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CN116745405A - 培养免疫细胞的方法 - Google Patents

培养免疫细胞的方法 Download PDF

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CN116745405A
CN116745405A CN202180088870.7A CN202180088870A CN116745405A CN 116745405 A CN116745405 A CN 116745405A CN 202180088870 A CN202180088870 A CN 202180088870A CN 116745405 A CN116745405 A CN 116745405A
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CN
China
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til
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concentration
medium
population
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Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180088870.7A
Other languages
English (en)
Inventor
S·K·沃德纳拉
Y·帕特尔
N·P·莱斯提弗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd filed Critical Lyle Immune Pharmaceutical Co ltd
Priority claimed from PCT/US2021/060667 external-priority patent/WO2022109501A2/en
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Abstract

本公开提供了在包含至少约30mM到至少约100mM钾离子的培养基中培养TIL的方法。在一些方面，相对于CD4+TIL，本文所公开的方法增强CD8+TIL的扩增。在一些方面，所述方法还增加细胞群中低分化细胞、例如低分化TIL的数量。在一些方面，本文所公开的方法富集肿瘤反应性、例如肿瘤特异性TIL，使得保持克隆多样性。在一些方面，将所述细胞、例如所述TIL施用于有需要的受试者。

Description

培养免疫细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国临时申请的优先权和权益：于2020年11月23日提出的美国临时申请No.63/198,933；于2021年2月5日提出的美国临时申请No.63/146,477；于2021年2月25日提出的美国临时申请No.63/153,922；于2021年3月23日提出的美国临时申请No.63/165,023；于2021年3月29日提出的美国临时申请No.63/167,592；于2021年4月28日提出的美国临时申请No.63/181,218；和于2021年10月28日提出的美国临时申请No.63/273,138；所述美国临时申请中每一者的全文皆以引用的方式并入本文中。
以电子方式提交的序列表的引用
与本申请一起提出的呈ASCII文本格式以电子方式提交的序列表的内容(名称：4385_043PC07_Seqlisting_ST25.txt，大小：1,999字节；以及创建日期：2021年11月23日)以引用的方式整体并入本文中。
发明领域
本公开涉及包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的组合物和培养细胞的方法。在一些方面，本文所公开的方法优先促进寡克隆或多克隆肿瘤反应性(例如肿瘤特异性)干细胞样T细胞(例如特征在于低分化的TIL)的富集。使用本文所公开方法培养的细胞可用于多种细胞疗法，包括(但不限于)过继性细胞疗法，例如自体T细胞疗法。
背景技术
使用免疫治疗策略已展示在治疗某些类型的晚期癌症方面有相当大的临床功效。然而，尽管取得了显著成功，但绝大多数患有晚期癌症的患者仍无法受益于免疫疗法治疗，最终将屈服于其疾病。细胞治疗技术(例如过继性细胞疗法，包括嵌合抗原受体(CAR)和工程化TCR T细胞)的关键限制是缺乏适宜的肿瘤靶，这可能导致在患有已用例如CAR T细胞治疗的实体癌的患者中无法观察到广泛的临床反应。
已经在调介晚期癌症患者的临床反应方面取得一定成功的另一方法是分离、扩增和输注自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。TIL是异质的，具有可变的肿瘤反应性和不相关或抑制性T细胞组成。肿瘤反应性群体通常对抗原高度敏感，导致细胞产物处于前功能障碍状态且功能受限。
已发现培养和扩增TIL的传统方法导致TIL的终末分化，从而导致TIL在转移到患者后的持久性较差。参见例如Rosenberg等人，Clinical Cancer Research 17(13):4550-557(2011)。另外，目前从肿瘤片段扩增异质TIL群体的方法产生具有降低的多克隆性并损失许多肿瘤优势T细胞克隆的TIL群体(参见例如Poschke等人，Clin.Cancer Res.(2020)，其全文皆以引用的方式并入本文中)。因此，产生这类TIL源性输注产物通常会导致肿瘤特异性T细胞在扩增期间损失，和不同分化状态下免疫细胞的不确定混合，这在根除实体瘤方面是无效的。为了进行治愈，需要具有增强的自我更新干细胞/效应物性质的TIL。另外，尚未阐述获得具有高水平的克隆多样性的低分化TIL的扩增群体的方法，所述低分化TIL保留进一步分裂并靶向和杀伤癌细胞的能力。
迄今为止，这些和其它关键限制已剥夺使用TIL作为有效治疗剂的用途，这使得难以获得足够数量的肿瘤反应性TIL用于T细胞疗法。因此，业内仍需要制备TIL组合物的改良方法和使用所述组合物的疗法。
发明内容
本公开的一些方面是关于离体或体外培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括将异质TIL群体放置于包含浓度为约30mM到约100mM的钾离子的代谢重编程培养基(“MRM”)中。在一些方面，异质TIL群体在放置于MRM中后富集CD8+TIL。
本公开的一些方面是关于增加CD8+TIL的数量或百分比的离体或体外方法，所述方法包括在包含浓度为约30mM到约100mM的钾离子的MRM中培养异质TIL群体。
本公开的一些方面是关于制备CD8+富集的TIL群体的方法，所述方法包括在包含浓度为约30mM到约100mM的钾离子的MRM中离体或体外培养异质TIL群体。
在一些方面，异质TIL群体包含CD4+TIL和CD8+TIL。在一些方面，异质TIL群体从获自受试者的一个或多个肿瘤样品获得。在一些方面，肿瘤样品经受初始TIL培养。在一些方面，初始TIL培养包括在MRM中培养肿瘤样品。
在一些方面，MRM在初始TIL培养期间还包含IL-2。在一些方面，MRM在初始TIL培养期间还包含IL-7、IL-15、IL-21或它们的任何组合。在一些方面，MRM在初始TIL培养期间包含IL-2和IL-21。在一些方面，初始TIL培养持续至少约14-19天。在一些方面，初始TIL培养持续至少约11天。在一些方面，初始TIL培养持续至少约14天。在一些方面，与初始TIL培养前CD8+TIL对非CD8+TIL的比例相比，在初始TIL培养后CD8+TIL对非CD8+TIL的比例增加。在一些方面，在初始TIL培养后刺激TIL。在一些方面，通过将TIL与CD3激动剂和/或CD28激动剂一起培养来刺激TIL。
在一些方面，肿瘤样品包含肿瘤活体组织切片。在一些方面，将肿瘤样品在培养之前片段化。在一些方面，使肿瘤样品在培养之前解离。
在一些方面，在培养异质TIL群体后，群体中至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，在培养异质TIL群体后，群体中至少约50％的TIL是CD8+TIL。
在一些方面，MRM还包含钠离子、钙离子、葡萄糖或它们的任何组合。
在一些方面，MRM还包含细胞扩增剂。在一些方面，细胞扩增剂包括GSK3B抑制剂、ACLY抑制剂、PI3K抑制剂、AKT抑制剂或它们的任何组合。在一些方面，PI3K抑制剂包括LY294002、匹替利司(pictilisib)、CAL101、IC87114或它们的任何组合。在一些方面，AKT抑制剂包括MK2206、A443654、AKTi-VIII或它们的任何组合。
在一些方面，钾离子的浓度为至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM、至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、至少约75mM、至少约80mM、至少约85mM、至少约90mM、至少约95mM或至少约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约30mM到约100mM、约30mM到约90mM、约30mM到约80mM、约30mM到约70mM、约30mM到约60mM、约30mM到约50mM、约40mM到约100mM、约40mM到约90mM、约40mM到约80mM、约40mM到约70mM、约40mM到约60mM或约40mM到约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约80mM。
在一些方面，MRM还包含钠离子。在一些方面，钠离子的浓度为约25mM到约100mM。在一些方面，钠离子的浓度为约30mM到约40mM、约30mM到约50mM、约30mM到约60mM、约30mM到约70mM、约30mM到约80mM、约40mM到约50mM、约40mM到约60mM、约40mM到约70mM、约40mM到约80mM、约50mM到约55mM、约50mM到约60mM、约50mM到约65mM、约50mM到约70mM、约50mM到约75mM、约50mM到约80mM、约55mM到约60mM、约55mM到约65mM、约55mM到约70mM、约55mM到约75mM、约55mM到约80mM、约60mM到约65mM、约60mM到约70mM、约60mM到约75mM、约60mM到约80mM、约70mM到约75mM、约70mM到约80mM或约75mM到约80mM。在一些方面，钠离子的浓度为约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM或约80mM。在一些方面，钠离子的浓度为约55mM。在一些方面，钠离子的浓度为约60mM。在一些方面，钠离子的浓度为约65mM。
在一些方面，MRM还包含葡萄糖。在一些方面，葡萄糖的浓度大于约10mM。在一些方面，葡萄糖的浓度为约10mM到约25mM、约10mM到约20mM、约15mM到约25mM、约15mM到约20mM、约15mM到约19mM、约15mM到约18mM、约15mM到约17mM、约15mM到约16mM、约16mM到约20mM、约16mM到约19mM、约16mM到约18mM、约16mM到约17mM、约17mM到约20mM、约17mM到约19mM或约17mM到约18mM。在一些方面，葡萄糖的浓度为约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM或约25mM。
在一些方面，MRM还包含钙离子。在一些方面，钙离子的浓度大于约0.4mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.4mM到约2.5mM、约0.5mM到约2.0mM、约1.0mM到约2.0mM、约1.1mM到约2.0mM、约1.2mM到约2.0mM、约1.3mM到约2.0mM、约1.4mM到约2.0mM、约1.5mM到约2.0mM、约1.6mM到约2.0mM、约1.7mM到约2.0mM、约1.8mM到约2.0mM、约1.2mM到约1.3mM、约1.2mM到约1.4mM、约1.2mM到约1.5mM、约1.2mM到约1.6mM、约1.2mM到约1.7mM、约1.2mM到约1.8mM、约1.3mM到约1.4mM、约1.3mM到约1.5mM、约1.3mM到约1.6mM、约1.3mM到约1.7mM、约1.3mM到约1.8mM、约1.4mM到约1.5mM、约1.4mM到约1.6mM、约1.4mM到约1.7mM、约1.4mM到约1.8mM、约1.5mM到约1.6mM、约1.5mM到约1.7mM、约1.5mM到约1.8mM、约1.6mM到约1.7mM、约1.6mM到约1.8mM或约1.7mM到约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM或约2.0mM。
在一些方面，MRM包含约40mM到约90mM钾离子和(i)约40mM到约80mM钠离子；(ii)约10mM到约24mM葡萄糖；(iii)约0.5mM到约2.8mM钙离子；或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
本公开的一些方面是关于扩增从人类受试者获得的TIL的方法，所述方法包括：在初始TIL培养基中培养TIL；在二次TIL培养基中培养TIL；在第三(或最终)TIL培养基中培养TIL，其中初始TIL培养基、二次TIL扩增培养基和/或第三TIL扩增培养基是MRM。在一些方面，初始TIL培养基和二次TIL扩增培养基是高血钾性的且第三TIL扩增培养基不是高血钾性的。在一些方面，初始TIL培养基还包含IL-2。在一些方面，初始TIL培养基还包含IL-21。在一些方面，初始TIL培养基还包含T细胞补充物、血清替代物、谷氨酰胺、谷氨酰胺取代物(例如Glutamax(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺))、非必需氨基酸、抗生素(例如青霉素(Penicillin)、链霉素(Streptomycin)或二者)、抗真菌剂(例如FUNGINTM)和/或丙酮酸钠。
在一些方面，将TIL在初始TIL培养基中培养至少约10天、至少约11天、至少约1周、至少约2周或至少约3周。在一些方面，在初始TIL培养基中培养TIL直到初始培养物中的细胞产量达到至少约1×105个、至少约2×105个、至少约3×105个、至少约4×105个、至少约5×105个、至少约6×105个、至少约7×105个、至少约8×105个、至少约9×105个、至少约1×106个、至少约2×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个、至少约10×106个、至少约15×106个、至少约20×106个、至少约25×106个、至少约30×106个、至少约35×106个、至少约40×106个、至少约45×106个或至少约50×106个细胞/片段。
在一些方面，在(b)中的二次TIL培养基中或之前，用CD3激动剂、CD28激动剂或二者刺激TIL。在一些方面，在二次TIL培养基中或之前，用CD27激动剂进一步刺激TIL。在一些方面，在二次TIL培养基中或之前，用4-1BB激动剂进一步刺激TIL。在一些方面，在刺激后，将TIL培养至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天或至少约26天。在一些方面，在二次培养基中培养TIL直到细胞产量达到至少约1×107个、至少约2×107个、至少约3×107个、至少约4×107个、至少约5×107个、至少约6×107个、至少约7×107个、至少约8×107个、至少约9×107个、至少约10×107个、至少约11×107个、至少约12×107个、至少约13×107个、至少约14×107个、至少约15×107个、至少约16×107个、至少约17×107个、至少约18×107个、至少约19×107个或至少约20×107个细胞。
在一些方面，在第三TIL培养基中，用CD3激动剂、CD28激动剂、CD27激动剂和/或4-1BB激动剂刺激TIL。在一些方面，第三TIL培养基不是高血钾性的。在一些方面，将TIL在第三TIL培养基中培养至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天或至少约21天。
本公开的一些方面是关于增加肿瘤反应性(例如肿瘤特异性)TIL的方法，所述方法包括：将一个或多个肿瘤片段在初始TIL培养基中培养长达约11天到19天，所述初始TIL培养基是高血钾性的并包含IL-2和任选地IL-21，由此从肿瘤片段获得TIL；在添加(i)CD3激动剂和(ii)CD28激动剂、CD27激动剂、4-1BB激动剂或它们的任何组合后，将TIL在二次TIL培养基中培养约7天到至少约14天，所述二次TIL培养基是高血钾性的；在添加(i)CD3激动剂和(ii)CD28激动剂、CD27激动剂、4-1BB激动剂或它们的任何组合后，将TIL在第三TIL培养基中培养约14天到至少约21天，所述第三TIL培养基是高血钾性的。
在一些方面，相对于在不是高血钾性的对照培养基中培养后TIL群体中的TCF7表达，TIL在MRM中培养后展现增加的TCF7表达。在一些方面，相对于在不是高血钾性的对照培养基中培养后CD8+CD62L+TIL的比例，TIL群体在MRM中培养后包含增加的CD8+CD62L+TIL比例。在一些方面，相对于在不是高血钾性的对照培养基中培养后CD8+PD1+TIL的比例，TIL群体在MRM中培养后包含增加的CD8+PD1+TIL比例。
在一些方面，与放置于对照培养基中的异质TIL群体的克隆多样性相比，异质TIL群体在放置于MRM中后具有增加的克隆多样性。
在一些方面，异质TIL群体在放置于MRM中后的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约99％到约100％、至少约98％到约100％、至少约97％到约100％、至少约96％到约100％、至少约95％到约100％、至少约94％到约100％、至少约93％到约100％、至少约92％到约100％、至少约91％到约100％、至少约90％到约100％、至少约85％到约100％、至少约80％到约100％、至少约75％到约100％、至少约70％到约100％、至少约65％到约100％、至少约60％到约100％、至少约55％到约100％、至少约50％到约100％、至少约45％到约100％或至少约40％到约100％。
在一些方面，如通过辛普森克隆性(Simpsons clonality)所测量，异质TIL群体在放置于MRM中后的克隆多样性评分小于约0.5、小于约0.45、小于约0.4、小于约0.35、小于约0.3、小于约0.275、小于约0.25、小于约0.225、小于约0.2、小于约0.175、小于约0.15、小于约0.125、小于约0.1、小于约0.075、小于约0.07、小于约0.06或小于约0.05。
在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，异质TIL群体在放置于MRM中后的克隆多样性评分小于约0.3。
在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，异质TIL群体在放置于MRM中后的克隆多样性评分小于约0.25。
在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，异质TIL群体在放置于MRM中后的克隆多样性评分小于约0.2。
在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，异质TIL群体在放置于MRM中后的克隆多样性评分小于约0.1。
本公开的一些方面是关于免疫细胞的组合物，所述组合物包含根据本文所公开的任一方法培养的一个或多个CD8+TIL。在一些方面，至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的免疫细胞是CD8+TIL。
本公开的一些方面是关于包含免疫细胞群的组合物，其中至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的免疫细胞是CD8+TIL。在一些方面，至少约50％的细胞是CD8+TIL。
在一些方面，相对于在不是高血钾性的对照培养基中培养后免疫细胞群中的TCF7表达，细胞在MRM中培养后展现增加的TCF7表达。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+/CD62L+TIL。在一些方面，在初始TIL培养结束时获得的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是PD1+。在一些方面，在初始TIL培养结束时获得的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD39+。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD27+。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD28+。在一些方面，在初始TIL培养结束时获得的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是PD1+CD39+。在一些方面，在初始TIL培养结束时获得的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是PD1+CD27+。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD62L+。在一些方面，在初始TIL培养结束时获得的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+CD103+PD1+TCF7+。
在一些方面，免疫细胞群包含至少约2×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约1×107个细胞。在一些方面，免疫细胞群包含至少约1×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约1×107个CD8+细胞。
在一些方面，CD8+TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约99％到约100％、至少约98％到约100％、至少约97％到约100％、至少约96％到约100％、至少约95％到约100％、至少约94％到约100％、至少约93％到约100％、至少约92％到约100％、至少约91％到约100％、至少约90％到约100％、至少约85％到约100％、至少约80％到约100％、至少约75％到约100％、至少约70％到约100％、至少约65％到约100％、至少约60％到约100％、至少约55％到约100％、至少约50％到约100％、至少约45％到约100％或至少约40％到约100％。
在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，CD8+TIL的克隆多样性评分小于约0.5、小于约0.45、小于约0.4、小于约0.35、小于约0.3、小于约0.275、小于约0.25、小于约0.225、小于约0.2、小于约0.175、小于约0.15、小于约0.125、小于约0.1、小于约0.075、小于约0.07、小于约0.06或小于约0.05。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，CD8+TIL的克隆多样性评分小于约0.3。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，CD8+TIL的克隆多样性评分小于约0.25。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，CD8+TIL的克隆多样性评分小于约0.2。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，CD8+TIL的克隆多样性评分小于约0.1。
本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用TIL群体，其中根据本文所公开的任一方法培养TIL群体。在一些方面，TIL群体富集CD8+TIL。在一些方面，TIL群体中至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，TIL群体中至少约50％的TIL是CD8+TIL。
本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的组合物。在一些方面，癌症包括实体瘤。在一些方面，癌症包括源自以下的实体瘤：黑色素瘤、结肠癌、肺癌、宫颈癌、胃肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、头颈部小细胞癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、睾丸生殖细胞肿瘤、胃腺癌、皮肤黑色素瘤、间皮瘤、肾透明细胞癌、宫颈鳞状细胞癌和子宫内膜腺癌、食管癌、膀胱尿路上皮癌、浸润性乳腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠腺癌或它们的任何组合。
在一些方面，所述方法包括向受试者施用至少约2×109个、至少约3×109个、至少约4×109个、至少约5×109个、至少约6×109个、至少约7×109个、至少约8×109个、至少约9×109个或至少约1×1010个或至少约10×1010个或至少约15×1010个或至少约20×1010个或至少约25×1010个或至少约30×1010个细胞。在一些方面，所述方法包括向受试者施用至少约1×109个、至少约3×109个、至少约4×109个、至少约5×109个、至少约6×109个、至少约7×109个、至少约8×109个、至少约9×109个或至少约1×109个CD8+细胞。在一些方面，所述方法包括向受试者施用约1×109到约4×109个、约5×109到约7×109个、约10×109到约30×109个、约40×109到约60×109个、约70×109到约90×109个细胞。在一些方面，所述方法包括向受试者施用大于90×109个细胞。
在一些方面，所述方法还包括施用检查点抑制剂。在一些方面，检查点抑制剂是在施用细胞群后施用于受试者。在一些方面，检查点抑制剂包括CTLA-4拮抗剂、PD1拮抗剂、TIM-3拮抗剂或它们的组合。在一些方面，检查点抑制剂包括抗CTLA-4抗体、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM-3抗体或它们的组合。在一些方面，所述方法还包括施用检查点激活剂。在一些方面，检查点抑制剂是在施用TIL群体后施用于受试者。在一些方面，检查点激活剂包括OX40激动剂、LAG-3激动剂、4-1BB(CD137)激动剂、GITR激动剂、TIM3激动剂或它们的组合。在一些方面，检查点激活剂包括抗OX40抗体、抗LAG-3抗体、抗CD137抗体、抗GITR抗体、抗TIM3抗体或它们的组合。
在一些方面，所述方法还包括施用细胞因子。在一些方面，细胞因子是在施用TIL群体后施用于受试者。在一些方面，细胞因子是IL-2。
在一些方面，所述方法还包括在施用细胞群之前向受试者施用淋巴细胞清除疗法。在一些方面，淋巴细胞清除疗法包含环磷酰胺(cyclophosphamide)、氟达拉滨(fludarabine)或环磷酰胺和氟达拉滨二者。
本公开的一些方面是关于扩增TIL群体，其克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约99％到约100％、至少约98％到约100％、至少约97％到约100％、至少约96％到约100％、至少约95％到约100％、至少约94％到约100％、至少约93％到约100％、至少约92％到约100％、至少约91％到约100％、至少约90％到约100％、至少约85％到约100％、至少约80％到约100％、至少约75％到约100％、至少约70％到约100％、至少约65％到约100％、至少约60％到约100％、至少约55％到约100％、至少约50％到约100％、至少约45％到约100％或至少约40％到约100％。
