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CN117083376A - 用于培养细胞的方法 - Google Patents

用于培养细胞的方法 Download PDF

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CN117083376A
CN117083376A CN202280026887.4A CN202280026887A CN117083376A CN 117083376 A CN117083376 A CN 117083376A CN 202280026887 A CN202280026887 A CN 202280026887A CN 117083376 A CN117083376 A CN 117083376A
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CN
China
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cells
medium
aspects
fold
concentration
Prior art date
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Pending
Application number
CN202280026887.4A
Other languages
English (en)
Inventor
S·K·沃德纳拉
Y·帕特尔
N·P·莱斯提弗
R·L·艾尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd
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Publication date
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Abstract

本公开提供了在包含至少约5mM钾离子的培养基中培养细胞例如多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的方法，其中所述培养基不是高渗的。在一些方面，所述培养基是低渗的。在一些方面，本文所公开的方法增加细胞群中较低分化细胞的数量。在一些方面，所述培养的细胞被工程化以例如包含嵌合抗原受体或工程化的T细胞受体。在一些方面，将所述细胞施用于有需要的受试者。

Description

用于培养细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年2月25日提交的美国临时申请号63/153,905、2021年2月25日提交的63/153,920、2021年3月23日提交的63/165,021、2021年3月23日提交的63/165,042、2021年3月29日提交的63/167,606、2021年3月29日提交的63/167,608、2021年4月28日提交的63/181,224、2021年10月28日提交的63/273,141的优先权和权益；其各自以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法。在一些方面，本文所公开的方法促进培养物中较低分化的细胞和/或未分化的细胞的富集。使用本文所公开的方法培养的细胞可用于各种细胞疗法，包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和TCR T细胞疗法，包括针对新抗原的T细胞疗法。
背景技术
癌症免疫疗法依赖于利用T细胞(感染和患病细胞的免疫系统的主要杀伤细胞)攻击和杀伤肿瘤细胞。然而，免疫疗法存在重要的障碍物：T细胞的杀伤能力可能减弱，这种现象通常被称为T细胞的耗竭或终末分化。免疫检查点阻断、离体扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和T细胞受体工程化(TCR)的T细胞疗法是利用从患者分离的功能活性T细胞并且需要高度功能性T细胞以便有效的治疗。这些T细胞被工程化并离体扩增以识别靶癌细胞上的抗原。T细胞疗法在治愈实体癌方面并不始终有效，部分是因为T细胞随着时间推移会丧失它们增殖或杀伤的能力。
克服T细胞耗竭的一种方式是选择性地施用具有较低分化状态的T细胞。例如，T记忆干细胞(TSCM)与较高分化的T中央记忆(TCM)或T效应记忆(TEM)细胞相比在施用后在患者中持续更长的时间段，并且TSCM比较高分化的细胞对肿瘤大小引起更显著和延长的作用。然而，许多过继细胞疗法(ACT)细胞制剂包含处于各种分化状态的免疫细胞的不明确的混合物，其在根除实体瘤方面是无效的。为了治愈，需要具有增强的自我更新干/效应子特性的T细胞产物。因此，本领域仍然需要从分离的T细胞混合群体中有效富集较低分化和/或初始T细胞的方法。
发明内容
本公开的某些方面涉及离体或体外培养免疫细胞和/或干细胞的方法，所述方法包括将免疫细胞和/或干细胞置于包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中，其中培养基不是高渗的。本公开的某些方面涉及制备免疫细胞群和/或干细胞群的方法，所述方法包括将免疫细胞和/或干细胞置于包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中，其中培养基不是高渗的。
在一些方面，培养基还包含一种或多种细胞因子。在一些方面，一种或多种细胞因子包括白介素-2(IL-2)、白介素-7(IL-7)、白介素-21(IL-21)、白介素-15(IL-15)或它们的任何组合。
本公开的某些方面涉及离体或体外增加未分化或较低分化细胞的数量或百分比的方法，所述方法包括在包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中培养免疫细胞和/或干细胞，其中所述培养基包含IL-2，但不包含IL-7和IL-15。在一些方面，培养后的免疫细胞和/或干细胞与在包含IL-2、IL-7和IL-15的培养基中培养的免疫细胞和/或干细胞相比包含更高数量和/或百分比的未分化或较低分化的免疫细胞和/或干细胞。
本公开的某些方面涉及离体或体外增加未分化或较低分化的免疫细胞和/或干细胞的数量和/或百分比的方法，该方法包括将免疫细胞和/或干细胞置于包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中，其中该培养基包含IL-7和IL-21。
本公开的某些方面涉及离体或体外增加未分化或较低分化的免疫细胞和/或干细胞的数量或百分比的方法，该方法包括将免疫细胞和/或干细胞置于包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中，其中该培养基包含IL-15和IL-21或其中该培养基包含IL-2、IL-7和IL-15。
在一些方面，细胞包含免疫细胞。在一些方面，免疫细胞包含T细胞、TIL、NK细胞、TIL、Treg或它们的任何组合。在一些方面，细胞包含干细胞。在一些方面，细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，细胞表达工程化的T细胞受体(TCR)，其可以是工程化的TCR。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基还包含钠离子(例如NaCl)、钙离子、葡萄糖和/或它们的任何组合。
在一些方面，培养基还包含细胞扩增剂。在一些方面，细胞扩增剂包括GSK3B抑制剂、ACLY抑制剂、PI3K抑制剂、AKT抑制剂或它们的任何组合。在一些方面，PI3K抑制剂选自LY294002、匹替利司(pictilisib)、CAL101、IC87114或它们的任何组合。在一些方面，AKT抑制剂选自MK2206、A443654、AKTi-VIII或它们的任何组合。在一些方面，与起始细胞群相比，培养基能够例如在最终细胞产物中：增加较低分化和/或未分化细胞的数量和/或百分比；提高转导效率；增加干样免疫细胞；增加体内活力；增加细胞潜能；防止细胞耗竭；或它们的任何组合。
在一些方面，钾离子的浓度为至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约45mM至约110mM、约45mM至约100mM、约45mM至约90mM、约45mM至约80mM、约45mM至约70mM、约45mM至约60mM、约45mM至约50mM、约50mM至约110mM、约50mM至约100mM、约50mM至约90mM、约50mM至约80mM、约50mM至约70mM、约60mM至约110mM、约60mM至约100mM、约60mM至约90mM、约60mM至约80mM、约60mM至约70mM、约70mM至约100mM、约70mM至约90mM、约70mM至约80mM、约80mM至约110mM、约80mM至约100mM、约80mM至约90mM、约90mM至约110mM、约90mM至约100mM、或约100mM至约110mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约80mM。
在一些方面，培养基具有低于约280mOsm/L的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基具有在约100mOsm/L至约280mOsm/L之间、约125mOsm/L至约280mOsm/L之间、约150mOsm/L至约280mOsm/L之间、约175mOsm/L至约280mOsm/L之间、约200mOsm/L至约280mOsm/L之间、约210mOsm/L至约280mOsm/L之间、约220mOsm/L至约280mOsm/L之间、约225mOsm/L至约280mOsm/L之间、约230mOsm/L至约280mOsm/L之间、约235mOsm/L至约280mOsm/L之间、约240mOsm/L至约280mOsm/L之间、约245mOsm/L至约280mOsm/L之间、约250mOsm/L至约280mOsm/L之间、约255mOsm/L至约280mOsm/L之间、约260mOsm/L至约280mOsm/L之间、约265mOsm/L至约280mOsm/L之间、约270mOsm/L至约280mOsm/L之间、或约275mOsm/L至约280mOsm/L之间的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基具有约100mOsm/L至约280mOsm/L、约125mOsm/L、约150mOsm/L、约175mOsm/L、约200mOsm/L、约210mOsm/L、约220mOsm/L、约225mOsm/L、约230mOsm/L、约235mOsm/L、约240mOsm/L、约245mOsm/L、约250mOsm/L、约255mOsm/L、约260mOsm/L、约265mOsm/L、约270mOsm/L或约275mOsm/L的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基具有约236mOsm/L的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基具有约250mOsm/L的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基具有约255mOsm/L的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基具有约260mOsm/L的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基具有约280mOsm/L至约285mOsm/L、约280mOsm/L至约290mOsm/L、约280mOsm/L至约295mOsm/L、约280mOsm/L至约300mOsm/L、约280mOsm/L至约305mOsm/L、约280mOsm/L至约310mOsm/L、约280mOsm/L至约315mOsm/L、或约280mOsm/L至小于320mOsm/L的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基具有约285mOsm/L、约290mOsm/L、约295mOsm/L、约300mOsm/L、约305mOsm/L、约310mOsm/L或约315mOsm/L的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基还包含钠离子。在一些方面，钠离子的浓度为从约25mM至约100mM。在一些方面，钠离子的浓度为从约30mM至约40mM、约30mM至约50mM、约30mM至约60mM、约30mM至约70mM、约30mM至约80mM、约40mM至约50mM、约40mM至约60mM、约40mM至约70mM、约40mM至约80mM、约50mM至约55mM、约50mM至约60mM、约50mM至约65mM、约50mM至约70mM、约50mM至约75mM、约50mM至约80mM、约55mM至约60mM、约55mM至约65mM、约55mM至约70mM、约55mM至约75mM、约55mM至约80mM、约60mM至约65mM、约60mM至约70mM、约60mM至约75mM、约60mM至约80mM、约70mM至约75mM、约70mM至约80mM、或约75mM至约80mM。在一些方面，钠离子的浓度为约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、或约80mM。
在一些方面，钠离子的浓度为约55mM。在一些方面，钠离子的浓度为约60mM。在一些方面，钠离子的浓度为约65mM。在一些方面，钠离子的浓度为约70mM。在一些方面，钠离子的浓度为约75mM。在一些方面，钠离子的浓度为约80至约85mM。在一些方面，钠离子的浓度为约80至约90mM。
在一些方面，培养基还包含葡萄糖。在一些方面，葡萄糖的浓度大于约10mM。在一些方面，葡萄糖的浓度为从约10mM至约25mM、约10mM至约20mM、约15mM至约25mM、约15mM至约20mM、约15mM至约19mM、约15mM至约18mM、约15mM至约17mM、约15mM至约16mM、约16mM至约20mM、约16mM至约19mM、约16mM至约18mM、约16mM至约17mM、约17mM至约20mM、约17mM至约19mM、或约17mM至约18mM。在一些方面，葡萄糖的浓度为约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM或约25mM。在一些方面，葡萄糖的浓度为约15.4mM、约15.9mM、约16.3mM、约16.8mM、约17.2mM或约17.7mM。
在一些方面，培养基还包含钙离子。在一些方面，钙离子的浓度大于约0.4mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约0.4mM至约2.5mM、约0.5mM至约2.0mM、约1.0mM至约2.0mM、约1.1mM至约2.0mM、约1.2mM至约2.0mM、约1.3mM至约2.0mM、约1.4mM至约2.0mM、约1.5mM至约2.0mM、约1.6mM至约2.0mM、约1.7mM至约2.0mM、约1.8mM至约2.0mM、约1.2至约1.3mM、约1.2至约1.4mM、约1.2至约1.5mM、约1.2至约1.6mM、约1.2至约1.7mM、约1.2至约1.8mM、约1.3至约1.4mM、约1.3至约1.5mM、约1.3至约1.6mM、约1.3至约1.7mM、约1.3至约1.8mM、约1.4至约1.5mM、约1.4至约1.6mM、约1.4至约1.7mM、约1.4至约1.8mM、约1.5至约1.6mM、约1.5至约1.7mM、约1.5至约1.8mM、约1.6至约1.7mM、约1.6至约1.8mM、或约1.7至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM或约2.0mM。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和(i)约80.5mM钠离子；(ii)约17.7mM葡萄糖；(iii)约1.8mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约254.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和(i)约76mM钠离子；(ii)约17.2mM葡萄糖；(iii)约1.7mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约255.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和(i)约72.2mM钠离子；(ii)约16.8mM葡萄糖；(iii)约1.6mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约257.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和(i)约67.6mM钠离子；(ii)约16.3mM葡萄糖；(iii)约1.5mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约257.5mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和(i)约63.9mM钠离子；(ii)约15.9mM葡萄糖；(iii)约1.4mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约259.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和(i)约59.3mM钠离子；(ii)约15.4mM葡萄糖；(iii)约1.3mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和(i)约55.6mM钠离子；(ii)约15mM葡萄糖；(iii)约1.2mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约262.26mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，在培养后免疫细胞是CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+、或TCF7+或它们的任何组合。
在一些方面，IL-2的浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL。
在一些方面，IL-2的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。在一些方面，IL-2的浓度为约1.0ng/mL。在一些方面，IL-2的浓度为约10ng/mL。
在一些方面，IL-21的浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL。在一些方面，IL-21的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。在一些方面，IL-21的浓度为约1.0ng/mL。在一些方面，IL-21的浓度为约10ng/mL。
在一些方面，IL-7的浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL。在一些方面，IL-7的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。在一些方面，IL-7的浓度为约1.0ng/mL。在一些方面，IL-7的浓度为约10ng/mL。
在一些方面，IL-15的浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL。在一些方面，IL-15的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。在一些方面，IL-15的浓度为约1.0ng/mL。在一些方面，IL-15的浓度为约10ng/mL。
在一些方面，免疫细胞和/或干细胞包含嵌合抗原受体、工程化的T细胞受体或它们的任何组合。
在一些方面，在培养后将免疫细胞和/或干细胞施用于人受试者。
在一些方面，将细胞还用载体转导。在一些方面，载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或TCR模拟物的转基因。在一些方面，CAR靶向CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白(surviving)、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分或它们的任何组合。在一些方面，TCR靶向AFP、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白(surviving)、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分或它们的任何组合。在一些方面，载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)、腺病毒、AAV杂合病毒、杆状病毒或它们的任何组合。本公开的某些方面涉及通过本文所公开的方法制备的细胞群。本公开的某些方面涉及细胞群，所述细胞群包含至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％或至少约70％的为CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+和TCF7+的细胞，其中所述细胞根据本文所公开的方法培养。本公开的某些方面涉及用于本文所公开的方法的细胞培养基。本公开的某些方面涉及细胞培养基，所述细胞培养基包含(i)如本文所公开的免疫细胞或干细胞和(ii)浓度高于40mM的钾离子，其中培养基不是高渗的。
在一些方面，钾离子的浓度为至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM、约60mM、约70mM、或约80mM。在一些方面，培养基还包含一种或多种细胞因子。在一些方面，一种或多种细胞因子是IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任何组合。本公开的某些方面涉及治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所公开的细胞群。在一些方面，疾病或疾患包括肿瘤，所述肿瘤源自包括以下的癌症：乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾脏癌(renal cancer)、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌(kidney cancer)、胰腺癌、甲状腺癌、食管癌、眼癌、胃(stomach)(胃(gastric))癌、胃肠道癌、卵巢癌、癌(carcinoma)、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或它们的组合。
本公开的某些方面涉及一种扩增从人受试者获得的免疫细胞的方法，该方法包括在初始扩增培养基中培养免疫细胞，其中初始扩增培养基是高钾的。在一些方面，该方法包括在初始扩增培养基中培养细胞后，在第二扩增培养基中培养免疫细胞。在一些方面，第二扩增培养基是高钾的。
本公开的某些方面涉及一种扩增从人受试者获得的免疫细胞的方法，该方法包括(a)在初始扩增培养基中和(b)在第二扩增培养基中培养免疫细胞，其中该初始扩增培养基或该第二扩增培养基是高钾的。在一些方面，第二扩增培养基是高钾的，并且其中初始扩增培养基不是高钾的。
在一些方面，该方法还包括在第三(或最终)扩增培养基中培养免疫细胞。在一些方面，第三扩增培养基是高钾的。在一些方面，初始扩增培养基和第二扩增培养基是高钾的，而第三扩增培养基不是高钾的。
在一些方面，初始扩增培养基还包含IL-2、IL-21或两者。在一些方面，初始扩增培养基还包含T细胞补充物、血清替代物、谷氨酰胺、谷氨酰胺替代物(例如Glutamax(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺))、非必需氨基酸、抗生素(例如青霉素、链霉素或两者)、抗真菌剂(例如FUNGINTM)和/或丙酮酸钠。在一些方面，将免疫细胞在初始扩增培养基中培养长达约六天、约七天、约八天、约九天或约10天。
在一些方面，在第二扩增培养基中用CD3激动剂、CD28激动剂或两者刺激免疫细胞。在一些方面，在第二扩增培养基中用CD27配体进一步刺激免疫细胞。在一些方面，在第二扩增培养基中用4-1BB配体进一步刺激免疫细胞。在一些方面，在用CD3激动剂、CD28激动剂和/或CD27配体刺激后，将免疫细胞培养至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天或至少约26天。
在一些方面，在第三扩增培养基中用CD3激动剂、CD28激动剂、CD27配体和/或4-1BB配体刺激免疫细胞。在一些方面，第三扩增培养基不是高钾的。在一些方面，将免疫细胞培养至少约28天、至少约29天、至少约30天、至少约31天、至少约32天、至少约33天、至少约34天、至少约35天、至少约36天、至少约37天、至少约38天、至少约39天、至少约40天、至少约41天、至少约42天或至少约43天。
本公开的一些方面涉及一种增加肿瘤反应性免疫细胞的方法，该方法包括：(a)在初始扩增培养基中培养免疫细胞长达约七天至14天，该初始扩增培养基是高钾的并且任选地包含IL-2和/或IL-21；(b)在添加CD3激动剂、CD28激动剂、CD27配体、4-1BB配体或它们的任何组合后在高钾的第二扩增培养基中培养免疫细胞约20天至约25天，例如约21天至约24天；(c)在添加CD3激动剂、CD28激动剂、CD27配体、4-1BB配体或它们的任何组合后在不是高钾的第三扩增培养基中培养免疫细胞约30天至约50天，例如约34天至约45天。
本公开的一些方面涉及表达一种或多种干样标志物和一种或多种效应子样标志物的免疫细胞。在一些方面，干样标志物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+或它们的任何组合。在一些方面，干样标志物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、TCF7+或它们的任何组合。在一些方面，干样标志物包括CD45RA+、CD45RO低、CD62L+、CCR7+、TCF7+或它们的任何组合。在一些方面，效应子样标志物包括pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+或它们的任何组合。本公开的一些方面涉及包含本文所公开的免疫细胞的工程化细胞群。在一些方面，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的工程化细胞包含免疫细胞。本公开的一些方面涉及包含免疫细胞或工程化细胞群和药学上可接受的载剂的药物组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，该方法包括向受试者施用免疫细胞、工程化细胞群或药物组合物。在一些方面，疾病或疾患是癌症。本公开的一些方面涉及制备免疫细胞的方法，该方法包括在合适的条件下在培养基中培养免疫细胞。
本公开的一些方面涉及人T细胞群，其中T细胞群中至少约5％的T细胞具有干样表型。在一些方面，T细胞群中至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％的T细胞具有干样表型。在一些方面，具有干样表型的T细胞是TCF7+。在一些方面，具有干样表型的T细胞是CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+和TCF7+。在一些方面，具有干样表型的T细胞是CD39-和CD69-。在一些方面，T细胞是CD8+T细胞。
本公开的一些方面涉及包含本文所公开的人T细胞群和药学上可接受的载剂的药物组合物。本公开的一些方面涉及杀伤靶细胞的方法，该方法包括在允许T细胞杀伤靶细胞的条件下使靶细胞与本文所公开的人T细胞群或本文所公开的药物组合物接触。本公开的一些方面涉及治疗有需要的患者的方法，该方法包括向患者施用本文所公开的人T细胞群或本文所公开的药物组合物。本公开的一些方面涉及诱导患者中的抗肿瘤免疫应答的方法，该方法包括向患者施用本文所公开的人T细胞群或本文所公开的药物组合物。本公开的一些方面涉及本文所公开的人T细胞群或本文所公开的药物组合物在制造用于在本文所公开的方法中治疗有需要的患者的药物中的用途。
在一些方面，在施用后，患者中肿瘤的大小(肿瘤大小)与参考肿瘤大小相比减小。在一些方面，参考肿瘤大小包括：(i)施用前的肿瘤大小，(ii)未接受施用的对应受试者中的肿瘤大小，或(iii)(i)和(ii)两者。在一些方面，与参考肿瘤大小相比，肿瘤大小减小至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。
在一些方面，在施用后，受试者的存活持续时间与参考存活持续时间相比增加。在一些方面，参考存活持续时间包括未接受施用的对应受试者的存活持续时间。在一些方面，与参考存活持续时间相比，存活持续时间为至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍、或至少约1,000倍或更多。
在一些方面，与在对照培养基中培养的免疫细胞相比，在培养后免疫细胞表达增加的IL-2。在一些方面，与在对照培养基中培养的免疫细胞相比，免疫细胞表达至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍IL-2。在一些方面，免疫细胞表达至少约20pg/ml、至少约25pg/ml、至少约50pg/ml、至少约75pg/ml、至少约100pg/ml、至少约150pg/ml、至少约200pg/ml、至少约250pg/ml、至少约300pg/ml、至少约350pg/ml、至少约400pg/ml、至少约450pg/ml、至少约500pg/ml、至少约600pg/ml、至少约700pg/ml、至少约800pg/ml、至少约900pg/ml、至少约1000pg/ml、至少约1250pg/ml、至少约1500pg/ml、至少约1750pg/ml、至少约2000pg/ml、至少约2500pg/ml、至少约3000pg/ml、至少约3500pg/ml、至少约4000pg/ml、至少约4500pg/ml、或至少约5000pg/ml IL-2。在一些方面，免疫细胞在单次刺激后表达增加的IL-2。在一些方面，免疫细胞在至少两次连续刺激、和至少三次连续刺激、和至少四次连续刺激、或至少五次连续刺激后表达增加的IL-2。
在一些方面，免疫细胞还表达c-Jun。
在一些方面，与在对照培养基中培养的免疫细胞相比，免疫细胞表现出增加的细胞毒性活性。在一些方面，与在对照培养基中培养的免疫细胞相比，免疫细胞的细胞毒性增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍IL-2。
在一些方面，与在对照培养基中培养的免疫细胞相比，免疫细胞表现出增加的持久性。在一些方面，免疫细胞在与靶细胞重复接触至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约12天或至少约14天后表现出细胞毒性活性。
方面
方面1.一种离体或体外培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括将TIL的异质群体置于包含浓度为约30mM至约100mM的钾离子的代谢重编程培养基(“MRM”)中。
方面2.如方面1所述的方法，其中所述TIL的异质群体在被置于所述MRM中之后富集了CD8+TIL。
方面3.一种离体或体外增加CD8+TIL的数量或百分比的方法，所述方法包括在包含浓度为约30mM至约100mM的钾离子的MRM中培养TIL的异质群体。
方面4.一种制备TIL的CD8+-富集群体的方法，所述方法包括在包含浓度为约30mM至约100mM的钾离子的MRM中离体或体外培养TIL的异质群体。
方面5.如方面1至4中任一项所述的方法，其中所述TIL的异质群体包含CD4+TIL和CD8+TIL。
方面6.如方面1至5中任一项所述的方法，其中所述TIL的异质群体从获自受试者的一个或多个肿瘤样品获得。
方面7.如方面6所述的方法，其中所述肿瘤样品经受初始TIL培养。
方面8.如方面7所述的方法，其中所述初始TIL培养包括在所述MRM中培养所述肿瘤样品。
方面9.如方面8所述的方法，其中在所述初始TIL培养期间所述MRM还包含IL-2。
方面10.如方面9所述的方法，其中在所述初始TIL培养期间所述MRM还包含IL-7、IL-15、IL-21或它们的任何组合。
方面11.如方面8至10中任一项所述的方法，其中在所述初始TIL培养期间所述MRM包含IL-2和IL-21。
方面12.如方面7至11中任一项所述的方法，其中所述初始TL培养持续至少约14-19天。
方面13.如方面7至12中任一项所述的方法，其中所述初始TIL培养持续至少约14天。
方面14.如方面7至13中任一项所述的方法，其中与所述初始TIL培养前的CD8+TIL与非CD8+TIL的比例相比，所述初始TIL培养后的CD8+TIL与非CD8+TIL的比例增加。
方面15.如方面7至14中任一项所述的方法，其中在所述初始TIL培养后刺激所述TIL。
方面16.如方面15所述的方法，其中通过用CD3激动剂和/或CD28激动剂培养所述TIL来刺激所述TIL。
方面17.如方面6至16中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品包括肿瘤活检。
方面18.如方面6至17中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品在培养前被破碎。
方面19.如方面1至18中任一项所述的方法，其中在培养所述TIL的异质群体后，所述群体中至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的所述TIL是CD8+TIL。
方面20.如方面1至19中任一项所述的方法，其中在培养所述TIL的异质群体后，所述群体中至少约50％的所述TIL是CD8+TIL。
方面21.如方面1至20中任一项所述的方法，其中所述MRM还包含钠离子、钙离子、葡萄糖及它们的任何组合。
方面22.如方面1至21中任一项所述的方法，其中所述MRM还包含细胞扩增剂。
方面23.如方面22所述的方法，其中所述细胞扩增剂包括GSK3B抑制剂、ACLY抑制剂、PI3K抑制剂、AKT抑制剂或它们的任何组合。
方面24.如方面23所述的方法，其中所述PI3K抑制剂包括LY294002、匹替利司、CAL101、IC87114或它们的任何组合。
方面25.如方面24所述的方法，其中所述AKT抑制剂包括MK2206、A443654、AKTi-VIII或它们的任何组合。
方面26.如方面3至25中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM、至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、至少约75mM、至少约80mM、至少约85mM、至少约90mM、至少约95mM、或至少约100mM。
方面27.如方面3至26中任一项所述的方法、其中所述钾离子的浓度为约30mM至约100mM、约30mM至约90mM、约30mM至约80mM、约30mM至约70mM、约30mM至约60mM、约30mM至约50mM、约40mM至约100mM、约40mM至约90mM、约40mM至约80mM、约40mM至约70mM、约40mM至约60mM、或约40mM至约50mM。
方面28.如方面1至27中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约40mM至约90mM。
方面29.如方面1至28中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约50mM至约90mM。
方面30.如方面1至29中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约50mM至约80mM。
方面31.如方面1至30中任一项所述的方法，其中所述MRM还包含钠离子。
方面32.如方面31所述的方法，其中所述钠离子的浓度为从约25mM至约100mM。
方面33.如方面31或32所述的方法，其中所述钠离子的浓度为从约30mM至约40mM、约30mM至约50mM、约30mM至约60mM、约30mM至约70mM、约30mM至约80mM、约40mM至约50mM、约40mM至约60mM、约40mM至约70mM、约40mM至约80mM、约50mM至约55mM、约50mM至约60mM、约50mM至约65mM、约50mM至约70mM、约50mM至约75mM、约50mM至约80mM、约55mM至约60mM、约55mM至约65mM、约55mM至约70mM、约55mM至约75mM、约55mM至约80mM、约60mM至约65mM、约60mM至约70mM、约60mM至约75mM、约60mM至约80mM、约70mM至约75mM、约70mM至约80mM、或约75mM至约80mM。
方面34.如方面31至33中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、或约80mM。
方面35.如方面31至34中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约55mM。
方面36.如方面31至35中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约60mM。
方面37.如方面31至36中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约65mM。
方面38.如方面1至37中任一项所述的方法，其中所述MRM还包含葡萄糖。
方面39.如方面38所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度大于约10mM。
方面40.如方面38或39所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度为从约10mM至约25mM、约10mM至约20mM、约15mM至约25mM、约15mM至约20mM、约15mM至约19mM、约15mM至约18mM、约15mM至约17mM、约15mM至约16mM、约16mM至约20mM、约16mM至约19mM、约16mM至约18mM、约16mM至约17mM、约17mM至约20mM、约17mM至约19mM、或约17mM至约18mM。
方面41.如方面38至40中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度为约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM或约25mM。
方面42.如方面1至41中任一项所述的方法，其中所述MRM还包含钙离子。
方面43.如方面42所述的方法，其中所述钙离子的浓度大于约0.4mM。
方面44.如方面42或43所述的方法，其中所述钙离子的浓度为从约0.4mM至约2.5mM、约0.5mM至约2.0mM、约1.0mM至约2.0mM、约1.1mM至约2.0mM、约1.2mM至约2.0mM、约1.3mM至约2.0mM、约1.4mM至约2.0mM、约1.5mM至约2.0mM、约1.6mM至约2.0mM、约1.7mM至约2.0mM、约1.8mM至约2.0mM、约1.2至约1.3mM、约1.2至约1.4mM、约1.2至约1.5mM、约1.2至约1.6mM、约1.2至约1.7mM、约1.2至约1.8mM、约1.3至约1.4mM、约1.3至约1.5mM、约1.3至约1.6mM、约1.3至约1.7mM、约1.3至约1.8mM、约1.4至约1.5mM、约1.4至约1.6mM、约1.4至约1.7mM、约1.4至约1.8mM、约1.5至约1.6mM、约1.5至约1.7mM、约1.5至约1.8mM、约1.6至约1.7mM、约1.6至约1.8mM、或约1.7至约1.8mM。
方面45.如方面42至44中任一项所述的方法，其中所述钙离子的浓度为约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、或约2.0mM。
方面46.如方面1至45中任一项所述的方法，其中所述MRM包含约40mM至约90mM钾离子和(i)约40mM至约80mM钠离子；(ii)约10mM至约24mM葡萄糖；(iii)约0.5mM至约2.8mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
方面47.一种扩增从人受试者获得的TIL的方法，所述方法包括：(a)在初始TIL培养基中培养所述TIL；(b)在第二TIL培养基中培养所述TIL；(c)在第三(或最终)TIL培养基中培养所述TIL，其中所述初始TIL培养基、所述第二TIL扩增培养基和/或所述第三TIL扩增培养基是MRM。
方面48.如方面47所述的方法，其中所述初始TIL培养基和所述第二TIL扩增培养基是高钾的，并且所述第三TIL扩增培养基不是高钾的。
方面49.如方面47或48所述的方法，其中所述初始TIL培养基还包含IL-2。
方面50.如方面49所述的方法，其中所述初始TIL培养基还包含IL-21。
方面51.如方面47至50中任一项所述的方法，其中所述初始TIL培养基还包含T细胞补充物、血清替代物、谷氨酰胺、谷氨酰胺替代物(例如Glutamax(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺))、非必需氨基酸、抗生素(例如青霉素、链霉素或两者)、抗真菌剂(例如FUNGINTM)和/或丙酮酸钠。
方面52.如方面47至51中任一项所述的方法，其中在所述初始TIL培养基中培养所述TIL至少约1周、至少约2周或至少约3周。
方面53.如方面47至52中任一项所述的方法，其中在所述初始TIL培养基中培养所述TIL，直至初始培养物中的细胞产量达到1x105、至少约2x105、至少约3x105、至少约4x105、至少约5x105、至少约6x105、至少约7x105、至少约8x105、至少约9x105、至少约1x106、至少约2x106、至少约3x106、至少约4x106、至少约5x106、至少约6x106、至少约7x106、至少约8x106、至少约9x106、或至少约10x106个细胞/碎片。
方面54.如方面47至53中任一项所述的方法，其中在(b)中的所述第二TIL培养基中或之前用CD3激动剂、CD28激动剂或两者刺激所述TIL。
方面55.如方面47至54中任一项所述的方法，其中在所述第二TIL培养基中或之前用CD27激动剂进一步刺激所述TIL。
方面56.如方面47至55中任一项所述的方法，其中在所述第二TIL培养基中或之前用4-1BB激动剂进一步刺激所述TIL。
方面57.如方面53至56中任一项所述的方法，其中在刺激后将所述TIL培养至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、或至少约26天。
方面58.如方面47至57中任一项所述的方法，其中在所述第二培养基中培养所述TIL，直至细胞产量达到至少约1x107、至少约2x107、至少约3x107、至少约4x107、至少约5x107、至少约6x107、至少约7x107、至少约8x107、至少约9x107、至少约10x107、至少约11x107、至少约12x107、至少约13x107、至少约14x107、至少约15x107、至少约16x107、至少约17x107、至少约18x107、至少约19x107、或至少约20x107个细胞。
方面59.如方面47至58中任一项所述的方法，其中在所述第三TIL培养基中用CD3激动剂、CD28激动剂、CD27激动剂和/或4-1BB激动剂刺激所述TIL。
方面60.如方面59所述的方法，其中所述第三TIL培养基不是高钾的。
方面61.如方面59或60所述的方法，其中将所述TIL在所述第三TIL培养基中培养至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、或至少约21天。
方面62.一种增加肿瘤反应性TIL的方法，所述方法包括：(a)在初始TIL培养基中培养一种或多种肿瘤碎片长达约14天至19天，由此从所述肿瘤碎片获得TIL，所述初始TIL培养基是高钾的并且包含IL-2和任选地IL-21；(b)在添加(i)CD3激动剂和(ii)CD28激动剂、CD27激动剂、4-1BB激动剂或它们的任何组合后，在高钾的第二TIL培养基中培养所述TIL约7天至至少约14天；(c)在添加(i)CD3激动剂和(ii)CD28激动剂、CD27激动剂、4-1BB激动剂或它们的任何组合后，在不是高钾的第三TIL培养基中培养所述TIL约14天至至少约21天。
方面63.如方面1至62中任一项所述的方法，其中相对于在不是高钾的对照培养基中培养后的TIL群体中的TCF7表达，所述TIL在所述MRM中培养后表现出TCF7的表达增加。
方面64.如方面1至63中任一项所述的方法，其中相对于在不是高钾的对照培养基中培养后CD8+CD62L+TIL的比例，所述TIL群体在所述MRM中培养后包含增加比例的CD8+CD62L+TIL。
方面65.如方面1至64中任一项所述的方法，其中相对于在不是高钾的对照培养基中培养后CD8+PD1+TIL的比例，所述TIL群体在所述MRM中培养后包含增加比例的CD8+PD1+TIL。
方面66.一种免疫细胞的组合物，所述组合物包含根据如方面1至65中任一项所述的方法培养的一种或多种CD8+TIL。
方面67.如方面66所述的组合物，其中至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的所述免疫细胞是CD8+TIL。
方面68.一种组合物，所述组合物包含免疫细胞群，其中至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的所述免疫细胞是CD8+TIL。
方面69.如方面66至68中任一项所述的组合物，其中至少约50％的所述细胞是CD8+TIL。
方面70.如方面66至69中任一项所述的组合物，其中相对于在不是高钾的对照培养基中培养后的免疫细胞群中的TCF7表达，所述细胞在所述MRM中培养后表现出TCF7的表达增加。
方面71.如方面66至70中任一项所述的组合物，其中至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的所述免疫细胞是CD8+/CD62L+TIL。
方面72.如方面66至71中任一项所述的组合物，其中在所述初始TIL培养结束时获得的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是PD1+。
方面73.如方面66至72中任一项所述的组合物，其中在所述初始TIL培养结束时获得的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD39+。
方面74.如方面66至73中任一项所述的组合物，其中至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的所述CD8+TIL是CD27+。
方面75.如方面66至74中任一项所述的组合物，其中至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的所述CD8+TIL是CD28+。
方面76.如方面66至75中任一项所述的组合物，其中在所述初始TIL培养结束时获得的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是PD1+CD39+。
方面77.如方面66至76中任一项所述的组合物，其中在所述初始TIL培养结束时获得的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是PD1+CD27+。
方面78.如方面66至77中任一项所述的组合物，其中至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的所述CD8+TIL是CD27+CD62L+。
方面79.如方面66至78中任一项所述的组合物，其中在所述初始TIL培养结束时获得的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+CD103+PD1+TCF7+。
方面80.如方面66至79中任一项所述的组合物，所述组合物包含至少约2x106、至少约3x106、至少约4x106、至少约5x106、至少约6x106、至少约7x106、至少约8x106、至少约9x106、或至少约1x107个细胞。
方面81.如方面66至80中任一项所述的组合物，所述组合物包含至少约1x106、至少约3x106、至少约4x106、至少约5x106、至少约6x106、至少约7x106、至少约8x106、至少约9x106、或至少约1x107个CD8+细胞。
方面82.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用TIL群体，其中所述TIL群体根据如方面1至65中任一项所述的方法培养。
方面83.如方面82所述的方法，其中所述TIL群体富含CD8+TIL。
方面84.如方面82或83所述的方法，其中所述TIL群体中至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的所述TIL是CD8+TIL。
方面85.如方面82至84中任一项所述的方法，其中所述TIL群体中至少约50％的所述TIL是CD8+TIL。
方面86.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如方面66至71中任一项所述的组合物。
方面87.如方面82至86中任一项所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。
方面88.如方面82至87中任一项所述的方法，其中所述癌症包括源自黑素瘤、结肠癌、肺癌、宫颈癌、胃肠道癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、头颈部小细胞癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、胰腺腺癌、头颈部鳞状细胞癌、睾丸生殖细胞瘤、胃腺癌、皮肤黑素瘤、间皮瘤、肾透明细胞癌、宫颈鳞状细胞癌和子宫颈内腺癌、食管癌、膀胱尿路上皮癌、侵袭性乳腺癌、肾乳头状细胞癌、结肠腺癌及它们的任何组合的实体瘤。
方面89.如方面82至88中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少约2x109、至少约3x109、至少约4x109、至少约5x109、至少约6x109、至少约7x109、至少约8x109、至少约9x109、或至少约1x1010、或至少约10x1010、或至少约15x1010、或至少约20x1010、或至少约25x1010、或至少约30x1010个细胞。
方面90.如方面82至89中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少约1x109、至少约3x109、至少约4x109、至少约5x109、至少约6x109、至少约7x109、至少约8x109、至少约9x109、或至少约1x109个CD8+细胞。
方面91.如方面82至90中任一项所述的方法，所述方法还包括施用检查点抑制剂。
方面92.如方面91所述的方法，其中在施用所述细胞群之后向所述受试者施用所述检查点抑制剂。
方面93.如方面91或92所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括CTLA-4拮抗剂、PD1拮抗剂、TIM-3拮抗剂、或它们的组合。
方面94.如方面91至93中任一项所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括抗CTLA-4抗体、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM-3抗体、或它们的组合。
方面95.如方面92至94中任一项所述的方法，所述方法还包括施用检查点激活剂。
方面96.如方面90至95中任一项所述的方法，其中在施用所述TIL群体之后向所述受试者施用所述检查点抑制剂。
方面97.如方面95或96所述的方法，其中所述检查点激活剂包括OX40激动剂、LAG-3激动剂、4-1BB(CD137)激动剂、GITR激动剂、TIM3激动剂、或它们的组合。
方面98.如方面95或96所述的方法，其中所述检查点激活剂包括抗OX40抗体、抗LAG-3抗体、抗CD137抗体、抗GITR抗体、抗TIM3抗体、或它们的组合。
方面99.如方面92至98中任一项所述的方法，所述方法还包括施用细胞因子。
方面100.如方面99所述的方法，其中在施用所述TIL群体之后向所述受试者施用所述细胞因子。
方面101.如方面99或100所述的方法，其中所述细胞因子是IL-2。
方面102.如方面99至101中任一项所述的方法，所述方法还包括在施用所述细胞群之前向所述受试者施用淋巴耗竭疗法。
方面103.如方面102所述的方法，其中所述淋巴耗竭疗法包括环磷酰胺、氟达拉滨、或环磷酰胺和氟达拉滨两者。
方面B1.一种在离体或体外培养期间增加人免疫细胞和/或干细胞的产量同时增加人免疫细胞和/或干细胞的干性的方法，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在30mM和100mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞和/或干细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
方面B2.一种制备用于免疫疗法的人免疫细胞和/或干细胞群的方法，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在30mM和100mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞和/或干细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
方面B3.一种在针对免疫疗法离体或体外培养期间增加人免疫细胞的干性的方法，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在30mM和100mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
方面B4.如方面B1至3中任一项所述的方法，其中所述钾离子和NaCl的总浓度在120mM和140mM之间。
方面B5.如方面B1至4中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度选自由以下组成的组：约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM和约80mM。
方面B6.如方面B1至8中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度在50mM和60mM之间。
方面B7.如方面B1至6中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约50mM。
方面B8.如方面B1至7中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约50mM，并且所述NaCl的浓度小于90mM。
方面B9.如方面B1至6中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约55mM。
方面B10.如方面B1至6和9中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约55mM，并且所述NaCl的浓度小于85mM。
方面B11.如方面B1至6中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约60mM。
方面B12.如方面B1至6和11中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约60mM，并且所述NaCl的浓度小于80mM。
方面B13.如方面B1至5中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度在60mM和70mM之间。
方面B14.如方面B13所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约65mM。
方面B15.如方面B13或14所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约65mM，并且所述NaCl的浓度小于75mM。
方面B16.如方面B13所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约70mM。
方面B17.如方面B13或16所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约70mM，并且所述NaCl的浓度小于70mM。
方面B18.如方面B13所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约75mM。
方面B19.如方面B13或18所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约75mM，并且所述NaCl的浓度小于65mM。
方面B20.如方面B1至19中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含一种或多种细胞因子。
方面B21.如方面B20所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子包括白介素-2(IL-2)、白介素-7(IL-2)、白介素-21(IL-21)、白介素-15(IL-15)或它们的任何组合。
方面B22.如方面B20所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子包括IL-2、IL-7和IL-15。
方面B23.如方面B1至22中任一项所述的方法，其中所述细胞包括人免疫细胞。
方面B24.如方面B23所述的方法，其中所述人免疫细胞包括T细胞、TIL、NK细胞、TIL、Treg或它们的任何组合。
方面B25.如方面B1至22中任一项所述的方法，其中所述细胞包括人干细胞。
方面B26.如方面B1至25中任一项所述的方法，其中所述细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。
方面B27.如方面B1至25中任一项所述的方法，其中所述细胞表达工程化的T细胞受体(TCR)。
方面B28.如方面B1至27中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含钙离子、葡萄糖或它们的任何组合。
方面B29.如方面B1至28中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含细胞扩增剂。
方面B30.如方面B29所述的方法，其中所述细胞扩增剂包括GSK3B抑制剂、ACLY抑制剂、PI3K抑制剂、AKT抑制剂或它们的任何组合。
方面B31.如方面B27所述的方法，其中所述PI3K抑制剂选自LY294002、匹替利司、CAL101、IC87114及它们的任何组合。
方面B32.如方面B30所述的方法，其中所述AKT抑制剂选自MK2206、A443654、AKTi-VIII及它们的任何组合。
方面B33.如方面B1至32中任一项所述的方法，其中与起始细胞群相比，所述培养基能够在最终细胞产物中：a.增加较低分化和/或未分化细胞的数量和/或百分比；b.提高转导效率；c.增加干样免疫细胞；d.增加体内活力；e.增加细胞潜能；f.防止细胞耗竭；或g.它们的任何组合。
方面B34.如方面B1至33中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含葡萄糖。
方面B35.如方面B34所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度大于约10mM。
方面B36.如方面B34或35所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度为从约10mM至约25mM、约10mM至约20mM、约15mM至约25mM、约15mM至约20mM、约15mM至约19mM、约15mM至约18mM、约15mM至约17mM、约15mM至约16mM、约16mM至约20mM、约16mM至约19mM、约16mM至约18mM、约16mM至约17mM、约17mM至约20mM、约17mM至约19mM、或约17mM至约18mM。
方面B37.如方面B34至36中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度为约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、或约25mM。
方面B38.如方面B34至37中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度为约15.4mM、约15.9mM、约16.3mM、约16.8mM、约17.2mM、或约17.7mM。
方面B39.如方面B1至38中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含钙离子。
方面B40.如方面B39所述的方法，其中所述钙离子的浓度大于约0.4mM。
方面B41.如方面B39或40所述的方法，其中所述钙离子的浓度为从约0.4mM至约2.5mM、约0.5mM至约2.0mM、约1.0mM至约2.0mM、约1.1mM至约2.0mM、约1.2mM至约2.0mM、约1.3mM至约2.0mM、约1.4mM至约2.0mM、约1.5mM至约2.0mM、约1.6mM至约2.0mM、约1.7mM至约2.0mM、约1.8mM至约2.0mM、约1.2至约1.3mM、约1.2至约1.4mM、约1.2至约1.5mM、约1.2至约1.6mM、约1.2至约1.7mM、约1.2至约1.8mM、约1.3至约1.4mM、约1.3至约1.5mM、约1.3至约1.6mM、约1.3至约1.7mM、约1.3至约1.8mM、约1.4至约1.5mM、约1.4至约1.6mM、约1.4至约1.7mM、约1.4至约1.8mM、约1.5至约1.6mM、约1.5至约1.7mM、约1.5至约1.8mM、约1.6至约1.7mM、约1.6至约1.8mM、或约1.7至约1.8mM。
方面B42.如方面B39至41中任一项所述的方法，其中所述钙离子的浓度为约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、或约2.0mM。
方面B43.如方面B1至42中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约50mM钾离子和(i)约80.5mM NaCl；(ii)约17.7mM葡萄糖；(iii)约1.8mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
方面B44.如方面B1至42中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约55mM钾离子和(i)约76mM NaCl；(ii)约17.2mM葡萄糖；(iii)约1.7mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
方面B45.如方面B1至42中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约60mM钾离子和(i)约72.2mM NaCl；(ii)约16.8mM葡萄糖；(iii)约1.6mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
方面B46.如方面B1至42中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约65mM钾离子和(i)约67.6mM NaCl；(ii)约16.3mM葡萄糖；(iii)约1.5mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
方面B47.如方面B1至42中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约70mM钾离子和(i)约63.9mM NaCl；(ii)约15.9mM葡萄糖；(iii)约1.4mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
方面B48.如方面B1至42中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约75mM钾离子和(i)约59.3mM NaCl；(ii)约15.4mM葡萄糖；(iii)约1.3mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
方面B49.如方面B1至42中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约80mM钾离子和(i)约55.6mM NaCl；(ii)约15mM葡萄糖；(iii)约1.2mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
方面B50.如方面B1至49中任一项所述的方法，其中在培养后所述免疫细胞是CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+CD27+、CD28+、或TCF7+或它们的任何组合。
方面B51.如方面B1至50中任一项所述的方法，其中所述培养基包含浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL的IL-2。
方面B52.如方面B51所述的方法，其中所述IL-2的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。
方面B53.如方面B51或52所述的方法，其中所述IL-2的浓度为约1.0ng/mL。
方面B54.如方面B51或52所述的方法，其中所述IL-2的浓度为约10ng/mL。
方面B55.如方面B1至54中任一项所述的方法，其中所述培养基包含浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL的IL-21。
方面B56.如方面B55所述的方法，其中所述IL-21的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。
方面B57.如方面B55或56所述的方法，其中所述IL-21的浓度为约1.0ng/mL。
方面B58.如方面B55或56所述的方法，其中所述IL-21的浓度为约10ng/mL。
方面B59.如方面B1至58中任一项所述的方法，其中所述培养基包含浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL的IL-7。
方面B60.如方面B56所述的方法，其中所述IL-7的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。
方面B61.如方面B59或60所述的方法，其中所述IL-7的浓度为约1.0ng/mL。
方面B62.如方面B59或60所述的方法，其中所述IL-7的浓度为约10ng/mL。
方面B63.如方面B1至62中任一项所述的方法，其中所述培养基包含浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL的IL-15。
方面B64.如方面B63所述的方法，其中所述IL-15的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。
方面B65.如方面B63或64所述的方法，其中所述IL-15的浓度为约1.0ng/mL。
方面B66.如方面B63或64所述的方法，其中所述IL-15的浓度为约10ng/mL。
方面B67.如方面B1至66中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞和/或干细胞包含嵌合抗原受体(CAR)、工程化的T细胞受体或它们的任何组合。
方面B68.如方面B1至67中任一项所述的方法，其中在培养后将所述免疫细胞和/或干细胞施用于人受试者。
方面B69.如方面B1至68中任一项所述的方法，其中将所述细胞还用载体转导。
方面B70.如方面B69所述的方法，其中所述载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或TCR模拟物的转基因。
方面B71.如方面B26和67至70中任一项所述的方法，其中所述CAR靶向CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPVE6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白(surviving)、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分或它们的任何组合。
方面B72.如方面B27和67至70中任一项所述的方法，其中所述TCR靶向AFP、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPVE6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白(surviving)、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分或它们的任何组合。
方面B73.如方面B69至72中任一项所述的方法，其中所述载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)、腺病毒、AAV杂合病毒、杆状病毒或它们的任何组合。
方面B74.如方面B1至73中任一项所述的方法，其中所述钾离子包括氯化钾。
方面B75.一种细胞群，所述细胞群通过如方面B1至74中任一项所述的方法制备。
方面B76.一种细胞群，所述细胞群包含至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％或至少约70％的为CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+和TCF7+的细胞，其中所述细胞根据如方面B1至74中任一项所述的方法培养。
方面B77.一种细胞培养基，所述细胞培养基用于如方面B1至74中任一项所述的方法。
方面B78.一种细胞培养基，所述细胞培养基包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)浓度小于100mM的NaCl。
方面B79.如方面78所述的培养基，其中所述钾离子的浓度为至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。
方面B80.如方面B78或79所述的培养基，所述培养基包含：a.约45mM钾离子和小于95mM NaCl，b.约50mM钾离子和小于90mM NaCl，c.约55mM钾离子和小于85mM NaCl，d.约60mM钾离子和小于80mM NaCl，e.约65mM钾离子和小于75mM NaCl，f.约70mM钾离子和小于70mM NaCl，g.约75mM钾离子和小于65mM NaCl，h.约80mM钾离子和小于60mM NaCl，i.约85mM钾离子和小于55mM NaCl，或j.约90mM钾离子和小于50mM NaCl。
方面B81.如方面B78至90中任一项所述的培养基，所述培养基还包含一种或多种细胞因子。
方面B82.如方面B91所述的培养基，其中所述一种或多种细胞因子选自由以下组成的组：IL-2、IL-7、IL-15、IL-21及它们的任何组合。
方面B83.如方面B78至82中任一项所述的培养基，其中所述钾离子包括氯化钾。
方面B84.一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用如方面B75或76所述的细胞群。
方面B85.如方面B84所述的方法，其中所述疾病或疾患包括肿瘤，所述肿瘤源自包括以下的癌症：乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾脏癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、食管癌、眼癌、胃(胃)癌、胃肠道癌、卵巢癌、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或它们的组合。
附图说明
图1A显示了用于FACS分析的严格细胞表面标志物和转录因子，其准确地定义了“干细胞样”细胞，例如T细胞。图1B是用各种表型特征和生物标志物表达谱注释的示例性细胞(例如T细胞)的进行性分化的图示。
图2A-2F是散点图，显示在不同钾浓度下的相对干样细胞群(图2A-2C)和相对产量(图2D-2F)，其中培养基具有250mOsmol(图2A和2D)、280mOsmol(图2B和2E)或320mOsmol(图2C和2F)的张力(圆：50mM钾离子；正方形：60mM钾离子；三角形：70mM钾离子；倒三角形：80mM钾离子；菱形：90mM钾离子；空心圆：对照)。图2G是显示了在张力为250mOsmol的对照培养基或低渗培养基中培养后的相对干样群体的线图。基于钾和NaCl的浓度计算培养基的张力，如表2所示。
图3A-3G显示了在低渗培养条件下在升高的钾中培养T细胞的影响。图3A显示了与本文所公开的一些方面一致的T细胞培养方案。图3B-图3H显示了在各种培养条件下CD45RACCR7表达的FACS分析。图3I-图3O显示了在各种培养条件下CD45RA和CD62L表达的FACS分析。图3O-图3V显示了在各种培养条件下T细胞持久性相关标志物CD27和CCR7+的表达的FACS分析。图3W-图3CC显示了在各种培养条件下TCF7和CD39表达的FACS分析。图3DD-图3FF显示了TCF7表达和CD3的FAC分析。图3GG显示了来自对照和具有升高的钾的培养条件的低渗改良培养基的TCF7+细胞的百分比。
图4A-4B显示了在体外扩增期间的T细胞产量和活力。图4A显示了在对照培养基和改良(低渗)培养基(即含有升高的钾和NaCl使得钾离子和NaCl的组合小于140mM的培养基)中培养的T细胞的扩增倍数(106)。图4B显示了在对照培养基和改良(低渗)培养基(即含有升高的钾和NaCl使得钾离子和NaCl的组合小于140mM的培养基)中培养的T细胞的活力。
图5A-图5R显示了低渗条件培养基富集的“干细胞样”T细胞。图5A-图5I显示了来自在对照培养基中培养的CD4和CD8 T细胞的“干细胞样”标志物的FACS分析。图5J-图5R显示了来自在改良(低渗)培养基(即含有升高的钾和NaCl使得钾离子和NaCl的组合小于140mM的培养基)中培养的CD4和CD8 T细胞的“干细胞样”标志物的FACS分析。
图6显示了改良培养基对转导效率的影响。改良(低渗)培养基具有升高的钾和NaCl，使得钾离子和NaCl的组合小于140mM。
图7显示了改良培养基中升高的钾对TSCM群的影响。
图8A-图8B是说明在MRM中培养的T细胞的蛋白质组图谱的蛋白质印迹图像，显示干性(图8A)和准备发挥效应子功能的细胞(图8B)两者的特征。
图9A-图9J显示了升高的钾对TSCM群体的效应子功能的命运的影响。图9A-图9D显示了FACS图，其显示CCR7+中IL-2表达的富集和CD19-CAR工程化CD4 T细胞中IFN-γ的减少。图9E-图9H显示了FACS图，其显示CCR7+中IL-2表达的富集和CD19-CAR工程化CD8 T细胞中IFN-γ的减少。图9I-图9J显示了在低渗培养条件下对照和升高的钾中IL-2(图9I)和IFN-γ(图9J)表达的定量。
图10A-图10D显示了在对照(左图)或具有升高的钾和低渗培养条件的改良(低渗)培养基(右图)中细胞因子对TSCM群体的影响。图10A-图10B显示了IL-2、IL-7和IL-15组合的效果。图10C-图10D显示了IL-7和IL-21组合的效果。
图11A-图11B显示了在包含升高的钾和细胞因子组合的改良(低渗)培养基中在低渗培养条件下在对照和升高的钾中培养的CAR工程化产物中的TSCM细胞的数量。图11A显示了来自供体1的CAR工程化产物中TSCM细胞的数量。从左至右，将细胞与以下一起培养：IL-2、IL-7和IL-15；IL-2(10ng/mL)；IL-2和IL-21(1ng/mL)；IL-7和IL-21(1ng/ml)；IL-15和IL-21(1ng/mL)；钾和IL-2、IL-7以及IL-15；钾和IL-2(10ng/mL)；钾和IL-2以及IL-21(1ng/mL)；钾和IL-7以及IL-21(1ng/mL)；钾和IL-15以及IL-21(1ng/mL)。图11B显示了来自供体1的CAR工程化产物中TSCM细胞的数量。从左至右，将细胞与以下一起培养：IL-2、IL-7和IL-15；IL-2(10ng/mL)；IL-2和IL-21(1ng/mL)；IL-7和IL-21(1ng/ml)；IL-15和IL-21(1ng/mL)；钾和IL-2、IL-7以及IL-15；钾和IL-2(10ng/mL)；钾和IL-2以及IL-21(1ng/mL)；钾和IL-7以及IL-21(1ng/mL)；钾和IL-15以及IL-21(1ng/mL)。
图12A-图12G是总体显示从肿瘤碎片培养和扩增TIL的示例性方法的示意图。图12B-图12C显示了包括初始扩增和第二扩增的示例性方法，其中在从初始TIL培养向第二TIL扩增的转变时(图12B-图12C)和在初始TIL培养期间(图12C)，任选地刺激TIL(例如，根据本文所公开的方法，例如，通过使细胞与4-1BBL、TRANSACTTM、抗CD3抗体、抗原呈递细胞或它们的任何组合接触)。图12D-图12E显示了包括初始扩增、第二扩增和最终扩增的示例性方法，其中(i)在从初始TIL培养向第二TIL扩增的转变时(图12D-图12E)；(ii)在从第二TIL扩增到最终TIL扩增的转变时(图12D-图12E)；和(iii)在初始TIL培养期间(图12E)，任选地刺激TIL。图12F-图12G显示了生成年轻TIL的示例性方法，其中初始扩增和第二扩增的持续时间较短，例如，每次扩增11天(或更少)，并且其中在从初始TIL培养向第二TIL扩增的转变时(图12F-图12G)和在初始TIL培养期间(图12G)任选地刺激TIL。
图13A-图13B是在T细胞条件培养基(CTSTMOPTIMIZERTM，本文也称为“对照培养基”，图13A)或代谢重编程培养基(本文也称为“MRM”；图13B)中初始培养(第14天)后TIL的FACS细胞表型分析的图示。图13A和图13B显示与在对照培养基中培养的TIL相比，在MRM中培养产生了具有增强的CD39和PD1表达(大于20％)的TIL。图13C是显示通过在对照或MRM中培养来自各种肿瘤类型的TIL获得的CD8+细胞百分比的个体差异的散点图。每个连接点代表从相同样品获得的TIL，因此该图总结了来自13名患者的数据。星号指示在对照培养基中培养后CD8+TIL的平均百分比与在MRM中培养后CD8+TIL的平均百分比显著不同。这些数据显示，与在对照培养基中培养TIL相比，在MRM中培养TIL导致CD8+T细胞的富集。
图14A-图14E是在对照培养基(图14A和图14C)或MRM(图14B和图14D)中培养14天后基于培养的CD4+(图14A-图14B)和CD8+(图14C-图14D)TIL的PD1和CD27表达的FACS细胞表型分析的图示。图14C是显示通过在对照或MRM中培养来自各种肿瘤类型的TIL获得的CD27+PD1+细胞百分比的个体差异的散点图。每个连接点代表从相同样品获得的TIL，因此图14C总结了来自9名患者的数据。星号指示在对照培养基中培养后CD27+PD1+TIL的平均百分比与在MRM中培养后CD27+PD1+TIL的平均百分比显著不同。这些数据显示，与在对照培养基中培养TIL相比，在MRM中培养TIL导致CD27+PD1+T细胞的富集。
图15是说明通过在对照培养基或MRM中培养来自各种肿瘤类型的TIL获得的CD27+CD28+细胞百分比在初始培养(第14天)后的统计学显著差异的图示。每个连接点代表从相同样品获得的TIL，因此图15总结了来自9名患者的数据。这些数据显示，与在对照培养基中培养的TIL相比，在MRM中培养TIL导致CD27+CD28+T细胞的富集。
图16A-图16B是在对照培养基(图16A)或MRM(图16B)中培养(第14天)的TIL的FACS细胞表型分析的图示，首先通过CD8或CD4表达、随后通过CD28和CD27表达、随后通过CD103和CD27表达、随后通过PD1和CD103表达、最后通过TCF7和CD27表达进行门控。图16C是说明在对照培养基(1)或MRM(2)中初始培养后(约第14天)TCF7+TIL的平均荧光强度(MFI)的图示。
图17A-图17H是第二扩增后(约第21-26天)在对照培养基(图17A-图17D)或MRM(图17E-图17H)中扩增的TIL的FACS细胞表型分析的图示，首先通过CD8或CD4表达进行门控(图17A和17E)，通过CD28和CD27表达对CD8+细胞进行门控(图17B和图17F)，通过PD1和CD27表达对CD8+细胞进行门控(图17C和图17G)，以及最后通过TCF7和CD39表达对CD8+细胞进行门控(图17D和图17H)。图17B-图17D和图17F-图17H是CD8+细胞。
图18A-图18H是第二扩增后(约第21天)通过在对照培养基(图18A-图18D)或MRM(图18E-图18H)中与突变体KRAS脉冲的树突细胞共培养扩增的CD8+TIL的FACS细胞表型分析的图示，首先通过CD8或CD4表达进行门控(图18A和图18E)，随后通过CD28和CD27表达对CD8+细胞进行门控(图18B和图18F)，随后通过PD1和CD27表达对CD8+细胞进行门控(图18C和图18G)，以及最后通过TCF7和CD8表达对仅PD1+和CD27+PD1+细胞进行门控(图18D和图18H)。图18B-图18D和图18F-图18H是CD8+细胞。
图19A-图19H是第二扩增后(约第21天)通过在对照培养基(图19A-图19D)或MRM(图19E-图19H)中与野生型KRAS脉冲的树突细胞共培养扩增的TIL的FACS细胞表型分析的图示，首先通过CD8或CD4表达进行门控(图19A和图19E)，随后通过CD28和CD27表达对CD8+细胞进行门控(图19B和图19F)，随后通过PD1和CD27表达对CD8+细胞进行门控(图19C和图19G)，以及最后通过TCF7和CD8表达对仅PD1+和CD27+PD1+细胞进行门控(图19D和图19H)。图19B-图19D和图19F-图19H是CD8+细胞。
图20A-图20B是在对照培养基(图20A)或MRM(图20B)中第二扩增后(约第21-26天)培养的TIL的FACS细胞表型分析的图示。
图21是显示第二扩增后(约第21天)在对照培养基或MRM中培养的TIL中IL-2、B2M、GZMB、IFNγ和TCF7基因表达的倍数变化(FC)的条形图。将每个基因的表达归一化为在对照培养基中培养的TIL中的表达。
图22A-图22L是第二扩增后(约第21-26天)在对照培养基(图22A、图22B、图22E和图22F)或MRM(图22C、图22D和图22G-图22L)中培养的CD4+或CD8+TIL的FACS细胞分选的图示，通过PD1表达(图22A-图22D)或CD103表达(图22E-图22H)和CD39表达(图22A-图22H)进行门控。图22I-图22L显示了CD4+TIL(图22I和图22K)和CD8+TIL(图22J和图22L)的门控，对PD1和CD39表达(图22I-图22J)、接着CD45RO和CD103表达(图21K-图21L)进行门控。
图23是如所示的表达IL-2和/或IFNγ的细胞的百分比的条形图，说明了在对照培养基或代谢重编程培养基(MRM；低渗培养基(即，含有升高的钾和NaCl使得钾离子和NaCl的组合小于140mM的改良培养基))中培养的ROR1嵌合抗原受体(CAR)T细胞的分化状态。
图24是在对照培养基(“ROR1 CAR”)或MRM培养基中共培养的ROR1 CAR T细胞的连续杀伤数据的图示。
图25A-图25B是说明如所示的在对照培养基或MRM中与H1975细胞共培养的CAR-T细胞的IL-2分泌(图25A)和IFNγ分泌(图25B)的条形图。
图26是显示如所示的在对照培养基(“ROR1 CAR”)和MRM中与H1975靶细胞共培养的ROR1 CAR T细胞增殖的线图。
图27是说明大量基因的单细胞基因表达的均匀流形近似和投影(UMAP)。每个单独的点代表单个细胞。对照细胞通常聚集在大于0的UMAP_1值处；并且MRM细胞通常聚集在小于0的UMAP_1值处，沿横坐标投影为‘0’时具有有限程度的重叠。
图28是显示在对照培养基(1)或MRM(2)中培养后具有较低分化表型的培养物中总人健康细胞(“H”)或患病供体细胞(“D1”和“D2”)的百分比的条形图。
图29是来自大量ATAC-seq的差异峰分析(y轴)和来自大量RNA-seq的差异基因分析(x轴)的散点图，说明在对照培养基或MRM中培养的细胞的转录和表观遗传差异。
图30是说明如所示的在对照培养基或MRM中培养的细胞中TCF7启动子区中显著差异峰的图。
图31A-图31C提供了在TCM(即对照培养基)和MRM中培养(或生长)的T细胞中抗ROR1(R12)CAR转导效率的比较。T细胞(包括CD4+和CD8+ T细胞两者)源自不同的供体：供体#1(图31A)、供体#2(图31B)和供体#3(图31C)。不同的转导条件(或测试组)如下：(1)在TCM中培养的非转导T细胞；(2)用对照CD19t-R12 CAR(即无c-Jun的R12 CAR)转导并在TCM中培养的T细胞；(3)用c-Jun-R12CAR(即具有c-Jun的R12 CAR)转导并在TCM中培养的T细胞；(4)在MRM中培养的非转导T细胞；(5)用对照CD19t-R12 CAR转导并在MRM中培养的T细胞；和(6)用c-Jun-R12 CAR转导并在MRM中培养的T细胞。
图32A-图32C显示了来自不同测试组的总转导T细胞群中存在的CD4+(黑色条)和CD8+(白色条)T细胞的百分比。不同的测试组与图31A-图31C中描述的相同。转导的T细胞源自三个不同的供体：供体#1(图32A)，供体#2(图32B)和供体#3(图32C)。
图33A-图33C显示了MRM对来自不同测试组的转导T细胞中c-Jun蛋白表达水平(显示为中值荧光强度(MFI))的影响。不同的测试组与图31A-图31C中描述的相同。转导的T细胞源自三个不同的供体：供体#1(图33A)，供体#2(图33B)和供体#3(图33C)。
图34A-图34F提供了来自不同测试组的干样转导的CD4+ T细胞(图34A、图34B和图34C-三种不同供体)和CD8+ T细胞(图34D、图34E和图34F-来自三种不同供体)的百分比的比较。不同试验组。不同的测试组与图31A-图31C中描述的相同。如实施例2中所解释的，干样细胞被鉴定为CD45RO-CCR7+CD45RA+CD62L+CD27+CD28+TCF7+。
图35A-图35J提供了来自不同测试组的转导T细胞(源自供体#1)上各种表面标志物的表达的比较。不同的测试组与图31A-图31C中描述的相同。图35A、图35B、图35C、图35D和图35E分别显示了表达CD39、LAG3、PD1、TIGIT和TIM3的抗ROR1(R12)CAR转导的CD4+ T细胞的百分比。图35F、图35G、图35H、图35I和图35J显示了分别表达CD39、LAG3、PD1、TIGIT和TIM3的抗ROR1CAR转导的CD8+ T细胞的百分比。
图36A-图36J提供了来自不同测试组的转导T细胞(源自供体#2)上各种表面标志物的表达的比较。不同的测试组与图31A-图31C中描述的相同。图36A、图36B、图36C、图36D和图36E分别显示了表达CD39、LAG3、PD1、TIGIT和TIM3的抗ROR1(R12)CAR转导的CD4+ T细胞的百分比。图36F、图36G、图36H、图36I和图36J显示了分别表达CD39、LAG3、PD1、TIGIT和TIM3的抗ROR1CAR转导的CD8+ T细胞的百分比。
图37A-图37J提供了来自不同测试组的转导T细胞(源自供体#3)上各种表面标志物的表达的比较。不同的测试组与图31A-图31C中描述的相同。图37A、图37B、图37C、图37D和图37E分别显示了表达CD39、LAG3、PD1、TIGIT和TIM3的抗ROR1(R12)CAR转导的CD4+ T细胞的百分比。图37F、图37G、图37H、图37I和图37J显示了分别表达CD39、LAG3、PD1、TIGIT和TIM3的抗ROR1(R12)CAR转导的CD8+ T细胞的百分比。
图38A-图38C提供了初次抗原刺激后MRM或TCM中转导和培养的T细胞产生IL-2的比较。转导的T细胞源自三个不同的供体：供体#1(图38A)，供体#2(图38B)和供体#3(图38C)。不同测试组如下：(1)用对照CD19t-R12 CAR(即无c-Jun的R12 CAR)转导并在TCM中培养的T细胞(实心圆)；(2)用c-jun-R12 CAR(即具有c-jun的R12CAR)转导并在TCM中培养的T细胞(实心方块)；(3)用对照CD19t-R12 CAR转导并在MRM中培养的T细胞(空心圆)；和(4)用c-Jun-R12 CAR转导并在MRM中培养的T细胞(空心方块)。x轴提供了效应物:靶(E:T)比率(即转导的T细胞与靶肿瘤细胞的比率)。
图39A-图39C提供了多轮抗原刺激后在MRM或TCM中转导和培养的T细胞产生IFN-γ的比较。如实施例3中进一步提供的，当未达到再接种后续轮次所需的转导T细胞的数量时，终止系列刺激测定：(i)供体#1的四轮抗原刺激(图39A)，(ii)供体#2的三轮抗原刺激(图39B)，和(iii)供体#3的两轮抗原刺激(图39C)。不同试验组如下：(1)用对照CD19t-R12CAR(即无c-Jun的R12 CAR)转导并在TCM中培养的T细胞(实心圆)；(2)用c-Jun-R12 CAR(即具有c-Jun的R12 CAR)转导并在TCM中培养的T细胞(实心方块)；(3)用对照CD19t-R12CAR转导并在MRM中培养的T细胞(空心圆)；和(3)用c-Jun-R12 CAR转导并在MRM中培养的T细胞(空心方块)。x轴提供了效应物:靶(E:T)比率(即转导的T细胞与靶肿瘤细胞的比率)。
图40A-图40F显示了转导的CD8+ T细胞在多轮抗原刺激后杀伤靶肿瘤细胞的能力。转导的T细胞源自三个不同的供体：供体#1(图40B和图40E)、供体#2(图40A和图40D)和供体#3(图40C和图40F)。图40A、图40B和图40C提供了用对照CD19t-R12 CAR(即无c-Jun的R12 CAR)(黑条)或c-Jun-R12 CAR(即具有c-Jun的R12 CAR)(白条)转导并在对照培养基(即TCM)中培养的CD8+ T细胞的结果。图40E、图40F和图40G提供了用对照CD19t-R12 CAR(黑条)或c-Jun-R12 CAR(白条)转导并在MRM中培养的CD8+ T细胞的结果。x轴提供了效应物:靶(E:T)比率(即转导的T细胞与靶肿瘤细胞的比率)。
图41A-图41H是说明使用对照方法(图41A-图41D)或MRM(41E-图41H)扩增的NSCLCTIL中标志物基因表达的图示。在MRM中扩增的TIL表现出优异的表型特征，如通过CD8+ T细胞级分、低CD39/CD69表达(图41B和如41D)、中央记忆(CD45RO+CD6L+；图41C和图41G)和高CD27表达(图41D和图41H)所测量的。虚线高亮框指示不利表型，并且实线高亮框指示有利表型。
图42A-图42C是说明从黑素瘤(图42A)、NSCLC(图42B)或结肠直肠癌(图42C)获得的TIL中T细胞区室内CD8+ T细胞对CD39和CD69两者的阴性表达的图示。从新鲜提供的人肿瘤样品开始培养，并在对照或MRM条件下扩增细胞。在最终快速扩增过程(REP)后，分析TIL的T细胞区室中CD8+ T细胞对CD39和CD69两者的阴性表达。对于每个分析，评估从黑素瘤(n＝6个独立肿瘤)、NSCLC(n＝5个独立肿瘤)和结肠直肠癌(n＝11个独立肿瘤)扩增的TIL。通过配对t检验测量统计学显著性。***p<.001，*p<.05。
具体实施方式
本公开涉及培养细胞的方法、通过所述方法制备的细胞、和/或用于细胞培养方法的组合物或试剂盒。在一些方面，本公开提供了生成用于过继细胞疗法(ACT)的免疫细胞群体(例如T细胞)的方法，其中免疫细胞具有较低分化的状态并保持增殖的能力。在一些方面，免疫细胞具有较低分化的状态并维持靶向和杀伤肿瘤细胞的能力。在一些方面，免疫细胞具有较低分化的状态、保持增殖的能力并维持靶向和杀伤肿瘤细胞的能力。在一些方面，与根据常规方法培养的免疫细胞相比，根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如T细胞)在ACT中具有增加的功效。在一些方面，与根据常规方法培养的免疫细胞相比，根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如T细胞)在ACT中向受试者施用时具有增加的持久性。此类增加的持久性是指免疫细胞(例如T细胞)在肿瘤微环境中浸润和发挥功能的能力、抵抗衰竭的能力以及确保继续扩增和应答持久性的干性持久性。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如T细胞)是干样细胞。这些细胞能够自我更新、增殖和分化。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如T细胞)是也表达效应子样标志物的干样细胞。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如T细胞)是也维持靶向和杀伤肿瘤细胞的能力的干样细胞。
当用载体转导细胞时，本公开的细胞培养方法能够增加所培养细胞的多能性和/或多潜能性或提高转导效率。在一些方面，当培养细胞和/或将细胞用于体内疗法时，培养方法能够减少和/或防止细胞耗竭。在一些方面，培养方法还能够增加体内活力、体内持久性、体内效应子功能或它们的任何组合。在一些方面，本文所公开的培养方法能够富集寡克隆或多克隆肿瘤反应性干样T细胞和/或CD8+TIL。在一些方面，本文所公开的培养方法能够保留源自癌症患者的TIL的克隆多样性。
在一些方面，本公开涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞)的方法，所述方法包括将所述细胞置于包含浓度为至少约5mM(例如，高于5mM)的钾的培养基中，其中培养基不是高渗的，例如是低渗的或等渗的。本公开的一些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞)的方法，所述方法包括将所述细胞置于包含浓度高于40mM(例如约50mM-80mM)的钾的培养基中。在一些方面，细胞是免疫细胞。在一些方面，免疫细胞包含T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、调节性T(Treg)细胞或它们的任何组合。在一些方面，细胞是多潜能细胞。在一些方面，细胞是多能细胞。在一些方面，多能细胞是诱导多能干细胞或胚胎干细胞。在一些方面，细胞是造血干细胞。
