CN117538299A - 一种核内荧光蛋白的流式细胞检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核内荧光蛋白的流式细胞检测方法；该方法采用流式细胞分析技术，区别于常规破膜染色方法，采用先固定再破膜的单细胞制备步骤，对组织内荧光细胞核定位的捕捉并检测分析，该检测方法的特点在于进行蛋白核定位的同时降低荧光表达的淬灭概率，维持了细胞的完整性和荧光比例，便于在流式细胞仪中捕捉检测，进而实现组织细胞内核内基因表达与荧光蛋白的共定位。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核内荧光蛋白的流式细胞检测方法。
背景技术
生物发光成像(Bioluminescence)被广泛应用于多种人类疾病研究中，在肿瘤研究中也被越来越多地使用，生物发光技术中通常采用内源性试剂即荧光素酶对细胞或DNA进行标记，内源性试剂通常利用体内的酶介导效应，与底物反应产生可检测的光。
与荧光成像相比，生物发光成像体内检测灵敏度更高，可用于进行定量分析。新兴荧光成像材料的出现，大大提高了成像的灵敏度，不同探测技术的相互结合，拓展了光学技术的应用。使用这些荧光蛋白标志物，我们可以在细胞水平或动物体内研究目的基因表达，蛋白质运输以及各种细胞内动态的生物化学信号通路等，实现生物体内基因行为、细胞活动等生物学过程的可视化，该技术正逐步应用于基础疾病研究，包括细胞定位、谱系示踪及表达谱等研究，新兴的量子点体内荧光成像目前主要在肿瘤的靶向探测和成像方面得以应用。未来，生物发光成像技术除了应用于基础疾病研究和新药研发，还可能会作为新技术扩展到临床诊断及药物治疗领域。
在细胞生物学中，流式细胞术的一种常见用途就是检测样品中存在的细胞类型，由于不同的细胞类型在其表面上表达的蛋白不同，因此可，通过添加抗体特异性标记蛋白，区分细胞之间的不同类型，通过免疫表型分析，研究人员能够监测特异质细胞群中存在的细胞类型的数量和百分比，分析多样化的细胞亚群。流式细胞分析已从最初的间接免疫荧光染色、单色或双色直接荧光染色，迅速发展到多色荧光分析，从而对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。细胞膜免疫表型分析是最重要的流式分析内容之一，很多细胞亚群的检测是以细胞膜的免疫表型特征为依据，然而，仅有细胞膜表面的免疫表型分析是不够的，细胞核内成分的分析则更能反映某些细胞的功能，且核内表达基因，包括Mki67、FOXP3等基因功能研究成为基因靶向治疗的又一热点，随着细胞内成分检测技术的不断完善，细胞内成分检测已成为流式细胞分析的又一指标。荧光标记的抗体无法通过完整的细胞膜进入细胞内，用流式细胞仪测定细胞内抗原，需先利用破膜剂破坏细胞膜的完整性，产生可供抗体通过的小孔。破膜效果的好坏将直接影响荧光染色和结果分析。然而研究发现样本制作过程中的破膜处理对插入荧光蛋白的表达影响较大，甚至破膜处理后荧光近乎完全淬灭，故寻找核内基因与插入荧光蛋白共定位的流式细胞检测方法迫在眉睫。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于荧光细胞核定位的流式检测方法。该方法采用流式细胞分析技术，区别于常规破膜染色方法，采用先固定再破膜的单细胞制备步骤，对组织内荧光细胞核定位的捕捉并检测分析，该检测方法的特点在于进行蛋白核定位的同时降低荧光表达的淬灭概率，维持了细胞的完整性和荧光比例，便于在流式细胞仪中捕捉检测，进而实现组织细胞内核内基因表达与荧光蛋白的共定位。
本发明公开了一种核内荧光蛋白的流式细胞检测方法，通过固定剂对细胞悬液先进行固定，再加入破膜剂对细胞进行破膜处理，对破膜后的细胞悬液进行流式细胞检测。
所述细胞选自白细胞或CD3+T细胞。
所述固定剂选自4％多聚甲醛。
所述破膜剂选自Perm Wash Buffer。
流式细胞检测方法具体为：
先用APC/Cy7 anti-mouse CD45、FITC anti-mouse CD3表面抗体对细胞进行标记，在4℃下，将细胞中加入100ul 4％多聚甲醛固定液对细胞悬液进行固定10-20min；
之后用staining buffer冲洗1次后再用perm wash进行破膜处理，用APC anti-mouse Mki67特异性抗体对Mki67进行标记，从而制备可以进入流式细胞仪检测的单细胞悬液。
与现有技术相比，本发明有如下优势：
本发明提供了一种检测核内表达基因与插入荧光蛋白共定位的检测方法，利用固定剂4％多聚甲醛对细胞悬液先进行固定，再利用破膜剂PermWash Buffer对固定后的细胞进行破膜处理，通过先固定后破膜的处理方法，避免细胞内荧光标记的猝灭；本发明对核内基因表达和荧光蛋白表达的各类细胞分别进行了验证，实现了核内表达基因与插入荧光蛋白共定位，该方法简单便捷，实用性高，降低适用成本并大大提高了检出效率。
利用本申请的方法，可以通过在特定时间空间探究基因功能及细胞互作，从而实现动物模型在肿瘤免疫、生物材料、生物医药等多领域、多维度中的应用研究。
附图说明
图1：本申请实施例一的流程示意图。
