109时，取出5×108个细胞以冷冻保存为MDA保留样本。5×108÷平均TC浓度(步骤14.44)＝待取出的体积。
当总细胞(TC)数目≤5×109时，取出4×106个细胞以冷冻保存为MDA保留样本。4×106÷平均TC浓度＝待取出的体积。
当测定总细胞数目时，待取出的细胞数目应允许保留150×109个活细胞。确认预LOVO的TVC为5×108或4×106或不适用。计算待取出的细胞体积。
计算袋中剩余的剩余总细胞。计算预LOVO的TC(总细胞)。[平均总细胞浓度X剩余体积＝预LOVO剩余TC]
根据剩余的细胞的总数目，选择表49中的对应过程。
表49：细胞总数目。
总细胞： 保留物(mL)
0<总细胞≤31×109 115
31×109<总细胞≤71×109 165
71×109<总细胞≤110×109 215
110×109<总细胞≤115×109 265
选择与所用过程相对应的IL-2添加的体积。体积计算为：保留物体积×2×300IU/mL＝所需IL-2的IU。所需IL-2的IU/6×104IU/mL＝LOVO袋后添加的IL-2体积。记录所有添加的体积。在冷冻小瓶中获得样本用于进一步分析。
充分混合细胞产物。密封所有袋以用于进一步处理，适当时包括冷冻保存。
按需要对获得的冷冻小瓶样本进行内毒素、IFN-γ、无菌和其他分析。
实例9：GEN 2和GEN 3示例性过程
此实例展示Gen 2和Gen 3过程。过程Gen 2和Gen 3TIL通常由来源于个体患者(通过手术切除肿瘤)的自体TIL构成，然后离体扩增。Gen 3过程的起始第一扩增步骤为在存在白介素-2(IL-2)和单克隆抗体OKT3的情况下进行细胞培养，该单克隆抗体OKT3靶向经照射的外周血单核细胞(PBMC)的支架上的T细胞共受体CD3。
Gen 2TIL产物的制造由两个阶段组成：1)预快速扩增(预REP)，和2)快速扩增方案(REP)。在预REP期间，将切除的肿瘤切割成≤50个各维度为2-3mm的碎片，这些碎片用含血清的培养基(含有补充的10％ HuSAB的RPMI 1640培养基)和6,000IU/mL的白介素-2(IL-2)培养11天的时间段。在第11天，收集TIL并将其引入大规模二级REP扩增中。REP由以下组成：在5L体积的补充有3000IU/mL rhIL-2的CM2中，在5×109个经照射的同种异体PBMC饲养细胞的共培养中活化≤200×106个来自预REP的活细胞持续5天，这些饲养细胞负载有150μg单克隆抗CD3抗体(OKT3)。在第16天，培养物体积降低90％并将细胞级分以≥1×109个活淋巴细胞/培养瓶分流至多个G-REX-500瓶中，用CM4补足至5L。将TIL再培养6天。在第22天收集REP，洗涤，配制并冷冻保存，随后在-150℃下运送至临床站点进行输注。
Gen 3TIL产物的制造由三个阶段组成：1)起始第一扩增方案，2)快速第二扩增方案(也称为快速扩增阶段或REP)，和3)传代培养物分流。为了实现起始第一扩增TIL增殖，将切除的肿瘤切割成≤120个各维度为2-3mm的碎片。在起始第一扩增的第0天，在3个100MCS容器中的每一者中，在约100cm2的表面区域上建立约2.5×108个同种异体照射的PBMC饲养细胞的饲养层，该饲养细胞负载有OKT-3。将肿瘤碎片分布在3个100MCS容器中，各容器用含有500mL含血清的CM1培养基和6,000IU/mL的白介素-2(IL-2)和15μg OKT-3培养7天的时间段。在第7天，通过以下来启动REP：将约5×108个负载有OKT-3的同种异体照射的PBMC饲养细胞的额外饲养细胞层并入三个100MCS容器中的每一者中的肿瘤破碎培养阶段中，用500mL CM2培养基和6,000IU/mL IL-2和30μgOKT-3培养通过使用密闭系统流体将负载OKT3的饲养细胞转移至100MCS容器中，活化同一容器中的整个起始第一扩增培养物来增强REP启动。对于Gen 3，TIL纵向扩大或分流涉及处理步骤，其中，整个细胞培养物通过密闭系统流体转移，从而按比例调整至较大容器，转移(自100M培养瓶转移至500M培养瓶)，添加额外4L CM4培养基。在第16天收集REP，洗涤，配制且冷冻保存，随后在-150℃下运送至临床站点以用于输注。
总体而言，Gen 3过程为更短、可缩放性更高且易于修改的扩增平台，其将适应稳健制造和过程可比性。
表50：示例性Gen 2和示例性Gen 3制造过程之比较。
在第0天，对于两种过程，将肿瘤洗涤3次，将碎片随机分组，分成两个池；每个过程一个池。对于Gen 2过程，将碎片转移至一个GREX 100MCS培养瓶中，该培养瓶具有含有6,000IU/mL rhIL-2之1L CM1培养基。对于Gen 3过程，将碎片转移至一个G-REX100MCS培养瓶中，该瓶具有含有6,000IU/mL rhIL-2、15μg OKT-3和2.5×108个饲养细胞的500mL CM1。Rep启动天的TIL的接种根据各过程在不同天进行。对于Gen 2过程，G-REX100MCS培养瓶的体积降低90％，将所收集的细胞悬浮液转移至新的G-REX-500MCS中，以在第11天在含有IL-2(3000IU/mL)加5×109个饲养细胞和OKT-3(30ng/mL)的CM2培养基中开始REP启动。每个方案中细胞在第16天扩增并分流至多个具有CM4培养基和IL-2(3000IU/mL)的G-REX-500MCS培养瓶中。然后在每个方案中的第22天收集培养物并冷冻保存。对于Gen 3过程，在第7天进行REP启动，其中，使用相同的G-REX100MCS进行REP启动。简言之，向各培养瓶中添加500mL含有IL-2(6000IU/mL)以及5×108个饲养细胞和30μg OKT-3的CM2培养基。在第9-11天，将培养物的规模纵向扩大。将整个体积的G-REX100M(1L)转移至G-REX-500MCS中，添加4L含有IL-2(3000IU/mL)的CM4。将培养瓶瓶孵育5天。在第16天收集培养物并冷冻保存。
比较中包括三种不同的肿瘤，两种肺肿瘤(L4054和L4055)和一种黑色素瘤(M1085T)。
对于L4054和L4055，CM1(培养基1)、CM2(培养基2)和CM4(培养基4)培养基是预先制备的且保持在4℃下。CM1和CM2培养基未经过滤制备，以比较具有和不具有培养基过滤的细胞生长。
对于L4055肿瘤，在REP启动和规模扩大时，将培养基在37℃下温热至多24小时。
结果。对于所实现的总活细胞，Gen 3的结果在Gen 2的结果的30％以内。在再刺激之后，Gen 3最终产物显示出更高的IFN-γ产量。如通过存在的总独特CDR3序列所测定，Gen3最终产物显示出增加的克隆多样性。Gen 3最终产物显示出较长平均端粒长度。
Gen 2和Gen 3过程的预REP和REP扩增遵循上文所描述的程序。对于各肿瘤，两个池含有相等数目的碎片。归因于肿瘤的较小尺寸，无法达成每个培养瓶的最大碎片数目。在Gen 2过程的第11天和Gen 3过程的第7天收集总预REP细胞(TVC)并进行计数。为比较两个预REP组，将细胞计数除以培养物中所提供的碎片的数目，以计算每个碎片的活细胞的平均值。如下表51中所指示，与Gen 3过程相比，以每个碎片计，在Gen 2过程中始终生长更多细胞。Gen 3过程的第11天之预期TVC数目的外推计算，计算方法是将预REP TVC除以7并然后乘以11。
表51：预REP细胞计数
*L4055，未经过滤的培养基。
对于Gen 2和Gen 3过程，根据过程条件对TVC进行计数，在过程的每天产生活细胞百分比。在收集时，收集第22天(Gen 2)和第16天(Gen 3)细胞，建立TVC计数。然后，将TVC除以第0天提供的碎片数目，以计算以每个碎片计的活细胞的平均值。通过将所收集的TVC除以REP启动TVC来计算扩增倍数。如表52所示，比较Gen 2和Gen 3，L4054的倍数扩增相似；在L4055的情况下，Gen 2过程的扩增倍数更高。特定地，在此情况下，在REP启动日之前使培养基升温24。对于M1085T，在Gen 3中也观测到较高扩增倍数。Gen 3过程的第22天的预期TVC数目之外推计算，计算方法是将REP TVC除以16并然后乘以22。
表52：TIL最终产物的总活细胞计数和扩增倍数。
*L4055，未经过滤的培养基。
表53：TIL最终产物的存活百分比：在收集时，将最终TIL REP产物与存活率％的放行准则进行比较。Gen 2和Gen 3过程的所有条件都超过70％存活率准则，在过程和肿瘤方面具有可比性。
在收集后，将最终TIL REP产物与存活率％的放行准则进行比较。Gen 2和Gen 3过程的所有条件都超过70％的存活率准则，在过程和肿瘤方面具有可比性。
表53：REP的存活百分比(TIL最终产物)
由于每个培养瓶的碎片数目低于最大所需数目，故针对各肿瘤计算收集时所估计的细胞计数。该评估基于以下预期：临床肿瘤在第0天足够大以接种2个或3个培养瓶。
表54：将估计细胞计数计算值外推至Gen 3过程之全尺寸2和3个培养瓶。
免疫表型分析-TIL最终产物的表型标记比较。三种肿瘤L4054、L4055和M1085T在Gen 2和Gen 3过程中均经历TIL扩增。在收集后，对REP TIL最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化和记忆标记物。对于所有条件，TCR a/b+细胞的百分比超过90％。
与自Gen 2过程收集的TIL相比，自Gen 3过程收集的TIL显示更高的CD8和CD28的表达。Gen 2过程显示较高的CD4+百分比。
与自Gen 2过程收集的TIL相比，自Gen 3过程收集的TIL显示更高的中枢记忆室的表达。
在来自两个肿瘤L4054和L4055的TIL中分析活化和耗竭标记物物，以比较来自Gen2和Gen 3TIL扩增过程的最终TIL产物。Gen 2和Gen 3过程的活化和耗竭标记物具有可比性。
再刺激时的干扰素γ分泌。在收集日，即Gen 2的第22天和Gen 3的第16天，对于L4054和L4055，使用经包被的抗CD3盘对TIL进行过夜再刺激。使用抗CD3、CD28和CD137珠子对M1085T进行再刺激。在所有条件下，在再刺激24小时后收集上清液并冷冻上清液。使用相同ELISA板同时对来自两种过程的上清液评定通过ELISA进行的IFNγ分析。在所分析的三个肿瘤中观测到来自Gen 3过程的较高的IFNγ产量。
培养基中的IL-2含量的测量。为了比较Gen 2与Gen 3过程之间的IL-2消耗，对于肿瘤L4054和L4055，在REP启动、规模纵向扩大和收集日收集细胞上清液。通过来自R&D的Quantitate ELISA试剂盒测定细胞培养物上清液中的IL-2的量。一般趋势指示当与Gen 2过程相比时，Gen 3过程中的IL-2浓度保持较高。此可能归因于Gen 3的REP启动时的IL-2浓度较高(6000IU/mL)以及整个过程中培养基的残留。
代谢底物和代谢物分析。代谢底物例如D-葡萄糖和L-谷氨酰胺的含量经测定为整体培养基消耗的代替物。测定其互逆代谢物，例如乳酸和氨。葡萄糖是培养基中的一种单糖，粒线体利用其以ATP形式产生能量。当葡萄糖经氧化时，产生乳酸(乳酸盐为乳酸的酯)。在细胞指数生长期期间大量产生乳酸盐。高含量的乳酸盐会对细胞培养过程产生负面影响。
L4054和L4055的用过的培养基在Gen 2和Gen 3过程的REP启动、规模纵向扩大和收集日进行收集。在Gen 2的第11天、第16天和第22天收集用过培养基，在Gen 3的第7天、第11天和第16天收集用过培养基。用CEDEX生物分析仪分析上清液中的葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、GlutaMaxTM和氨的浓度。
L-谷氨酰胺是细胞培养基制剂中所需的一种不稳定的必需氨基酸。谷氨酰胺含有一种胺，和此酰胺结构基团可向细胞输送和递送氮。当L-谷氨酰胺氧化时，细胞会产生有毒的氨副产物。为了抵消L-谷氨酰胺的降解，向Gen 2和Gen 3过程的培养基中补充GlutaMaxTM，其在水溶液中更稳定且不会自发降解。在两个肿瘤株系中，Gen 3组在过程期间显示L-谷氨酰胺和GlutaMaxTM的减少，以及整个REP中氨的增加。在Gen 2组中，观测到恒定的L-谷氨酰胺和GlutaMaxTM浓度，以及氨产量略微增加。对于氨，Gen 2和Gen 3过程在收集日时具有可比性，L-谷氨酰胺降解略有不同。
通过Flow-FISH重复端粒。使用Flow-FISH技术测定在Gen 2和Gen 3过程中，L4054和L4055上的端粒重复的平均长度。使用来自DAKO的用于流式细胞术分析的端粒PNA试剂盒/FITC计算相关端粒长度(RTL)的测定结果。Gen 3显示与Gen 2相当的端粒长度。
CD3分析。为了确定各过程中产生的细胞产物的克隆多样性，对L4054和L4055的所收集的TIL最终产物进行取样，且通过T细胞受体的CDR3部分的测序进行克隆多样性的分析。
表55显示了Gen 2和Gen 3之间在TIL收集的细胞产物上的L4054上共享独特CDR3序列百分比的比较。Gen 3与Gen 2最终产物共享199个序列，相当于Gen 2前80％的独特CDR3序列中的97.07％与Gen 3最终产物共享。
表55：L4054上Gen 2与Gen 3过程之间的共享uCDR3序列的比较
表56显示Gen 2和Gen 3之间在TIL收集细胞产物上，L4055上共享独特CDR3序列百分比之比较。Gen 3与Gen 2最终产物共享1833个序列，对应于Gen 2最终产物的前80％的独特CDR3序列中的99.45％与Gen 3最终产物共享。