本公开的一些方面是关于扩增TIL群体，如通过辛普森克隆性所测量，其克隆多样性评分小于约0.5、小于约0.45、小于约0.4、小于约0.35、小于约0.3、小于约0.275、小于约0.25、小于约0.225、小于约0.2、小于约0.175、小于约0.15、小于约0.125、小于约0.1、小于约0.075、小于约0.07、小于约0.06或小于约0.05。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，克隆多样性评分小于约0.3。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，克隆多样性评分小于约0.25。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，克隆多样性评分小于约0.2。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，克隆多样性评分小于约0.1。
在一些方面，至少约2×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约1×107个细胞。在一些方面，至少约1×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约1×107个CD8+细胞。
在一些方面，至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的扩增TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约50％的扩增TIL是CD8+TIL。
在一些方面，相对于在不是高血钾性的对照培养基中培养后免疫细胞群中的TCF7表达，扩增TIL在MRM中培养后展现增加的TCF7表达。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的扩增TIL是CD8+/CD62L+TIL。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是PD1+。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD39+。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD27+。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD28+。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是PD1+CD39+。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是PD1+CD27+。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD62L+。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+CD103+PD1+TCF7+。
在一些方面，本文所公开的组合物或本文所公开的扩增TIL群体包含表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的至少一种免疫细胞。在一些方面，干细胞样标记物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+或它们的任何组合。在一些方面，干细胞样标记物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+和TCF7+或它们的任何组合。在一些方面，效应物样标记物包括pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+或它们的任何组合。在一些方面，组合物或群体中至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的扩增TIL包含表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的至少一种免疫细胞。
本公开的一些方面是关于表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的TIL。在一些方面，干细胞样标记物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+或它们的任何组合。在一些方面，干细胞标记物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+和TCF7+。在一些方面，效应物样标记物包括pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+或它们的任何组合。
本公开的一些方面是关于扩增TIL群体，所述扩增TIL群体包含本文所公开的TIL，例如包含一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的TIL。在一些方面，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的扩增TIL群体包含含有一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的TIL。
本公开的一些方面是关于药物组合物，所述药物组合物包含含有一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的TIL，和药学上可接受的载体。
本公开的某些方面是关于治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的TIL、本文所公开的扩增TIL群体或本文所公开的药物组合物。在一些方面，疾病或疾患是癌症。
在一些方面，相对于在对照培养基中培养后CD39-/CD69-TIL的比例，TIL群体在MRM中培养后包含增加的CD39-/CD69-TIL比例。
在一些方面，扩增TIL群体或权利要求117-136中任一项，其中TIL群体中TIL总数的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％或至少约40％是CD39-/CD69-。
附图说明
图1A-1F是展示从肿瘤片段培养和扩增TIL的示例性过程的示意图。图1A-1B展示了包括初始扩增和二次扩增的示例性过程，其中TIL在从初始TIL培养过渡到二次TIL扩增时(图1A-1B)和在初始TIL培养期间(图1B)任选地进行刺激(例如，根据本文所公开的方法，例如通过细胞与4-1BBL、TRANSACTTM、抗CD3抗体、抗原呈递细胞或它们的任何组合接触)。图1C-1D展示了包括初始扩增、二次扩增和最终扩增的示例性过程，其中TIL任选地进行刺激：(i)在从初始TIL培养过渡到二次TIL扩增时(图1C-1D)；(ii)在从二次TIL扩增过渡到最终TIL扩增时(图1C-1D)；以及(iii)在初始TIL培养期间(图1D)。图1E-1F展示了产生年轻TIL的示例性过程，其中初始扩增和二次扩增每次扩增的持续时间较短，例如11天(或更短)，并且其中TIL在从初始TIL培养过渡到二次TIL扩增时(图1E-1F)和在初始TIL培养期间(图1F)任选地进行刺激。
图2A-2B是在T细胞条件培养基(例如CTSTMOPTIMIZERTM；在本文中又称为“对照培养基”；图2A)或代谢重编程培养基(在本文中又称为“MRM”；图2B)中初始培养后(第14天)，TIL的FACS细胞表型分型的图形表示。图2A和图2B显示，与在对照培养基中培养的TIL相比，在MRM中培养产生具有增强的CD39和PD1表达(大于20％)的TIL。图2C是散布图，其显示通过在对照或MRM中培养来自不同肿瘤类型的TIL获得的CD8+细胞百分比的个体差异。每一连接点代表从同一样品获得的TIL，使得图汇总13名患者的数据。星号指示，在对照培养基中培养后的平均CD8+TIL百分比与在MRM中培养后的平均CD8+TIL百分比显著不同。这些数据显示，与在对照培养基中培养TIL相比，在MRM中培养TIL可富集CD8+T细胞。
图3A-3E是基于在对照培养基(图3A和图3C)或MRM(图3B和图3D)中培养14天后，所培养CD4+(图3A-3B)和CD8+(图3C-3D)TIL的PD1和CD27的表达的FACS细胞表型分型的图形表示。图3C是散布图，其显示通过在对照或MRM中培养来自不同肿瘤类型的TIL获得的CD27+PD1+细胞百分比的个体差异。每一连接点代表从同一样品获得的TIL，使得图3C汇总9名患者的数据。星号指示，在对照培养基中培养后的平均CD27+PD1+TIL百分比与在MRM中培养后平均CD27+PD1+TIL百分比显著不同。这些数据显示，与在对照培养基中培养TIL相比，在MRM中培养TIL可富集CD27+PD1+T细胞。
图4是示出了通过在初始培养后(第14天)在对照培养基或MRM中培养来自不同肿瘤类型的TIL获得的CD27+CD28+细胞百分比的统计学上显著差异的图形表示。每一连接点代表从同一样品获得的TIL，使得图4汇总9名患者的数据。这些数据显示，与在对照培养基中培养的TIL相比，在MRM中培养TIL可富集CD27+CD28+T细胞。
图5A-5B是在对照培养基(图5A)或MRM(图5B)中培养(第14天)的TIL的FACS细胞表型分型的图形表示，首先根据CD8或CD4表达设门，然后根据CD28和CD27表达设门，然后根据CD103和CD27表达设门，然后根据PD1和CD103表达设门，最后根据TCF7和CD27表达设门。图5C是示出了在对照培养基(1)或MRM(2)中初始培养后(约第14天)，TCF7+TIL的平均荧光强度(MFI)的图形表示。
图6A-6H是在二次扩增后(约第21-26天)在对照培养基(图6A-6D)或MRM(图6E-6H)中扩增的TIL的FACS细胞表型分型的图形表示，首先根据CD8或CD4表达设门(图6A和图6E)，根据CD8+细胞上的CD28和CD27表达设门(图6B和图6F)，根据CD8+细胞上的PD1和CD27表达设门(图6C和图6G)，最后根据CD8+细胞上的TCF7和CD39表达设门(图6D和图6H)。图6B-6D和图6F-6H是CD8+细胞。
图7A-7H是通过在二次扩增后(约第21天)在对照培养基(图7A-7D)或MRM(图7E-7H)中与突变体KRAS脉冲的树突细胞共培养扩增的CD8+TIL的FACS细胞表型分型的图形表示，首先根据CD8或CD4表达设门(图7A和图7E)，然后根据CD8+细胞上的CD28和CD27表达设门(图7B和图7F)，然后根据CD8+细胞上的PD1和CD27表达设门(图7C和图7G)，最后根据仅PD1+和CD27+、PD1+细胞上的TCF7和CD8表达设门(图7D和图7H)。图7B-7D和图7F-7H是CD8+细胞。
图8A-8H是通过在二次扩增后(约第21天)在对照培养基(图8A-8D)或MRM(图8E-8H)中与野生型KRAS脉冲的树突细胞共培养扩增的TIL的FACS细胞表型分型的图形表示，首先根据CD8或CD4表达设门(图8A和图8E)，然后根据CD8+细胞上的CD28和CD27表达设门(图8B和图8F)，然后根据CD8+细胞上的PD1和CD27表达设门(图8C和图8G)，最后根据仅PD1+和CD27+、PD1+细胞上的TCF7和CD8表达设门(图8D和图8H)。图8B-8D和图8F-8H是CD8+细胞。
图9A-9B是在二次扩增后(约第21-26天)在对照培养基(图9A)或MRM(图9B)中培养的TIL的FACS细胞表型分型的图形表示。
图10是展示了在二次扩增后(约第21天)在对照培养基或MRM中培养的TIL中IL-2、B2M、GZMB、IFNγ和TCF7的基因表达的倍数变化(FC)的条形图。每一基因的表达相对于在对照培养基中培养的TIL中的表达归一化。
图11A-11L是在二次扩增后(约第21-26天)在对照培养基(图11A、图11B、图11E和图11F)或MRM(图11C、图11D和图11G-11L)中培养的CD4+或CD8+TIL的FACS细胞分选的图形表示，根据PD1表达(图11A-11D)或CD103表达(图11E-11H)和CD39表达(图11A-11H)设门。图11I-11L显示CD4+TIL(图11I和图11K)和CD8+TIL(图11J和图11L)的设门，对PD1和CD39表达设门(图11I-11J)，然后根据CD45RO和CD103表达(图11K-11L)设门。
图12是条形图，示出了肿瘤片段中的免疫细胞(“肿瘤”)、使用对照培养基扩增的TIL(“对照”)和使用代谢重编程培养基扩增的TIL(“MRM”)的辛普森克隆性值。
图13A-13B是使用图12中所呈现的数据产生的关于在对照培养基中扩增的TIL(图13A)和在MRM中扩增的TIL(图13B)的差异丰度(DA)图。图13C-13D是在对照培养基中(图13C)或在MRM中(图13D)培养的TIL群体中前50种优势肿瘤TCR的肿瘤抗原识别的图形表示。
图14是展示在MRM中培养的TIL的KRAS突变体活性的图。1SEQ ID NO:6；2SEQ IDNO:1；3SEQ ID NO:7；4SEQ ID NO:8；5SEQ ID NO:9；6SEQ ID NO:10；7SEQ ID NO:11。
图15A-15D是示出了使用对照培养基或MRM产生的TIL的肿瘤识别和肿瘤杀伤活性的条形图，如通过所分泌IFN-γ(图15A和图15D)、所分泌IL-2(图15A)、所分泌TNF-α(图15B)、肿瘤细胞杀伤百分比(图15C)所证实。A＝使用对照培养基产生的TIL，并且B＝使用MRM产生的TIL(图15A、图15B和图15D)；“对照TIL”＝使用对照培养基产生的TIL，并且“MRMTIL”＝使用MRM产生的TIL(图15C)；并且“TC系”＝肿瘤细胞系(图15D)。
图16是在与TIL接触并共培养后(在箭头所指示的时间下)，离体培养的自体黑色素瘤肿瘤细胞随时间的细胞溶解百分比的图形表示。在对照培养基或MRM中培养TIL并以1:1效应T细胞(E)对肿瘤细胞(T)、2:1E:T和4:1E:T的比率将其添加到所培养肿瘤细胞中，如所指示。
图17A-17H是示出了使用对照过程(图17A-17D)或MRM(17E-17H)扩增的NSCLC TIL中标记基因的表达的图形表示。在MRM中扩增的TIL展现优异的表型特征，如通过CD8+T细胞分数、低CD39/CD69表达(图17B和17D)、中央记忆(CD45RO+CD6L+；图17C和17G)和高CD27表达(图17D和17H)所测量。虚线突出显示的框指示不利的表型，实线突出显示的框指示有利的表型。
图18A-18C是示出了从黑色素瘤(图8A)、NSCLC(图18B)或结直肠癌(图18C)获得的TIL中，T细胞隔室内CD39和CD69二者的CD8+T细胞的负表达的图形表示。从新鲜供应的人的肿瘤样品起始培养并在对照或MRM条件下扩增细胞。在最终快速扩增过程(REP)后，分析TIL的T细胞隔室内CD39和CD69二者的CD8+T细胞的负表达。对于每一分析，评价从黑色素瘤(n＝6个独立肿瘤)、NSCLC(n＝5个独立肿瘤)和结直肠癌(n＝11个独立肿瘤)扩增的TIL。通过配对t检验测量统计学显著性。***p<.001，*p<.05。
图19A和图19B是条形图示出了非小细胞肺癌(NSCLC)(图19A)和黑色素瘤(图19B)的肿瘤片段中的免疫细胞(“肿瘤”)、使用对照培养基扩增的TIL(“对照”)和使用代谢重编程培养基扩增的TIL(“MRM”)的辛普森克隆性值。
具体实施方式
本公开涉及培养免疫细胞(例如TIL)的方法、通过所述方法制备的细胞(例如包含寡克隆或多克隆肿瘤反应性(例如肿瘤特异性)干细胞样T细胞和/或CD8+TIL富集的组合物)和/或使用本文所述的免疫细胞治疗受试者的方法。本公开的细胞培养方法能够增强CD8+TIL的扩增和/或增加所培养TIL的多能性和/或多潜能性。在一些方面，当培养免疫细胞和/或将免疫细胞用于体内疗法时，培养方法能够减少和/或防止免疫细胞耗竭，例如TIL耗竭。在一些方面，本公开的培养方法能够保持源自癌症患者的TIL的克隆多样性。
在一些方面，本公开涉及离体或体外培养TIL的方法，所述方法包括在代谢重编程培养基(例如包含浓度高于40mM的钾离子的高血钾性培养基)中培养异质TIL群体，其中高血钾性培养基不是高渗的。在一些方面，本公开涉及增加CD8+TIL的数量或百分比的离体或体外方法，所述方法包括在代谢重编程培养基(例如包含浓度为至少5mM的钾离子的高血钾性培养基)中培养异质TIL群体。在其它方面，本公开涉及制备CD8+富集的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体的方法，所述方法包括在代谢重编程培养基(例如包含浓度为至少5mM的钾离子的高血钾性培养基)中离体或体外培养异质TIL群体。在一些方面，本公开涉及制备CD8+富集的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体的方法，所述方法包括在代谢重编程培养基(例如包含浓度介于40mM与80mM之间的钾离子和浓度介于100mM与30mM之间的NaCl的培养基)中离体或体外培养异质TIL群体，其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，高血钾性培养基不是高渗的。在一些方面，高血钾性培养基是低渗的。在一些方面，高血钾性培养基是等渗的。在一些方面，高血钾性培养基还包含白细胞介素(IL)-2、IL-21、IL-7、IL-15或它们的任何组合。在一些方面，高血钾性培养基还包含钠离子、钙离子、葡萄糖或它们的任何组合。
在更详细地阐述本公开之前应理解，本公开并不限于所述的特定组合物或工艺步骤，其当然会发生变化。如所属领域的技术人员在阅读本公开后应明了，本文阐述和说明的每一个别方面具有离散组分和特征，这些特征可容易地与其它几个方面中任一者的特征分离或组合而不背离本公开的范围或精神。可通过所列举事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序来实施任一所列举方法。
本文所提供的标题并非对本公开的各个方面的限制，本公开可通过参考整个说明书来定义。还应理解，本文所用的术语仅用于达成阐述特定方面的目的，而不意图具有限制性。
I.术语
为了可更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一者应具有下文所述的含义。其它定义阐述于本申请通篇中。
在本公开通篇中，术语“一个(a)”或“一个(an)”实体是指一个或多个所述实体；例如，“嵌合多肽”应理解为代表一个或多个嵌合多肽。因此，术语“一个(a)”或(“一个(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
另外，本文所用的“和/或”应视为具或不具另一者的两个指定特征或组分中的每一者的特定公开。因此，如本文片语(例如“A和/或B”)中所用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如片语(例如“A、B和/或C”)中所用的术语“和/或”意图涵盖以下方面中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。另外，“或”用于指清单中组分的开放清单。举例来说，“其中X包含A或B”意指X包含A，X包含B，X包含A和B，或X包含A或B和任何其它组分。
应理解，每当在本文中使用语言“包含”阐述方面时，还提供了根据“由……组成”和/或“基本上由……组成”阐述的其它类似方面。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语皆具有与本公开相关的领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。举例来说，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology，第3版，1999,Academic Press；和OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Revised,2000,OxfordUniversity Press向所属领域的技术人员提供了本公开中所用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以其国际单位制(Système International de Unites，SI)接受的形式表示。数字范围包括定义范围的数字。
本文所用的缩写定义于本公开通篇中。本公开的各个方面进一步详细阐述于以下子部分中。
术语“约”或“基本上包含”是指值或组成在如由所属领域的技术人员所测定的特定值或组成的可接受的误差范围内，这将部分取决于测量或测定值或组成的方式，即测量系统的限制。举例来说，“约”或“基本上包含”可意指根据所属领域中的实践在1个标准差内或大于1个标准差。替代地，“约”或“基本上包含”可意指高达10％的范围。另外，尤其对于生物系统或过程，该术语可意指高达一个数量级或高达值的5倍。当申请和权利要求书中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“基本上包含”的含义应假设在特定值或组成的可接受的误差范围内。
如本文所用的术语“大约”在应用于一个或多个所关注值时是指与所述参考值相似的值。在一些方面，除非另有说明或从上下文明显看出，否则术语“大约”是指在任一方向上(大于或小于)在所述参考值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的一系列值(这一数值将超过可能值的100％的情况除外)。
如本文所述，除非另有指示，否则任一浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列举范围内的任一整数和(适当时)其分数(例如整数的十分之一和百分之一)的值。
如本文所用的术语“对照培养基”是指与本文所公开的代谢重编程培养基(“MRM”)相比的任何培养基。对照培养基可包含与代谢重编程培养基相同的组分，某些离子浓度除外，例如钾离子。在一些方面，本文所述的代谢重编程培养基是由对照培养基通过调整一种或多种离子浓度(例如钾离子浓度)来制备，如本文所述。在一些方面，对照培养基包含基础培养基，例如CTSTMOPTIMIZERTM。在一些方面，对照培养基包含AIM V、RPMI或包含AIM V和RPMI的混合物。在一些方面，对照培养基包含(i)50％AIM V，(ii)50％RPMI1640，(iii)5％或10％人类血清，和(iv)IL-2。因此，在一些方面，对照培养基包含也在代谢重编程培养基中添加的一种或多种其它组分，包括(但不限于)氨基酸、葡萄糖、谷氨酰胺、T细胞刺激剂、抗体、取代物等，但对照培养基具有不同于代谢重编程培养基的某些离子浓度。除非另有指示，否则术语“培养基(media)”和“培养基(medium)”可互换使用。
如本文所用的术语“免疫细胞”是指免疫系统的细胞。在一些方面，免疫细胞选自T淋巴细胞(“T细胞”)、B淋巴细胞(“B细胞”)、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞。在一些方面，免疫细胞是肿瘤浸润细胞(TIL)。如本文所用的“TIL”是指已至少一次进入肿瘤中或能够进入肿瘤(例如在肿瘤的实质内)的T细胞。在一些方面，肿瘤是实体瘤。在一些方面，肿瘤是液体肿瘤，例如造血系统癌症。通过本发明方法制备的TIL可具有与天然存在的TIL相同的一种或多种性质。在一些方面，通过本发明方法制备的TIL具有不存在于天然存在的TIL中的一种或多种性质。TIL可使用任何方法获得。在一些方面，TIL是从受试者的肿瘤样品获得。在一些方面，在促进TIL从肿瘤组织逃逸、TIL增殖和/或TIL扩增的条件下培养肿瘤样品或其部分。在一些方面，用于促进TIL逃逸、增殖和/或扩增的培养基是本文所公开的任何代谢重编程培养基，例如高血钾性培养基。
如本文所用的细胞“群”是指一个以上的细胞(例如多个细胞)的集合。在一些方面，细胞群包含一个以上的TIL，例如多个TIL。在一些方面，细胞群包含含有多种类型的细胞的细胞异质混合物，例如TIL和除TIL以外的细胞的异质混合物。
TIL包括(但不限于)CD8+T细胞(即细胞毒性T细胞)、CD4+T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。TIL包括原代TIL(例如从患者组织样品获得)和次代TIL(例如已从原代TIL培养、扩增或增殖的TIL细胞群)。在一些方面，TIL进行基因修饰。在一些方面，TIL是CD8+T细胞。CD8+TIL通常视为负责破坏癌细胞的TIL亚群。相反，CD4+TIL通常视为用作免疫反应的抑制剂，其可限制针对肿瘤的免疫反应。
在一些方面，TIL可使用细胞表面标记物进行生物化学定义。TIL通常可通过表达以下生物标记物中的一者或多者来分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45RA、CD95、PD-1和CD25。在一些方面，TIL可根据其浸润肿瘤和选择性杀伤癌细胞的能力进行功能定义。
如本文所用的术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的且是指由胸腺产生或处理的任何淋巴细胞。T细胞的非限制性类别包括效应T细胞(例如CD8+T细胞)和Th细胞(例如CD4+T细胞)。在一些方面，免疫细胞是Th1细胞。在一些方面，免疫细胞是Th2细胞。在一些方面，免疫细胞是Tc17细胞。在一些方面，免疫细胞是Th17细胞。在一些方面，免疫细胞是Treg细胞。
如本文所用的术语“记忆”T细胞是指先前遇到过并对其同源抗原有反应(例如，体内、体外或离体)或已用例如抗CD3抗体刺激过(例如，体外或离体)的T细胞。具有“记忆样”表型的免疫细胞(例如TIL)在二次暴露于抗原或刺激时会繁殖或增殖以引起比初次暴露期间快而强的免疫反应。在一些方面，记忆T细胞包括中央记忆T细胞(TCM细胞)、效应记忆T细胞(TEM细胞)、组织驻留记忆T细胞(TRM细胞)、干细胞样记忆T细胞(TSCM细胞)或它们的任何组合。
如本文所用的术语“干细胞样(stem-like)”或“干细胞样(stemcell-like)”是指细胞自我更新的性质或能力，并具有产生和复原记忆和效应T细胞亚组的整个系列的多能能力。在一些方面，干细胞样细胞可通过细胞表达的特异性标记物来测量。在一些方面，那些干细胞样标记物可以是CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+和TCF7+中的一者或多者。在一些方面，干细胞样细胞可通过转录组分析、例如使用本文所公开的干性基因签名来鉴别。在一些方面，效应物样标记物包括Krishna等人，Science370:1328-34(2020年12月11日)；和/或Galletti等人，Nature Immunology(2018年10月)中所公开的标记物，所述文献中每一者的全文皆以引用的方式并入本文中。
如本文所用的术语“干细胞样记忆T细胞”、“T记忆干细胞”或“TSCM细胞”是指表达CD95、CD45RA、CCR7和CD62L并被赋予干细胞样自我更新能力和复原记忆和效应T细胞亚组的整个系列的多能能力的记忆T细胞。
如本文所用的术语“中央记忆T细胞”或“TCM细胞”是指表达CD45RO、CCR7和CD62L的记忆T细胞。中央记忆T细胞通常发现于淋巴结内和外周循环中。
如本文所用的术语“效应物样”或“效应细胞样”是指肿瘤细胞杀伤能力和细胞因子多功能性，例如细胞产生发炎细胞因子和/或细胞毒性分子的能力。在一些方面，效应物样细胞可通过细胞表达的特异性标记物来测量。在一些方面，那些效应物样标记物可以是pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+中的一者或多者。在一些方面，效应物样标记物包括选自由以下组成的组的STAT靶：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2和它们的任何组合。在一些方面，效应物样细胞可通过转录组分析来鉴别。在一些方面，效应物样标记物包括Kaech等人，Cell 111:837-51(2002)；Tripathi等人，J.Immunology185:2116-24(2010)；和/或Johnnidis等人，ScienceImmunology6:eabe3702(2021年1月15日)中所公开的标记物，所述文献中每一者的全文皆以引用的方式并入本文中。