图2：本申请实施例一检测结果图。
图3：本申请实施例二检测结果图。
图4：本申请实施例三检测结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例一
为了实现核内表达基因的标记且避免破坏插入荧光蛋白表达细胞的形态及荧光信号，发明人将提取组织研磨后的单细胞样本采用先固定后破膜的方法制备流式细胞分析样本，之后对比固定及固定破膜前后荧光蛋白表达情况。制备方法包括以下步骤：
1)制备单细胞悬液
将采集的抗凝血液通过红细胞裂解液裂红，利用PBS缓冲液冲洗，制备成单细胞血液并分为4组：G1 unstain(不做固定和破膜处理)，G2 Perm组，G3 PFA组，G4 PFA+Perm组；
2)细胞处理
①采用ThermoFisher破膜试剂盒按照其说明书步骤对G2组进行处理；
②在4℃下，加入100ul 4％多聚甲醛(PFA)固定液对G3组细胞悬液进行固定15min，之后用stainingbuffer冲洗2次；
③在4℃下，加入100ul 4％多聚甲醛(PFA)固定液对G4组细胞悬液进行固定15min，之后用stainingbuffer冲洗1次后再用PermWash Buffer进行破膜处理，从而制备可以进入流式细胞仪检测的单细胞悬液；
3)检测
将单细胞悬液放置到流式细胞仪中，通过流式细胞术对四组细胞内tdTomato表达情况进行了检测。流式细胞术检测结果如图2所示，G1组即固定前白细胞中tdTomato荧光比例为34.4％，G2组仅破膜方法检测出白细胞中tdTomato荧光比例下降至9.96％；G3组即固定后白细胞中tdTomato荧光比例为31.11％；G4组先固定后破膜方法检测出白细胞中tdTomato荧光比例为34.7％，与G1组结果基本一致。
由上述内容可知，通过本发明先固定在破膜的方法可以最大程度上保证荧光蛋白不猝灭，从而实现对荧光标记的物质进行更全面的检测。
实施例二
白细胞内核内表达基因Mki67与插入荧光蛋白tdTomato表达共定位
为了实现核内表达基因的标记且避免破坏插入荧光蛋白表达细胞的形态及荧光信号，发明人将提取组织研磨后的单细胞样本采用先固定后破膜的方法制备流式细胞分析样本，之后对核内表达基因(以Mki67为例)进行特异性抗体标记后上机检测。制备方法包括以下步骤：
1)制备单细胞悬液
将采集的抗凝血液通过红细胞裂解液裂红，PBS冲洗，制备成单细胞血液并分为4组：G1 unstain(不做固定和破膜处理)，G2 Perm组，G3 PFA组，G4 PFA+Perm组；
2)固定破膜
①采用ThermoFisher破膜试剂盒按照说明书中步骤对G2组进行处理并用APCanti-mouse Mki67特异性抗体对Mki67进行标记；
②在4℃下，加入100ul 4％多聚甲醛(PFA)固定液对G3组细胞悬液进行固定15min，之后用stainingbuffer冲洗2次；
③在4℃下，加入100ul 4％多聚甲醛(PFA)固定液对G4组细胞悬液进行固定15min，之后用staining buffer冲洗1次后再用perm wash进行破膜处理，用APC anti-mouse Mki67特异性抗体对Mki67进行标记，从而制备可以进入流式细胞仪检测的单细胞悬液；
3)检测
将单细胞悬液放置到流式细胞仪中，根据荧光示踪小鼠设计策略，Mki67与tdTomato共同表达。发明人通过流式细胞术对核内基因Mki67表达及tdTomato表达情况进行了检测。流式细胞术检测结果如图3所示，G1组即固定前白细胞中tdTomato荧光比例为73.7％，G2组仅破膜方法检测出白细胞中Mki67+细胞比例约为68％，而tdTomato荧光蛋白表达的比例下降至1.79％；G3组固定后白细胞中tdTomato比例为41.48％；G4组先固定后破膜方法检测出核内表达基因阳性细胞中荧光蛋白表达的比例约为27.83％，与Mki67+比例26.44％基本一致。
可见，利用本发明先固定再破膜的方法可以实现白细胞内核内表达基因Mki67与插入荧光蛋白tdTomato表达共定位，获得准确的图像分析结果。
实施例三
CD3+T细胞内核内表达基因Mki67与插入荧光蛋白tdTomato表达共定位
为了实现核内表达基因的标记且避免破坏插入荧光蛋白表达细胞的形态及荧光信号，发明人将提取组织研磨后的单细胞样本进行表抗标记后，采用先固定后破膜的方法制备流式细胞分析样本，之后对核内表达基因(以Mki67为例)进行特异性抗体标记后上机检测。制备方法包括以下步骤：
1)制备单细胞悬液
将采集的抗凝血液通过红细胞裂解液裂红，PBS冲洗，制备成单细胞血液并分为4组：G1 untreated组，G2 Perm组，G3 PFA组，G4 PFA+Perm组；
2)固定破膜
①G1组细胞用APC/Cy7 anti-mouse CD45、FITC anti-mouse CD3表面抗体对组织内T细胞进行标记；
②G2组细胞先用APC/Cy7 anti-mouse CD45、FITC anti-mouse CD3表面抗体对组织内T细胞进行标记，采用ThermoFisher破膜试剂盒按照说明书中步骤对G2组进行处理并用APC anti-mouse Mki67特异性抗体对Mki67进行标记；