表56：L4055上Gen 2与Gen 3过程之间的共享uCDR3序列的比较
CM1和CM2培养基未经过滤预先制备且保持在4℃，直至用于肿瘤L4055以用于Gen2和Gen 3过程。
对于L4055肿瘤，在REP启动日，使培养基在37℃下升温24小时以用于Gen 2和Gen3过程。
在过程中收集的上清液中未测量LDH。
M1085T TIL细胞计数使用K2 cellometer细胞计数器进行。
在肿瘤M1085T上，样本不可用，例如用于代谢分析的上清液；用于活化和耗竭标记物分析、端粒长度和CD3-TCR vb分析的TIL产物。
结论。此实例比较了3个独立供体肿瘤组织的功能品质属性，外加Gen 2和Gen 3过程之间的扩增表型表征和培养基消耗。
Gen 2和Gen 3预REP和REP扩增比较根据所产生的总活细胞和总有核细胞群体的存活率来评定。收集日时的TVC细胞剂量在Gen 2(22天)与Gen 3(16天)之间无可比性。Gen3细胞剂量低于Gen 2，为在收集时收集的总活细胞的约40％。
假设预REP收集在第11天而不是第7天进行，REP收集在第22天而不是第16天进行，则计算Gen 3过程的外推细胞数目。在这两种情况下，与Gen 2过程相比，Gen 3在TVC上显示出更接近的数目，表明早期活化增强型TIL增长。
在Gen 3过程中额外培养瓶(2或3)的外推值的情况下，假设处理的肿瘤尺寸更大，达到如所描述的每个过程所需的最大碎片数目。观测到，与在第22天的Gen 2过程相比，Gen3过程在第16天收集的TVC上可达类似剂量。此观测结果是重要的，指示培养物的早期活化降低TIL处理时间。
Gen 2和Gen 3预REP和REP扩增比较根据所产生的总活细胞和总有核细胞群体的存活率来评定。收集日时的TVC细胞剂量在Gen 2(22天)与Gen 3(16天)之间无可比性。Gen3细胞剂量低于Gen 2，约在收集时收集的总活细胞的约40％。
就表型表征而言，与Gen 2过程相比，在Gen 3过程中在三个肿瘤上观测到较高的CD8+和CD28+表达。
与Gen 2过程相比，Gen 3过程显示略微较高的中枢记忆隔室。
尽管Gen 3过程的持续时间较短，但Gen 2和Gen 3过程显示相当的活化和耗竭标记物。
在所分析的三个肿瘤中，Gen 3最终产物上的IFNγ产量比Gen 2高3倍。此数据表明，与Gen 2过程相比，Gen 3过程产生功能强大且更有效的TIL产物，此可能归因于Gen 3上的CD8和CD28的表达更高。表型表征表明，在三个肿瘤上，与Gen 2过程相比，Gen 3的CD8+、CD28+表达呈阳性趋势。
Gen 2和Gen 3的TIL最终产物的端粒长度相当。
Gen 2和Gen 3最终产物的葡萄糖和乳酸盐含量相当，表明Gen 3过程的培养基上的营养物含量未受到影响，因为与Gen 2相比，在过程中的每一天均未进行减量移除且过程中的整体培养基体积较小。
与Gen 2过程相比，Gen 3过程的总体处理时间减少约两倍，此将显著降低通过Gen3过程扩增的TIL产物的商品成本(COG)。
IL-2消耗表明Gen 2过程中的IL-2消耗的一般趋势，而在Gen 3过程中，由于未移除旧培养基，因此IL-2较高。
通过CDR3 TCRab序列分析，Gen 3过程显示较高的克隆多样性。
在预REP的第0天添加饲养细胞和OKT-3允许TIL的早期活化并允许使用Gen 3过程进行TIL生长。
表57描述与当前Gen 2过程相比，Gen 3过程的各种实施例和结果。
表57：示例性Gen 3过程特征
实例10：示例性GEN 3过程(也称为GEN 3.1)
此实例描述关于“用于TIL扩增的Gen 2和Gen 3过程之间的可比较性”的其他研究。Gen 3过程经修改以在该过程早期包括活化步骤，其目标为增加最终总活细胞(TVC)输出，同时维持表型和功能概况。如下文所描述，将Gen 3实施例修改为另一实施例并在本文中在此实例中称为Gen 3.1。
在一些实施例中，Gen 3.1TIL制造过程具有四个操作员介入：
1.肿瘤碎片分离和活化：在过程的第0天，解剖肿瘤且产生各自为约3×3mm的最终碎片(总共至多240个碎片)并在1至4个G-REX100MCS培养瓶中培养。各培养瓶含有至多60个碎片、500mL CM1或DM1培养基，且补充有6,000IU rhIL-2、15μg OKT3和2.5×108个经照射的同种异体单核细胞。将培养物在37℃下孵育6至8天。
2.TIL培养物再活化：在第7至8天，在两种情况下，培养物通过缓慢添加补充有6,000IU rhIL-2、30μg OKT3和5×108个经照射的同种异体单核细胞的CM2或DM1培养基来补充。注意不要干扰瓶底部的现有细胞。将培养物在37℃下培养3至4天。
3.培养规模纵向扩大：在第10至11天进行。在培养规模纵向扩大期间，在两种情况下，将G-REX100MCS的全部内容物转移至含有4L补充有3,000IU/mL IL-2的CM4或DM2的G-REX500MCS培养瓶中。将培养瓶在37℃下孵育5至6天直至收集。
4.收集/洗涤/配制：在第16至17天，将培养瓶体积减小且合并。将细胞浓缩且用含有1％HAS的PlasmaLyte ApH 7.4洗涤。经洗涤的细胞悬浮液与CryoStor10以1:1的比例配制，补充rhIL-2至最终浓度为300IU/mL。
通过受控速率冷冻将DP冷冻保存且储存在气相液氮中。*完整标准TIL培养基1、2或4(CM1、CM2、CM4)可替代称为确定成分培养基(DM1或DM2)的CTSTMOpTmizerTMT细胞无血清扩增培养基，如上文所提及。
过程描述。在第0天，将肿瘤洗涤3次，然后破碎成3×3×3的最终碎片。在将整个肿瘤破碎后，然后将最终碎片同等地随机化且分成三个池。将一个随机化碎片池引入各组，根据三种实验矩阵添加相同数目的碎片。
在整个TIL扩增过程中，使用标准培养基进行肿瘤L4063扩增，并使用确定成分培养基(CTS OpTmizer)进行肿瘤L4064扩增。培养基的组分描述于本文中。
CM1完整培养基1：RPMI+谷氨酰胺，补充有2mM GlutaMaxTM、10％人AB血清、庆大霉素(50μg/mL)、2-巯基乙醇(55μM)。最终培养基制剂补充有6000IU/mL IL-2。
CM2完整培养基2：50％ CM1培养基+50％ AIM-V培养基。最终培养基制剂补充有6000IU/mL IL-2。
CM4完整培养基4：补充有GlutaMaxTM(2mM)之AIM-V。最终培养基制剂补充有3000IU/mL IL-2。
补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)的CTS OpTmizerCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。
DM1：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)以及CTSTM免疫细胞SR(3％)和GlutaMaxTM(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。最终制剂补充有6,000IU/mL IL-2。
DM2：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)以及CTSTM免疫细胞SR(3％)和GlutaMaxTM(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。最终制剂补充有3,000IU/mL IL-2。
预先制备所有类型的所用培养基，即，完整(CM)和确定(DM)培养基，保持在4℃下直至使用前一天，在培养箱中在37℃下在处理日之前提前升温至多24小时。
对于两种肿瘤，在第7天进行TIL培养物再活化。规模扩大对于L4063在第10天并对于L4064在第11天出现。收集两种培养物并在第16天冷冻保存。
达成的结果。确定了Gen 3.0和Gen 3.1过程的细胞计数和存活率百分比。在所有条件下的扩增均遵循此实例中所描述的细节。
对于各肿瘤，将碎片分成三个相等数目的池。归因于肿瘤的较小尺寸，无法达成每个培养瓶的最大碎片数目。对于三个不同的过程，评估在各条件下的总活细胞和细胞存活率。细胞计数确定为在第7天用于再活化的TVC、在第10天(L4064)或第11天(L4063)用于规模扩大的TVC，以及在第16/17天收集的TVC。
第7天和第10/11天的细胞计数视为FIO。通过将在第16/17天进行收集时的TVC除以第7天再活化日的TVC来计算扩增倍数。为了比较三个组，将收集日的TVC除以在第0天添加至培养物中的碎片的数目，以计算以每个碎片计的活细胞的平均值。
对L4063和L4064进行细胞计数和存活率分析。在两个肿瘤上，以每个碎片计，Gen3.1测试过程比Gen 3.0过程产生更多的细胞。
总活细胞计数和扩增倍数；在过程期间的存活率百分比。在再活化、规模纵向扩大和收集后，获得在所有条件下的存活率百分比。在第16/17天收集后，针对存活率百分比的放行准则来比较最终TIL。所有条件均超过70％的存活率准则，在过程及肿瘤方面具有可比性。
免疫表型分析-TIL最终产物的表型表征。对最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化和记忆标记物。在所有条件下，TCRα/β、CD4+和CD8+细胞的群体百分比是一致的。
进行REP TIL的扩增表型分析。在两个肿瘤中TIL产物显示，与Gen 3.0相比，Gen3.1条件下CD4+细胞的百分比较高，在两种条件下，与Gen 3.1条件相比，Gen 3.0中来自CD8+群体的CD28+细胞百分比较高。
自Gen 3.0和Gen 3.1过程收集的TIL显示与CD4+和CD8+细胞上的CD27和CD56表达相当的表型标记物，以及CD4+门控细胞群体上相当的CD28表达。TIL最终产物的记忆标记物比较：
将在第16天收集的TIL的冷冻样本进行染色以用于分析。TIL记忆状态在Gen 3.0与Gen 3.1过程之间相当。TIL最终产物的活化和耗竭标记物比较：
活化和耗竭标记物在CD4+和CD8+细胞上门控的Gen 3.0和Gen 3.1过程之间具有可比性。
再刺激时的干扰素γ分泌。收集的TIL使用L4063和L4064的经涂布的抗CD3板进行过夜再刺激。在所分析的两个肿瘤中，与Gen 3.0过程相比，观测到来自Gen 3.1过程的较高的IFNγ产生。
培养基中的IL-2含量的测量。为比较在所有条件和过程下的IL-2消耗量，在第7天的再活化起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)的规模扩大和第16天/第17天的收集时收集细胞上清液并冷冻。然后将上清液解冻然后分析。通过制造商方案测定细胞培养物上清液中的IL-2的量。
在同一培养基条件下评估的整个过程中，Gen 3和Gen 3.1的总体过程就IL-2消耗而言具有可比性。对所收集的L4063和L4064的用过的培养基的IL-2浓度(pg/mL)分析。
代谢物分析。对于每种条件，在L4063和L4064的第7天再活化起始、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模扩大和第16天/第17天收集时自L4063和L4064收集用过培养基上清液。用CEDEX生物分析仪分析上清液的葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、GlutaMaxTM和氨的浓度。
与完整培养基(2g/L)相比，确定成分培养基的葡萄糖浓度更高，为4.5g/L。总体而言，各培养基类型中Gen 3.0和Gen 3.1过程的葡萄糖浓度和消耗量相当。
观测到乳酸盐的增加，且Gen 3.0和Gen 3.1条件之间以及用于再活化扩增的两种培养基(完整培养基和确定成分培养基)之间的乳酸盐的增加相当。
在一些情况下，标准基础培养基含有2mM L-谷氨酰胺且补充有2mM GlutaMaxTM以补偿L-谷氨酰胺在培养条件下自然降解为L-谷氨酸和氨的情况。
在一些情况下，所使用的确定(无血清)培养基与基础培养基相比不含L-谷氨酰胺，仅补充有最终浓度为2mM的GlutaMaxTM。GlutaMaxTM系L-丙氨酸和L-谷氨酰胺之的二肽，在水溶液中比L-谷氨酰胺更稳定，不会自发降解为谷氨酸和氨。相反，二肽逐渐分解成单个氨基酸，从而保持较低但足够浓度的L-谷氨酰胺，以维持稳定的细胞生长。
在一些情况下，谷氨酰胺和GlutaMaxTM的浓度在规模扩大日略微降低，但在收集日显示增加，达到与再活化日相比类似或更接近的含量。对于L4064，在整个过程期间，谷氨酰胺和GlutaMaxTM浓度在不同条件下显示以相似的速率出现轻微降解。
与在含有2mM GlutaMaxTM的确定成分培养基中生长的样本相比，在含有2mM谷氨酰胺+2mM GlutaMaxTM的标准培养基中生长的样本中的氨浓度更高。此外，如所预期，在培养过程中，存在氨的逐渐增加或累积。在三种不同测试条件，在氨浓度方面不存在差异。
通过Flow-FISH测量重复端粒。使用Flow-FISH技术测量在Gen 3和Gen 3.1过程中，L4063和L4064上的端粒重复的平均长度。使用来自DAKO的用于流式细胞术分析的端粒PNA试剂盒/FITC计算相关端粒长度(RTL)的测定结果。进行端粒分析。比较样本与对照细胞系(1301白血病)中的端粒长度。对照细胞系为具有允许计算相对端粒长度的长稳定端粒的四倍体细胞系。在两种肿瘤中评定的Gen 3和Gen 3.1过程显示相当的端粒长度。
TCR Vβ谱系分析
为了确定在各过程中产生的细胞产物的克隆多样性，通过对T细胞受体的CDR3部分进行测序来分析TIL最终产物的克隆多样性分析。