本公开的一些方面涉及在离体或体外培养期间增加人免疫细胞和/或干细胞的产量同时增加人免疫细胞和/或干细胞的干性(stemness)的方法，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在30mM和100mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞和/或干细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110和140mM之间。本公开的一些方面涉及制备用于免疫疗法的人免疫细胞和/或干细胞群的方法，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在30mM和100mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞和/或干细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110和140mM之间。本公开的一些方面涉及在针对免疫疗法离体或体外培养期间增加人免疫细胞的干性的方法，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在30mM和100mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110和140mM之间。在一些方面，人免疫细胞是T细胞。
在一些方面，本公开涉及离体或体外培养TIL的方法，该方法包括在代谢重编程培养基(例如，包含浓度高于40mM的钾离子的高钾培养基)中培养TIL的异质群体，其中该高钾培养基不是高渗的。在一些方面，本公开涉及离体或体外增加CD8+TIL的数量或百分比的方法，该方法包括在代谢重编程培养基(例如，包含浓度为至少5mM的钾离子的高钾培养基)中培养TIL的异质群体。在其他方面，本公开涉及制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的CD8+富集群体的方法，该方法包括在代谢重编程培养基(例如，包含浓度为至少5mM的钾离子的高钾培养基)中离体或体外培养TIL的异质群体。
在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在某些方面，培养基还包含白介素(IL)-2、IL-21、IL-7、IL-15或它们的任何组合。在一些方面，培养基包含IL-2、IL-7和IL-15。在一些方面，培养基包含IL-2和IL-21。在一些方面，培养基还包含钠离子、钙离子、葡萄糖或它们的任何组合。
在更详细地描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定组合物或方法步骤，因此此类组合物或方法步骤当然可变化。本领域技术人员在阅读本公开时将显而易见的是，本文所描述且说明的各个单独方面具有离散的组分和特征，所述组分和特征可容易地与任何另外的若干方面的特征分离或组合而不偏离本公开的范围或精神。任何叙述的方法可以以所叙述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
本文提供的标题并非是对本公开的各个方面的限制，所述各个方面可通过参考说明书整体来限定。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不意图是限制性的。
I.术语
为了能够更容易地理解本公开内容，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下文所述的含义。另外的定义在整个申请中阐述。
贯穿本公开，术语“一个”或“一种”实体是指一个/种或多个/种该实体；例如，“一种嵌合多肽”应理解为表示一种或多种嵌合多肽。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。
此外，在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一个具有或不具有另一者的具体公开。因此，本文在短语中使用的术语“和/或”诸如“A和/或B”意图包括：“A和B”；“A或B”；“A”(单独)；和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用术语“和/或”意图包括以下方面的每一方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独的)；B(单独的)；和C(单独的)。此外，“或”用于表示列表中的组分的开放列表。例如，“其中X包含A或B”意味着X包含A、X包含B、X包含A和B、或X包含A或B和任何其他组分。
应当理解，本文无论在何处用措辞“包含/包括(comprising)”来描述方面，都还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似方面。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本公开所相关领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。举例来说，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,OxfordUniversity Press对技术人员提供本公开中使用的许多术语的综合词典。
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受形式表示。数值范围包括限定范围的数字。
贯穿本公开定义了本文所用的缩写。在以下小节中更详细地描述了本公开的各个方面。
术语“约”或“基本上包括”是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其部分取决于如何测量或确定值或组成，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上包含”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。可替代地，“约”或“基本上包含”可以意指高达10％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，这些术语可以指高达一个数量级或高达5倍的值。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上包括”的含义在该特定值或组成的可接受的误差范围内。
如本文所用，在应用于一个或多个目标值时，术语“大约”是指类似于所阐述的参考值的值。在某些方面，术语“大约”是指在所阐述的参考值的任一方向上的(大于或小于)10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％的情况)。
如本文所述，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当情况下，其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。
如本文所用，术语“多能细胞”是指能够分化成任何细胞类型(例如在人体内)的自我复制细胞。
如本文所用，“多潜能细胞”是指能够分化成多于一种分化后代细胞的自我复制细胞。
如本文所用，术语“对照培养基”是指与本文所公开的代谢重编程培养基(“MRM”)相比的任何培养基。对照培养基可包含与代谢重编程培养基相同的组分，除了某些离子浓度，例如钾离子。在一些方面，如本文所述，通过调节一种或多种离子浓度(例如钾离子浓度)由对照培养基制备本文所述的代谢重编程培养基。在一些方面，对照培养基包括基础培养基，例如CTSTMOPTMIZERTM。在一些方面，对照培养基包含AIM V、RPMI、或包含AIM V和RPMI的混合物。在一些方面，对照培养基包含(i)50％ AIM V，(ii)50％ RPMI1640，(iii)5％或10％人血清，和(iv)IL-2。在一些方面，对照培养基因此包含也被添加到代谢重编程培养基中的一种或多种另外的组分，包括但不限于氨基酸、葡萄糖、谷氨酰胺、T细胞刺激物、抗体、取代物等，但对照培养基具有不同于代谢重编程培养基的某些离子浓度。除非另有说明，术语“培养基(media)”和“培养基(medium)”可互换使用。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的细胞。在一些方面，免疫细胞选自T淋巴细胞(“T细胞”)、B淋巴细胞(“B细胞”)、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞。在一些方面，免疫细胞是肿瘤浸润细胞(TIL)。如本文所用，“TIL”是指已经至少一次进入肿瘤或能够(例如在肿瘤实质内)进入肿瘤的T细胞。在一些方面，肿瘤是实体瘤。在一些方面，肿瘤是液体肿瘤，例如造血系统癌症。通过本发明方法制备的TIL可具有与天然存在的TIL相同的一种或多种特性。在一些方面，通过本发明方法制备的TIL具有一种或多种在天然存在的TIL中不存在的特性。TIL可使用任何方法获得。在一些方面，TIL获自受试者的肿瘤样品。在一些方面，在促进TIL从肿瘤组织中逃逸、TIL增殖和/或TIL扩增的条件下培养肿瘤样品或其部分。在一些方面，用于促进TIL逃逸、增殖和/或扩增的培养基是本文所公开的任何代谢重编程培养基，例如高钾培养基。
TIL包括但不限于CD8+ T细胞(即细胞毒性T细胞)、CD4+ T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。TIL包括原代(例如从患者组织样品中获得的)和次级TIL(例如已从原代TIL中培养、扩增或增殖的TIL细胞群)。在一些方面，TIL是经遗传修饰的。在一些方面，TIL是CD8+T细胞。CD8+TIL通常被认为是负责破坏癌细胞的TIL亚群。相反，CD4+TIL通常被认为充当免疫应答的抑制因子，其可限制针对肿瘤的免疫应答。
在一些方面，可使用细胞表面标志物生物化学地定义TIL。TIL通常可通过表达以下生物标志物中的一种或多种来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45RA、CD95、PD-1和CD25。在一些方面，TIL可通过它们浸润肿瘤和选择性杀伤癌细胞的能力来功能性地定义。
原代免疫细胞，包括原代T细胞，可从许多组织来源获得，包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和/或肿瘤组织。白细胞，包括PBMC，可通过熟知的技术从其他血细胞中分离，例如FICOLLTM分离和白细胞单采术。白细胞单采产品通常含有淋巴细胞(包括T和B细胞)、单核细胞、粒细胞和其他有核白细胞。例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析从其他白细胞中进一步分离T细胞。T细胞的特定亚群，诸如CD3+、CD25+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、GITR+和CD45RO+T细胞，可通过阳性或阴性选择技术(例如，使用基于荧光或基于磁性的细胞分选)进一步分离。例如，T细胞可通过与各种可商购获得的抗体缀合珠诸如 CELLECTIONTM、DETACHABEADTM(Thermo Fisher)或/> 细胞分离产物(Miltenyi Biotec)孵育足以阳性选择所需T细胞或阴性选择去除不需要的细胞的时间来分离。
在一些情况下，在癌症治疗后直接从癌症患者获得自体T细胞。已经观察到，在某些癌症治疗后，特别是那些损害免疫系统的癌症治疗后，在治疗后不久收集的T细胞的质量可具有提高的离体扩增和/或离体工程化后移植的能力。
无论是在遗传修饰之前还是之后，通常都可使用如例如美国专利5,858,358、5,883,223、6,352,694、6,534,055、6,797,514、6,867,041、6,692,964、6,887,466、6,905,680、6,905,681、6,905,874、7,067,318、7,144,575、7,172,869、7,175,843、7,232,566、7,572,631和10,786,533中所述的方法来活化和扩增T细胞，其各自以引用的方式整体明确地并入本文。通常，T细胞可通过与附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而在体外或离体扩增。特别地，可刺激T细胞群体，诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD3抗体接触，或通过与蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)结合钙离子载体接触。对于辅助分子在T细胞表面上的共刺激，可使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可采用抗CD3抗体和抗CD28抗体。在某些方面，通过与TRANSACTTM、或其他已知的活化剂接触来活化和扩增T细胞。
如本文所用，细胞的“群”是指多于一个细胞的集合，例如多个细胞。在一些方面，细胞群包含多于一种免疫细胞，例如多种免疫细胞。在一些方面，细胞群包含细胞的异质混合物，其包含多种类型的细胞，例如免疫细胞和非免疫细胞的异质混合物。在一些方面，细胞群包含多个T细胞。
如本文所用，术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的，并且是指由胸腺产生或加工的任何淋巴细胞。T细胞的非限制性种类包括效应T细胞(诸如CD8+T细胞)和T辅助(Th)细胞(诸如CD4+T细胞)。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞)是Th1细胞。在一些方面，免疫细胞是Th2细胞。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞)是Tc17细胞。在一些方面，免疫细胞是Th17细胞。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞)是肿瘤浸润细胞(TIL)。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞)是Treg细胞。
如本文所用，术语“记忆”T细胞是指先前已遇到并响应于其同源抗原(例如，在体内、在体外或离体)或已用例如抗CD3抗体刺激(例如，在体外或离体)的T细胞。在第二次暴露时具有“记忆样”表型的免疫细胞，这种记忆T细胞与第一次暴露期间相比可以复制以产生更快和更强的免疫应答。在一些方面，在第二次暴露于抗原或刺激时具有“记忆样”表型的TIL复制或增殖以产生比第一次暴露期间更快和更强的免疫应答。在一些方面，记忆T细胞包括中央记忆T细胞(TCM细胞)、效应记忆T细胞(TEM细胞)、组织驻留记忆T细胞(TRM细胞)、干细胞样记忆T细胞(TSCM细胞)或它们的任何组合。
如本文所用，术语“干样”或“干细胞样”是指细胞自我更新的特性或能力，并且具有生成和重建整个记忆和效应T细胞亚群谱的多潜能能力。在一些方面，干样细胞可通过由细胞表达的特定标志物来测量。在一些方面，这些干样标志物可以是CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+和TCF7+中的一种或多种。在一些方面，干样细胞可以通过转录组分析来鉴定，例如使用本文所公开的干性基因标签。在一些方面，效应子样标志物包括Krishna等人,Science 370:1328-34(2020年12月11日)和/或Galletti等人,NatureImmunology(2018年10月)中公开的标志物，其各自以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，术语“干细胞样记忆T细胞”、“T记忆干细胞”或“TSCM细胞”是指表达CD95、CD45RA、CCR7和CD62L并且被赋予干细胞样自我更新能力和重建整个记忆和效应T细胞亚群谱的多潜能能力的记忆T细胞。
如本文所用，术语“中央记忆T细胞”或“TCM细胞”是指表达CD45RO、CCR7和CD62L的记忆T细胞。中央记忆T细胞通常存在于淋巴结和外周循环中。
如本文所用，术语“效应子样”或“效应细胞样”是指肿瘤细胞杀伤能力和细胞因子多功能性，例如细胞产生炎性细胞因子和/或细胞毒性分子的能力。在一些方面，效应子样细胞可通过由细胞表达的特定标志物来测量。在一些方面，这些效应子样标志物可以是pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+中的一种或多种。在一些方面，效应子样标志物包括选自由以下组成的组的STAT靶标：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2及它们的任何组合。在一些方面，效应子样细胞可通过转录组分析来鉴定。在一些方面，效应子样标志物包括Kaech等人,Cell 111:837-51(2002)；Tripathi等人,J.Immunology 185:2116-24(2010)；和/或Johnnidis等人,ScienceImmunology 6:eabe3702(2021年1月15日)中公开的标志物，其各自以引用的方式整体并入本文。
在一些方面，使用Gattinoni,L.等人,Nat Med 17(10):1290-97(2011)中描述的效应子相关基因组来表征效应子样细胞。在一些方面，效应子样细胞的基因标签包括选自以下的一种或多种基因：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMI、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A,、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、KLRB1及它们的任何组合(参见例如，Gattinoni,L.等人,Nat Med 17(10):1290-97(2011)。
如本文所用，术语“效应记忆T细胞”或“TEM细胞”是指表达CD45RO但缺乏CCR7和CD62L表达的记忆T细胞。因为效应记忆T细胞缺乏淋巴结归巢受体(例如CCR7和CD62L)，所以这些细胞通常存在于外周循环和非淋巴组织中。
如本文所用，术语“组织驻留记忆T细胞”或“TRM细胞”是指不循环并且保持驻留在外周组织诸如皮肤、肺和胃肠道中的记忆T细胞。在某些方面，组织驻留记忆T细胞也是效应记忆T细胞。
如本文所用，术语“初始T细胞”或“TN细胞”是指表达CD45RA、CCR7和CD62L但不表达CD95的T细胞。如本文所用，术语“初始TIL”是指表达CD45RA、CCR7和CD62L但不表达CD95的TIL。TN细胞代表T细胞谱系中最不分化的细胞。在TN细胞和抗原呈递细胞(APC)之间的相互作用诱导TN细胞向激活的TEFF细胞分化和免疫应答。
如本文所用，术语“破碎”、“碎片”和“碎片化”描述了用于破坏肿瘤的过程，包括机械破碎方法诸如压碎、切片、分割和粉碎肿瘤组织，以及用于破坏肿瘤组织的物理结构的任何其他方法。
如本文所用的术语“培养”是指离体和/或体外细胞的受控生长。如本文所用，“培养”包括细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)在细胞扩增或细胞工程化(例如，用表达CAR、TCR或TCRm的构建体转导)期间的生长。在一些方面，所培养的细胞从受试者(例如人受试者)获得。在一些方面，所培养的细胞包括从人受试者获得的T细胞或NK细胞。在一些方面，所培养的细胞包括从人受试者获得的免疫细胞。在一些方面，所培养的细胞包括一种或多种本文所公开的工程化免疫细胞。在一些方面，在培养之前纯化T细胞和/或NK细胞。在一些方面，T细胞和/或NK细胞是肿瘤浸润T细胞和/或NK细胞。在一些方面，所培养的细胞包括从人受试者获得的TIL。在一些方面，培养包括将肿瘤样品或肿瘤碎片置于本文所公开的培养基中，其中该培养基促进TIL从肿瘤样品逃逸和TIL扩增。在一些方面，在培养之前分离或纯化TIL。在一些方面，细胞培养意图扩增所培养细胞的数量，例如以增加细胞的增殖。
如本文所用，“细胞工程化”是指细胞(例如本文所公开的多能细胞、多潜能细胞或免疫细胞)的靶向修饰。在一些方面，细胞工程化包括病毒基因工程化、非病毒基因工程化、引入允许肿瘤特异性靶向的受体(例如，TCR、TCRm和/或CAR)、引入一种或多种改善T细胞功能的内源基因、引入一种或多种改善T细胞功能的合成基因或它们的任何组合。
如本文所用，关于免疫细胞培养(例如TIL培养)的“扩增(expand)”或“扩增(expansion)”是指刺激或活化细胞并培养细胞的过程。在细胞被刺激或活化和培养后，扩增过程可导致培养细胞群中所需细胞的比例或总数增加，例如TIL的比例或总数增加。扩增并不要求培养细胞群中所有细胞类型的数量都增加。相反，在一些方面，在扩增过程中，仅培养细胞群中的细胞亚群的数量增加，而其他细胞类型的数量可能不改变或可能减少。
如本文所用，术语“产量”是指培养方法或其部分之后的细胞总数。在一些方面，术语“产量”是指特定细胞群，例如T细胞群中的干样T细胞。可使用任何方法确定产量，包括但不限于基于代表性样品估计产量。
如本文所用，术语“干性”、“干细胞样”、“干样”或“较低分化”是指表达与更初始表型一致的标志物的细胞，例如多能细胞、多潜能细胞或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。例如，较低分化的T细胞可以表达表征TN或TSCM细胞的一种或多种标志物。在一些方面，“较低分化的”或“干样”T细胞表达CD45RA、CCR7和CD62L。在一些方面，“较低分化的”或“干样”T细胞表达CD45RA、CCR7和CD62L，并且是CD45RO低的。在一些方面，“较低分化的”或“干样”T细胞表达CD45RA、CCR7和CD62L，而不表达CD45RO。在一些方面，“较低分化的”或“干样”T细胞表达CD45RA、CCR7、CD62L和TCF7。在一些方面，本文所公开的方法促进具有较低分化表型的细胞，例如多能细胞、多潜能细胞或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，本文所公开的方法促进具有较低分化表型的细胞(例如TIL)的生长和/或增殖。不受任何特定机制的束缚，在一些方面，本文所公开的方法阻断、抑制或限制较低分化的细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的分化，导致培养物中干样细胞的数量增加。例如，通常认为，为了有效控制肿瘤，优选的是具有干细胞样记忆或中央记忆表型的较低分化的免疫细胞(例如T细胞、NK细胞和/或TIL)的过继转移。参见Gattinoni,L.等人,J.Clin.Invest.115:1616–1626(2005)；Gattinoni,L.等人Nat Med15(7):808-814(2009)；Lynn,R.C.等人,Nature 576(7786):293-300(2019)；Gattinoni,L.等人,J.Clin.Invest.115:1616–1626(2005)；Gattinoni,L.等人Nat Med 15(7):808-814(2009)；以及Gattinoni,L.等人,Nat Med 17(10):1290-1297(2011)。
干性的特征在于自我更新能力、多潜能性和增殖潜能的持久性。在一些方面，干性的特征在于特定的基因标签(gene signature)，例如跨多种基因的组合表达模式。在一些方面，基因标签包括选自以下的一种或多种基因：ACTN1、DSC1、TSHZ2、MYB、LEF1、TIMD4、MAL、KRT73、SESN3、CDCA7L、LOC283174、TCF7、SLC16A10、LASS6、UBE2E2、IL7R、GCNT4、TAF4B、SULT1B1、SELP、KRT72、STXBP1、TCEA3、FCGBP、CXCR5、GPA33、NELL2、APBA2、SELL、VIPR1、FAM153B、PPFIBP2、FCER1G、GJB6、OCM2、GCET2、LRRN1、IL6ST、LRRC16A、IGSF9B、EFHA2、LOC129293、APP、PKIA、ZC3H12D、CHMP7、KIAA0748、SLC22A17、FLJ13197、NRCAM、C5orf13、GIPC3、WNT7A、FAM117B、BEND5、LGMN、FAM63A、FAM153B、ARHGEF11、RBM11、RIC3、LDLRAP1、PELI1、PTK2、KCTD12、LMO7、CEP68、SDK2、MCOLN3、ZNF238、EDAR、FAM153C、FAAH2、BCL9、C17orf48、MAP1D、ZSWIM1、SORBS3、IL4R、SERPINF1、C16orf45、SPTBN1、KCNQ1、LDHB、BZW2、NBEA、GAL3ST4、CRTC3、MAP3K1、HLA-DOA、RAB43、SGTB、CNN3、CWH43、KLHL3、PIM2、RGMB、C16orf74、AEBP1、SNORD115-11、SNORD115-11、GRAP及它们的任何组合(参见例如，Gattinoni等人,Nature Medicine 17(10):1290-97(2011))。在一些方面，基因标签包括选自以下的一种或多种基因：NOG、TIMD4、MYB、UBE2E2、FCER1G、HAVCR1、FCGBP、PPFIBP2、TPST1、ACTN1、IGF1R、KRT72、SLC16A10、GJB6、LRRN1、PRAGMIN、GIPC3、FLNB、ARRB1、SLC7A8、NUCB2、LRRC7、MYO15B、MAL、AEBP1、SDK2、BZW2、GAL3ST4、PITPNM2、ZNF496、FAM117B、C16orf74、TDRD6、TSPAN32、C18orf22、C3orf44、LOC129293、ZC3H12D、MLXIP、C7orf10、STXBP1、KCNQ1、FLJ13197、LDLRAP1、RAB43、RIN3、SLC22A17、AGBL3、TCEA3、NCRNA00185、FAM153B、FAM153C、VIPR1、MMP19、HBS1L、EEF2K、SNORA5C、UBASH3A、FLJ43390、RP6-213H19.1、INPP5A、PIM2、TNFRSF10D、SNRK、LOC100128288、PIGV、LOC100129858、SPTBN1、PROS1、MMP28、HES1、CACHD1、NSUN5C、LEF1、TTTY14、SNORA54、HSF2、C16orf67、NSUN5B、KIAA1257、NRG2、CAD、TARBP1、STRADB、MT1F、TMEM41B、PDHX、KDM6B、LOC100288322、UXS1、LGMN、NANOS2、PYGB、RASGRP2、C14orf80、XPO6、SLC24A6、FAM113A、MRM1、FBXW8、NDUFS2、KCTD12及它们的任何组合(参见例如，Gattinoni,L.等人,Nat Med 17(10):1290-1297(2011)或Galletti等人Nat Immunol 21,1552-1562(2020))。
在延长的抗原暴露的存在下，诸如在许多癌症中，较高分化的免疫细胞(例如效应和效应记忆T细胞)常常变得耗竭并丧失它们的抗肿瘤功能。可以使用任何方法测量生物标志物，例如T细胞标志物。在一些方面，使用抗体染色随后通过门控流式细胞术鉴定T细胞。
如本文所用，术语“张力”是指跨越细胞膜的有效渗透压梯度的量度。张力可基于溶液中钾离子和氯化钠(NaCl)的水平来测量或计算。在本文中，张力计算为钾离子(K+)的浓度和氯化钠(NaCl)的浓度之和乘以2。张力可以按溶液(例如培养基)的渗透压摩尔浓度表示。如本文所用，当培养基中溶质的浓度等于细胞内溶质的浓度时，溶液(例如培养基)被认为是“等渗的”。如本文所用，等渗培养基具有约280mOsm/L的张力(例如([K+]+[NaCl])X2＝280)。
如本文所用，如果溶液(例如培养基)中溶质的浓度低于细胞中溶质的浓度，则该溶液被认为是“低渗的”。如本文所用，低渗溶液具有小于280mOsm/L的张力(例如([K+]+[NaCl])X 2<280)。在一些方面，低渗培养基具有至少约210mOsm/L至小于约280mOsm/L的张力。在一些方面，低渗培养基具有至少约220mOsm/L至小于约280mOsm/L的张力。在一些方面，低渗培养基具有至少约230mOsm/L至小于约280mOsm/L的张力。在一些方面，低渗培养基具有至少约240mOsm/L至小于约280mOsm/L的张力。在一些方面，本文所述的低渗培养基具有约250mOsm/L的张力(例如([K+]+[NaCl])X 2＝250)。
如本文所用，如果溶液(例如培养基)中溶质的浓度高于细胞中溶质的浓度，则该溶液被认为是“高渗的”。如本文所用，高渗溶液具有大于300mOsm/L的渗透压摩尔浓度(例如([K+]+[NaCl])X 2>280)。在一些方面，本文所述的高渗培养基具有约320mOsm/L的张力。在某些方面，通过增加或降低选自钾离子、钠离子、葡萄糖及它们的任何组合的一种或多种溶质的浓度来调节溶液(例如培养基)的张力。在一些方面，通过增加或降低钾离子和NaCl的浓度来调节溶液(例如培养基)的张力。在一些方面，可以通过用第二溶质的减少抵消一种溶质的增加来维持培养基的张力。例如，增加培养基中钾离子的浓度而不改变钠离子的浓度可以增加培养基的张力。然而，如果增加钾离子的浓度并且降低钠离子的浓度，则可以保持原始培养基的张力。如本文所用，培养基的张力由钾浓度和NaCl浓度之和乘以2来定义。参见例如表2。
如本文所用，术语“钾”、“钾离子”、“钾阳离子”和“K+”可互换使用以指代元素钾。元素钾作为阳离子存在于溶液中。然而，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是制备包含钾离子的溶液的标准方法包括将含钾的盐(例如KCl)稀释到溶液中。因此，可以将包含摩尔(M)浓度的钾离子的溶液(例如培养基)描述为包含等摩尔(M)浓度的含钾的盐。
如本文所用，术语“钠离子”和“钠阳离子”可互换使用以指代元素钠。元素钠作为一价阳离子存在于溶液中。然而，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是制备包含钠离子的溶液的标准方法包括将含钠的盐(例如NaCl)稀释到溶液中。因此，可以将包含摩尔(M)浓度的钠离子的溶液(例如培养基)描述为包含等摩尔(M)浓度的含钠的盐。
如本文所用，术语“钙离子”和“钙阳离子”可互换使用以指代元素钙。元素钙作为二价阳离子存在于溶液中。然而，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是制备包含钙离子的溶液的标准方法包括将含钙的盐(例如CaCl2)稀释到溶液中。因此，可以将包含摩尔(M)浓度的钙离子的溶液(例如培养基)描述为包含等摩尔(M)浓度的含钙的盐。
如本文所用，术语“基础”培养基是指补充有本文所公开的一种或多种另外的元素(例如钾、钠、钙、葡萄糖、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任何组合)的任何起始培养基。基础培养基可以是用于培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的任何培养基。在一些方面，基础培养基选自平衡盐溶液(例如PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、克里克氏培养基、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最低必需培养基(GMEM)、α最低必需培养基(αMEM)、伊可夫氏改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、M199、OPTMIZERTMCTSTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)、OPTMIZERTM完全培养基、IM MUNOCULTTMXF(STEMCELLTMTechnologies)、IMMUNOCULTTMXF、AIMVTM、TEXMACSTM培养基、TRANSACTTMTIL扩增培养基、TIL快速扩增方案培养基及它们的任何组合。在一些方面，基础培养基不含血清。在一些方面，基础培养基包含PRIME-XV T细胞CDM。在一些方面，基础培养基包含OPTMIZERTM。在一些方面，基础培养基包含OPTMIZERTM Pro。在一些方面，基础培养基包含X-VIVOTM 15(LONZA)。在一些方面，基础培养基包含IMMUNOCULTTM。在一些方面，基础培养基包括克里克氏培养基(Click's medium)。在一些方面，基础培养基包含TRANSACTTM TIL扩增培养基。在一些方面，基础培养基包含TIL快速扩增培养基。在一些方面，基础培养基还包含免疫细胞血清替代物(ICSR)。例如，在一些方面，基础培养基包含补充有ICSR的OPTMIZERTM完全培养基、补充有ICSR的AIM VTM、补充有ICSR的IMMUNOCULTTMXF、补充有ICSR的RPMI、补充有ICSR的TEXMACSTM或它们的任何组合。在一些方面，合适的基础培养基包括克里克氏培养基、OPTMIZERTM(CTSTM)培养基、T细胞扩增培养基(Sigma-Aldrich)、AI M VTM培养基(CTSTM)、TEXMACSTM培养基(MiltenyiBiotech)、IM/>培养基(Stem Cell Technologies)、/>T细胞扩增XSFM(Irvine Scientific)、伊可夫氏培养基和/或RPMI-1640培养基。在一些方面，基础培养基包含不含NaCl的CTSTMOPTMIZE RTM。在一些方面，合适的基础培养基包括克里克氏培养基、OPTIM IZERTM(CTSTM)培养基、/>T细胞扩增培养基(Sigma-Al drich)、AIM VTM培养基(CTSTM)、TEXMACSTM培养基(Miltenyi Biot ech)、/>培养基(Stem Cell Technologies)、/> T细胞扩增XSFM(Irvine Scientific)、伊可夫氏培养基和/或RPMI-1640培养基。在一些方面，基础培养基包含不含NaCl的CTSTMOPTIMIZERTM。在一些方面，除了添加以控制张力的NaCl(例如与钾离子组合添加的NaCl)之外，基础培养基还包含一种或多种钠盐。
如本文所用，术语“细胞因子”是指由细胞释放的对细胞之间的相互作用和通讯具有特定作用的小分泌蛋白。细胞因子的非限制性示例包括白介素(例如白介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15、IL-3、IL-5、IL-6、IL-11、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17、IL-21和IL-23)、干扰素(IFN；例如，IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)家族成员和转化生长因子(TGF)家族成员。本公开的某些方面涉及在包含细胞因子的培养基中培养细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的方法。本公开的一些方面涉及在包含细胞因子的培养基中扩增细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的方法。在一些方面，细胞因子是白介素。在一些方面，细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21及它们的任何组合。IL-2(UniProtKB–P60568)由T细胞响应于抗原或促有丝分裂刺激而产生。已知IL-2刺激T细胞增殖和其他对调节免疫应答至关重要的活性。IL-7(UniProtKB-P13232)是能够刺激淋巴祖细胞增殖的造血生长因子。据信IL-7在B细胞成熟的某些阶段期间的增殖中起作用。IL-15(UniProtKB-P40933)如IL-2一样是刺激T淋巴细胞增殖的细胞因子。IL-21(UniProtKB-Q9HBE4)是具有免疫调节活性的细胞因子。IL-21被认为促进在先天性免疫和适应性免疫之间的转换并且诱导B细胞中IgG1和IgG3的产生。IL-21还可以与IL-15协同在自然杀伤(NK)细胞的增殖和成熟中起作用，并且IL-21可以响应于活化刺激而调节成熟B细胞和T细胞的增殖。与IL-15和IL-18协同作用，IL-15还刺激T细胞和NK细胞中干扰素γ的产生，并且IL-21还可以抑制在T细胞介导的免疫应答期间树突细胞的活化和成熟。
如本文所用，术语“高钾”，例如“高钾培养基”，是指具有增加的钾浓度的培养基。在一些方面，高钾培养基包含浓度为至少5mM的钾离子。在一些方面，高钾培养基包含浓度高于40mM的钾离子。在一些方面，高钾培养基的钾离子浓度为至少约10mM、至少约15mM、至少约20mM、至少约25mM、至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM、至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。如本文所用，术语“代谢重编程培养基”、“代谢重编程培养基”或“MRM”是指本公开的高钾培养基。在某些方面，代谢重编程培养基包含约40mM至约80mM NaCl、约40mM至约90mM KCl、约0.5mM至约2.8mM钙以及约10mM至约24mM葡萄糖。在一些方面，代谢重编程培养基还具有约250mOsmol至约340mOsmol的渗透压摩尔浓度。
如本文所用，术语“高于”意指大于但不等于。例如，“高于4mM”意指大于4mM但不包括4mM的任何量。
如本文所用，术语“优先”是指主要结果。例如，如果本文所公开的方法优先促进CD8+TIL的扩增，则应理解扩增的主要产物是CD8+TIL。术语“优先”不一定意味着例如100％的所得TIL是CD8+，而是该术语暗示CD8+TIL比CD8-TIL扩增到更大的程度。
如本文所用，“施用”是指使用各种方法和递送系统中的任一种向受试者物理引入治疗剂或包含治疗剂的组合物。本文所述的治疗剂(例如如本文所述培养的T细胞、NK细胞和/或TIL)的不同施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。
如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病变内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、气管内、肺、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、心室内、玻璃体内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。
另选地，本文所述的治疗剂(例如如本文所述培养的T细胞、NK细胞和/或TIL)可经由非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。施用还可以例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长时间段内进行。
如本文所用，术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质，诸如蛋白质、肽或半抗原。如本文所用，术语“同源抗原”是指免疫细胞(例如T细胞)识别并由此诱导免疫细胞活化(例如触发诱导效应子功能(诸如细胞因子产生)和/或细胞增殖的细胞内信号)的抗原。
“癌症”是指特征在于体内异常细胞不受控制地生长的各种各样的疾病。不受调控的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入邻近组织，并且还可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远侧部分。如本文所用，“癌症”是指原发性、转移性和复发性癌症。
术语“血液恶性肿瘤”或“血液癌症”是指哺乳动物的造血组织和淋巴组织癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤的非限制性示例包括影响血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织的那些，包括急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CIVIL)、急性单核细胞白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。血液恶性肿瘤也被称为“液体肿瘤”。液体肿瘤癌症包括但不限于白血病、骨髓瘤和淋巴瘤以及其他血液恶性肿瘤。从液体肿瘤获得的TIL在本文中也可称为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
如本文所用的“实体瘤”是指异常的组织块。实体瘤可以是良性的或恶性的。实体瘤的非限制性示例包括肉瘤、癌和淋巴瘤，诸如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织区室，所述组织区室包括实质(癌细胞)和癌细胞分散在其中并且可以提供支持微环境的支持基质细胞。
在一些方面，癌症选自肾上腺皮质癌、晚期癌、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移瘤、脑瘤、脑癌、乳腺癌、儿童癌症、原发灶不明的癌症、卡斯尔曼病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、尤因家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾细胞癌、喉癌和下咽癌，急性淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓样白血病、慢性粒单核细胞性白血病、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻窦癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、基底细胞和鳞状细胞皮肤癌、黑素瘤、小肠癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、肾母细胞瘤和由癌症治疗引起的继发性癌症。在一些方面，癌症选自软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、艾伯内西氏肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肪肉瘤(adipose sarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、肺泡软部肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、维尔姆斯瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特发性多色素出血性肉瘤、B细胞成免疫细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞成免疫细胞肉瘤、詹森氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西氏肉瘤、库弗细胞(Kupffer cell)肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨周肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、或毛细血管扩张性肉瘤(telangiectalticsarcoma)。在一些方面，癌症选自肢端雀斑状黑素瘤、无黑色素性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、Cloudman黑素瘤、S91黑素瘤、Harding-Passey黑素瘤、幼年黑素瘤、恶性雀斑痣样黑素瘤、恶性黑素瘤、转移性黑素瘤、结节性黑素瘤、甲黑素瘤(subungal melanoma)或浅表扩散性黑素瘤。在一些方面，癌症选自腺泡癌(acinar carcinoma/acinous carcinoma)、囊性腺样癌、腺样囊性癌、腺癌(carcinoma adenomatosum)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma/carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管源性癌、脑回状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶质癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、胸廓癌、皮肤癌、柱状细胞癌(cylindrical carcinoma/cylindrical cell carcinoma)、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎性癌、脑样癌、表皮样癌(epiermoid carcinoma)、上皮腺样癌、外生性癌、溃疡性癌、纤维癌、胶状癌(gelatiniform carcinoma/gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma/carcinoma gigantocellulare)、腺体癌、颗粒细胞癌、毛发基质癌、血样癌、肝细胞癌、许特尔细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明癌、hypemephroid癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher氏癌、库尔契茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma/carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare/medullary carcinoma)、黑色素癌、软癌(carcinomamolle)、粘液癌(mucinous carcinoma/carcinoma muciparum)、粘液细胞癌、粘液上皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum/mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌、骨质癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、粉刺癌、肾的肾细胞肾癌、贮备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏癌(schneiderian carcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、软癌(carcinoma spongiosum)、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、毛细血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum/carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinomatuberosum/tuberous carcinoma)、疣状癌或绒毛状癌(carcinoma viflosum)。在一些方面，癌症选自白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、恶变前皮肤病灶、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、成神经细胞瘤、神经内分泌癌、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、前列腺癌、米勒癌(Müllerian cancer)、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或子宫乳头状浆液性癌。
如本文所用，术语“免疫应答”是指脊椎动物内针对外来剂的生物学应答，所述应答保护生物体免受这些剂和由它们引起的疾病的影响。免疫应答是由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或中性粒细胞)和由这些细胞中的任一种或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，所述免疫应答导致选择性靶向、结合、损伤、破坏侵入病原体、感染了病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞或者(在自身免疫或病理性炎症的情况下)正常的人细胞或组织和/或将它们从脊椎动物体内消除。免疫反应包括，例如T细胞(例如效应T细胞或Th细胞，诸如CD4+或CD8+T细胞(例如TIL))的活化或抑制，或Treg细胞的抑制。如本文所用，术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的，并且是指由胸腺产生或加工的任何淋巴细胞。在一些方面，T细胞是CD4+ T细胞。在一些方面，T细胞是CD8+ T细胞。在一些方面，T细胞是NKT细胞。在一些方面，免疫细胞是TIL。在一些方面，TIL是CD4+TIL。在一些方面，TIL是CD8+TIL。
如本文所用，术语“抗肿瘤免疫应答”是指针对肿瘤抗原的免疫应答。
“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物(诸如非人灵长类动物、绵羊、狗)和啮齿动物(诸如小鼠、大鼠和豚鼠)。在一些方面，受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。如本文所用，短语“有需要的受试者”包括将受益于例如施用如本文所述培养的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)以控制肿瘤生长的受试者，诸如哺乳动物受试者。
术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指提供所需生物、治疗和/或预防结果的剂(例如如本文所述培养的T细胞NK细胞和/或TIL)的量。结果可以是疾病的一种或多种体征、症状或病因的减少、改善、缓和、减轻、延迟和/或缓解，或者生物系统的任何其他所需的改变。关于实体瘤，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(诸如抑制肿瘤生长)或者预防或延迟其他不需要的细胞增殖的量。在一些方面，有效量是足以延迟肿瘤发展的量。在一些方面，有效量是足以预防或延迟肿瘤复发的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。
组合物(例如，如本文所述培养的细胞)的有效量可以例如(i)减少癌细胞的数量；(ii)缩小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延迟、减缓、并且可能停止癌细胞浸润到周围器官中；(iv)抑制(即在一定程度上减缓并且可能停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)防止或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解一种或多种与癌症相关的症状。
在一些方面，“治疗有效量”是本文所公开的组合物(例如，如本文所述培养的T细胞)在临床上证明可实现癌症的显著减少或癌症(诸如晚期实体瘤)的进展减缓(消退)的量。本公开的治疗剂(例如，如本文所述培养的T细胞)促进疾病消退的能力可以使用技术人员已知的多种方法(诸如在临床试验期间在人受试者中、在预测在人中的功效的动物模型系统中或通过在体外测定中测定剂的活性)来评估。
关于治疗的术语“有效的”和“有效性”包括药理学有效性和生理学安全性两者。药理学有效性是指本文所公开的组合物(例如，如本文所述培养的细胞)促进患者中的癌症消退的能力。生理学安全性是指由施用本文所公开的组合物(例如，如本文所述培养的细胞)引起的毒性水平或其他在细胞、器官和/或生物体水平上的不良生理作用(不良作用)。
如本文所用的术语“嵌合抗原受体”和“CAR”是指具有与细胞内结构域偶联的抗原特异性细胞外结构域的重组融合蛋白，所述细胞内结构域指导细胞在抗原与细胞外结构域结合后执行特化功能。在一些方面，本文所公开的嵌合抗原受体包含本公开的嵌合多肽。
术语“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”和“嵌合免疫受体”在本文中各自可与术语“嵌合抗原受体”互换使用。嵌合抗原受体与其他抗原结合剂的区别在于它们既能结合MHC非依赖性抗原，又能通过其细胞内结构域转导活化信号。
嵌合抗原受体的抗原特异性细胞外结构域识别并特异性地结合抗原，通常是恶性肿瘤的表面表达抗原。当抗原特异性细胞外结构域例如以在约0.1pM至约10μM之间(例如约0.1pM至约1μM或约0.1pM至约100nM)的亲和力常数或相互作用亲和力(KD)结合抗原时，其特异性地结合抗原。用于确定相互作用的亲和力的方法是本领域已知的。适用于本公开的CAR的抗原特异性细胞外结构域可以是任何抗原结合多肽，广泛多种所述多肽在本领域中是已知的。在一些方面，抗原结合结构域是单链Fv(scFv)。其他基于抗体的识别结构域诸如cAb VHH(骆驼科动物抗体可变结构域)及其人源化形式、IgNAR VH(鲨鱼抗体可变结构域)及其人源化形式、sdAb VH(单结构域抗体可变结构域)和“骆驼化”抗体可变结构域也适用于本公开的CAR。在一些方面，基于T细胞受体(TCR)的识别结构域诸如单链TCR(scTv，即含有VαVβ的单链双结构域TCR)也适用于本公开的TCR。
如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指由2条不同的跨膜多肽链(即α链和β链)构成的异二聚体，每条链由将链锚定在T细胞表面膜内的恒定区和识别并结合由MHC呈递的抗原的可变区组成。TCR复合物与形成2种异二聚体CD3γε和CD3δε以及1种同二聚体CD3ζ的6种多肽缔合，它们一起形成CD3复合物。T细胞受体工程化的T细胞疗法利用保留这些复合物的T细胞的修饰来特异性地靶向由特定肿瘤细胞表达的抗原。如本文所用，术语“TCR”包括天然存在的TCR和工程化的TCR。
如本文所用，“工程化的TCR”或“工程化的T细胞受体”是指经工程化以所需亲和力与主要组织相容性复合物(MHC)/肽靶抗原特异性地结合的T细胞受体(TCR)，该主要组织相容性复合物/肽靶抗原被选择、克隆和/或随后引入免疫细胞群(例如，T细胞和/或NK细胞)中。
“TCR模拟物”或“TCRm”是指识别包含肽和MHC-I分子两者的表位的一类抗体，所述识别类似于T细胞上TCR对此类复合物的识别。
如本文所用，术语“转导效率”是指：(i)可在限定的时间段内被物理引入细胞的材料(例如，外源多核苷酸)的量；(ii)将给定量的材料物理引入细胞所花费的时间量；(iii)细胞群所摄取的靶材料(例如外源多核苷酸，即转基因)的水平(例如表达转基因的细胞的百分比)；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，通过增加转导效率，本文提供的培养方法可允许将更大量的外源核苷酸序列引入细胞和/或减少引入给定量的外源核苷酸序列所需的时间量。不受任何一种理论的束缚，在一些方面，此类作用可增加经修饰的免疫细胞中所编码的蛋白质(例如c-Jun多肽)的表达。如本文所用，术语“ug”和“uM”可分别与“μg”和“μΜ”互换使用。
本文所述的各个方面更详细描述于以下小节中。
II.本公开的方法
本公开涉及离体或体外培养细胞的方法。在一些方面，本公开的方法包括在培养条件下培养或放置细胞，例如多能细胞、多潜能细胞或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)，其中培养物(例如，某些离子浓度、培养基的张力、细胞因子和/或它们的任何组合)能够减少、限制或防止细胞的分化，从而影响或改善它们在细胞疗法中的用途。
在一些方面，本公开的方法包括在培养条件下培养或放置免疫细胞(例如TIL)，其中培养物(例如某些离子浓度、培养基的张力、细胞因子和或它们的任何组合)能够增强CD8+TIL的扩增。在一些方面，培养物(例如，某些离子浓度、培养基的张力、细胞因子和或它们的任何组合)能够限制或防止TIL(例如，CD8+TIL和/或CD4+TIL)的分化，从而影响或改善它们在细胞疗法中的用途。在一些方面，本公开包括在高钾浓度的代谢重编程培养基中培养TIL。
在一些方面，在本文所公开的代谢重编程培养基(MRM)中培养细胞，例如免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，与使用常规方法(例如在具有小于5mM钾离子的培养基中)培养的细胞相比，在MRM中培养的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)具有更高比例的干样细胞。在一些方面，与使用常规方法(例如在具有小于5mM钾离子的培养基中)培养的细胞相比，在MRM中培养的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)具有更高比例的效应子样细胞。在一些方面，与使用常规方法(例如在具有小于5mM钾离子的培养基中)培养的细胞相比，在MRM中培养的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)具有更高比例的干样细胞和效应子样细胞两者。在一些方面，与使用常规方法(例如在具有小于5mM钾离子的培养基中)培养的细胞相比，在MRM中培养的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)具有更高的增殖潜力。
本公开的一些方面涉及制备免疫细胞群(例如，T细胞和/或NK细胞)的方法，该方法包括在包含浓度高于5mM的钾离子的培养基(例如，本文所公开的代谢重编程培养基)中培养细胞。本公开的一些方面涉及制备T细胞群的方法，该方法包括在包含浓度高于5mM的钾离子的培养基(例如，本文所公开的代谢重编程培养基)中培养T细胞。在一些方面，本公开提供了制备免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的方法，该方法包括在包含浓度高于5mM(例如高于40mM，例如在55mM和70mM之间)的钾离子的培养基中培养细胞，该培养基能够保留所培养的细胞的干样表型(例如，最小分化)。在一些方面，本公开提供了制备T细胞的方法，该方法包括在包含浓度高于5mM(例如高于40mM，例如在55mM和70mM之间)的钾离子的培养基中培养T细胞，该培养基能够保留所培养的T细胞的干样表型(例如，最小分化)。在一些方面，所培养的细胞具有比在具有较低钾浓度的培养基中生长的细胞更多的干样表型(例如，较低分化)。
细胞培养基用于体外扩增细胞产物，所述细胞产物用于扩增和活化用于治疗各种疾病的细胞。最迫切的未满足的需要之一是扩增可用于疗法的细胞，例如可以破坏癌细胞的细胞。转移性实体瘤仅在美国就造成>500,000人死亡。已知T淋巴细胞能够在其他可用治疗无效的设置下杀死肿瘤。例如，手术、化学疗法、放射疗法和‘靶向’或小分子疗法对许多常见类型的转移性癌症诸如结肠、乳腺、肺、胰腺、前列腺、胆管和其他组织学的那些癌症无效。基于细胞的癌症免疫疗法可以代表这些组织学中的治愈性疗法。
细胞免疫疗法的功效取决于在体内的持久性、多能性和不对称细胞分裂(T细胞干性的表型特征)。用于培养和/或工程化治疗性细胞的培养基可以深刻地影响细胞的代谢、表观遗传和表型属性。目前使用的培养基的配方已经在大约40年没有经历过显著的变化(参见Moore等人,JAMA 199(8):519–24(1967)，其以引用的方式整体并入本文)。然而，本文所公开的强有力的临床前数据证明，在离体操作期间，离子(尤其是钾(K+))、营养素和/或细胞因子的浓度可以显著影响T细胞的多能性。该效应是多因素的，并且取决于治疗细胞的靶标、肿瘤微环境中的细胞功能和转移前治疗细胞的质量。本文公开了例如在过继转移之前促进抗肿瘤细胞干性的策略。
在一些方面，本公开的方法包括在包含浓度为至少约5mM的钾离子的培养基中放置、生长或培养细胞(例如免疫细胞，例如T细胞和/或NK细胞)，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为至少约50mM。在一些方面，本公开的方法包括在包含浓度高于约40mM的钾离子的培养基中放置、生长或培养细胞(例如，T细胞)，其中培养基是低渗的或等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为至少约50mM。在一些方面，本公开的方法包括在包含浓度为至少约50mM的钾离子的培养基中放置、生长或培养细胞(例如，T细胞)，其中培养基是低渗的或等渗的。本公开的一些方面涉及制备表达嵌合抗原受体(CAR)或TCR的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)群的方法，该方法包括将细胞置于包含浓度为至少约5mM的钾离子的培养基中，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为至少约50mM。本公开的一些方面涉及制备表达嵌合抗原受体(CAR)或TCR的免疫细胞(例如T细胞、NK细胞和/或TIL)群的方法，所述方法包括将细胞置于包含浓度为至少约5mM的钾离子的培养基中，其中培养基不是高渗的，例如其中培养基是低渗的或等渗的。本公开的一些方面涉及制备表达嵌合抗原受体(CAR)或TCR的免疫细胞(例如T细胞、NK细胞和/或TIL)群的方法，所述方法包括将细胞置于包含浓度为至少约50mM的钾离子的培养基中。在一些方面，培养基是低渗的或等渗的。可以通过添加足够量的钾盐来制备培养基。可以通过相对于钾离子的浓度控制培养基中NaCl的浓度来改变培养基的张力。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，本公开还提供了在具有高浓度钾离子(例如高于约5mM，例如高于40mM，例如在55mM和70mM之间)但等渗或低渗的培养基中生长的细胞，例如多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)，这些细胞能够比在高渗培养基中生长的细胞保留更多的最小分化的干样表型。因此，在一些方面，培养基在添加钾盐后不是高渗的。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在某些方面，培养基还包含白介素(IL)-2、IL-21、IL-7、IL-15或它们的任何组合。在一些方面，培养基还包含钠离子(例如NaCl)、钙离子、葡萄糖或它们的任何组合。
在某些方面，相对于使用常规方法(例如在具有小于5mM钾离子的培养基中或在高渗条件下)培养的细胞群，使用本文所公开的方法培养的细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))群表现出增加的干样细胞数量。在一些方面，细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))相对于起始细胞群表现出干样细胞特征性标志物的表达增加。在一些方面，起始细胞群包含从人受试者获得的细胞。在一些方面，起始细胞群包含从人受试者获得的T细胞。在一些方面，起始T细胞群包含TN细胞、TSCM细胞、TCM细胞、TEM细胞或它们的任何组合。
在一些方面，相对于使用常规方法(例如，在具有小于5mM钾离子的培养基中)培养的细胞群，使用本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)群表现出增加的干样细胞数量。在一些方面，相对于使用常规方法(例如，在具有小于5mM钾离子的培养基中)培养的T细胞群，使用本文所公开的方法培养的T细胞群表现出增加的干样T细胞数量。在一些方面，相对于起始免疫细胞群(即，在培养之前)，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)表现出干样细胞特征性标志物的表达增加。在一些方面，相对于起始T细胞群(即，在培养之前)，T细胞表现出干样细胞特征性标志物的表达增加。在一些方面，起始免疫细胞群包括从人受试者获得的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，起始免疫细胞群包括从人受试者获得的T细胞。在一些方面，起始免疫T细胞群包括TN细胞、TSCM细胞、TCM细胞、TEM细胞或它们的任何组合。在一些方面，起始免疫细胞群包括用编码如本文所述的配体结合蛋白的构建体转染前的T细胞。
可以使用本领域已知的任何方法测量增加的细胞多能性。在某些方面，通过抗体染色随后通过门控流式细胞术测量细胞干性。在一些方面，通过自噬通量测量细胞干性。在一些方面，通过葡萄糖摄取测量细胞干性。在一些方面，通过脂肪酸摄取测量细胞干性。在一些方面，通过线粒体生物量测量细胞干性。在一些方面，通过RNA定量/表达分析(例如，微阵列、qPCR(taqman)、RNA-Seq.、单细胞RNA-Seq.或它们的任何组合)测量细胞干性。在一些方面，通过代谢测定(例如，海马代谢测定、细胞外酸化率(ECAR)分析；耗氧率(OCR)分析；备用呼吸容量分析；和/或线粒体膜电位分析)(例如，与之相关的转录物)测量细胞干性。在一些方面，使用一种或多种体内功能测定法(例如，测定细胞持久性、抗肿瘤能力、抗肿瘤清除率、病毒清除率、多能性、细胞因子释放、细胞杀伤或它们的任何组合)测量干性。
在一些方面，细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL)))的分化状态的特征在于表达较低分化细胞的典型标志物的细胞数量增加。在一些方面，细胞(例如T细胞)的分化状态的特征在于表达较低分化细胞(例如T细胞)的典型标志物的细胞数量增加。在一些方面，干样细胞数量的增加的特征在于表达TN和/或TSCM细胞典型标志物的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))数量的增加。在某些方面，干样免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))数量的增加的特征在于表达TSCM细胞典型标志物的细胞数量的增加。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))群表现出表达CD45RA的细胞数量的增加。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))群表现出表达CCR7的细胞数量的增加。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))群表现出表达CD62L的细胞数量的增加。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))群表现出表达CD28的细胞数量的增加。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))表现出表达CD95的细胞数量的增加。在一些方面，细胞是CD45RO低的。在一些方面，细胞不表达CD45R0。在一些方面，细胞群表现出D45RA+、CCR7+和CD62L+的细胞数量的增加。在一些方面，细胞群表现出CD95+、CD45RA+、CCR7+和CD62L+的细胞数量的增加。在一些方面，细胞群表现出表达TCF7的细胞数量的增加。在一些方面，细胞群表现出CD45RA+、CCR7+、CD62L+和TCF7+的细胞数量的增加。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))群表现出CD95+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+和TCF7+的细胞数量的增加。在一些方面，细胞表达CD3。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))群表现出CD3+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+和TCF7+的细胞数量的增加。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))群表现出CD3+、CD95+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+和TCF7+的细胞数量的增加。在一些方面，细胞表达CD27。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))群表现出CD27+、CD3+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+和TCF7+的细胞数量的增加。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞(例如CD8+TIL，例如肿瘤反应性CD8+TIL))群表现出CD27+、CD3+、CD95+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+和TCF7+的细胞数量的增加。在一些方面，细胞群表现出TSCM细胞数量的增加。在一些方面，细胞群表现出TN细胞数量的增加。在一些方面，细胞群表现出TSCM和TN细胞数量的增加。在一些方面，细胞群表现出干样T细胞数量的增加。在一些方面，T细胞是CD4+细胞。在一些方面，T细胞是CD8+细胞。
在一些方面，培养物中的干样细胞的数量相对于(例如用MRM)培养前的干样细胞的数量增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约100％。在一些方面，培养物中的干样细胞的数量相对于(例如用MRM)培养前的干样细胞的数量增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、或至少约20倍。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，干样T细胞占培养物中CD8+T细胞总数的至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％或至少约15％。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，干样T细胞占培养物中CD4+T细胞总数的至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，干样T细胞占培养物中T细胞总数的至少约10％至至少约70％。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，干样T细胞占培养物中CD8+T细胞总数的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约70％。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，干样T细胞占培养物中CD4+T细胞总数的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约70％。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，培养物中T细胞总数的至少约10％至至少约40％是CD39-/CD69-T细胞。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，培养物中T细胞总数的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％或至少约40％是CD39-/CD69-T细胞。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，培养物中T细胞总数的至少约10％至至少约70％是CD39-/TCF7+T细胞。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，培养物中T细胞总数的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％或至少约40％是CD39-/TCF7+T细胞。在一些方面，T细胞是CD4+T细胞。在一些方面，T细胞是CD8+T细胞。
在一些方面，根据本文所公开的方法培养的细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))表现出增加的转导效率。在一些方面，与使用常规方法(例如在含有小于5mM K+的培养基中)类似转导和培养的细胞相比，转导后更大百分比的细胞表达例如编码CAR、TCR或TCRm的靶转基因，其中根据本文所公开的方法培养细胞。在某些方面，使用病毒载体转导细胞，例如多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，病毒载体包括AAV。在一些方面，病毒载体包括逆转录病毒。在一些方面，病毒载体包括慢病毒。在某些方面，与使用常规方法培养的类似地转导的细胞相比，更大百分比的根据本文所公开的方法培养的细胞在慢病毒转导细胞后表达CAR或TCR。在一些方面，转导效率相对于使用常规方法培养的类似地转导的细胞增加了至少1.5倍。在一些方面，转导效率相对于使用常规方法培养的类似地转导的细胞增加了至少2倍。
在一些方面，细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))在根据本文所公开的方法培养之前被转导。在一些方面，细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))在根据本文所公开的方法培养之后被转导。在一些方面，在转导之前、期间和之后，根据本文所公开的方法(例如在包含至少50mM钾离子的低渗或等渗培养基中)培养细胞，例如多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。
在某些方面，使用病毒载体转导细胞(例如免疫细胞)。在一些方面，载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体和爱泼斯坦-巴尔病毒载体。在一些方面，病毒载体包括逆转录病毒。在一些方面，病毒载体包括慢病毒。在一些方面，病毒载体包括AAV。
在一些方面，使用非病毒方法转导细胞(例如免疫细胞)。在一些方面，非病毒方法包括使用转座子。在一些方面，使用非病毒递送方法允许重新编程细胞(例如免疫细胞，例如，T细胞和/或NK细胞)，并将细胞直接输注到受试者中。在一些方面，可通过使用CRISPR/Cas系统和基因组编辑替代物诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)和大范围核酸酶(MN)将多核苷酸插入靶细胞(例如T细胞)或宿主细胞(例如用于重组表达所编码蛋白质的细胞)的基因组中。
在某些方面，在过继转移根据本文所公开的方法培养的细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)时，与使用常规培养条件(例如在含有小于5mM K+的培养基中)培养的细胞相比，转移的细胞表现出减少的细胞耗竭。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养的任选地表达配体结合蛋白的T细胞过继转移后，与使用常规方法(例如在含有小于5mM K+的培养基中)培养的T细胞相比，转移的T细胞表现出减少的细胞耗竭。在某些方面，在过继转移所培养的细胞时，与使用常规培养条件(例如在含有小于5mM K+的培养基中)培养的细胞相比，转移的细胞在体内持续更长的时间段。在一些方面，与使用常规培养条件(例如在含有小于5mMK+的培养基中)培养的细胞相比，转移的细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)具有更大的体内功效，例如肿瘤杀伤活性。在一些方面，与使用常规培养条件(例如在含有小于5mM K+的培养基中)培养的细胞相比，在受试者中需要较低剂量的根据本文所公开的方法培养的细胞来引发应答，例如减小肿瘤体积。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养免疫细胞(例如TIL(例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+ TIL)))后，干样CD8+TIL(例如干样肿瘤反应性CD8+ TIL)占培养物中CD8+TIL总数的至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％。
在一些方面，在过继转移根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如TIL(例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+ TIL)))后，与使用常规培养条件培养的细胞相比，转移的细胞表现出减少的细胞耗竭。在一些方面，在过继转移所培养的TIL时，与使用常规培养条件培养的TIL相比，转移的CD8+富集TIL在体内持续更长的时间段。在一些方面，与使用常规培养条件培养的TIL相比，转移的CD8+富集TIL具有更大的体内功效，例如肿瘤杀伤活性。在一些方面，与使用常规培养条件培养的细胞相比，在受试者中需要较低剂量的根据本文所公开的方法培养的CD8+富集TIL来引发应答，例如减小肿瘤体积。
在一些方面，在代谢重编程培养基(例如本文所公开的高钾培养基)中培养TIL用于整个离体培养，例如从肿瘤样品首次铺板时起经过整个扩增过程，并且直至施用。在一些方面，在本文所公开的培养基中培养TIL达扩增的持续时间。
在一些方面，在从受试者分离后立即根据本文所公开的方法(例如在包含至少5mM钾离子的培养基中)培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，根据本文所公开的方法在细胞扩增期间培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，根据本文所公开的方法在细胞的工程化期间(例如在用编码转基因的构建体(例如配体结合蛋白)转导期间)培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，根据本文所公开的方法在细胞工程化后(例如在用编码转基因的构建体(例如配体结合蛋白)转导后)培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，根据本文所公开的方法在整个扩增和工程化过程中培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，根据本文所公开的方法在整个病毒基因工程化过程中培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，根据本文所公开的方法在整个非病毒基因工程化过程中培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，在将配体结合蛋白引入免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)以允许肿瘤特异性靶向(例如CAR、TCR或TCR模拟物)期间根据本文所公开的方法培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，根据本文所公开的方法在引入改善T细胞功能的一种或多种内源基因的整个过程中培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，根据本文所公开的方法在引入改善T细胞功能的一种或多种合成基因的整个过程中培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。
在一些方面，根据本文所公开的方法(例如在包含至少5mM钾离子的培养基中)培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)，用于整个离体培养，例如从免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)从受试者分离时起经过生长、扩增、工程化，并且直至施用到需要过继细胞疗法的受试者中。在一些方面，根据本文所公开的方法(例如在包含至少5mM钾离子的培养基中)培养T细胞，用于整个离体培养，例如从T细胞从受试者分离时起经过生长、扩增、工程化，并且直至施用到需要过继细胞疗法的受试者中。在一些方面，根据本文所公开的方法培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)达扩增的持续时间。在一些方面，根据本文所公开的方法培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)，直至活免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的总数为至少约104、至少约5x104、至少约105、至少约5x105、至少约106、或至少约5x106、至少约1x107、至少约5x107、至少约1x108、至少约5x108、至少约1x109、至少约5x109、至少约1x1010、至少约5x1010、至少约1x1011、至少约5x1011、至少约1x1012、或至少约5x1012个总细胞。在一些方面，根据本文所公开的方法培养T细胞，直至活T细胞的总数为至少约104、至少约5x104、至少约105、至少约5x105、至少约106、或至少约5x106、至少约1x107、至少约5x107、至少约1x108、至少约5x108、至少约1x109、至少约5x109、至少约1x1010、至少约5x1010、至少约1x1011、至少约5x1011、至少约1x1012、或至少约5x1012个总T细胞。
在一些方面，代谢重编程培养基(例如高钾培养基)包含线粒体燃料。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高钾培养基)包含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高钾培养基)包含至少约0.1mM、至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约5mM、或至少约10mM的O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高钾培养基)包含至少约1.0mM O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐。
在一些方面，代谢重编程培养基(例如高钾培养基)包含糖酵解介导的代谢的抑制剂，例如激酶抑制剂，例如磷酸肌醇3-激酶抑制剂。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高钾培养基)包含磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂，例如艾德利西布(idelalisib)(例如CAL-101；Selleckchem)。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高钾培养基)包含至少约0.1mM、至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约5mM、或至少约10mM艾德利西布。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高钾培养基)包含至少约1.0mM艾德利西布。
在一些方面，代谢重编程培养基(例如高钾培养基)还包含(i)一种或多种细胞扩增剂、(ii)钠离子、(iii)一种或多种糖、(iv)钙离子和(v)一种或多种细胞因子中的一种或多种。
II.A.钾
本公开的一些方面涉及在包含相对于常规免疫细胞培养基浓度增加的钾离子(例如大于约5mM、大于约40mM、大于约45mM、大于约50mM、大于约55mM、大于约60mM、大于约65mM、大于约70mM)的培养基中培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，其中该高钾培养基是低渗的或等渗的。本公开部分地基于以下发现：培养基的张力与钾离子的水平组合产生用于促进干性同时仍保持功效的理想环境。
本公开的一些方面涉及在离体或体外培养期间增加人免疫细胞和/或干细胞的产量同时增加人免疫细胞和/或干细胞的干性(stemness)的方法，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在30mM和100mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞和/或干细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110和140mM之间。本公开的一些方面涉及制备用于免疫疗法的人免疫细胞和/或干细胞群的方法，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在30mM和100mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞和/或干细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110和140mM之间。本公开的一些方面涉及在针对免疫疗法离体或体外培养期间增加人免疫细胞的干性的方法，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在30mM和100mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110和140mM之间。
本公开的一些方面涉及在包含浓度为至少约5mM的钾离子的培养基中培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，其中培养基是低渗的。本公开的一些方面涉及在包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法。本公开的一些方面涉及在包含浓度为至少约50mM的钾离子的培养基中培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法。本公开的一些方面涉及在包含浓度为至少约50mM的钾离子的培养基中培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，在从受试者分离后立即将细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)在本文所公开的培养基(例如，包含浓度为至少约50mM的钾离子)中培养。在一些方面，在扩增细胞期间，将细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)在本文所公开的培养基(例如，包含浓度为至少约50mM的钾离子)中培养。在一些方面，在工程化细胞期间，例如在用编码CAR或TCR的构建体转导期间，将细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)在从受试者分离后立即在本文所公开的培养基(例如，包含浓度为至少约50mM的钾离子)中培养。在一些方面，在工程化细胞后，例如在用编码CAR或TCR的构建体转导后，将细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)在本文所公开的培养基(例如，包含浓度为至少约50mM的钾离子)中培养。在一些方面，在整个扩增和工程化中，将细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)在本文所公开的培养基(例如，包含浓度为至少约50mM的钾离子)中培养。在某些方面，在整个病毒基因工程化中，将细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)在本文所公开的培养基(例如，包含浓度为至少约50mM的钾离子)中培养。在某些方面，在整个非病毒基因工程化中，将细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)在本文所公开的培养基(例如，包含浓度为至少约50mM的钾离子)中培养。在某些方面，在引入允许肿瘤特异性靶向的受体(例如，TCR、TCRm和/或CAR)期间，将细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)在本文所公开的培养基(例如，包含浓度为至少约50mM的钾离子)中培养。在某些方面，在引入改善T细胞功能的一种或多种内源基因的整个过程中，将细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)在本文所公开的培养基(例如，包含浓度为至少约50mM的钾离子)中培养。在某些方面，在引入改善T细胞功能的一种或多种合成基因的整个过程中，将细胞(例如，T细胞、NK细胞或TIL)在本文所公开的培养基(例如，包含浓度为至少约50mM的钾离子)中培养。
本公开的一些方面涉及离体或体外培养TIL的方法，该方法包括将TIL的异质群体置于代谢重编程培养基(例如高钾培养基)中。本公开的一些方面涉及离体或体外增加CD8+TIL的数量或百分比的方法，该方法包括在代谢重编程培养基(例如高钾培养基)中培养TIL的异质群体。本公开的其他方面涉及制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的CD8+富集群体的方法，该方法包括在代谢重编程培养基(例如高钾培养基)中离体或体外培养TIL的异质群体。在一些方面，钾离子的浓度为至少约30mM至至少约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM、至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、至少约75mM、至少约80mM、至少约85mM、至少约90mM、至少约95mM、或至少约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM至约90mM。
本公开的一些方面涉及在包含相对于对照培养基浓度增加的钾离子(例如大于约5mM、大于约40mM、大于约45mM、大于约50mM、大于约55mM、大于约60mM、大于约65mM或大于约70mM)的培养基(即本文所公开的代谢重编程培养基)中培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的方法。在一些方面，代谢重编程培养基包含至少约5mM至至少约100mM钾离子、至少约5mM至至少约90mM钾离子、至少约5mM至至少约80mM钾离子、至少约5mM至至少约75mM钾离子、至少约5mM至至少约70mM钾离子、至少约5mM至至少约65mM钾离子、至少约5mM至至少约60mM钾离子、至少约5mM至至少约55mM钾离子、至少约5mM至至少约50mM钾离子、至少约5mM至至少约45mM钾离子、至少约5mM至至少约40mM钾离子、至少约10mM至至少约80mM钾离子、至少约10mM至至少约75mM钾离子、至少约10mM至至少约70mM钾离子、至少约10mM至至少约65mM钾离子、至少约10mM至至少约60mM钾离子、至少约10mM至至少约55mM钾离子、至少约10mM至至少约50mM钾离子、至少约10mM至至少约45mM钾离子、至少约10mM至至少约40mM钾离子、至少约20mM至至少约80mM钾离子、至少约20mM至至少约75mM钾离子、至少约20mM至至少约70mM钾离子、至少约20mM至至少约65mM钾离子、至少约20mM至至少约60mM钾离子、至少约20mM至至少约55mM钾离子、至少约20mM至至少约50mM钾离子、至少约20mM至至少约45mM钾离子、至少约20mM至至少约40mM钾离子、至少约30mM至至少约80mM钾离子、至少约30mM至至少约75mM钾离子、至少约30mM至至少约70mM钾离子、至少约30mM至至少约65mM钾离子、至少约30mM至至少约60mM钾离子、至少约30mM至至少约55mM钾离子、至少约30mM至至少约50mM钾离子、至少约30mM至至少约45mM钾离子、至少约30mM至至少约40mM钾离子、至少约40mM至至少约80mM钾离子、至少约40mM至至少约75mM钾离子、至少约40mM至至少约70mM钾离子、至少约40mM至至少约65mM钾离子、至少约40mM至至少约60mM钾离子、至少约40mM至至少约55mM钾离子、至少约40mM至至少约50mM钾离子、至少约40mM至至少约45mM钾离子、至少约45mM至至少约80mM钾离子、至少约45mM至至少约75mM钾离子、至少约45mM至至少约70mM钾离子、至少约45mM至至少约65mM钾离子、至少约45mM至至少约60mM钾离子、至少约45mM至至少约55mM钾离子、至少约45mM至至少约50mM钾离子、至少约50mM至至少约80mM钾离子、至少约50mM至至少约75mM钾离子、至少约50mM至至少约70mM钾离子、至少约50mM至至少约65mM钾离子、至少约50mM至至少约60mM钾离子、或至少约50mM至至少约55mM钾离子。
在一些方面，钾离子的浓度为至少约5mM、至少约10mM、至少约15mM、至少约20mM、至少约25mM、至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM或至少约45mM。在一些方面，钾离子的浓度为至少约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM或约45mM。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM。在一些方面，钾离子的浓度为约45mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM。
在一些方面，钾离子的浓度为至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、至少约75mM、至少约80mM、至少约85mM、至少约90mM、至少约95mM、至少约100mM、至少约105mM、至少约110mM、至少约115mM、至少约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、约100mM、约105mM、约110mM、约115mM、约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约5mM至约100mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约5mM至约90mM、约5mM至约80mM、约5mM至约70mM、约5mM至约60mM或约5mM至约50mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约25mM至约100mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约25mM至约90mM、约25mM至约80mM、约25mM至约70mM、约25mM至约60mM或约25mM至约50mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM至约100mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM至约90mM、约40mM至约85mM、约40mM至约80mM、约40mM至约75mM、约40mM至约70mM、约40mM至约65mM、约40mM至约60mM、约40mM至约55mM或约40mM至约50mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约90mM、约50mM至约85mM、约50mM至约80mM、约50mM至约75mM、约50mM至约70mM、约50mM至约65mM、约50mM至约60mM或约50mM至约55mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约50mM钾离子和小于约90mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，代谢重编程培养基包含浓度在约40mM和约80mM之间的钾离子以及浓度在约30mM和约100mM之间的NaCl，其中钾离子和NaCl的总浓度在约110mM和约140mM之间。在一些方面，本公开的代谢重编程培养基中的钾离子浓度为约5mM至约100mM。在一些方面，本公开的代谢重编程培养基中的钾离子浓度为约5mM至约100mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，本公开的代谢重编程培养基中的钾离子浓度为约5mM至约90mM、约5mM至约80mM、约5mM至约70mM、约5mM至约60mM、或约5mM至约50mM。
