CN117384759B - 一种基于微针阵列的类器官培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及未分化的人类、动物或植物细胞，如细胞系的培养或维持领域，具体的说，涉及一种基于微针阵列的类器官培养方法。本发明的基于微针阵列的类器官培养方法，使用类器官培养装置，包括如下步骤：1）将类器官置于下件中培养；2）将中件安装至下件上方，将细胞添加到中件中，细胞混同培养基通过微针阵列形成的通路，利用重力向位于微针末端的类器官进行转移，并通过微针末端的开孔，扩散到类器官组织中。本发明基于微针阵列，利用拼插式的组合方式，实现细胞组织与类器官的共培养，能够实现体外可控范围、可控组合的细胞与类器官或者不同类器官之间的共培养，为后续的研究多器官联合治疗以及研究人体的发育提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及未分化的人类、动物或植物细胞，如细胞系的培养或维持领域，具体的说，涉及一种基于微针阵列的类器官培养方法。
背景技术
在过去的十年中，科学家利用干细胞的自我更新和产生分化细胞的能力，通过它们能够产生发育胚胎的所有组织并维持成人的组织稳态。这些关键的干细胞特征已被利用在体外开发“微型器官”，即所谓的类器官。类器官是干细胞衍生和自组织的3D培养物，其表型细胞类型组成，结构以及一定程度上不同组织的功能。目前在体内已经开发了了多重类器官模型，比如脑部不同区域类器官（全脑、前脑、小脑等）、肾脏类器官、肠类器官、心脏类器官、肺类器官、皮肤类器官等。类器官在癌症、遗传病等多范围疾病研究、药物筛查等多方面均具备显著的优势。
传统的类器官培养是在6孔板或者10cm板上进行，缺少必要的互相联系。但随着微观3D打印和微工程技术的发展，使类器官芯片的发展成为现实。“器官芯片”是微工程仿生系统，其中包含由活体人类细胞衬里的微流体通道，其再现活器官的关键功能单元，以在体外重建整合的人体器官水平病理生理学。这些微器件可用于测试药物和化学品的功效和毒性，并创建人类疾病的体外模型。因此，它们可能代表用于制药、化学和环境应用的传统动物模型的低成本替代品。但目前来看，实现芯片上的“全身体”却鲜见报道。
类器官培养时，由于中心养料、氧气供应不足导致的类器官中心坏死的问题、及组织细胞缺乏迁徙能力等原因，难以实现多重类器官融合培养，获得成分多样化类器官。传统芯片进行类器官共培养时，需要将类器官从之前的培养基中取出，然后再将不同的类器官与冷的Matrigel胶混合，再放置于类器官共培养芯片中，或将类器官与有迁移能力的细胞紧密贴合，通过组织细胞的自身迁移能力，获得多样化类器官，如血管化或有免疫细胞的类脑器官，整个操作过程繁琐低效。因此需要一种方法可以在类器官水平实现快速、多种类、可靠递送共培养物，获得组织多样化类器官。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能够实现细胞迁移的基于微针阵列的类器官培养方法。
本发明提供的一种基于微针阵列的类器官培养方法，使用类器官培养装置，所述类器官培养装置包括用于培养类器官的下件、用于培养细胞组织的中件；所述下件与中件可拆卸连接，并且所述中件中培养的细胞组织通过微针与下件中的类器官相连通；所述方法包括如下步骤：
1）将类器官置于下件中培养；
2）将中件安装至下件上方，将细胞添加到中件中，细胞混同培养基通过微针通路，利用重力向位于微针末端的类器官进行转移，并通过微针末端的开孔，扩散到类器官中。
进一步，还包括步骤3）使下件的类器官混合细胞后，将上件盖合在中件上方，然后进行培养。
进一步，所述下件包括下件底座和连接在下件底座上方的下件基台，所述基台的上设有上端开口的培养槽，所述培养槽内设有至少一个类器官放置孔；相邻的两个类器官放置孔之间设有组隔板，组隔板与培养槽的底壁相连接，与培养槽的侧壁之间设有孔隙；所述基台上还有下件培养基加液槽，所述下件培养基加液槽位于培养槽的两侧，并与培养槽通过培养基入液口相连通。
进一步，所述类器官放置孔的周围设有定位桩；所述基台的一侧设有定位圆角。