在三个条件之间比较三个参数：
●独特CDR3(uCDR3)的多样性指数
●共享uCDR3％
●对于uCDR3前80％：
○比较共享uCDR3复本％
○比较独特克隆型的频率
对照和Gen 3.1测试，TIL收集细胞产物上的共享独特CDR3序列的百分比：975个序列在Gen 3和Gen 3.1测试最终产物之间共享，等效于与Gen 3.1共享的来自Gen 3独特CDR3序列的前80％的88％。
对照和Gen 3.1测试，TIL收集细胞产物上共享独特CDR3序列的百分比：2163个序列在Gen 3和Gen 3.1测试最终产物之间共享，等效于与Gen 3.1共享的来自Gen 3独特CDR3序列的前80％的87％。
来自收集第16天收集的1×106个细胞中鉴别的独特CD3序列的数目，用于不同的过程。基于样本中独特肽CDR的数量，Gen 3.1测试条件显示出与Gen 3.0相比略高的克隆多样性。
夏侬熵(Shannon entropy)多样性指数为可靠和常用的比较度量，因为在两种肿瘤中，Gen 3.1条件与Gen 3过程相比显示略微更高的多样性，表明Gen 3.1测试条件的TCRVβ谱系比Gen 3.0过程更具多克隆性。
此外，Gen 3.1测试条件的TCRVβ谱系与Gen 3.0过程的相应谱系在肿瘤L4063和L4064上显示超过87％的重叠。
Gen 3.1测试L4064在再活化日用过的培养基上的IL-2浓度值低于预期值(类似于Gen3.1对照和Gen 3.0条件)。
低值可能由于移液错误造成，但由于采集的样本很少，因此不可能重复分析。
结论。与Gen 3.0和Gen 3.1对照相比，第0天的Gen 3.1测试条件(包括饲养细胞和OKT-3)在收集第16天显示出细胞剂量的较高TVC。Gen 3.1测试条件下最终产物的TVC比Gen3.0高约2.5倍。
对于所测试的两个肿瘤样本，在第0天添加OKT-3和饲养细胞的Gen 3.1测试条件在收集时达到培养瓶的最大容量。在这些条件下，若在第0天起始最多4个培养瓶，则最终细胞剂量可在80-100×109个TIL之间。
在Gen 3.1测试和Gen 3.0过程之间保持所有品质属性，例如表型表征，包括最终TIL产物的纯度、耗竭、活化和记忆标记物。
在所分析的两种肿瘤中，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1中的最终TIL产物的IFN-γ产生比Gen 3.0高3倍，表明Gen 3.1过程产生有效的TIL产物。
在各测试条件下未观测到葡萄糖或乳酸盐含量的差异。在各种培养基条件下，未观测到Gen 3.0与Gen 3.1过程之间的谷氨酰胺和氨的差异。培养基中的较低谷氨酰胺含量未限制细胞生长，表明仅在培养基中添加GlutaMaxTM便足以提供细胞增殖所需的营养。
在第11天和第10天分别规模纵向扩大，在过程的收集日所达到的细胞数目方面未显示显著差异，并在两种情况下，在整个过程期间的代谢物消耗具有可比性。此观测结果表明Gen 3.0优化过程可在处理天数方面具有灵活性，从而促进过程安排的灵活性。
与Gen 3.0相比，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1过程显示出较高的克隆多样性，通过CDR3 TCRab序列分析测量。
图32描述Gen 3过程(Gen 3优化过程)的实施例。标准培养基和CTS Optimizer无血清培养基可用于Gen 3优化过程TIL扩增。在使用CTS Optimizer无血清培养基的情况下，建议将培养基上的GlutaMaxTM的最终浓度增加至4mM。
实例11：经修饰的具有膜锚定的IL-15和IL-21免疫调节融合蛋白的TIL的制备和表征
材料和方法
病毒制备和T细胞转导
为了制备慢病毒，将含有经拴系的细胞因子基因序列(表58)的pLenti-载体和包装辅助载体(VSV-G，Gag/Pol)共同转染至293T细胞中。自第2-3天培养物上清液收集慢病毒上清液，然后进行超速离心(120,000g)浓缩慢病毒用于TIL转导。在T细胞转导之前，用TransACT(1:100)刺激预REP细胞2天。将1E5个经活化的预REP细胞与经浓缩的慢病毒一起添加至预包被有重组人纤维蛋白片段(Retronectin)的48孔板中。在基因转导之后两天，收集预REP细胞以用于REP过程或其他表型表征和功能分析。
表58：膜锚定的IL-15和IL-21融合蛋白DNA序列
流式细胞术
为了检验经转导的细胞中的MIL-15表达，使用生物素-缀合物IL-15(biolgend,San Diego,CA)加链霉抗生物素蛋白-BV421(Biolegend,San Diego,CA)将经转导的细胞染色。为了检验mIL-21表达，使用PE结合的IL-21抗体将经转导的细胞染色。为了检验T细胞分裂，使用CellTraceTM紫细胞增殖染料(ThermoFisher scientific,Waltham,MA)预先标记T细胞。在5天之后，在存在或不存在IL-2(20IU/mL)的情况下，在离体培养物中分析T细胞分裂。为了检验T细胞活化和分化，使用来自碧迪生物科学、Biolegend、赛默飞世尔的抗体进行表型表征。用BioRad ZE5流式细胞仪获取数据且用FlowJo软件(FlowJo,LLC,Ashland,OR)进行分析。
T细胞计数和存活率
在TIL扩增之后收集REP细胞。使用Cellometer K2细胞计数器(Nexcelom,Lawrence,MA)通过AOPI分析评估活细胞数目。
预REP和REP过程
将人肿瘤样本解剖成约3mm碎块，与推荐的含有IL-2(6000IU/mL)的培养基一起在Grex10中培养。在培养11天之后，收集预REP细胞以用于2天活化和2天慢病毒转导。然后，在REP扩增过程中用经照射的PBMC、抗CD3抗体和3,000IU/mL IL-2将经转导的预REP细胞再繁殖11天。
结果
基因转导之后mIL-15/mIL-21的表达
在基因转导之后，用300IU/mL IL-2将经转导的预REP细胞再离体扩增5天。通过流式细胞术染色，经转导的预REP细胞显示出mIL-15和mIL-21的表达。如图38A中所示，存在经mIL-15慢病毒转导的TIL中的54.8％mIL-15的表达、经mIL-21转导的TIL中的53.5％mIL-21的表达以及经mIL-15/IL21转导的TIL中的36.5％mIL-15/mIL-21双重阳性细胞的表达。使用未经转导的细胞作为阴性对照。
mIL-15预REP细胞显示出pSTAT5信号的持续活化并显示增加的增殖
在验证表面细胞因子表达之后，检验T细胞功能性。STAT5的磷酸化为在γ链细胞因子刺激后T细胞活化的标记物。在血清饥饿的条件下，经mIL-15、mIL-21和mIL-15/IL-21慢病毒转导的细胞显示持续的pSTAT5信号，指示mIL-15具有功能性。如图38B中所示，在诱导pSTAT5活化方面，mIL-15优于mIL-21。此外，通过CellTrace增殖分析检验经mIL-15慢病毒转导的TIL的细胞增殖。在存在或不存在IL-2的情况下，将预先经CellTrace紫标记的TIL离体培养5天。如图38C中所示，在存在或不存在IL-2的情况下，mIL-15TIL与mIL-21或mIL-15/IL-21TIL相比显示出较好的增殖能力。mIL-15TIL可在不存在IL-2的情况下增殖，表明mIL-15可替代IL-2提供增殖信号。
REP过程之后的mIL-15/mIL-21的表达
在慢病毒转导之后，在REP过程中将TIL扩增11天。然后，通过流式细胞术评估膜结合的细胞因子受体的表面表达。如图39A中所示，存在mIL-15TIL中的31.1％mIL-15的表达、mIL-21TIL中的63％mIL-21的表达以及mIL-15/IL21 TIL中的10.7％mIL-15/mIL-21双重阳性细胞的表达。使用未经转导的细胞作为阴性对照。
mIL-15/mIL-21的表达促进REP过程中的CD8T细胞扩增
在所收集的REP细胞中，在经mIL-15、mIL-21和mIL-15/IL-21慢病毒转导的TIL中检测到CD8+T细胞百分比的增加(图39B)。此与先前报导一致，这些先前报导证实IL-15和IL-21充当优先刺激CD8 T细胞的增殖和存活的强效刺激剂。
表达mIL-15/mIL-21的REP TIL的表型
为了表征mIL-15和mIL-21对REP细胞的免疫调节作用，在门控的CD8+CD3+T细胞(图40)和CD4+CD3+T细胞子集(图41)中用新鲜解冻的REP细胞进行表型分析。我们发现mbIL-15显著抑制CD25(IL-2Rα)表达。与IL-2相同，IL-15在使用IL-2Rβ和IL-2Rγ方面进行竞争，表明调节CD25的负反馈机制。此外，mIL-15似乎活化T细胞，其特征在于较高的TIM3、TOX的表达，而IL-21显示出拮抗作用。此外，mIL-15和mIL-21均抑制Eomes的表达。未观测到其他表面标记物(例如PD-1、CD27、CXCR3等)的表达的显著差异。
实例12：经修饰的具有膜锚定的IL-15和IL-21免疫调节融合蛋白的TIL的制备和表征
对于此研究，将制备经修饰的具有膜锚定的IL-15和/或IL-21免疫调节融合蛋白的TIL，其中，使用NFAT启动子控制膜锚定的免疫调节IL-15和IL-21的表达，该启动子包括连接至最小人IL-2启动子的NFAT响应元件，参见例如表59。将如下所述来表征经修饰的TIL。
材料和方法
病毒制备和T细胞转导
为了制备慢病毒，将含有经拴系的细胞因子基因序列(表59)的pLenti-载体和包装辅助载体(VSV-G，Gag/Pol)共同转染至293T细胞中。自第2-3天培养物上清液收集慢病毒上清液，然后进行超速离心(120,000g)以浓缩慢病毒以用于TIL转导。在T细胞转导之前，用TransACT(1:100)刺激预REP细胞2天。将1E5个经活化的预REP细胞与经浓缩的慢病毒一起添加至预包被有重组人纤维蛋白片段的48孔板中。在基因转导的两天后，收集预REP细胞以用于REP过程或其他表型表征和功能分析。
表59：膜锚定的IL-12、IL-15和IL-21DNA序列(具有NFAT启动子)
流式细胞术
为了检验经转导的细胞中的MIL-15表达，使用生物素-缀合物IL-15(biolgend,San Diego,CA)加链霉抗生物素蛋白-BV421(Biolegend,San Diego,CA)将经转导的细胞染色。为了检验mIL-21表达，使用PE结合的IL-21抗体将经转导的细胞染色。为了检验T细胞分裂，使用CellTraceTM紫细胞增殖染料(ThermoFisher scientific,Waltham,MA)预先标记T细胞。在5天之后，在存在或不存在IL-2(20IU/mL)的情况下，在离体培养物中分析T细胞分裂。为了检验T细胞活化和分化，使用来自碧迪生物科学、Biolegend、赛默飞世尔的抗体进行表型表征。用BioRad ZE5流式细胞仪获取数据且用FlowJo软件(FlowJo,LLC,Ashland,OR)进行分析。
T细胞计数和存活率
在TIL扩增之后收集REP细胞。使用Cellometer K2细胞计数器(Nexcelom,Lawrence,MA)通过AOPI分析评估活细胞数目。
预REP和REP过程
将人肿瘤样本解剖成约3mm碎块，与推荐的含有IL-2(6000IU/mL)的培养基一起在Grex10中培养。在培养11天之后，收集预REP细胞以用于2天活化和2天慢病毒转导。然后，在REP扩增过程中用经照射的PBMC、抗CD3抗体和3,000IU/mL IL-2将经转导的预REP细胞再扩增11天。
结果
基因转导之后的mIL-15/mIL-21的表达
在基因转导之后，用300IU/mL IL-2将经转导的预REP细胞再离体扩增5天。通过流式细胞术染色，评估经转导的预REP细胞的MIL-15和mIL-21的表达。使用未经转导的细胞作为阴性对照。
mIL-15预REP细胞显示出pSTAT5信号的持续活化并显示增加的增殖
在验证表面细胞因子表达之后，检验T细胞功能性。特定地，在血清饥饿条件下评估经修饰的TIL的STAT5的磷酸化，以测定经修饰的TIL是否表达功能性mIL-15和/或IL-21。此外，通过CellTrace增殖分析检验经mIL-15慢病毒转导的TIL的细胞增殖。
REP过程之后的mIL-15/mIL-21的表达
在慢病毒转导之后，在REP过程中将TIL扩增11天并然后通过流式细胞术评估膜结合的细胞因子受体的表面表达。针对CD8+T细胞评估所收集的REP细胞。先前报导证实IL-15和IL-21充当优先刺激CD8 T细胞的增殖和存活的强效刺激剂。
表达mIL-15/mIL-21的REP TIL的表型
为了表征mIL-15和mIL-21对REP细胞的免疫调节作用，在门控的CD8+CD3+T细胞和CD4+CD3+T细胞子集中用新鲜解冻的REP细胞进行表型分析。将评估以下的表达：CD27、PD1、TIM3、CD62L、TOX、T-bet、CD38、CXCR3、Eomes及CD25。
实例13：经修饰的具有膜锚定的IL-2和IL-12免疫调节融合蛋白的TIL的制备和表征