在一些方面，本公开的代谢重编程培养基中的钾离子浓度为约25mM至约90mM、约25mM至约80mM、约25mM至约70mM、约25mM至约60mM、或约25mM至约50mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，本公开的代谢重编程培养基中的钾离子浓度为约40mM至约100mM。在一些方面，本公开的代谢重编程培养基中的钾离子浓度为约40mM至约100mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM至约90mM、约40mM至约85mM、约40mM至约80mM、约40mM至约75mM、约40mM至约70mM、约40mM至约65mM、约40mM至约60mM、约40mM至约55mM、或约40mM至约50mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约115mM、约50mM至约110mM、约50mM至约105mM、约50mM至约100mM、约50mM至约95mM、约50mM至约90mM、约50mM至约85mM、约50mM至约80mM、约50mM至约75mM、约50mM至约70mM、约50mM至约65mM、约50mM至约60mM、或约50mM至约55mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约50mM至约120mM钾离子和小于约90mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约55mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM至约115mM、约55mM至约110mM、约55mM至约105mM、约55mM至约100mM、约55mM至约95mM、约55mM至约90mM、约55mM至约85mM、约55mM至约80mM、约55mM至约75mM、约55mM至约70mM、约55mM至约65mM、或约55mM至约60mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约55mM至约120mM钾离子和小于约85mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约60mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM至约115mM、约60mM至约110mM、约60mM至约105mM、约60mM至约100mM、约60mM至约95mM、约60mM至约90mM、约60mM至约85mM、约60mM至约80mM、约60mM至约75mM、约60mM至约70mM、或约60mM至约65mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约60mM至约120mM钾离子和小于约80mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约65mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM至约115mM、约65mM至约110mM、约65mM至约105mM、约65mM至约100mM、约65mM至约95mM、约65mM至约90mM、约65mM至约85mM、约65mM至约80mM、约65mM至约75mM、或约65mM至约70mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约65mM至约120mM钾离子和小于约75mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约70mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM至约115mM、约70mM至约110mM、约70mM至约105mM、约70mM至约100mM、约70mM至约95mM、约70mM至约90mM、约70mM至约85mM、约70mM至约80mM、或约70mM至约75mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约70mM至约120mM钾离子和小于约70mM至约20mMNaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约75mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM至约115mM、约75mM至约110mM、约75mM至约105mM、约75mM至约100mM、约75mM至约95mM、约75mM至约90mM、约75mM至约85mM、或约75mM至约80mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约75mM至约120mM钾离子和小于约65mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约80mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM至约115mM、约80mM至约110mM、约80mM至约105mM、约80mM至约100mM、约80mM至约95mM、约80mM至约90mM、或约80mM至约85mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约80mM至约120mM钾离子和小于约60mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约85mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM至约115mM、约85mM至约110mM、约85mM至约105mM、约85mM至约100mM、约85mM至约95mM、或约85mM至约90mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约85mM至约120mM钾离子和小于约65mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约90mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM至约115mM、约90mM至约110mM、约90mM至约105mM、约90mM至约100mM、或约90mM至约95mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约90mM至约120mM钾离子和小于约50mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约95mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约95mM至约115mM、约95mM至约110mM、约95mM至约105mM、或约95mM至约100mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约95mM至约120mM钾离子和小于约55mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约100mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约100mM至约115mM、约100mM至约110mM、或约100mM至约105mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约100mM至约120mM钾离子和小于约50mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约105mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约105mM至约115mM、或约105mM至约110mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约105mM至约120mM钾离子和小于约35mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约110mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约110mM至约115mM。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基包含至少约110mM至约120mM钾离子和小于约30mM至约20mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM至约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM至约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM至约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM至约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM至约90mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约90mM，并且NaCl的浓度小于约90mM至约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约80mM，并且NaCl的浓度小于约90mM至约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM至约90mM，并且NaCl的浓度小于约90mM至约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM至约80mM，并且NaCl的浓度小于约80mM至约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM至约90mM，并且NaCl的浓度小于约70mM至约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM至约80mM，并且NaCl的浓度小于约70mM至约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM至约90mM，并且NaCl的浓度小于约60mM至约50mM。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约55mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM至约55mM，并且NaCl的浓度小于约90至约85。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM至约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM至约60mM，并且NaCl的浓度小于约85至约80。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM至约65mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM至约65mM，并且NaCl的浓度小于约80mM至约75mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM至约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM至约70mM，并且NaCl的浓度小于约75mM至约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM至约75mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM至约75mM，并且NaCl的浓度小于约70mM至约65mM。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM至约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM至约80mM，并且NaCl的浓度小于约65mM至约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM至约85mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM至约85mM，并且NaCl的浓度小于约60mM至约55mM。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM至约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM至约90mM，并且NaCl的浓度小于约55mM至约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM至约95mM。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM至约95mM，并且NaCl的浓度小于约50至约45。在一些方面，钾离子的浓度为约95mM至约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约95mM至约100mM，并且NaCl的浓度小于约45mM至约40mM。在一些方面，钾离子的浓度为约100mM至约105mM。在一些方面，钾离子的浓度为约100mM至约105mM，并且NaCl的浓度小于约40mM至约35mM。在一些方面，钾离子的浓度为约105mM至约110mM。在一些方面，钾离子的浓度为约105mM至约110mM，并且NaCl的浓度小于约35至约30。在一些方面，钾离子的浓度为约110mM至约115mM。在一些方面，钾离子的浓度为约110mM至约115mM，并且NaCl的浓度小于约30mM至约25mM。在一些方面，钾离子的浓度为约115mM至约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约115mM至约120mM，并且NaCl的浓度小于约25mM至约20mM。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在某些方面，钾离子的浓度为约40mM至约90mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约40mM至约80mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约40mM至约70mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约50mM至约90mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约50mM至约80mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约50mM至约70mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约55mM至约90mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约55mM至约80mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约55mM至约70mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约60mM至约90mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约60mM至约80mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约60mM至约70mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约65mM至约90mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约65mM至约80mM，其中培养基是低渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约65mM至约70mM，其中培养基是低渗的。
在某些方面，钾离子的浓度为约40mM至约90mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约40mM至约80mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约40mM至约70mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约50mM至约90mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约50mM至约80mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约50mM至约70mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约55mM至约90mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约55mM至约80mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约55mM至约70mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约60mM至约90mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约60mM至约80mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约60mM至约70mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约65mM至约90mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约65mM至约80mM，其中培养基是等渗的。在某些方面，钾离子的浓度为约65mM至约70mM，其中培养基是等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约4mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约4mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约5mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约5mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约6mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约6mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约7mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约7mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约8mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约8mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约9mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约9mM，其中培养基是低渗的或等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约10mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约10mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约11mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约11mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约12mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约12mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约13mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约13mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约14mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约14mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约15mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约15mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约16mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约16mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约17mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约17mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约18mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约18mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约19mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约19mM，其中培养基是低渗的或等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约20mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约20mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约21mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约21mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约22mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约22mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约23mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约23mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约24mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约24mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约25mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约25mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约26mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约26mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约27mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约27mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约28mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约28mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约29mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约29mM，其中培养基是低渗的或等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约30mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约30mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约31mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约31mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约32mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约32mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约33mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约33mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约34mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约34mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约35mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约35mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约36mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约36mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约37mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约37mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约38mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约38mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约39mM，其中培养基是低渗的或等渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约39mM，其中培养基是低渗的或等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约40mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约41mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约41mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约42mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约42mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约43mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约43mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约44mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约44mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约45mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约45mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约46mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约46mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约47mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约47mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约48mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约48mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度高于约49mM，其中培养基是低渗的。在一些方面，钾离子的浓度为约49mM，其中培养基是低渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约40mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约41mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约41mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约42mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约42mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约43mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约43mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约44mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约44mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约45mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约45mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约46mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约46mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约47mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约47mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约48mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约48mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约49mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约49mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约51mM。在一些方面，钾离子的浓度为约51mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约52mM。在一些方面，钾离子的浓度为约52mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约53mM。在一些方面，钾离子的浓度为约53mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约54mM。在一些方面，钾离子的浓度为约54mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约55mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约56mM。在一些方面，钾离子的浓度为约56mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约57mM。在一些方面，钾离子的浓度为约57mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约58mM。在一些方面，钾离子的浓度为约58mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约59mM。在一些方面，钾离子的浓度为约59mM。在某些方面，培养基是低渗的。在某些方面，培养基是等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约50mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约51mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约51mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约52mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约52mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约53mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约53mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约54mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约54mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约55mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约56mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约56mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约57mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约57mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约58mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约58mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约59mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约59mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约61mM。在一些方面，钾离子的浓度为约61mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约62mM。在一些方面，钾离子的浓度为约62mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约63mM。在一些方面，钾离子的浓度为约63mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约64mM。在一些方面，钾离子的浓度为约64mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约65mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约66mM。在一些方面，钾离子的浓度为约66mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约67mM。在一些方面，钾离子的浓度为约67mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约68mM。在一些方面，钾离子的浓度为约68mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约69mM。在一些方面，钾离子的浓度为约69mM。在某些方面，培养基是低渗的。在某些方面，培养基是等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约60mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约61mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约61mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约62mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约62mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约63mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约63mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约64mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约64mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约65mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约66mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约66mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约67mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约67mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约68mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约68mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约69mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约69mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约71mM。在一些方面，钾离子的浓度为约71mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约72mM。在一些方面，钾离子的浓度为约72mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约73mM。在一些方面，钾离子的浓度为约73mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约74mM。在一些方面，钾离子的浓度为约74mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约75mM。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约76mM。在一些方面，钾离子的浓度为约76mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约77mM。在一些方面，钾离子的浓度为约77mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约78mM。在一些方面，钾离子的浓度为约78mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约79mM。在一些方面，钾离子的浓度为约79mM。在某些方面，培养基是低渗的。在某些方面，培养基是等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约70mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约71mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约71mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约72mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约72mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约73mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约73mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约74mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约74mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约75mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约76mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约76mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约77mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约77mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约78mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约78mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约79mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约79mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约81mM。在一些方面，钾离子的浓度为约81mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约82mM。在一些方面，钾离子的浓度为约82mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约83mM。在一些方面，钾离子的浓度为约83mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约84mM。在一些方面，钾离子的浓度为约84mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约85mM。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约86mM。在一些方面，钾离子的浓度为约86mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约87mM。在一些方面，钾离子的浓度为约87mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约88mM。在一些方面，钾离子的浓度为约88mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约89mM。在一些方面，钾离子的浓度为约89mM。在某些方面，培养基是低渗的。在某些方面，培养基是等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约80mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约81mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约81mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约82mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约82mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约83mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约83mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约84mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约84mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约85mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约86mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约86mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约87mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约87mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约88mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约88mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约89mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约89mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约91mM。在一些方面，钾离子的浓度为约91mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约92mM。在一些方面，钾离子的浓度为约92mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约93mM。在一些方面，钾离子的浓度为约93mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约94mM。在一些方面，钾离子的浓度为约94mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约95mM。在一些方面，钾离子的浓度为约95mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约96mM。在一些方面，钾离子的浓度为约96mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约97mM。在一些方面，钾离子的浓度为约97mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约98mM。在一些方面，钾离子的浓度为约98mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约99mM。在一些方面，钾离子的浓度为约99mM。在某些方面，培养基是低渗的。在某些方面，培养基是等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约90mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约91mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约91mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约92mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约92mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约93mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约93mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约94mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约94mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约95mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约95mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约96mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约96mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约97mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约97mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约98mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约98mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约99mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约99mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约100mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约101mM。在一些方面，钾离子的浓度为约101mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约102mM。在一些方面，钾离子的浓度为约102mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约103mM。在一些方面，钾离子的浓度为约103mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约104mM。在一些方面，钾离子的浓度为约104mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约105mM。在一些方面，钾离子的浓度为约105mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约106mM。在一些方面，钾离子的浓度为约106mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约107mM。在一些方面，钾离子的浓度为约107mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约108mM。在一些方面，钾离子的浓度为约108mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约109mM。在一些方面，钾离子的浓度为约109mM。在某些方面，培养基是低渗的。在某些方面，培养基是等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约100mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约100mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约101mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约101mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约102mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约102mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约103mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约103mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约104mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约104mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约105mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约105mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约106mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约106mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约107mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约107mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约108mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约108mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约109mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约109mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约110mM。在一些方面，钾离子的浓度为约110mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约111mM。在一些方面，钾离子的浓度为约111mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约112mM。在一些方面，钾离子的浓度为约112mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约113mM。在一些方面，钾离子的浓度为约113mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约114mM。在一些方面，钾离子的浓度为约114mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约115mM。在一些方面，钾离子的浓度为约115mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约116mM。在一些方面，钾离子的浓度为约116mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约117mM。在一些方面，钾离子的浓度为约117mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约118mM。在一些方面，钾离子的浓度为约118mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约119mM。在一些方面，钾离子的浓度为约119mM。在某些方面，培养基是低渗的。在某些方面，培养基是等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约110mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约110mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约111mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约111mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约112mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约112mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约113mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约113mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约114mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约114mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约115mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约115mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约116mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约116mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约117mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约117mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约118mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约118mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约119mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约119mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约120mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约121mM。在一些方面，钾离子的浓度为约121mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约122mM。在一些方面，钾离子的浓度为约122mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约123mM。在一些方面，钾离子的浓度为约123mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约124mM。在一些方面，钾离子的浓度为约124mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约125mM。在一些方面，钾离子的浓度为约125mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约126mM。在一些方面，钾离子的浓度为约126mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约127mM。在一些方面，钾离子的浓度为约127mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约128mM。在一些方面，钾离子的浓度为约128mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约129mM。在一些方面，钾离子的浓度为约129mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约130mM。在一些方面，钾离子的浓度为约130mM。在某些方面，培养基是低渗的。在某些方面，培养基是等渗的。
在一些方面，钾离子的浓度高于约120mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约120mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约121mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约121mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约122mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约122mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约123mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约123mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约124mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约124mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约125mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约125mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约126mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约126mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约127mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约127mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约128mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约128mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约129mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约129mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约130mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约130mM，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，可以通过在培养基中添加足够量的钾盐来制备包含高浓度的钾离子的培养基。在一些方面，钾盐的非限制性示例包括三氯氨络铂酸钾、水合五氯钌酸钾、双(草酸根)铂(II)酸钾二水合物、硫酸氢钾、硼氢化钾、溴化钾、碳酸钾、氯化钾、铬酸钾、重铬酸钾、二氰合银酸钾、二氰合金酸钾、氟化钾、氟硫酸钾、六氯铱酸钾、六氯锇酸钾、六氯钯酸钾、六氯铂酸钾、六氯铑酸钾、六氰铬酸钾、黄血盐钾、六氰钌(II)酸钾水合物、六氟锑酸钾、六氟镍酸钾、六氟磷酸钾、六氟钛酸钾、六氟锆酸钾、六羟基锑酸钾、六碘铂酸钾、六碘铼酸钾、氢氧化钾、碘酸钾、碘化钾、锰酸钾、偏钒酸钾、钼酸钾、硝酸钾、亚硝基过硫酸钾、锇酸钾(VI)二水合物、五氯亚硝酰基钌酸钾、高氯酸钾、过铼酸钾、高钌酸钾、过硫酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、焦磷酸钾、硒氰酸钾、硒氰酸钾、锡酸钾三水合物、硫酸钾、碲酸钾水合物、亚碲酸钾、四硼酸钾四水合物、四溴金酸钾、四溴钯酸钾、四氯钯酸钾、四氯铂酸钾、四氰基钯酸钾、四氰基铂酸钾、四氟硼酸钾、四硝基铂酸钾、连四硫酸钾、对甲苯硫代磺酸钾、和羟基柠檬酸三钾一水合物。在某些方面，钾盐包括氯化钾(KCl)。在某些方面，钾盐包括葡糖酸钾。在某些方面，钾盐包括柠檬酸钾。在某些方面，钾盐包括羟基柠檬酸钾。在一些方面，钾盐包括本文所公开的任何钾盐的组合。
在一些方面，培养基包含本文所公开的浓度的钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含本文所公开的浓度的钾离子，并且培养基具有约280mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子，并且培养基具有约254mOsmol至约256mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子，并且培养基具有约254.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约51mM、约52mM、约53mM或约54mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约51mM、约52mM、约53mM或约54mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约51mM、约52mM、约53mM或约54mM钾离子，并且培养基具有约254mOsmol至约256mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约51mM、约52mM、约53mM或约54mM钾离子，并且培养基具有约254.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约51mM、约52mM、约53mM或约54mM钾离子，并且培养基具有约255.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约55mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子，并且培养基具有约254mOsmol至约256mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子，并且培养基具有约255.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约56mM、约57mM、约58mM或约59mM钾离子，并且培养基具有约256mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约56mM、约57mM、约58mM或约59mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约56mM、约57mM、约58mM或约59mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约258mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子，并且培养基具有约257.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子，并且培养基具有约256mOsmol至约258mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子，并且培养基具有约257.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约61mM、约62mM、约63mM或约64mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约61mM、约62mM、约63mM或约64mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约61mM、约62mM、约63mM或约64mM钾离子，并且培养基具有约256mOsmol至约258mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约61mM、约62mM、约63mM或约64mM钾离子，并且培养基具有约257.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约61mM、约62mM、约63mM或约64mM钾离子，并且培养基具有约257.5mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约65mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol至约258mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子，并且培养基具有约257.5mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约66mM、约67mM、约68mM或约69mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约66mM、约67mM、约68mM或约69mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约66mM、约67mM、约68mM或约69mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol至约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约66mM、约67mM、约68mM或约69mM钾离子，并且培养基具有约257.5mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约66mM、约67mM、约68mM或约69mM钾离子，并且培养基具有约259.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子，并且培养基具有约259mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子，并且培养基具有约259mOsmol至约261mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子，并且培养基具有约259.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约71mM、约72mM、约73mM或约74mM钾离子，并且培养基具有约259mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约71mM、约72mM、约73mM或约74mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约71mM、约72mM、约73mM或约74mM钾离子，并且培养基具有约259mOsmol至约261mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约71mM、约72mM、约73mM或约74mM钾离子，并且培养基具有约259.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约71mM、约72mM、约73mM或约74mM钾离子，并且培养基具有约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约75mM钾离子，并且培养基具有约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子，并且培养基具有约259mOsmol至约261mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子，并且培养基具有约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约261mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约262mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约263mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约261mOsmol至约263mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约262.26mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子，并且培养基具有约262mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子，并且培养基具有约261mOsmol至约263mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子，并且培养基具有约262.26mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约262mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约263mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约264mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约265mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约260mOsmol至约270mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约261mOsmol至约263mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约263mOsmol至约265mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基还包含细胞扩增剂。如本文所用，“细胞扩增剂”是指促进培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的体外和/或离体生长和增殖的剂，例如小分子、多肽或它们的任何组合。在一些方面，细胞扩增剂包含PI3K抑制剂。在一些方面，培养基还包含AKT抑制剂。在一些方面，培养基还包含PI3K抑制剂和AKT抑制剂。在一些方面，PI3K抑制剂包括LY294002。在一些方面，PI3K抑制剂包括IC87114。在一些方面，PI3K抑制剂包括艾德利西布(idelalisib)(参见例如，Peterson等人,Blood Adv.2(3):210-23(2018))。在一些方面，培养基还包含GSK3B抑制剂。在一些方面，GSK3B抑制剂包括TWS119。在一些方面，培养基还包含ACLY抑制剂。在一些方面，ACLY抑制剂包括羟基柠檬酸三钾一水合物。在一些方面，PI3K抑制剂包括羟基柠檬酸盐。在一些方面，PI3K抑制剂包括匹替利司(pictilisib)。在一些方面，PI3K抑制剂包括CAL-101。在一些方面，AKT抑制剂包括MK2206、A443654或AKTi-VIII(CAS 612847-09-3)。
在一些方面，在本文所公开的培养基中培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))用于整个离体培养，例如从T细胞从受试者分离的时间开始，经过生长、扩增、工程化，并且直至施用。在一些方面，在本文所公开的培养基中培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))持续扩增的持续时间。在一些方面，在本文所公开的培养基中培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))持续扩增的持续时间。在一些方面，在本文所公开的培养基中培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))，直至活细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的总数为至少约104、5x104、105、5x105、106或5x106个总细胞。
II.B.钠
本公开的某些方面涉及培养细胞(例如多能细胞、多潜能细胞或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度为至少约5mM的钾离子和(ii)浓度小于约115mM的钠离子(例如NaCl)，其中培养基是低渗的或等渗的。本公开的一些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)浓度小于约115mM的钠离子(例如NaCl)。本公开的某些方面涉及培养T细胞的方法，该方法包括将T细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)浓度小于约115mM的钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。
在一些方面，通过从包含较高浓度钠离子(例如NaCl)的基础培养基开始并稀释溶液以达到钠离子(例如NaCl)的目标浓度来达到钠的目标浓度。在一些方面，通过添加一种或多种钠盐(例如更多NaCl)提高钠离子(例如NaCl)的浓度来达到钠的目标浓度。钠盐的非限制性示例包括(偏)高碘酸钠、酒石酸甲基砷酸二钠水合物、叠氮化钠、苯甲基氧化钠、溴化钠、碳酸钠、氯化钠、铬酸钠、环己烷丁酸钠、乙硫醇钠、氟化钠、单氟磷酸钠、甲酸钠、六氯铱(III)酸钠水合物、六氯铱(IV)酸钠六水合物、六氯铂(IV)酸钠六水合物、六氯铑(III)酸钠、六氟铝酸钠、六氟锑(V)酸钠、六氟砷(V)酸钠、六氟铁(III)酸钠、六氟磷酸钠、六氟硅酸钠、六羟基铂(IV)酸钠、六偏磷酸钠、氟化氢钠、硫酸氢钠、氰胺一钠、氢氧化钠、碘化钠、偏硼酸钠四水合物、九水偏硅酸钠、偏钒酸钠、钼酸钠、硝酸钠、亚硝酸钠、草酸钠、过硼酸钠一水合物、过碳酸钠、高氯酸钠、高碘酸钠、高锰酸钠、高铼酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠、硒酸钠、亚硒酸钠、锡酸钠、硫酸钠、亚碲酸钠、四硼酸钠、四氯铝酸钠、四氯金(III)酸钠、四氯钯(II)酸钠、四氯铂(II)酸钠、硫代磷酸三钠、硫代硫酸钠、硫代硫酸钠五水合物、氟氧化钇钠、三偏磷酸钠及它们的任何组合。在某些方面，钠盐包括氯化钠(NaCl)。在某些方面，钠盐包括葡糖酸钠。在某些方面，钠盐包括碳酸氢钠。在某些方面，钠盐包括羟基柠檬酸钠。在某些方面，钠盐包括磷酸钠。
在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度小于基础培养基的浓度。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度随着钾离子的浓度增加而降低。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为从约25mM至约115mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为从约25mM至约100mM、约30mM至约40mM、约30mM至约50mM、约30mM至约60mM、约30mM至约70mM、约30mM至约80mM、约40mM至约50mM、约40mM至约60mM、约40mM至约70mM、约40mM至约80mM、约50mM至约55mM、约50mM至约60mM、约50mM至约65mM、约50mM至约70mM、约50mM至约75mM、约50mM至约80mM、约55mM至约60mM、约55mM至约65mM、约55mM至约70mM、约55mM至约75mM、约55mM至约80mM、约60mM至约65mM、约60mM至约70mM、约60mM至约75mM、约60mM至约80mM、约70mM至约75mM、约70mM至约80mM、或约75mM至约80mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约40mM至约80mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约50mM至约85mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约55mM至约80mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约30mM至约35mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约35mM至约40mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约40mM至约45mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约45mM至约50mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约50mM至约55mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约55mM至约60mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约60mM至约65mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约65mM至约70mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约70mM至约75mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约75mM至约80mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为从约80mM至约85mM。
在一些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM或约90mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约40mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约45mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约50mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约55mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约55.6mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约59.3mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约60mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约63.9mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约65mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约67.6mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约70mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约72.2mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约75mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约76mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约80mM。在某些方面，钠离子(例如，NaCl)的浓度为约80.5mM。在一些方面，培养基包含约40mM至约90mM钾离子和约40mM至约80mM钠离子(例如，NaCl)。
在一些方面，培养基包含约50mM至约75mM钾离子和约80mM至约90mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约55mM至约75mM钾离子和约80mM至约90mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约60mM至约75mM钾离子和约80mM至约90mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM至约75mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约66mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约67mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约68mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约69mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约71mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约72mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约73mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约74mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约80mM至约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约80mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约90mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约80mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约90mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约80mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约85mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约90mM钠离子(例如，NaCl)。
在一些方面，培养基包含约40mM至约90mM钾离子和约30mM至约109mM NaCl，其中NaCl的浓度(mM)等于或低于(135-钾离子浓度)。在一些方面，培养基包含约40mM钾离子和小于或等于约95mM NaCl(例如，约95mM、约94mM、约93mM、约92mM、约91mM、约90mM、约85mM、约80mM、约75mM、约70mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约45mM钾离子和小于或等于约90mM NaCl(例如，约90mM、约89mM、约88mM、约87mM、约86mM、约85mM、约80mM、约75mM、约70mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和小于或等于约85mM NaCl(例如，约85mM、约84mM、约83mM、约82mM、约81mM、约80mM、约75mM、约70mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和小于或等于约80mM NaCl(例如，约80mM、约79mM、约78mM、约77mM、约76mM、约75mM、约70mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和小于或等于约75mM NaCl(例如，约75mM、约74mM、约73mM、约72mM、约71mM、约70mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和小于或等于约70mM NaCl(例如，约70mM、约69mM、约68mM、约67mM、约66mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和小于或等于约70mM NaCl(例如，约65mM、约64mM、约63mM、约62mM、约61mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和小于或等于约60mM NaCl(例如，约60mM、约59mM、约58mM、约57mM、约56mM、约55mM、约50mM、约45mM或约40mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和小于或等于约55mM NaCl(例如，约55mM、约54mM、约53mM、约52mM、约51mM、约50mM、约45mM、约40mM或约35mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约85mM钾离子和小于或等于约50mMNaCl(例如，约50mM、约49mM、约48mM、约47mM、约46mM、约45mM、约40mM、约35mM或约30mMNaCl)。在一些方面，培养基包含约90mM钾离子和小于或等于约45mM NaCl(例如，约45mM、约44mM、约43mM、约42mM、约41mM、约40mM、约35mM、约30mM或约25mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约60mM NaCl。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约61mMNaCl。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约62mM NaCl。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约80.5mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约80.5mM钠离子，并且培养基具有约254.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和约76mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和约76mM钠离子，并且培养基具有约255.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和约72.2mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和约72.2mM钠离子，并且培养基具有约257.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约67.6mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约67.6mM钠离子，并且培养基具有约257.5mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约63.9mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约63.9mM钠离子，并且培养基具有约259.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约59.3mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约59.3mM钠离子，并且培养基具有约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和约55.6mM钠离子(例如，NaCl)。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和约55.6mM钠离子，并且培养基具有约262.26mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约75mM NaCl。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。