进一步，中件包括中件底座和连接在中件底座上方的中件基台，所述中件基台上与下件的培养槽对应的位置设有中件U形加液槽，所述中件U形加液槽（底面为弧形，便于细胞组织利用重力作用下沉，通过微针阵列连通至类器官，例如类脑组织）中设有至少一个中件细胞培养室，所述中件细胞培养室的下方连接有微针阵列，中件细胞培养室与微针阵列相连通，当中件与下件相连接时，微针阵列的下端插入类器官放置孔上培养的类器官中。
进一步，所述中件底座上设有与下件基台边缘匹配的向上凹陷的凹槽，所述凹槽与下件基台的定位圆角对应的侧设有圆弧内角。
进一步，所述装置包括用于闭合装置的上件，所述上件与中件可拆卸连接。
进一步，所述上件为连接在中件上方的盖体，所述盖体的内表面设有上盖支撑块；所述中件基台的一侧为圆角，所述上件与中件基台的圆角对应的一侧设有圆弧内角。
进一步，所述步骤1）具体为：11）输入基质胶：首先将基质胶用移液器以此注入下件的类器官放置孔中；
12）放置类器官：将类器官小心的放置在注满基质胶的类器官放置孔中；
13）注入培养基：将类器官培养基通过下件加液槽，向类器官放置孔加注培养基。
进一步，所述步骤2）具体为：
21）将中件和下件定位圆角对齐，缓慢下压放置中件到下件中；
22）在中件中培养小胶质细胞：将小胶质细胞的培养基转移至中件U形加液槽内，然后再将小胶质细胞用移液器依次接种到中件的细胞培养室中；
23）小胶质细胞混同培养基通过微针通路，利用重力向位于微针末端的类器官进行转移，并通过微针末端的开孔，扩散到类器官中。
进一步，所述步骤3）中的培养方法为：每天检查中件的剩余液量，如有剩余培养基，用移液器移除，重新添加4ml培养基；每3天通过下件加液槽通路（仅穿过中件），更换20ml培养基。培养条件为：放置在5%CO2培养箱中在37℃进行培养。
本发明基于微加工技术，基于微针阵列，利用拼插式的组合方式，可实现细胞组织与类器官的共培养，能够体外可控范围、可控组合的细胞与类器官或者不同类器官之间的共培养，以重现和研究多个器官或组织对药物、毒素的反应，为后续的研究多器官联合治疗以及研究人体的发育提供了基础。
附图说明
图1为本发明的类器官的培养装置的爆炸图。
图2为本发明的上件的仰视图。
图3为本发明的中间的俯视图。
图4为本发明的中件的仰视图。
图5为本发明的中件的短边剖视图。
图6为本发明的下件的透视图。
图7为本发明的下件的剖面图。
图8为实施例1中的荧光检测结果图。
图9为实施例2中内皮细胞与类脑球共培养的荧光检测结果图（10X）。
图10为实施例2中内皮细胞与类脑球共培养的荧光检测结果图（100X）。
附图标记说明：1.下件，11.下件底座，12.下件基台，13.培养槽，14.类器官放置孔，15.定位桩，16.组隔板，17.下件培养基加液槽，18.培养基入液口，19.定位圆角，2.中件，21.中件底座，22.中件基台，23.中件U形加液槽，24.中件细胞培养室，25.微针阵列，26.通孔，27.凹槽，3.上件，31.盖体，32.上盖支撑块。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如图1-7所示，本发明提供一种类器官培养装置，所述装置包括用于培养类器官的下件1、用于培养细胞组织的中件2以及用于闭合装置的上件3；所述下件1与中件2可拆卸连接，并且所述中件2中培养的细胞组织通过微针阵列25与下件1中的类器官相连通。
所述下件1包括下件底座11和连接在下件底座11上方的下件基台12，所述下件基台12上设有上端开口的培养槽13，所述培养槽13内设有至少一个类器官放置孔14，所述类器官放置孔14的周围设有定位桩15；相邻的两个类器官放置孔14之间设有组隔板16，组隔板16与培养槽13的底壁相连接，与培养槽13的侧壁之间留有孔隙（所述孔隙小于类器官的尺寸，例如类脑器官的直径）；所述基台上还有下件培养基加液槽17，所述下件培养基加液槽17位于培养槽的两侧，并与培养槽通过培养基入液口18相连通。
所述培养基入液口18位于加液槽的底部，所述培养基入液口18的高度略高于培养槽的底部，保证连通以及加液槽中的液体完全流出，避免浪费。
所述下件底座11的一侧设有定位圆角19。