将四个冷冻保存的TIL群体解冻且使用Cellaca MX计数器评估细胞数目和存活率。然后，将TIL再悬浮且使用SQZ方法(即，“挤压(squeeze)”)将编码膜锚定的IL-2和/或IL-12的mRNA(mbIL-2和mb-IL12)递送至TIL的亚群中。示例性mbIL-2和mbIL-12构建体描绘于图37中。将评估以下TIL亚群：1)无SQZ；2)无mRNA；3)mbIL-2mRNA；4)mbIL-12mRNA；和5)mbIL-2+mbIL-12mRNA。在挤压之后，使用Cellaca MX计数器再次评估细胞之存活率和数目。然后，将细胞再悬浮并在存在或不存在300IU/mL IL-2的情况下，在CM2培养基中培养4天。每天收集细胞以测定细胞数目、存活率和表面标记物表达，包括(但不限于)：mbIL-2和mIL-12。在挤压之后，还将在存在或不存在300IU/mL IL-2的情况下用TransAct刺激细胞。还将评估细胞数目、存活率和标记物表达以及IFNg和TNFa含量。还将在挤压之后将一些TIL冷冻保存并在1周之后解冻，以在存在或不存在IL-2的情况下培养1、2、3和4天之后分析mbIL-2和mbIL-12的表达。此将允许评估与新鲜细胞相比，经挤压和冷冻保存的细胞是否保持相同的膜结合的细胞因子表达量。
在体外细胞毒性分析中使用KILR THP-1细胞评估用mbIL-2和mbIL-12进行挤压的细胞的功能作用。在存在或不存在300IU/mL IL-2的情况下，将经挤压的TIL与KILR THP-1细胞以10:1比率共同培养。在24小时之后，通过向培养板中添加底物来评估细胞毒性。在单独的实验集合中，在存在或不存在300IU/mL IL-2的情况下，将经挤压和对照组TIL与KILRTHP-1细胞共同培养3天。在此培养期之后，评估TIL数目、存活率和表型。
在此初始体外实验集合之后，在NSG和hIL-2NOG小鼠中用对照组以及经mbIL-2和mbIL-12挤压的TIL运行PDX模型。对于这些实验，将使用经冷冻保存的黑色素瘤TIL和配对的PDX肿瘤细胞。简言之，在NSG和hIL-2NOG小鼠中接种PDX肿瘤细胞。在建立肿瘤之后，用对照组和经挤压的TIL(对应于PDX模型)以10E6个细胞/小鼠通过尾部静脉注射来接种携带肿瘤的小鼠。每两周一次测定肿瘤和小鼠体重。
在如上文所描述完成初始概念验证(POC)实验之后，使用以上实例7中所描述的Gen2过程进行两次工程改造操作，然后进行细胞挤压过程(如上文所描述)以用mbIL-2mRNA和/或mbIL-12mRNA转染所得TIL群体。在挤压之前和之后针对细胞计数和存活率来评定TIL，并在存在或不存在IL-2的情况下，在挤压之后评估标记物表达且评估4天。
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提供上述实例以为本领域技术人员提供如何制得并使用本发明的组合物、系统和方法的实施例的完整公开内容和描述，并不意在限制本发明人定义其发明的范围。本领域技术人员显而易见的进行本发明的上文所描述模式的修改旨在在以下权利要求的范围内。本说明书中提及的所有专利和公开指示本领域技术人员的技能水平。
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Claims (229)

1.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，其中，可选地，患者或受试者已接受至少一种先前疗法，
TIL中的一部分为经修饰的TIL，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
2.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从受试者或患者所切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及(i)在施用(h)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
3.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将自受试者获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从受试者切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)在施用(h)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
4.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，所述方法包括以下步骤：
(a)由手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自患者或受试者的癌症获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及(i)在施用(h)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
5.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，所述方法包括以下步骤：
(a)自受试者或患者切除肿瘤，所述肿瘤包含第一TIL群体，可选地，通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自癌症获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式进行；
(b)将肿瘤处理成多个肿瘤碎片并将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；
(g)通过冷冻保存过程，冷冻保存来自步骤(f)的包含所收集的TIL群体的输注袋；
(h)向患有癌症的受试者或患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群体；以及
(i)在施用(h)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
6.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，所述方法包括以下步骤：
(a)由手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自受试者或患者获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体；
(c)使第一TIL群体与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中进行第一TIL群体的初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第一细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3(抗CD3抗体)和可选的抗原呈递细胞(APC)，起始第一扩增进行1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速第二扩增，获得第三TIL群体；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和APC；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，快速第二扩增可在快速第二扩增开始之后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有癌症的受试者或患者施用治疗有效部分的第三TIL群体；以及
(h)在施用(g)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
7.一种治疗有需要的患者或受试者的癌症的方法，所述方法包括施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)群体，所述方法包括以下步骤：
(a)自受试者或患者的癌症切除肿瘤，所述肿瘤包含第一TIL群体，可选地，通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自癌症获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式进行；
(b)将肿瘤破碎成肿瘤碎片；
(c)使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中进行第一TIL群体的初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第一细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3(抗CD3抗体)和可选的抗原呈递细胞(APC)，起始第一扩增进行1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速第二扩增，获得第三TIL群体；其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和APC；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，快速第二扩增可在快速第二扩增开始之后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；
(g)向患有癌症的受试者或患者施用治疗有效部分的第三TIL群体；以及
(h)在施用(g)之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
8.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：
(a)通过将自肿瘤获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从受试者的癌症切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)自步骤(a)中的第一TIL群体选择PD-l阳性TIL，获得富含PD-l的TIL群体；
(c)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第一细胞培养基中培养富含PD-l的TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增在包含第一透气表面区域的容器中进行，其中，起始第一扩增进行约1至7天或约1至8天的第一时间段以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(d)通过在包含IL-2、OKT-3和APC的第二培养基中培养第二TIL群体来进行快速第二扩增，产生治疗性TIL群体，其中，在快速第二扩增中添加的APC的数目为在步骤(b)中添加的APC的数目的至少两倍，快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得治疗性TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，其中，快速第二扩增在具有第二透气表面区域的容器中进行；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，以及
(g)在所述方法期间的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
9.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将自肿瘤获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从受试者或患者的癌症切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至14天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至14天以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的治疗性TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(g)在步骤(f)中的转移至输注袋之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
10.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将自肿瘤获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得来自从受试者的癌症切除的肿瘤的第一TIL群体；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(g)在步骤(f)中的转移至输注袋之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
11.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)由手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自患者或受试者的癌症获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体，
(b)将第一TIL群体添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(g)在步骤(f)中转移之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