在一些方面，效应物样细胞是使用Gattinoni,L.等人，Nat Med17(10):1290-97(2011)中所述的效应物相关基因集来表征。在一些方面，效应物样细胞的基因签名包括一个或多个选自以下的基因：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMI、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、KLRB1和它们的任何组合(参见例如Gattinoni,L.等人，Nat Med 17(10):1290-97(2011)。
如本文所用的术语“效应记忆T细胞”或“TEM细胞”是指表达CD45RO但不表达CCR7和CD62L的记忆T细胞。由于效应记忆T细胞缺少淋巴结归巢受体(例如CCR7和CD62L)，故这些细胞通常发现于外周循环和非淋巴组织中。
如本文所用的术语“组织驻留记忆T细胞”或“TRM细胞”是指不进行循环并保持驻留于外周组织(例如皮肤、肺和胃肠道)中的记忆T细胞。在一些方面，组织驻留记忆T细胞也是效应记忆T细胞。
如本文所用的术语“原初T细胞”、“TN细胞”或“原初TIL”是指表达CD45RA、CCR7和CD62L、但不表达CD95的T细胞和/或TIL。这些细胞代表T细胞谱系中分化程度最低的细胞。原初T细胞与抗原呈递细胞(APC)之间的相互作用诱导原初T细胞向激活TEFF细胞分化并诱导免疫反应。
如本文所用的术语“片段化”、“片段”和“片段化的”阐述了破坏肿瘤的工艺，包括机械片段化方法，例如破碎、切割、分裂和粉碎肿瘤组织以及破坏肿瘤组织的物理结构的任何其它方法。
如本文所用的术语“培养”是指离体和/或体外细胞的受控生长。如本文所用的“培养”包括细胞(例如TIL)在细胞扩增期间的生长。在一些方面，所培养细胞是从受试者(例如人类受试者)获得。在一些方面，所培养细胞包含从人类受试者获得的TIL。在一些方面，培养包括将肿瘤样品或肿瘤片段放置于本文所公开的培养基中，其中培养基促进TIL从肿瘤样品逃逸和TIL扩增。在一些方面，TIL在培养之前进行分离或纯化。在一些方面，细胞培养意图扩增所培养细胞的数量，例如以增加细胞的增殖。
如本文用于TIL的“扩增(expand)”或“扩增(expansion)”是指刺激或激活细胞和培养细胞的过程。扩增过程可在刺激或激活和培养细胞后引起所培养细胞群中期望细胞的比例或总数增加，例如TIL的比例或总数增加。扩增无需所培养细胞群中的所有细胞类型的数量增加。相反，在一些方面，仅所培养细胞群中的细胞亚组的数量在扩增期间增加，而其它细胞类型的数量可能无变化或可能减少。
如本文所用的术语“产量”是指培养方法后的细胞总数或其一部分。在一些方面，术语“产量”是指特定细胞群，例如TIL群体中的干细胞样TIL。产量可使用任何方法来测定，包括(但不限于)基于代表性样品估计产量。
如本文所用的术语“干细胞样”、“干细胞样”或“低分化”是指表达与更原初表型一致的标记物的细胞，例如免疫细胞(例如TIL)。举例来说，低分化TIL可表达TN或TSCM细胞所特有的一种或多种标记物。在一些方面，“低分化”或“干细胞样”TIL表达CD45RA、CCR7和CD62L。在一些方面，“低分化”或“干细胞样”TIL表达CD45RA、CCR7和CD62L，并且是CD45RO低。在一些方面，“低分化”或“干细胞样”免疫细胞(例如TIL)表达CD45RA、CCR7和CD62L，并且不表达CD45RO。在一些方面，“低分化”或“干细胞样”T细胞表达CD45RA、CCR7、CD62L和TCF7。在一些方面，本文所公开的方法促进具有低分化表型的细胞(例如TIL)的生长和/或增殖。不受限于任何特定机制，在一些方面，本文所公开的方法阻断、抑制或限制低分化细胞(例如TIL)的分化，从而增加培养物中干细胞样细胞的数量。举例来说，通常认为，为了有效地控制肿瘤，具有干细胞样记忆或中央记忆表型的低分化TIL的过继性转移是优选的。参见例如Gattinoni,L.等人，J.Clin.Invest.115:1616-1626(2005)；Gattinoni,L.等人，Nat Med15(7):808-814(2009)；Lynn,R.C.等人，Nature 576(7786):293-300(2019)；Gattinoni,L.等人，J.Clin.Invest.115:1616-1626(2005)；Gattinoni,L.等人，Nat Med 15(7):808-814(2009)；和Gattinoni,L.等人，Nat Med 17(10):1290-1297(2011)。
干性的特征在于自我更新的能力、多能性和增殖潜能的持久性。在一些方面，干性的特征在于特定基因签名，例如跨大量基因的组合表达模式。在一些方面，基因签名包含一个或多个选自以下的基因：ACTN1、DSC1、TSHZ2、MYB、LEF1、TIMD4、MAL、KRT73、SESN3、CDCA7L、LOC283174、TCF7、SLC16A10、LASS6、UBE2E2、IL7R、GCNT4、TAF4B、SULT1B1、SELP、KRT72、STXBP1、TCEA3、FCGBP、CXCR5、GPA33、NELL2、APBA2、SELL、VIPR1、FAM153B、PPFIBP2、FCER1G、GJB6、OCM2、GCET2、LRRN1、IL6ST、LRRC16A、IGSF9B、EFHA2、LOC129293、APP、PKIA、ZC3H12D、CHMP7、KIAA0748、SLC22A17、FLJ13197、NRCAM、C5orf13、GIPC3、WNT7A、FAM117B、BEND5、LGMN、FAM63A、FAM153B、ARHGEF11、RBM11、RIC3、LDLRAP1、PELI1、PTK2、KCTD12、LMO7、CEP68、SDK2、MCOLN3、ZNF238、EDAR、FAM153C、FAAH2、BCL9、C17orf48、MAP1D、ZSWIM1、SORBS3、IL4R、SERPINF1、C16orf45、SPTBN1、KCNQ1、LDHB、BZW2、NBEA、GAL3ST4、CRTC3、MAP3K1、HLA-DOA、RAB43、SGTB、CNN3、CWH43、KLHL3、PIM2、RGMB、C16orf74、AEBP1、SNORD115-11、SNORD115-11、GRAP和它们的任何组合(参见例如Gattinoni(2011))。在一些方面，基因签名包含一个或多个选自以下的基因：NOG、TIMD4、MYB、UBE2E2、FCER1G、HAVCR1、FCGBP、PPFIBP2、TPST1、ACTN1、IGF1R、KRT72、SLC16A10、GJB6、LRRN1、PRAGMIN、GIPC3、FLNB、ARRB1、SLC7A8、NUCB2、LRRC7、MYO15B、MAL、AEBP1、SDK2、BZW2、GAL3ST4、PITPNM2、ZNF496、FAM117B、C16orf74、TDRD6、TSPAN32、C18orf22、C3orf44、LOC129293、ZC3H12D、MLXIP、C7orf10、STXBP1、KCNQ1、FLJ13197、LDLRAP1、RAB43、RIN3、SLC22A17、AGBL3、TCEA3、NCRNA00185、FAM153B、FAM153C、VIPR1、MMP19、HBS1L、EEF2K、SNORA5C、UBASH3A、FLJ43390、RP6-213H19.1、INPP5A、PIM2、TNFRSF10D、SNRK、LOC100128288、PIGV、LOC100129858、SPTBN1、PROS1、MMP28、HES1、CACHD1、NSUN5C、LEF1、TTTY14、SNORA54、HSF2、C16orf67、NSUN5B、KIAA1257、NRG2、CAD、TARBP1、STRADB、MT1F、TMEM41B、PDHX、KDM6B、LOC100288322、UXS1、LGMN、NANOS2、PYGB、RASGRP2、C14orf80、XPO6、SLC24A6、FAM113A、MRM1、FBXW8、NDUFS2、KCTD12和它们的任何组合(参见例如Gattinoni,L.等人，Nat Med17(10):1290-1297(2011)或Galletti等人，Nat Immunol 21,1552-1562(2020))。
在延长抗原暴露存在下，例如在许多癌症中，更高分化的免疫细胞(例如效应T细胞和效应记忆T细胞)通常被耗竭并失去其抗肿瘤功能。生物标记物(例如T细胞标记物)可使用任何方法来测量。在一些方面，T细胞是使用抗体染色、然后通过设门流式细胞术来鉴别。
如本文所用的术语“克隆型”是指具有源自TCRα或TCRβ重排的独特DNA序列的T细胞群。独特的可变α链(VA)序列可与一条以上的可变β链(VB)序列配对。相反，独特VB序列可与一条以上的VA序列配对。
如本文所用的术语“张力”是指穿过细胞膜的有效渗透压梯度的量度。张力可基于溶液中钾离子和氯化钠(NaCl)的水平来测量或计算。在本文中，张力计算为钾离子(K+)的浓度和氯化钠(NaCl)的浓度的和乘以2。张力可以用溶液(例如培养基)的渗透压来表示。如本文所用，当培养基中溶质的浓度等效于细胞内溶质的浓度时，溶液(例如培养基)视为“等渗”。如本文所用的等渗培养基具有约280mOsm/L的渗透压(例如([K+]+[NaCl])×2＝280)。
如本文所用，如果溶液中溶质的浓度低于细胞中溶质的浓度，则溶液(例如培养基)视为“低渗”。如本文所用的低渗溶液具有小于280mOsm/L的张力(例如([K+]+[NaCl])×2<280)。在一些方面，本文所述的低渗培养基具有约240mOsm/L或约250mOsm/L的渗透压。在一些方面，低渗培养基具有至少约220mOsm/L到小于约280mOsm/L的张力。在一些方面，低渗培养基具有至少约230mOsm/L到小于约280mOsm/L的张力。在一些方面，低渗培养基具有至少约240mOsm/L到小于约280mOsm/L的张力。在一些方面，本文所述的低渗培养基具有约250mOsm/L的张力(例如([K+]+[NaCl])×2＝250)。
如本文所用，如果溶液中溶质的浓度高于细胞中溶质的浓度，则溶液(例如培养基)视为“高渗”。如本文所用的高渗溶液具有大于300mOsm/L的渗透压(例如([K+]+[NaCl])×2>280)。在一些方面，本文所述的高渗培养基具有约320mOsm/L的渗透压。在某些方面，通过增加或减小一种或多种溶质的浓度来调整溶液(例如培养基)的张力，所述一种或多种溶质选自钾离子、钠离子、葡萄糖和它们的任何组合。在一些方面，溶液(例如培养基)的张力是通过增加或减小钾离子和NaCl的浓度来调整。在一些方面，培养基的张力可通过用第二溶质的减少抵消一种溶质的增加来维持。举例来说，增加培养基中钾离子的浓度而不改变钠离子的浓度可增加培养基的张力。然而，如果增加钾离子的浓度并减小钠离子的浓度，则可维持原始培养基的张力。如本文所用，培养基的张力是通过钾浓度和NaCl浓度的和乘以2来定义。参见例如表2。
如本文所用的术语“钾”、“钾离子”、“钾阳离子”和“K+”可互换使用，是指元素钾。元素钾以正离子存在于溶液中。然而，所属领域的技术人员将容易明了，制备包含钾离子的溶液的标准方法包括将含钾盐(例如KCl)稀释到溶液中。因此，包含摩尔(M)浓度钾离子的溶液(例如培养基)可阐述为包含等摩尔(M)浓度的包含钾的盐。
如本文所用的术语“钠离子”和“钠阳离子”可互换使用，是指元素钠。元素钠以单价阳离子存在于溶液中。然而，所属领域的技术人员将容易明了，制备包含钠离子的溶液的标准方法包括将含钠盐(例如NaCl)稀释到溶液中。因此，包含摩尔(M)浓度钠离子的溶液(例如培养基)可阐述为包含等摩尔(M)浓度的包含钠的盐。
如本文所用的术语“钙离子”和“钙阳离子”可互换使用，是指元素钙。元素钙以二价阳离子存在于溶液中。然而，所属领域的技术人员将容易明了，制备包含钙离子的溶液的标准方法包括将含钙盐(例如CaCl2)稀释到溶液中。因此，包含摩尔(M)浓度钙离子的溶液(例如培养基)可阐述为包含等摩尔(M)浓度的包含钙的盐。
如本文所用的术语“高血钾性”(例如“高血钾性培养基”)是指具有增加的钾浓度的培养基。在一些方面，高血钾性培养基包含浓度大于5mM的钾离子。在一些方面，高血钾性培养基包含浓度高于40mM的钾离子。在一些方面，高血钾性培养基包含至少约10mM、至少约15mM、至少约20mM、至少约25mM、至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM、至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM或约100mM的钾离子浓度。如本文所用的术语“代谢重编程培养基(metabolicreprogramming media)”、“代谢重编程培养基(metabolic reprogramming medium)”或“MRM”是指本公开的高血钾性培养基。在某些方面，代谢重编程培养基包含约40mM到约80mMNaCl、约40mM到约90mM KCl、约0.5mM到约2.8mM钙和约10mM到约24mM葡萄糖。在一些方面，代谢重编程培养基还包含约250mOsmol到约340mOsmol的渗透压。
如本文所用的术语“基础”培养基是指补充有本文所公开的一种或多种其它要素(例如钾、钠、钙、葡萄糖、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任何组合)的任何起始培养基。基础培养基可以是用于培养免疫细胞(例如TIL)的任何培养基。在一些方面，基础培养基选自平衡盐溶液(例如PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle's Medium，DMEM)、克里克培养基(Click’s medium)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(Glasgow Minimal Essential Medium，GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良达尔伯克培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)、M199、OPTMIZERTMCTSTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)、OPTMIZERTM完全培养基、IMMUNOCULTTMXF(STEMCELLTMTechnologies)、IMMUNOCULTTMXF、AIM V/TEXMACSTM培养基、TRANSACTTMTIL扩增培养基、TIL快速扩增方案培养基和它们的任何组合。在一些方面，基础培养基是不含血清的。在一些方面，基础培养基包含PRIME-XV T细胞CDM。在一些方面，基础培养基包含OPTMIZERTM。在一些方面，基础培养基包含OPTMIZERTM Pro。在一些方面，基础培养基包含X-VIVOTM 15(LONZA)。在一些方面，基础培养基包含IMMUNOCULTTM。在一些方面，基础培养基包含克里克培养基。在一些方面，基础培养基包含TRANSACTTM TIL扩增培养基。在一些方面，基础培养基包含TIL快速扩增培养基。在一些方面，基础培养基还包含免疫细胞血清替代物(ICSR)。举例来说，在一些方面，基础培养基包括补充有ICSR的OPTMIZERTM完全培养基、补充有ICSR的AIM V、补充有ICSR的IMMUNOCULTTMXF、补充有ICSR的RPMI、补充有ICSR的TEXMACSTM或它们的任何组合。在一些方面，适宜基础培养基包括克里克培养基、培养基、/>T细胞扩增培养基(Sigma-Aldrich)、AIM/>培养基/>培养基(Miltenyi Biotech)、/>培养基(Stem Cell Technologies)、/>T细胞扩增XSFM(Irvine Scientific)、伊斯科夫培养基和/或RPMI-1640培养基。在一些方面，基础培养基包含不含NaCl的CTSTMOPTIMIZERTM。在一些方面，适宜基础培养基包括克里克培养基、培养基、/>T细胞扩增培养基(Sigma-Aldrich)、AIM/>培养基/> 培养基(Miltenyi Biotech)、/>培养基(StemCell Technologies)、/>T细胞扩增XSFM(Irvine Scientific)、伊斯科夫培养基和/或RPMI-1640培养基。在一些方面，基础培养基包含不含NaCl的CTSTMOpTimizerTM。在一些方面，除添加用于控制张力的NaCl外，基础培养基包含一种或多种钠盐，例如与钾离子组合添加的NaCl。
如本文所用的术语“细胞因子”是指对细胞之间的相互作用和通信具有特异性效应的由细胞释放的小分泌蛋白。细胞因子的非限制性实例包括白细胞介素(例如白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15、IL-3、IL-5、IL-6、IL-11、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17、IL-21、IL-23和IL-29)、干扰素(IFN；例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)家族成员和转化生长因子(TGF)家族成员。本公开的一些方面是关于在包含细胞因子的培养基中培养细胞(例如T细胞和/或NK细胞)的方法。本公开的一些方面是关于在包含细胞因子的培养基中培养TIL的方法。本公开的一些方面是关于在包含细胞因子的培养基中扩增TIL的方法。在一些方面，细胞因子是白细胞介素。在一些方面，细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21和它们的组合。IL-2(UniProtKB-P60568)是由T细胞响应抗原或有丝分裂刺激产生。已知IL-2刺激T细胞增殖和调控免疫反应的其它关键活性。IL-7(UniProtKB-P13232)是能够刺激淋巴样祖细胞增殖的造血系统生长因子。认为IL-7在B细胞成熟的某些时期中在增殖中起作用。与IL-2一样，IL-15(UniProtKB-P40933)是刺激T淋巴细胞增殖的细胞因子。IL-21(UniProtKB-Q9HBE4)是具有免疫调控活性的细胞因子。认为IL-21促进先天性免疫与过继性免疫之间的转换并诱导B细胞产生IgG1和IgG3。IL-21还能够在自然杀伤(NK)细胞的增殖和成熟中与IL-15协同起作用，并且IL-21可调控成熟B细胞和T细胞响应激活刺激物的增殖。在与IL-15和IL-18协同作用下，IL-15还刺激T细胞和NK细胞产生干扰素γ，并且IL-21还可在T细胞介导的免疫反应期间抑制树突细胞的激活和成熟。
如本文所用的术语“高于”意指大于但不等于。举例来说，“高于5mM”意指大于5mM、但不包括5mM的任一量。
如本文所用的术语“优先”是指主要结果。举例来说，如果本文所公开的方法优先促进CD8+TIL的扩增，则应理解扩增的主要产物是CD8+TIL。术语“优先”不一定意指100％的例如所得TIL是CD8+，而是该术语表明CD8+TIL扩增的程度大于CD8-TIL。
如本文所用的“施用”是指使用多种方法和递送系统中的任一者将治疗剂或包含治疗剂的组合物物理引入受试者。本文所述的治疗剂(例如如本文所述培养的TIL)的不同施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。
如本文所用的片语“肠胃外施用”意指除肠和局部施用外的施用模式，通常通过注射，并且包括(但不限于)静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心内、真皮内、经气管、气管内、肺、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、心室内、玻璃体内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。
替代地，本文所述的治疗剂(例如如本文所述培养的TIL)可经由非肠胃外途径、例如局部、表皮或粘膜施用途径、例如鼻内、经口、经阴道、经直肠、舌下或局部来施用。施用还可以实施例如一次、多次和/或在一个或多个延长时段内实施。
如本文所用的术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质，例如蛋白质、肽或半抗原。如本文所用的术语“同源抗原”是指免疫细胞(例如TIL)识别并由此诱导免疫细胞激活(例如触发诱导效应功能、例如细胞因子产生和/或细胞增殖的胞内信号)的抗原。
“癌症”是指特征在于异常细胞在体内不受控生长的一大组各种疾病。失调的细胞分裂和生长可形成恶性肿瘤，其侵入邻近组织并且还会通过淋巴系统或血流转移到身体的远端部分。如本文所用的“癌症”是指原发性、转移性和复发性癌症。
术语“恶性血液病”或“血液癌”是指哺乳动物造血和淋巴组织癌症和肿瘤。恶性血液病的非限制性实例包括侵袭血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统组织的那些恶性血液病，包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CIVIL)、急性单核细胞白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)和非霍奇金淋巴瘤。恶性血液病又称为“液体肿瘤”。液体肿瘤癌症包括(但不限于)白血病、骨髓瘤和淋巴瘤以及其它恶性血液病。从液体肿瘤获得的TIL在本文中又可称为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
如本文所用的“实体瘤”是指异常组织团块。实体瘤可以是良性或恶性的。实体瘤的非限制性实例包括肉瘤、癌瘤和淋巴瘤，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持基质细胞，其中癌细胞是分散的，并且可提供支持微环境。
如本文所用的术语“免疫反应”是指脊椎动物内对外源剂的生物反应，所述反应保护有机体抵抗这些剂和由其引起的疾病。免疫反应是通过免疫系统细胞(例如T淋巴细胞(例如TIL)、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和由这些细胞中的任一者或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用来调介，所述作用可选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或从脊椎动物的身体消除侵入性病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性或其它异常细胞或在自身免疫或病理性炎症的情形下正常人的细胞或组织。免疫反应包括例如激活或抑制T细胞，例如效应T细胞或Th细胞，例如CD4+或CD8+TIL，或抑制Treg细胞。如本文所用的术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的，是指由胸腺产生或处理的任何淋巴细胞。在一些方面，TIL是CD8+TIL。在一些方面，TIL是CD4+TIL。
如本文所用的术语“抗肿瘤免疫反应”是指针对肿瘤抗原的免疫反应。
“受试者”包括任何人或非人动物，术语“非人动物”包括(但不限于)脊椎动物，例如非人类灵长类动物、绵羊、狗和啮齿类动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠。在一些方面，受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。如本文所用的片语“有需要的受试者”包括将受益于例如施用如本文所述培养的免疫细胞(例如TIL)以控制肿瘤生长的受试者，例如哺乳动物受试者。
术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指提供期望生物、治疗和/或预防结果的剂(例如如本文所述培养的TIL)的量。该结果可以是减少、改善、缓和、减弱、延迟和/或减轻疾病的一个或多个征象、症状或病因或生物系统的任何其它期望变化。关于实体瘤，有效量包含足以引起肿瘤皱缩和/或足以减小肿瘤生长速率(例如抑制肿瘤生长)或足以防止或延迟其它不希望细胞增殖的量。在一些方面，有效量是足以延迟肿瘤发展的量。在一些方面，有效量是足以防止或延迟肿瘤复发的量。有效量可以一次或多次施用来施用。
组合物(例如如本文所述培养的细胞)的有效量可例如(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)抑制、延迟、在一定程度上减缓并且可停止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即在一定程度上减缓并且可停止肿瘤转移)；(v)抑制肿瘤生长；(vi)防止或延迟肿瘤发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。
在一些方面，“治疗有效量”是在临床上证实实现癌症的显著减少或减缓癌症(例如晚期实体瘤)的进展(消退)的本文所公开组合物(例如如本文所述培养的T细胞)的量。本公开的治疗剂(例如如本文所述培养的T细胞)促进疾病消退的能力可使用所属领域的技术人员已知的多种方法来评估，例如在人类受试者中在临床试验期间、在预测人中的功效的动物模型系统中或通过在体外测定中测定剂的活性。
关于治疗的术语“有效”和“有效性”包括药理学有效性和生理学安全性二者。药理学有效性是指本文所公开的组合物(例如如本文所述培养的细胞)促进患者的癌症消退的能力。生理学安全性是指源自施用本文所公开的组合物(例如如本文所述培养的细胞)的在细胞、器官和/或有机体层级上的毒性或其它不良生理学效应(不良效应)的水平。
如本文所用的术语“肿瘤反应性”是指免疫细胞(例如TIL)靶向和杀伤肿瘤细胞的能力。如本文所用的术语“肿瘤特异性”是指特异性靶向肿瘤细胞的肿瘤反应性免疫细胞，例如TIL。
如本文所用的术语“T细胞受体”或“TCR”是指由2条不同的跨膜多肽链构成的异二聚体：α链和β链，其各自是由恒定区和可变区组成，所述恒定区将链锚定于T细胞表面膜内，所述可变区识别并结合到由MHC呈递的抗原。TCR复合物与6条多肽缔合形成2种异二聚体CD3γε和CD3δε和1种同二聚体CD3ζ，其一起形成CD3复合物。T细胞受体进行工程化的T细胞疗法利用保持这些复合物特异性靶向由特定肿瘤细胞表达的抗原的T细胞修饰。如本文所用的术语“TCR”包括天然TCR和工程化的TCR。
如本文所用的术语“ug”和“uM”可分别与“μg”和“μΜ”互换使用。
本文所述的各个方面进一步详细阐述于以下子部分中。
II.本公开的方法
本公开涉及离体或体外培养免疫细胞(例如TIL)的方法。在一些方面，本公开的方法包括在培养条件中培养免疫细胞(例如TIL)或将其放置于培养条件中，其中培养(例如某些离子浓度、培养基张力、细胞因子和或它们的任何组合)能够增强CD8+TIL的扩增。在一些方面，培养(例如某些离子浓度、培养基张力、细胞因子和或它们的任何组合)能够减少、限制或防止免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL和/或CD4+TIL)分化，由此影响或改良其在细胞疗法中的用途。在一些方面，本公开包括在高钾浓度代谢重编程培养基中培养TIL。令人惊奇地发现，与使用较低钾水平(例如小于约40mM钾离子，例如5mM钾离子)的常规方法相比，增加的钾与具有增加的干细胞样标记物表达和增加的克隆多样性的增加的CD8+TIL扩增相关联，同时维持肿瘤反应性(例如肿瘤特异性)。另外，尽管超高钾浓度(例如>80mM、>90mM或>100mM)会减少TIL扩增，但本文所述的方法在培养条件(例如持续时间)后产生治疗有效数量的TIL，与常规方法一致。