本公开的一些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)浓度小于约100mM的NaCl。本公开的某些方面涉及培养T细胞的方法，所述方法包括将T细胞置于培养基中，所述培养基包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)浓度小于约90mM的NaCl。
II.C.糖
本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度为至少约5mM的钾离子和(ii)糖，其中培养基是低渗的或等渗的。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)糖。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)糖。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)糖；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，通过从包含较高浓度糖的基础培养基开始并稀释所述溶液以达到糖的目标浓度来达到糖的目标浓度。在一些方面，通过添加糖提高糖的浓度直至达到所需浓度来达到糖的目标浓度。
在一些方面，糖是单糖、二糖或多糖。在一些方面，糖选自葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖或它们的任何组合。在某些方面，糖是葡萄糖。在一些方面，培养基包含(i)浓度为至少约5mM的钾离子和(ii)葡萄糖。在一些方面，培养基包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)葡萄糖。在一些方面，培养基包含(i)浓度为至少约5mM的钾离子和(ii)甘露糖。在一些方面，培养基包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)甘露糖。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)葡萄糖；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，培养基包含(i)浓度高于50mM的钾离子和(ii)葡萄糖；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，培养基包含(i)浓度为至少约40mM的钾离子和(ii)甘露糖；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，培养基包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)甘露糖；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)葡萄糖。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度为至少约30mM至至少约100mM的钾离子和(ii)葡萄糖。在一些方面，MRM包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)葡萄糖。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)甘露糖。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约30mM至至少约100mM的钾离子和(ii)甘露糖。在一些方面，MRM包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)甘露糖。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)甘露糖。在一些方面，MRM是低渗的。在一些方面，MRM是等渗的。在一些方面，MRM包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)葡萄糖；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，MRM包含(i)浓度高于50mM的钾离子和(ii)葡萄糖；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约40mM的钾离子和(ii)甘露糖；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)甘露糖；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约10mM至约24mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度小于约4.29g/L。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度小于约24mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度大于约5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约5mM至约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约10mM至约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约10mM至约25mM、约10mM至约20mM、约10mM至约5mM、约15mM至约25mM、约15mM至约20mM、约15mM至约19mM、约15mM至约18mM、约15mM至约17mM、约15mM至约16mM、约16mM至约20mM、约16mM至约19mM、约16mM至约18mM、约16mM至约17mM、约17mM至约20mM、约17mM至约19mM、或约17mM至约18mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约5mM至约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约10mM至约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约10mM至约15mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约14mM至约14.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约14.5mM至约15mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约15mM至约15.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约15.5mM至约16mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约16mM至约16.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约16.5mM至约17mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约17mM至约17.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约17.5mM至约18mM。
在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM，为约10.5mM、约11mM、约11.5mM、约12mM、约12.5mM、约13mM、约13.5mM、约14mM、约14.5mM、约15mM、约15.5mM、约16mM、约16.5mM、约17mM、约17.5mM、约18mM、约18.5mM、约19mM、约19.5mM、约20mM、约20.5mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM或约25mM。
在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约6mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约7mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约8mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约9mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约10mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约10.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约11mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约11.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约12mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约12.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约13mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约13.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约14mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约14.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15.4mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15.9mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约16.3mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约16.8mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约17.2mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约17.7mM。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约17.7mM葡萄糖。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约17.7mM葡萄糖，并且培养基具有约254.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和约17.2mM葡萄糖。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和约17.2mM葡萄糖，并且培养基具有约255.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和约16.8mM葡萄糖。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和约16.8mM葡萄糖，并且培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基具有约257.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约16.3mM葡萄糖。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约16.3mM葡萄糖，并且培养基具有约257.5mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约15.9mM葡萄糖。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约15.9mM葡萄糖，并且培养基具有约259.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约15.4mM葡萄糖。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约15.4mM葡萄糖，并且培养基具有约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和约15mM葡萄糖。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和约15mM葡萄糖，并且培养基具有约262.26mOsmol的渗透压摩尔浓度。
II.D.钙
本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度为至少约5mM的钾离子和(ii)钠离子，其中培养基是低渗的或等渗的。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)钠离子。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)钠离子。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度为至少约40mM的钾离子和(ii)NaCl；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)NaCl；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，通过从包含较高浓度钙离子的基础培养基开始并稀释所述溶液以达到钙离子的目标浓度来达到钙的目标浓度。在一些方面，通过添加一种或多种钙盐提高钙离子的浓度来达到钙的目标浓度。钙盐的非限制性示例包括溴化钙、碳酸钙、氯化钙、氰氨化钙、氟化钙、氢化钙、氢氧化钙、碘酸钙、碘化钙、硝酸钙、亚硝酸钙、草酸钙、四水合高氯酸钙、磷酸二氢钙、磷酸三氢钙、硫酸钙、四水合硫氰酸钙、羟基磷灰石或它们的任何组合。在一些方面，钙盐包括氯化钙(CaCl2)。在一些方面，钙盐包括葡糖酸钙。
在一些方面，钙离子的浓度小于基础培养基的浓度。在一些方面，钙离子的浓度大于基础培养基的浓度。在一些方面，钙离子的浓度大于约0.4mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约2.8mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约2.5mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约2.0mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.9mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.7mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.6mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.5mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.4mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.3mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.2mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.1mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.0mM。
在一些方面，钙离子的浓度为从约0.4mM至约2.8mM、约0.4mM至约2.7mM、约0.4mM至约2.5mM、约0.5mM至约2.0mM、约1.0mM至约2.0mM、约1.1mM至约2.0mM、约1.2mM至约2.0mM、约1.3mM至约2.0mM、约1.4mM至约2.0mM、约1.5mM至约2.0mM、约1.6mM至约2.0mM、约1.7mM至约2.0mM、约1.8mM至约2.0mM、约0.8至约0.9mM、约0.8至约1.0mM、约0.8至约1.1mM、约0.8至约1.2mM、约0.8至约1.3mM、约0.8至约1.4mM、约0.8至约1.5mM、约0.8至约1.6mM、约0.8至约1.7mM、约0.8至约1.8mM、约0.9至约1.0mM、约0.9至约1.1mM、约0.9至约1.2mM、约0.9至约1.3mM、约0.9至约1.4mM、约0.9至约1.5mM、约0.9至约1.6mM、约0.9至约1.7mM、约0.9至约1.8mM、约1.0至约1.1mM、约1.0至约1.2mM、约1.0至约1.3mM、约1.0至约1.4mM、约1.0至约1.5mM、约1.0至约1.6mM、约1.0至约1.7mM、约1.0至约1.8mM、约1.1至约1.2mM、约1.1至约1.3mM、约1.1至约1.4mM、约1.1至约1.5mM、约1.1至约1.6mM、约1.1至约1.7mM、约1.1至约1.8mM、约1.2至约1.3mM、约1.2至约1.4mM、约1.2至约1.5mM、约1.2至约1.6mM、约1.2至约1.7mM、约1.2至约1.8mM、约1.3至约1.4mM、约1.3至约1.5mM、约1.3至约1.6mM、约1.3至约1.7mM、约1.3至约1.8mM、约1.4至约1.5mM、约1.4至约1.6mM、约1.4至约1.7mM、约1.4至约1.8mM、约1.5至约1.6mM、约1.5至约1.7mM、约1.5至约1.8mM、约1.6至约1.7mM、约1.6至约1.8mM、或约1.7至约1.8mM。
在一些方面，钙离子的浓度为从约0.8mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约0.9mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.0mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.1mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.2mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约0.8mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约0.8mM至约0.9mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约0.9mM至约1.0mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.0mM至约1.1mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.1mM至约1.2mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.2mM至约1.3mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.3mM至约1.4mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.4mM至约1.5mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.5mM至约1.6mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.7mM至约1.8mM。
在一些方面，钙离子的浓度为约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM或约2.0mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.6mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.7mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.9mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.0mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.1mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.2mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.3mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.4mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.5mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.6mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.7mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.8mM。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约1.8mM钙离子。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约1.8mM钙离子，并且培养基具有约254.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子、约1.8mM钙离子和NaCl；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和约1.7mM钙离子。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和约1.7mM钙离子，并且培养基具有约255.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子、约1.7mM钙离子和NaCl；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和约1.6mM钙离子。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和约1.6mM钙离子，并且培养基具有约257.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子、约1.6mM钙离子和NaCl；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约1.5mM钙离子。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约1.5mM钙离子，并且培养基具有约257.5mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子、约1.5mM钙离子和NaCl；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约1.4mM钙离子。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约1.4mM钙离子，并且培养基具有约259.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子、约1.4mM钙离子和NaCl；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约1.3mM钙离子。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约1.3mM钙离子，并且培养基具有约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子、约1.3mM钙离子和NaCl；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和约1.2mM钙离子。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和约1.2mM钙离子，并且培养基具有约262.26mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子、约1.2mM钙离子和NaCl；其中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
本公开的一些方面涉及在包含(i)浓度为至少约5mM的钾离子和(ii)钙离子的培养基中培养免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的方法。在一些方面，培养基是低渗的或等渗的。
II.E.张力
本公开的某些方面涉及在包含比常规培养基更高浓度的钾离子(例如大于约5mM钾离子)的培养基中培养细胞(例如多能细胞、多潜能细胞或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，其中培养基不是高渗的。令人惊讶地发现，在具有高钾离子浓度(例如，大于5mM钾离子)的非高渗培养基中培养多能细胞/多潜能细胞/免疫细胞导致培养物中干样(例如，较低分化或未分化)细胞的数量增加。在此类条件下培养的细胞也保持效应子功能和增殖能力。如果(i)培养基具有高浓度的钾(例如，大于5mM，例如大于50mM)并且培养基是低渗的或等渗的，则该效应最显著。因此，尽管增加培养基中的钾离子可能另外增加张力，但本文所公开的数据表明单独增加钾离子在促进细胞群中的干样特性方面不如在低渗或等渗条件下增加钾离子有效。
在本公开的一些方面，调节培养基的张力。在本公开的一些方面，基于钾离子和/或NaCl的浓度调节代谢重编程培养基的张力(例如，(钾离子的浓度和NaCl的浓度)×2)。在一些方面，培养基的张力低于基础培养基的张力。在一些方面，培养基的张力高于基础培养基的张力。在一些方面，培养基的张力与基础培养基的张力相同。
本公开中使用的培养基可以是低渗的或等渗的。培养基的张力可能受到许多因素的影响，所述因素包括培养基中钾离子的浓度。在一些方面，钾离子浓度增加搭配一种或多种其他因子的浓度的增加或降低。在一些方面，该搭配影响培养基的张力。在一些方面，钾离子的浓度增加，而钠离子(例如NaCl)的浓度降低。
在一些方面，可以基于钾离子和张力的变化制备用于本发明培养基的培养基。参见表2。例如，在一些方面，如果用于本公开的培养基是低渗的(例如，小于280mOsm)并且包含至少约50mM的钾离子，则足以维持培养基为低渗的NaCl浓度可基于下式确定：NaCl浓度＝(所需张力(280)/2)-钾离子浓度。(即，NaCl的浓度(mM)等于或低于(140-钾离子浓度))。在一些方面，本文所公开的低渗培养基包含在110mM和140mM之间的钾离子和NaCl的总浓度。因此，对于低渗培养基，钾离子的浓度可以设定在50mM和90mM之间的浓度，并且钠离子浓度可以在90mM和50mM之间或更低，只要钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间即可。在一些方面，本文所公开的低渗培养基包含在115mM和140mM之间的钾离子和NaCl的总浓度。在一些方面，本文所公开的低渗培养基包含在120mM和140mM之间的钾离子和NaCl的总浓度。
在一些方面，培养基是等渗的(在280mOsm和300mOsm之间)并且包含浓度在约50mM和70mM之间的钾离子。钠离子的相应浓度可以再次基于下式计算：NaCl浓度＝(所需张力/2)-钾离子浓度。例如，如果钾的浓度是50mM并且所需的张力是300mOsm，则钠浓度可以是100mM。
在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基具有约280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±1mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±2mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±3mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±4mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±5mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±6mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±7mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±8mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±9mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±10mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约280mOsm/L至约285mOsm/L、约280mOsm/L至约290mOsm/L、约280mOsm/L至约295mOsm/L、约280mOsm/L至约300mOsm/L、约280mOsm/L至约305mOsm/L、约280mOsm/L至约310mOsm/L、约280mOsm/L至约315mOsm/L、或约280mOsm/L至小于320mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约285mOsm/L、约290mOsm/L、约295mOsm/L、约300mOsm/L、约305mOsm/L、约310mOsm/L或约315mOsm/L的张力。
在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基具有低于约280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约280mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的(参见表2)。在一些方面，培养基具有低于280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于280mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于275mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于275mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于270mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于270mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于265mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于265mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于260mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于260mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于265mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于265mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于260mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于260mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于255mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于255mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于约250mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约250mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于约245mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约245mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于约240mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约240mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于约235mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约235mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于约230mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约230mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有低于约225mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约225mOsm/L的张力。在一些方面，张力高于约220mOsm/L；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。在一些方面，培养基具有从约230mOsm/L至约280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约240mOsm/L至约280mOsm/L的张力。
在一些方面，培养基具有低于约220mOsm/L的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基具有低于约215mOsm/L的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基具有低于约210mOsm/L的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基具有低于约205mOsm/L的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基具有低于约200mOsm/L的渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基具有从约100mOsm/L至约280mOsm/L、约125mOsm/L至约280mOsm/L、约150mOsm/L至约280mOsm/L、约175mOsm/L至约280mOsm/L、约200mOsm/L至约280mOsm/L、约210mOsm/L至约280mOsm/L、约220mOsm/L至约280mOsm/L、约225mOsm/L至约280mOsm/L、约230mOsm/L至约280mOsm/L、约235mOsm/L至约280mOsm/L、约240mOsm/L至约280mOsm/L、约245mOsm/L至约280mOsm/L、约250mOsm/L至约280mOsm/L、约255mOsm/L至约280mOsm/L、约260mOsm/L至约280mOsm/L、约265mOsm/L至约280mOsm/L、约270mOsm/L至约280mOsm/L、或约275mOsm/L至约280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约250mOsm/L至约270mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约250mOsm/L至约255mOsm/L、约250mOsm/L至约260mOsm/L、约250mOsm/L至约265mOsm/L、约255mOsm/L至约260mOsm/L、约255mOsm/L至约265mOsm/L、约255mOsm/L至约265mOsm/L、约260mOsm/L至约265mOsm/L、或约254mOsm/L至约263mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约254mOsm/L至约255mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约255mOsm/L至约256mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约256mOsm/L至约257mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约257mOsm/L至约258mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约258mOsm/L至约259mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约260mOsm/L至约261mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约261mOsm/L至约262mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约262mOsm/L至约263mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约263mOsm/L至约264mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约264mOsm/L至约265mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约220mOsm/L至约280mOsm/L的张力；如通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2测量的。
在一些方面，培养基具有约100mOsm/L、约125mOsm/L、约150mOsm/L、约175mOsm/L、约200mOsm/L、约210mOsm/L、约220mOsm/L、约225mOsm/L、约230mOsm/L、约235mOsm/L、约240mOsm/L、约245mOsm/L、约250mOsm/L、约255mOsm/L、约260mOsm/L、约265mOsm/L、约270mOsm/L、或约275mOsm/L的张力。在一些方面，通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2来测量渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基具有约250mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约262.26mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约260mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约259.7mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约257.5mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约257.2mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约255.2mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约254.7的张力。在一些方面，培养基具有约255mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约260mOsm/L的张力。在一些方面，通过将钾离子浓度和NaCl浓度相加并乘以2来测量渗透压摩尔浓度。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和(i)约80.5mM钠离子；(ii)约17.7mM葡萄糖；(iii)约1.8mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和(i)约80.5mM钠离子；(ii)约17.7mM葡萄糖；(iii)约1.8mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合；并且培养基具有约254.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和(i)约80.5mM NaCl；(ii)约17.7mM葡萄糖；(iii)约1.8mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和(i)约80.5mM NaCl；(ii)约17.7mM葡萄糖；和(iii)约1.8mM钙离子。
在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和(i)约76mM钠离子；(ii)约17.2mM葡萄糖；(iii)约1.7mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和(i)约76mM钠离子；(ii)约17.2mM葡萄糖；(iii)约1.7mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合；并且培养基具有约255.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和(i)约76mMNaCl；(ii)约17.2mM葡萄糖；(iii)约1.7mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和(i)约76mM NaCl；(ii)约17.2mM葡萄糖；和(iii)约1.7mM钙离子。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和(i)约72.2mM钠离子；(ii)约16.8mM葡萄糖；(iii)约1.6mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和(i)约72.2mM钠离子；(ii)约16.8mM葡萄糖；(iii)约1.6mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合；并且培养基具有约257.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和(i)约72.2mM NaCl；(ii)约16.8mM葡萄糖；(iii)约1.6mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和(i)约72.2mM NaCl；(ii)约16.8mM葡萄糖；和(iii)约1.6mM钙离子。
在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和(i)约67.6mM钠离子；(ii)约16.3mM葡萄糖；(iii)约1.5mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和(i)约67.6mM钠离子；(ii)约16.3mM葡萄糖；(iii)约1.5mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合；并且培养基具有约257.5mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和(i)约67.6mM NaCl；(ii)约16.3mM葡萄糖；(iii)约1.5mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和(i)约67.6mM NaCl；(ii)约16.3mM葡萄糖；和(iii)约1.5mM钙离子。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和(i)约63.9mM钠离子；(ii)约15.9mM葡萄糖；(iii)约1.4mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和(i)约63.9mM钠离子；(ii)约15.9mM葡萄糖；(iii)约1.4mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合；并且培养基具有约259.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和(i)约63.9mM NaCl；(ii)约15.9mM葡萄糖；(iii)约1.4mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和(i)约63.9mM NaCl；(ii)约15.9mM葡萄糖；和(iii)约1.4mM钙离子。
在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和(i)约59.3mM钠离子；(ii)约15.4mM葡萄糖；(iii)约1.3mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和(i)约59.3mM钠离子；(ii)约15.4mM葡萄糖；(iii)约1.3mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合；并且培养基具有约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和(i)约59.3mMNaCl；(ii)约15.4mM葡萄糖；(iii)约1.3mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和(i)约59.3mM NaCl；(ii)约15.4mM葡萄糖；和(iii)约1.3mM钙离子。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和(i)约55.6mM钠离子；(ii)约15mM葡萄糖；(iii)约1.2mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和(i)约55.6mM钠离子；(ii)约15mM葡萄糖；(iii)约1.2mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合；并且培养基具有约262.26mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和(i)约55.6mMNaCl；(ii)约15mM葡萄糖；(iii)约1.2mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和(i)约55.6mM NaCl；(ii)约15mM葡萄糖；和(iii)约1.2mM钙离子。
可在任何点将培养基的张力调节至例如本文所公开的等渗或低渗状态。在一些方面，在将细胞添加到培养基中之前，可将培养基的张力调节至例如本文所公开的等渗或低渗状态。在一些方面，在细胞工程化之前，例如在用表达CAR、TCR或TCR模拟物的构建体转导之前，在低渗或等渗培养基中培养细胞。在一些方面，在细胞工程化期间，例如在用表达CAR、TCR或TCR模拟物的构建体转导期间，在低渗或等渗培养基中培养细胞。在一些方面，在细胞工程化后，例如在用表达CAR、TCR或TCR模拟物的构建体转导后，在低渗或等渗培养基中培养细胞。在一些方面，在整个细胞扩增过程中在低渗或等渗培养基中培养细胞。
II.F.细胞因子
本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)如本文所公开的浓度为至少约5mM的钾离子和(ii)细胞因子，其中培养基是低渗的或等渗的。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)如本文所公开的浓度高于40mM的钾离子和(ii)细胞因子。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于培养基中，该培养基包含(i)如本文所公开的浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)细胞因子。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。
本公开的一些方面涉及离体或体外增加免疫细胞中较低分化的免疫细胞(例如，干样T细胞、NK细胞或TIL，例如，具有一种或多种TSCM样表型和/或功能的细胞)的数量的方法，所述方法包括将所述细胞置于培养基中，所述培养基包含(i)如本文所公开的浓度为至少约5mM的钾和(ii)细胞因子，其中培养基是低渗的或等渗的。本公开的一些方面涉及离体或体外增加免疫细胞中较低分化的免疫细胞(例如，干样T细胞、NK细胞或TIL，例如，具有一种或多种TSCM样表型和/或功能的细胞)的数量的方法，所述方法包括将所述细胞置于培养基中，所述培养基包含(i)如本文所公开的浓度为至少约50mM的钾和(ii)细胞因子。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21及它们的任何组合。
在一些方面，本文所公开的培养基(例如MRM)包含细胞因子。在一些方面，MRM是低渗的。在一些方面，MRM是等渗的。在一些方面，MRM是高渗的。在一些方面，细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21及它们的任何组合。在一些方面，MRM不包含IL-2。在一些方面，MRM包含IL2和IL21。在一些方面，MRM包含IL2、IL21和IL15。在一些方面，MRM在TIL细胞的初始培养期间包含IL-2。在一些方面，MRM在TIL细胞的初始培养期间包含IL-2和IL-21。在一些方面，MRM在TIL细胞的第二扩增(例如快速扩增)期间包含IL-2、IL-15和IL-21。在一些方面，MRM在TIL细胞的最终扩增期间包含IL-2、IL-15和IL-21。在一些方面，第二扩增和/或最终扩增中IL-2和/或IL-21的浓度低于初始培养物中IL-2和/或IL-21的浓度。
可以在任何点将细胞因子添加到培养基中。在一些方面，在将细胞添加到培养基中之前将细胞因子添加到培养基中。在一些方面，在细胞工程化之前，例如在用表达CAR或TCR的构建体转导之前，在包含(i)本文所公开的浓度的钾和(ii)细胞因子的培养基中培养细胞。在一些方面，在细胞工程化期间，例如在用表达CAR或TCR的构建体转导期间，在包含(i)本文所公开的浓度的钾和(ii)细胞因子的培养基中培养细胞。在一些方面，在细胞工程化之后，例如在用表达CAR或TCR的构建体转导之后，在包含(i)本文所公开的浓度的钾和(ii)细胞因子的培养基中培养细胞。在一些方面，在整个细胞扩增过程中，在包含(i)本文所公开的浓度的钾和(ii)细胞因子的培养基中培养细胞。
可在任何点将细胞因子添加到MRM中。在一些方面，在将TIL(例如肿瘤样品)添加到培养基中之前将细胞因子添加到MRM中。在一些方面，在包括扩增的整个TIL培养中，在包含(i)本文所公开的浓度的钾和(ii)细胞因子的MRM中培养TIL(例如肿瘤样品)。在一些方面，在整个TIL扩增中，在包含(i)本文所公开的浓度的钾和(ii)细胞因子的MRM中培养TIL(例如肿瘤样品)。
在一些方面，培养基包含(i)至少约5mM钾离子和(ii)IL-2。在一些方面，培养基包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-2。在一些方面，培养基包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-2。在一些方面，培养基包含(i)至少约5mM钾离子和(ii)IL-7。在一些方面，培养基包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-7。在一些方面，培养基包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-7。在一些方面，培养基包含(i)至少约5mM钾离子和(ii)IL-15。在一些方面，培养基包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-15。在一些方面，培养基包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-15。在一些方面，培养基包含(i)至少约5mM钾离子和(ii)IL-21。在一些方面，培养基包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-21。在一些方面，培养基包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-21。在一些方面，培养基包含(i)至少约5mM钾离子和(ii)IL-2，并且培养基不包含IL-7。在一些方面，培养基包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-2，并且培养基不包含IL-7。在一些方面，培养基包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-2，并且培养基不包含IL-7。在一些方面，培养基包含(i)至少约5mM钾离子和(ii)IL-2，并且培养基不包含IL-15。在一些方面，培养基包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-2，并且培养基不包含IL-15。在一些方面，培养基包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-2，并且培养基不包含IL-15。在一些方面，培养基包含(i)至少约5mM钾离子和(ii)IL-2，并且培养基不包含IL-7和IL-15。在一些方面，培养基包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-2，并且培养基不包含IL-7和IL-15。在一些方面，培养基包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-2，并且培养基不包含IL-7和IL-15。在一些方面，培养基包含(i)至少约5mM钾离子和(ii)IL-2和IL-21。在一些方面，培养基包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-2和IL-21。在一些方面，培养基包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-2和IL-21。在一些方面，培养基包含(i)至少约5mM钾离子和(ii)IL-7和IL-21。在一些方面，培养基包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-7和IL-21。在一些方面，培养基包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-7和IL-21。在一些方面，培养基包含(i)至少约5mM钾离子和(ii)IL-15和IL-21。在一些方面，培养基包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-15和IL-21。在一些方面，培养基包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-15和IL-21。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基还包含NaCl，其中钾离子和NaCl的总浓度为从110mM至140mM。
在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM至至少约100mM钾离子和(ii)IL-2。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-2。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-2。在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM至至少约100mM钾离子和(ii)IL-7。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-7。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-7。在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM至至少约100mM钾离子和(ii)IL-15。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-15。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-15。在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM至至少约100mM钾离子和(ii)IL-21。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-21。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-21。在一些方面，MRM不包含IL-7和/或IL-15。
本公开的某些方面涉及离体或体外增加免疫细胞中较低分化的免疫细胞(例如，干样T细胞、NK细胞或TIL，例如，具有TSCM样表型的细胞)的数量的方法，所述方法包括在包含浓度为至少约50mM的钾离子的培养基中培养所述细胞，其中所述培养基包含IL-2。在一些方面，培养基不包含IL-7和/或IL-15。在一些方面，在所述培养基中培养后较低分化的细胞(例如，干样T细胞、NK细胞或TIL，例如，具有TSCM样表型的细胞)的数量高于在包含IL-2、IL-7和IL-15的培养基中培养的较低分化的细胞的数量。
在一些方面，本文所述的培养基(例如MRM(例如包含浓度大于5mM的钾离子))包含约50IU/mL至约500IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含约50IU/mL、约60IU/mL、约70IU/mL、约80IU/mL、约90IU/mL、约100IU/mL、约125IU/mL、约150IU/mL、约175IU/mL、约200IU/mL、约225IU/mL、约250IU/mL、约275IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL或约500IU/mL的IL-2。
因此，在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约50IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约60IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约70IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约80IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约90IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约100IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约125IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约150IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约175IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约200IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约225IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约250IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约275IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约300IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约350IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约400IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约450IU/mL的IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约500IU/mL的IL-2。在一些方面，包含钾离子和IL-2的培养基(例如MRM)还包含浓度小于约115nM的NaCl。
在一些方面，培养基包含至少约0.1ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL IL-2。
在一些方面，培养基包含至少约0.1ng/mL、至少约0.5ng/mL、至少约1ng/mL、至少约2ng/mL、至少约3ng/mL、至少约4ng/mL、至少约5ng/mL、至少约6ng/mL、至少约7ng/mL、至少约8ng/mL、至少约9ng/mL、至少约10ng/mL、至少约11ng/mL、至少约12ng/mL、至少约13ng/mL、至少约14ng/mL、至少约15ng/mL、至少约16ng/mL、至少约17ng/mL、至少约18ng/mL、至少约19ng/mL或至少约20ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约1.0ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约2.0ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约3.0ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约4.0ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约5.0ng/mLIL-2。在一些方面，培养基包含至少约6.0ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约7.0ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约8.0ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约9.0ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约10ng/mL IL-2。
在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约0.1ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含从约50ng/mL至约600ng/mL、约50ng/mL至约500ng/mL、约50ng/mL至约450ng/mL、约50ng/mL至约400ng/mL、约50ng/mL至约350ng/mL、约50ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约600ng/mL、约100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约450ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约350ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约450ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约350ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约250ng/mL至约350ng/mL、约300ng/mL至约600ng/mL、约300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约450ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约350ng/mL、约250ng/mL至约300ng/mL、或约275ng/mL至约325ng/mL IL-2。
在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约50ng/mL、至少约60ng/mL、至少约70ng/mL、至少约80ng/mL、至少约90ng/mL、至少约100ng/mL、至少约110ng/mL、至少约120ng/mL、至少约130ng/mL、至少约140ng/mL、至少约150ng/mL、至少约160ng/mL、至少约170ng/mL、至少约180ng/mL、至少约190ng/mL、至少约200ng/mL、至少约210ng/mL、至少约220ng/mL、至少约230ng/mL、至少约240ng/mL、至少约250ng/mL、至少约260ng/mL、至少约270ng/mL、至少约280ng/mL、至少约290ng/mL、至少约300ng/mL、至少约310ng/mL、至少约320ng/mL、至少约330ng/mL、至少约340ng/mL、至少约350ng/mL、至少约360ng/mL、至少约370ng/mL、至少约380ng/mL、至少约390ng/mL、至少约400ng/mL、至少约410ng/mL、至少约420ng/mL、至少约430ng/mL、至少约440ng/mL、至少约450ng/mL、至少约460ng/mL、至少约470ng/mL、至少约480ng/mL、至少约490ng/mL、至少约500ng/mL、至少约510ng/mL、至少约520ng/mL、至少约530ng/mL、至少约540ng/mL、至少约550ng/mL、至少约560ng/mL、至少约570ng/mL、至少约580ng/mL、至少约590ng/mL、或至少约600ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约50ng/mLIL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约60ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约70ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约73.6ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约75ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约80ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约90ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约100ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约200ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约400ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约500ng/mL IL-2。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约600ng/mL IL-2。
在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约30mM至至少约100mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含大于40mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约45mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约50mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约55mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约60mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约65mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约70mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约75mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约80mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约85mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约90mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖和(v)约10ng/mL IL-2。
在一些方面，培养基包含至少约0.1ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL IL-21。
在一些方面，培养基包含至少约0.1ng/mL、至少约0.5ng/mL、至少约1ng/mL、至少约2ng/mL、至少约3ng/mL、至少约4ng/mL、至少约5ng/mL、至少约6ng/mL、至少约7ng/mL、至少约8ng/mL、至少约9ng/mL、至少约10ng/mL、至少约11ng/mL、至少约12ng/mL、至少约13ng/mL、至少约14ng/mL、至少约15ng/mL、至少约16ng/mL、至少约17ng/mL、至少约18ng/mL、至少约19ng/mL或至少约20ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约1.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约2.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约3.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约4.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约5.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约6.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约7.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约8.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约9.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约10ng/mL IL-21。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约10ng/mL IL-21。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约15ng/mL IL-21。在一些方面，培养基，例如MRM，包含至少约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约25ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约35ng/mL IL-21。
在一些方面，本文所述的培养基(例如MRM(例如包含浓度大于5mM的钾离子))包含约50IU/mL至约500IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基包含约50IU/mL、约60IU/mL、约70IU/mL、约80IU/mL、约90IU/mL、约100IU/mL、约125IU/mL、约150IU/mL、约175IU/mL、约200IU/mL、约225IU/mL、约250IU/mL、约275IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL、或约500IU/mL的IL-21。
在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约50IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约60IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约70IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约80IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约90IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约100IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约125IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约150IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约175IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约200IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约225IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约250IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约275IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约300IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约350IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约400IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约450IU/mL的IL-21。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约500IU/mL的IL-21。在一些方面，包含钾离子和IL-21的培养基(例如MRM)还包含浓度小于约115nM的NaCl。
在一些方面，本文所述的培养基(例如MRM(例如包含浓度大于5mM的钾离子))包含约500IU/mL至约1,500IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基包含约500IU/mL、约550IU/mL、约600IU/mL、约650IU/mL、约700IU/mL、约750IU/mL、约800IU/mL、约850IU/mL、约900IU/mL、约950IU/mL、约1,000IU/mL、约1,050IU/mL、约1,100IU/mL、约1,150IU/mL、约1,200IU/mL、约1,250IU/mL、约1,300IU/mL、约1,350IU/mL、约1,400IU/mL、约1,450IU/mL或约1,500IU/mL的IL-7。
在一些方面，用于本公开的培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约500IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约550IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约600IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约650IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约700IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约750IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约800IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约850IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约900IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约950IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,000IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,050IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,100IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,150IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,200IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,250IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,300IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,350IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,400IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,450IU/mL的IL-7。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约1,500IU/mL的IL-7。在一些方面，包含钾离子和IL-7的培养基(例如MRM)还包含浓度小于约115nM的NaCl。
在一些方面，培养基包含至少约0.1ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL IL-7。
在一些方面，培养基包含至少约0.1ng/mL、至少约0.5ng/mL、至少约1ng/mL、至少约2ng/mL、至少约3ng/mL、至少约4ng/mL、至少约5ng/mL、至少约6ng/mL、至少约7ng/mL、至少约8ng/mL、至少约9ng/mL、至少约10ng/mL、至少约11ng/mL、至少约12ng/mL、至少约13ng/mL、至少约14ng/mL、至少约15ng/mL、至少约16ng/mL、至少约17ng/mL、至少约18ng/mL、至少约19ng/mL或至少约20ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含至少约1.0ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含至少约2.0ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含至少约3.0ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含至少约4.0ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含至少约5.0ng/mLIL-7。在一些方面，培养基包含至少约6.0ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含至少约7.0ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含至少约8.0ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含至少约9.0ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含至少约10ng/mL IL-7。
在一些方面，本文所述的培养基(例如MRM(例如包含浓度大于5mM的钾离子))包含约50IU/mL至约500IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基包含约50IU/mL、约60IU/mL、约70IU/mL、约80IU/mL、约90IU/mL、约100IU/mL、约125IU/mL、约150IU/mL、约175IU/mL、约200IU/mL、约225IU/mL、约250IU/mL、约275IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL、或约500IU/mL的IL-15。
因此，在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约50IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约60IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约70IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约80IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约90IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约100IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约125IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约150IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约175IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约200IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约225IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约250IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约275IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约300IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约350IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约400IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约450IU/mL的IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)浓度高于5mM的钾离子和(ii)约500IU/mL的IL-15。在一些方面，包含钾离子和IL-15的培养基(例如MRM)还包含浓度小于约115nM的NaCl。
在一些方面，培养基包含至少约0.1ng/mL IL-15。在一些方面，培养基包含从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL IL-15。
在一些方面，培养基包含至少约0.1ng/mL、至少约0.2ng/mL、至少约0.3ng/mL、至少约0.4ng/mL、至少约0.5ng/mL、至少约0.6ng/mL、至少约0.7ng/mL、至少约0.8ng/mL、至少约0.9ng/mL、至少约1ng/mL、至少约2ng/mL、至少约3ng/mL、至少约4ng/mL、至少约5ng/mL、至少约6ng/mL、至少约7ng/mL、至少约8ng/mL、至少约9ng/mL、至少约10ng/mL、至少约11ng/mL、至少约12ng/mL、至少约13ng/mL、至少约14ng/mL、至少约15ng/mL、至少约16ng/mL、至少约17ng/mL、至少约18ng/mL、至少约19ng/mL、或至少约20ng/mL IL-15。在一些方面，培养基包含至少约1.0ng/mL IL-15。在一些方面，培养基包含至少约2.0ng/mL IL-15。在一些方面，培养基包含至少约3.0ng/mL IL-15。在一些方面，培养基包含至少约4.0ng/mL IL-15。在一些方面，培养基包含至少约5.0ng/mL IL-15。在一些方面，培养基包含至少约6.0ng/mLIL-15。在一些方面，培养基包含至少约7.0ng/mL IL-15。在一些方面，培养基包含至少约8.0ng/mL IL-15。在一些方面，培养基包含至少约9.0ng/mL IL-15。在一些方面，培养基包含至少约10ng/mL IL-15。在一些方面，培养基还包含NaCl，其中钾离子和NaCl的总浓度为从110mM至140mM。
在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约30mM至至少约100mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含大于40mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约45mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约50mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约55mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约60mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约65mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约70mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约75mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约80mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约85mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约90mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，培养基(例如MRM)包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约300ng/mL IL-2和(vi)约0.4ng/mL IL-15。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子和约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖和(v)约10ng/mL IL-2，其中培养基是低渗的。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约40mM钾离子以及约50ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子以及约10ng/mLIL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约10ng/mL IL-2和(vi)约1ng/mL IL-7，其中培养基是低渗的。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约10ng/mL IL-2和(vi)约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mLIL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约10ng/mL IL-2、(vi)约1ng/mL IL-7和(vii)约1ng/mLIL-15，其中培养基是低渗的。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约10ng/mL IL-2和(vi)约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mLIL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子以及约1ng/mLIL-7和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约1ng/mL IL-7和(vi)约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中培养基是低渗的。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约1ng/mL IL-15和(vi)约1ng/mL IL-2111，其中培养基是低渗的。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM NaCl、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖和(v)约10ng/mL IL-2。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mLIL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约40mM钾离子、NaCl以及约50ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-7，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM NaCl、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约10ng/mL IL-2和(vi)约1ng/mL IL-7。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mLIL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子、NaCl以及约10ng/mLIL-2和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM NaCl、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约10ng/mL IL-2和(vi)约1ng/mL IL-15。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mLIL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM NaCl、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约10ng/mL IL-2、(vi)约1ng/mL IL-7和(vii)约1ng/mLIL-15。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mLIL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子、NaCl以及约10ng/mLIL-2和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子、NaCl以及约10ng/mL IL-2和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM NaCl、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约10ng/mL IL-2和(vi)约1ng/mL IL-21。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mLIL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM NaCl、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约1ng/mL IL-7和(vi)约1ng/mL IL-21。