12.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)自受试者或患者的癌症切除肿瘤，所述肿瘤包含第一TIL群体，可选地，通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自癌症获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式进行；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增，产生第二TIL群体，其中，第一扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，第一扩增进行约3至11天以获得第二TIL群体，自步骤(b)至步骤(c)的转变在不打开系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群体的细胞培养基来进行第二扩增，产生第三TIL群体，其中，第二扩增进行约7至11天以获得第三TIL群体，第二扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，自步骤(c)至步骤(d)的转变在不打开系统的情况下进行；
(e)收集自步骤(d)获得的第三TIL群体，其中，自步骤(d)至步骤(e)的转变在不打开系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所收集的第三TIL群体转移至输注袋，其中，自步骤(e)至(f)的转移在不打开系统的情况下进行；以及
(g)在步骤(f)中的转移之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中，第一扩增分为第一步骤和第二步骤，所述方法还包括通过在含有IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行第一扩增的第一步骤，产生自肿瘤碎片或样本脱出的TIL，将肿瘤碎片或样本中剩余的TIL与自肿瘤碎片或样本脱出的TIL分离，可选地，消化肿瘤碎片或样本以产生肿瘤消化物；以及通过在细胞培养基中培养肿瘤碎片或样本或肿瘤消化物中的剩余TIL来进行第一扩增的第二步骤，产生第二TIL群体。
14.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)由手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于自受试者或患者的癌症获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的其他方式，获得和/或接受第一TIL群体；
(b)使第一TIL群体与第一细胞培养基接触；
(c)在第一细胞培养基中进行第一TIL群体的初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第一细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3(抗CD3抗体)和可选的抗原呈递细胞(APC)，起始第一扩增进行1至8天的时间段；
(d)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速第二扩增，获得第三TIL群体，其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和APC；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，快速第二扩增可在快速第二扩增开始之后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(e)收集第三TIL群体；以及
(f)在步骤(f)中的收集之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
15.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)自受试者或患者的癌症切除肿瘤，肿瘤包含第一TIL群体，可选地，通过手术切除、针吸活体组织切片、粗针活体组织切片、小活体组织切片或用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的肿瘤样本的其他方式进行；
(b)将肿瘤碎片化成肿瘤碎片；
(c)使肿瘤碎片与第一细胞培养基接触；
(d)在第一细胞培养基中进行第一TIL群体的初始扩增(或起始第一扩增)，获得第二TIL群体，其中，第一细胞培养基包含IL-2、可选的OKT-3(抗CD3抗体)和可选的抗原呈递细胞(APC)，其中，起始第一扩增进行1至8天的时间段；
(e)在第二细胞培养基中进行第二TIL群体的快速第二扩增，获得第三TIL群体，其中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3(抗CD3抗体)和APC；快速扩增进行14天以下的时间段，可选地，快速第二扩增可在快速第二扩增开始之后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天；
(f)收集第三TIL群体；以及
(g)在步骤(f)中的收集之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
16.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：
(1)通过将自肿瘤获得的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片，获得和/或接受来自从受试者的癌症切除的肿瘤的第一TIL群体；
(2)通过在包含IL-2、可选的OKT-3，和可选的包含抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约1至7天或约1至8天的第一时间段以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(3)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；
(4)收集自步骤(c)获得的治疗性TIL群体；以及
(5)在步骤(d)中的收集之前或之后的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，在步骤(b)中，细胞培养基还包含抗原呈递细胞(APC)，步骤(c)中的培养基中的APC的数目大于步骤(b)中的培养基中的APC的数目。
18.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：
(a)通过在包含IL-2、可选的OKT-3和可选的抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，所述第一TIL群体可通过将来自从受试者的癌症切除的肿瘤的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得；其中，起始第一扩增在具有第一透气表面区域的容器中进行，起始第一扩增进行约1至7天或约1至8天的第一时间段以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(b)通过使第二TIL群体与第二TIL群体的具有额外的IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增中的APC的数目为步骤(a)中的APC的数目的至少两倍，快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，快速第二扩增在具有第二透气表面区域的容器中进行；
(c)收集自步骤(b)获得的治疗性TIL群体；以及
(d)在步骤(c)中的收集之前或之后的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
19.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：
(a)通过在包含IL-2、可选的OKT-3和可选的包含抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约1至7天或约1至8天的第一时间段以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(b)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约1至11天的第二时间段以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；
(c)收集自步骤(b)获得的治疗性TIL群体；以及
(d)在步骤(c)中的收集之前或之后的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，在步骤(a)中，细胞培养基还包含抗原呈递细胞(APC)，步骤(c)中的培养基中的APC的数目大于步骤(b)中的培养基中的APC的数目。
21.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其中，起始第一扩增分为第一步骤和第二步骤，所述方法还包括通过在含有IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增的第一步骤，产生自肿瘤碎片或样本脱出的TIL，将肿瘤碎片或样本中剩余的TIL与自肿瘤碎片或样本脱出的TIL分离，可选地，消化肿瘤碎片或样本以产生肿瘤消化物；以及通过在细胞培养基中培养肿瘤碎片或样本或肿瘤消化物中的剩余TIL来进行起始第一扩增的第二步骤，产生第二TIL群体。
22.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：
(a)通过将肿瘤样本在包含IL-2的第一细胞培养基中培养约3天，获得和/或接受来自肿瘤样本的第一TIL群体，肿瘤样本由来自受试者的癌症的肿瘤的一次以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或针吸活体组织切片获得；
(b)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增在具有第一透气表面区域的容器中进行，起始第一扩增进行约7或8天的第一时间段以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(c)通过用额外的IL-2、OKT-3和APC补充第二TIL群体的第二细胞培养基来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增中添加的APC的数目为步骤(b)中添加的APC的数目的至少两倍，快速第二扩增进行约11天的第二时间段以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体，快速第二扩增在具有第二透气表面区域的容器中进行；
(d)收集自步骤(c)获得的治疗性TIL群体；
(e)将来自步骤(d)的所收集的TIL群体转移至输注袋；以及
(f)在步骤(e)中的转移至输注袋之前的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
23.一种将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增成治疗性TIL群体的方法，所述方法包括：
(a)通过将肿瘤样本在包含IL-2的第一细胞培养基中培养约3天，获得和/或接受来自肿瘤样本的第一TIL群体，肿瘤样本由来自受试者的癌症的肿瘤的一次以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或针吸活体组织切片获得；
(b)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群体来进行起始第一扩增，产生第二TIL群体，其中，起始第一扩增进行约7或8天的第一时间段以获得第二TIL群体，第二TIL群体的数目大于第一TIL群体；
(c)通过使第二TIL群体与包含IL-2、OKT-3和APC的第三细胞培养基接触来进行快速第二扩增，产生第三TIL群体，其中，快速第二扩增进行约11天的第二时间段以获得第三TIL群体，第三TIL群体为治疗性TIL群体；
(d)收集自步骤(c)获得的治疗性TIL群体；及
(e)在步骤(f)中收集之前或之后的任何时间修饰TIL的一部分，使得经修饰的TIL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
24.根据权利要求1至18和21至23中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、由人乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌和肾细胞癌。
25.一种扩增T细胞的方法，所述方法包括：
(a)通过培养第一T细胞群体以实现生长以及启动第一T细胞群体的活化来进行自供体获得的第一T细胞群体的起始第一扩增；