使用免疫治疗策略已展示在治疗某些类型的晚期癌症方面有相当大的临床功效。免疫检查点阻断(ICB)在患有转移性黑色素瘤的患者中可产生客观的且有时耐久的反应。某些结肠癌、肺癌患者和小比例的患有其它恶性病的患者队列也可受益于ICB。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已在患有血细胞恶性病、最显著地可用CD19或B细胞成熟抗原(BCMA)CAR靶向的B细胞谱系肿瘤的患者中调介显著的临床反应。用经识别共用非突变肿瘤抗原(例如NY-ESO-1)的T细胞受体(TCR)转导的T细胞治疗也可在表达TCR匹配的人类白细胞抗原(HLA)的患者中调介临床反应。然而，尽管取得这些显著的成功，但绝大多数患有晚期癌症的患者仍无法受益于免疫疗法治疗并最终将屈服于其疾病。
TIL疗法还显示了在调介患有晚期癌症的患者的临床反应方面的潜能。新的证据已证实，TIL是由肿瘤反应性细胞和非特异性旁观细胞构成的异质群体。这一异质TIL群体在TIL疗法中产生困难和不希望效应和/或稀释TIL疗法的功效，这是因为异质群体中的非特异性旁观细胞并非优选的。旁观细胞是非特异性T细胞，其可稀释反应性TIL的多样性。旁观细胞包括识别与肿瘤无关的表位的TIL。另外，TIL疗法的功效已在患有黑色素瘤、晚期宫颈癌、肺癌、乳腺癌和/或胃肠癌的患者中展示多种反应。
在一些方面，本公开提供了用于体内疗法的离体或体外减少TIL群体的异质性的方法。在一些方面，本文所公开的方法富集特定类型的TIL群体，例如CD8+TIL和/或肿瘤反应性CD8+TIL。在一些方面，本文所公开的方法富集干细胞样T细胞群，例如干细胞样肿瘤反应性TIL和/或干细胞样肿瘤反应性CD8+TIL。
不受限于任何理论，本公开阐述了使用高血钾性培养基富集具有特定细胞类型的TIL群体(即肿瘤反应性TIL、CD8+TIL、肿瘤反应性CD8+TIL、干细胞样肿瘤反应性TIL、干细胞样CD8+TIL和/或干细胞样肿瘤反应性CD8+TIL)的方法。因此，本公开的一些方面是关于离体或体外培养TIL的方法，所述方法包括将异质TIL群体放置于包含浓度高于40mM的钾离子的高血钾性培养基中。在一些方面，异质TIL群体在放置于高血钾性培养基中后富集CD8+TIL。
本公开的一些方面是关于增加CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL，例如肿瘤特异性CD8+TIL)的数量或百分比的离体或体外方法，所述方法包括在包含浓度为至少5mM的钾离子的高血钾性培养基中培养异质TIL群体。本公开的其它方面是关于制备CD8+富集(例如肿瘤反应性CD8+富集)的TIL群体的方法，所述方法包括在包含浓度为至少5mM的钾离子的高血钾性培养基中离体或体外培养异质TIL群体。
本公开的一些方面是关于增加肿瘤反应性TIL的数量或百分比的离体或体外方法，所述方法包括在包含浓度为至少5mM的钾离子的高血钾性培养基中培养异质TIL群体。本公开的其它方面是关于制备肿瘤反应性富集的TIL群体的方法，所述方法包括在包含浓度为至少5mM的钾离子的高血钾性培养基中离体或体外培养异质TIL群体。
本公开的一些方面是关于增加干细胞样TIL(例如干细胞样肿瘤反应性TIL、干细胞样CD8+TIL或干细胞样肿瘤反应性CD8+TIL)的数量或百分比的离体或体外方法，所述方法包括在包含浓度为至少5mM的钾离子的高血钾性培养基中培养异质TIL群体。本公开的其它方面是关于制备富集干细胞样TIL(例如干细胞样肿瘤反应性TIL、干细胞样CD8+TIL或干细胞样肿瘤反应性CD8+TIL)的TIL群体的方法，所述方法包括在包含浓度为至少5mM的钾离子的高血钾性培养基中离体或体外培养异质TIL群体。
在一些方面，与在对照条件(例如在包含浓度小于约5mM的钾离子的培养基中)下培养的TIL相比，本文所公开的方法和/或组合物增加培养物中TIL的克隆多样性。
克隆多样性可使用任何方法来评价。在一些方面，克隆多样性是使用根据本文所公开的方法培养的TIL亚组来评价。评价TIL群体的克隆多样性的方法的非限制性实例可参见例如Venturi等人，J.Immunolog.Mtd.321:182-95(2007)，其全文皆以引用的方式并入本文中。在一些方面，克隆多样性是使用(ADAPTIVE)来评价。在一些方面，克隆多样性是使用TCR深度测序来评价。在某些方面，克隆多样性是通过对从TIL群体分离的总RNA(例如由总RNA制备的cDNA)中的TCRβCDR3序列测序来评价。在一些方面，克隆多样性是使用辛普森克隆性来评价。
在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性与肿瘤样品中TIL的克隆多样性相同。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约99％到约100％、至少约98％到约100％、至少约97％到约100％、至少约96％到约100％、至少约95％到约100％、至少约94％到约100％、至少约93％到约100％、至少约92％到约100％、至少约91％到约100％、至少约90％到约100％、至少约85％到约100％、至少约80％到约100％、至少约75％到约100％、至少约70％到约100％、至少约65％到约100％、至少约60％到约100％、至少约55％到约100％、至少约50％到约100％、至少约45％到约100％或至少约40％到约100％。在某些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约95％到约100％。在某些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约90％到约100％。在某些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约85％到约100％。在某些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约80％到约100％。在某些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约75％到约100％。在某些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约70％到约100％。在某些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约60％到约100％。在某些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约50％到约100％。在某些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约40％到约100％。
在一些方面，克隆多样性是使用辛普森克隆性(√∑pi2，其中pi是给定样品中克隆i的比例丰度)来评价。辛普森克隆性常用于评价样品内的生产性重排，由此测量克隆频率分布的量级(参见例如Venturi等人，J.Immunol.Meth.321:182-95(2007)，其全文以引用的方式并入本文中)。辛普森克隆性的值介于0到1范围内，其中值接近1代表克隆多样性较低且因此更单克隆的TIL群体。
在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.5、小于约0.45、小于约0.4、小于约0.35、小于约0.3、小于约0.275、小于约0.25、小于约0.225、小于约0.2、小于约0.175、小于约0.15、小于约0.125、小于约0.1、小于约0.075、小于约0.07、小于约0.06或小于约0.05。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.5。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.4。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.3。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.275。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.25。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.24。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.23。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.22。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.21。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.2。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.19。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.18。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.17。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.16。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.15。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.14。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.13。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.12。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.11。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.1。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.09。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.08。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.07。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.06。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，根据本文所公开的方法培养的TIL的克隆多样性的克隆多样性评分小于约0.05。
在一些方面，本公开包括扩增从人类受试者获得的TIL的方法，所述方法包括：
a.在初始TIL培养基中培养TIL(“初始TIL培养”)；
b.在二次TIL培养基中培养TIL(“第二TIL培养”)；和
c.在第三(或最终)TIL培养基中培养TIL(“最终TIL培养”)，
其中初始TIL培养基、二次TIL培养基和/或第三TIL培养基是高血钾性的。在一些方面，最终TIL培养还包括T细胞刺激或激活。在一些方面，第二TIL培养还包括T细胞刺激或激活。
在一些方面，本公开包括扩增从人类受试者获得的TIL的方法，所述方法包括：
a.在初始TIL培养基中培养TIL(“初始TIL培养”)；和
b.在二次TIL培养基中扩增TIL(“第二TIL扩增”)；
其中初始TIL培养基和/或二次TIL培养基是高血钾性的。
在一些方面，本公开包括扩增从人类受试者获得的TIL的方法，所述方法包括：
a.在初始TIL培养基中培养TIL(“初始TIL培养”)；
b.在二次TIL培养基中扩增TIL(“第二TIL扩增”)；和
c.在第三(或最终)TIL培养基中扩增TIL(“最终TIL扩增”)，
其中初始TIL培养基、二次TIL培养基和/或第三TIL培养基是高血钾性的。
在一些方面，仅初始TIL培养基是高血钾性的。在一些方面，仅二次TIL培养基是高血钾性的。在一些方面，初始TIL培养基和二次TIL培养基皆是高血钾性的。在一些方面，初始TIL培养基和二次TIL培养基是高血钾性的且第三TIL培养基不是高血钾性的。在一些方面，初始TIL培养基还包含IL-2、IL-21或二者。在一些方面，初始TIL培养物、二次TIL培养物和第三或最终TIL培养物包含IL-2，含或不含IL-21。
在一些方面，初始TIL培养基、二次TIL培养和/或第三或最终TIL培养物还包含T细胞补充物、血清替代物、谷氨酰胺、谷氨酰胺取代物(例如Glutamax(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺))、非必需氨基酸、抗生素(例如青霉素、链霉素或二者)、抗真菌剂(例如FUNGINTM)和/或丙酮酸钠。
在一些方面，将TIL在初始TIL培养基中培养长达约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天或约19天。在一些方面，将TIL在初始TIL培养基中培养约14天到约19天。
在一些方面，在(b)中用二次TIL培养基中的CD3激动剂、CD28激动剂或二者刺激第二TIL培养中的TIL。在一些方面，用二次TIL培养基中的CD27配体进一步刺激第二TIL培养中的TIL。在一些方面，用二次TIL培养基中的4-1BB配体进一步刺激第二TIL培养中的TIL。
在一些方面，在刺激或激活后，将第二TIL扩增中的TIL培养至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天。
在一些方面，在刺激或激活后，将第二TIL扩增中的TIL培养约6天到约12天、约7天到约11天、约7天到约10天、约8天到约12天。
在一些方面，在第二刺激或激活后，将第三或最终TIL扩增中的TIL培养至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天。
在一些方面，在第二刺激或激活后，将第三或最终TIL扩增中的TIL培养约7天到约14天、约7天到约12天、约7天到约11天、约8天到约14天、约8天到约13天、约8天到约12天。
本公开还提供了在本文所公开的代谢重编程培养基、本文所公开的细胞培养物或本文所公开的细胞袋或生物反应器中培养TIL作为初始TIL培养物。在一些方面，将初始TIL培养物培养维持至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天。在一些方面，将初始TIL培养物培养维持14天到约19天。
本发明方法可进一步发展成二次TIL扩增。为了开始二次TIL扩增，用CD3激动剂和/或CD28激动剂(例如TRANSACTTM)刺激或激活TIL。在一些方面，用CD27配体进一步刺激培养基中的TIL。在一些方面，用4-1BB配体进一步刺激培养基中的TIL。在一些方面，将第二TIL扩增维持至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天。在一些方面，将二次TIL扩增培养维持约7天(约1周)。
在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约1×107到至少约50×107个、至少约2×107到至少约40×107个、至少约3×107到至少约30×107个、至少约4×107到至少约25×107个、至少约5×107到至少约20×107个、至少约1×107到至少约20×107个、至少约2×107到至少约20×107个、至少约3×107到至少约20×107个或至少约4×107到至少约20×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约5×107到至少约20×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约1×107个、至少约2×107个、至少约3×107个、至少约4×107个、至少约5×107个、至少约6×107个、至少约7×107个、至少约8×107个、至少约9×107个、至少约10×107个、至少约11×107个、至少约12×107个、至少约13×107个、至少约14×107个、至少约15×107个、至少约16×107个、至少约17×107个、至少约18×107个、至少约19×107个或至少约20×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约5×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约6×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约7×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约8×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约9×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约10×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约15×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约20×107个细胞。
二次TIL扩增后，可在最终扩增阶段进一步扩增TIL。为了开始最终TIL扩增，将TIL从第二TIL扩增培养物转移到对照培养基(即非高血钾性培养基)。在开始最终TIL扩增培养时，用CD3激动剂和/或CD28激动剂(例如TRANSACTTM)进一步刺激TIL。在一些方面，用CD27配体进一步刺激培养基中的TIL。在一些方面，用4-1BB配体进一步刺激培养基中的TIL。
在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约1×107到至少约50×107个、至少约2×107到至少约40×107个、至少约3×107到至少约30×107个、至少约4×107到至少约25×107个、至少约5×107到至少约20×107个、至少约1×107到至少约20×107个、至少约2×107到至少约20×107个、至少约3×107到至少约20×107个或至少约4×107到至少约20×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约5×107到至少约20×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约1×107个、至少约2×107个、至少约3×107个、至少约4×107个、至少约5×107个、至少约6×107个、至少约7×107个、至少约8×107个、至少约9×107个、至少约10×107个、至少约11×107个、至少约12×107个、至少约13×107个、至少约14×107个、至少约15×107个、至少约16×107个、至少约17×107个、至少约18×107个、至少约19×107个或至少约20×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约5×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约6×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约7×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约8×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约9×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约10×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约15×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约20×107个细胞。
在一些方面，使TIL经受最终扩增。在一些方面，最终扩增包括刺激。在一些方面，刺激与二次扩增期间所用的刺激相同。在一些方面，在最终扩增期间通过在含或不含4-1BBL和/或CD27L的包含TRANSACTTM的培养基中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在最终扩增期间通过在包含TRANSACTTM和4-1BBL和/或CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在最终扩增期间通过在包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。
在一些方面，在静态GREX中实施最终扩增步骤。在一些方面，在搅拌罐中实施最终扩增。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40×109到至少约100×109个、至少约40×109到至少约90×109个、至少约40×109到至少约80×109个、至少约40×109到至少约70×109个、至少约40×109到至少约60×109个、至少约40×109到至少约50×109个、至少约10×109到至少约100×109个、至少约20×109到至少约100×109个、至少约30×109到至少约100×109个、至少约30×109到至少约50×109个或至少约35×109到至少约45×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40×109到至少约100×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40×109个、至少约45×109个、至少约50×109个、至少约55×109个、至少约60×109个、至少约65×109个、至少约70×109个、至少约75×109个、至少约80×109个、至少约85×109个、至少约90×109个、至少约95×109个或至少约100×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约50×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约60×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约70×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约80×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约90×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约100×109个细胞。
在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约7天到至少约21天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约7天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约8天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约9天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约10天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约11天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约12天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约13天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约14天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约15天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约16天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约17天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约18天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约19天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约20天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约21天。
在一些方面，高血钾性培养基不是低渗的。在一些方面，高血钾性培养基不是等渗的。在一些方面，高血钾性培养基不是高渗的。
在一些方面，异质TIL群体包含CD4+TIL和CD8+TIL。在一些方面，异质TIL群体从获自受试者的一个或多个肿瘤样品获得。从受试者获得的任何肿瘤样品可用于本文所公开的方法中。在一些方面，肿瘤样品包含肿瘤活体组织切片。在一些方面，肿瘤活体组织切片包含钻孔活体组织切片。在一些方面，肿瘤样品包含在肿瘤切除手术期间获得的肿瘤组织。在一些方面，肿瘤样品包含空芯针活体组织切片。在一些方面，肿瘤样品是从发炎肿瘤(例如包含大量TIL的肿瘤)收集。
在一些方面，将肿瘤样品平铺并经受初始TIL培养。在一些方面，初始TIL培养包括在代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)中培养肿瘤样品。从肿瘤样品扩增TIL的任何方法皆可用于本文所公开的方法中。在一些方面，在平铺和初始TIL培养之前将肿瘤样品分级分离。在一些方面，初始TIL培养持续至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天或至少约28天。在一些方面，初始TIL培养持续至少约14天到约19天。在一些方面，初始TIL培养持续至少约14天。
在一些方面，与初始TIL培养前CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL和/或干细胞样CD8+TIL)对非CD8+TIL的比例相比，在初始TIL培养后CD8+TIL对非CD8+TIL的比例增加。在一些方面，CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL和/或干细胞样CD8+TIL)对非CD8+TIL的比例增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍。在一些方面，CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL和/或干细胞样CD8+TIL)对非CD8+TIL的比例增加至少约50倍。
在一些方面，在培养异质TIL群体后，群体中至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的TIL是CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL和/或干细胞样CD8+TIL)。在一些方面，在培养异质TIL群体后，群体中至少约50％的TIL是CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL和/或干细胞样CD8+TIL)。在一些方面，在培养异质TIL群体后，群体中至少约25％的TIL是CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL和/或干细胞样CD8+TIL)。在一些方面，在培养异质TIL群体后，群体中至少约75％的TIL是CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL和/或干细胞样CD8+TIL)。
在一些方面，在初始TIL培养后刺激或激活TIL。在刺激TIL期间可使用扩增和/或刺激TIL的任何方法。在一些方面，在初始TIL培养后刺激TIL。在一些方面，通过使TIL经受TRANSACTTMTIL扩增、TIL快速扩增方案或它们的组合来刺激TIL。在一些方面，在本文所公开的高血钾性培养基中刺激TIL。