在某些方面，培养基包含大于40mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mLIL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约45mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约50mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约55mM钾离子、NaCl以及约1ng/mLIL-15和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约60mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约65mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约70mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约75mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约80mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约85mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含至少约90mM钾离子、NaCl以及约1ng/mL IL-15和约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在某些方面，培养基包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM NaCl、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约1ng/mL IL-15和(vi)约1ng/mL IL-21，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
在一些方面，培养基包含大于40mM钾离子、NaCl、约200IU/mL IL-2、约1200IU/mLIL-7、约200IU/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子、NaCl、约200IU/mL IL-2、约1200IU/mL IL-7、约200IU/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子、NaCl、约200IU/mL IL-2、约1200IU/mL IL-7、约200IU/mLIL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子、NaCl、约200IU/mL IL-2、约1200IU/mL IL-7、约200IU/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子、NaCl、约200IU/mL IL-2、约1200IU/mL IL-7、约200IU/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子、NaCl、约200IU/mL IL-2、约1200IU/mL IL-7、约200IU/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子、NaCl、约200IU/mL IL-2、约1200IU/mL IL-7、约200IU/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子、NaCl、约200IU/mL IL-2、约1200IU/mL IL-7、约200IU/mL IL-15，其中所述培养基中钾离子和NaCl的总浓度在110mM和140mM之间。
II.G.基础培养基
本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于包含浓度为至少约5mM的钾离子的培养基中，其中培养基是低渗的或等渗的。本公开的一些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中。本公开的一些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于包含浓度高于40mM的钾离子和浓度小于100mM的NaCl的培养基中。本公开的一些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于包含浓度为至少约50mM的钾离子的培养基中。本公开的一些方面涉及培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于包含浓度为至少约50mM的钾离子和浓度小于90mM的NaCl的培养基中。在一些方面，通过向基础培养基中添加钾离子来制备所述培养基。可使用本领域已知的用于培养细胞(例如，多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的任何基础培养基。
在一些方面，基础培养基还包含一种或多种必需氨基酸。在一些方面，基础培养基包含一种或多种选自以下的必需氨基酸：L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-谷氨酰胺或它们的任何组合。在一些方面，基础培养基包含L-谷氨酰胺。
在一些方面，基础培养基包含至少约0.01mM的一种或多种必需氨基酸。在一些方面，基础培养基包含约0.01mM至约10mM的一种或多种必需氨基酸。在一些方面，基础培养基包含约0.01mM至约10mM、约0.01mM至约9mM、约0.01mM至约8mM、约0.01mM至约7mM、约0.01mM至约6mM、约0.01mM至约5mM、约0.01mM至约4mM、约0.01mM至约3mM、约0.01mM至约2mM、约0.01mM至约1mM、约0.1mM至约10mM、约0.1mM至约9mM、约0.1mM至约8mM、约0.1mM至约7mM、约0.1mM至约6mM、约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约4mM、约0.1mM至约3mM、约0.1mM至约2mM、约0.1mM至约1mM、约1mM至约10mM、约1mM至约9mM、约1mM至约8mM、约1mM至约7mM、约1mM至约6mM、约1mM至约5mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM、或约1mM至约2mM的一种或多种必需氨基酸。
在一些方面，基础培养基包含至少约0.01mM、至少约0.1mM、至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约2mM、至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM、至少约11mM、至少约12mM、至少约13mM、至少约14mM、或至少约15mM或至少约50mM的一种或多种必需氨基酸。
在某些方面，基础培养基包含约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.1mM、约2.2mM、约2.3mM、约2.4mM、约2.5mM、约2.6mM、约2.7mM、约2.8mM、约2.9mM、约3.0mM、约3.1mM、约3.2mM、约3.3mM、约3.4mM、约3.5mM、约3.6mM、约3.7mM、约3.8mM、约3.9mM、约4.0mM、约4.1mM、约4.2mM、约4.3mM、约4.4mM、约4.5mM、约4.6mM、约4.7mM、约4.8mM、约4.9mM、约5.0mM、约5.1mM、约5.2mM、约5.3mM、约5.4mM、约5.5mM、约5.6mM、约5.7mM、约5.8mM、约5.9mM、约6.0mM、约6.1mM、约6.2mM、约6.3mM、约6.4mM、约6.5mM、约6.6mM、约6.7mM、约6.8mM、约6.9mM或约7.0mM的一种或多种必需氨基酸。
在一些方面，基础培养基包含L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含至少约0.01mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约0.01mM至约10mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约0.01mM至约10mM、约0.01mM至约9mM、约0.01mM至约8mM、约0.01mM至约7mM、约0.01mM至约6mM、约0.01mM至约5mM、约0.01mM至约4mM、约0.01mM至约3mM、约0.01mM至约2mM、约0.01mM至约1mM、约0.1mM至约10mM、约0.1mM至约9mM、约0.1mM至约8mM、约0.1mM至约7mM、约0.1mM至约6mM、约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约4mM、约0.1mM至约3mM、约0.1mM至约2mM、约0.1mM至约1mM、约1mM至约10mM、约1mM至约9mM、约1mM至约8mM、约1mM至约7mM、约1mM至约6mM、约1mM至约5mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM、或约1mM至约2mM L-谷氨酰胺。
在一些方面，基础培养基包含至少约0.01mM、至少约0.1mM、至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约2mM、至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM、至少约11mM、至少约12mM、至少约13mM、至少约14mM、或至少约15mM或至少约50mM L-谷氨酰胺。
在某些方面，基础培养基包含约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.1mM、约2.2mM、约2.3mM、约2.4mM、约2.5mM、约2.6mM、约2.7mM、约2.8mM、约2.9mM、约3.0mM、约3.1mM、约3.2mM、约3.3mM、约3.4mM、约3.5mM、约3.6mM、约3.7mM、约3.8mM、约3.9mM、约4.0mM、约4.1mM、约4.2mM、约4.3mM、约4.4mM、约4.5mM、约4.6mM、约4.7mM、约4.8mM、约4.9mM、约5.0mM、约5.1mM、约5.2mM、约5.3mM、约5.4mM、约5.5mM、约5.6mM、约5.7mM、约5.8mM、约5.9mM、约6.0mM、约6.1mM、约6.2mM、约6.3mM、约6.4mM、约6.5mM、约6.6mM、约6.7mM、约6.8mM、约6.9mM或约7.0mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约1.7mM L-谷氨酰胺。在某些方面，基础培养基包含约1.68mM L-谷氨酰胺。
在一些方面，基础培养基包含约0.14mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约0.15mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约1.76mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约1.83mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约1.84mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约1.97mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约2.05mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约2.11mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约2.18mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约5.41mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约5.47mM L-谷氨酰胺。在一些方面，基础培养基包含约<0.10mM L-谷氨酰胺。
在一些方面，基础培养基包含L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含至少约0.01mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约0.01mM至约10mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约0.01mM至约10mM、约0.01mM至约9mM、约0.01mM至约8mM、约0.01mM至约7mM、约0.01mM至约6mM、约0.01mM至约5mM、约0.01mM至约4mM、约0.01mM至约3mM、约0.01mM至约2mM、约0.01mM至约1mM、约0.1mM至约10mM、约0.1mM至约9mM、约0.1mM至约8mM、约0.1mM至约7mM、约0.1mM至约6mM、约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约4mM、约0.1mM至约3mM、约0.1mM至约2mM、约0.1mM至约1mM、约1mM至约10mM、约1mM至约9mM、约1mM至约8mM、约1mM至约7mM、约1mM至约6mM、约1mM至约5mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM、或约1mM至约2mM L-谷氨酸。
在一些方面，基础培养基包含至少约0.01mM、至少约0.1mM、至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约2mM、至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM、至少约11mM、至少约12mM、至少约13mM、至少约14mM、或至少约15mM或至少约50mM L-谷氨酸。
在某些方面，基础培养基包含约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.1mM、约2.2mM、约2.3mM、约2.4mM、约2.5mM、约2.6mM、约2.7mM、约2.8mM、约2.9mM、约3.0mM、约3.1mM、约3.2mM、约3.3mM、约3.4mM、约3.5mM、约3.6mM、约3.7mM、约3.8mM、约3.9mM、约4.0mM、约4.1mM、约4.2mM、约4.3mM、约4.4mM、约4.5mM、约4.6mM、约4.7mM、约4.8mM、约4.9mM、约5.0mM、约5.1mM、约5.2mM、约5.3mM、约5.4mM、约5.5mM、约5.6mM、约5.7mM、约5.8mM、约5.9mM、约6.0mM、约6.1mM、约6.2mM、约6.3mM、约6.4mM、约6.5mM、约6.6mM、约6.7mM、约6.8mM、约6.9mM或约7.0mM L-谷氨酸。
在一些方面，基础培养基包含约0.15mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约0.17mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约0.18mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约0.19mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约0.85mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约0.86mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约0.9mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约0.95mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约1.06mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约1.09mM L-谷氨酸。在一些方面，基础培养基包含约<0.10mM L-谷氨酸。
在一些方面，基础培养基包含二肽。在一些方面，基础培养基包含谷氨酰胺-谷氨酰胺(Gln-Gln)。在一些方面，基础培养基包含丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)。
在一些方面，基础培养基包含至少约0.1mM二肽(例如，Ala-Gln)。在一些方面，基础培养基包含约0.1mM至约50mM二肽(例如，Ala-Gln)。在一些方面，基础培养基包含约0.1mM至约40mM、约0.1mM至约35mM、约0.1mM至约30mM、约0.1mM至约25mM、约0.1mM至约20mM、约1mM至约20mM、约2mM至约20mM、约3mM至约20mM、约4mM至约20mM、约5mM至约20mM、约6mM至约20mM、约7mM至约20mM、约8mM至约20mM、约9mM至约20mM、约10mM至约20mM、约1mM至约10mM、约2mM至约10mM、约3mM至约10mM、约4mM至约10mM、约5mM至约10mM、约6mM至约10mM、约7mM至约10mM、约8mM至约10mM、或约9mM至约10mM二肽(例如，Ala-Gln)。
在一些方面，基础培养基包含至少约0.1mM、至少约1.0mM、至少约2mM、至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM、至少约11mM、至少约12mM、至少约13mM、至少约14mM、至少约15mM、至少约16mM、至少约17mM、至少约18mM、至少约19mM、至少约20mM、至少约25mM、至少约30mM或至少约50mM二肽(例如，Ala-Gln)。
在某些方面，基础培养基包含约1mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM或约2.0mM二肽(例如，Ala-Gln)。在一些方面，基础培养基包含约1.7mM二肽(例如，Ala-Gln)。在某些方面，基础培养基包含约1.68mM二肽(例如，Ala-Gln)。
在某些方面，基础培养基包含约6mM、约6.1mM、约6.2mM、约6.3mM、约6.4mM、约6.5mM、约6.6mM、约6.7mM、约6.8mM、约6.9mM、约7.0mM、约7.1mM或约7.2mM二肽(例如，Ala-Gln)。在一些方面，基础培养基包含约6.8mM二肽(例如，Ala-Gln)。在一些方面，基础培养基包含约6.81mM二肽(例如，Ala-Gln)。在一些方面，基础培养基包含约6.9mM二肽(例如，Ala-Gln)。在一些方面，基础培养基包含约6.96mM二肽(例如，Ala-Gln)。在某些方面，基础培养基包含约7.0mM二肽(例如，Ala-Gln)。
在某些方面，基础培养基包含小于约5mM氨(NH3)。在一些方面，基础培养基包含小于约4mM、小于约3.5mM、小于约3mM、小于约2.5mM、小于约2mM、小于约1.5mM、小于约1mM、小于约0.5mM、小于约0.4mM、小于约0.3mM、小于约0.2mM或小于约0.1mM氨。在某些方面，基础培养基包含约0.01mM氨至小于约2mM氨、约0.01mM氨至小于约1.9mM氨、约0.01mM氨至小于约1.8mM氨、约0.01mM氨至小于约1.7mM氨、约0.01mM氨至小于约1.6mM氨、约0.01mM氨至小于约1.5mM氨、约0.01mM氨至小于约1.4mM氨、约0.01mM氨至小于约1.3mM氨、约0.01mM氨至小于约1.2mM氨、约0.01mM氨至小于约1.1mM氨、约0.01mM氨至小于约1mM氨、约0.01mM氨至小于约0.9mM氨、约0.01mM氨至小于约0.8mM氨、约0.01mM氨至小于约0.7mM氨、约0.01mM氨至小于约0.6mM氨、约0.01mM氨至小于约0.5mM氨、约0.01mM氨至小于约0.4mM氨、约0.01mM氨至小于约0.3mM氨、约0.01mM氨至小于约0.2mM氨、或约0.01mM氨至小于约0.1mM氨。在一些方面，基础培养基包含约1.2mM氨。在一些方面，基础培养基包含约1.25mM氨。在一些方面，基础培养基包含约1.259mM氨。在一些方面，基础培养基包含约1.28mM氨。在一些方面，基础培养基包含约1.3mM氨。在一些方面，基础培养基包含约0.3mM氨。在一些方面，基础培养基包含约0.34mM氨。在一些方面，基础培养基包含约0.35mM氨。在一些方面，基础培养基包含约0.36mM氨。在一些方面，基础培养基包含约0.37mM氨。在一些方面，基础培养基包含小于约0.3mM氨。在一些方面，基础培养基包含小于约0.29mM氨。在一些方面，基础培养基包含小于约0.28mM氨。在一些方面，基础培养基包含小于约0.278mM氨。在一些方面，基础培养基不包含氨。
在一些方面，基础培养基包含乳酸盐。在某些方面，基础培养基不包含乳酸盐。
在一些方面，基础培养基包含钾，例如，在添加钾之前基础培养基包含钾，如本文所述。在一些方面，基础培养基包含小于约10mM钾离子。在一些方面，基础培养基包含约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.1mM、约2.2mM、约2.3mM、约2.4mM、约2.5mM、约2.6mM、约2.7mM、约2.8mM、约2.9mM、约3.0mM、约3.1mM、约3.2mM、约3.3mM、约3.4mM、约3.5mM、约3.6mM、约3.7mM、约3.8mM、约3.9mM、约4.0mM、约4.1mM、约4.2mM、约4.3mM、约4.4mM、约4.5mM、约4.6mM、约4.7mM、约4.8mM、约4.9mM、约5.0mM、约5.1mM、约5.2mM、约5.3mM、约5.4mM、约5.5mM、约5.6mM、约5.7mM、约5.8mM、约5.9mM或约6.0mM钾离子。在某些方面，基础培养基包含约4mM钾离子。
在一些方面，基础培养基选自平衡盐溶液(例如，PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最低必需培养基(GMEM)、α最低必需培养基(αMEM)、伊可夫氏改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、M199、OPTMIZERTMCTSTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)、OPTMIZERTM完全培养基、IMMUNOCULTTMXF(STEMCELLTMTechnologies)、IMMUNOCUL TTMXF、AIMVTM、TEXMACSTM培养基及它们的任何组合。在一些方面，基础培养基包含PRIME-XV T细胞CDM。在一些方面，基础培养基包含OPTMIZERTM。在一些方面，基础培养基包含OPTMI ZERTMPro。在一些方面，基础培养基包含X-VIVOTM 15(LONZA)。在一些方面，基础培养基包含IMMUNOCULTTM。在一些方面，基础培养基不含血清。在一些方面，基础培养基还包含免疫细胞血清替代物(ICSR)。例如，在一些方面，基础培养基包含补充有ICSR的OPT MIZERTM完全培养基、补充有ICSR的AIM V、补充有ICSR的IM MUNOCULTTMXF、补充有ICSR的RPMI、补充有ICSR的TEXM ACSTM或它们的任何组合。在特定方面，基础培养基包括OPTMIZE RTM完全培养基。
在一些方面，培养基，例如MRM，例如第二TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基，还包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。CD3激动剂和/或CD28激动剂可刺激正在培养基中培养的TIL。在一些方面，CD3激动剂可以是能够结合CD3复合物并活化CD3的任何分子。在一些方面，CD3激动剂是小分子。在一些方面，CD3激动剂是蛋白质。在一些方面，CD3激动剂是抗CD3抗体。如本文所用，术语“抗CD3抗体”是指针对T细胞中的CD3复合物的抗体或其变体，例如单克隆抗体并且包括人、人源化、嵌合或鼠抗体。在一些方面，抗CD3抗体包括OKT-3(也称为莫罗单抗(muromonab))和UCHT-1。其他抗CD3抗体包括例如维西珠单抗(visilizumab)、奥昔珠单抗(otelixizumab)和替利珠单抗(teplizumab)。
术语“OKT-3”或“OKT3”是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物类似物或变体，包括人、人源化、嵌合或鼠抗体，并且包括可商购获得的形式诸如OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3纯，Miltenyi Biotech,Inc.,San Diego,Calif.,USA)和莫罗单抗或其变体、保守氨基酸取代、糖型或生物类似物。能够产生OKT-3的杂交瘤保藏在欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC)并且指定目录号86022706。能够产生OKT-3的杂交瘤也保藏在美国典型培养物保藏中心并且指定ATCC保藏号CRL 8001。
在一些方面，CD28激动剂可以是能够活化CD28或其下游途径的任何分子。在一些方面，CD28激动剂是小分子。在一些方面，CD28激动剂是蛋白质。在一些方面，CD28激动剂是抗CD28抗体。如本文所用，术语“抗CD28抗体”是指针对CD28并活化T细胞的抗体或其变体，例如单克隆抗体并且包括人、人源化、嵌合或鼠抗体。在一些方面，抗CD28抗体包括目录号100182-1(BPS Bioscience)、目录号100186-1(BPS Bioscience)。
在一些方面，将CD3激动剂和CD28激动剂一起添加到培养基(例如MRM)中。在一些方面，将CD3激动剂和CD28激动剂在一种组合物中同时添加到培养基(例如MRM)中。在一些方面，依序添加CD3激动剂和CD28激动剂。在一些方面，培养基，例如MRM，例如第二TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基，包含和/或补充有包含CD3激动剂和CD28激动剂两者的取代物，例如TRANSACTTM。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约1:100TRANSACTTM。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约1:150TRANSACTTM。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约1:200TRANSACTTM。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约1:250TRANSACTTM。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约1:300TRANSACTTM。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约1:350TRANSACTTM。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约1:400TRANSACTTM。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约1:450TRANSACTTM。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约1:500TRANSACTTM。
在一些方面，培养基，例如MRM，例如第二TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基，包含和/或补充有TRANSACTTM替代物。人工抗原呈递细胞(aAPC)诸如基因工程化的人K562 aAPC可用于快速扩增TIL。在一些方面，通过用包含编码CD70、CD80、CD86、41BB配体和OX40配体的基因的多顺反子慢病毒载体转导K562细胞来生成aAPC。K562细胞不表达HLA-A、HLA-B或HLA-DR分子，这使得它们在用上述共刺激配体转导时成为T细胞扩增的有力工具(参见例如Suhoski等人,Molecular therapy,2007)。在一些方面，第二TIL扩增和/或第三TIL扩增包括将TIL与aAPC+OKT3共培养。在一些方面，第二TIL扩增和/或第三TIL扩增包括在OKT3(例如至少约30ng/mL OKT3)而不是TRANSACTTM的存在下将TIL与经辐照的APC(例如，PBMC)共培养。在一些方面，免疫细胞(例如TIL)与饲养细胞(例如aAPC)的比率为至少约1:50、至少约1:100、至少约1:150、至少约1:200、至少约1:250、至少约1:300、至少约1:350、至少约1:400、至少约1:450、或至少约1:500。在一些方面，免疫细胞(例如TIL)与饲养细胞(例如aAPC)的比率为至少约1:100。在一些方面，免疫细胞(例如TIL)与饲养细胞(例如aAPC)的比率为至少约1:200。
在一些方面，培养基，例如MRM，例如第二TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基，包含和/或补充有CD27配体(CD27L)。CD27配体(CD70)能够与其受体结合，然后在结合后，该受体能够生成并长期维持T细胞免疫。CD27是TNF-受体超家族的成员。CD27，一种120kDa的跨膜同型二聚体磷酸糖蛋白，似乎也具有共刺激作用。CD27L，CD70，是响应抗原刺激在T和B细胞上表达的跨膜糖蛋白；因此，它被认为是活化早期的标志物。在体外，T细胞上的CD27和B细胞上的CD70的相互作用在增殖方面增强了T细胞活化，但仅分泌相对少量的IL-2。敲除小鼠的研究已表明，CD27在初始T细胞活化中起很小的作用，但对于T细胞记忆的生成是至关重要的。
在一些方面，培养基，例如MRM，例如第二TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基，包含约0.1μg/ml至约50μg/ml CD27L。在一些方面，培养基(例如MRM)包含和/或补充有约0.1μg/ml至约40μg/ml、约0.1μg/ml至约30μg/ml、约0.1μg/ml至约20μg/ml、约0.1μg/ml至约10μg/ml、约0.1μg/ml至约5μg/ml、约1μg/ml至约10μg/ml、约2μg/ml至约10μg/ml、约3μg/ml至约10μg/ml、约4μg/ml至约10μg/ml、约5μg/ml至约10μg/ml、约1μg/ml至约9μg/ml、约1μg/ml至约8μg/ml、约1μg/ml至约7μg/ml、约1μg/ml至约6μg/ml、约1μg/ml至约5μg/ml、约3μg/ml至约7μg/ml、约4μg/ml至约6μg/ml、约3μg/ml至约6μg/ml、或约4μg/ml至约7μg/ml CD27L。
在一些方面，培养基，例如MRM，例如第二TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基，包含和/或补充有至少约0.1μg/ml、至少约1μg/ml、至少约2μg/ml、至少约3μg/ml、至少约4μg/ml、至少约5μg/ml、至少约6μg/ml、至少约7μg/ml、至少约8μg/ml、至少约9μg/ml、至少约10μg/ml、至少约11μg/ml、至少约12μg/ml、至少约13μg/ml、至少约14μg/ml、至少约15μg/ml、至少约16μg/ml、至少约17μg/ml、至少约18μg/ml、至少约19μg/ml、至少约20μg/ml、至少约25μg/ml、至少约30μg/ml、或至少约50μg/ml CD27L。在一些方面，培养基(例如MRM)包含和/或补充有至少约5μg/ml CD27L。
在一些方面，培养基，例如MRM，例如第二TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基，包含和/或补充有4-1BB配体(4-1BBL)。4-1BBL(4-1BB配体，CD137L)存在于APC(抗原呈递细胞)上并与4-1BB(也称为CD137)结合，其是一种属于TNF超家族的2型跨膜糖蛋白受体，其在活化的T淋巴细胞上表达。4-1BB配体可用于体外活化T细胞。在一些方面，培养基，例如MRM，例如第二TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基，包含约0.1μg/ml至约50μg/ml CD27L。在一些方面，培养基(例如MRM)包含和/或补充有约0.1μg/ml至约10μg/ml、约0.1μg/ml至约9μg/ml、约0.1μg/ml至约8μg/ml、约0.1μg/ml至约7μg/ml、约0.1μg/ml至约6μg/ml、约0.1μg/ml至约5μg/ml、约0.1μg/ml至约4μg/ml、约0.1μg/ml至约3μg/ml、约0.1μg/ml至约2μg/ml、约0.1μg/ml至约1μg/ml、1μg/ml至约10μg/ml、约1μg/ml至约5μg/ml、约1μg/ml至约4μg/ml、约1μg/ml至约3μg/ml、或约1μg/ml至约2μg/ml 4-1BBL。
在一些方面，培养基，例如MRM，例如第二TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基，包含和/或补充有至少约0.1μg/ml、至少约0.2μg/ml、至少约0.3μg/ml、至少约0.4μg/ml、至少约0.5μg/ml、至少约0.6μg/ml、至少约0.7μg/ml、至少约0.8μg/ml、至少约0.9μg/ml、至少约1μg/ml、至少约1.1μg/ml、至少约1.2μg/ml、至少约1.3μg/ml、至少约1.4μg/ml、至少约1.5μg/ml、至少约1.6μg/ml、至少约1.7μg/ml、至少约1.8μg/ml、至少约1.9μg/ml、至少约μg/ml、至少约2μg/ml、至少约3μg/ml、至少约4μg/ml、至少约5μg/ml、或至少约10μg/ml 4-1BBL。在一些方面，培养基(例如MRM)包含和/或补充有至少约1μg/ml 4-1BBL。
在一些方面，将4-1BBL与CD27L一起添加到培养基(例如MRM)中。在一些方面，将4-1BBL与CD27L同时添加到培养基(例如MRM)中。在一些方面，依序将4-1BBL与CD27L添加到培养基(例如MRM)中。在一些方面，在扩增过程(例如第二扩增和/或最终扩增)期间使用的培养基(例如MRM)包含TRANSACTTM、4-1BBL和CD27L。在一些方面，培养基(例如MRM)包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L。在一些方面，在扩增过程(例如第二扩增和/或最终扩增)期间使用的培养基(例如MRM)包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L。
在一些方面，培养基(例如MRM，例如初始TIL培养基、第二TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)改良自选自以下的基础培养基：平衡盐溶液(例如PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、克里克氏培养基、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最低必需培养基(GMEM)、α最低必需培养基(αMEM)、伊可夫氏改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、M199、OPTMIZERTMCTSTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)、OPTMIZERTM完全培养基、IMM UNOCULTTMXF(STEMCELLTMTechnologies)、IMMUNOCULTTMXF、AIM VTM、TEXMACSTM培养基及它们的任何组合。在一些方面，基础培养基不含血清。在一些方面，基础培养基还包含免疫细胞血清替代物(ICSR)。例如，在一些方面，基础培养基包含补充有ICSR的OPTMIZERTM完全培养基、补充有ICSR的AIM V、补充有ICSR的IMMUNOCULTTMXF、补充有ICSR的RPMI、补充有ICSR的TEX MACSTM或它们的任何组合。在特定方面，基础培养基包括OPTMIZ ERTM完全培养基。在一些方面，合适的基础培养基包括克里克氏培养基、OPTIMIZERTM 培养基、/>T细胞扩增培养基(Sigma-Aldrich)、AIM VTM培养基/> 培养基(MiltenyiBiotech)、IMMUNOCULTTM培养基(Stem Cell Technologies)、/>T细胞扩增XSFM(Irvine Scientific)、伊可夫氏培养基和/或RPMI-1640培养基。
本公开包括包含基础培养基、NaCl、KCl、钙和葡萄糖的培养基(例如MRM)，其中NaCl的浓度在约40mM和约80mM之间，KCl的浓度在40mM和90mM之间，钙的浓度在约0.5mM和约2.8mM之间，并且葡萄糖的浓度在约10mM和约24mM之间。
在一些方面，培养基(例如MRM)还包含免疫细胞。在一些方面，免疫细胞包含TIL。
在一些方面，培养基(例如MRM)还包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任何组合。在一些方面，培养基(例如MRM)还包含IL-2和IL-21。在一些方面，IL-2的浓度为约200ng/ml至约400ng/ml(例如，约200ng/ml、约300ng/ml或约400ng/ml)。在一些方面，IL-21的浓度为约20ng/ml至约40ng/ml(例如，约20ng/ml、约30ng/ml或约40ng/ml)。
在一些方面，培养基(例如MRM)还包含约2.5％血清补充物(CTSTMImmune Cell SR，Thermo Fisher)、2mM L-谷氨酰胺、2mM L-glutamax、MEM非必需氨基酸溶液、Pen-strep、20μg/ml FUNGINTM、丙酮酸钠或它们的任何组合。在一些方面，培养基(例如MRM)还包含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐。在一些方面，培养基(例如MRM)还包含激酶抑制剂。
在一些方面，培养基(例如MRM)还包含CD3激动剂。在一些方面，CD3激动剂是抗CD3抗体。在一些方面，抗CD3抗体包含OKT-3。
在一些方面，培养基(例如MRM)还包含CD28激动剂。在一些方面，CD28激动剂是抗CD28抗体。在一些方面，培养基(例如MRM)还包含CD27配体(CD27L)。在一些方面，培养基(例如MRM)还包含4-1BB配体(4-1BBL)。
在一些方面，本公开包括包含本文所公开的培养基(例如MRM)的细胞培养物、包含本文所公开的培养基(例如MRM)的细胞袋、或包含本文所公开的培养基(例如MRM)的生物反应器。
II.H.细胞
本公开的一些方面涉及培养细胞(例如免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于如本文所公开的包含浓度为至少约5mM的钾离子的低渗或等渗培养基中。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于如本文所公开的包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于如本文所公开的包含浓度为至少约50mM的钾离子的培养基中。本公开的一些方面涉及培养细胞(例如免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))的方法，该方法包括将细胞置于如本文所公开的包含浓度为至少约40mM至至少约90mM的钾离子的培养基中。
本公开的一些方面涉及培养细胞(例如，本文所公开的人免疫细胞和/或干细胞)的方法，所述方法包括将细胞置于如本文所公开的包含浓度为至少约40mM的钾离子和浓度小于100mM的NaCl的培养基中。本公开的某些方面涉及培养细胞(例如，本文所公开的人免疫细胞和/或干细胞)的方法，所述方法包括将所述细胞置于如本文所公开的包含浓度为至少约50mM的钾离子和浓度小于90mM的NaCl的培养基中。
置于培养基中的细胞可以是从需要疗法的受试者收集和/或分离的细胞。在一些方面，置于培养基中的细胞在培养之前已经被工程化。在一些方面，置于培养基中的细胞已经被扩增。在一些方面，置于培养基中的TIL在被置于本文所公开的培养基(例如MRM)中之前已被扩增。置于培养基中的细胞可以被称为起始(初始，即患者样品、单采样品、血沉棕黄层)细胞。由在本文所公开的培养基中培养细胞产生的细胞可以被称为所得(培养的)细胞。
本文所公开的方法提供了促进培养的多能或多潜能细胞的较低分化表型的培养条件。因此，本文所公开的方法和培养基用于培养多潜能(例如多能)细胞类型。在一些方面，可使用本文所公开的方法培养的细胞是多潜能细胞。在一些方面，细胞是多能细胞。在某些方面，多能细胞包括胚胎干细胞(ESC)。在某些方面，多能细胞包括诱导的多能干细胞(iPSC)。在一些方面，细胞是造血干细胞。
在某些方面，细胞是免疫细胞。在一些方面，起始免疫细胞分离自人受试者。在一些方面，起始免疫细胞分离自用于同种异体细胞疗法的人受试者。在一些方面，起始免疫细胞分离自用于自体细胞疗法的人受试者。在一些方面，细胞是T细胞。在一些方面，细胞是NK细胞。在一些方面，细胞是TIL。在一些方面，细胞是Treg。在一些方面，细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)分离自人受试者。在一些方面，免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或肿瘤浸润NK细胞。在某些方面，细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)是工程化的。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)被工程化以包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)被工程化以包含工程化的T细胞受体(TCR)。
在一些方面，细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)在根据本文所公开的方法培养之前被工程化。在一些方面，细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)在根据本文所公开的方法培养之后被工程化。在一些方面，在细胞工程化之前/期间和之后，根据本文所公开的方法(例如在包含至少50mM钾离子的低渗或等渗培养基中)培养细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)被工程化以表达工程化的T细胞受体(TCR)。在某些方面，在本文所公开的条件下(例如在包含至少约50mM钾离子的低渗或等渗培养基中)培养细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)导致更高的转导效率。在一些方面，与在包含4mM钾离子或更少的培养基中培养的细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)相比，根据本文所公开的方法在包含至少约60mM钾离子的低渗或等渗培养基中培养的细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)中的转导效率高至少约2倍。在一些方面，与在包含4mM钾离子或更少的培养基中培养的细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)相比，根据本文所公开的方法在包含至少约65mM钾离子的低渗或等渗培养基中培养的细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)中的转导效率高至少约2.5倍。
在一些方面，细胞包含表达抗原受体和/或另一种另外的多肽的构建体。在一些方面中，抗原受体包含抗体、工程化的抗体(诸如scFv)、CAR、工程化的TCR、TCR模拟物(例如，抗体-T细胞受体(abTCR)或嵌合抗体-T细胞受体(caTCR))或嵌合信号传导受体(CSR)。举例而言，TCR可以包含工程化的TCR，其中TCR(例如，α/βTCR或γ/δTCR)的抗原结合结构域已由抗体(具有或不具有抗体的恒定结构域)的抗原结合结构域置换；然后工程化的TCR变得对抗体的抗原具有特异性，同时保持TCR的信号传导功能。嵌合信号传导受体可以包含(1)细胞外结合结构域(例如，天然/修饰的受体细胞外结构域、天然/修饰的配体细胞外结构域、scFv、纳米抗体、Fab、DARPin和亲和体分子(affibody))，(2)跨膜结构域，和(3)细胞内信号传导结构域(例如，活化转录因子或者募集和/或活化JAK/STAT、激酶、磷酸酶和泛素；SH3；SH2；和PDZ的结构域)。参见例如，EP340793B1、WO 2017/070608、WO 2018/200582、WO 2018/200583、WO 2018/200585，以及Xu等人,Cell Discovery(2018)4:62。
在一些方面，抗原受体靶向感兴趣的抗原(例如，肿瘤抗原或病原体的抗原)。抗原可包括但不限于AFP(甲胎蛋白)、αvβ6或另一种整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、Braf、CA9(碳酸酐酶9)、CCL-1(C-C基序趋化因子配体1)、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD45、CD47、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD98、CD123、CD138、CD171、CD352、CEA(癌胚抗原)、封闭蛋白18.2、封闭蛋白6、c-MET、DLL3(δ样蛋白3)、DLL4、ENPP3(外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3)、EpCAM、EPG-2(上皮糖蛋白2)、EPG-40、ephrinB2、EPHa2(肾上腺素受体A2)、ERBB二聚体、雌激素受体、ETBR(内皮素B受体)、FAP-α(成纤维细胞活化蛋白α)、胎儿AchR(胎儿乙酰胆碱受体)、FBP(叶酸结合蛋白)、FCRL5、FR-α(叶酸受体α)、GCC(鸟苷酸环化酶C)、GD2、GD3、GPC2(磷脂酰肌醇蛋白聚糖2)、GPC3、gp100(糖蛋白100)、GPNMB(糖蛋白NMB)、GPRC5D(G蛋白偶联受体5D)、HER2、HER3、HER4、乙型肝炎表面抗原、HLA-A1(人白细胞抗原Al)、HLA-A2(人白细胞抗原A2)、HMW-MAA(人高分子量黑素瘤相关抗原)、IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)、Igκ、Igλ、IL-22Ra(IL-22受体α)、IL-13Ra2(IL-13受体α2)、KDR(激酶插入结构域受体)、LI细胞粘附分子(LI-CAM)、Liv-1、LRRC8A(富含亮氨酸重复蛋白8家族成员A)、Lewis Y、黑素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1(黑色素A)、鼠巨细胞病毒(MCMV)、MCSP(黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、间皮素、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、MHC/肽复合物(例如与源自AFP、KRAS、NY-ESO、MAGE-A和WT1的肽复合的HLA-A)、NCAM(神经细胞粘附分子)、Nectin-4、NKG2D(自然杀伤2组成员D)配体、NY-ESO、癌胚抗原、PD-1、PD-L1、PRAME(黑素瘤优先表达的抗原)、孕酮受体、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、ROR1、ROR2、SIRPα(信号调节蛋白α)、SLIT、SLITRK6(NTRK样蛋白6)、STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原1)、存活蛋白、TAG72(肿瘤相关糖蛋白72)、TPBG(滋养层糖蛋白)、Trop-2、VEGFR1(血管内皮生长因子受体1)、VEGFR2、以及来自HIV、HBV、HCV、HPV和其他病原体的抗原。
在某些方面，抗原受体靶向hTERT。在一些方面，抗原受体靶向KRAS。在一些方面，抗原受体靶向Braf。在一些方面，抗原受体靶向TGFβRII。在一些方面，抗原受体靶向MAGEA10/A4。在一些方面，抗原受体靶向AFP。在一些方面，抗原受体靶向PRAME。在一些方面，抗原受体靶向MAGE A1。在一些方面，抗原受体靶向WT-1。在一些方面，抗原受体靶向NY-ESO。在一些方面，抗原受体靶向PRAME。在一些方面，抗原受体靶向NY-ESO。在一些方面，抗原受体靶向CD19。
在一些方面，抗原受体靶向BCMA。在一些方面，抗原受体靶向CD147。在一些方面，抗原受体靶向CD19。在一些方面，抗原受体靶向CD19和CD22。在一些方面，抗原受体靶向CD19和CD28。在一些方面，抗原受体靶向CD20。在一些方面，抗原受体靶向CD20和CD19。在一些方面，抗原受体靶向CD22。在一些方面，抗原受体靶向CD30。在一些方面，抗原受体靶向CEA。在一些方面，抗原受体靶向DLL3。在一些方面，抗原受体靶向EGFRvIII。在一些方面，抗原受体靶向GD2。在一些方面，抗原受体靶向HER2。在一些方面，抗原受体靶向IL-1RAP。在一些方面，抗原受体靶向间皮素。在一些方面，抗原受体靶向methothelin。在一些方面，抗原受体靶向NKG2D。在一些方面，抗原受体靶向PSMA。在一些方面，抗原受体靶向TnMUC1。
在一些方面，免疫细胞是TIL。在一些方面，TIL存在于从受试者获得的肿瘤样品中。因此，在一些方面，该方法包括将肿瘤样品置于本文所公开的MRM中。在标准TIL培养期间，将肿瘤样品(例如肿瘤活检或其碎片)铺板在初始TIL培养基中，并培养至少约14-19天。在一些方面，在初始TIL培养中将肿瘤样品(例如肿瘤活检)在MRM中培养至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天。至少约20天、至少约21天。在一些方面，初始TIL培养持续约14天。在一些方面，初始TIL培养持续足够的天数，直至产生约2x106至约10x106个细胞的细胞产量。
在一些方面，与初始TIL培养前CD8+TIL与非CD8+TIL的比例相比，初始TIL培养后CD8+TIL与非CD8+TIL的比例(例如，CD8+TIL与CD4+TIL的比例)增加。在一些方面，与在基础培养基或不包含增加浓度的钾离子的培养基(对照培养基)中的初始TIL培养后CD8+TIL与非CD8+TIL的比例相比，初始TIL培养后CD8+TIL与非CD8+TIL的比例(例如，CD8+TIL与CD4+TIL的比例)增加。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约45倍、或至少约50倍。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约40倍。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约50倍。
在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、至少约250％、至少约300％。至少约350％、至少约400％、至少约450％、或至少约500％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约20％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约40％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约60％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约80％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约100％。
在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约20％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约30％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约40％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约50％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约60％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约70％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约75％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约80％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约90％。
在一些方面，肿瘤样品分离自人受试者。在一些方面，扩增从人受试者分离的起始肿瘤样品和其中的TIL用于同种异体细胞疗法。在一些方面，肿瘤样品分离自人受试者，并且其中的TIL被扩增用于自体细胞疗法。
II.H.1.嵌合抗原受体(CAR)
在一些方面，细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)包含CAR。在一些方面，可以制备以表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞)是例如CD8+T细胞或CD4+ T细胞。在一些方面，本文所公开的CAR表达细胞是CAR T细胞，例如单CAR T细胞、基因组编辑的CAR T细胞、双CAR T细胞或串联CAR T细胞。国际申请号PCT/US2019/044195中提供了此类CAR T细胞的示例。
在一些方面，CAR特异性地结合(即靶向)在肿瘤细胞(诸如恶性B细胞、恶性T细胞或恶性浆细胞)上表达的一种或多种抗原。
在一些方面，CAR特异性地结合(即靶向)选自由以下组成的组的抗原：CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPVE6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白(surviving)、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分或它们的任何组合。
在一些方面，CAR靶向BCMA。在一些方面，CAR靶向CD147。在一些方面，CAR靶向CD19。在一些方面，CAR靶向ROR1。在一些方面，CAR靶向GPC3。在一些方面，CAR靶向GPC2。在一些方面，CAR靶向CD19和CD22。在一些方面，CAR靶向CD19和CD28。在一些方面，CAR靶向CD20。在一些方面，CAR靶向CD20和CD19。在一些方面，CAR靶向CD22。在一些方面，CAR靶向CD30。在一些方面，CAR靶向CEA。在一些方面，CAR靶向DLL3。在一些方面，CAR靶向EGFRvIII。在一些方面，CAR靶向GD2。在一些方面，CAR靶向HER2。在一些方面，CAR靶向IL-1RAP。在一些方面，CAR靶向间皮素。在一些方面，CAR靶向methothelin。在一些方面，CAR靶向NKG2D。在一些方面，CAR靶向PSMA。在一些方面，CAR靶向TnMUC1。
在某些方面，CAR包含特异性地结合与MHC复合的抗原的抗原结合结构域。在一些方面，CAR包含来自TCRm(例如，本文所公开的任何TCRm)的抗原结合结构域。
II.H.2.T细胞受体工程化(TCR)的细胞
在一些方面，本文所公开的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)包含T细胞受体(TCR)，例如工程化的TCR。在一些方面，TCR特异性地结合肿瘤抗原。如本文所用，术语“工程化的TCR”或“工程化的T细胞受体”是指经工程化以所需亲和力与主要组织相容性复合物(MHC)/肽靶抗原特异性地结合的T细胞受体(TCR)，该主要组织相容性复合物/肽靶抗原被选择、克隆和/或随后引入免疫细胞群(例如，T细胞和/或NK细胞)中。在一些方面，TCR特异性地结合从癌症患者中鉴定的新抗原。
在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)在肿瘤细胞(诸如恶性B细胞、恶性T细胞或恶性浆细胞)上表达的一种或多种抗原。
在某些方面，本公开的工程化的细胞可以表达靶向抗原的T细胞受体(TCR)。在一些方面，TCR工程化的细胞能够主要靶向以下类型：共有的肿瘤相关抗原(共有的TAA)和独特的肿瘤相关抗原(独特的TAA)或肿瘤特异性抗原。前者可以包括但不限于睾丸癌(CT)抗原、过表达抗原和分化抗原，而后者可以包括但不限于新抗原和肿瘤病毒抗原。人乳头瘤病毒(HPV)E6蛋白和HPV E7蛋白属于肿瘤病毒抗原的范畴。
在一些方面，TCR工程化的细胞可以靶向CT抗原，例如黑素瘤相关抗原(MAGE)，包括但不限于MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9.23、MAGE-A10和MAGE-A12。在一些方面，TCR工程化的细胞可以靶向糖蛋白(gp100)、T细胞识别的黑素瘤抗原(MART-1)和/或酪氨酸酶，它们主要在黑素瘤和正常黑素细胞中发现。在一些方面，TCR工程化的细胞可以靶向维尔姆斯瘤1(WT1)，即一种在大多数急性髓样白血病(AML)、急性淋巴样白血病、几乎每种类型的实体瘤和几种关键组织诸如心脏组织中高度表达的过表达抗原。在一些方面，TCR工程化的细胞可以靶向间皮素，即另一种在间皮瘤中高度表达但也存在于几种组织(包括气管)的间皮细胞上的过表达抗原。
在一些方面，TCR工程化的细胞可以靶向任何新抗原，其可以由单独肿瘤特异性的随机体细胞突变形成。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)选自由以下组成的组的癌症抗原：AFP、Braf、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白(surviving)、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分或它们的任何组合。
在某些方面，TCR特异性地结合(即靶向)hTERT。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)KRAS。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)Braf。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)TGFβRII。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)MAGE A10/A4。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)AFP。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)PRAME。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)MAGE A1。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)WT-1。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)NY-ESO。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)PRAME。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)NY-ESO。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)CD19。在某些方面，TCR特异性地结合从癌症患者中鉴定的新抗原。
在一些方面，TCR包含细胞内γ/δ结构域。在一些方面，TCR是抗体-T细胞受体(AbTCR)(参见例如Xu等人,Cell Discovery 4:62(2018)，其以引用的方式整体并入本文)。
II.H.3.T细胞受体模拟物(TCRm)
在一些方面，本文所公开的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)包含T细胞受体模拟物(TCRm)，也称为TCR样抗体。TCRm是识别包含肽和MHC-I分子两者的表位的一类抗体，所述识别类似于T细胞上TCR对此类复合物的识别(参见例如Traneska等人,Front.Immunol.8(1001):1-12(2017)，其以引用的方式整体并入本文)。在一些方面，TCRm特异性地结合肿瘤抗原。在某些方面，TCRm特异性地结合从癌症患者中鉴定的新抗原。
在一些方面，TCRm特异性地结合(即靶向)在肿瘤细胞(诸如恶性B细胞、恶性T细胞或恶性浆细胞)上表达的一种或多种抗原。在一些方面，TCRm是单克隆抗体。在一些方面，TCRm特异性地结合WT1。在一些方面，TCRm特异性地结合WT1的片段。在一些方面，TCRm包含ESK1(参见例如Ataie等人,J.Mol.Biol.428(1):194-205(2016)，其以引用的方式整体并入本文)。在一些方面，TCRm特异性地结合MAGE-A1。在一些方面，TCRm特异性地结合p68 RNA解旋酶/HLA-A*02:01。在一些方面，TCRm特异性地结合hCG-b/HL A-A*02:01。在一些方面，TCRm特异性地结合Her2-E75/HLA-A*02:01。在一些方面，TCRm特异性地结合在HLA-A*02:01环境中的PR-1(参见例如Oncoimmunology 5(1):e1049803(2015年6月)，其以引用的方式整体并入本文)。在一些方面，TCRm特异性地结合在HLA-A*24上呈递的存活素-2B衍生的九聚体肽AYACNTSTL(SV2B80-88)(SV2B80-88/HLA-A*24)(参见例如，Kurosawa等人,NatureScient ific Reports 9(9827):1-11(2019)，其以引用的方式整体并入本文)。在一些方面，TCRm特异性地结合一种或多种肿瘤相关的PRAME肽/HLA-I抗原(参见例如J ClinInvest.127(7):2705-18(2017)，其以引用的方式整体并入本文)。在一些方面，TCRm特异性地结合酪氨酸酶。在一些方面，TCRm特异性地结合端粒酶催化亚基。在一些方面，TCRm特异性地结合糖蛋白100(gp100)。在一些方面，TCRm特异性地结合粘蛋白1(MUC1)。在一些方面，TCRm特异性地结合人端粒酶逆转录酶(hTERT)。在一些方面，TCRm特异性地结合NYESO-1。在一些方面，TCRm特异性地结合MART-1。在一些方面，TCR m特异性地结合PRAME。
在一些方面，TCRm特异性地结合病毒抗原。在一些方面，TCRm特异性地结合Env183/A2(Hep B/HLA-A*02:01)。在一些方面，TCRm特异性地结合KP14/1和KP15/11(HIV包膜gp160/HLAA*02:01)。在一些方面，TCRm特异性地结合RL36A(西尼罗病毒/小鼠H-2Db)。在一些方面，TCRm特异性地结合来源于HTLV的病毒表位。在一些方面，TCRm特异性地结合来源于流感的病毒表位。在一些方面，TCRm特异性地结合来源于CMV的病毒表位。在一些方面，TCRm特异性地结合来源于HIV的病毒表位。
II.I.TIL分离、扩增和收获
任何TIL分离、培养和/或扩增的方法可根据本文所公开的方法进行改进，例如通过在本文描述的培养基中培养和/或扩增TIL。
通常，TIL从获自人受试者的肿瘤样品获得。从受试者获得肿瘤活检的任何方法可用于本文所公开的方法，只要肿瘤样品含有肿瘤和TIL的混合物。在一些方面，通过肿瘤切除分离肿瘤样品。在一些方面，通过针吸活检分离肿瘤样品。在一些方面，肿瘤样品包括实体瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。在其他方面，肿瘤样品包括液体肿瘤，诸如从血液恶性肿瘤获得的肿瘤。肿瘤可以是任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、肝癌(包括但不限于肝细胞癌)和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑素瘤)。在一些方面，在TIL分离/扩增之前将肿瘤样品冷冻保存。在一些方面，肿瘤样品是新鲜的，例如没有冷冻保存。在一些方面，将肿瘤样品直接置于MRM培养基中。
在一些方面，供体患者(例如，从其获得肿瘤的受试者)是未经治疗的(即，患者尚未接受用于治疗肿瘤的先前疗法)。在一些方面，供体患者已接受一种或多种用于治疗肿瘤的先前疗法。在一些方面，受试者已接受至少一种先前疗法、至少两种先前疗法、至少三种先前疗法或至少四种先前疗法。在一些方面，受试者对于一种或多种先前疗法是复发性或难治性的。
在一些方面，受试者已接受一种或多种先前抗癌疗法。在一些方面，先前抗癌疗法包括标准护理疗法。在一些方面，先前抗癌疗法包括免疫疗法。在一些方面，先前疗法包括包含检查点抑制剂的免疫疗法。在一些方面，先前疗法包括包含抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体或它们的任何组合的免疫疗法。
在一些方面，在切除肿瘤样品之前向受试者施用一种或多种增强TIL的分离和/或扩增的疗法。在一些方面，向受试者施用激酶抑制剂或ITK抑制剂。激酶抑制剂和/或ITK抑制剂的示例可见于例如国际公开号WO2019217753中，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，在初始扩增和/或第二扩增期间将激酶抑制剂和/或ITK抑制剂添加到培养基中。在一些方面，ITK抑制剂选自由以下组成的组：基于氨基噻唑的ITK抑制剂、基于苯并咪唑的ITK抑制剂、基于氨基嘧啶的ITK抑制剂、基于3-氨基吡啶-2-酮的ITK抑制剂、基于吲哚基吲唑的ITK抑制剂、基于吡唑基吲哚的抑制剂、噻吩并吡唑抑制剂和靶向ATP口袋中半胱氨酸-442的ITK抑制剂。在一些方面，ITK抑制剂选自由以下组成的组：依鲁替尼(ibrutinib)、达沙替尼(dasatinib)、博舒替尼(bosutinib)、尼罗替尼(nilotinib)、埃罗替尼(erlotinib)、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及它们的任何组合。
在一些方面，将肿瘤样品切成较小碎片。在一些方面，较小碎片中的一者或多者为至少约1mm2、至少约1.5mm2、至少约2mm2、至少约2.5mm2、至少约3mm2、至少约3.5mm2、至少约4mm2、至少约4.5mm2、至少约5mm2、至少约5.5mm2、至少约6mm2、或至少约6.5mm2。在一些方面，较小碎片中的一者或多者为至少约1mm3、至少约1.5mm3、至少约2mm3、至少约2.5mm3、至少约3mm3、至少约3.5mm3、至少约4mm3、至少约4.5mm3、至少约5mm3、至少约5.5mm3、至少约6mm3、至少约6.5mm3、至少约7mm3、至少约7.5mm3、至少约8mm3、至少约8.5mm3、至少约9mm3、至少约9.5mm3、或至少约10mm3。在一些方面，通过在酶促培养基(例如，补充有谷氨酸盐(例如，约2mM)、庆大霉素(例如，约10mcg/mL)、DNA酶(例如，约30单位/mL)和胶原酶(例如，约1.0mg/mL)的RPMI 1640缓冲液)中培养肿瘤样品，对肿瘤样品进行酶促消化。在一些方面，通过将肿瘤置于酶促培养基中并机械解离(即，解聚)肿瘤(例如，约1分钟)，接着在37℃下在5％CO2中孵育(例如，30分钟)，接着在前述条件下重复机械解离和孵育的循环，直至仅存在小的组织块，从而产生肿瘤消化物。在该过程结束时，如果细胞悬浮液含有大量的红细胞或死细胞，则可使用FICOLL分支亲水多糖进行密度梯度分离以去除这些细胞。
机械和/或酶促解离可在任何培养基中进行。在一些方面，机械和/或酶促解离在本文所公开的MRM培养基中进行。
在一些方面，机械解离包括向切除的肿瘤施加物理压力。在一些方面，机械解离包括重复物理压力。在一些方面，每分钟施加重复物理压力至少约50次、至少约60次、至少约70次、至少约80次、至少约90次、至少约100次、至少约110次、至少约120次、至少约130次、至少约140次、至少约150次、至少约160次、至少约170次、至少约180次、至少约190次、至少约200次、至少约210次、至少约220次、至少约230次、至少约240次、至少约250次、至少约260次、至少约270次、至少约280次、至少约290次、至少约300次、至少约310次、至少约320次、至少约330次、至少约340次、至少约350次、或至少约360次。在一些方面，每分钟施加重复物理压力至少约120至260次。在一些方面，施加高达约6N/cm2、高达约5.5N/cm2、高达约5.0N/cm2、高达约4.5N/cm2、高达约4.0N/cm2、高达约3.5N/cm2、高达约3.0N/cm2的重复物理压力。在一些方面，机械解离进行约90分钟或更少、约85分钟或更少、约80分钟或更少、约75分钟或更少、约70分钟或更少、约65分钟或更少、约60分钟或更少、约55分钟或更少、或约50分钟或更少。在一些方面，在室温下施加机械解离。在一些方面，在低于室温下施加机械解离。在一些方面中，根据在国际公开号WO 2021/123832中公开的方法和/或使用其中公开的装置来施加机械解离，其以引用的方式整体并入本文。
在一些方面，将肿瘤样品(即，切除的肿瘤组织样品或解离的肿瘤样品)或其碎片置于培养基(例如本文所公开的培养基)中，其中培养基还包含IL-2。在一些方面，培养基包含至少约4000IU/ml IL-2、至少约4500IU/ml IL-2、至少约5500IU/ml IL-2、至少约6000IU/ml IL-2或至少约6500IU/ml IL-2。在一些方面，培养基包含至少约600IU/ml IL-2。在一些方面，培养基包含至少约100ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约200ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约400ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约500ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约600ng/mL IL-2。
在一些方面，培养基包含至少约1500IU/mL IL-2。在一些方面，培养基包含从约1500IU/mL至约12,000IU/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约1500IU/mL、至少约1600IU/mL、至少约1700IU/mL、至少约1800IU/mL、至少约1900IU/mL、至少约2000IU/mL、至少约2100IU/mL、至少约2200IU/mL、至少约2300IU/mL、至少约2400IU/mL、至少约2500IU/mL、至少约2600IU/mL、至少约2700IU/mL、至少约2800IU/mL、至少约2900IU/mL、至少约3000IU/mL、至少约3100IU/mL、至少约3200IU/mL、至少约3300IU/mL、至少约3400IU/mL、至少约3500IU/mL、至少约3600IU/mL、至少约3700IU/mL、至少约3800IU/mL、至少约3900IU/mL、至少约4000IU/mL、至少约4100IU/mL、至少约4200IU/mL、至少约4300IU/mL、至少约4400IU/mL、至少约4500IU/mL、至少约4600IU/mL、至少约4700IU/mL、至少约4800IU/mL、至少约4900IU/mL、至少约5000IU/mL、至少约5100IU/mL、至少约5200IU/mL、至少约5300IU/mL、至少约5400IU/mL、至少约5500IU/mL、至少约5600IU/mL、至少约5700IU/mL、至少约5800IU/mL、至少约5900IU/mL、至少约6000IU/mL、至少约6100IU/mL、至少约6200IU/mL、至少约6300IU/mL、至少约6400IU/mL、至少约6500IU/mL、至少约6600IU/mL、至少约6700IU/mL、至少约6800IU/mL、至少约6900IU/mL、至少约7000IU/mL IL-2、至少约7100IU/mL、至少约7200IU/mL、至少约7300IU/mL、至少约7400IU/mL、至少约7500IU/mL、至少约7600IU/mL、至少约7700IU/mL、至少约7800IU/mL、至少约7900IU/mL、或至少约8000IU/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约3000IU/mL IL-2。在一些方面，如本文所述，在第二培养(例如REP培养)期间在培养基中培养TIL，其中该培养基包含约3000IU/mL。在一些方面，培养基包含至少约6000IU/mL IL-2。在一些方面，如本文所述，在初始培养期间在培养基中培养TIL，其中该培养基包含约6000IU/mL。
在其他方面，将肿瘤样品或其碎片置于培养基(例如本文所公开的培养基)中，其中培养基还包含IL-21。在一些方面，培养基包含至少约1.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约2.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约3.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约4.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约5.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约6.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约7.0ng/mLIL-21。在一些方面，培养基包含至少约8.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约9.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约10ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约15ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约20ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约30ng/mL IL-21。
单个肿瘤碎片可在单一培养室(例如孔)中一起培养，或者单个肿瘤碎片可在单独的培养室(例如孔)中培养。用于促进培养的肿瘤样品中TIL逃逸的标准培养基包括补充有Glutamax(Gibco/Invitrogen；Carlsbad,Calif.)、1×Pen-Strep(Gibco/Invitrogen；Carlsbad,Calif.)、50μM 2-巯基乙醇(Gibco/Invitrogen；Carlsbad,Calif.)、20μg/ml庆大霉素(Gibco/Invitrogen；Carlsbad,Calif.)和1mM丙酮酸盐(Gibco/Inv itrogen；Carlsbad,Calif.)的RPMI 1640。在一些方面，根据本公开改良标准培养基。在一些方面，标准培养基包括补充有血清补充物(CT STMImmune Cell SR，Thermo Fisher)、L-谷氨酰胺(Gibco)、L-gluta max(Gibco)、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、Pen-strep(Gibco)、FUNGINTM(InvivoGen)、丙酮酸钠(Gibco)、IL-2、IL-21、O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐(Sigma)及它们的任何组合的CTSTMOPTMIZERTM。在一些方面，标准培养基包括补充有约2.5％血清补充物(CTSTMImmune Cell SR，Thermo Fisher)、约2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、约2mM L-glutamax(Gibco)、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、Pen-strep(Gi bco)、约20μg/ml FUNGINTM(InvivoGen)、丙酮酸钠(Gibco)、约IL-2(300ng/mL)、约IL-21(30ng/ml)和约1mM O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐(Sigma)的CTSTMOPTMIZERTM。
在一些方面，在初始培养中培养肿瘤样品或其碎片至少约1周、至少约2周、或至少约3周。在一些方面，将肿瘤样品或其碎片培养至少约2周。如本文所用，“肿瘤样品”是指肿瘤组织和/或解聚的肿瘤组织(即，由肿瘤组织的机械和/或化学解聚产生的细胞悬浮液)。在一些方面，在初始培养中培养肿瘤样品或碎片约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。
在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或碎片与肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂接触。在一些方面，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂、OX40激动剂、CD27激动剂、GITR激动剂、HVEM激动剂、CD95激动剂或它们的任何组合。在一些方面，TNFRSF激动剂是美国公开号US2020/0121719 A1中公开的任何TNFRSF激动剂，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其碎片与约10-500ng/ml 4-1BB配体接触。在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其碎片与约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约250ng/ml、约300ng/ml、约350ng/ml、约400ng/ml、约450ng/ml、约500ng/ml、约550ng/ml、约600ng/ml、约650ng/ml、约700ng/ml、约750ng/ml、约800ng/ml、约850ng/ml、约900ng/ml、约950ng/ml、约1000ng/ml、或约1100ng/ml 4-1BB配体接触。在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其碎片与约100ng/ml 4-1BB配体接触。在一些方面，在初始培养的约第3天、初始培养的约第4天、初始培养的约第5天、初始培养的约第6天或初始培养的约第7天使肿瘤样品或其碎片与4-1BB配体接触。在一些方面，使肿瘤样品或其碎片在初始培养的约第5天与4-1BB配体接触。
在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其碎片与TRANSACTTM接触。在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其碎片与TRANSACTTM(例如，约1:50、约1:100、约1:150、约1:200、约1:250、约1:300、约1:350或约1:400)接触。在一些方面，在初始培养的约第4天、初始培养的约第5天、初始培养的约第6天或初始培养的约第7天使肿瘤样品或其碎片与TRANSACTTM接触。在一些方面，使肿瘤样品或其碎片在初始培养的约第5天与TRANSACTTM接触。在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其碎片与4-1BB配体和TRANSACTTM两者接触。在一些方面，使肿瘤样品或其碎片在初始培养的约第3天与4-1BB配体和TRANSACTTM两者接触。在一些方面，使肿瘤样品或其碎片在初始培养的约第4天与4-1BB配体和TRANSACTTM两者接触。在一些方面，使肿瘤样品或其碎片在初始培养的约第5天与4-1BB配体和TRANSACTTM两者接触。在一些方面，使肿瘤样品或其碎片在初始培养的约第6天与4-1BB配体和TRANSACTTM两者接触。在一些方面，使肿瘤样品或其碎片在初始培养的约第7天与4-1BB配体和TRANSACTTM两者接触。在一些方面，使肿瘤样品或其碎片在初始培养的约第8天与4-1BB配体和TRANSACTTM两者接触。
在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约1x105至至少约1x108、至少约5x105至至少约1x108、至少约1x106至至少约1x108、至少约2x106至至少约1x108、至少约3x106至至少约1x108、至少约4x106至至少约1x108、至少约5x106至至少约1x108、至少约1x105至至少约5x107、至少约5x105至至少约10x106、至少约1x106至至少约10x106、至少约2x106至至少约10x106、至少约3x106至至少约10x106、至少约4x106至至少约10x106、或至少约5x106至至少约10x106个细胞/培养碎片。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约2x106-10x106个细胞/碎片。
在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约1x105、至少约2x105、至少约3x105、至少约4x105、至少约5x105、至少约6x105、至少约7x105、至少约8x105、至少约9x105、至少约1x106、至少约2x106、至少约3x106、至少约4x106、至少约5x106、至少约6x106、至少约7x106、至少约8x106、至少约9x106、或至少约10x106个细胞/碎片。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约2x106个细胞/碎片。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约3x106个细胞/碎片。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约4x106个细胞/碎片。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约5x106个细胞/碎片。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约6x106个细胞/碎片。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约7x106个细胞/碎片。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约8x106个细胞/碎片。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约9x106个细胞/碎片。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其碎片，直至初始培养物中的细胞产量达到至少约10x106个细胞/碎片。在一些方面，使细胞(例如TIL)在初始培养后通过滤器。在一些方面，使细胞(例如TIL)在初始培养后通过至少约10μm、至少约15μm、至少约20μm、至少约25μm、至少约30μm、至少约35μm、至少约40μm、至少约45μm、至少约50μm的过滤器。在一些方面，使细胞(例如TIL)在初始培养后通过约40μm的过滤器。
在一些方面，TIL经受第二扩增。在一些方面，第二扩增步骤在一个或多个透气烧瓶(例如，GREX烧瓶)中进行。在一些方面，将TIL在不打开封闭系统的情况下转变到第二扩增。在一些方面，在将TIL推进到第二扩增之前，筛选来自第一扩增的TIL的肿瘤特异性细胞溶解活性。在一些方面，在推进到第二扩增之前筛选TIL的一种或多种生物标志物的表达。在一些方面，生物标志物包括通常由更初始的TIL(例如CD8+、CD27+、CD3+、CD95+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+、TCF7+或它们的任何组合)表达的一种或多种基因的表达。在一些方面，在推进到第二扩增之前筛选TIL的PD-1表达。在一些方面，在将TIL推进到第二扩增之前，不筛选来自第一扩增的TIL。在一些方面，在初始扩增中获得的所有TIL经受第二扩增。在一些方面，来自第一扩增的TIL在推进到第二扩增之前被合并。
在一些方面，使用快速扩增协议(REP)对TIL进行第二扩增。参见例如，Dudley等人,Science 298:850-54(2002)；Dudley等人,J.Clin.Oncol.23:2346-57(2005)；Dudley等人,J.Clin.Oncol.26:5233-39(2008)；Riddell等人,Science 257:238-41(1992)；以及Dudley等人,J.Immunother.26:332-42(2003)，其各自以引用的方式整体并入本文。在一些方面，在饲养淋巴细胞和白介素-2(IL-2)、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合的存在下使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增TIL。在某些方面，TIL在IL-2、IL-15和IL-21存在下快速扩增。在一些方面，快速扩增期间培养基中IL-2的浓度低于初始培养期间培养基中IL-2的浓度。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度小于300ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约50ng/ml、约55ng/ml、约60ng/ml、约65ng/ml、约70ng/ml、约73.6ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约85ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约105ng/ml、约110ng/ml、约115ng/ml、约120ng/ml、约125ng/ml、约130ng/ml、约135ng/ml、约140ng/ml、约145ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、或约275ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约50ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约55ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约60ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约65ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约70ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约73.6ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约75ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约80ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约85ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约90ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约95ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约100ng/ml。
在一些方面，快速扩增期间培养基中IL-21的浓度低于初始培养期间培养基中IL-21的浓度。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度小于30ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约1ng/ml、约2ng/ml、约3ng/ml、约4ng/ml、约5ng/ml、约6ng/ml、约7ng/ml、约8ng/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约11ng/ml、约12ng/ml、约13ng/ml、约14ng/ml、约15ng/ml、约16ng/ml、约17ng/ml、约18ng/ml、约19ng/ml、约20ng/ml、约21ng/ml、约22ng/ml、约23ng/ml、约24ng/ml、约25ng/ml、约26ng/ml、约27ng/ml、约28ng/ml或约29ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约5ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约6ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约7ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约8ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约9ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约10ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约11ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约12ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约13ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约14ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约15ng/ml。
在一些方面，快速扩增期间培养基中IL-15的浓度为约0.1ng/ml、约0.2ng/ml、约0.3ng/ml、约0.4ng/ml、约0.5ng/ml、约0.6ng/ml、约0.7ng/ml、约0.8ng/ml、约0.9ng/ml、约1.0ng/ml、约1.1ng/ml、约1.2ng/ml、约1.3ng/ml、约1.4ng/ml、约1.5ng/ml、约1.6ng/ml、约1.7ng/ml、约1.8ng/ml、约1.9ng/ml、约2.0ng/ml、约2.25ng/ml、约2.5ng/ml、约2.75ng/ml、约3.0ng/ml、约3.5ng/ml、约4.0ng/ml、约4.5ng/ml、或约5.0ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.1ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.2ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.3ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.4ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.5ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.6ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.7ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.8ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.9ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约1.0ng/ml。