(b)在步骤(a)中启动的第一T细胞群体的活化开始衰减之后，通过培养第一T细胞群体以实现生长以及增强第一T细胞群体的活化来进行第一T细胞群体的快速第二扩增，获得第二T细胞群体；
(c)收集第二T细胞群体；以及
(d)在步骤(c)中的收集之前或之后的任何时间修饰T细胞的一部分，使得经修饰的T细胞中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
26.一种扩增T细胞的方法，所述方法包括：
(a)通过培养第一T细胞群体以实现生长以及启动第一T细胞群体的活化来进行来自肿瘤样本的第一T细胞群体的起始第一扩增，肿瘤样本自供体中的肿瘤的一次以上小活体组织切片、粗针活体组织切片或针吸活体组织切片获得；
(b)在步骤(a)中启动的第一T细胞群体的活化开始衰减之后，通过培养第一T细胞群体以实现生长以及增强第一T细胞群体的活化来进行第一T细胞群体的快速第二扩增，获得第二T细胞群体；
(c)收集第二T细胞群体；以及
(d)在步骤(e)中的收集之前或之后的任何时间修饰T细胞的一部分，使得经修饰的T细胞中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
27.一种扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)自患者的外周血获得外周血单核细胞(PBMC)的样本；
(b)将PBMC在包含第一细胞培养基的培养物中培养选自如下的时间段：约9天、约10天、约11天、约12天、约13天和约14天，从而实现来自PBMC的外周血淋巴细胞(PBL)的扩增，第一细胞培养基具有IL-2、抗CD3/抗CD28抗体和第一抗生素组合；
(c)自步骤(b)中的培养物收集PBL；以及
(d)在步骤(c)中的收集之前或之后的任何时间修饰PBL的一部分，使得经修饰的PBL中的每一个包含与其表面膜缔合的免疫调节组合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，患者已用依鲁替尼或另一种白介素-2诱导型T细胞激酶(ITK)抑制剂预治疗。
29.根据权利要求26或28所述的方法，其中，患者对用依鲁替尼或另一种ITK抑制剂的治疗而言是难治性的。
30.根据权利要求2至29中任一项所述的方法，其中，所述免疫调节组合物包含一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白，所述膜锚定的免疫调节融合蛋白各自包含一种以上免疫调节剂和细胞膜锚部分。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述一种以上免疫调节剂包括一种以上细胞因子。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-12。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述IL-12包含连接至人IL-12p40亚基的人IL-12p35亚基。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述人IL-12p35亚基具有SEQ ID NO:247的氨基酸序列，所述人IL-12p40亚基具有SEQ ID NO:248的氨基酸序列。
36.根据权利要求32所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-15。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述IL-15为人IL-15。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述人IL-15具有SEQ ID NO:258的氨基酸序列。
39.根据权利要求32所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-18。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述IL-18为人IL-18。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述人IL-18具有SEQ ID NO:269或SEQ ID NO:270的氨基酸序列。
42.根据权利要求32所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-21。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述IL-21为人IL-21。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述人IL-21具有SEQ ID NO:271的氨基酸序列。
45.根据权利要求30所述的方法，其中，所述一种以上免疫调节剂包括CD40激动剂。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述CD40激动剂为抗CD40结合结构域或CD40L。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述CD40激动剂为包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的CD40结合结构域。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述CD40结合结构域的VH和VL选自以下：
a.具有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:275的氨基酸序列的VL；
b.具有SEQ ID NO:277的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:278的氨基酸序列的VL；
c.具有SEQ ID NO:280的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:281的氨基酸序列的VL；和
d.具有SEQ ID NO:283的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:284的氨基酸序列的VL。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中，所述CD40结合结构域为scFv。
50.根据权利要求46所述的方法，其中，所述CD40激动剂为具有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的人CD40L。
51.根据权利要求30至50中任一项所述的方法，其中，所述膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端根据下式：S-IA-L-C，式中，S为信号肽，IA为免疫调节剂，L为接头，C为细胞膜锚部分。
52.根据权利要求30至51中任一项所述的方法，其中，所述细胞膜锚部分包含CD8a跨膜-胞内结构域、B7-1跨膜结构域、B7-2跨膜结构域或CD8a跨膜结构域。
53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述细胞膜锚部分包含B7-1跨膜结构域。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述细胞膜锚部分具有SEQ ID NO:239的氨基酸序列。
55.根据权利要求30至54中任一项所述的方法，其中，所述免疫调节组合物包含两种以上不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白，所述不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白中的每一种各自包含不同的免疫调节剂。
56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述不同的免疫调节剂选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF、GCSF或它们的变体，以及CD40激动剂。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述不同的免疫调节剂选自：IL-12和IL-15、IL-15和IL-18、CD40L和IL-15、IL-15和IL-21，以及IL-2和IL-12。
58.根据权利要求30至57中任一项所述的方法，其中，所述修饰包括将编码融合蛋白的异源核酸引入TIL的一部分中，在经修饰的TIL的表面上表达所述融合蛋白。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，使用一种以上选自以下的方法将所述异源核酸引入经修饰的TIL的基因组中：CRISPR方法、TALE方法、锌指方法和它们的组合。
60.根据权利要求2至29中任一项所述的方法，其中，所述免疫调节组合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含一种以上连接至TIL表面抗原结合结构域的免疫调节剂。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述一种以上免疫调节剂包含一种以上细胞因子。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-12。
64.根据权利要求62所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-15。
65.根据权利要求62所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-21。
66.根据权利要求60至65中任一项所述的方法，其中，TIL表面抗原结合结构域包含抗体重链可变结构域和轻链可变结构域。
67.根据权利要求60至66中任一项所述的方法，其中，TIL表面抗原结合结构域包含抗体或其片段。
68.根据权利要求43至50中任一项所述的方法，其中，TIL表面抗原结合结构域对以下TIL表面抗原中的一种以上具有亲和力：CD45、CD4、CD8、CD3、CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD25、CD127、CD19、CD20、CD22、HLA-DR、CD197、CD38、CD27、CD196、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CD84、CD229、CCR1、CCR5、CCR4、CCR6、CCR8、CCR10、CD 16、CD56、CD 137、OX40或GITR。
69.根据权利要求60至68中任一项所述的方法，其中，所述修饰包括将所述融合蛋白与所述TIL的一部分在允许所述融合蛋白与所述TIL的一部分结合的条件下孵育。
70.根据权利要求2至29中任一项所述的方法，其中，所述免疫调节组合物包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含多种免疫调节剂。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，所述多种免疫调节剂通过可降解接头共价连接在一起。
72.根据权利要求71所述的方法，其中，所述纳米颗粒包含在所述纳米颗粒的表面上的至少一种聚合物、阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。
74.根据权利要求73所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-12。
75.根据权利要求73所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-15。
76.根据权利要求73所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-21。
77.根据权利要求70至76中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒为脂质体、蛋白纳米凝胶、核苷酸纳米凝胶、聚合物纳米颗粒或固态纳米颗粒。
78.根据权利要求77所述的方法，其中，所述纳米颗粒为纳米凝胶。
79.根据权利要求70至78中任一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒还包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域结合以下抗原中的一种以上：CD45、CDlla(整合素α-L)、CD 18(整合素β-2)、CD1lb、CD1lc、CD25、CD8或CD4。
80.根据权利要求70至79中任一项所述的方法，其中，所述修饰包括将所述免疫调节组合物连接至所述TIL的一部分的表面。
81.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，对来自第一扩增的TIL或来自第二扩增的TIL或其两者进行修饰。