在一些方面，相对于使用常规方法(例如在具有小于约40mM钾离子的培养基中)培养的细胞群，使用本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的干细胞样TIL数量。在一些方面，相对于起始细胞群，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))展现增加的干细胞样细胞所特有的标记物表达。在一些方面，起始细胞群包含从人类受试者获得的细胞。在一些方面，起始细胞群包含从人类受试者获得的TIL。
增加的细胞多能性可使用任何方法来测量。在一些方面，细胞干性是通过抗体染色、然后通过设门流式细胞术来测量。在一些方面，细胞干性是通过自噬通量来测量。在一些方面，细胞干性是通过葡萄糖摄取来测量。在一些方面，细胞干性是通过脂肪酸摄取来测量。在一些方面，细胞干性是通过线粒体生物量来测量。在一些方面，细胞干性是通过RNA量化/表达分析(例如微阵列、qPCR(TaqMan)、RNA-Seq.、单细胞RNA-Seq.或它们的任何组合)来测量。在一些方面，细胞干性是通过代谢测定(例如与之关联的转录物)(例如Seahorse代谢测定、胞外酸化率分析(ECAR)；氧消耗速率分析(OCR)；备用呼吸量分析；和/或线粒体膜电位分析)来测量。在一些方面，干性是使用一种或多种体内功能测定(例如测定细胞持久性、抗肿瘤能力、抗肿瘤清除率、病毒清除率、多能性、细胞因子释放、细胞杀伤或它们的任何组合)。
在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))的分化状态的特征在于增加的表达低分化细胞典型标记物的细胞数。在一些方面，干细胞样免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数增加的特征在于表达TN和/或TSCM细胞的典型标记物的免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数增加。在一些方面，干细胞样免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数增加的特征在于表达TSCM细胞的典型标记物的免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数增加。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的表达CD45RA的免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的表达CCR7的免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，TIL群体展现增加的表达CD62L的免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，TIL群体展现增加的表达CD28的免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的表达CD95的免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))为CD45RO低。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))不表达CD45RO。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的CD8+、CD45RA+、CCR7+和CD62L+免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的CD8+、CD95+、CD45RA+、CCR7+和CD62L+免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的表达TCF7的细胞数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的CD8+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+和TCF7+免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的CD8+、CD95+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+和TCF7+免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))表达CD3。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的CD8+、CD3+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+和TCF7+免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的CD8+、CD3+、CD95+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+、TCF7+免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))表达CD27。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的CD8+、CD27+、CD3+、CD95+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+、TCF7+免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的CD8+、CD27+、CD3+、CD95+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+、TCF7+免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的TSCM细胞数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的TN细胞数。在一些方面，免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))群体展现增加的TSCM和TN细胞数。在一些方面，细胞群展现增加的干细胞样TIL数。
在一些方面，培养物中的干细胞样免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数相对于培养前的干细胞样免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，培养物中的干细胞样免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数相对于培养前的干细胞样免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))数增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍或至少约20倍。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))后，干细胞样CD8+TIL(例如干细胞样肿瘤反应性CD8+TIL)占培养物中CD8+TIL总数的至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL后，干细胞样TIL占培养物中TIL总数的至少约10％到至少约70％。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL后，干细胞样TIL占培养物中CD8+TIL总数的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约70％。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL后，干细胞样TIL占培养物中CD4+TIL总数的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约70％。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL后，培养物中TIL总数的至少约10％到至少约40％是CD39-/CD69-TIL。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL后，培养物中TIL总数的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％或至少约40％是CD39-/CD69-TIL。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL后，培养物中TIL总数的至少约10％到至少约70％是CD39-/TCF7+TIL。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL后，培养物中TIL总数的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％或至少约40％是CD39-/TCF7+TIL。在一些方面，TIL是CD4+T细胞。在一些方面，TIL是CD8+TIL。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如TIL，例如CD8+TIL(例如肿瘤反应性CD8+TIL))的过继性转移后，与使用常规培养条件培养的细胞相比，所转移细胞展现减少的细胞耗竭。在一些方面，在所培养TIL的过继性转移后，与使用常规培养条件培养的TIL相比，所转移的CD8+富集的TIL在体内持续更长时间段。这种增加的持久性是指TIL浸润于肿瘤微环境中并在其中发挥作用的能力、抵抗耗竭的能力以及确保反应的持续扩增和耐久性的干性的持久性。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如T细胞)是干细胞样细胞。这类细胞能够自我更新、增殖和分化。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如T细胞)是还表达效应物样标记物的干细胞样细胞。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的免疫细胞(例如T细胞)是还维持靶向和杀伤肿瘤细胞能力的干细胞样细胞。
在一些方面，与使用常规培养条件培养的TIL相比，所转移的CD8+富集的TIL具有更大的体内功效，例如肿瘤杀伤活性。在一些方面，与使用常规培养条件培养的细胞相比，在受试者中需要更低剂量的根据本文所公开的方法培养的CD8+富集的TIL来引发反应，例如减小的肿瘤体积。
在一些方面，在代谢重编程培养基(例如本文所公开的高血钾性培养基)中培养TIL，历时整个离体培养，例如从首次平铺肿瘤样品的时间到整个扩增过程，并且直到施用。在一些方面，将TIL在本文所公开的培养基中培养扩增的持续时间。
在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)包含线粒体燃料。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)包含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)包含至少约0.1mM、至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约5mM或至少约10mM O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)包含至少约1.0mM O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐。
在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)包含糖酵解介导的代谢的抑制剂，例如激酶抑制剂，例如磷酸肌醇3-激酶抑制剂。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)包含磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂，例如艾德拉尼(idelalisib，例如CAL-101；Selleckchem)。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)包含至少约0.1mM、至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约5mM或至少约10mM艾德拉尼。在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)包含至少约1.0mM艾德拉尼。
在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)还包含以下中的一者或多者：(i)一种或多种细胞扩增剂、(ii)钠离子、(iii)一种或多种糖、(iv)钙离子和(v)一种或多种细胞因子。
II.A.钾
本公开的一些方面是关于离体或体外培养TIL的方法，所述方法包括将异质TIL群体放置于代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)中。本公开的一些方面是关于增加CD8+TIL的数量或百分比的离体或体外方法，所述方法包括在代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)中培养异质TIL群体。本公开的其它方面是关于制备CD8+富集的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体的方法，所述方法包括在代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)中离体或体外培养异质TIL群体。在一些方面，钾离子的浓度为至少约30mM到至少约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM、至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、至少约75mM、至少约80mM、至少约85mM、至少约90mM、至少约95mM或至少约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为至少约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM。在一些方面，钾离子的浓度为约45mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM。
在一些方面，钾离子的浓度为至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、至少约75mM、至少约80mM、至少约85mM、至少约90mM、至少约95mM或至少约100mM、至少约105mM、至少约110mM、至少约115mM、至少约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、约100mM、约105mM、约110mM、约115mM、约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM到约90mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约40mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM到约85mM、约40mM到约80mM、约40mM到约75mM、约40mM到约70mM、约40mM到约65mM、约40mM到约60mM、约40mM到约55mM或约40mM到约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约90mM、约50mM到约85mM、约50mM到约80mM、约50mM到约75mM、约50mM到约70mM、约50mM到约65mM、约50mM到约60mM或约50mM到约55mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约100mM、约50mM到约95mM、约50mM到约90mM、约50mM到约85mM、约50mM到约80mM、约50mM到约75mM、约50mM到约70mM、约50mM到约65mM、约50mM到约60mM或约50mM到约55mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约55mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM到约100mM、约55mM到约95mM、约55mM到约90mM、约55mM到约85mM、约55mM到约80mM、约55mM到约75mM、约55mM到约70mM、约55mM到约65mM或约55mM到约60mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约100mM、约60mM到约95mM、约60mM到约90mM、约60mM到约85mM、约60mM到约80mM、约60mM到约75mM、约60mM到约70mM或约60mM到约65mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约65mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM到约100mM、约65mM到约95mM、约65mM到约90mM、约65mM到约85mM、约65mM到约80mM、约65mM到约75mM或约65mM到约70mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约70mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM到约100mM、约70mM到约95mM、约70mM到约90mM、约70mM到约85mM、约70mM到约80mM或约70mM到约75mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约75mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM到约100mM、约75mM到约95mM、约75mM到约90mM、约75mM到约85mM或约75mM到约80mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约80mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM到约100mM、约80mM到约95mM、约80mM到约90mM或约80mM到约85mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约85mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM到约100mM、约85mM到约95mM或约85mM到约90mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约90mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM到约95mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约95mM到约100mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM到约90mM。在一些方面，培养基是高渗的。在一些方面，培养基是等渗的。在一些方面，培养基包含至少约50mM钾离子和小于约90mM NaCl。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约55mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM到约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约65mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM到约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM到约75mM。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM到约85mM。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM到约95mM。在一些方面，钾离子的浓度为约95mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约100mM到约105mM。在一些方面，钾离子的浓度为约105mM到约110mM。在一些方面，钾离子的浓度为约110mM到约115mM。在一些方面，钾离子的浓度为约115mM到约120mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约40mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM到约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM到约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM到约70mM。
在一些方面，钾离子的浓度高于约40mM。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约41mM。在一些方面，钾离子的浓度为约41mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约42mM。在一些方面，钾离子的浓度为约42mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约43mM。在一些方面，钾离子的浓度为约43mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约44mM。在一些方面，钾离子的浓度为约44mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约45mM。在一些方面，钾离子的浓度为约45mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约46mM。在一些方面，钾离子的浓度为约46mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约47mM。在一些方面，钾离子的浓度为约47mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约48mM。在一些方面，钾离子的浓度为约48mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约49mM。在一些方面，钾离子的浓度为约49mM。
在一些方面，钾离子的浓度高于约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约51mM。在一些方面，钾离子的浓度为约51mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约52mM。在一些方面，钾离子的浓度为约52mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约53mM。在一些方面，钾离子的浓度为约53mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约54mM。在一些方面，钾离子的浓度为约54mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约55mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约56mM。在一些方面，钾离子的浓度为约56mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约57mM。在一些方面，钾离子的浓度为约57mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约58mM。在一些方面，钾离子的浓度为约58mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约59mM。在一些方面，钾离子的浓度为约59mM。
在一些方面，钾离子的浓度高于约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约61mM。在一些方面，钾离子的浓度为约61mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约62mM。在一些方面，钾离子的浓度为约62mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约63mM。在一些方面，钾离子的浓度为约63mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约64mM。在一些方面，钾离子的浓度为约64mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约65mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约66mM。在一些方面，钾离子的浓度为约66mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约67mM。在一些方面，钾离子的浓度为约67mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约68mM。在一些方面，钾离子的浓度为约68mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约69mM。在一些方面，钾离子的浓度为约69mM。
在一些方面，钾离子的浓度高于约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约71mM。在一些方面，钾离子的浓度为约71mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约72mM。在一些方面，钾离子的浓度为约72mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约73mM。在一些方面，钾离子的浓度为约73mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约74mM。在一些方面，钾离子的浓度为约74mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约75mM。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约76mM。在一些方面，钾离子的浓度为约76mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约77mM。在一些方面，钾离子的浓度为约77mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约78mM。在一些方面，钾离子的浓度为约78mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约79mM。在一些方面，钾离子的浓度为约79mM。