中件2包括中件底座21和连接在中件底座21上方的中件基台22，所述中件基台22上与下件的培养槽13对应的位置设有中件U形加液槽23，所述中件U形加液槽23（底面为弧形，便于细胞组织利用重力作用下沉，通过微针阵列连通至类脑组织等类器官中）中设有至少一个中件细胞培养室24，所述中件细胞培养室24的下方连接有微针阵列25，中件细胞培养室24与微针阵列25相连通；所述中件基台22与下件培养基加液槽17相对应的位置处设置有通孔26，所述中件底座21的底部设有上延伸的凹槽27，当中件2与下件1相连接时，下件基台12插入中件的凹槽27内，此时，通孔26与下件培养基加液槽17相连通，所述中件U形加液槽23位于培养槽13的正上方，所述微针阵列25的下端插入类器官放置孔上培养的类脑等类器官组织中。
所述上件为连接在中件上方的盖体，所述盖体的内设有上盖支撑块，当将上盖盖和在中件上时，所述上盖支撑块与中件基台的上表面相接触，在上盖与中件之间流出可供空气流通的空隙。
本发明还提供一种类器官培养方法，所述方法使用上述类器官培养装置，包括如下步骤：
1、将类器官置于下件中培养；
2、将中件安装至下件上方，将细胞添加到中件中，细胞混同培养基通过微针通路，利用重力向位于微针末端的类器官进行转移，并通过微针末端的开孔，扩散到类器官中；
3、使下件的类器官混合细胞后，将上件盖合在中件上方，然后进行培养。
所述步骤1具体为：11）输入基质胶：首先将6ml冷的Matrigel胶（基质胶）用移液器以此注入下件的类器官放置孔中，每个孔2ml。
12）放置类器官：将类器官小心的放置在注满基质胶的类器官放置孔中；
13）注入培养基：将30ml的类器官培养基通过下件加液槽，缓慢的加注培养基。
所述步骤2具体为：21）将中件和下件定位圆角对齐，缓慢下压放置中件到下件1中。
22）在中件中培养小胶质细胞：将小胶质细胞的培养基4ml转移至中件U形加液槽内，然后再将小胶质细胞用移液器依次接种到中件的3个细胞培养室中。
23）小胶质细胞混同培养基通过微针通路，利用重力向位于微针末端的类器官进行转移，并通过微针末端的开孔，扩散到类器官组织中。
上述装置和方法中，所述类器官可以为类脑器官。
所述步骤3）中的培养方法为：每天检查中件的剩余液量，如有剩余培养基，用移液器移除，重新添加4ml培养基；每3天通过下件加液槽通路（仅穿过中件），更换20ml培养基。培养条件为：放置在5%CO2培养箱中在37℃进行培养；
培养过程中，可按照实验要求，在第7天甚至更久的时间节点进行取样。取样时，拿开上件，移去中件内培养基后，轻轻向上抬起中件，此时类脑器官会附着在中件下端的微针上一同被带出。
实施例1
一、材料的准备
1.类脑器官的制备
将iPSC（人诱导多能干细胞）使用类脑分化试剂盒STEMdiff Cerebral Organoid试剂盒（StemCell Technologies，08570），按照STEMCELL TECHNOLOGIES官网的操作流程进行分化，得到类脑器官。
2.小胶质细胞的制备
使用STEMdiff™ Hematopoietic Kit将iPSC（人诱导多能干细胞）分化为CD34+及CD45+的造血祖细胞。进一步对造血祖细胞使用STEMdiff™ Microglia kit 试剂盒诱导培养得到小胶质细胞。
二、类器官的培养
1、将类脑器官置于下件中培养；具体为：
11）输入基质胶：首先将6ml冷的Matrigel胶用移液器以此注入下件的类器官放置孔中，每个孔2ml。
12）放置类脑器官：将类脑器官小心的放置在注满基质胶的类器官放置孔中；
13）注入培养基：将30ml的类器官培养基通过下件加液槽，缓慢的加注培养基。
所述步骤2具体为：21）将中件和下件定位圆角对齐，缓慢下压放置中件到下件中。
2、将中件安装至下件上方，将小胶质细胞添加到中件中，细胞混同培养基通过微针通路，利用重力向位于微针末端的类脑球进行转移，并通过微针末端的开孔，扩散到类脑组织中；具体为：
21）将中件和下件定位圆角对齐，缓慢下压放置中件到下件中。
22）在中件中培养小胶质细胞：将小胶质细胞的培养基4ml转移至中件U形加液槽内，然后再将小胶质细胞用移液器依次接种到中件的3个细胞培养室中。
23）小胶质细胞混同培养基通过微针通路，利用重力向位于微针末端的类脑球进行转移，并通过微针末端的开孔，扩散到类脑组织中。