82.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，对来自起始第一扩增的TIL或来自快速第二扩增的TIL或其两者进行修饰。
83.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，在第一扩增之后并在第二扩增之前进行修饰。
84.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，在起始第一扩增之后并在快速第二扩增之前进行修饰，或者在这两个时间点时进行修饰。
85.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，在第二扩增之后进行修饰。
86.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，在快速第二扩增之后进行修饰。
87.根据权利要求2至63中任一项所述的方法，其中，在收集之后进行修饰。
88.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，所述第一扩增进行约11天的时间段。
89.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，所述起始第一扩增进行约11天的时间段。
90.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，在第一扩增中，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于细胞培养基中。
91.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，在起始第一扩增中，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于细胞培养基中。
92.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，在第二扩增步骤中，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在，所述OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
93.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，在快速第二扩增步骤中，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在，所述OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
94.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，所述第一扩增使用透气容器进行。
95.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，所述起始第一扩增使用透气容器进行。
96.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，所述第二扩增使用透气容器进行。
97.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，所述快速第二扩增使用透气容器进行。
98.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，所述第一扩增的细胞培养基还包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和它们的组合。
99.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，起始第一扩增的细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和它们的组合。
100.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，第二扩增的细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和它们的组合。
101.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，快速第二扩增的细胞培养基进一步包含选自如下的细胞因子：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和它们的组合。
102.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，所述方法还包括在向患者施用TIL之前用非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案治疗患者的步骤。
103.根据权利要求102所述的方法，其中，所述非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
104.根据权利要求102所述的方法，其中，所述非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
105.根据权利要求102所述的方法，其中，所述非骨髓清除式淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并且以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨一天。
106.根据权利要求103至105中任一项所述的方法，其中，环磷酰胺与美司钠(mesna)一起施用。
107.根据权利要求1至7或102至106中任一项所述的方法，所述方法还包括在向患者施用TIL之后的第二天开始用IL-2方案治疗患者的步骤。
108.根据权利要求1至7或102至106中任一项所述的方法，所述方法还包括在向患者施用TIL的同一天开始用IL-2方案治疗患者的步骤。
109.根据权利要求107或108所述的方法，其中，所述IL-2方案为包含600,000或720,000IU/kg的阿地白介素或其生物类似物或变体的高剂量IL-2方案，所述方案以每八小时一次15分钟推注的静脉内输注形式施用直至耐受。
110.根据权利要求1至7或102至109中任一项所述的方法，其中，施用治疗有效的TIL群体，所述TIL群体包含约2.3×1010至约13.7×1010个TIL。
111.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，所述起始第一扩增和所述快速第二扩增进行21天以下的时间段。
112.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，所述起始第一扩增和所述快速第二扩增进行16天或17天以下的时间段。
113.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，所述起始第一扩增进行7或8天以下的时间段。
114.根据权利要求6至8或14至23中任一项所述的方法，其中，所述快速第二扩增进行11天以下的时间段。
115.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，步骤(c)中的第一扩增和步骤(d)中的第二扩增各自单独地在11天的时间段内进行。
116.根据权利要求2至5或9至13中任一项所述的方法，其中，步骤(a)至(f)在约10天至约22天内进行。
117.根据权利要求2至116中任一项所述的方法，其中，经修饰的TIL还包含基因修饰，所述基因修饰引起至少一部分治疗性TIL群体中的一种以上免疫检查点基因的表达的沉默或降低。
118.根据权利要求117所述的方法，其中，所述一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、TET2、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、TOX、SOCS1、ANKRD11和BCOR。
119.根据权利要求117所述的方法，其中，所述一种以上免疫检查点基因选自：PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ和PKA。
120.根据权利要求2至119中任一项所述的方法，其中，经修饰的TIL还包含基因修饰，所述基因修饰引起至少一部分治疗性TIL群体中的一种以上免疫检查点基因的表达的增强，所述一种以上免疫检查点基因选自：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2胞内结构域(ICD)和/或NOTCH配体mDLL1。
121.根据权利要求117至120中任一项所述的方法，其中，所述基因修饰使用可编程核酸酶进行，所述可编程核酸酶介导所述一种以上免疫检查点基因处的双链或单链断裂的产生。
122.根据权利要求117至120中任一项所述的方法，其中，所述基因修饰使用一种以上选自以下的方法进行：CRISPR方法、TALE方法、锌指方法和它们的组合。
123.根据权利要求122所述的方法，其中，所述基因修饰使用CRISPR方法进行。
124.根据权利要求123所述的方法，其中，所述CRISPR方法为CRISPR/Cas9方法。
125.根据权利要求122所述的方法，其中，所述基因修饰使用TALE方法进行。
126.根据权利要求122所述的方法，其中，所述基因修饰使用锌指方法进行。
127.根据权利要求1至23或81至116中任一项所述的方法，其中，经修饰的TIL被修饰以在细胞的表面上瞬时表达所述免疫调节组合物。
128.根据权利要求127所述的方法，其中，所述免疫调节组合物包含一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白，各融合蛋白包含一种以上免疫调节剂和细胞膜锚部分。
129.根据权利要求128所述的方法，其中，所述一种以上免疫调节剂包含一种以上细胞因子。
130.根据权利要求129所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。
131.根据权利要求130所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-2。
132.根据权利要求131所述的方法，其中，所述IL-2为人IL-2。
133.根据权利要求132所述的方法，其中，所述人IL-2具有SEQ ID NO:272的氨基酸序列。
134.根据权利要求130所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-12。
135.根据权利要求134所述的方法，其中，所述IL-12包含连接至人IL-12p40亚基的人IL-12p35亚基。
136.根据权利要求135所述的方法，其中，所述人IL-12p35亚基具有SEQ ID NO:267的氨基酸序列，所述人IL-12p40亚基具有SEQ ID NO:268的氨基酸序列。
137.根据权利要求130所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-15。
138.根据权利要求137所述的方法，其中，所述IL-15为人IL-15。
139.根据权利要求138所述的方法，其中，所述人IL-15具有SEQ ID NO:258的氨基酸序列。
140.根据权利要求130所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-18。
141.根据权利要求140所述的方法，其中，所述IL-18为人IL-18。
142.根据权利要求141所述的方法，其中，所述人IL-18具有SEQ ID NO:269或SEQ IDNO:270的氨基酸序列。
143.根据权利要求130所述的方法，其中，所述一种以上细胞因子包括IL-21。
144.根据权利要求143所述的方法，其中，所述IL-21为人IL-21。
145.根据权利要求144所述的方法，其中，所述人IL-21具有SEQ ID NO:271的氨基酸序列。
146.根据权利要求128所述的方法，其中，所述一种以上免疫调节剂包含CD40激动剂。
147.根据权利要求146所述的方法，其中，所述CD40激动剂为抗CD40结合结构域或CD40L。
148.根据权利要求147所述的方法，其中，所述CD40激动剂为包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的CD40结合结构域。
149.根据权利要求148所述的方法，其中，所述CD40结合结构域的VH和VL选自：
a.具有SEQ ID NO:274的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:275的氨基酸序列的VL；
b.具有SEQ ID NO:277的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:278的氨基酸序列的VL；
c.具有SEQ ID NO:280的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:281的氨基酸序列的VL；和