在一些方面，钾离子的浓度高于约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约81mM。在一些方面，钾离子的浓度为约81mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约82mM。在一些方面，钾离子的浓度为约82mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约83mM。在一些方面，钾离子的浓度为约83mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约84mM。在一些方面，钾离子的浓度为约84mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约85mM。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约86mM。在一些方面，钾离子的浓度为约86mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约87mM。在一些方面，钾离子的浓度为约87mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约88mM。在一些方面，钾离子的浓度为约88mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约89mM。在一些方面，钾离子的浓度为约89mM。
在一些方面，钾离子的浓度高于约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约91mM。在一些方面，钾离子的浓度为约91mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约92mM。在一些方面，钾离子的浓度为约92mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约93mM。在一些方面，钾离子的浓度为约93mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约94mM。在一些方面，钾离子的浓度为约94mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约95mM。在一些方面，钾离子的浓度为约95mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约96mM。在一些方面，钾离子的浓度为约96mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约97mM。在一些方面，钾离子的浓度为约97mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约98mM。在一些方面，钾离子的浓度为约98mM。在一些方面，钾离子的浓度高于约99mM。在一些方面，钾离子的浓度为约99mM。
在一些方面，钾离子的浓度高于约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约100mM。
在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约90mM，并且NaCl的浓度小于约90mM到约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约80mM，并且NaCl的浓度小于约90mM到约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约90mM，并且NaCl的浓度小于约90mM到约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约80mM，并且NaCl的浓度小于约80mM到约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM到约90mM，并且NaCl的浓度小于约70mM到约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM到约80mM，并且NaCl的浓度小于约70mM到约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM到约90mM，并且NaCl的浓度小于约60mM到约50mM。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约55mM。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM到约55mM，并且NaCl的浓度小于约90mM到约85mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM到约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM到约60mM，并且NaCl的浓度小于约85mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约65mM。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM到约65mM，并且NaCl的浓度小于约80mM到约75mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM到约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM到约70mM，并且NaCl的浓度小于约75mM到约70mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM到约75mM。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM到约75mM，并且NaCl的浓度小于约70mM到约65mM。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM到约80mM。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM到约80mM，并且NaCl的浓度小于约65mM到约60mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM到约85mM。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM到约85mM，并且NaCl的浓度小于约60mM到约55mM。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM到约90mM。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM到约90mM，并且NaCl的浓度小于约55mM到约50mM。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM到约95mM。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM到约95mM，并且NaCl的浓度小于约50mM到约45mM。在一些方面，钾离子的浓度为约95mM到约100mM。在一些方面，钾离子的浓度为约95mM到约100mM，并且NaCl的浓度小于约45mM到约40mM。在一些方面，钾离子的浓度为约100mM到约105mM。在一些方面，钾离子的浓度为约100mM到约105mM，并且NaCl的浓度小于约40mM到约35mM。在一些方面，钾离子的浓度为约105mM到约110mM。在一些方面，钾离子的浓度为约105mM到约110mM，并且NaCl的浓度小于约35mM到约30mM。在一些方面，钾离子的浓度为约110mM到约115mM。在一些方面，钾离子的浓度为约110mM到约115mM，并且NaCl的浓度小于约30mM到约25mM。在一些方面，钾离子的浓度为约115mM到约120mM。在一些方面，钾离子的浓度为约115mM到约120mM，并且NaCl的浓度小于约25mM到约20mM。在一些方面，钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约40mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约40mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约41mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约41mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约42mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约42mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约43mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约43mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约44mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约44mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约45mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约45mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约46mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约46mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约47mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约47mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约48mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约48mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约49mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约49mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约50mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约50mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约51mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约51mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约52mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约52mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约53mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约53mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约54mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约54mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约55mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约55mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约56mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约56mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约57mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约57mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约58mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约58mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约59mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约59mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约60mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约60mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约61mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约61mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约62mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约62mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约63mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约63mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约64mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约64mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约65mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约65mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约66mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约66mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约67mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约67mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约68mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约68mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约69mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约69mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约70mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约70mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约71mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约71mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约72mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约72mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约73mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约73mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约74mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约74mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约75mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约75mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约76mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约76mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约77mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约77mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约78mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约78mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约79mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约79mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约80mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约80mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约81mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约81mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约82mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约82mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约83mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约83mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约84mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约84mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约85mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约85mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约86mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约86mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约87mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约87mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约88mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约88mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约89mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约89mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约90mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约90mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约91mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约91mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约92mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约92mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约93mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约93mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约94mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约94mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约95mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约95mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约96mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约96mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约97mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约97mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约98mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约98mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约99mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约99mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约100mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约100mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约101mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约101mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约102mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约102mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约103mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约103mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约104mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约104mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约105mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约105mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约106mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约106mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约107mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约107mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约108mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约108mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约109mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约109mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约110mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约110mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约111mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约111mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约112mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约112mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约113mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约113mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约114mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约114mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约115mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约115mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约116mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约116mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约117mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约117mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约118mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约118mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约119mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约119mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，钾离子的浓度高于约120mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约120mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约121mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约121mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约122mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约122mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约123mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约123mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约124mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约124mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约125mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约125mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约126mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约126mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约127mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约127mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约128mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约128mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约129mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约129mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度高于约130mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，钾离子的浓度为约130mM，其中培养基中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，包含高浓度钾离子的高血钾性培养基可通过在培养基中添加足量钾盐来制备。在一些方面，钾盐的非限制性实例包括三氯氨络铂酸钾、五水氯钌酸钾、双(草酸根)铂酸钾(II)二水合物、硫酸氢钾、硼氢化钾、溴化钾、碳酸钾、氯化钾、铬酸钾、重铬酸钾、氰化银钾、氰化亚金钾、氟化钾、氟硫酸钾、六氯铱酸钾、六氯锇酸钾、六氯钯酸钾、六氯铂酸钾、六氯铼酸钾、六氰铬酸钾、六氰高铁酸钾、六氰钌酸钾(II)水合物、六氟锑酸钾、六氟镍酸钾、六氟磷酸钾、六氟钛酸钾、六氟锆酸钾、六氢锑酸钾、六碘铂酸钾、六碘铼酸钾、氢氧化钾、碘酸钾、碘化钾、锰酸钾、偏钒酸钾、钼酸钾、硝酸钾、亚硝基二磺酸钾、锇酸钾(VI)二水合物、五氯亚硝基钌酸钾、高氯酸钾、高铼酸钾、高钌酸钾、过硫酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、焦磷酸钾、硒氰酸钾、硒氰酸钾、锡酸钾三水合物、硫酸钾、碲酸钾水合物、亚碲酸钾、四硼酸钾四水合物、四溴金酸钾、四溴钯酸钾、四氯钯酸钾、四氯铂酸钾、四氰钯酸钾、四氰铂酸钾、四氟硼酸钾、四硝基铂酸钾、连四硫酸钾、对甲苯硫代磺酸钾和羟基柠檬酸三钾单水合物。在一些方面，钾盐包括氯化钾(KCl)。在一些方面，钾盐包括葡萄糖酸钾。在某些方面，钾盐包括柠檬酸钾。在某些方面，钾盐包括羟基柠檬酸钾。在一些方面，钾盐包括本文所公开钾盐中任一者的组合。
II.B.细胞扩增剂
在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)还包含细胞扩增剂。如本文所用的“细胞扩增剂”是指促进所培养免疫细胞(例如TIL)的体外和/或离体生长和增殖的剂，例如小分子、多肽或它们的任何组合。在一些方面，细胞扩增剂包括PI3K抑制剂。在一些方面，培养基还包含AKT抑制剂。在一些方面，培养基还包含PI3K抑制剂和AKT抑制剂。在一些方面，PI3K抑制剂包括LY294002。在一些方面，PI3K抑制剂包括IC87114。在一些方面，PI3K抑制剂包括艾德拉尼(参见例如Peterson等人，Blood Adv.2(3):210-23(2018))。在一些方面，培养基还包含GSK3B抑制剂。在一些方面，GSK3B抑制剂包括TWS119。在一些方面，培养基还包含ACLY抑制剂。在一些方面，ACLY抑制剂包括羟基柠檬酸三钾单水合物。在一些方面，PI3K抑制剂包括羟基柠檬酸盐。在一些方面，PI3K抑制剂包括匹替利司。在一些方面，PI3K抑制剂包括CAL-101。在一些方面，AKT抑制剂包括MK2206、A443654或AKTi-VIII(CAS612847-09-3)。
II.C.钠
在一些方面，代谢重编程培养基(例如高血钾性培养基)还包含钠离子(例如NaCl)。在一些方面，代谢重编程培养基包含浓度小于约115mM的钠离子(例如NaCl)。在一些方面，代谢重编程培养基包含浓度为40mM到约80mM的钠离子(例如NaCl)。
在一些方面，通过从包含较高钠离子(例如NaCl)浓度的基础培养基开始并稀释溶液以达到钠离子(例如NaCl)的目标浓度来达到钠的目标浓度。在一些方面，通过添加一种或多种钠盐(例如更多NaCl)升高钠离子(例如NaCl)的浓度来达到钠的目标浓度。钠盐的非限制性实例包括(偏)高碘酸钠、酒石酸砷钠水合物、叠氮化钠、苯甲醇钠、溴化钠、碳酸钠、氯化钠、铬酸钠、环己烷丁酸钠、乙硫醇钠、氟化钠、氟磷酸钠、甲酸钠、六氯铱酸钠(III)水合物、六氯铱酸钠(IV)六水合物、六氯铂酸钠(IV)六水合物、六氯铑酸钠(III)、六氟铝酸钠、六氟锑酸钠(V)、六氟砷酸钠(V)、六氟高铁酸钠(III)、六氟磷酸钠、六氟硅酸钠、六羟基铂酸钠(IV)、六偏磷酸钠、二氟化氢钠、硫酸氢钠、氰胺一钠、氢氧化钠、碘化钠、偏硼酸钠四水合物、偏硅酸钠九水合物、偏钒酸钠、钼酸钠、硝酸钠、亚硝酸钠、草酸钠、过硼酸钠单水合物、过碳酸钠、高氯酸钠、高碘酸钠、高锰酸钠、高铼酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠、硒酸钠、亚硒酸钠、锡酸钠、硫酸钠、亚碲酸钠、四硼酸钠、四氯铝酸钠、四氯金酸钠(III)、四氯钯酸钠(II)、四氯铂酸钠(II)、硫代磷酸钠、硫代硫酸钠、硫代硫酸钠五水合物、氧氟化钇钠、三偏磷酸钠和它们的任何组合。在一些方面，钠盐包括氯化钠(NaCl)。在一些方面，钠盐包括葡萄糖酸钠。在某些方面，钠盐包括碳酸氢钠。在某些方面，钠盐包括羟基柠檬酸钠。在某些方面，钠盐包括磷酸钠。
在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度小于基础培养基的浓度。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度随着钾离子的浓度增加而减小。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约25mM到约115mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约25mM到约100mM、约30mM到约40mM、约30mM到约50mM、约30mM到约60mM、约30mM到约70mM、约30mM到约80mM、约40mM到约50mM、约40mM到约60mM、约40mM到约70mM、约40mM到约80mM、约50mM到约55mM、约50mM到约60mM、约50mM到约65mM、约50mM到约70mM、约50mM到约75mM、约50mM到约80mM、约55mM到约60mM、约55mM到约65mM、约55mM到约70mM、约55mM到约75mM、约55mM到约80mM、约60mM到约65mM、约60mM到约70mM、约60mM到约75mM、约60mM到约80mM、约70mM到约75mM、约70mM到约80mM或约75mM到约80mM。在某些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约40mM到约80mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约50mM到约85mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约55mM到约80mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约30mM到约35mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约35mM到约40mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约40mM到约45mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约45mM到约50mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约50mM到约55mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约55mM到约60mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约60mM到约65mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约65mM到约70mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约70mM到约75mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约75mM到约80mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约80mM到约85mM。
在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM或约90mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约40mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约45mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约50mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约55mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约60mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约65mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约70mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约75mM。在一些方面，钠离子(例如NaCl)的浓度为约80mM。
在一些方面，培养基包含约40mM到约90mM钾离子和约40mM到约80mM钠离子(例如NaCl)。
在一些方面，培养基包含约50mM到约75mM钾离子和约80mM到约90mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约55mM到约75mM钾离子和约80mM到约90mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约60mM到约75mM钾离子和约80mM到约90mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM到约75mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约66mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约67mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约68mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约69mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约71mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约72mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约73mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约74mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约80mM到约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约80mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和约90mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约80mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约90mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约80mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约85mM钠离子(例如NaCl)。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和约90mM钠离子(例如NaCl)。
在一些方面，培养基包含约40mM到约90mM钾离子和约30mM到约109mM NaCl，其中NaCl的浓度(mM)等于或低于(135-钾离子浓度)。在一些方面，培养基包含约40mM钾离子和小于或等于约95mM NaCl(例如约95mM、约94mM、约93mM、约92mM、约91mM、约90mM、约85mM、约80mM、约75mM、约70mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约45mM钾离子和小于或等于约90mM NaCl(例如约90mM、约89mM、约88mM、约87mM、约86mM、约85mM、约80mM、约75mM、约70mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和小于或等于约85mM NaCl(例如约85mM、约84mM、约83mM、约82mM、约81mM、约80mM、约75mM、约70mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约55mM钾离子和小于或等于约80mM NaCl(例如约80mM、约79mM、约78mM、约77mM、约76mM、约75mM、约70mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约60mM钾离子和小于或等于约75mM NaCl(例如约75mM、约74mM、约73mM、约72mM、约71mM、约70mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约65mM钾离子和小于或等于约70mM NaCl(例如约70mM、约69mM、约68mM、约67mM、约66mM、约65mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和小于或等于约70mM NaCl(例如约65mM、约64mM、约63mM、约62mM、约61mM、约60mM、约55mM或约50mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约75mM钾离子和小于或等于约60mM NaCl(例如约60mM、约59mM、约58mM、约57mM、约56mM、约55mM、约50mM、约45mM或约40mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约80mM钾离子和小于或等于约55mM NaCl(例如约55mM、约54mM、约53mM、约52mM、约51mM、约50mM、约45mM、约40mM或约35mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约85mM钾离子和小于或等于约50mMNaCl(例如约50mM、约49mM、约48mM、约47mM、约46mM、约45mM、约40mM、约35mM或约30mMNaCl)。在一些方面，培养基包含约90mM钾离子和小于或等于约45mM NaCl(例如约45mM、约44mM、约43mM、约42mM、约41mM、约40mM、约35mM、约30mM或约25mM NaCl)。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约60mM NaCl。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约61mMNaCl。在一些方面，培养基包含约70mM钾离子和约62mM NaCl。
在一些方面，培养基包含约50mM钾离子和约75mM NaCl。在一些方面，培养基是低渗的。在一些方面，培养基是等渗的。
本公开的一些方面是关于培养细胞、例如多潜能、多能和/或免疫细胞(例如T细胞、NK细胞和/或TIL)的方法，所述方法包括将细胞放置于包含以下的培养基中：(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)浓度小于约100mM的NaCl。本公开的某些方面是关于培养T细胞的方法，所述方法包括将T细胞放置于包含以下的培养基中：(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)浓度小于约90mM的NaCl。
II.D.糖
在一些方面，代谢重编程培养基(MRM)(例如高血钾性培养基)包含糖。在一些方面，MRM是低渗的。在一些方面，MRM是等渗的。在一些方面，通过从包含较高糖浓度的基础培养基开始并稀释溶液以达到糖的目标浓度来达到糖的目标浓度。在一些方面，通过添加糖升高糖的浓度直到达到期望浓度来达到糖的目标浓度。
在一些方面，糖是单糖、二糖或多糖。在一些方面，糖选自葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖或它们的任何组合。在一些方面，糖是葡萄糖。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约30mM到至少约100mM的钾离子和(ii)葡萄糖。在一些方面，MRM包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)葡萄糖。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约30mM到至少约100mM的钾离子和(ii)甘露糖。在一些方面，MRM包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)甘露糖。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)甘露糖。在一些方面，MRM是低渗的。在一些方面，MRM是等渗的。在一些方面，MRM包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)葡萄糖；其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，MRM包含(i)浓度高于50mM的钾离子和(ii)葡萄糖；其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约40mM的钾离子和(ii)甘露糖；其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)甘露糖；其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，MRM包含(i)浓度高于40mM的钾离子和(ii)葡萄糖；其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，MRM包含(i)浓度高于50mM的钾离子和(ii)葡萄糖；其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约40mM的钾离子和(ii)甘露糖；其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。在一些方面，MRM包含(i)浓度为至少约50mM的钾离子和(ii)甘露糖；其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约10mM到约24mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度小于约24mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度大于约10mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约5mM到约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约10mM到约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约10mM到约25mM、约10mM到约20mM、约10mM到约5mM、约15mM到约25mM、约15mM到约20mM、约15mM到约19mM、约15mM到约18mM、约15mM到约17mM、约15mM到约16mM、约16mM到约20mM、约16mM到约19mM、约16mM到约18mM、约16mM到约17mM、约17mM到约20mM、约17mM到约19mM或约17mM到约18mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约5mM到约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约10mM到约20mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约10mM到约15mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约14mM到约14.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约14.5mM到约15mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15mM到约15.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15.5mM到约16mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约16mM到约16.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约16.5mM到约17mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约17mM到约17.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约17.5mM到约18mM。
在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM，为约10.5mM、约11mM、约11.5mM、约12mM、约12.5mM、约13mM、约13.5mM、约14mM、约14.5mM、约15mM、约15.5mM、约16mM、约16.5mM、约17mM、约17.5mM、约18mM、约18.5mM、约19mM、约19.5mM、约20mM、约20.5mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM或约25mM。
在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约6mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约7mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约8mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约9mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约10mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约10.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约11mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约11.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约12mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约12.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约13mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约13.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约14mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约14.5mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15.4mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约15.9mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约16.3mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约16.8mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约17.2mM。在一些方面，糖(例如葡萄糖)的浓度为约17.7mM。