非特异性T细胞受体刺激物可包括例如，OKT3(例如，约30ng/ml)、小鼠单克隆抗CD3抗体(购自Raritan,N.J.或Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)。在一些方面，在存在T细胞生长因子(诸如约200-400IU/ml的T细胞生长因子，诸如300IU/ml IL-2或IL-15)的情况下，通过用一种或多种抗原(包括其抗原部分，诸如表位，或癌症细胞，其可任选地由载体表达，诸如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如约0.3μMMART-1:26-35(27L)或gp100:209-217(210M))体外刺激外周血单核细胞(PBMC)来快速扩增TIL。在一些方面，通过使用TRANSACTTM刺激来扩增TIL。在一些方面，体外诱导的TIL通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的癌症的相同抗原刺激而快速扩增。在一些方面，可用经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2刺激TIL。
在一些方面，在第二扩增期间通过在包含TRANSACTTM和任选的4-1BBL和/或CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在第二扩增期间通过在包含TRANSACTTM、4-1BBL和CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在第二扩增期间通过在包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。
在一些方面，在TIL扩增之前、期间或之后对一种或多种TIL进行遗传修饰。可使用本领域已知的任何方法实现TIL的遗传修饰。在一些方面，使用Cas9核酸内切酶(CRISPR；参见例如US2017067021A1，其以引用的方式整体并入本文)、TALEN、锌指核酸内切酶、定点诱变或它们的任何组合。在一些方面，一种或多种TIL被遗传修饰以破坏或消除人细胞因子诱导型含SH2蛋白的表达(CISH；参见例如US10406177B2，其以引用的方式整体并入本文)。在一些方面，使用AAV来修饰一种或多种TIL，例如一种或多种TIL包含AAV。在一些方面，使用慢病毒或逆转录病毒修饰一种或多种TIL。在一些方面，一种或多种TIL被遗传修饰以表达外源修饰的或工程化的T细胞受体(TCR)。在一些方面，一种或多种TIL被遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，一种或多种TIL被遗传修饰以表达CD86。在一些方面，一种或多种TIL被遗传修饰以表达OX40L。在一些方面，一种或多种TIL被遗传修饰以表达4-1BBL。在一些方面，一种或多种TIL被遗传修饰以表达抗PD1抗体。
在一些方面，在还包含肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂的培养基中扩增TIL。任何TNFRSF激动剂可用于本文所公开的方法中。TNFRSF激动剂的非限制性示例可见于例如US20200121719A1中，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，在初始培养后添加TNFRSF激动剂。在一些方面，在第二和/或最终扩增期间添加TNFRSF激动剂。
在一些方面，在还包含4-1BB激动剂的培养基中扩增TIL。任何4-1BB激动剂可用于本文所公开的方法中。在一些方面，4-1BB激动剂包括4-1BB抗体。4-1BB激动剂的非限制性示例可见于例如US20200032209A1中，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，在初始培养后添加4-1BB激动剂。在一些方面，在第二或最终扩增期间添加4-1BB激动剂。
在一些方面，在第二扩增期间通过在包含TRANSACTTM和任选的4-1BBL和/或CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在第二扩增期间通过在包含TRANSACTTM、4-1BBL和CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在第二扩增期间通过在包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。
在一些方面，在还包含腺苷a2a受体拮抗剂的培养基中扩增TIL。任何腺苷a2a受体拮抗剂可用于本文所公开的方法中。腺苷a2a受体拮抗剂的非限制性示例可见于例如US20210137930A1中，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，腺苷a2a受体拮抗剂选自由以下组成的组：韦帕迪兰(vipadenant)、CPI-444(賽佛瑞冷(ciforadenant))、SCH58261、ZM241385、SCH420814、SYN115、8-CSC、KW-6002、A2A受体拮抗剂1、ADZ4635、ST4206、KF21213、SCH412348和7MMG-49、或它们的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药、以及它们的组合。在一些方面，在初始培养期间添加腺苷a2a受体拮抗剂。在一些方面，在第二和/或最终扩增期间添加腺苷a2a受体拮抗剂。
在一些方面，在还包含AKT途径抑制剂(AKTi)的培养基中扩增TIL。任何AKTi可用于本文所公开的方法中。可用于本公开中的AKTi的非限制性示例可见于例如WO2020096927中，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，AKTi选自由以下组成的组：阿氟色替(afuresertib)、优泼色替(uprosertib)、帕塔色替(ipatasertib)、AT7867、AT13148、以及它们的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。在一些方面，AKTi是mTOR抑制剂，例如AZD8055或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。在一些方面，AKTi是PI3K抑制剂，例如LY294002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。在一些方面，在初始培养期间添加AKTi。在一些方面，在第二和/或最终扩增期间添加AKTi。
在一些方面，通过使扩增的TIL与一种或多种抗原呈递细胞接触来重新活化或刺激扩增的细胞。任何抗原呈递细胞可用于本文所公开的方法中。在一些方面，抗原呈递细胞是经遗传修饰的细胞。在一些方面，抗原呈递细胞在细胞表面上包含肿瘤抗原或其碎片。在一些方面，使扩增的TIL与在细胞表面上包含多于一种肿瘤抗原或其碎片的抗原呈递细胞接触。
在一些方面，抗原呈递细胞(APC)是基因工程化的。在一些方面，APC被基因工程化用于一种或多种转基因(例如抗原或刺激信号)的可调表达。在一些方面，根据WO2020/086742中所公开的方法对APC进行基因工程化，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面，APC被基因工程化以表达一种或多种刺激分子。在一些方面，APC被基因工程化以表达CD86、OC40L、4-1BBL或它们的任何组合。在一些方面，APC是美国专利号US10,415,015中公开的APC，其以引用的方式整体并入本文。
在一些方面，在第二TIL培养基中培养TIL，直至第二扩增中的细胞产量达到至少约1x107至至少约50x107、至少约2x107至至少约40x107、至少约3x107至至少约30x107、至少约4x107至至少约25x107、至少约5x107至至少约20x107、至少约1x107至至少约20x107、至少约2x107至至少约20x107、至少约3x107至至少约20x107、或至少约4x107至至少约20x107个细胞。在一些方面，在第二TIL培养基中培养TIL，直至第二扩增中的细胞产量达到至少约5x107至至少约20x107个细胞。在一些方面，在第二TIL培养基中培养TIL，直至第二扩增中的细胞产量达到至少约1x107、至少约2x107、至少约3x107、至少约4x107、至少约5x107、至少约6x107、至少约7x107、至少约8x107、至少约9x107、至少约10x107、至少约11x107、至少约12x107、至少约13x107、至少约14x107、至少约15x107、至少约16x107、至少约17x107、至少约18x107、至少约19x107、或至少约20x107个细胞。在一些方面，在第二TIL培养基中培养TIL，直至第二扩增中的细胞产量达到至少约5x107个细胞。在一些方面，在第二TIL培养基中培养TIL，直至第二扩增中的细胞产量达到至少约6x107个细胞。在一些方面，在第二TIL培养基中培养TIL，直至第二扩增中的细胞产量达到至少约7x107个细胞。在一些方面，在第二扩增中培养TIL，直至第二TIL培养基中的细胞产量达到至少约8x107个细胞。在一些方面，在第二扩增中培养TIL，直至第二TIL培养基中的细胞产量达到至少约9x107个细胞。在一些方面，在第二TIL培养基中培养TIL，直至第二扩增中的细胞产量达到至少约10x107个细胞。在一些方面，在第二TIL培养基中培养TIL，直至第二扩增中的细胞产量达到至少约15x107个细胞。在一些方面，在第二TIL培养基中培养TIL，直至第二扩增中的细胞产量达到至少约20x107个细胞。
在一些方面，TIL经受最终扩增。在一些方面，最终扩增期间的培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合。在某些方面，最终扩增期间的培养基包含IL-2、IL-15和IL-21。在一些方面，最终扩增期间培养基中IL-2的浓度低于初始培养期间培养基中IL-2的浓度。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度小于300ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约50ng/ml、约55ng/ml、约60ng/ml、约65ng/ml、约70ng/ml、约73.6ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约85ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约105ng/ml、约110ng/ml、约115ng/ml、约120ng/ml、约125ng/ml、约130ng/ml、约135ng/ml、约140ng/ml、约145ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml、或约275ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约50ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约55ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约60ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约65ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约70ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约73.6ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约75ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约80ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约85ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约90ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约95ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-2浓度为约100ng/ml。
在一些方面，最终扩增期间培养基中IL-21的浓度低于初始培养期间培养基中IL-21的浓度。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度小于30ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约1ng/ml、约2ng/ml、约3ng/ml、约4ng/ml、约5ng/ml、约6ng/ml、约7ng/ml、约8ng/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约11ng/ml、约12ng/ml、约13ng/ml、约14ng/ml、约15ng/ml、约16ng/ml、约17ng/ml、约18ng/ml、约19ng/ml、约20ng/ml、约21ng/ml、约22ng/ml、约23ng/ml、约24ng/ml、约25ng/ml、约26ng/ml、约27ng/ml、约28ng/ml或约29ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约5ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约6ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约7ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约8ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约9ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约10ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约11ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约12ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约13ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约14ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-21浓度为约15ng/ml。
在一些方面，最终扩增期间培养基中IL-15的浓度为约0.1ng/ml、约0.2ng/ml、约0.3ng/ml、约0.4ng/ml、约0.5ng/ml、约0.6ng/ml、约0.7ng/ml、约0.8ng/ml、约0.9ng/ml、约1.0ng/ml、约1.1ng/ml、约1.2ng/ml、约1.3ng/ml、约1.4ng/ml、约1.5ng/ml、约1.6ng/ml、约1.7ng/ml、约1.8ng/ml、约1.9ng/ml、约2.0ng/ml、约2.25ng/ml、约2.5ng/ml、约2.75ng/ml、约3.0ng/ml、约3.5ng/ml、约4.0ng/ml、约4.5ng/ml、或约5.0ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-15浓度为约0.1ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-15浓度为约0.2ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-15浓度为约0.3ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-15浓度为约0.4ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-15浓度为约0.5ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-15浓度为约0.6ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-15浓度为约0.7ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-15浓度为约0.8ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-15浓度为约0.9ng/ml。在一些方面，最终扩增期间的IL-15浓度为约1.0ng/ml。
在一些方面，最终扩增包括刺激。在一些方面，该刺激与第二扩增期间使用的刺激相同。在一些方面，在最终扩增期间通过在包含TRANSACTTM、4-1BBL、CD27L或它们的任何组合的MRM中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在最终扩增期间通过在包含TRANSACTTM和任选的4-1BBL和/或CD27L的MRM中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在最终扩增期间通过在包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L的MRM中培养细胞来刺激TIL。
在一些方面，最终扩增步骤在静态GREX中进行。在一些方面，最终扩增在搅拌罐中进行。在一些方面，最终扩增步骤在生物反应器中进行。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40x109至至少约100x109、至少约40x109至至少约90x109、至少约40x109至至少约80x109、至少约40x109至至少约70x109、至少约40x109至至少约60x109、至少约40x109至至少约50x109、至少约10x109至至少约100x109、至少约20x109至至少约100x109、至少约30x109至至少约100x109、至少约30x109至至少约50x109、或至少约35x109至至少约45x109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40x109至至少约100x109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40x109、至少约45x109、至少约50x109、至少约55x109、至少约60x109、至少约65x109、至少约70x109、至少约75x109、至少约80x109、至少约85x109、至少约90x109、至少约95x109、或至少约100x109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40x109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约50x109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约60x109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约70x109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约80x109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约90x109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约100x109个细胞。
在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约7天至至少约21天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约7天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约8天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约9天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约10天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约11天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约12天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约13天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约14天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约15天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约16天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约17天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约18天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约19天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约20天。在一些方面，继续最终扩增直至最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约21天。
在一些方面，收获扩增的TIL。可使用任何方法(包括通过离心)收获TIL。在一些方面，使用自动化系统收获TIL。细胞收集器和/或细胞处理系统可从多种来源商购获得，并且任何基于细胞的收集器可用于本文所公开的方法中。在一些方面，细胞收集器和/或细胞处理系统是基于膜的细胞收集器。在一些方面，使用细胞处理系统例如LOVO系统(FreseniusKabi)进行细胞收获。在一些方面，细胞收集器和/或细胞处理系统可在封闭的无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些方面，从封闭系统生物反应器进行收获。在一些方面，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些方面，采用单个生物反应器。在一些方面，封闭系统生物反应器是单一生物反应器。在开放和封闭系统中离体扩增TIL的方法的示例可见于例如美国专利号10,166,257中，其以引用的方式整体并入本文。
在一些方面，将扩增的TIL冷冻保存。可使用任何方法冷冻保存TIL。冷冻保存哺乳动物细胞(包括TIL)的各种方法已由例如以下描述：(i)General Protocol for theCryopreservation of Mammalian Cel ls,UNC(2007)，可在unclineberger.org/tissueculture/protocols/general-protocol-for-the-cryopreservation-of-mammalian-cells/获得；和(ii)Clar ke等人,Improved post-thaw recovery ofperipheral blood stem/prog enitor cells using a novel intracellular-likecryopreservation solution,Cytotherapy 2009-6-6，可在sigmaaldrich.com/catalog/papers/19499402获得，其各自以引用的方式整体并入本文。
在一些方面，根据以下培养TIL：
(1)从受试者分离肿瘤样品，并将肿瘤切成碎片和/或机械或化学解聚。
(2)然后将所得肿瘤样品或其碎片在包含本文所公开的进一步补充有300ng/mL或6000IU/ml IL-2和30ng/ml IL-21的代谢重编程培养基的初始培养物中培养。
(3)任选地，在初始培养开始后的第5天，使TIL与TRANSACTTM(1:200)和100ng/mL4-1BB配体接触，然后将TIL再培养5-9天或直至达到约10x106至约200x106个细胞。然后合并TIL。
(4)然后将来自步骤3的至少0.5x106个TIL与100-200倍过量的经辐照的PBMC饲养细胞混合，并在补充有30ng/ml抗CD3抗体(例如OKT3)、75ng/mL IL-2、10ng/mL IL-21和0.4ng/mL IL-15的培养基(例如，本文所公开的代谢重编程培养基)中培养。如本文所述，继续这种第二(REP)培养直至获得治疗有效量的TIL。
III.本公开的组合物
III.A.细胞培养基
本公开的一些方面涉及如本文所公开的包含至少约5mM钾离子的低渗或等渗细胞培养基。本公开的某些方面涉及如本文所公开的包含高于40mM钾离子的细胞培养基。本公开的某些方面涉及如本文所公开的包含至少约50mM钾离子的细胞培养基。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基是代谢重编程培养基。
本公开的一些方面涉及如本文所公开的包含至少约50mM钾离子和小于90mM NaCl的细胞培养基。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度为至少110mM。在一些方面，培养基是代谢重编程培养基。
在一些方面，培养基包含约40mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约41mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约42mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约43mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约44mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约45mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约46mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约47mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约48mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约49mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子，并且培养基具有约254mOsmol至约256mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子，并且培养基具有约254.7mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约51mM、约52mM、约53mM或约54mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约51mM、约52mM、约53mM或约54mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约51mM、约52mM、约53mM或约54mM钾离子，并且培养基具有约254mOsmol至约256mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约51mM、约52mM、约53mM或约54mM钾离子，并且培养基具有约254.7mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约51mM、约52mM、约53mM或约54mM钾离子，并且培养基具有约255.2mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约55mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子，并且培养基具有约254mOsmol至约256mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子，并且培养基具有约255.2mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约56mM、约57mM、约58mM或约59mM钾离子，并且培养基具有约256mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约56mM、约57mM、约58mM或约59mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约56mM、约57mM、约58mM或约59mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约258mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子，并且培养基具有约257.2mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子，并且培养基具有约256mOsmol至约258mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子，并且培养基具有约257.2mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约61mM、约62mM、约63mM或约64mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约61mM、约62mM、约63mM或约64mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约61mM、约62mM、约63mM或约64mM钾离子，并且培养基具有约256mOsmol至约258mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约61mM、约62mM、约63mM或约64mM钾离子，并且培养基具有约257.2mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约61mM、约62mM、约63mM或约64mM钾离子，并且培养基具有约257.5mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约65mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子，并且培养基具有约250mOsmol至约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol至约258mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子，并且培养基具有约257.5mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约66mM、约67mM、约68mM或约69mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约66mM、约67mM、约68mM或约69mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约66mM、约67mM、约68mM或约69mM钾离子，并且培养基具有约257mOsmol至约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约66mM、约67mM、约68mM或约69mM钾离子，并且培养基具有约257.5mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约66mM、约67mM、约68mM或约69mM钾离子，并且培养基具有约259.7mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子，并且培养基具有约259mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子，并且培养基具有约259mOsmol至约261mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子，并且培养基具有约259.7mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约71mM、约72mM、约73mM或约74mM钾离子，并且培养基具有约259mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约71mM、约72mM、约73mM或约74mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约71mM、约72mM、约73mM或约74mM钾离子，并且培养基具有约259mOsmol至约261mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约71mM、约72mM、约73mM或约74mM钾离子，并且培养基具有约259.7mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约71mM、约72mM、约73mM或约74mM钾离子，并且培养基具有约260mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约75mM钾离子，并且培养基具有约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子，并且培养基具有约259mOsmol至约261mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子，并且培养基具有约260mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约261mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约262mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约263mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约261mOsmol至约263mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM或约84mM钾离子，并且培养基具有约262.26mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子，并且培养基具有约262mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子，并且培养基具有约261mOsmol至约263mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子，并且培养基具有约262.26mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约262mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约263mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约264mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约265mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约255mOsmol至约265mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约260mOsmol至约270mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约261mOsmol至约263mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约81mM、约82mM、约83mM、约84mM或约85mM钾离子，并且培养基具有约263mOsmol至约265mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含钠离子。在一些方面，钠离子的浓度小于基础培养基的浓度。在一些方面，钠离子的浓度随着钾离子的浓度增加而降低。在一些方面，钠离子的浓度为从约25mM至约115mM。在一些方面，钠离子的浓度为从约25mM至约100mM、约30mM至约40mM、约30mM至约50mM、约30mM至约60mM、约30mM至约70mM、约30mM至约80mM、约40mM至约50mM、约40mM至约60mM、约40mM至约70mM、约40mM至约80mM、约50mM至约55mM、约50mM至约60mM、约50mM至约65mM、约50mM至约70mM、约50mM至约75mM、约50mM至约80mM、约55mM至约60mM、约55mM至约65mM、约55mM至约70mM、约55mM至约75mM、约55mM至约80mM、约60mM至约65mM、约60mM至约70mM、约60mM至约75mM、约60mM至约80mM、约70mM至约75mM、约70mM至约80mM、或约75mM至约80mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约50mM至约85mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约55mM至约80mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约30mM至约35mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约35mM至约40mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约40mM至约45mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约45mM至约50mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约50mM至约55mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约55mM至约60mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约60mM至约65mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约65mM至约70mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约70mM至约75mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约75mM至约80mM。在某些方面，钠离子的浓度为从约80mM至约85mM。
在一些方面，钠离子的浓度为约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM或约90mM。在某些方面，钠离子的浓度为约55mM。在某些方面，钠离子的浓度为约55.6mM。在某些方面，钠离子的浓度为约59.3mM。在某些方面，钠离子的浓度为约60mM。在某些方面，钠离子的浓度为约63.9mM。在某些方面，钠离子的浓度为约65mM。在某些方面，钠离子的浓度为约67.6mM。在某些方面，钠离子的浓度为约70mM。在某些方面，钠离子的浓度为约72.2mM。在某些方面，钠离子的浓度为约75mM。在某些方面，钠离子的浓度为约76mM。在某些方面，钠离子的浓度为约80mM。在某些方面，钠离子的浓度为约80.5mM。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约80.5mM钠离子。在一些方面，培养基具有约254.7mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和约76mM钠离子。在一些方面，培养基具有约255.2mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和约72.2mM钠离子。在一些方面，培养基具有约257.2mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约67.6mM钠离子。在一些方面，培养基具有约257.5mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约63.9mM钠离子。在一些方面，培养基具有约259.7mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约59.3mM钠离子。在一些方面，培养基具有约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和约55.6mM钠离子。在一些方面，培养基具有约262.26mOsmol的张力。
在一些方面，培养基包含约40mM钾离子和100mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约41mM钾离子和99mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约42mM钾离子和98mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约43mM钾离子和97mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约44mM钾离子和96mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约45mM钾离子和95mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约46mM钾离子和94mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约47mM钾离子和93mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约48mM钾离子和92mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约49mM钾离子和91mM的NaCl浓度。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和90mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约51mM钾离子和89mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约52mM钾离子和88mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约53mM钾离子和87mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约54mM钾离子和86mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和85mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约56mM钾离子和84mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约57mM钾离子和83mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约58mM钾离子和82mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约59mM钾离子和81mM的NaCl浓度。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和80mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约61mM钾离子和79mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约62mM钾离子和78mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约63mM钾离子和77mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约64mM钾离子和76mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和75mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约66mM钾离子和74mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约67mM钾离子和73mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约68mM钾离子和72mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约69mM钾离子和71mM的NaCl浓度。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和70mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约71mM钾离子和69mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约72mM钾离子和68mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约73mM钾离子和67mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约74mM钾离子和66mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和65mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约76mM钾离子和64mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约77mM钾离子和63mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约78mM钾离子和62mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约79mM钾离子和61mM的NaCl浓度。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和60mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约81mM钾离子和59mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约82mM钾离子和58mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约83mM钾离子和57mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约84mM钾离子和56mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约85mM钾离子和55mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约86mM钾离子和54mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约87mM钾离子和53mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约88mM钾离子和52mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约89mM钾离子和51mM的NaCl浓度。
在一些方面，培养基包含约890mM钾离子和50mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约91mM钾离子和49mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约92mM钾离子和48mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约93mM钾离子和47mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约94mM钾离子和46mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约95mM钾离子和45mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约96mM钾离子和44mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约97mM钾离子和43mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约98mM钾离子和42mM的NaCl浓度。在一些方面，培养基包含约99mM钾离子和41mM的NaCl浓度。
在一些方面，培养基包含NaCl。在一些方面，NaCl的浓度小于基础培养基的浓度。在一些方面，NaCl的浓度随着钾离子的浓度增加而降低。在一些方面，NaCl的浓度为从约25mM至约115mM。在一些方面，NaCl的浓度为从约25mM至约100mM、约30mM至约40mM、约30mM至约50mM、约30mM至约60mM、约30mM至约70mM、约30mM至约80mM、约40mM至约50mM、约40mM至约60mM、约40mM至约70mM、约40mM至约80mM、约50mM至约55mM、约50mM至约60mM、约50mM至约65mM、约50mM至约70mM、约50mM至约75mM、约50mM至约80mM、约55mM至约60mM、约55mM至约65mM、约55mM至约70mM、约55mM至约75mM、约55mM至约80mM、约60mM至约65mM、约60mM至约70mM、约60mM至约75mM、约60mM至约80mM、约70mM至约75mM、约70mM至约80mM、或约75mM至约80mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约50mM至约85mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约55mM至约80mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约30mM至约35mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约35mM至约40mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约40mM至约45mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约45mM至约50mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约50mM至约55mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约55mM至约60mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约60mM至约65mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约65mM至约70mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约70mM至约75mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约75mM至约80mM。在某些方面，NaCl的浓度为从约80mM至约85mM。
在一些方面，培养基包含钙离子。在一些方面，钙离子的浓度大于约0.4mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约2.8mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约2.5mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约2.0mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.9mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.7mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.6mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.5mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.4mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.3mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.2mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.1mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.0mM。
在一些方面，钙离子的浓度为从约0.4mM至约2.8mM、约0.4mM至约2.7mM、约0.4mM至约2.5mM、约0.5mM至约2.0mM、约1.0mM至约2.0mM、约1.1mM至约2.0mM、约1.2mM至约2.0mM、约1.3mM至约2.0mM、约1.4mM至约2.0mM、约1.5mM至约2.0mM、约1.6mM至约2.0mM、约1.7mM至约2.0mM、约1.8mM至约2.0mM、约0.8至约0.9mM、约0.8至约1.0mM、约0.8至约1.1mM、约0.8至约1.2mM、约0.8至约1.3mM、约0.8至约1.4mM、约0.8至约1.5mM、约0.8至约1.6mM、约0.8至约1.7mM、约0.8至约1.8mM、约0.9至约1.0mM、约0.9至约1.1mM、约0.9至约1.2mM、约0.9至约1.3mM、约0.9至约1.4mM、约0.9至约1.5mM、约0.9至约1.6mM、约0.9至约1.7mM、约0.9至约1.8mM、约1.0至约1.1mM、约1.0至约1.2mM、约1.0至约1.3mM、约1.0至约1.4mM、约1.0至约1.5mM、约1.0至约1.6mM、约1.0至约1.7mM、约1.0至约1.8mM、约1.1至约1.2mM、约1.1至约1.3mM、约1.1至约1.4mM、约1.1至约1.5mM、约1.1至约1.6mM、约1.1至约1.7mM、约1.1至约1.8mM、约1.2至约1.3mM、约1.2至约1.4mM、约1.2至约1.5mM、约1.2至约1.6mM、约1.2至约1.7mM、约1.2至约1.8mM、约1.3至约1.4mM、约1.3至约1.5mM、约1.3至约1.6mM、约1.3至约1.7mM、约1.3至约1.8mM、约1.4至约1.5mM、约1.4至约1.6mM、约1.4至约1.7mM、约1.4至约1.8mM、约1.5至约1.6mM、约1.5至约1.7mM、约1.5至约1.8mM、约1.6至约1.7mM、约1.6至约1.8mM、或约1.7至约1.8mM。
在一些方面，钙离子的浓度为从约0.8mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约0.9mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.0mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.1mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.2mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约0.8mM至约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约0.8mM至约0.9mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约0.9mM至约1.0mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.0mM至约1.1mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.1mM至约1.2mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.2mM至约1.3mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.3mM至约1.4mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.4mM至约1.5mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.5mM至约1.6mM。在一些方面，钙离子的浓度为从约1.7mM至约1.8mM。
在一些方面，钙离子的浓度为约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM或约2.0mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.6mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.7mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.9mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.0mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.1mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.2mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.3mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.4mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.5mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.6mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.7mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.8mM。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约1.8mM钙离子。在一些方面，培养基还包含小于90mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和约1.7mM钙离子。在一些方面，培养基还包含小于85mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和约1.6mM钙离子。在一些方面，培养基具有约257.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基还包含小于80mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约1.5mM钙离子。在一些方面，培养基还包含小于75mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约1.4mM钙离子。在一些方面，培养基还包含小于70mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约1.3mM钙离子。在一些方面，培养基还包含小于65mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和约1.2mM钙离子。在一些方面，培养基还包含小于60mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含糖。在一些方面，糖是单糖、二糖或多糖。在一些方面，糖选自葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖及它们的任何组合。在某些方面，糖是葡萄糖。在一些方面，培养基包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)葡萄糖。在一些方面，培养基包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)甘露糖。在一些方面，培养基包含多于一种糖。在一些方面，培养基包含葡萄糖和半乳糖。在一些方面，培养基包含葡萄糖和果糖。在一些方面，培养基包含葡萄糖和甘露糖。在一些方面，培养基包含葡萄糖和麦芽糖。在一些方面，培养基包含葡萄糖和蔗糖。在一些方面，培养基包含葡萄糖和乳糖。在一些方面，培养基包含葡萄糖和海藻糖。
在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度小于约4.29g/L。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度小于约24mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度大于约5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度大于约5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约5mM至约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约10mM至约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约10mM至约25mM、约10mM至约20mM、约10mM至约5mM、约15mM至约25mM、约15mM至约20mM、约15mM至约19mM、约15mM至约18mM、约15mM至约17mM、约15mM至约16mM、约16mM至约20mM、约16mM至约19mM、约16mM至约18mM、约16mM至约17mM、约17mM至约20mM、约17mM至约19mM、或约17mM至约18mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约5mM至约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约10mM至约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约10mM至约15mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约14mM至约14.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约14.5mM至约15mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约15mM至约15.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约15.5mM至约16mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约16mM至约16.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约16.5mM至约17mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约17mM至约17.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为从约17.5mM至约18mM。
在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM，为约10.5mM、约11mM、约11.5mM、约12mM、约12.5mM、约13mM、约13.5mM、约14mM、约14.5mM、约15mM、约15.5mM、约16mM、约16.5mM、约17mM、约17.5mM、约18mM、约18.5mM、约19mM、约19.5mM、约20mM、约20.5mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM或约25mM。
在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约13mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约13.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约14mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约14.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15.4mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15.9mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约16.3mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约16.8mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约17.2mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约17.7mM。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约17.7mM葡萄糖。在一些方面，培养基还包含小于90mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和约17.2mM葡萄糖。在一些方面，培养基还包含小于85mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和约16.8mM葡萄糖。在一些方面，培养基还包含小于80mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约16.3mM葡萄糖。在一些方面，培养基还包含小于75mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约15.9mM葡萄糖。在一些方面，培养基还包含小于70mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约15.4mM葡萄糖。在一些方面，培养基还包含小于65mM的NaCl。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和约15mM葡萄糖。在一些方面，培养基还包含小于60mM的NaCl。
在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基具有约280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±1mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±2mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±3mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±4mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±5mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±6mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±7mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±8mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±9mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有280mOsm/L±10mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约280mOsm/L至约285mOsm/L、约280mOsm/L至约290mOsm/L、约280mOsm/L至约295mOsm/L、约280mOsm/L至约300mOsm/L、约280mOsm/L至约305mOsm/L、约280mOsm/L至约310mOsm/L、约280mOsm/L至约315mOsm/L、或约280mOsm/L至小于320mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约285mOsm/L、约290mOsm/L、约295mOsm/L、约300mOsm/L、约305mOsm/L、约310mOsm/L或约315mOsm/L的张力。在一些方面，通过将钾离子和NaCl的浓度相加并乘以2来测量张力。
在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基具有低于约280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于275mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于270mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于265mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于260mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于265mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于260mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于255mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约250mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约245mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约240mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约235mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约230mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约225mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约220mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约215mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约210mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约205mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有低于约200mOsm/L的张力。在一些方面，通过将钾离子和NaCl的浓度相加并乘以2来测量张力。
在一些方面，培养基具有从约100mOsm/L至约280mOsm/L、约125mOsm/L至约280mOsm/L、约150mOsm/L至约280mOsm/L、约175mOsm/L至约280mOsm/L、约200mOsm/L至约280mOsm/L、约210mOsm/L至约280mOsm/L、约220mOsm/L至约280mOsm/L、约225mOsm/L至约280mOsm/L、约230mOsm/L至约280mOsm/L、约235mOsm/L至约280mOsm/L、约240mOsm/L至约280mOsm/L、约245mOsm/L至约280mOsm/L、约250mOsm/L至约280mOsm/L、约255mOsm/L至约280mOsm/L、约260mOsm/L至约280mOsm/L、约265mOsm/L至约280mOsm/L、约270mOsm/L至约280mOsm/L、或约275mOsm/L至约280mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约250mOsm/L至约270mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约250mOsm/L至约255mOsm/L、约250mOsm/L至约260mOsm/L、约250mOsm/L至约265mOsm/L、约255mOsm/L至约260mOsm/L、约255mOsm/L至约265mOsm/L、约255mOsm/L至约265mOsm/L、约260mOsm/L至约265mOsm/L、或约254mOsm/L至约263mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约254mOsm/L至约255mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约255mOsm/L至约256mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约256mOsm/L至约257mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约257mOsm/L至约258mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约258mOsm/L至约259mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约260mOsm/L至约261mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约261mOsm/L至约262mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约262mOsm/L至约263mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约263mOsm/L至约264mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有从约264mOsm/L至约265mOsm/L的张力。在一些方面，通过将钾离子和NaCl的浓度相加并乘以2来测量张力。
在一些方面，培养基具有约100mOsm/L、约125mOsm/L、约150mOsm/L、约175mOsm/L、约200mOsm/L、约210mOsm/L、约220mOsm/L、约225mOsm/L、约230mOsm/L、约235mOsm/L、约240mOsm/L、约245mOsm/L、约250mOsm/L、约255mOsm/L、约260mOsm/L、约265mOsm/L、约270mOsm/L、或约275mOsm/L的张力。在一些方面，通过将钾离子和NaCl的浓度相加并乘以2来测量张力。
在一些方面，培养基具有约250mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约262.26mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约260mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约259.7mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约257.5mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约257.2mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约255.2mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约254.7的张力。在一些方面，培养基具有约255mOsm/L的张力。在一些方面，培养基具有约260mOsm/L的张力。在一些方面，通过将钾离子和NaCl的浓度相加并乘以2来测量张力。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和(i)约80.5mM钠离子；(ii)约17.7mM葡萄糖；(iii)约1.8mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约254.7mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和(i)约80.5mM NaCl；(ii)约17.7mM葡萄糖；(iii)约1.8mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和(i)约76mM钠离子；(ii)约17.2mM葡萄糖；(iii)约1.7mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约255.2mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和(i)约76mM钠离子；(ii)约17.2mM葡萄糖；和(iii)约1.7mM钙离子；其中所述培养基具有约255.2mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和(i)约76mM NaCl；(ii)约17.2mM葡萄糖；(iii)约1.7mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和(i)约72.2mM钠离子；(ii)约16.8mM葡萄糖；(iii)约1.6mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约257.2mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和(i)约72.2mM钠离子；(ii)约16.8mM葡萄糖；和(iii)约1.6mM钙离子；其中所述培养基具有约257.2mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和(i)约72.2mM NaCl；(ii)约16.8mM葡萄糖；(iii)约1.6mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和(i)约67.6mM钠离子；(ii)约16.3mM葡萄糖；(iii)约1.5mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约257.5mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和(i)约67.6mM钠离子；(ii)约16.3mM葡萄糖；和(iii)约1.5mM钙离子；其中所述培养基具有约257.5mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和(i)约67.6mM NaCl；(ii)约16.3mM葡萄糖；(iii)约1.5mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和(i)约63.9mM钠离子；(ii)约15.9mM葡萄糖；(iii)约1.4mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约259.7mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和(i)约63.9mM钠离子；(ii)约15.9mM葡萄糖；和(iii)约1.4mM钙离子；其中所述培养基具有约259.7mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和(i)约63.9mM NaCl；(ii)约15.9mM葡萄糖；(iii)约1.4mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和(i)约59.3mM钠离子；(ii)约15.4mM葡萄糖；(iii)约1.3mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和(i)约59.3mM钠离子；(ii)约15.4mM葡萄糖；和(iii)约1.3mM钙离子；其中所述培养基具有约260mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和(i)约59.3mM NaCl；(ii)约15.4mM葡萄糖；(iii)约1.3mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和(i)约55.6mM钠离子；(ii)约15mM葡萄糖；(iii)约1.2mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。在一些方面，培养基具有约262.26mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和(i)约55.6mM钠离子；(ii)约15mM葡萄糖；和(iii)约1.2mM钙离子；其中所述培养基具有约262.26mOsmol的张力。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和(i)约55.6mM NaCl；(ii)约15mM葡萄糖；(iii)约1.2mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
III.B.根据所述方法制备的细胞
本公开的某些方面涉及包含根据本文所公开的方法培养的一种或多种多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的细胞组合物。本公开的一些方面涉及通过在离体或体外培养期间增加人免疫细胞和/或干细胞的产量同时增加人免疫细胞和/或干细胞的干性的方法产生的细胞组合物，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在100mM和30mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞和/或干细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110和140mM之间。本公开的一些方面涉及通过制备用于免疫疗法的人免疫细胞和/或干细胞群的方法产生的细胞组合物，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在100mM和30mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞和/或干细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110和140mM之间。本公开的一些方面涉及通过在针对免疫疗法离体或体外培养期间增加人免疫细胞的干性的方法产生的细胞组合物，所述方法包括在包含浓度在40mM和80mM之间的钾离子以及浓度在100mM和30mM之间的NaCl的培养基中培养人免疫细胞，其中钾离子和NaCl的总浓度在110和140mM之间。
与根据常规方法培养的可比较细胞相比，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的细胞具有增加数量的较低分化细胞。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的细胞表现出干样表型的一种或多种典型标志物的表达增加。在一些方面，与根据常规方法(例如在含有小于5mM K+的培养基中)培养的可比较细胞相比，根据本文所公开的方法和/或在代谢重编程培养基中培养的细胞群具有增加数量的效应子样细胞。在一些方面，与根据常规方法(例如在含有小于5mM K+的培养基中)培养的可比较细胞相比，根据本文所公开的方法和/或在代谢重编程培养基中培养的细胞群具有增加数量的干样细胞和效应子样细胞两者。在一些方面，与根据常规方法培养的细胞相比，根据本文所公开的方法培养的细胞表现出更大的增殖潜力。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的细胞表现出增加的转导效率。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的细胞在移植到受试者中后表现出增加的体内活力。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的细胞表现出增加的细胞潜能。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的细胞表现出减少的细胞耗竭。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的细胞在移植到受试者中后表现出增加的体内持久性。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的细胞在移植到受试者中后表现出增加的体内活性。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的细胞在移植到受试者中后表现出更持久的体内应答。在一些方面，受试者是人。
在一些方面，细胞组合物中至少约5％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约10％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约15％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约20％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约25％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约30％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约35％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约40％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约45％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约50％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约55％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约60％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约65％的细胞具有干样表型。在一些方面，细胞组合物中至少约70％的细胞具有干样表型。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，干样T细胞占培养物中T细胞总数的至少约10％至至少约70％。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，干样T细胞占培养物中CD8+T细胞总数的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约70％。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，干样T细胞占培养物中CD4+T细胞总数的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约70％。
在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约1.5倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约2.0倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约2.5倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约3.0倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约3.5倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约4.0倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约4.5倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约5.0倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约5.5倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约6.0倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约6.5倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约7.0倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约7.5倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约8.0倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约9.0倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约10倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约15倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约20倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约30倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约40倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约50倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约75倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约100倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约500倍。在一些方面，与培养前细胞组合物中的细胞数量相比，细胞组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约1000倍。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，培养物中T细胞总数的至少约10％至至少约70％是CD39-/TCF7+T细胞。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，培养物中T细胞总数的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％或至少约40％是CD39-/TCF7+T细胞。在一些方面，T细胞是CD4+T细胞。在一些方面，T细胞是CD8+T细胞。
在一些方面，细胞组合物包含免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的不表达CD45R0的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD45RA的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CCR7的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD62L的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达TCF7的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD3的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD27的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95和CD45RA的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD45RA和CCR7的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95、CD45RA和CCR7的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD45RA、CCR7和CD62L的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7和CD62L的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD45RA、CCR7、CD62L和TCF7的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7、CD62L和TCF7的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27并且不表达CD45RO或为CD45RO低的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27并且不表达CD45RO或为CD45RO低的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。