d.具有SEQ ID NO:283的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:284的氨基酸序列的VL。
150.根据权利要求148或149所述的方法，其中，所述CD40结合结构域为scFv。
151.根据权利要求46所述的方法，其中，所述CD40激动剂为具有SEQ ID NO:273的氨基酸序列的人CD40L。
152.根据权利要求128至151中任一项所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端独立地根据下式：S-IA-L-C，式中，S为信号肽，IA为免疫调节剂，L为接头，C为细胞膜锚部分。
153.根据权利要求128至152中任一项所述的方法，其中，所述细胞膜锚部分包含CD8a跨膜-胞内结构域、B7-1跨膜结构域、B7-2跨膜结构域或CD8a跨膜结构域。
154.根据权利要求153所述的方法，其中，所述细胞膜锚部分包含B7-1跨膜结构域。
155.根据权利要求154所述的方法，其中，所述细胞膜锚部分具有SEQ ID NO:239的氨基酸序列。
156.根据权利要求128至155中任一项所述的方法，其中，所述免疫调节组合物包含两种以上不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白，所述不同的膜锚定的免疫调节融合蛋白中的每一种各自包含不同的免疫调节剂。
157.根据权利要求156所述的方法，其中，所述不同的免疫调节剂选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF、GCSF或它们的变体，以及CD40激动剂。
158.根据权利要求157所述的方法，其中，所述不同的免疫调节剂选自：IL-12和IL-15、IL-15和IL-18、CD40L和IL-15、IL-15和IL-21，以及IL-2和IL-12。
159.根据权利要求128至158中任一项所述的方法，其中，所述修饰包括将编码融合蛋白的异源核酸引入TIL的一部分中，在经修饰的TIL的表面上表达所述融合蛋白。
160.根据权利要求159所述的方法，其中，使用一种以上选自以下的方法将所述异源核酸引入经修饰的TIL的基因组：CRISPR方法、TALE方法、锌指方法和它们的组合。
161.根据权利要求128至158中任一项所述的方法，其中，经修饰的TIL通过用编码所述融合蛋白的核酸转染TIL来修饰。
162.根据权利要求161所述的方法，其中，所述核酸为RNA。
163.根据权利要求162所述的方法，其中，所述RNA为mRNA。
164.根据权利要求163所述的方法，其中，通过电穿孔用所述mRNA转染TIL。
165.根据权利要求164所述的方法，其中，在第一扩增之后且在第二扩增之前，通过电穿孔用所述mRNA转染TIL。
166.根据权利要求164所述的方法，其中，在第一扩增之前，通过电穿孔用所述mRNA转染TIL。
167.根据权利要求161所述的方法，其中，经修饰的TIL通过使用微流体装置暂时性破坏TIL的细胞膜来用编码所述融合蛋白的核酸进行转染，从而允许所述核酸的转染。
168.根据权利要求163至167中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在用所述mRNA转染TIL之前，通过用抗CD3激动剂孵育来活化TIL。
169.根据权利要求168所述的方法，其中，所述抗CD3激动剂为OKT-3。
170.根据权利要求168或169所述的方法，其中，在用所述mRNA转染TIL之前，通过用所述抗CD3激动剂孵育TIL约1至3天来活化TIL。
171.一种组合物，所述组合物包含权利要求1至131中任一项所述的经修饰的TIL。
172.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至131中任一项所述的经修饰的TIL和药学上可接受的载体。
173.根据权利要求30所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-2。
174.根据权利要求30所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-15。
175.根据权利要求30所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-18。
176.根据权利要求30所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-21。
177.根据权利要求30所述的方法，其中，所述经修饰的TIL包含第一膜锚定的免疫调节融合蛋白和第二膜锚定的免疫调节融合蛋白。
178.根据权利要求177所述的方法，其中，所述第一膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-15，所述第二膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-21。
179.根据权利要求177或178所述的方法，其中，所述第一膜锚定的免疫调节融合蛋白和所述第二免疫调节融合蛋白的表达由经修饰的TIL中的NFAT启动子控制。
180.根据权利要求30所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端独立地根据下式：S-IA-L-C，式中，S为信号肽，IA为免疫调节剂，L为接头，C为细胞膜锚部分。
181.根据权利要求180所述的方法，其中，IA为细胞因子。
182.根据权利要求180所述的方法，其中，IA选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。
183.根据权利要求180所述的方法，其中，IA为IL-2。
184.根据权利要求180所述的方法，其中，IA为IL-12。
185.根据权利要求180所述的方法，其中，IA为IL-15。
186.根据权利要求180所述的方法，其中，IA为IL-21。
187.根据权利要求30所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端独立地根据下式：S1-IA1-L1-C1-L2-S2-IA2-L3-C2，式中，S1和S2各自独立地为信号肽，IA1和IA2各自独立地为免疫调节剂，L1至L3各自独立地为接头，C1和C2各自独立地为细胞膜锚部分。
188.根据权利要求187所述的方法，其中，S1与S2相同。
189.根据权利要求187或188所述的方法，其中，C1与C2相同。
190.根据权利要求187至189中任一项所述的方法，其中，L2为可裂解接头。
191.根据权利要求190所述的方法，其中，L2为弗林蛋白酶可裂解接头。
192.根据权利要求187至191中任一项所述的方法，其中，IA1和IA2各自独立地为细胞因子。
193.根据权利要求187至191中任一项所述的方法，其中，IA1和IA2各自独立地选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。
194.根据权利要求187至191中任一项所述的方法，其中，IA1和IA2各自独立地选自IL-2和IL-12，限制条件为IA1和IA2中的一个为IL-2且另一个为IL-12。
195.根据权利要求187至191中任一项所述的方法，其中，IA1和IA2各自独立地选自IL-15和IL-21，限制条件为IA1和IA2中的一个为IL-15且另一个为IL-21。
196.根据权利要求1至126或173至195中任一项所述的方法，其中，经修饰的TIL被基因修饰，以在细胞的表面上表达所述免疫调节组合物。
197.根据权利要求196所述的方法，其中，所述免疫调节组合物包含一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白，所述膜锚定的免疫调节融合蛋白各自包含一种以上免疫调节剂和细胞膜锚部分。
198.根据权利要求197所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-2。
199.根据权利要求197所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-15。
200.根据权利要求197所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-18。
201.根据权利要求197所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-21。
202.根据权利要求197所述的方法，其中，经修饰的TIL包含第一膜锚定的免疫调节融合蛋白和第二膜锚定的免疫调节融合蛋白。
203.根据权利要求202所述的方法，其中，所述第一膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-15，所述第二膜锚定的免疫调节融合蛋白包含IL-21。
204.根据权利要求202或203所述的方法，其中，所述第一膜锚定的免疫调节融合蛋白和所述第二免疫调节融合蛋白的表达由经修饰的TIL中的NFAT启动子控制。
205.根据权利要求197所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端独立地根据下式：S-IA-L-C，式中，S为信号肽，IA为免疫调节剂，L为接头，C为细胞膜锚部分。
206.根据权利要求205所述的方法，其中，IA为细胞因子。
207.根据权利要求205所述的方法，其中，IA选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。
208.根据权利要求205所述的方法，其中，IA为IL-2。
209.根据权利要求205所述的方法，其中，IA为IL-12。
210.根据权利要求205所述的方法，其中，IA为IL-15。
211.根据权利要求205所述的方法，其中，IA为IL-21。
212.根据权利要求205至211中任一项所述的方法，其中，L为CD8a跨膜-胞内结构域、B7-1跨膜结构域、B7-2跨膜结构域或CD8a跨膜结构域。
213.根据权利要求205至211中任一项所述的方法，其中，L为B7-1跨膜结构域。
214.根据权利要求205至211中任一项所述的方法，其中，L具有SEQ ID NO:239的氨基酸序列。
215.根据权利要求197所述的方法，其中，所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白自N末端至C末端独立地根据下式：S1-IA1-L1-C1-L2-S2-IA2-L3-C2，式中，S1和S2各自独立地为信号肽，IA1和IA2各自独立地为免疫调节剂，L1至L3各自独立地为接头，C1和C2各自独立地为细胞膜锚部分。
216.根据权利要求215所述的方法，其中，S1与S2相同。
217.根据权利要求215或216所述的方法，其中，C1与C2相同。
218.根据权利要求215至217中任一项所述的方法，其中，L2为可裂解接头。
219.根据权利要求218所述的方法，其中，L2为弗林蛋白酶可裂解接头。
220.根据权利要求215至219中任一项所述的方法，其中，IA1和IA2各自独立地为细胞因子。
221.根据权利要求215至219中任一项所述的方法，其中，IA1和IA2各自独立地选自：IL-2、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFNγ、TNFa、IFNα、IFNβ、GM-CSF或GCSF或它们的变体。
222.根据权利要求215至219中任一项所述的方法，其中，IA1和IA2各自独立地选自IL-2和IL-12，限制条件为IA1和IA2中的一个为IL-2且另一个为IL-12。
223.根据权利要求215至219中任一项所述的方法，其中，IA1和IA2各自独立地选自IL-15和IL-21，限制条件为IA1和IA2中的一个为IL-15且另一个为IL-21。
224.根据权利要求215至223中任一项所述的方法，其中，C1和C2各自独立地为CD8a跨膜-胞内结构域、B7-1跨膜结构域、B7-2跨膜结构域或CD8a跨膜结构域。
225.根据权利要求215至223中任一项所述的方法，其中，C1和C2各自为B7-1跨膜结构域。
226.根据权利要求215至223中任一项所述的方法，其中，C1和C2各自具有SEQ ID NO:239的氨基酸序列。
227.根据权利要求197至226中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的TIL在NFAT启动子的控制下表达所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白。
228.根据权利要求197至227中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的TIL用逆转录病毒载体转导，以表达所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白。
229.根据权利要求197至227中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的TIL用慢病毒载体转导，以表达所述一种以上膜锚定的免疫调节融合蛋白。
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