③G3组细胞先用APC/Cy7 anti-mouse CD45、FITC anti-mouse CD3表面抗体对组织内T细胞进行标记，在4℃下，将细胞中加入100ul 4％多聚甲醛(PFA)固定液对G3组细胞悬液进行固定15min，之后用stainingbuffer冲洗2次；
④G4组细胞先用APC/Cy7 anti-mouse CD45、FITC anti-mouse CD3表面抗体对组织内T细胞进行标记，在4℃下，将细胞中加入100ul 4％多聚甲醛(PFA)固定液对G4组细胞悬液进行固定15min，之后用staining buffer冲洗1次后再用perm wash进行破膜处理，用APC anti-mouse Mki67特异性抗体对Mki67进行标记，从而制备可以进入流式细胞仪检测的单细胞悬液；
3)检测
将单细胞悬液放置到流式细胞仪中，通过流式细胞术对核内基因Mki67表达及tdTomato表达情况进行了检测。流式细胞术检测结果如图4所示，G1组即固定前CD3+T细胞中tdTomato荧光比例为76.59％，G2组仅破膜方法检测出CD3+T细胞中Mki67+细胞比例为80.16％，tdTomato荧光蛋白表达的比例下降至1.29％；G3组固定后CD3+T细胞中tdTomato比例为36.15％；G4组先固定后破膜方法检测出CD3+T细胞内的Mki67阳性细胞中荧光蛋白表达的比例约为16.12％，与Mki67+16.29％比例基本一致。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种核内荧光蛋白的流式细胞检测方法，其特征在于，通过固定剂对细胞悬液先进行固定，再加入破膜剂对细胞进行破膜处理，对破膜后的细胞悬液进行流式细胞检测。
2.根据权利要求1所述的一种核内荧光蛋白的流式细胞检测方法，其特征在于，所述细胞选自白细胞或CD3+T细胞。
3.根据权利要求1所述的一种核内荧光蛋白的流式细胞检测方法，其特征在于，所述固定剂选自4％多聚甲醛。
4.根据权利要求1所述的一种核内荧光蛋白的流式细胞检测方法，其特征在于，所述破膜剂选自PermWashBuffer。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种核内荧光蛋白的流式细胞检测方法，其特征在于，流式细胞检测方法具体为：
先用APC/Cy7 anti-mouse CD45、FITC anti-mouse CD3表面抗体对细胞进行标记，在4℃下，将细胞中加入100ul 4％多聚甲醛固定液对细胞悬液进行固定10-20min；
之后用staining buffer冲洗1次后再用perm wash进行破膜处理，用APC anti-mouseMki67特异性抗体对Mki67进行标记，从而制备可以进入流式细胞仪检测的单细胞悬液。
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|---|---|---|---|---|
| CN101126758A (zh) * | 2007-09-06 | 2008-02-20 | 江苏省肿瘤医院 | 流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法 |
| CN112795539A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-14 | 中山大学 | 一种细胞流式分析干细胞细胞因子的方法 |
-
2023
- 2023-11-07 CN CN202311466174.2A patent/CN117538299A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN101126758A (zh) * | 2007-09-06 | 2008-02-20 | 江苏省肿瘤医院 | 流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法 |
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| Title |
|---|
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| 王敏: "《医学免疫学实验指导》", 31 January 2018, 北京邮电大学出版社, pages: 219 - 220 * |
| 韩夏夏 等: "应用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统研究B细胞中转录因子T-bet的调控作用", 《上海交通大学学报（医学版）》, vol. 42, no. 4, 30 April 2022 (2022-04-30), pages 433 - 442 * |
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