3、使下件的类脑球混合细胞后，将上件盖合在中件上方，然后进行培养，培养方法为：每天检查中件的剩余液量，如有剩余培养基，用移液器移除，重新添加4ml培养基；每3天通过下件加液槽通路（仅穿过中件），更换20ml培养基。培养条件为：放置在5%CO2培养箱中在37℃进行培养；
培养过程中，可按照实验要求，在第7天甚至更久的时间节点进行取样。取样时，拿开上件，移去中件内培养基后，轻轻向上抬起中件，此时类脑球会附着在中件下端的微针上一同被带出。
对培养第7天的类脑组织，进行免疫荧光检测，具体方法为：用10ml移液管将类脑球从培养装置中吸出，进行冰冻切片，厚度为8-10μm；然后分别使用IBA1和DAPI进行染色，上机观测。
结果如图8所示。图中绿色物质为NEUN，是类脑中神经元的标记物，代表类脑；图中红色物质为IBA1，是小胶质细胞的标记物，代表小胶质细胞。从图中可以看出沿着上微针将大量的小胶质细胞递送到类脑球内部，两者融合状态好，镜下未见组织和细胞形变及凋亡表现，经过不断融合形成有免疫细胞的类脑器官。
实施例2：内皮细胞与类脑器官共培养
1.内皮细胞的制备：
使用STEMCELL的试剂盒（STEMdiff™ Endothelial Differentiation Kit(08005, 08007)），将iPSC分化成内皮细胞后，方法同上述的小胶质细胞，加入到培养体系中。共培养7天。得到内皮细胞与类脑混合体。
2.将实施例1中的小胶质细胞替换为上述内皮细胞，其他步骤相同，结果如图9和图10所示，从图9可以看到，10倍镜经过微针插入式共培养后，大量的内皮细胞进入到类脑球中，且经过7天的共培养，由于内皮自身迁徙特点，均匀分布在类脑中心和边缘；从图10可以看到，100倍镜下，内皮细胞在局部已经连接在一起，形成了类似初级脉管样结构，构成血管化类脑器官。
图9和图10中，蓝色荧光为DAPI细胞核染色，绿色为CD31+内皮细胞染色。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (9)
1.一种基于微针阵列的类器官培养方法，其特征在于，使用类器官培养装置，所述类器官培养装置包括用于培养类器官的下件、用于培养细胞组织的带有微针的中件；所述下件与中件可拆卸连接，所述中件中培养的细胞组织通过微针与下件中的类器官相连通；所述下件包括下件底座和连接在下件底座上方的下件基台，所述基台的上设有上端开口的培养槽，所述培养槽内设有至少一个类器官放置孔；所述下件基台上还有下件培养基加液槽，所述下件培养基加液槽位于培养槽的两侧，并与培养槽通过培养基入液口相连通；中件包括中件底座和连接在中件底座上方的中件基台，所述中件基台上与下件的培养槽对应的位置设有中件U形加液槽，所述中件U形加液槽中设有至少1个中件细胞培养室，所述中件细胞培养室的下方连接有微针阵列，中件细胞培养室与微针阵列相连通；
所述方法包括如下步骤：
1）将类器官置于下件中培养；
2）将中件安装至下件上方，当中件与下件相连接时，微针阵列的下端插入类器官放置孔上培养的类脑组织中，将细胞添加到中件中，细胞混同培养基通过微针通路，利用重力向位于微针末端的类脑组织进行转移，并通过微针末端的开孔，扩散到类脑组织中。
2.根据权利要求1所述的基于微针阵列的类器官培养方法，其特征在于，相邻的两个类器官放置孔之间设有组隔板，组隔板与培养槽的底壁相连接，与培养槽的侧壁之间设有孔隙。
3.根据权利要求2所述的基于微针阵列的类器官培养方法，其特征在于，所述类器官放置孔的周围设有定位桩；所述基台的一侧设有定位圆角。
4.根据权利要求3所述的基于微针阵列的类器官培养方法，其特征在于，所述中件底座上设有与下件基台边缘匹配的向上凹陷的凹槽，所述凹槽与下件基台的定位圆角对应的侧设有圆弧内角。
5.根据权利要求1所述的基于微针阵列的类器官培养方法，其特征在于，所述装置包括用于闭合装置的上件，所述上件与中件可拆卸连接。
6.根据权利要求5所述的基于微针阵列的类器官培养方法，其特征在于，所述上件为连接在中件上方的盖体，所述盖体的内表面设有上盖支撑块；所述中件基台的一侧为圆角，所述上件与中件基台的圆角对应的一侧设有圆弧内角。