在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的不表达CD39和CD69的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD8并且不表达CD39和CD69的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，培养物中T细胞总数的至少约10％至至少约40％是CD39-/CD69-T细胞。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养T细胞后，培养物中T细胞总数的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％或至少约40％是CD39-/CD69-T细胞。
在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达(i)一种或多种干样标志物和(ii)一种或多种效应子样标志物两者的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达至少两种干样标志物和一种或多种效应子样标志物的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达至少三种干样标志物和一种或多种效应子样标志物的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达至少四种干样标志物和一种或多种效应子样标志物的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达一种或多种干样标志物和至少两种效应子样标志物的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)。
在一些方面，干样标志物选自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及它们的任何组合。在一些方面，干样标志物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+和TCF7+或它们的任何组合。在一些方面，免疫细胞表达CD45RO低。在一些方面，干样标志物包括本文列出的作为基因标签的一部分的一个或多个基因(参见上文；参见例如Gattinoni,L.等人,Nat Med 17(10):1290-1297(2011)或Galletti等人Nat Immunol 21,1552-1562(2020))。
在一些方面，效应子样标志物选自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及它们的任何组合。在一些方面，效应子样标志物包括选自由以下组成的组的STAT靶标：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2及它们的任何组合。
在一些方面，干样标志物包括在WNT信号传导途径中表达的基因。在一些方面，干样标志物包括选自GNG2、PSMC3、PSMB10、PSMC5、PSMB8、PSMB9、AKT1、MYC、CLTB、PSME1、DVL2、PFN1、H2AFJ、LEF1、CTBP1、MOV10、HIST1H2BD、FZD3、ITPR3、PARD6A、LRP5、HIST2H4A、HIST2H3C、HIST1H2AD、HIST2H2BE、HIST3H2BB、DACT1及它们的任何组合的一个或多个基因。在一些方面，干样标志物包括选自MYC、AKT1、LEF1及它们的任何组合的一个或多个基因。
在一些方面，效应子样标志物是包括选自TBCD、ARL4C、KLF6、LPGAT1、LPIN2、WDFY1、PCBP4、PIK343、FAS、LLGL2、PPP2R2B、TTC39C、GGA2、LRP8、PMAIP1、MVD、IL15RA、FHOD1、EML4、PEA15、PLEKHA5、WSB2、PAM、CD68、MSC、TLR3、S1PR5、KLRB1、CYTH3、RAB27B、SCD5及它们的任何组合的一个或多个基因的效应记忆相关基因。在一些方面，效应子样标志物包括选自KLF6、FAS、KLRB1、TLR3及它们的任何组合的一个或多个基因。
在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的CD45RA+、STAT5+和STAT3+的免疫细胞。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的CD62L+、STAT5+和STAT3+的免疫细胞。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的TCF7+、STAT5+和STAT3+的免疫细胞。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、STAT5+和STAT3+的免疫细胞。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+的免疫细胞。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的CD45RA+、CD45RO-、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+的免疫细胞。
在一些方面，免疫细胞包含选自一种或多种CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及它们的任何组合的标志物和一种或多种选自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及它们的任何组合的标志物。在一些方面，免疫细胞表达CD45RO低。在一些方面，免疫细胞包含一种或多种选自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及它们的任何组合的标志物和一种或多种效应子样标志物。在一些方面，免疫细胞包含一种或多种干样标志物和一种或多种选自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及它们的任何组合的标志物。在一些方面，免疫细胞表达CD45RO低。
本公开的一些方面涉及表达一种或多种干样标志物和一种或多种效应子样标志物的免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达至少两种干样标志物和一种或多种效应子样标志物。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达至少三种干样标志物和一种或多种效应子样标志物。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达至少四种干样标志物和一种或多种效应子样标志物。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达一种或多种干样标志物和至少两种效应子样标志物。在一些方面，干样标志物选自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及它们的任何组合。在一些方面，干样标志物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+和TCF7+或它们的任何组合。在一些方面，免疫细胞表达CD45RO低。在一些方面，干样标志物包括本文列出的作为基因标签的一部分的一个或多个基因(参见上文；参见例如Gattinoni,L.等人,Nat Med 17(10):1290-1297(2011)或Galletti等人Nat Immunol 21,1552-1562(2020))。在一些方面，效应子样标志物选自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及它们的任何组合。在一些方面，效应子样标志物包括选自由以下组成的组的STAT靶标：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2及它们的任何组合。
在一些方面，免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达CD45RA+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达CD62L+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达TCF7+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+的免疫细胞。在一些方面，免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)表达CD45RA+、CD45RO低、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。
本公开的一些方面涉及包含免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)群的细胞组合物，其中该免疫细胞群包含(i)表达一种或多种干样标志物的第一免疫细胞亚群(例如干样免疫细胞)和(ii)表达一种或多种效应子样标志物的第二免疫细胞亚群(例如效应子样免疫细胞)，其中与在对照培养基中培养的免疫细胞群相比，该免疫细胞群包含较高百分比(即，干样免疫细胞的数量/免疫细胞的总数)的表达一种或多种干样标志物的第一免疫细胞亚群。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)产生这些细胞组合物。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)具有表达GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT和/或NKG7的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的表达增加(例如较高百分比)以及表达IL-32的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的表达降低(例如较低百分比)。NKG7最高的细胞已显示是更好的杀伤细胞(Malarkannan等人2020Nat.Immuno.)。而IL-32较高的细胞已显示具有活化诱导的细胞死亡(Goda等人,2006Int.Immunol)。在一些方面，具有较高GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT和/或NKG7表达的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)是表达效应子样标志物的CD8+T细胞。在一些方面，具有较低IL-32表达的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)是表达效应子样标志物的CD8+ T细胞。
本公开的一些方面涉及包含免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)或工程化免疫细胞的细胞组合物。本公开的一些方面涉及包含免疫细胞(例如T细胞、NK细胞或TIL)或工程化免疫细胞的细胞群。在一些方面，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的工程化细胞包含免疫细胞。
在一些方面，免疫细胞是工程化免疫细胞。如本文所用，“工程化的”免疫细胞是指已以例如根据本文所公开的方法赋予细胞一种或多种非天然存在免疫细胞的特征的物理和/或功能特性的方式操纵的免疫细胞。例如，在一些方面，工程化的免疫细胞可通过修饰免疫细胞以表达一种或多种与细胞异源的蛋白质(例如嵌合抗原受体或T细胞受体)来生成，使得工程化的免疫细胞不是天然存在的。在一些方面，工程化的免疫细胞可通过以特定方式培养免疫细胞来生成，例如在低渗和高钾培养基中培养，其中所得工程化的免疫细胞具有一种或多种在天然存在的细胞中未显示的物理和/或功能特性。在一些方面，表达一种或多种干样标志物和一种或多种效应子样标志物的免疫细胞(例如工程化的细胞)(例如本公开的工程化细胞)是T干/效应(TSE)细胞。在一些方面，TSE细胞保持较低分化状态(例如，表达一种或多种干样标志物、能够增殖、能够分化或它们的任何组合)，并且细胞具有效应子功能(例如，表达一种或多种效应子样标志物、能够靶向和/或杀伤肿瘤细胞、表现出多功能性或它们的组合)。在一些方面，本文所公开的TSE细胞表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。在一些方面，本文所公开的TSE细胞表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。在一些方面，TSE细胞是CD45RO低的。在一些方面，TSE细胞表达例如如本文所公开的重组受体。本公开的一些方面涉及包含一种或多种TSE细胞的细胞组合物。本公开的一些方面涉及包含一种或多种TSE细胞的工程化免疫细胞群。在一些方面，群体中至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约40％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约50％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约60％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约70％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约75％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约80％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约85％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约90％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约95％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约98％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中至少约99％的工程化免疫细胞是TSE细胞。在一些方面，群体中约100％的工程化免疫细胞是TSE细胞。
在一些方面，细胞组合物包含一种或多种免疫细胞，例如T细胞和/或NK细胞，其是基因工程化的。在一些方面，细胞组合物包含一种或多种免疫细胞，例如T细胞和/或NK细胞，其被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。本文(例如上文第II.G.1.小节)中公开的任何CAR都可以用于细胞组合物的细胞中。
在一些方面，细胞组合物包含一种或多种免疫细胞，例如T细胞和/或NK细胞，其被工程化以表达T细胞受体(TCR)，例如工程化的TCR。本文(例如上文第II.G.2.小节)中公开的任何TCR都可以用于细胞组合物的细胞中。
在一些方面，细胞组合物包含一种或多种免疫细胞，例如T细胞和/或NK细胞，其被工程化以表达TCRm。本文(例如上文第II.G.3.小节)中公开的任何TCRm都可以用于细胞组合物的细胞中。
在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物(例如，用作疗法的最终细胞产物的产量)包含至少约1x105个、5x105个、1x106个、5x106个、1x107个、5x107个、1x108个、5x108个、1x109个或5x109个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约1x103个、5x103个、1x104个、5x104个、1x105个、5x105个、1x106个、5x106个、1x107个、5x107个、1x108个、5x108个、1x109个或5x109个干样细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约5x109个、6x109个、7x109个、8x109个、9x109个、1x1010个、2x1010个、3x1010个、4x1010个、5x1010个、6x1010个、7x1010个、8x1010个、9x1010个、10x1010个、11x1010个、12x1010个、13x1010个、14x1010个或15x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约1x106个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约1x106个干样细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约1x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约2x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约3x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约4x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约5x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约6x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约7x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约8x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约9x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约10x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约11x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约12x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约13x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约14x1010个细胞。在一些方面，通过本文所述的任何方法获得的细胞组合物包含至少约15x1010个细胞。在一些方面，细胞产量代表CD3+细胞的总数。在一些方面，本文所公开的方法到在本公开的培养基中培养至少约第10天产生包含至少约1x1010、至少约1.1x1010、至少约1.2x1010、至少约1.3x1010、至少约1.4x1010、至少约1.5x1010、至少约1.6x1010、至少约1.7x1010、至少约1.8x1010、至少约1.9x1010、或至少约2.0x1010个扩增细胞的组合物。在一些方面，本文所公开的方法到在本公开的培养基中培养至少约第10天产生包含至少约1.8x1010个扩增免疫细胞的组合物。
在一些方面，细胞组合物包含至少约1x1010、至少约1.1x1010、至少约1.2x1010、至少约1.3x1010、至少约1.4x1010、至少约1.5x1010、至少约1.6x1010、至少约1.7x1010、至少约1.8x1010、至少约1.9x1010、或至少约2.0x1010个干样细胞。在一些方面，本文所公开的方法到培养的至少约第10天产生包含至少约1x1010、至少约1.1x1010、至少约1.2x1010、至少约1.3x1010、至少约1.4x1010、至少约1.5x1010、至少约1.6x1010、至少约1.7x1010、至少约1.8x1010、至少约1.9x1010、或至少约2.0x1010个干样细胞的组合物。在一些方面，本文所公开的方法到在本公开的培养基中培养至少约第10天产生包含至少约1.8x1010个干样细胞的组合物。
在一些方面，本文所公开的方法产生包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％活的免疫细胞的组合物。在一些方面，本文所公开的方法产生包含至少约1.8x1010个具有至少约94％细胞活力的干样细胞的组合物。
本公开的一些方面涉及包含富集了CD8+TIL的TIL群体的组合物。在一些方面，组合物包含根据本文所公开的任何方法培养的TIL群体。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约20％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约30％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约40％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约50％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约60％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约70％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约80％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约90％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约95％的TIL是CD8+TIL。
在一些方面，TIL表现出指示较低分化表型的一种或多种生物标志物的表达增加。在一些方面，TIL表现出TCF7的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出TCF7的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、或至少约50倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出TCF7的表达增加至少约40倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+TCF7+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是TCF7+。
在一些方面，TIL表现出CD45RO的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD45RO的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD45RO的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+CD45RO+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD45RO+。
在一些方面，TIL表现出CD62L的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD62L的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD62L的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+CD62L+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD62L+。
在一些方面，TIL表现出CD27的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+CD27+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD27+。
在一些方面，TIL表现出CD62L和CD27的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD62L和CD27的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+/CD62L+/CD27+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD62L+CD27+。
在一些方面，TIL表现出CD28的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD28的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD28的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+/CD28+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD28+。
在一些方面，TIL表现出CD27和CD28的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27和CD28的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27和CD28的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+CD27+CD28+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+。
在一些方面，TIL表现出CD27、CD28、PD1和CD103的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27、CD28、PD1和CD103的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27、CD28、PD1和CD103的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+CD27+CD28+PD1+CD103+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+PD1+CD103+。
在一些方面，TIL表现出CD27、CD28、PD1和TCF7的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27、CD28、PD1和TCF7的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27、CD28、PD1和TCF7的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+CD27+CD28+PD1+TCF7+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+PD1+TCF7+。
在一些方面，TIL表现出CD27、CD28、PD1、CD103和TCF7的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27、CD28、PD1、CD103和TCF7的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD27、CD28、PD1、CD103和TCF7的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+CD27+CD28+PD1+CD103+TCF7+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+PD1+CD103+TCF7+。
在一些方面，TIL表现出CD39的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD39的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD39的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+CD39+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD39+。
在一些方面，TIL表现出CD39和PD1的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD39和PD1的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD39和PD1的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+CD39+PD1+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD39+PD1+。
在一些方面，TIL表现出PD1的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出PD1的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出PD1的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+/PD1+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是PD1+。
在一些方面，TIL表现出PD1和CD27的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出PD1和CD27的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出PD1和CD27的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+PD1+CD27+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是PD1+CD27+。
在一些方面，TIL表现出CD103的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD103的表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出CD103的表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+/CD103+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD103+。
在一些方面，与根据常规方法培养的可比较免疫细胞相比，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)具有增加数量的较低分化细胞。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出干样表型的一种或多种典型标志物的表达增加。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)在移植到受试者中后表现出增加的体内活力。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出增加的细胞潜能。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)表现出降低的细胞耗竭。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)在移植到受试者中后表现出增加的体内持久性。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)在移植到受试者中后表现出增加的体内活性。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)在移植到受试者中后表现出更持久的体内应答。在一些方面，受试者是人。
在一些方面，组合物中至少约5％的TIL(例如CD8+TIL)具有干样表型。在一些方面，组合物中至少约10％的TIL(例如CD8+TIL)具有干样表型。在一些方面，组合物中至少约15％的TIL(例如CD8+TIL)具有干样表型。在一些方面，组合物中至少约20％的TIL(例如CD8+TIL)具有干样表型。在一些方面，组合物中至少约25％的TIL(例如CD8+TIL)具有干样表型。在一些方面，组合物中至少约30％的TIL(例如CD8+TIL)具有干样表型。在一些方面，组合物中至少约35％的TIL(例如CD8+TIL)具有干样表型。在一些方面，组合物中至少约40％的TIL(例如CD8+TIL)具有干样表型。在一些方面，组合物中至少约45％的TIL(例如CD8+TIL)具有干样表型。在一些方面，组合物中至少约50％的TIL(例如CD8+TIL)具有干样表型。
在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约1.5倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约2.0倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约2.5倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约3.0倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约3.5倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约4.0倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约4.5倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约5.0倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约5.5倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约6.0倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约6.5倍。在一些方面，与培养前组合物中的细胞数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约7.0倍。在一些方面，与培养前组合物中的细胞数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约7.5倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约8.0倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL(例如CD8+TIL)的数量增加至少约9.0倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约10倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约15倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL(例如CD8+TIL)的数量相比，组合物中具有干样表型的细胞数量增加至少约20倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL的数量增加至少约30倍。在一些方面，与培养前组合物中的细胞数量相比，组合物中具有干样表型的TIL的数量增加至少约40倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL的数量增加至少约50倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL的数量增加至少约75倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL的数量增加至少约100倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL的数量增加至少约500倍。在一些方面，与培养前组合物中TIL的数量相比，组合物中具有干样表型的TIL的数量增加至少约1000倍。
在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的不表达CD45R0的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD45RA的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CCR7的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD62L的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达TCF7的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD3的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD27的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95和CD45RA的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95、CD45RA和CCR7的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7和CD62L的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7、CD62L和TCF7的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27并且不表达CD45R0的TIL。
在一些方面，初始培养后的细胞组合物包含至少约2x106、至少约3x106、至少约4x106、至少约5x106、至少约6x106、至少约7x106、至少约8x106、至少约9x106、或至约10x106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的细胞组合物包含约2x106至约10x106，例如约2x106、约3x106、约4x106、约5x106、约6x106、约7x106、约8x106、约9x106、或约10x106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约2x106个细胞(例如TIL)至约3x106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约3x106个细胞(例如TIL)至约4x106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约4x106个细胞(例如TIL)至约5x106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约5x106个细胞(例如TIL)至约6x106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约6x106个细胞(例如TIL)至约7x106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约7x106个细胞(例如TIL)至约8x106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约8x106个细胞(例如TIL)至约9x106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约9x106个细胞(例如TIL)至约10x106个细胞(例如TIL)。
在一些方面，第二TIL扩增后的细胞组合物包含至少约5x107、至少约3x107、至少约4x107、至少约5x107、至少约6x107、至少约7x107、至少约8x107、至少约9x107、至少约10x107、至少约11x107、至少约12x107、至少约13x107、至少约14x107、至少约15x107、至少约16x107、至少约17x107、至少约18x107、至少约19x107、或至少约20x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的细胞组合物包含约5x107至约20x107，例如约5x107、约6x107、约7x107、约8x107、约9x107、约10x107、约11x107、约12x107、约13x107、约14x107、约15x107、约16x107、约17x107、约18x107、约19x107、或约20x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约5x107至约6x107个细胞(例如TIL)、约6x107至约7x107个细胞(例如TIL)、约7x107至约8x107个细胞(例如TIL)、约8x107至约9x107个细胞(例如TIL)、约9x107至约10x107个细胞(例如TIL)、约10x107至约11x107个细胞(例如TIL)、约11x107至约12x107个细胞(例如TIL)、约12x107至约13x107个细胞(例如TIL)、约13x107至约14x107个细胞(例如TIL)、约14x107至约15x107个细胞(例如TIL)、约15x107至约16x107个细胞(例如TIL)、约16x107至约17x107个细胞(例如TIL)、约17x107至约18x107个细胞(例如TIL)、约18x107至约19x107个细胞(例如TIL)、或约19x107至约20x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约5x107至约6x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约6x107至约7x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约7x107至约8x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约8x107至约9x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约9x107至约10x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约10x107至约11x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约11x107至约12x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约12x107至约13x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约13x107至约14x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约14x107至约15x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约15x107至约16x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约16x107至约17x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约17x107至约18x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约18x107至约19x107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约19x107至约20x107个细胞(例如TIL)。
在一些方面，最终TIL扩增后的细胞组合物包含至少约10x109、至少约20x109、至少约30x109、至少约40x109、至少约50x109、至少约60x109、至少约70x109、至少约80x109、至少约90x109、或至少约100x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的细胞组合物包含约10x109至约100x109，例如约10x109、约20x109、约30x109、约40x109、约50x109、约60x109、约70x109、约80x109、约90x109、或约100x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约10x109至约20x109个细胞(例如TIL)、约20x109至约30x109个细胞(例如TIL)、约30x109至约40x109个细胞(例如TIL)、约40x109至约50x109个细胞(例如TIL)、约50x109至约60x109个细胞(例如TIL)、约60x109至约70x109个细胞(例如TIL)、约70x109至约80x109个细胞(例如TIL)、约80x109至约90x109个细胞(例如TIL)、或约90x109至约100x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约10x109至约20x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约20x109至约30x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约30x109至约40x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约40x109至约50x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约50x109至约60x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约60x109至约70x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约70x109至约80x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约80x109至约90x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约90x109至约100x109个细胞(例如TIL)。
在一些方面，适于向受试者施用的细胞组合物包含至少约2x109、至少约3x109、至少约4x109、至少约5x109、至少约6x109、至少约7x109、至少约8x109、至少约9x109、或至少约1x1010、或至少约10x1010、或至少约15x1010、或至少约20x1010、或至少约25x1010、或至少约30x1010个CD8+TIL。在一些方面，适于向受试者施用的细胞组合物包含至少约2x109个CD8+TIL。在一些方面，适于向受试者施用的细胞组合物包含至少约5x109个CD8+TIL。在一些方面，适于向受试者施用的细胞组合物包含至少约9x109个CD8+TIL。在一些方面，细胞组合物包含至少约1x1010个CD8+TIL。在一些方面，适于向受试者施用的细胞组合物包含至少约10x1010个CD8+TIL。在一些方面，细胞组合物包含至少约20x1010个CD8+TIL。在一些方面，适于向受试者施用的细胞组合物包含至少约30x1010个CD8+TIL。
IV.制备细胞培养基的方法
本公开的某些方面涉及制备本文所公开的细胞培养基的方法。本公开的一些方面涉及制备包含至少约5mM钾离子的低渗或等渗细胞培养基的方法。本公开的一些方面涉及制备包含至少约50mM钾离子的细胞培养基的方法。本公开的一些方面涉及制备包含至少约50mM钾离子和小于90mM NaCl的细胞培养基的方法。在一些方面，培养基通过将可商购获得的培养基(例如，本文所公开的基础培养基)改良成浓度为至少约5mM的钾离子以及钠离子、钙离子、糖(例如，葡萄糖)和细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21)中的一种或多种来制备。
在一些方面，基础培养基是本文所公开的任何基础培养基，例如上文第II.F.小节中所述的基础培养基。在一些方面，基础培养基包含浓度小于5mM的钾离子。在一些方面，基础培养基包含浓度小于50mM的钾离子。在一些方面，基础培养基包含钠离子、钙离子、糖(例如，葡萄糖)和细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21)中的一种或多种。
在一些方面，基础培养基选自平衡盐溶液(例如，PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最低必需培养基(GMEM)、α最低必需培养基(αMEM)、伊可夫氏改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、M199、OPTMIZERTMCTSTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)、OPTMIZERTM完全培养基、IMMUNOCULTTMXF(STEMCELLTMTechnologies)、IMMUNOCUL TTMXF、AIMV、TEXMACSTM培养基及它们的任何组合。在一些方面，基础培养基包含PRIME-XV T细胞CDM。在一些方面，基础培养基包含OPTMIZERTM。在一些方面，基础培养基包含OPTMIZE RTM Pro。在一些方面，基础培养基包含X-VIVOTM 15(LONZA)。在一些方面，基础培养基包含IMMUNOCULTTM。在一些方面，基础培养基不含血清。在一些方面，基础培养基还包含免疫细胞血清替代物(ICSR)。例如，在一些方面，基础培养基包含补充有ICSR的OPT MIZERTM完全培养基、补充有ICSR的AIM V、补充有ICSR的IM MUNOCULTTMXF、补充有ICSR的RPMI、补充有ICSR的TEXM ACSTM或它们的任何组合。在特定方面，基础培养基包括OPTMIZE RTM完全培养基。
在一些方面，合适的基础培养基包括克里克氏培养基、OPTIMI培养基、/>T细胞扩增培养基(Sigma-Aldri ch)、AIM/>培养基/> 培养基(Miltenyi Biotech)、/>培养基(Stem CellTechnologies)、/>T细胞扩增XSFM(Irvine Scientific)、伊可夫氏培养基和/或RPMI-1640培养基。
在一些方面，本公开包括包含基础培养基、NaCl、KCl、钙和葡萄糖的高钾培养基(例如代谢重编程培养基)，其中NaCl的浓度在约40mM和约80mM之间，KCl的浓度在40mM和90mM之间，钙的浓度在约0.5mM和约2.8mM之间，并且葡萄糖的浓度在约10mM和约24mM之间。在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)的渗透压摩尔浓度在约250mOsmol和约340mOsmol之间。
在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)还包含免疫细胞。在一些方面，免疫细胞包含TIL。
在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)还包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任何组合。在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)还包含IL-2和IL21。在一些方面，IL-2的浓度为约200ng/ml至约400ng/ml(例如，约200ng/ml、约300ng/ml或约400ng/ml)。在一些方面，IL-21的浓度为约20ng/ml至约40ng/ml(例如，约20ng/ml、约30ng/ml或约40ng/ml)。
在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)还包含约2.5％T细胞补充物、约2.5％血清替代物、约2mM L-谷氨酰胺、约免疫细胞血清替代物、约2mM L-谷氨酰胺、约2mM Glutamax、MEM非必需氨基酸溶液、Penstrep，约20μg/ml FUNGINTM、丙酮酸钠或它们的任何组合。在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)还包含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐。在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)还包含激酶抑制剂。
在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)还包含CD3激动剂。在一些方面，CD3激动剂是抗CD3抗体。在一些方面，抗CD3抗体包含OKT-3。
在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)还包含CD28激动剂。在一些方面，CD28激动剂是抗CD28抗体。在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)还包含CD27配体(CD27L)。在一些方面，高钾培养基(例如代谢重编程培养基)还包含4-1BB配体(4-1BBL)。
在一些方面，本公开包括包含本文所公开的高钾培养基(例如代谢重编程培养基)的细胞培养物；包含本文所公开的高钾培养基(例如代谢重编程培养基)的细胞袋；或包含本文所公开的高钾培养基(例如代谢重编程培养基)的生物反应器。
在一些方面，制备本文所述的细胞培养基的方法包括向基础培养基中添加钾离子直至达到所需的钾离子浓度。在一些方面，通过在培养基中添加足够量的钾盐将钾离子添加到基础培养基中。在一些方面，钾盐的非限制性示例包括三氯铂胺钾、水合五氯钌酸钾、双(草酸根)铂(II)酸钾二水合物、硫酸氢钾、硼氢化钾、溴化钾、碳酸钾、氯化钾、铬酸钾、重铬酸钾、二氰银酸钾、二氰金酸钾、氟化钾、氟硫酸钾、六氯铱酸钾、六氯锇酸钾、六氯钯酸钾、六氯铂酸钾、六氯铼酸钾、六氰铬酸钾、六氰高铁酸钾、六氰钌(II)酸钾水合物、六氟锑酸钾、六氟镍酸钾、六氟磷酸钾、六氟钛酸钾、六氟锆酸钾、六羟基锑酸钾、六碘铂酸钾、六碘铼酸钾、氢氧化钾、碘酸钾、碘化钾、锰酸钾、偏钒酸钾、钼酸钾、硝酸钾、亚硝基二磺酸钾、二水合锇(VI)酸钾、五氯亚硝基钌酸钾、高氯酸钾、高铼酸钾、高钌酸钾、过硫酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、焦磷酸钾、硒氰酸钾、硒氰酸钾、三水合锡酸钾、硫酸钾、碲酸钾水合物、亚碲酸钾、四硼酸钾四水合物、四溴金酸钾、四溴钯酸钾、四氯钯酸钾、四氯铂酸钾、四氰钯酸钾、四氰铂酸钾、四氟硼酸钾、四硝基铂酸钾、连四硫酸钾、对甲苯硫代磺酸钾和羟基柠檬酸钾三元一水合物。在某些方面，钾盐包括氯化钾(KCl)。在某些方面，钾盐包括柠檬酸钾。在某些方面，钾盐包括羟基柠檬酸钾。
在本公开的一些方面，细胞培养基包含浓度为至少约5mM的钾离子、以及钠离子，其中培养基是低渗的或等渗的。在本公开的一些方面，细胞培养基包含浓度为至少约50mM的钾离子、以及钠离子。在一些方面，制备本文所述的细胞培养基的方法包括向基础培养基中添加钠离子直至达到所需的钠离子浓度。在一些方面，通过添加一种或多种钠盐将钠离子添加到基础培养基中。钠盐的非限制性示例包括(偏)高碘酸钠、酒石酸甲基砷酸二钠水合物、叠氮化钠、苯甲基氧化钠、溴化钠、碳酸钠、氯化钠、铬酸钠、环己烷丁酸钠、乙硫醇钠、氟化钠、单氟磷酸钠、甲酸钠、六氯铱(III)酸钠水合物、六氯铱(IV)酸钠六水合物、六氯铂(IV)酸钠六水合物、六氯铑(III)酸钠、六氟铝酸钠、六氟锑(V)酸钠、六氟砷(V)酸钠、六氟铁(III)酸钠、六氟磷酸钠、六氟硅酸钠、六羟基铂(IV)酸钠、六偏磷酸钠、氟化氢钠、硫酸氢钠、氰胺一钠、氢氧化钠、碘化钠、偏硼酸钠四水合物、九水偏硅酸钠、偏钒酸钠、钼酸钠、硝酸钠、亚硝酸钠、草酸钠、过硼酸钠一水合物、过碳酸钠、高氯酸钠、高碘酸钠、高锰酸钠、高铼酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠、硒酸钠、亚硒酸钠、锡酸钠、硫酸钠、亚碲酸钠、四硼酸钠、四氯铝酸钠、四氯金(III)酸钠、四氯钯(II)酸钠、四氯铂(II)酸钠、硫代磷酸三钠、硫代硫酸钠、硫代硫酸钠五水合物、氟氧化钇钠、三偏磷酸钠及它们的任何组合。在某些方面，钠盐包括氯化钠(NaCl)。在某些方面，钠盐包括碳酸氢钠。在某些方面，钠盐包括羟基柠檬酸钠。在某些方面，钠盐包括磷酸钠。在本公开的一些方面，细胞培养基包含浓度为至少约50mM的钾离子和浓度小于90mM的NaCl。在一些方面，制备本文所述的细胞培养基的方法包括向基础培养基中添加NaCl直至达到所需的钠离子浓度，其中钾和NaCl的总浓度大于110mM且小于140mM。
在一些方面，钠离子的所需浓度低于基础培养基的所需浓度。因此，在一些方面，通过用缺乏钠离子或具有较低浓度的钠离子的合适溶液稀释基础培养基来达到所需的钠离子浓度。
在本公开的一些方面，细胞培养基包含浓度为至少约5mM的钾离子、以及钙离子，其中培养基是低渗的或等渗的。在本公开的一些方面，细胞培养基包含浓度为至少约50mM的钾离子、以及钙离子。在本公开的一些方面，细胞培养基包含浓度为至少约50mM的钾离子、浓度小于90mM的NaCl、以及钙离子。在一些方面，制备本文所述的细胞培养基的方法包括向基础培养基中添加钙离子直至达到所需的钙离子浓度。在一些方面，通过添加一种或多种钙盐将钙离子添加到基础培养基中。钙盐的非限制性示例包括溴化钙、碳酸钙、氯化钙、氰氨化钙、氟化钙、氢化钙、氢氧化钙、碘酸钙、碘化钙、硝酸钙、亚硝酸钙、草酸钙、四水合高氯酸钙、磷酸二氢钙、磷酸三氢钙、硫酸钙、四水合硫氰酸钙、羟基磷灰石或它们的任何组合。在一些方面，钙盐包括氯化钙(CaCl2)。
在一些方面，钙离子的所需浓度低于基础培养基的所需浓度。因此，在一些方面，通过用缺乏钙离子或具有较低浓度的钙离子的合适溶液稀释基础培养基来达到所需的钙离子浓度。
在本公开的一些方面，细胞培养基包含浓度为至少约5mM的钾离子、以及糖(例如葡萄糖)，其中培养基是低渗的或等渗的。在本公开的一些方面，细胞培养基包含浓度为至少约50mM的钾离子、以及糖(例如葡萄糖)。在一些方面，制备本文所述的细胞培养基的方法包括向基础培养基中添加糖(例如葡萄糖)直至达到所需的糖(例如葡萄糖)浓度。糖的非限制性示例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖或它们的任何组合。在一些方面，糖包括葡萄糖。
在一些方面，糖(例如葡萄糖)的所需浓度低于基础培养基的所需浓度。因此，在一些方面，通过用缺乏糖(例如葡萄糖)或具有较低浓度的糖(例如葡萄糖)的合适溶液稀释基础培养基来达到所需的糖(例如葡萄糖)浓度。
在一些方面，调节培养基的张力以达到目标渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基的目标渗透压摩尔浓度低于基础培养基的目标渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基的张力高于基础培养基的目标渗透压摩尔浓度。在一些方面，培养基的目标渗透压摩尔浓度与基础培养基的目标渗透压摩尔浓度相同。
培养基可以是低渗的、等渗的或高渗的。培养基的张力可能受到许多因素的影响，所述因素包括培养基中钾离子的浓度。在一些方面，钾离子浓度增加搭配一种或多种其他因子的浓度的增加或降低。在一些方面，该搭配影响培养基的张力。在一些方面，钾离子的浓度增加，而钠离子的浓度降低。在一些方面，钾离子的浓度增加，而糖(例如葡萄糖)的浓度降低。在一些方面，钾离子的浓度增加，而钙离子的浓度降低。在一些方面，钾离子的浓度增加，而钠离子和糖(例如葡萄糖)的浓度降低。在一些方面，钾离子的浓度增加，而钠离子和钙离子的浓度降低。在一些方面，钾离子的浓度增加，而钠离子、糖(例如葡萄糖)和钙离子的浓度降低。在一些方面，调节钾离子、钠离子和/或糖(例如葡萄糖)的浓度以便获得目标张力。
IV.方法治疗
本公开的某些方面涉及根据本文所公开的任何方法培养的细胞(例如多能细胞、多潜能细胞和/或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))群。在某些方面，细胞是免疫细胞。在一些方面，细胞是T细胞。在一些方面，细胞是NK细胞。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)分离自人受试者。在一些方面，免疫细胞是肿瘤浸润T细胞或肿瘤浸润NK细胞。在某些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)是工程化的。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)被工程化以包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)被工程化以包含工程化的T细胞受体(TCR)。在一些方面，TCR识别在癌症患者中鉴定的新抗原。
在一些方面，免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)包含CAR。在一些方面，T细胞是CD8+ T细胞或CD4+ T细胞。在一些方面，T细胞是Th1、Th2、Th17或Tc17细胞。在一些方面，CAR表达细胞是CAR T细胞，例如单CAR T细胞、基因组编辑的CAR T细胞、双CAR T细胞或串联CAR T细胞。国际申请号PCT/US2019/044195中提供了此类CAR T细胞的示例。
在一些方面，TIL是肿瘤浸润T细胞。在一些方面，TIL包含CD4+T细胞和CD8+T细胞两者。在一些方面，TIL包含CD8+T细胞。在一些方面，TIL富含肿瘤特异性TIL。在一些方面，TIL富含干样TIL。
在一些方面，细胞包含表达抗原受体和/或另一种另外的多肽的构建体。在一些方面中，抗原受体包含抗体、工程化的抗体(诸如scFv)、CAR、工程化的TCR、TCR模拟物(例如，抗体-T细胞受体(abTCR)或嵌合抗体-T细胞受体(caTCR))或嵌合信号传导受体(CSR)。举例而言，TCR可以包含工程化的TCR，其中TCR(例如，α/βTCR或γ/δTCR)的抗原结合结构域已由抗体(具有或不具有抗体的恒定结构域)的抗原结合结构域置换；然后工程化的TCR变得对抗体的抗原具有特异性，同时保持TCR的信号传导功能。嵌合信号传导受体可以包含(1)细胞外结合结构域(例如，天然/修饰的受体细胞外结构域、天然/修饰的配体细胞外结构域、scFv、纳米抗体、Fab、DARPin和亲和体分子)，(2)跨膜结构域，和(3)细胞内信号传导结构域(例如，活化转录因子或者募集和/或活化JAK/STAT、激酶、磷酸酶和泛素；SH3；SH2；和PDZ的结构域)。参见例如，EP340793B1、WO 2017/070608、WO 2018/200582、WO 2018/200583、WO2018/200585，以及Xu等人,Cell Discovery(2018)4:62。
在一些方面，抗原受体靶向感兴趣的抗原(例如，肿瘤抗原或病原体的抗原)。抗原可包括但不限于AFP(甲胎蛋白)、αvβ6或另一种整合素、BCMA、Braf、B7-H3、B7-H6、CA9(碳酸酐酶9)、CCL-1(C-C基序趋化因子配体1)、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD45、CD47、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD98、CD123、CD138、CD171、CD352、CEA(癌胚抗原)、封闭蛋白18.2、封闭蛋白6、c-MET、DLL3(δ样蛋白3)、DLL4、ENPP3(外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3)、EpCAM、EPG-2(上皮糖蛋白2)、EPG-40、ephrinB2、EPHa2(肾上腺素受体A2)、ERBB二聚体、雌激素受体、ETBR(内皮素B受体)、FAP-α(成纤维细胞活化蛋白α)、胎儿AchR(胎儿乙酰胆碱受体)、FBP(叶酸结合蛋白)、FCRL5、FR-α(叶酸受体α)、GCC(鸟苷酸环化酶C)、GD2、GD3、GPC2(磷脂酰肌醇蛋白聚糖2)、GPC3、gp100(糖蛋白100)、GPNMB(糖蛋白NMB)、GPRC5D(G蛋白偶联受体5D)、HER2、HER3、HER4、乙型肝炎表面抗原、HLA-A1(人白细胞抗原Al)、HLA-A2(人白细胞抗原A2)、HMW-MAA(人高分子量黑素瘤相关抗原)、IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)、Igκ、Igλ、IL-22Ra(IL-22受体α)、IL-13Ra2(IL-13受体α2)、KDR(激酶插入结构域受体)、LI细胞粘附分子(LI-CAM)、Liv-1、LRRC8A(富含亮氨酸重复蛋白8家族成员A)、Lewis Y、黑素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1(黑色素A)、鼠巨细胞病毒(MCMV)、MCSP(黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、间皮素、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、MHC/肽复合物(例如与源自AFP、KRAS、NY-ESO、MAGE-A和WT1的肽复合的HLA-A)、NCAM(神经细胞粘附分子)、Nectin-4、NKG2D(自然杀伤2组成员D)配体、NY-ESO、癌胚抗原、PD-1、PD-L1、PRAME(黑素瘤优先表达的抗原)、孕酮受体、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、ROR1、ROR2、SIRPα(信号调节蛋白α)、SLIT、SLITRK6(NTRK样蛋白6)、STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原1)、存活蛋白、TAG72(肿瘤相关糖蛋白72)、TPBG(滋养层糖蛋白)、Trop-2、VEGFR1(血管内皮生长因子受体1)、VEGFR2、以及来自HIV、HBV、HCV、HPV和其他病原体的抗原。
在某些方面，抗原受体靶向hTERT。在一些方面，抗原受体靶向KRAS。在一些方面，抗原受体靶向Braf。在一些方面，抗原受体靶向TGFβRII。在一些方面，抗原受体靶向MAGEA10/A4。在一些方面，抗原受体靶向AFP。在一些方面，抗原受体靶向PRAME。在一些方面，抗原受体靶向MAGE A1。在一些方面，抗原受体靶向WT-1。在一些方面，抗原受体靶向NY-ESO。在一些方面，抗原受体靶向PRAME。在一些方面，抗原受体靶向NY-ESO。在一些方面，抗原受体靶向CD19。
在一些方面，抗原受体靶向BCMA。在一些方面，抗原受体靶向CD147。在一些方面，抗原受体靶向CD19。在一些方面，抗原受体靶向CD19和CD22。在一些方面，抗原受体靶向CD19和CD28。在一些方面，抗原受体靶向CD20。在一些方面，抗原受体靶向CD20和CD19。在一些方面，抗原受体靶向CD22。在一些方面，抗原受体靶向CD30。在一些方面，抗原受体靶向CEA。在一些方面，抗原受体靶向DLL3。在一些方面，抗原受体靶向EGFRvIII。在一些方面，抗原受体靶向GD2。在一些方面，抗原受体靶向HER2。在一些方面，抗原受体靶向IL-1RAP。在一些方面，抗原受体靶向间皮素。在一些方面，抗原受体靶向methothelin。在一些方面，抗原受体靶向NKG2D。在一些方面，抗原受体靶向PSMA。在一些方面，抗原受体靶向TnMUC1。
在一些方面，CAR特异性地结合(即靶向)在肿瘤细胞(诸如恶性B细胞、恶性T细胞或恶性浆细胞)上表达的一种或多种抗原。在一些方面，CAR特异性地结合(即靶向)选自由以下组成的组的抗原：CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白(surviving)、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分或它们的任何组合。
在一些方面，CAR靶向BCMA。在一些方面，CAR靶向CD147。在一些方面，CAR靶向CD19。在一些方面，CAR靶向CD19和CD22。在一些方面，CAR靶向CD19和CD28。在一些方面，CAR靶向CD20。在一些方面，CAR靶向CD20和CD19。在一些方面，CAR靶向CD22。在一些方面，CAR靶向CD30。在一些方面，CAR靶向CEA。在一些方面，CAR靶向DLL3。在一些方面，CAR靶向EGFRvIII。在一些方面，CAR靶向GD2。在一些方面，CAR靶向HER2。在一些方面，CAR靶向IL-1RAP。在一些方面，CAR靶向间皮素。在一些方面，CAR靶向methothelin。在一些方面，CAR靶向NKG2D。在一些方面，CAR靶向PSMA。在一些方面，CAR靶向TnMUC1。
在一些方面，本文所公开的免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)包含T细胞受体(TCR)，例如工程化的TCR。在一些方面，工程化的TCR特异性地结合肿瘤抗原。如本文所用，术语“工程化的TCR”或“工程化的T细胞受体”是指经工程化以所需亲和力与主要组织相容性复合物(MHC)/肽靶抗原特异性地结合的T细胞受体(TCR)，所述靶抗原被选择、克隆和/或随后引入T细胞群中。
在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)在肿瘤细胞(诸如恶性B细胞、恶性T细胞或恶性浆细胞)上表达的一种或多种抗原。
在某些方面，本公开的工程化的细胞表达靶向抗原的T细胞受体(TCR)。在一些方面，TCR工程化的细胞靶向共有的肿瘤相关抗原(共有的TAA)。在一些方面，TCR工程化的细胞靶向独特的肿瘤相关抗原(独特的TAA)。在一些方面，TCR工程化的细胞靶向肿瘤特异性抗原。在一些方面，TCR工程化的细胞可以靶向CT抗原，例如黑素瘤相关抗原(MAGE)，包括但不限于MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9.23、MAGE-A10和MAGE-A12。在一些方面，TCR工程化的细胞可以靶向糖蛋白(gp100)、T细胞识别的黑素瘤抗原(MART-1)和/或酪氨酸酶，它们主要在黑素瘤和正常黑素细胞中发现。在一些方面，TCR工程化的细胞可以靶向维尔姆斯瘤1(WT1)，即一种在大多数急性髓样白血病(AML)、急性淋巴样白血病、几乎每种类型的实体瘤和几种关键组织诸如心脏组织中高度表达的过表达抗原。在一些方面，TCR工程化的细胞可以靶向间皮素，即另一种在间皮瘤中高度表达但也存在于几种组织(包括气管)的间皮细胞上的过表达抗原。
在一些方面，TCR工程化的细胞可以靶向任何新抗原，其可以由单独肿瘤特异性的随机体细胞突变形成。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)选自由以下组成的组的癌症抗原：AFP、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶(prostase)、PAP、ELF2M、肝配蛋白(Ephrin)B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白(surviving)、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分或它们的任何组合。
在某些方面，TCR特异性地结合(即靶向)hTERT。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)KRAS。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)Braf。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)TGFβRII。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)MAGE A10/A4。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)AFP。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)PRAME。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)MAGE A1。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)WT-1。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)NY-ESO。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)PRAME。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)NY-ESO。在一些方面，TCR特异性地结合(即靶向)CD19。在一些方面，TCR特异性地结合在癌症患者中鉴定的新抗原。
在一些方面，将细胞(例如多能细胞、多潜能细胞或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))施用于有需要的受试者。在一些方面，将使用本文所公开的方法制备的细胞(例如多能细胞、多潜能细胞或免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞))施用于受试者以治疗癌症，例如肿瘤。在一些方面，治疗方法包括向受试者施用有效量的本公开的细胞组合物，例如根据本文所公开的方法制备的细胞，例如本文所公开的表达嵌合多肽或TCR的T细胞。在一些方面，治疗方法包括向受试者施用有效量的本公开的TIL组合物，例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体的组合物，例如富含CD8+ TIL、肿瘤特异性TIL和/或干样TIL的TIL群体。
本公开还提供了在受试者中刺激针对靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的细胞组合物，例如根据本文所公开的方法制备的细胞，例如本文所公开的表达嵌合多肽或TCR的T细胞。
本公开还提供了在受试者中刺激针对靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，该方法包括施用有效量的本公开的TIL组合物，例如根据本文所公开的方法制备的TIL群体，例如富含CD8+TIL的TIL群体。
本公开还提供了在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的细胞组合物，例如根据本文所公开的方法制备的细胞，例如本文所公开的表达嵌合多肽或TCR的T细胞。
在一些方面，在本公开的细胞组合物中施用的细胞是T细胞。在一些方面，细胞是自体T细胞。在一些方面，在本公开的细胞组合物中施用的细胞群包含TIL。在一些方面，在本公开的细胞组合物中施用的细胞群包含自体TIL。
在一些方面，该方法包括向受试者施用至少约1x104、至少约5x104、至少约1x105、至少约5x105、至少约1x106、至少约2x106、至少约3x106、至少约4x106、至少约5x106、至少约6x106、至少约7x106、至少约8x106、至少约9x106、至少约1x107、至少约5x107、至少约1x108个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括向受试者施用至少约1x104、至少约5x104、至少约1x105、至少约5x105、至少约1x106、至少约2x106、至少约3x106、至少约4x106、至少约5x106、至少约6x106、至少约7x106、至少约8x106、至少约9x106、至少约1x107、至少约5x107、至少约1x108、至少约1x109、至少约2x109、至少约3x109、至少约4x109、至少约5x109、至少约6x109、至少约7x109、至少约8x109、至少约9x109、至少约1x1010、至少约10x1010、至少约15x1010、至少约20x1010、至少约25x1010、或至少约30x1010个细胞(例如TIL)。在一些方面，细胞是TIL。在一些方面，TIL是CD8+TIL。
在一些方面，该方法包括施用至少约10x109、至少约20x109、至少约30x109、至少约40x109、至少约50x109、至少约60x109、至少约70x109、至少约80x109、至少约90x109、或至少约100x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约10x109至约100x109，例如约10x109、约20x109、约30x109、约40x109、约50x109、约60x109、约70x109、约80x109、约90x109、或约100x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约10x109至约20x109个细胞(例如TIL)、约20x109至约30x109个细胞(例如TIL)、约30x109至约40x109个细胞(例如TIL)、约40x109至约50x109个细胞(例如TIL)、约50x109至约60x109个细胞(例如TIL)、约60x109至约70x109个细胞(例如TIL)、约70x109至约80x109个细胞(例如TIL)、约80x109至约90x109个细胞(例如TIL)、或约90x109至约100x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约10x109至约20x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约20x109至约30x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约30x109至约40x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约40x109至约50x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约50x109至约60x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约60x109至约70x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约70x109至约80x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约80x109至约90x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，该方法包括施用约90x109至约100x109个细胞(例如TIL)。在一些方面，TIL是CD8+TIL。
在一些方面，与参考肿瘤体积相比，施用本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞)减少了受试者的肿瘤体积。在一些方面，与参考肿瘤体积相比，施用本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+ TIL、肿瘤特异性TIL和/或干样TIL))减少了受试者的肿瘤体积。在一些方面，参考肿瘤体积是在施用工程化的细胞之前受试者的肿瘤体积。在另外的方面，参考肿瘤体积是未接受施用的相应受试者的肿瘤体积。在一些方面，与参考肿瘤体积相比，施用后受试者的肿瘤体积减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
在一些方面，治疗肿瘤包括减少受试者的肿瘤重量。在某些方面，施用本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞)可以在施用于受试者时减少受试者的肿瘤重量。在一些方面，施用本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或干样TIL))可在施用于受试者时减少受试者的肿瘤重量。在一些方面，与参考肿瘤重量相比，施用后肿瘤重量减少了至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，参考肿瘤重量是在施用本公开的细胞组合物之前受试者的肿瘤重量。在另外的方面，参考肿瘤重量是未接受施用的相应受试者的肿瘤重量。
在一些方面，向例如患有肿瘤的受试者施用本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞)可以增加所述受试者的肿瘤和/或肿瘤微环境(TME)中的TIL(例如，CD4+或CD8+)的数量和/或百分比。在一些方面，向例如患有肿瘤的受试者施用本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或干样TIL))可增加受试者的肿瘤和/或肿瘤微环境(TME)中TIL(例如，CD8+TIL)的数量和/或百分比。在某些方面，与参考(例如，在未接受本公开的细胞组合物的受试者或在施用本公开的细胞组合物之前的相同受试者中的对应值)相比，肿瘤和/或TME中TIL(例如CD8+)的数量和/或百分比增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％、或至少约300％或更多。
在一些方面，相对于施用过包含根据常规方法(例如，在不包含浓度为至少50mM的钾离子的培养基中培养)制备的细胞的类似细胞疗法的受试者中的免疫应答的持续时间，向例如患有肿瘤的受试者施用本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞)可以增加受试者中的免疫应答的持续时间。在一些方面，相对于施用包含根据常规方法(例如，在不包含浓度为至少约40mM至至少约90mM(例如至少50mM)的钾离子的培养基中培养)制备的细胞的类似细胞疗法的受试者中的免疫应答的持续时间，向例如患有肿瘤的受试者施用本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或干样TIL))可以增加受试者中的免疫应答的持续时间。在某些方面，与参考(例如，施用包含根据常规方法(例如，在不包含浓度至少为50mM的钾离子的培养基中培养)制备的细胞的类似细胞疗法的受试者)相比，免疫应答的持续时间增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、或至少约1000％或更多。在某些方面，与参考(例如，施用过包含根据常规方法(例如，在不包含浓度为至少50mM的钾离子的培养基中培养)制备的细胞的类似细胞疗法的受试者)相比，免疫应答的持续时间增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、或至少约10倍或更多。在一些方面，与参考(例如，施用包含根据常规方法(例如，在不包含浓度为至少约40mM至至少约90mM(例如至少50mM)的钾离子的培养基中培养)制备的细胞的类似细胞疗法的受试者)相比，免疫应答的持续时间增加了至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、或至少约10倍或更多。
除了上述之外，施用本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞)可以具有有助于治疗肿瘤的其他效应。此外，施用根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+ TIL、肿瘤特异性TIL和/或干样TIL)可以具有有助于治疗肿瘤的其他效应。
如本文所述，本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL)可用于治疗多种癌症类型，例如源自包括乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、食管癌、眼癌、胃(胃)癌、胃肠道癌、卵巢癌、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或它们的组合的癌症的肿瘤。在一些方面，癌症包括实体瘤。在一些方面，癌症包括源自黑素瘤、结肠癌、肺癌、宫颈癌、胃肠道癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、头颈部小细胞癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、胰腺腺癌、头颈部鳞状细胞癌、睾丸生殖细胞瘤、胃腺癌、皮肤黑素瘤、间皮瘤、肾透明细胞癌、宫颈鳞状细胞癌和子宫颈内腺癌、食管癌、膀胱尿路上皮癌、侵袭性乳腺癌、肾乳头状细胞癌、结肠腺癌或它们的任何组合的实体瘤。
在一些方面，癌症包括黑素瘤。在一些方面，癌症包括结肠直肠癌。在一些方面，癌症包括结肠癌。在一些方面，癌症包括胰腺癌。在一些方面，癌症包括头颈癌。在一些方面，癌症包括宫颈癌。在一些方面，癌症包括卵巢癌。在一些方面，癌症包括肺癌。在一些方面，癌症包括胃肠道癌。在一些方面，癌症包括乳腺癌。在一些方面，癌症包括前列腺癌。在一些方面，癌症包括肝癌。在一些方面，癌症包括骨癌。在一些方面，癌症包括头颈部小细胞癌。在一些方面，癌症包括肺鳞状细胞癌。在一些方面，癌症包括肺腺癌。在一些方面，癌症包括胰腺腺癌。在一些方面，癌症包括头颈部鳞状细胞癌。在一些方面，癌症包括睾丸生殖细胞瘤。在一些方面，癌症包括胃腺癌。在一些方面，癌症包括皮肤黑素瘤。在一些方面，癌症包括间皮瘤。在一些方面，癌症包括肾透明细胞癌。在一些方面，癌症包括宫颈鳞状细胞癌。在一些方面，癌症包括子宫颈内腺癌。在一些方面，癌症包括食管癌。在一些方面，癌症包括膀胱尿路上皮癌。在一些方面，癌症包括侵袭性乳腺癌。在一些方面，癌症包括肾乳头状细胞癌。在一些方面，癌症包括结肠腺癌。在一些方面，癌症包括子宫癌。在一些方面，癌症包括脑癌。在一些方面，癌症包括甲状腺癌。在一些方面，癌症包括食管癌。在一些方面，癌症包括眼癌。在一些方面，癌症包括胃(胃)癌。在一些方面，癌症包括胃肠道癌。在一些方面，癌症包括肉瘤。在一些方面，癌症包括白血病。在一些方面，癌症包括淋巴瘤。在一些方面，癌症包括骨髓瘤。
因此，本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的黑素瘤的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的结肠直肠癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的结肠癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的胰腺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的头颈癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的宫颈癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的卵巢癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的肺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的胃肠道癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的乳腺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的前列腺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的肝癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的骨癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的头颈部小细胞癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的肺鳞状细胞癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的肺腺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的胰腺腺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的头颈部鳞状细胞癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的睾丸生殖细胞肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的胃腺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的皮肤黑素瘤的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的间皮瘤的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的肾透明细胞癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的宫颈鳞状细胞癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的子宫颈内腺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的食管癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的膀胱尿路上皮癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的侵袭性乳腺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的肾乳头状细胞癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的结肠腺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的子宫癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的脑瘤的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的食管癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的甲状腺癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的眼癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的胃(胃)癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的胃肠道癌的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的肉瘤的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的白血病的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的淋巴瘤的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者中的骨髓瘤的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。
在一些方面，本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞)可以与其他治疗剂(例如，抗癌剂和/或免疫调节剂)组合使用。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+ TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))可与其他治疗剂(例如，抗癌剂和/或免疫调节剂)组合使用。因此，在某些方面，本文所公开的治疗肿瘤的方法包括与一种或多种另外的治疗剂组合施用本公开的细胞组合物。
在一些方面，本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞)可以与一种或多种抗癌剂组合使用，使得可以靶向免疫途径的多个元件。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))可与一种或多种抗癌剂组合使用。在一些方面，抗癌剂包括免疫检查点抑制剂(即，阻断通过特定免疫检查点途径的信号传导)。
可用于本方法的免疫检查点抑制剂的非限制性示例包括CTLA-4拮抗剂(例如，抗CTLA-4抗体)、PD-1拮抗剂(例如，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体)、TIM-3拮抗剂(例如，抗TIM-3抗体)或它们的组合。在一些方面，检查点抑制剂是PD-1拮抗剂。在一些方面，检查点抑制剂是抗PD-1抗体。在一些方面，检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。在本申请的其他地方详细公开了组合治疗的全面和非限制性列表。
在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)在施用另外的治疗剂之前或之后施用于受试者。在其他方面，将本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)与另外的治疗剂同时施用于受试者。在某些方面，将本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)和另外的治疗剂可作为在药学上可接受的载剂中的单一组合物同时施用。在其他方面，将本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)和另外的治疗剂作为单独的组合物同时施用。
在一些方面，受试者是非人动物，诸如大鼠或小鼠。在一些方面，受试者是人。