7.根据权利要求1-6任一所述的基于微针阵列的类器官培养方法，其特征在于，所述步骤1）具体为：
11）输入基质胶：首先将基质胶用移液器以此注入下件的类器官放置孔中；
12）放置类器官：将类器官小心的放置在注满基质胶的类器官放置孔中；
13）注入培养基：将类器官培养基通过下件加液槽，向类器官放置孔加注培养基。
8.根据权利要求7所述的基于微针阵列的类器官培养方法，其特征在于，所述步骤2）具体为：
21）将中件和下件定位圆角对齐，缓慢下压放置中件到下件中；
22）在中件中培养小胶质细胞：将小胶质细胞的培养基转移至中件U形加液槽内，然后再将小胶质细胞用移液器依次接种到中件的细胞培养室中；
23）小胶质细胞混同培养基通过微针通路，利用重力向位于微针末端的类器官进行转移，并通过微针末端的开孔，扩散到类器官组织中。
9.根据权利要求1-6任一所述的基于微针阵列的类器官培养方法，其特征在于，所述类器官为类脑器官。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6197575B1 (en) * | 1998-03-18 | 2001-03-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Vascularized perfused microtissue/micro-organ arrays |
| CN111748443A (zh) * | 2019-03-29 | 2020-10-09 | 北京大橡科技有限公司 | 一种3d多层高通量器官芯片及其制备方法和应用 |
| CN116622506A (zh) * | 2023-04-19 | 2023-08-22 | 重庆大学 | 一种脑类器官培养芯片及其制备方法和脑类器官培养方法 |
| CN117004559A (zh) * | 2022-04-29 | 2023-11-07 | 北京干细胞与再生医学研究院 | 一种人多能干细胞来源的脑和心肌复合模型的构建方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090286317A1 (en) * | 2006-09-14 | 2009-11-19 | Probiogen Ag | Modular culture system for maintenance, differentiation and proliferation of cells |
| WO2022010982A1 (en) * | 2020-07-07 | 2022-01-13 | Redbud Labs, Inc. | Microscale bioreactor system for and method of providing cell culture growth conditions in a small-volume vessel |
-
2023
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6197575B1 (en) * | 1998-03-18 | 2001-03-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Vascularized perfused microtissue/micro-organ arrays |
| CN111748443A (zh) * | 2019-03-29 | 2020-10-09 | 北京大橡科技有限公司 | 一种3d多层高通量器官芯片及其制备方法和应用 |
| CN117004559A (zh) * | 2022-04-29 | 2023-11-07 | 北京干细胞与再生医学研究院 | 一种人多能干细胞来源的脑和心肌复合模型的构建方法 |
| CN116622506A (zh) * | 2023-04-19 | 2023-08-22 | 重庆大学 | 一种脑类器官培养芯片及其制备方法和脑类器官培养方法 |
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