在一些方面，本文所公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)可与其他治疗剂(例如，抗癌剂和/或免疫调节剂)组合使用。因此，在某些方面，本文所公开的治疗肿瘤的方法包括向受试者施用本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)与一种或多种另外的治疗剂的组合。此类剂可以包括例如化学治疗药物、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、放射程序、共刺激分子的活化剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或它们的任何组合。
在一些方面，本文所公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)可与标准护理治疗(例如，手术、放射疗法和化学疗法)组合使用。本文所述的方法还可用作维持疗法，例如，意图预防肿瘤发生或复发的疗法。
在一些方面，本公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)可与一种或多种抗癌剂组合使用，使得可以靶向免疫途径的多个元件。此类组合的非限制性示例包括：增强肿瘤抗原呈递的疗法(例如，树突细胞疫苗、分泌GM-CSF的细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特)；抑制负免疫调节的疗法，例如通过抑制CTLA-4和/或PD1/PD-L1/PD-L2途径和/或耗竭或阻断Treg或其他免疫抑制细胞(例如，髓样衍生的抑制细胞)；刺激正免疫调节的疗法，例如用刺激CD-137、OX-40和/或CD40或GITR途径和/或刺激T细胞效应子功能的激动剂；全身增加抗肿瘤T细胞频率的疗法；耗竭或抑制Treg(诸如肿瘤中的Treg)的疗法，例如使用CD25的拮抗剂(例如达克珠单抗(daclizumab))或通过离体抗CD25珠耗竭；影响肿瘤中抑制性髓样细胞功能的疗法；增强肿瘤细胞免疫原性的疗法(例如蒽环类抗生素)；过继T细胞或NK细胞转移，包括基因工程化细胞，例如工程化以表达嵌合抗原受体的细胞(CAR-T疗法)；抑制代谢酶诸如吲哚胺二氧化酶(IDO)、二氧化酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶的疗法；逆转/预防T细胞无反应性或耗竭的疗法；引发肿瘤部位的先天免疫活化和/或炎症的疗法；施用免疫刺激细胞因子；阻断免疫抑制细胞因子；或它们的任何组合。
在一些方面，抗癌剂包括免疫检查点抑制剂(即，阻断通过特定免疫检查点途径的信号传导)。可用于本方法的免疫检查点抑制剂的非限制性示例包括CTLA-4拮抗剂(例如，抗CTLA-4抗体)、PD-1拮抗剂(例如，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体)、TIM-3拮抗剂(例如，抗TIM-3抗体)或它们的组合。此类免疫检查点抑制剂的非限制性示例包括以下：抗PD1抗体(例如，纳武单抗派姆单抗(KEY/>MK-3475)、匹地利珠单抗(CT-011)、PDR001、MEDI0680(AMP-514)、TSR-042、REGN2810、JS001、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、BGB-A317、BI 754091、SHR-1210、及它们的组合)；抗PD-L1抗体(例如，阿替利珠单抗(/>RG7446；MPDL3280A；RO5541267)、度伐利尤单抗(durvalumab)(MEDI4736、/>)、BMS-936559、阿维鲁单抗(avelumab)/>LY3300054、CX-072(Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035、MDX-1105、及它们的组合)；和抗CTLA-4抗体(例如，伊匹单抗/>曲美木单抗(tremelimumab)(替西木单抗(ticilimumab)；CP-675,206)、AGEN-1884、ATOR-1015、及它们的组合)。
在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与PD1拮抗剂组合施用于受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与抗PD1抗体组合施用于受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与纳武单抗组合施用于受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与派姆单抗组合施用于受试者。
在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与PD-L1拮抗剂组合施用于受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与抗PD-L1抗体组合施用于受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与阿替利珠单抗组合施用于受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与度伐利尤单抗组合施用于受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与阿维鲁单抗组合施用于受试者。
在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与CTLA-4拮抗剂组合施用于受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与抗CTLA-4抗体组合施用于受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与伊匹单抗组合施用于受试者。在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与曲美木单抗组合施用于受试者。
在一些方面，抗癌剂包括免疫检查点活化剂(即，促进通过特定免疫检查点途径的信号传导)。在某些方面，免疫检查点活化剂包括OX40激动剂(例如，抗OX40抗体)、LAG-3激动剂(例如抗LAG-3抗体)、4-1BB(CD137)激动剂(例如，抗CD137抗体)、GITR激动剂(例如，抗GITR抗体)、TIM3激动剂(例如，抗TIM3抗体)或它们的组合。在一些方面，另外的治疗剂包括细胞因子。在一些方面，细胞因子包括IL-2、Il-21、Il-7、Il-15或它们的任何组合。
在一些方面，将本文所公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)在施用另外的治疗剂之前或之后施用于受试者。在其他方面，将本文所公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)与另外的治疗剂同时施用于受试者。在某些方面，本文所公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)和另外的治疗剂可作为在药学上可接受的载剂中的单一组合物同时施用。在其他方面，本文所公开的细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)和另外的治疗剂作为单独的组合物同时施用。在一些方面，本文所公开的另外的治疗剂和细胞组合物(例如，根据本文所公开的方法制备的免疫细胞，诸如表达CAR或TCR的T细胞和/或TIL群体)依序施用。
本公开的某些方面涉及治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括施用根据本文所公开的任何方法培养的细胞，例如Treg细胞。本公开的其他方面涉及治疗炎症性病理的方法，所述方法包括施用根据本文所公开的任何方法培养的细胞，例如Treg细胞。在一些方面，炎症性病理包括细胞因子释放综合征。在一些方面，炎症性病理包括脓毒症。在一些方面，炎症性病理包括移植物抗宿主病。在一些方面，细胞(例如，Treg细胞)是工程化的。
在一些方面，将本文所公开的细胞组合物(例如，包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如，富含CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或初始TIL))与检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体)组合施用于受试者。在一些方面，细胞组合物在检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体)之前施用。在一些方面，细胞组合物在检查点抑制剂(例如，抗PD1抗体)之后施用。
在一些方面，在接受细胞组合物之前向受试者施用淋巴耗竭疗法。在本文所公开的方法中可使用任何淋巴耗竭疗法。在一些方面，淋巴耗竭疗法包括化学疗法。在一些方面，淋巴耗竭疗法包括环磷酰胺。在一些方面，淋巴耗竭疗法包括氟达拉滨。在一些方面，淋巴耗竭疗法包括环磷酰胺和氟达拉滨。在一些方面，在细胞组合物之前至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天或至少约14天施用淋巴耗竭疗法。
实施例
实施例1.方法
培养基制备：T细胞条件培养基(TCM)补充有免疫细胞血清替代物(ThermoFisher)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、2mM Glutamax(Gibco)、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、丙酮酸钠(Gibco)、IL-2(200IU/mL)、IL-7(120IU/ml)、IL-15(20IU/ml)。
对于低渗条件培养基，通过添加NaCl、葡萄糖和无钙的RPMI调节具有不同钠、钾、葡萄糖和钙浓度的TCM培养基。在向TCM中添加规定的无NaCl的RPMI后，最终浓度范围为：NaCl(40-80mM)、KCl(40-80mM)、钙(0.5-2.8mM)、葡萄糖(10-24mM)和渗透压摩尔浓度(约250-260mOsmol)。参见表1。
表1.具有不同钾、钠、葡萄糖和钙浓度的低渗条件培养基
*基于下式计算张力：2X(K浓度+NaCl浓度)
我们还通过用不同的钾浓度维持恒定的张力条件(250mOsmol-低渗、280mOsmol-等渗、320mOsmol-高渗)测试了张力对T细胞的作用。在低渗条件下的终浓度为NaCl(35-75mM)、KCl(50-90mM)，在等渗条件下的终浓度为NaCl(50-90mM)、KCl(50-90mM)，在高渗条件下的终浓度为NaCl(70-110mM)、KCl(50-90mM)。参见表2。
表2.具有不同钾和NaCl浓度的低渗、等渗、高渗溶液
*根据下式计算张力：张力＝([K]+[NaCl])x2
其中“[K]”是培养基的钾浓度，并且“[NaCl]”是培养基的氯化钠浓度。
细胞培养和转导：将健康供体冷冻保存的人CD4和CD8细胞用TRANSACTTM(Miltenyi)在T细胞条件培养基-TCM、基础培养基或低渗条件培养基中活化。在TCM或低渗条件培养基中活化24小时后，在Grex板(Wilson Wolf)中用慢病毒颗粒转导T细胞以引入嵌合抗原受体(抗-CD19 CAR)。转导后第二天，向T细胞补充新鲜培养基以稀释TRANSACTTM并终止T细胞活化。根据细胞生长和密度，通过吸取Grex板中一半培养基用温热的2X细胞因子培养基喂养T细胞。在第7天，将细胞收获、计数并通过流式细胞术分析干性标志物的表达。
细胞内细胞因子测定：在第7天，洗涤T细胞，并将其置于对照培养基中，并在布雷菲德菌素A存在下用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和离子霉素再刺激5小时，以测量细胞内细胞因子IL-2、IFNγ和TNFα。在含有可固定活/死细胞的溶液的FACS缓冲液中用表面抗体染色法对T细胞染色。在固定和透化后，用相应的细胞内细胞因子抗体对细胞染色。使用流式细胞术评估细胞内细胞因子表达的定量。
通过流式细胞术进行的干性表型CAR表达测量：在第7天，通过流式细胞术评估来自各个治疗的活T细胞。首先将细胞用细胞染色缓冲液洗涤，并在37℃下用抗CCR7染色15分钟。此后，将抗几种其他抗原的抗体的2x主混合物(如下详述)添加至细胞中并在4℃下孵育20分钟。将细胞用细胞染色缓冲液洗涤并按照制造商的方案用foxp3染色试剂盒(ebioscience)透化。固定后，在4℃下将细胞针对TCF7染色二十分钟，随后在Aurora(cytek)上通过流式细胞术分析细胞。以下是用于评估干性标志物的抗体列表：CD8(BD-#563795)、CD4(BD-#612936)、CD27(BD-#612829)、CD3(Thermo-#612893)、CD28(Biolegend-#302936)、CD62L、CAR-EGFR(Thermo-#352911)、CD45RO(BD#564290)、CD39(Biolegend-#328236)、TCF7(Cell signaling-#14456)、CCR7(BD-#562381)、CD127(Bio legend-#351324)、CD45RA(BD-#560673)。
实施例2.结果
培养基组分的多种操纵途径可以导致对所生成的T细胞产物的深刻改变。总之，我们依序和并行地操纵了以下中的一种或多种：张力、无机盐、营养物(葡萄糖)和/或细胞因子含量。我们从操纵稀释剂张力开始以评估其在影响最终T细胞干性方面的作用，如通过多个表面标志物所评估的。为了总结最终T细胞群的干性，我们描绘了定量具有最高量的相对干性的所需T细胞亚群的相对群体的流式细胞术门控方案(图1A)。所描绘的流式细胞术方案是所得T细胞的预期干性、代谢功能和体内行为的公认替代品(图1B)。
我们通过为CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+和TCF7+的T细胞的相对数量来定量这些干预的效应，如通过细胞计数和多色流式细胞术评估的(图2A-2F)。与张力协调，我们同时改变了Na+、K+和Ca2+，因为这些全部都报道了在控制T细胞命运和功能中的作用(Trebak和Kinet,Nature reviews(2019)；Verkhratsky等人,Exp.Physio(2019))。与所述阳离子的改变协调地另外改变氯化物。我们发现，具有升高的钾浓度、降低的Na浓度和降低的Ca浓度的相对“低渗”的溶液导致干样细胞的数量最多(图2A-2F)。
特别地，与在对照培养基中培养的T细胞相比，在具有50mM、55mM或60mM钾的低渗培养基(<280mOsm/L)中的T细胞培养物具有干样细胞相对数量的至少1倍增加和至多2.5倍增加(通常更接近该范围的较高端值)。此外，与在对照培养基中培养的T细胞相比，在具有65mM、70mM、75mM、80mM、85mM或90mM钾的低渗培养基中的T细胞培养物具有干样细胞相对数量的至少2.5倍增加和至多15倍增加(通常至少4-5倍增加)。类似地，与在对照培养基中培养的T细胞相比，在具有50mM、55mM、60mM、65mM或70mM钾的等渗培养基(约270-300mOsm/L)中的T细胞培养物具有干样细胞相对数量的至少1倍增加和至多2.5倍增加(通常更接近该范围的较高端)。
增加的钾水平通常在一定程度上与可接受的或甚至提高的细胞产量相关。特别地，与在对照培养基中培养的T细胞相比，在具有50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM钾的低渗培养基或等渗培养基中培养的T细胞具有治疗上可接受的细胞产量。相反，超过70-75mM的K+浓度的增加对多名供体之间的细胞产量是可再现地有害的(图2D-2F)。
另外在这些滴定中操纵葡萄糖浓度。据报道，营养素限制促进T细胞的干性和寿命，其中糖酵解的抑制促进干性。相反，较高的葡萄糖浓度促进效应子功能和随同发生的干性丧失。与此一致，证明最理想的T细胞谱的培养基制剂具有较低的葡萄糖浓度。因此，我们得出结论，相对于对照培养基条件，具有最理想的细胞产物(由最高数量的干样T细胞组成)的重新配制的培养基是低渗的、中度高钾的、低钠的、低钙的和低糖的。
在低渗培养条件下的离子盐滴定中(图3A)，我们发现CD45RA+以及淋巴结归巢分子CCR7+、CD62L+和T细胞持久性相关标志物CD27的表达增加(图3B-图3V)。表1显示了具有钾(50-90mM)、氯化钠(50-90mM)、葡萄糖(15-20mM)、钙(1.2-2.0mM)、渗透压摩尔浓度(约250-280mOsm)和张力的每种培养基。表1还包括对照培养基，即在RPMI基础培养基中具有升高的钾(55.3mM)的高渗培养基，其含有约103mM NaCl(该实验的数据未显示)。与对照条件相比，具有升高的钾的低渗培养基导致CD45RA+、CCR7+表达增加约30％-50％，CD45RA+、CD62L+表达增加约30％-50％，并且CCR7+CD27+细胞增加约10％-20％(图3B-图3V)。CD39是在活化的T细胞上表达的外切ATP/ADP酶，并且参与T细胞效应子分化、耗竭和凋亡。CD39的表达增加是加速老化和同时发生的干细胞样表型丧失的量度。与对照条件相比，低渗条件培养基导致CD39+表达减少约20％-30％(图3W-图3CC)。这些结果表明升高的钾富集了较低分化的细胞，同时防止了T细胞的耗竭。结果还表明低渗调节增加了CAR+T细胞中的TCF7并降低了CD39表达(图3W-图3CC)。转录因子TCF7在维持T干细胞样表型和自我更新和产生更多效应T细胞的能力方面起主要作用。与对照条件相比，具有在60mM-80mM范围内的升高的钾的培养基导致TCF7+表达增加约20％-40％(图3DD-图3GG)。这些结果表明CAR-T或T-细胞产物的低渗调节与过继转移后存活和持续的能力相关。
在低渗调节下培养不影响体外扩增期间T细胞的产量或活力(图4A-4B)。T细胞产量和活力在多名供体中是一致的，表明低渗培养基可以有效地用于使用临床级试剂产生含有较低分化细胞的细胞产物。
由于升高的钾调节富集了较低分化的细胞，我们接下来寻求使用精确定义“干样”T细胞的严格表面标志物和转录因子来检查TSCM群(图1A)(参见例如，Gattinoni等人,Nature Medicine 2011)。我们的结果表明，低渗调节在CD4和CD8 CAR+T细胞两者中富集了CD45RO-CCR7+CD45RA+CD62L+CD27+CD28+TCF7+(图5A-图5R)。与对照条件相比，低渗条件培养基使转导效率提高了约2-3倍(图6)。使用这些严格标准，我们发现与对照条件相比，升高的钾使干样群体增加了3倍至8倍(图7)。
为了进一步表征细胞的分化状态，将用重组TCR转导的T细胞用对照培养基或代谢重编程培养基(MRM；NaCl(40-80mM)、KCl(40-90mM)、钙(0.5-2.8mM)、葡萄糖(10-24mM)和渗透压摩尔浓度(约250-340mOsmol)，参见下文实施例3)扩增，并且通过蛋白质印迹测量干性相关基因(BACH2、LEF1和TCF1)的蛋白质表达水平(图8A)。另外，还测量了STAT3和STAT5(包括其活化的磷酸化形式)的蛋白质表达水平(图8B)。这些数据表明，在MRM中培养的细胞表现出显著更高的干性相关转录因子的蛋白质表达，这意味着细胞保持了增加的干性特征的能力。另外，磷酸化STAT3和STAT5丰度的增加表明这些细胞也表现出更高水平的可提供增加的抗肿瘤效应子功能的促生长和促炎信号传导途径。
先前的报道表明，体外获得全部效应子功能会损害过继转移T细胞的功效，每个细胞的IFNγ产生是该效应子功能获得的可靠替代品(Gattinoni等人,JCI 2005)。相反，具有保留的IL-2产生能力的那些T细胞代表具有保留的干性能力的群体(Gattinoni等人,JCI(2005)；Wang等人,STM(2012))。因此，我们评估了使用低渗条件培养基生成的T细胞群的效应子功能命运。与对照条件相比，低渗条件培养基保留了淋巴归巢受体，其中IL-2表达增加了3倍并且IFNγ表达减少了3倍(图9A-图9J)。IFNγ和IL-2的相反作用对于在T细胞的体外扩增期间维持较低分化状态至关重要。在CD4和CD8亚群中都观察到这种现象而没有CCR7表达的损失(图9A-图9H)。
先前的报道表明，尽管IL-2对于大量的活化T细胞的产生具有很大的效用，但在体外暴露于IL-2分化和T细胞增殖后也观察到同时发生的快速分化和同时发生的干性损失(Waldmann等人,Nat Rev Immunol,2006)。相反地，先前的报道(Hinrichs等人,Blood,2008)已经表明，利用替代的常见γ链细胞因子可以产生相似的细胞产量，具有相当的T细胞干性保留。为此，我们测试了滴定量的这些细胞因子的不同组合是否可以在T细胞干性和总细胞产量方面给我们另外重新配制的培养基提供额外的益处。我们的结果表明，IL-7和IL-21的组合足以富集较低分化的产物(图10A-图10D)。与标准培养条件相比，这些细胞因子的组合在富集初始样细胞方面具有非常小的效应。然而，使用包括CD45RO-CCR7+CD45RA+CD62L+CD27+CD28+TCF7+的严格标志物，我们的结果表明，与标准培养条件相比，IL-7、IL-21与升高的钾和低渗培养条件在CAR工程化产物中导致相对更高数量(约20倍以上)的干样细胞(图11A-图11B)。
在重组TCR修饰的免疫细胞中还观察到在包含升高的钾的低渗培养基中培养CAR工程化的T细胞的效应。将T细胞用NY-ESO-1TCR转染，并且在如上所述的具有升高的钾的低渗培养基中培养。在具有升高的钾的低渗培养基中培养这种TCR修饰的免疫细胞导致与在具有升高的钾的类似低渗条件下培养的CAR-T细胞类似的细胞产量(约1.5亿个细胞)、活力(大于或等于90％)和干样表型(约50％的表达CCR7和CD45RA的CD3+细胞)(数据未显示)。
实施例3.制备培养基和培养TIL的方法
对照培养基：可商购获得的T细胞培养基(例如，CTSTMOPTIMIZERTM、IMMUNOCULTTM或TEXMACSTM)。
代谢重编程培养基(“MRM”)：使用无NaCl的T细胞培养基调节T细胞培养基的无机盐离子浓度。MRM的最终浓度如下：NaCl(40-80mM)、KCl(40-90mM)、钙(0.5-2.8mM)、葡萄糖(10-24mM)和渗透压摩尔浓度(约250-340mOsmol)。
用于初始培养以及第二和最终TIL扩增的TIL培养基制备：对照培养基或MRM补充有2.5％血清补充物(CTSTMImmune Cell SR，Thermo Fisher)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、2mML-glutamax(Gibco)、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、Pen-strep(Gibco)、20μg/ml FUNGINTM(InvivoGen)、丙酮酸钠(Gibco)和1mM O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐(Sigma)。
初始TIL培养：图12是概括描绘本文所述培养TIL的方法的某些方面的示意图。将从各种肿瘤类型(结肠、肺、肝细胞癌、肾、胰腺、乳腺、黑素瘤和前列腺)手术切除的平均大小为1-10mm3的多种肿瘤接种在24孔板中的2ml对照培养基或如上所述的MRM中，两者都补充有IL-2(300ng/mL)和IL-21(30ng/ml)。将肿瘤碎片在37℃的热夹套培养箱中用5％ CO2培养，直至可见集落形成。根据细胞的生长，每3天重新装满补充有IL-2(300ng/mL)和IL-21(30ng/ml)的新鲜培养基(对照或MRM)。该方法在初始培养结束时产生约2x106-10x106个细胞/碎片的产量。将用于分析的细胞亚群通过40μm过滤器，并使用包括CD62L、CD27、CD28、CD45RO、CD39、TIM3、CD127、PD1、CD103、CD45RA和TCF7的各种生物标志物用多色流式细胞术进行表型分析。
第二TIL扩增：当来自初始培养的细胞产量达到约2x106-10x106个细胞/培养碎片时(通常在约第14天至第19天)，通过添加1:100T细胞TRANSACTTM(Miltenyi Biotec)、5μg/ml重组人CD27配体(R&Dsystems)和1μg/ml重组人4-1BB配体/TNFSF9(R&D systems)来刺激在对照培养基或MRM(两者均补充有IL-2(73.6ng/ml)、IL-21(10ng/ml)和IL-15(0.4ng/ml))中培养的TIL。将细胞维持在培养物中直至获得约5x107至20x107个细胞(刺激后约7至11天)。在第二扩增期结束时，使用包括CD62L、CD27、CD28、CD45RO、CD39、TIM3、CD127、PD1、CD103、CD45RA和TCF7的各种生物标志物用多色流式细胞术分析TIL。仅分析活细胞和CD3+细胞。
最终TIL扩增：当培养达到约5x107至20x107个细胞的产量时，将在对照培养基或MRM中培养的TIL转移到补充有IL-2(73.6ng/ml)、IL-21(10ng/ml)和IL-15(0.4ng/ml)的新鲜对照培养基中。用1:100TRANSACTTM(Miltenyi Biotec)、5μg/ml重组人CD27配体(R&Dsystems)和1μg/ml重组人4-1BB配体/TNFSF9(R&D systems)第二刺激TIL。在静态GREX或搅拌罐中培养细胞，直至获得约10x109-100x109个细胞/碎片的产量(约14天)，并用多色流式细胞术分析各种生物标志物，包括CD62L、CD27、CD28、CD45RO、CD39、TIM3、CD127、PD1、CD103、CD45RA和TCF7。为了检查细胞的多功能性，用PMA/离子霉素(1:500)刺激所得TIL 4小时，并使用以下标志物进行细胞内染色：CD4、CD8、CD27、IL2、IFNγ、TNFα和TCF7。仅分析活细胞和CD3+细胞。
实施例4.MRM导致CD8+、肿瘤反应性、较低分化的TIL的扩增
使TIL如实施例3中所述生长(图12)。在初始TIL培养(即14天)后，进行多参数流式细胞术以定量细胞培养物中存在的CD4+和CD8+TIL的百分比。与在对照培养基中培养的细胞相比，在MRM中培养的细胞显著富集了约20％-80％的CD8+TIL(图13A-图13C并且数据未显示)。尽管CD4+TIL能够根除实体瘤，但对肿瘤的优异细胞溶解活性主要由CD8+TIL介导。肿瘤细胞主要表达由CD8+TIL识别的MHC I类相关肿瘤抗原。因此，在TIL疗法输注产品中具有更大比例的CD8+TIL是治疗有益的。与在对照培养基中培养的TIL相比，使用MRM培养TIL出乎意料地富集了CD8+TIL(图13C)。
在MRM中初始培养结束(约第14天)时获得的TIL也证明了肿瘤反应性TIL的几种细胞表面标志物(例如CD39、CD103、CD226和/或PD1)的一致表达。与在对照培养基中培养的TIL相比，在MRM中的初始培养产生了CD39和PD1表达增强(大于20％)的TIL(图13A-图13B)。先前使用的方法显示，在初始TIL培养期间PD1亚群中的PD1表达完全丧失，表明肿瘤反应性TIL的不合需要的丧失(参见例如Poschke等人,Oncoimmunology 5(12):e1240859(2016)；以及Gros等人,JCI 124(5):2246-59(2014))。我们观察到T细胞刺激后PD1表达的维持依赖于供体(数据未显示)。对于包括CD39和CD103的其他肿瘤反应性标志物的表达获得了类似的结果(参见图13A-图13B和图13A-图13B，数据未显示)。然而，在第14天观察到的克隆库在整个TIL过程中维持(数据未显示)。
我们还观察到在MRM中培养的CD4+和CD8+TIL两者中PD1(指示肿瘤反应性代谢状态)和CD27的共表达(图14A-图14E)。CD27表达，其在初始和记忆定向T细胞上组成型表达，指示T细胞中的干样表型。先前的报道表明，在T细胞刺激后的细胞扩增期间，CD8+T细胞中的CD27表达降低(参见例如，Tran等人,J.Immunotherapy31(8):742-51(2008)；以及Rosenberg等人,Clinical Cancer Research17(13):4550-557(2011)，Huang等人,J.Immunology 176(12):7726-35(2006))。相反，本文所公开的在MRM中培养的TIL在整个培养过程中保留了CD27表达，从而允许选择性扩增干样肿瘤反应性克隆。如所预期的，不是所有CD27+细胞在第14天共表达PD1，表明不是所有干样细胞显示肿瘤反应性代谢状态。
TIL的抗肿瘤功能和存活依赖于TCR、细胞因子和共刺激受体接收的整合信号。任何这些信号的不充分暴露将导致TIL的无反应和萎缩。先前使用的培养和扩增TIL的方法导致TIL中CD27表达的丧失。然而，在输注产品中(例如在最小程度扩增的TIL中)维持CD27表达的TIL已显示与过继T细胞疗法后的肿瘤消退相关(参见例如，Tran等人,J.Immunotherapy 31(8):742-51(2008)；以及Rosenberg等人,Clinical Cancer Research17(13):4550-557(2011))。此外，共刺激受体例如CD27和CD28的表达升高与体内治疗功效相关(Tran等人,J.Immunotherapy 31(8):742-51(2008)，Geltink等人,Cell 171,385–397(2017))。这些共刺激受体的表达也与干性和较长的端粒长度(与年轻TIL培养物有关)相关。与先前使用的方法(例如对照培养基)相反，使用本文所述的MRM富集了具有CD27和CD28表达的TIL，达到跨几种肿瘤类型的TIL总数的约20％至约80％(图15并且数据未显示)。CD27和CD28的富集不是CD8+T细胞亚群所独有的，在CD4+亚群中也观察到了(数据未显示)。
CD27和CD62L的表达与较低分化的T细胞相关，并且与T细胞向肿瘤组织和淋巴结的有效运输相关。CD27、CD28和CD62L的表达也与较长的端粒长度有关，所述较长的端粒长度间接地与TIL的年龄和体内治疗功效有关(参见例如，Tran等人,J.Immunotherapy31(8):742-51(2008)；和Rosenberg等人,Clinical Cancer Research17(13):4550-557(2011))。然而，如本文所公开的，与最低限度培养的TIL类似，在MRM中培养的TIL在整个过程中维持CD27和CD62L表达。与在对照培养基中培养的那些相比，我们观察到在MRM中培养的TIL中CD27和CD62L表达增加约50％(数据未显示)。
介导免疫检查点阻断后肿瘤消退的肿瘤反应性克隆被认为源自表达PD1和转录因子TCF-7的CD8+T细胞(Im等人,Nature537:417-21(2016)；和Feldman等人,Cell 175(4):998-1013(2018))。在本文所公开的MRM中培养的TIL显示肿瘤反应性TIL生物标志物(PD1和CD103)的富集，同时TCF7表达水平高4倍至50倍(图16A-图16C、图17D、图17H和图21)。TCF7的表达指示更多的干样细胞。尽管表达PD1，这些细胞仍保持增殖能力并在进一步刺激后维持较低分化的细胞(图17A-图17H)。
实施例5：MRM保留TIL的肿瘤反应性
肿瘤在本质上是异质性的，并且通常含有基因诸如KRAS、P53和BRAF(公共新抗原)的常见突变。如本文所公开的使用MRM的方法富集了识别此类新抗原的TIL。
从患有胰腺腺癌的患者获得肿瘤切除物，该癌症主要具有带有KRASG12V、KRASG12C和KRASG12D突变的肿瘤细胞。将上述KRAS热点突变的HPLC纯化的9聚体、10聚体和25聚体肽纯化并用于脉冲由患者匹配的外周血单核细胞生成的未成熟树突细胞(DC)。将这些肽库脉冲的DC与获自同一胰腺腺癌患者的TIL共培养，并根据上述实施例中描述的方法进行培养。在MRM中培养TIL导致CD8+T细胞增加约30％，其中CD27、CD28、PD1和TCF-7显著共表达(图18A-图18H)。这些结果表明本文所公开的MRM保留了识别公共抗原的肿瘤反应性TCR克隆。
如所预期的，用野生型KRAS肽脉冲的TIL不导致KRAS特异性TIL的特异性扩增。然而，我们一致地观察到在MRM中培养的TIL的CD27、CD28、PD1和TCF7的表达增加。这些结果表明，在MRM中培养细胞保留了识别罕见的公共新抗原的TIL的生长和增殖(图19A-图19H)。
CD8+TIL和与肿瘤反应性相关的标志物(CD39和PD1)的优先富集在该扩增过程中得以维持(图20A-图20B)。这些结果表明，MRM甚至在初始培养后进一步增强肿瘤反应性TIL中的PD1表达。此外，如通过qPCR测量的，根据本文所公开的方法在MRM中培养的TIL表现出TCF7表达的大于50倍的增加(图21)。这些数据与TCF7(其是在再刺激后TIL的自我更新和增殖爆发所需的主要转录调节因子)的作用一致。
据报道，TIL中CD103的表达与具有高突变抗原负荷的肿瘤中的TIL浸润相关。除了CD39和PD1表达外，我们的数据证明在MRM中TIL的扩增增加了PD1+CD39+CD103+细胞的数量(图22A-图22L)，同时也增加了干性相关基因的表达。因此，在MRM中培养TIL可能足以增加所得扩增细胞产物中具有肿瘤反应性和较高比例干样细胞两者的细胞数量。
本文提供的数据证明，MRM中TIL的扩增生成的细胞群不仅具有干性的增加，而且具有与肿瘤反应性相关的几种细胞表面标志物的表达增加。本文所述的使用MRM的方法产生具有改进的治疗产物的特征和特性的TIL。
实施例6.治疗方法
用于输注的TIL将源自患者自身的肿瘤，从原发性、转移性或淋巴结切除。如以上实施例1所述，通过将小肿瘤碎片(约1-10mm3)铺板在含有MRM的24孔板中开始TIL培养。这些碎片将生长直至获得约2x106至约10x106个细胞/肿瘤碎片(通常约2-3周)。将来自所有碎片的所得细胞合并，并以2x106/孔的密度铺板用于T细胞刺激，例如通过添加TRANSACTTM和任选的CD27激动剂、41BB激动剂和/或OX-40。将细胞维持在培养物中直至获得约5x107至约20x107个TIL。将例如使用TRANSACTTM和任选的CD27激动剂、41BB激动剂和/或OX-40进一步刺激这些细胞，以实现输注产品的细胞数量的1000-2000倍增加(约1-150x109个TIL)。
在施用TIL输注产品之前，将对患者施用例如包括环磷酰胺和氟达拉滨的淋巴耗竭治疗。除了TIL输注外，患者还将在输注如本文所公开培养的TIL后接受抗PD1检查点抑制剂(例如派姆单抗或纳武单抗)。
实施例7.在MRM中培养的CAR T细胞的表征
在如上所述的对照培养基或代谢重编程培养基(MRM)中培养CD4+和CD8+供体匹配的T细胞，两者都补充有200IU/ml IL-2、1200IU/ml IL-7和200IU/ml IL-15(R&D systems)并用TRANSACTTM(Miltenyi Biotec)活化。活化后24或48小时，用编码ROR1嵌合抗原受体(CAR)的慢病毒转导细胞。将T细胞以2.5e6个活T细胞/ml重悬于补充有200IU/ml IL-2、1200IU/ml IL-7和200IU/ml IL-15的对照培养基或MRM中。过夜孵育后，将细胞转移到板(Wilson Wolf)中，活化后扩增7天，然后冷冻保存，随后用于下述测定。
MRM显著提高了在生产过程中较低分化T细胞的保留。这种干样T细胞还具有较高的靶刺激后增殖的能力和肿瘤细胞杀伤能力(数据未显示)。
在扩增后第7天，用PMA和离子霉素混合物、接着用高尔基体抑制剂(Biolegend，按照制造商的说明书)刺激每组1X 106个CAR T细胞。通过以下方式评估细胞因子产生：细胞内染色和通过活/CD3+/CAR+测量的流式细胞术，然后比较IL-2+、IFNγ+、IL-2+/IFNγ+双阳性和双阴性亚群。
与在对照培养基中扩增的CAR T细胞相比，在MRM中扩增的CAR T细胞显示IL-2+和IL-2+/IFNγ+双阳性T细胞的富集(图23；三个独特供体的平均值)。该细胞因子谱与表面标志物分析一致，其中在MRM中培养细胞产生具有更多较低分化的T细胞的CAR T细胞群。与单独的IFNγ产生或无细胞因子产生相比，T细胞中的IL-2产生指示较低分化的T细胞。此外，增加的IL-2产生将支持CAR T细胞的持久性以及因此更好的治疗。
为了评估T细胞的细胞毒性，将如上所述产生的ROR1 CAR T细胞与Nuclight Red标记的(NLR)H1975-ROR1+靶肿瘤细胞一起以1:5(E:T)比率接种在24孔板中，每个CAR T条件有3x技术重复。与单独的肿瘤细胞相比，通过平均NLR强度随时间的Incucyte荧光测量确定肿瘤细胞杀伤。培养3天后，从靶细胞孔中取出三分之一的T细胞，接种在新鲜靶细胞上，并替换到Incucyte中。以3天或4天的间隔将其重复至多3-4次。
与在对照培养基中培养的CAR T细胞相比，在MRM中培养的CAR T细胞显示增强的细胞毒性(图24；y轴表示靶细胞密度)。在对照培养基中培养的CAR T细胞随时间推移失去控制靶肿瘤细胞生长的能力。这种增加的细胞毒性表明在MRM中培养的CAR T细胞具有更大和更持久的抗肿瘤作用。
评估了来自上述连续杀伤测定的CART细胞的细胞因子分泌。简言之，在每次刺激后(例如，在第3天、第7天和第10天)，在与靶肿瘤细胞一起共培养24小时后收集培养基上清液。使用V-PLEX促炎症组1人试剂盒(MSD)测量细胞因子分泌。
与在对照培养基中培养的CAR T细胞相比，在MRM中培养的ROR1 CAR T细胞在与H1975靶肿瘤细胞共培养中产生显著更多的IL-2(图25A)和IFNγ(图25B)。类似于图23中所示的用PMA/离子霉素刺激的T细胞获得的数据，在MRM中培养的CAR T细胞当与靶肿瘤细胞共培养时显示增加的IL-2(约4x)和IFNγ(约4x)分泌，如经由ELISA评估的。在重复刺激后，IL-2分泌在所有样品中丧失；然而，在MRM中培养的CAR T细胞在整个三次靶细胞刺激中显示显著更高的IFNγ。在MRM中培养的CAR T细胞的细胞因子分泌的增加的幅度和持续时间表明具有延迟的CAR T细胞的终末分化的更强抗肿瘤应答。
MRM产生的CAR T细胞在与H1975靶肿瘤细胞共培养时在连续杀伤测定中也显示增强的增殖(图26)。更大的增殖表明MRM产生的细胞更具干样，具有高增殖能力。增加的扩增也支持通过在MRM中培养产生的CAR T细胞具有优异的抗肿瘤应答。
实施例8.在MRM中培养的细胞在转录上是不同的
使用对照培养基或MRM，使用本文所述的方法，使用健康供体(H)和两个患病供体(D1、D2)的T细胞生成重组TCR转导的T细胞。将来自产物的TCR+细胞分选并进行大量RNA-seq(如Galletti等人Nat.Immunology 21,1552-1562(2020)所述进行)、大量ATAC-seq(如Lynn等人Nature 2019所述进行)以及使用10X基因组学平台的转录体和表位(CITE)-seq的单细胞细胞索引(Stoeckius等人Nat.Method 14,865-868(2017))。使用具有标准参数的10X cellranger软件(10XGenomics)处理CITE-seq数据。使用标准分析流水线(如Lynn等人Nature 2019所述)处理大量RNA-seq和ATAC-seq数据。
使用均匀流形近似和投影(UMAP)(Becht,E.等人Nat.Biotech.2018)将来自所得细胞的跨越数百个基因的单细胞基因表达映射至二维，其中每个点代表细胞(图27)。UMAP说明在对照培养基(UMAP_1通常大于0)或MRM(UMAP_1通常小于0)中培养生成的细胞在二维空间中分别聚类，表明它们在其整体转录组上显著不同。使用MRM生成的细胞表现为明显且主要均一的细胞群，其明显不同于由在对照培养基中培养的细胞生成的结果，然而，应当注意，存在如沿横坐标投影为‘0’的有限程度的重叠。
然后使用Seurat(Satija等人Nat.Biotech 2015)中的FindClusters功能对细胞进行聚类分析。使用Seurat的AddModuleScore功能，根据Gattinoni等人2009的初始相关基因组对每个细胞进行评分。为了评估生成具有较低分化表型的细胞的能力，计算每个供体和方法(对照培养基或MRM)中具有高初始相关评分的聚类中的细胞百分比(图28)。在所有三个供体中，与使用对照培养基生成的细胞相比，使用MRM生成的细胞显示显著较高比例的较低分化细胞。
为了进一步理解通过在对照培养基与MRM中培养生成的细胞的转录和表观遗传差异，进行了来自大量ATAC-seq的差异峰分析和来自大量RNA-seq的差异基因分析(如Lynn等人Nature 2019所述)。与初始样表型相关的几种转录因子诸如TCF7、LEF1、KLF2、BACH2，不仅在它们各自的启动子区具有显著的差异峰，而且在通过在MRM中培养产生的细胞中具有显著更高的差异表达(图29)。
图30显示了TCF7启动子区中的显著差异峰。就染色质可及性和使用MRM产生的细胞中的基因表达两者而言，与更多效应/活化表型诸如STAT1和IRF8相关的转录因子也是显著的(图29)。EGR2，一种与T细胞无反应性相关的转录因子(Mi Oh等人Nat Comm.2015)在使用MRM产生的细胞中也显著下调，表明这些细胞更有功能。因此，在整体水平上，与在对照培养基中培养的细胞相比，使用MRM产生的细胞富集了代表初始样表型和效应/活化表型两者的转录因子。
单细胞轨迹构建和拟时计算用于进一步表征在MRM中培养的T细胞。与在对照培养基中培养的T细胞不同，在MRM中培养的T细胞即使在用肿瘤细胞长期和反复攻击后，也能够使干样细胞群再增殖，并分化产生效应细胞。使用在Seurat(Hao等人,bioRXiv 2020)中实施的Monocle 3(Trapnell等人,Nature Biotechnology 2014；Qiu等人,Nature Methods2017；Cao等人,Nature 2019)对T细胞进行单细胞轨迹构建和拟时计算。拟时细胞轨迹揭示即使在使用MRM中扩增的T细胞用肿瘤细胞重复刺激后，仍存在大量分化较低的CD8+ T细胞，而在对照培养基中扩增的T细胞的生长主要是更分化的。最分化细胞的特征也不同，MRM培养的T细胞生成GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT和NKG7较高而IL-32较低的细胞。NKG7最高的细胞已显示是更好的杀伤细胞(Malarkannan等人,Nat.Immuno.2020)，而IL-32更高的细胞已显示具有活化诱导的细胞死亡(Goda等人,Int.Immunol2006)，说明在MRM中扩增的T细胞生成类似于能够参与效应子功能的高度细胞毒性细胞的效应细胞。
实施例9：CAR转导效率的分析
为了评估代谢重编程培养基对CAR转导效率的影响，在代谢重编程培养基(MRM)或T细胞条件培养基(即TCM)中用抗ROR1 CAR构建体转导人CD4+和CD8+ T细胞。以下提供了用于实施本实施例的示例性方法。
培养基制备
如上所述制备培养基(参见实施例1)。
慢病毒载体(LVV)构建和慢病毒产生
生成包含以下组分的抗ROR1 CAR构建体：(i)抗ROR1 CAR(源自R12抗体)(本文称为“R12 CAR”)，(ii)截短的EGFR(“EGFRt”)，和(iii)野生型c-Jun蛋白(本文称为“c-Jun-R12 CAR”)。设计c-Jun-R12CAR构建体，使得当在细胞(例如T细胞)中转导时，转导的细胞将表现出增加的c-Jun蛋白表达以及抗ROR1 CAR和EGFRt的表面表达。作为对照，还生成了包含截短的CD19(“CD19t”)而不是c-Jun的对应抗ROR1 CAR构建体(本文称为“对照CD19t-R12CAR”)。参见Terakura,S.等人,Blood 119(1):72-82(2012)，其以全文引用方式并入本文。
用VSV-G包膜假型化并通过瞬时转染HEK293T细胞产生慢病毒载体。在填充1mL的LVV等分试样并在-80℃下储存之前，将最终体积在2-8℃下保持不超过24小时。在T细胞转导之前将LVV等分试样在冰上解冻。
T细胞分离
从三名健康供体分离CD4+和CD8+ T细胞并使用供应商BloodWorks(Seattle,WA,USA)和AllCells(Alameda,CA,USA)冷冻。供应商从捐赠者处获得并保存了所有适当的知情同意书。为了分离CD4+和CD8+ T细胞，经由单采术收集样品，从其中分别分离CD4+和CD8+细胞，顺序是首先阳性选择CD8+ T细胞，随后从CD8选择物中阳性选择流通的CD4+ T细胞。将分离的CD4+或CD8+ T细胞以每小瓶20E+06个细胞(AllCells)或50E+06个细胞(BloodWorks)冷冻。
细胞培养和转导
将健康供体冷冻保存的人CD4+和CD8+ T细胞(即来自供应商)在合适的培养基(即TCM或MRM)中解冻，并以1:1的比率混合。将合并的供体CD4+和CD8+ T细胞在300x g下离心5分钟，并重悬于补充有IL-2、IL-7和IL-15的合适培养基(即T细胞条件培养基或MRM)中。然后使用CD3/CD28 TRANSACTTM(Miltenyi Biotec Inc.)活化T细胞。在TCM或MRM中活化24小时(即第1天)后，用包含抗ROR1CAR构建体(即“c-Jun-R12 CAR”和“对照CD19t-R12 CAR”)的上述LVV转导T细胞。未转导的T细胞用作对照。转导后第二天(即第2天)，添加新鲜培养基(即TCM或MRM)以稀释TRANSACTTM并终止T细胞活化。使转导的T细胞进一步扩增另外五天(即第7天)，然后随后分析或在液氮中冷冻保存以长期保存。
转导效率分析
为了比较来自不同组的CAR转导效率(参见表3)，使用流式细胞术确定表达以下的CD4+和CD8+ T细胞的百分比：(i)c-Jun、抗ROR1R12 scFv和EGFRt或(ii)c-Jun、抗ROR1 R12scFv和截短的CD19。
表3.实验组
如图31A-图31C所示，在TCM组和MRM组两者以及每个供体中，对照CD19t-R12 CAR和c-Jun-R12 CAR之间的转导效率是可比较的。类似地，在TCM组和MRM组之间，转导的T细胞(即表达EGFRt和R12 CAR两者)的百分比是可比较的。在每个供体中从不同组转导的CD4+和CD8+ T细胞的百分比中也没有观察到显著差异(参见图32A-图32C)。有趣的是，与来自TCM组的对应转导的T细胞相比，来自MRM组的用c-Jun-R12 CAR转导的T细胞表达显著更高水平的c-Jun蛋白表达(参见图33A-图33C)。增加的表达对于c-Jun蛋白是特异性的，并且对于其他转基因(即R12 CAR和EGFRt)不是全局性的。
这些结果表明，本文所述的抗ROR1 CAR构建体能够在两种培养条件下以相似的程度被转导至T细胞中。结果进一步表明代谢重编程培养基条件用于选择性增加本文提供的抗ROR1 CAR构建体的c-Jun蛋白的表达。
实施例10：干样表型表达的分析
为了评估代谢重编程培养基是否对转导的T细胞的干样特性有任何影响，如实施例1中所述用抗ROR1 CAR构建体(即c-Jun-R12CAR或对照CD19t-R12 CAR)转导人CD4+和CD8+ T细胞。然后，在使细胞扩增另外四至五天(即第6或7天)后，使用流式细胞术评估转导的T细胞的干性。
简而言之，首先将T细胞用细胞染色缓冲液洗涤，并在37℃下用抗CCR7染色15分钟。接下来，再次洗涤T细胞，然后向细胞中添加针对几种其他抗原的抗体的主混合物(如下详述)，并在黑暗中于室温孵育25分钟。然后将细胞用细胞染色缓冲液洗涤并按照制造商的方案用FOXP3染色试剂盒(ebioscience)透化。固定后，将细胞用预稀释的正常小鼠血清(Jackson ImmunoResearch-#015-000-120)和正常兔血清(Jackson ImmunoResearch-#011-000-120)在黑暗中于室温封闭15分钟。然后将细胞用TCF7和c-Jun的2x抗体混合物在黑暗中于室温染色30分钟。彻底洗涤细胞后，在Cytek Aurora光谱流式细胞仪上通过流式细胞术对其进行分析，并使用FlowJo软件(TreeStar,Ashland,OR)进行分析。
以下是用于评估干性标志物的抗体列表：CD8(Thermo-#58-0088-42)、CD4(BD-#612936)、CD27(BD-#612829)、CD3(Thermo-#612896)、CD28(Biolegend-#302936)、CD62L(BD-#740301)、R12Anti-Id(Genscript-#48F6H5E1)、EGFR(ΒioLegend-#98812)、CD 45RO(BioLegend-#566143)、CD39(BioLegend-#328236)、TCF7(Cell Signaling-#9066S)、c-Jun(Cell Signaling-#15683S)、CCR7(BD-#562381)、CD45RA(BD-#560673)、LAG-3(Thermo-#67-2239-42)、TIM-3(Thermo-#78-3109-42)、TIGIT(Thermo-#46-9500-42)、PD-1(Thermo-#25-2799-42)。具体地，如本文所述，“干样”细胞被定义为：CD45RO-CCR7+CD45RA+CD62L+CD27+CD28+TCF7+。
如图34A-图34C所示，与来自TCM组的细胞相比，用MRM中的抗ROR1 CAR构建体转导的CD4+ T细胞就其表型表达而言更具干样。无论CD4+ T细胞是用c-Jun-R12 CAR转导还是用对照CD19t-R12CAR转导，这通常都是正确的(参见图34A-图34C中的最后两个条)。类似地，与在TCM中转导的对应细胞相比，在MRM中转导的CD8+T细胞通常更具干样(至少对于源自供体#1和#2的CD8+ T细胞；参见图34D和图34E)。但是，与CD4+ T细胞不同，当用c-Jun-R12 CAR转导CD8+ T细胞时，与对照CD19t-R12 CAR相比，观察到干样细胞的一致增加。因此，在CD8+ T细胞中，当在MRM中用c-Jun-R12CAR转导CD8+ T细胞时，观察到最大百分比的干样细胞。
这些结果突出了本文所述的代谢重编程培养基在产生较低分化(即更具干样)的转导的CD4+和CD8+ T细胞中的有用性。并且，至少对于CD8+ T细胞，结果进一步表明过表达转录因子诸如c-Jun，可进一步改善转导的T细胞的干样特性。
实施例11：表型和功能分析
为了进一步评估MRM对抗ROR1 CAR T细胞的作用，如实施例1所述用抗ROR1 CAR构建体转导人CD4+和CD8+ T细胞并进行扩增。在第6天或第7天，对转导的CD4+和CD8+ T细胞进行表型分析(例如，不同表面标志物诸如CD39、LAG3、PD1、TIGIT和TIM3的表达)和功能分析(例如，IL-2和/或IFN-γ的产生以及在初次和/或慢性抗原刺激后的体外杀伤)。
表型表达
使用Cytek Aurora光谱流式细胞仪评估转导的CD4+和CD8+ T细胞上表面标志物的表达，并使用FlowJo软件(TreeStar,Ashland,OR)进行分析。
细胞毒性和细胞因子分泌
使用体外杀伤测定测量转导的T细胞的细胞溶解活性。简而言之，转导的T细胞(“效应物”)与靶肿瘤细胞(“靶)以1:4、1:16、1:64和1:128的效应物∶靶比率共培养，并使用IncuCyte每6小时以4x放大倍数扫描(通过追踪代表靶肿瘤细胞的红色细胞核的数量来测量细胞溶解活性)。共培养24小时后，从不同条件收集上清液并在-80℃冷冻用于随后的细胞因子分析。然后将含有细胞的培养板返回到IncuCyte以继续周期性扫描。
对于细胞因子分泌分析，将先前冷冻的上清液解冻，并且使用MesoScaleDiscovery(MSD)多重平台评估某些细胞因子(例如IL-2和IFN-g)的水平，并且根据制造商的方案在MSD Meso Sector S 600机器上测量。
连续再刺激测定
在该测定中，每三天或四天用A549 NLR靶细胞连续再刺激转导的CD4+和CD8+ T细胞。将T细胞以1:1的E:T比率铺板，总共进行2至4轮刺激。在整个研究中维持3x105个转导T细胞/mL的密度。为了建立每轮刺激，将T细胞用以下标志物染色并使用流式细胞术分析以计算共培养物中存在的转导T细胞群的比例：CD45、CD3、CD4、CD8、CAR和EGFRt。如上所述，将每种样品的等分试样保留用于滴定的Incucyte杀伤测定。
结果
如图35A-图35E、图36A-图36E和图37A-图37E所示，与TCM中转导的对应细胞相比，在MRM中用抗ROR1 CAR构建体转导的CD4+ T细胞之间在各种表面标志物表达水平上观察到显著差异。对于CD8+ T细胞观察到类似的结果(参见图35F-图35J、图36F-图36J和图37F-图37J)，进一步证实了在转导期间存在的钾浓度可能对转导的T细胞有影响。
此外，除了表型差异外，还在转导的T细胞中观察到明显的功能差异。如图38A-图38C所示，在初次抗原刺激后，与在TCM中转导和培养的对应细胞相比，在MRM中转导和培养的T细胞产生更高量的IL-2。并且，如早先在实施例1中观察到的，转导的T细胞中增加的c-Jun蛋白表达也导致更多的IL-2分泌。例如，在TCM和MRM组中，与用对照CD19t-R12 CAR转导的对应细胞相比，用c-Jun-R12CAR转导的T细胞在初次刺激后产生更高水平的IL-2。因此，通常在被修饰以过表达c-Jun并在MRM中培养的T细胞中观察到最大的IL-2产生。
在连续/慢性抗原刺激后观察到类似的结果。如图39A-图39C所示，在终末轮抗原刺激后，与在TCM中转导和培养的对应细胞相比，在MRM中转导和培养的T细胞保持了它们产生IFN-γ的能力。同样，与来自其他组的转导细胞相比，来自MRM组的用c-Jun-R12 CAR转导的T细胞维持产生IFN-γ的能力更长时间。至于多重抗原刺激后转导细胞的细胞毒性，与来自TCM组的对应细胞相比，在MRM中转导和培养的T细胞维持其杀伤肿瘤细胞的能力更长时间(图40A-图40E)。
总之，上述结果证实了在MRM中培养的经修饰以过表达c-Jun(例如，具有ROR1 CAR和c-Jun过表达)的CAR T细胞允许生成甚至在慢性抗原刺激后仍保持功能的干样转导的T细胞。
实施例12.离体肿瘤细胞的TIL清除
将按照标准TIL扩增方法产生的非小细胞肺癌(NSCLC)TIL与根据本文所公开的方法在MRM中产生的TIL进行比较。虽然对照方法生成高度富含CD8+ T细胞的TIL，但这些细胞不富含干样CD8+CD39-CD69-T细胞群，并表达低水平的中央记忆标志物和共刺激受体CD27(图41A-图41D)。对照扩增方法生成具有富集的干样CD8+CD39-CD69-T细胞和较高表达的共刺激受体CD27的T细胞产物，但导致CD8+ T细胞的扩增减少。在MRM中培养的TIL产生CD8+T细胞的高度富集群体，其具有增强的CD8+CD39-CD69-干样T细胞、中央记忆标志物(CD45RO+CD62L+)的丰度，以及显著更高的共刺激受体CD27表达(图41E-图41H)。总的来说，这些标志物证明了与临床反应相关的干样细胞的属性。
具有增强的干样特性(包括关键共刺激受体CD27的保留、延长的端粒、记忆细胞表型和富含CD39-/CD69-CD8+T细胞的细胞群的存在)的TIL产物与改善的临床反应相关。T细胞的其他分化状态相关特征，包括分泌多功能细胞因子的能力和共刺激受体CD28的表达，也与抗肿瘤效力相关。在MRM中扩增的TIL表现出有利的表型属性，包括在黑素瘤、NSCLC和结肠直肠癌中与对照TIL扩增方法相比CD8+CD39-CD69-T细胞的丰度增加(图42A-图42C)。
实施例13.MRM中的TIL培养
本文呈现的数据显示，相对于在具有较低水平钾(例如小于约40mM钾离子，例如5mM钾离子)的培养基中培养的TIL，在包含增加的钾的培养基中培养TIL生成了具有增加的CD8+TIL扩增和增加的干性的TIL群体。此外，数据表明培养基中极高水平的钾(例如，大于约80mM、大于约90mM或大于约100mM钾离子)可导致TIL产量降低，这可能是由于TIL生长和扩增降低，数据未显示。为了进一步表征MRM对TIL培养的作用，(1)将在初始扩增阶段期间在对照培养基(包含55mM钾离子的等渗RPMI制剂)中培养、接着在最终扩增阶段期间在包含50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)钾离子和在50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)NaCl的MRM培养基中培养TIL；(2)将在初始扩增阶段期间在包含50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)钾离子和在50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)NaCl的MRM培养基中培养、接着在最终扩增阶段期间在对照培养基中培养TIL；以及(3)将在初始扩增阶段期间在包含50-70mM之间(例如，50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)钾离子和在50-70mM之间(例如，50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)NaCl的MRM培养基中培养、接着在最终扩增阶段期间在包含50-70mM之间(例如，50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)钾离子和在50-70mM之间(例如，50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)NaCl的MRM培养基中培养TIL。在所有实验中，初始培养条件将还包含6000IU/mL IL-2，并且最终培养条件将还包含3000IU/mL IL-2。将表征根据该方法培养的TIL的干性和效应子标志物的表达、细胞毒性和产量。
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应当理解，具体实施方式部分，而不是发明内容和摘要部分，意图用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可阐述发明人预期的本公开的一个或多个但不是所有示例性实施方案，并且因此不意图以任何方式限制本公开和所附权利要求。
本公开已经在上文中借助于说明特定功能的实施及其关系的功能性结构单元进行了描述。为便于描述，本文中已经任意地界定这些功能性结构单元的边界。也可限定替代边界，只要指定功能及其相互关系被适当地执行。
具体实施方案的上述描述将充分揭示本公开的一般性质，使得其他人可通过应用本领域技术内的知识，在不偏离本公开的一般概念的情况下，在不进行过度实验的情况下，容易地修改和/或改编此类具体实施方案的各种应用。因此，基于本文所呈现的教导内容以及指导内容，此类改编以及修改意图在所公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应了解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，以使得本说明书的术语或措辞应由熟练的技术人员根据教义和指导进行解释。
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贯穿本申请所引用的全部引用参考文献(包括著作参考文献、美国或外国专利或专利申请和网站)的内容据此以引用的方式明确地并入，如同出于任何目的将其全文写入本文中一样，在其中引用的参考文献也一样。在出现任何不一致的情况下，以本文字面公开的材料为准。

Claims (159)

1.一种离体或体外培养免疫细胞和/或干细胞的方法，所述方法包括将免疫细胞和/或干细胞置于包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中，其中所述培养基不是高渗的。
2.一种制备免疫细胞群和/或干细胞群的方法，所述方法包括将免疫细胞和/或干细胞置于包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中，其中所述培养基不是高渗的。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述培养基还包含一种或多种细胞因子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子包括白介素-2(IL-2)、白介素21、白介素-15(IL-15)或它们的任何组合。
5.一种离体或体外增加未分化或较低分化细胞的数量或百分比的方法，所述方法包括在包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中培养免疫细胞和/或干细胞，其中所述培养基包含IL-2，但不包含IL-7和IL-15。
6.如权利要求6所述的方法，其中所述培养后的所述免疫细胞和/或干细胞与在包含IL-2、IL-7和IL-15的培养基中培养的免疫细胞和/或干细胞相比包含更高数量和/或百分比的未分化或较低分化的免疫细胞和/或干细胞。
7.一种离体或体外增加未分化或较低分化的免疫细胞和/或干细胞的数量和/或百分比的方法，所述方法包括将免疫细胞和/或干细胞置于包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中，其中所述培养基包含IL-7和IL-21。
8.一种离体或体外增加未分化或较低分化的免疫细胞和/或干细胞的数量或百分比的方法，所述方法包括将所述免疫细胞和/或干细胞置于包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中，其中所述培养基包含IL-15和IL-21。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述细胞包括免疫细胞。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞、TIL、NK细胞、TIL、Treg和或它们的组合。
11.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述细胞包括干细胞。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。
13.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述细胞表达T细胞受体(TCR)。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述培养基是低渗的。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含钠离子、钙离子、葡萄糖和/或它们的任何组合。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含细胞扩增剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞扩增剂包括GSK3B抑制剂、ACLY抑制剂、PI3K抑制剂、AKT抑制剂或它们的任何组合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述PI3K抑制剂选自LY294002、匹替利司、CAL101、IC87114或它们的任何组合。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述AKT抑制剂选自MK2206、A443654、AKTi-VIII或它们的任何组合。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中与起始细胞群相比，所述培养基能够在最终细胞产物中：
a.增加较低分化和/或未分化细胞的数量和/或百分比；
b.提高转导效率；
c.增加干样免疫细胞；
d.增加体内活力；
e.增加细胞潜能；
f.防止细胞耗竭；或
g.它们的任何组合。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约45mM至约110mM、约45mM至约100mM、约45mM至约90mM、约45mM至约80mM、约45mM至约70mM、约45mM至约60mM、约45mM至约50mM、约50mM至约110mM、约50mM至约100mM、约50mM至约90mM、约50mM至约80mM、约50mM至约70mM、约60mM至约110mM、约60mM至约100mM、约60mM至约90mM、约60mM至约80mM、约60mM至约70mM、约70mM至约100mM、约70mM至约90mM、约70mM至约80mM、约80mM至约110mM、约80mM至约100mM、约80mM至约90mM、约90mM至约110mM、约90mM至约100mM、或约100mM至约110mM。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约50mM至约90mM。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述钾离子的浓度为约50mM至约80mM。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述培养基具有低于约280mOsm/L的渗透压摩尔浓度。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述培养基具有在约100mOsm/L至约280mOsm/L、约125mOsm/L至约280mOsm/L、约150mOsm/L至约280mOsm/L、约175mOsm/L至约280mOsm/L、约200mOsm/L至约280mOsm/L、约210mOsm/L至约280mOsm/L、约220mOsm/L至约280mOsm/L、约225mOsm/L至约280mOsm/L、约230mOsm/L至约280mOsm/L、约235mOsm/L至约280mOsm/L、约240mOsm/L至约280mOsm/L、约245mOsm/L至约280mOsm/L、约250mOsm/L至约280mOsm/L、约255mOsm/L至约280mOsm/L、约260mOsm/L至约280mOsm/L、约265mOsm/L至约280mOsm/L、约270mOsm/L至约280mOsm/L、或约275mOsm/L至约280mOsm/L之间的渗透压摩尔浓度。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述培养基具有约100mOsm/L至约280mOsm/L、约125mOsm/L、约150mOsm/L、约175mOsm/L、约200mOsm/L、约210mOsm/L、约220mOsm/L、约225mOsm/L、约230mOsm/L、约235mOsm/L、约240mOsm/L、约245mOsm/L、约250mOsm/L、约255mOsm/L、约260mOsm/L、约265mOsm/L、约270mOsm/L、或约275mOsm/L的渗透压摩尔浓度。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述培养基具有约250的渗透压摩尔浓度。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述培养基具有约255的渗透压摩尔浓度。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述培养基具有约260的渗透压摩尔浓度。
31.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述培养基是等渗的。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述培养基具有约280mOsm/L至约285mOsm/L、约280mOsm/L至约290mOsm/L、约280mOsm/L至约295mOsm/L、约280mOsm/L至约300mOsm/L、约280mOsm/L至约305mOsm/L、约280mOsm/L至约310mOsm/L、约280mOsm/L至约315mOsm/L、或约280mOsm/L至小于320mOsm/L的渗透压摩尔浓度。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述培养基具有约285mOsm/L、约290mOsm/L、约295mOsm/L、约300mOsm/L、约305mOsm/L、约310mOsm/L或约315mOsm/L的渗透压摩尔浓度。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含钠离子。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述钠离子的浓度为从约25mM至约100mM。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述钠离子的浓度为从约30mM至约40mM、约30mM至约50mM、约30mM至约60mM、约30mM至约70mM、约30mM至约80mM、约40mM至约50mM、约40mM至约60mM、约40mM至约70mM、约40mM至约80mM、约50mM至约55mM、约50mM至约60mM、约50mM至约65mM、约50mM至约70mM、约50mM至约75mM、约50mM至约80mM、约55mM至约60mM、约55mM至约65mM、约55mM至约70mM、约55mM至约75mM、约55mM至约80mM、约60mM至约65mM、约60mM至约70mM、约60mM至约75mM、约60mM至约80mM、约70mM至约75mM、约70mM至约80mM、或约75mM至约80mM。
37.如权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、或约80mM。
38.如权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约55mM。
39.如权利要求34至38中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约60mM。
40.如权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约65mM。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含葡萄糖。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度大于约10mM。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度为从约10mM至约25mM、约10mM至约20mM、约15mM至约25mM、约15mM至约20mM、约15mM至约19mM、约15mM至约18mM、约15mM至约17mM、约15mM至约16mM、约16mM至约20mM、约16mM至约19mM、约16mM至约18mM、约16mM至约17mM、约17mM至约20mM、约17mM至约19mM、或约17mM至约18mM。
44.如权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度为约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、或约25mM。
45.如权利要求41至44中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖的浓度为约15.4mM、约15.9mM、约16.3mM、约16.8mM、约17.2mM、或约17.7mM。
46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含钙离子。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述钙离子的浓度大于约0.4mM。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中所述钙离子的浓度为从约0.4mM至约2.5mM、约0.5mM至约2.0mM、约1.0mM至约2.0mM、约1.1mM至约2.0mM、约1.2mM至约2.0mM、约1.3mM至约2.0mM、约1.4mM至约2.0mM、约1.5mM至约2.0mM、约1.6mM至约2.0mM、约1.7mM至约2.0mM、约1.8mM至约2.0mM、约1.2至约1.3mM、约1.2至约1.4mM、约1.2至约1.5mM、约1.2至约1.6mM、约1.2至约1.7mM、约1.2至约1.8mM、约1.3至约1.4mM、约1.3至约1.5mM、约1.3至约1.6mM、约1.3至约1.7mM、约1.3至约1.8mM、约1.4至约1.5mM、约1.4至约1.6mM、约1.4至约1.7mM、约1.4至约1.8mM、约1.5至约1.6mM、约1.5至约1.7mM、约1.5至约1.8mM、约1.6至约1.7mM、约1.6至约1.8mM、或约1.7至约1.8mM。
49.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述钙离子的浓度为约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、或约2.0mM。
50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约50mM钾离子和
(i)约80.5mM钠离子；
(ii)约17.7mM葡萄糖；
(iii)约1.8mM钙离子；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述培养基具有约254.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
52.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约55mM钾离子和
(i)约76mM钠离子；
(ii)约17.2mM葡萄糖；
(iii)约1.7mM钙离子；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述培养基具有约255.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
54.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约60mM钾离子和
(i)约72.2mM钠离子；
(ii)约16.8mM葡萄糖；
(iii)约1.6mM钙离子；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述培养基具有约257.2mOsmol的渗透压摩尔浓度。
56.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约65mM钾离子和
(i)约67.6mM钠离子；
(ii)约16.3mM葡萄糖；
(iii)约1.5mM钙离子；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述培养基具有约257.5mOsmol的渗透压摩尔浓度。
58.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约70mM钾离子和
(i)约63.9mM钠离子；
(ii)约15.9mM葡萄糖；
(iii)约1.4mM钙离子；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述培养基具有约259.7mOsmol的渗透压摩尔浓度。
60.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约75mM钾离子和
(i)约59.3mM钠离子；
(ii)约15.4mM葡萄糖；
(iii)约1.3mM钙离子；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述培养基具有约260mOsmol的渗透压摩尔浓度。
62.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约80mM钾离子和
(i)约55.6mM钠离子；
(ii)约15mM葡萄糖；
(iii)约1.2mM钙离子；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述培养基具有约262.26mOsmol的渗透压摩尔浓度。
64.如权利要求9至55中任一项所述的方法，其中在培养后所述免疫细胞是CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+CD27+、CD28+、或TCF7+或它们的任何组合。
65.如权利要求4至6和9至64中任一项所述的方法，其中所述IL-2的浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述IL-2的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。
67.如权利要求65或66所述的方法，其中所述IL-2的浓度为约1.0ng/mL。
68.如权利要求65或66所述的方法，其中所述IL-2的浓度为约10ng/mL。
69.如权利要求4、7和8至68中任一项所述的方法，其中所述IL-21的浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述IL-21的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。
71.如权利要求69或70所述的方法，其中所述IL-21的浓度为约1.0ng/mL。
72.如权利要求69或70所述的方法，其中所述IL-21的浓度为约10ng/mL。
73.如权利要求5至7和9至72中任一项所述的方法，其中所述IL-7的浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述IL-7的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。
75.如权利要求73或74所述的方法，其中所述IL-7的浓度为约1.0ng/mL。
76.如权利要求73或74所述的方法，其中所述IL-7的浓度为约10ng/mL。
77.如权利要求4-6和8至76中任一项所述的方法，其中所述IL-15的浓度为从约0.1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约14ng/mL、约1ng/mL至约13ng/mL、约1ng/mL至约12ng/mL、约1ng/mL至约11ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约9ng/mL、约1ng/mL至约8ng/mL、约1ng/mL至约7ng/mL、约1ng/mL至约6ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约1ng/mL至约4ng/mL、约1ng/mL至约3ng/mL、约1ng/mL至约2ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、或约15ng/mL至约20ng/mL。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述IL-15的浓度为约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2ng/mL、约3ng/mL、约4ng/mL、约5ng/mL、约6ng/mL、约7ng/mL、约8ng/mL、约9ng/mL、约10ng/mL、约11ng/mL、约12ng/mL、约13ng/mL、约14ng/mL、约15ng/mL、约16ng/mL、约17ng/mL、约18ng/mL、约19ng/mL或约20ng/mL。
79.如权利要求77或78所述的方法，其中所述IL-15的浓度为约1.0ng/mL。
80.如权利要求77或78所述的方法，其中所述IL-15的浓度为约10ng/mL。
81.如权利要求1至80中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞和/或干细胞包含嵌合抗原受体、工程化的T细胞受体或它们的任何组合。
82.如权利要求1至81中任一项所述的方法，其中在培养后将所述免疫细胞和/或干细胞施用于人受试者。
83.如权利要求1至82中任一项所述的方法，其中所述细胞还用载体转导。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或TCR模拟物的转基因。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述CAR靶向CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分或它们的任何组合。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述TCR靶向AFP、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、legumain、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白的细胞外部分或它们的任何组合。
87.如权利要求84所述的方法，其中所述载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)、腺病毒、AAV杂合病毒、杆状病毒或它们的任何组合。
88.一种细胞群，所述细胞群通过如权利要求1至87中任一项所述的方法制备。
89.一种细胞群，所述细胞群包含至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％或至少约70％的为CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+和TCF7+的细胞，其中所述细胞根据如权利要求1至87中任一项所述的方法培养。
90.一种细胞培养基，所述细胞培养基用于如权利要求1至87中任一项所述的方法。
91.一种细胞培养基，所述细胞培养基包含(i)如权利要求1至87中所述的免疫细胞或干细胞和(ii)浓度高于40mM的钾离子，其中所述培养基不是高渗的。
92.如权利要求91所述的培养基，其中所述钾离子的浓度为至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。
93.如权利要求91或92所述的培养基，其中所述钾离子的浓度为约50mM、约60mM、约70mM、或约80mM。
94.如权利要求91至93中任一项所述的培养基，所述培养基还包含一种或多种细胞因子。
95.如权利要求94所述的培养基，其中所述一种或多种细胞因子是IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任何组合。
96.一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求88或89所述的细胞群。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述疾病或疾患包括肿瘤，所述肿瘤源自包括以下的癌症：乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾脏癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、食管癌、眼癌、胃(胃)癌、胃肠道癌、卵巢癌、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或它们的组合。
98.一种扩增从人受试者获得的免疫细胞的方法，所述方法包括在初始扩增培养基中培养所述免疫细胞，其中所述初始扩增培养基是高钾的。
99.如权利要求98所述的方法，所述方法包括在所述初始扩增培养基中培养所述细胞后，在第二扩增培养基中培养所述免疫细胞。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述第二扩增培养基是高钾的。
101.一种扩增从人受试者获得的免疫细胞的方法，所述方法包括(a)在初始扩增培养基中和(b)在第二扩增培养基中培养所述免疫细胞，其中所述初始扩增培养基或所述第二扩增培养基是高钾的。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述第二扩增培养基是高钾的，并且其中所述初始扩增培养基不是高钾的。
103.如权利要求98至102中任一项所述的方法，所述方法还包括在第三(或最终)扩增培养基中培养所述免疫细胞。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述第三扩增培养基是高钾的。
105.如权利要求103所述的方法，其中所述初始扩增培养基和所述第二扩增培养基是高钾的，并且所述第三扩增培养基不是高钾的。
106.如权利要求98至105中任一项所述的方法，其中所述初始扩增培养基还包含IL-2、IL-21或两者。
107.如权利要求98至106中任一项所述的方法，其中所述初始扩增培养基还包含T细胞补充物、血清替代物、谷氨酰胺、谷氨酰胺替代物(例如Glutamax(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺))、非必需氨基酸、抗生素(例如青霉素、链霉素或两者)、抗真菌剂(例如FUNGINTM)和/或丙酮酸钠。
108.如权利要求98至107中任一项所述的方法，其中将所述免疫细胞在所述初始扩增培养基中培养长达约六天、约七天、约八天、约九天或约10天。
109.如权利要求99至108中任一项所述的方法，其中在所述第二扩增培养基中用CD3激动剂、CD28激动剂或两者刺激所述免疫细胞。
110.如权利要求99至109中任一项所述的方法，其中在所述第二扩增培养基中用CD27配体进一步刺激所述免疫细胞。
111.如权利要求99至110中任一项所述的方法，其中在所述第二扩增培养基中用4-1BB配体进一步刺激所述免疫细胞。
112.如权利要求99至111中任一项所述的方法，其中在用CD3激动剂、CD28激动剂和/或CD27配体刺激后，将所述免疫细胞培养至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天或至少约26天。
113.如权利要求103至112中任一项所述的方法，其中在所述第三扩增培养基中用CD3激动剂、CD28激动剂、CD27配体和/或4-1BB配体刺激所述免疫细胞。
114.如权利要求103至113中任一项所述的方法，其中所述第三扩增培养基不是高钾的。
115.如权利要求113或114所述的方法，其中将所述免疫细胞培养至少约28天、至少约29天、至少约30天、至少约31天、至少约32天、至少约33天、至少约34天、至少约35天、至少约36天、至少约37天、至少约38天、至少约39天、至少约40天、至少约41天、至少约42天或至少约43天。
116.一种增加肿瘤反应性免疫细胞的方法，所述方法包括：
a.在初始扩增培养基中培养免疫细胞长达约七天至14天，所述初始扩增培养基是高钾的并且任选地包含IL-2和/或IL-21；
b.在添加CD3激动剂、CD28激动剂、CD27配体、4-1BB配体或它们的任何组合后在高钾的第二扩增培养基中培养所述免疫细胞约20天至约25天，例如约21天至约24天；
c.在添加CD3激动剂、CD28激动剂、CD27配体、4-1BB配体或它们的任何组合后在不是高钾的第三扩增培养基中培养所述免疫细胞约30天至约50天，例如约34天至约45天。
117.如权利要求1至87中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含TIL。
118.如权利要求98至116中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含TIL。
119.如权利要求117或118所述的方法，其中所述TIL包含CD8+TIL。
120.如权利要求117至119中任一项所述的方法，其中所述TIL富含CD8+TIL。
121.如权利要求117至119中任一项所述的方法，其中所述TIL富含肿瘤特异性TIL。
122.如权利要求117至119中任一项所述的方法，其中所述TIL富含干样TIL。
123.一种免疫细胞，所述免疫细胞表达一种或多种干样标志物和一种或多种效应子样标志物。
124.如权利要求123所述的免疫细胞，其中所述干样标志物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+或它们的任何组合。
125.如权利要求123或124所述的免疫细胞，其中所述效应子样标志物包括pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+或它们的任何组合。
126.一种工程化细胞群，所述工程化细胞群包含如权利要求123至125中任一项所述的免疫细胞。
127.一种工程化细胞群，其中至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的所述工程化细胞包含如权利要求123至125中任一项所述的免疫细胞。
128.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求123至125中任一项所述的免疫细胞或如权利要求126或127所述的工程化细胞群和药学上可接受的载剂。
129.一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求123至125中任一项所述的免疫细胞、如权利要求126或127所述的工程化细胞群或如权利要求128所述的药物组合物。
130.如权利要求129所述的方法，其中所述疾病或疾患是癌症。
131.一种制备如权利要求123至125中任一项所述的免疫细胞的方法，所述方法包括在合适的条件下在培养基中培养所述免疫细胞。
132.一种人T细胞群，其中所述T细胞群中至少约5％的所述T细胞具有干样表型。
133.如权利要求132所述的人T细胞群，其中所述T细胞群中至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％的所述T细胞具有干样表型。
134.如权利要求132或133所述的人T细胞群，其中所述具有干样表型的T细胞是TCF7+。
135.如权利要求132至134中任一项所述的人T细胞群，其中所述具有干样表型的T细胞是CD3+、CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+和TCF7+。
136.如权利要求132至135中任一项所述的人T细胞群，其中所述具有干样表型的T细胞是CD39-和CD69-。
137.如权利要求132至136中任一项所述的人T细胞群，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
138.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求132至137中任一项所述的人T细胞群和药学上可接受的载剂。
139.一种杀伤靶细胞的方法，所述方法包括在允许T细胞杀伤所述靶细胞的条件下使所述靶细胞与如权利要求132至137中任一项所述的人T细胞群或如权利要求138所述的药物组合物接触。
140.一种治疗有需要的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求132至137中任一项所述的人T细胞群或如权利要求138所述的药物组合物。
141.一种诱导患者中的抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求132至137中任一项所述的T细胞群或如权利要求138所述的药物组合物。
142.如权利要求132至137中任一项所述的人T细胞群或如权利要求138所述的药物组合物在制造用于在如权利要求139至141中任一项所述的方法中治疗有需要的患者的药物中的用途。
143.如权利要求132至137中任一项所述的人T细胞群或如权利要求138所述的药物组合物，其用于在有需要的患者中治疗癌症的方法中。
144.如权利要求96、97和139至141中任一项所述的方法，其中在所述施用后所述患者中肿瘤的大小(肿瘤大小)与参考肿瘤大小相比减小。
145.如权利要求144所述的方法，其中所述参考肿瘤大小包括：(i)所述施用前的肿瘤大小，(ii)未接受所述施用的对应受试者中的肿瘤大小，或(iii)(i)和(ii)两者。
146.如权利要求144或145所述的方法，其中与所述参考肿瘤大小相比，所述肿瘤大小减小至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。
147.如权利要求96、97、139至141和144至146中任一项所述的方法，其中在所述施用后所述受试者的存活持续时间与参考存活持续时间相比增加。
148.如权利要求147所述的方法，其中所述参考存活持续时间包括未接受所述施用的对应受试者的存活持续时间。
149.如权利要求147或148所述的方法，其中，与所述参考存活持续时间相比，所述存活持续时间为至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍、或至少约1,000倍或更多。
150.如权利要求1至87和98至122中任一项所述的方法，其中与在对照培养基中培养的免疫细胞相比，在培养后所述免疫细胞表达增加的IL-2。
151.如权利要求150所述的方法，其中与在对照培养基中培养的所述免疫细胞相比，所述免疫细胞表达至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍IL-2。
152.如权利要求150或151所述的方法，其中所述免疫细胞表达至少约20pg/ml、至少约25pg/ml、至少约50pg/ml、至少约75pg/ml、至少约100pg/ml、至少约150pg/ml、至少约200pg/ml、至少约250pg/ml、至少约300pg/ml、至少约350pg/ml、至少约400pg/ml、至少约450pg/ml、至少约500pg/ml、至少约600pg/ml、至少约700pg/ml、至少约800pg/ml、至少约900pg/ml、至少约1000pg/ml、至少约1250pg/ml、至少约1500pg/ml、至少约1750pg/ml、至少约2000pg/ml、至少约2500pg/ml、至少约3000pg/ml、至少约3500pg/ml、至少约4000pg/ml、至少约4500pg/ml、或至少约5000pg/ml IL-2。
153.如权利要求150至152中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞在单次刺激后表达增加的IL-2。
154.如权利要求150至153中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞在至少两次连续刺激、和至少三次连续刺激、和至少四次连续刺激、或至少五次连续刺激后表达增加的IL-2。
155.如权利要求150到154中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞还表达c-Jun。
156.如权利要求1至87、98至122和150至155中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞与在对照培养基中培养的所述免疫细胞相比表现出增加的细胞毒性活性。
157.如权利要求156所述的方法，其中与在对照培养基中培养的免疫细胞相比，免疫细胞的细胞毒性增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约16倍、至少约17倍、至少约18倍、至少约19倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍或至少约1,000倍IL-2。
158.如权利要求1至87、98至122和150至157中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞与在对照培养基中培养的所述免疫细胞相比表现出增加的持久性。
159.如权利要求158所述的方法，其中所述免疫细胞在与靶细胞重复接触至少约5天、至少约7天、至少约10天、至少约12天或至少约14天后表现出细胞毒性活性。
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