II.E.钙
在一些方面，MRM(例如高血钾性培养基)包含钙离子。在一些方面，通过从包含较高钙离子浓度的基础培养基开始并稀释溶液以达到钙离子的目标浓度来达到钙的目标浓度。在一些方面，通过添加一种或多种钙盐升高钙离子的浓度来达到钙的目标浓度。钙盐的非限制性实例包括溴化钙、碳酸钙、氯化钙、氰胺化钙、氟化钙、氢化钙、氢氧化钙、碘酸钙、碘化钙、硝酸钙、亚硝酸钙、草酸钙、高氯酸钙四水合物、磷酸二氢钙、磷酸钙、硫酸钙、硫氰酸钙四水合物、羟基磷灰石和它们的任何组合。在一些方面，钙盐包括氯化钙(CaCl2)。在一些方面，钙盐包括葡萄糖酸钙。
在一些方面，钙离子的浓度小于基础培养基的浓度。在一些方面，钙离子的浓度大于基础培养基的浓度。在一些方面，钙离子的浓度大于约0.4mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约2.8mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约2.5mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约2.0mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.9mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.7mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.6mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.5mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.4mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.3mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.2mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.1mM。在一些方面，钙离子的浓度小于约1.0mM。
在一些方面，钙离子的浓度为约0.4mM到约2.8mM、约0.4mM到约2.7mM、约0.4mM到约2.5mM、约0.5mM到约2.0mM、约1.0mM到约2.0mM、约1.1mM到约2.0mM、约1.2mM到约2.0mM、约1.3mM到约2.0mM、约1.4mM到约2.0mM、约1.5mM到约2.0mM、约1.6mM到约2.0mM、约1.7mM到约2.0mM、约1.8mM到约2.0mM、约0.8mM到约0.9mM、约0.8mM到约1.0mM、约0.8mM到约1.1mM、约0.8mM到约1.2mM、约0.8mM到约1.3mM、约0.8mM到约1.4mM、约0.8mM到约1.5mM、约0.8mM到约1.6mM、约0.8mM到约1.7mM、约0.8mM到约1.8mM、约0.9mM到约1.0mM、约0.9mM到约1.1mM、约0.9mM到约1.2mM、约0.9mM到约1.3mM、约0.9mM到约1.4mM、约0.9mM到约1.5mM、约0.9mM到约1.6mM、约0.9mM到约1.7mM、约0.9mM到约1.8mM、约1.0mM到约1.1mM、约1.0mM到约1.2mM、约1.0mM到约1.3mM、约1.0mM到约1.4mM、约1.0mM到约1.5mM、约1.0mM到约1.6mM、约1.0mM到约1.7mM、约1.0mM到约1.8mM、约1.1mM到约1.2mM、约1.1mM到约1.3mM、约1.1mM到约1.4mM、约1.1mM到约1.5mM、约1.1mM到约1.6mM、约1.1mM到约1.7mM、约1.1mM到约1.8mM、约1.2mM到约1.3mM、约1.2mM到约1.4mM、约1.2mM到约1.5mM、约1.2mM到约1.6mM、约1.2mM到约1.7mM、约1.2mM到约1.8mM、约1.3mM到约1.4mM、约1.3mM到约1.5mM、约1.3mM到约1.6mM、约1.3mM到约1.7mM、约1.3mM到约1.8mM、约1.4mM到约1.5mM、约1.4mM到约1.6mM、约1.4mM到约1.7mM、约1.4mM到约1.8mM、约1.5mM到约1.6mM、约1.5mM到约1.7mM、约1.5mM到约1.8mM、约1.6mM到约1.7mM、约1.6mM到约1.8mM或约1.7mM到约1.8mM。
在一些方面，钙离子的浓度为约0.8mM到约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.9mM到约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.0mM到约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.1mM到约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.2mM到约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.8mM到约1.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.8mM到约0.9mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.9mM到约1.0mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.0mM到约1.1mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.1mM到约1.2mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.2mM到约1.3mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.3mM到约1.4mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.4mM到约1.5mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.5mM到约1.6mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.7mM到约1.8mM。
在一些方面，钙离子的浓度为约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM或约2.0mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.6mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.7mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.8mM。在一些方面，钙离子的浓度为约0.9mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.0mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.1mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.2mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.3mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.4mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.5mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.6mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.7mM。在一些方面，钙离子的浓度为约1.8mM。
在一些方面，MRM包含约40mM到约90mM钾离子和约0.5mM到约2.8mM钙离子。在一些方面，MRM包含约40mM到约90mM钾离子、NaCl和约0.5mM到约2.8mM钙离子；其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
II.F.细胞因子
在一些方面，MRM包含细胞因子。在一些方面，MRM是低渗的。在一些方面，MRM是等渗的。在一些方面，细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21和它们的任何组合。在一些方面，MRM不包含IL-2。在一些方面，MRM包含IL2和IL21。在一些方面，MRM包含IL2、IL21和IL15。
细胞因子可在任一点添加到MRM中。在一些方面，细胞因子在将TIL(例如肿瘤样品)添加到培养基中之前添加到MRM中。在一些方面，在包含以下的MRM中培养TIL(例如肿瘤样品)：(i)本文所公开浓度的钾，和(ii)整个TIL培养(包括扩增)中的细胞因子。在一些方面，在包含以下的MRM中培养TIL(例如肿瘤样品)：(i)本文所公开浓度的钾，和(ii)整个TIL扩增中的细胞因子。
在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM到至少约100mM钾离子和(ii)IL-2。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-2。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-2。在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM到至少约100mM钾离子和(ii)IL-7。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-7。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-7。在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM到至少约100mM钾离子和(ii)IL-15。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-15。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-15。在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM到至少约100mM钾离子和(ii)IL-21。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子和(ii)IL-21。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子和(ii)IL-21。在一些方面，MRM不包含IL-7和/或IL-15。
在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM到至少约100mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM到至少约100mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM到至少约100mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约30mM到至少约100mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)大于40mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约50mM钾离子、(ii)NaCl和(iii)IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM不包含IL-7和/或IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。
在一些方面，MRM包含至少约0.1ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含约50ng/mL到约600ng/mL、约50ng/mL到约500ng/mL、约50ng/mL到约450ng/mL、约50ng/mL到约400ng/mL、约50ng/mL到约350ng/mL、约50ng/mL到约300ng/mL、约100ng/mL到约600ng/mL、约100ng/mL到约500ng/mL、约100ng/mL到约450ng/mL、约100ng/mL到约400ng/mL、约100ng/mL到约350ng/mL、约100ng/mL到约300ng/mL、约200ng/mL到约500ng/mL、约200ng/mL到约450ng/mL、约200ng/mL到约400ng/mL、约200ng/mL到约350ng/mL、约200ng/mL到约300ng/mL、约250ng/mL到约350ng/mL、约300ng/mL到约600ng/mL、约300ng/mL到约500ng/mL、约300ng/mL到约450ng/mL、约300ng/mL到约400ng/mL、约300ng/mL到约350ng/mL、约250ng/mL到约300ng/mL或约275ng/mL到约325ng/mL IL-2。
在一些方面，MRM包含至少约50ng/mL、至少约60ng/mL、至少约70ng/mL、至少约80ng/mL、至少约90ng/mL、至少约100ng/mL、至少约110ng/mL、至少约120ng/mL、至少约130ng/mL、至少约140ng/mL、至少约150ng/mL、至少约160ng/mL、至少约170ng/mL、至少约180ng/mL、至少约190ng/mL、至少约200ng/mL、至少约210ng/mL、至少约220ng/mL、至少约230ng/mL、至少约240ng/mL、至少约250ng/mL、至少约260ng/mL、至少约270ng/mL、至少约280ng/mL、至少约290ng/mL、至少约300ng/mL、至少约310ng/mL、至少约320ng/mL、至少约330ng/mL、至少约340ng/mL、至少约350ng/mL、至少约360ng/mL、至少约370ng/mL、至少约380ng/mL、至少约390ng/mL、至少约400ng/mL、至少约410ng/mL、至少约420ng/mL、至少约430ng/mL、至少约440ng/mL、至少约450ng/mL、至少约460ng/mL、至少约470ng/mL、至少约480ng/mL、至少约490ng/mL、至少约500ng/mL、至少约510ng/mL、至少约520ng/mL、至少约530ng/mL、至少约540ng/mL、至少约550ng/mL、至少约560ng/mL、至少约570ng/mL、至少约580ng/mL、至少约590ng/mL或至少约600ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约50ng/mLIL-2。在一些方面，MRM包含至少约60ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约70ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约73.6ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约75ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约80ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约90ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约100ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约200ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约400ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约500ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约600ng/mL IL-2。
在一些方面，MRM包含至少约1500IU/mL IL-2。在一些方面，MRM包含约1500IU/mL到约12,000IU/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约1500IU/mL、至少约1600IU/mL、至少约1700IU/mL、至少约1800IU/mL、至少约1900IU/mL、至少约2000IU/mL、至少约2100IU/mL、至少约2200IU/mL、至少约2300IU/mL、至少约2400IU/mL、至少约2500IU/mL、至少约2600IU/mL、至少约2700IU/mL、至少约2800IU/mL、至少约2900IU/mL、至少约3000IU/mL、至少约3100IU/mL、至少约3200IU/mL、至少约3300IU/mL、至少约3400IU/mL、至少约3500IU/mL、至少约3600IU/mL、至少约3700IU/mL、至少约3800IU/mL、至少约3900IU/mL、至少约4000IU/mL、至少约4100IU/mL、至少约4200IU/mL、至少约4300IU/mL、至少约4400IU/mL、至少约4500IU/mL、至少约4600IU/mL、至少约4700IU/mL、至少约4800IU/mL、至少约4900IU/mL、至少约5000IU/mL、至少约5100IU/mL、至少约5200IU/mL、至少约5300IU/mL、至少约5400IU/mL、至少约5500IU/mL、至少约5600IU/mL、至少约5700IU/mL、至少约5800IU/mL、至少约5900IU/mL、至少约6000IU/mL、至少约6100IU/mL、至少约6200IU/mL、至少约6300IU/mL、至少约6400IU/mL、至少约6500IU/mL、至少约6600IU/mL、至少约6700IU/mL、至少约6800IU/mL、至少约6900IU/mL、至少约7000IU/mL IL-2、至少约7100IU/mL、至少约7200IU/mL、至少约7300IU/mL、至少约7400IU/mL、至少约7500IU/mL、至少约7600IU/mL、至少约7700IU/mL、至少约7800IU/mL、至少约7900IU/mL或至少约8000IU/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约3000IU/mL IL-2。在一些方面，如本文所述，在第二培养(例如REP培养)期间在MRM中培养TIL，其中MRM包含约3000IU/mL。在一些方面，MRM包含至少约6000IU/mL IL-2。在一些方面，如本文所述，在初始培养期间在MRM中培养TIL，其中MRM包含约6000IU/mL。
在一些方面，MRM包含至少约0.1ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含约0.1ng/mL到约30ng/mL、约1ng/mL到约30ng/mL、约1ng/mL到约25ng/mL、约1ng/mL到约20ng/mL、约1ng/mL到约15ng/mL、约1ng/mL到约10ng/mL、约5ng/mL到约30ng/mL、约5ng/mL到约20ng/mL、约10ng/mL到约30ng/mL、约10ng/mL到约20ng/mL或约15ng/mL到约30ng/mL IL-21。
在一些方面，MRM包含至少约0.1ng/mL、至少约0.5ng/mL、至少约1ng/mL、至少约2ng/mL、至少约3ng/mL、至少约4ng/mL、至少约5ng/mL、至少约6ng/mL、至少约7ng/mL、至少约8ng/mL、至少约9ng/mL、至少约10ng/mL、至少约11ng/mL、至少约12ng/mL、至少约13ng/mL、至少约14ng/mL、至少约15ng/mL、至少约16ng/mL、至少约17ng/mL、至少约18ng/mL、至少约19ng/mL、至少约20ng/mL、至少约25ng/mL、至少约30ng/mL、至少约35ng/mL或至少约40ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约1.0ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约2.0ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约3.0ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约4.0ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约5.0ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约6.0ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约7.0ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约8.0ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约9.0ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约10ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约15ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约25ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约35ng/mL IL-21。
在一些方面，MRM包含约50IU/mL到约500IU/mL IL-21。在一些方面，MRM包含约50IU/mL、约60IU/mL、约70IU/mL、约80IU/mL、约90IU/mL、约100IU/mL、约125IU/mL、约150IU/mL、约175IU/mL、约200IU/mL、约225IU/mL、约250IU/mL、约275IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL或约500IU/mL IL-21。
在一些方面，MRM包含至少约0.1ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含约0.1ng/mL到约20ng/mL、约1ng/mL到约20ng/mL、约1ng/mL到约15ng/mL、约1ng/mL到约14ng/mL、约1ng/mL到约13ng/mL、约1ng/mL到约12ng/mL、约1ng/mL到约11ng/mL、约1ng/mL到约10ng/mL、约1ng/mL到约9ng/mL、约1ng/mL到约8ng/mL、约1ng/mL到约7ng/mL、约1ng/mL到约6ng/mL、约1ng/mL到约5ng/mL、约1ng/mL到约4ng/mL、约1ng/mL到约3ng/mL、约1ng/mL到约2ng/mL、约5ng/mL到约15ng/mL、约5ng/mL到约10ng/mL、约10ng/mL到约20ng/mL、约10ng/mL到约15ng/mL或约15ng/mL到约20ng/mL IL-7。
在一些方面，MRM包含至少约0.1ng/mL、至少约0.5ng/mL、至少约1ng/mL、至少约1.3ng/mL、至少约1.5ng/mL、至少约1.7ng/mL、至少约2ng/mL、至少约2.3ng/mL、至少约2.5ng/mL、至少约2.7ng/mL、至少约3ng/mL、至少约3.3ng/mL、至少约3.5ng/mL、至少约3.7ng/mL、至少约4ng/mL、至少约4.3ng/mL、至少约4.5ng/mL、至少约4.7ng/mL、至少约5ng/mL、至少约5.3ng/mL、至少约5.5ng/mL、至少约5.7ng/mL、至少约6ng/mL、至少约7ng/mL、至少约8ng/mL、至少约9ng/mL、至少约10ng/mL、至少约11ng/mL、至少约12ng/mL、至少约13ng/mL、至少约14ng/mL、至少约15ng/mL、至少约16ng/mL、至少约17ng/mL、至少约18ng/mL、至少约19ng/mL或至少约20ng/mL IL-7。在一些方面，培养基包含至少约1.0ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约2.0ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约2.3ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约2.5ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约2.7ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约3.0ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约3.3ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约3.5ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约3.7ng/mL IL-7。
在一些方面，MRM包含约500IU/mL到约1,500IU/mL IL-7。在一些方面，MRM包含约500IU/mL、约550IU/mL、约600IU/mL、约650IU/mL、约700IU/mL、约750IU/mL、约800IU/mL、约850IU/mL、约900IU/mL、约950IU/mL、约1,000IU/mL、约1,050IU/mL、约1,100IU/mL、约1,150IU/mL、约1,200IU/mL、约1,250IU/mL、约1,300IU/mL、约1,350IU/mL、约1,400IU/mL、约1,450IU/mL或约1,500IU/mL IL-7。
在一些方面，MRM包含至少约0.1ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含约0.1ng/mL到约20ng/mL、约1ng/mL到约20ng/mL、约1ng/mL到约15ng/mL、约1ng/mL到约14ng/mL、约1ng/mL到约13ng/mL、约1ng/mL到约12ng/mL、约1ng/mL到约11ng/mL、约1ng/mL到约10ng/mL、约1ng/mL到约9ng/mL、约1ng/mL到约8ng/mL、约1ng/mL到约7ng/mL、约1ng/mL到约6ng/mL、约1ng/mL到约5ng/mL、约1ng/mL到约4ng/mL、约1ng/mL到约3ng/mL、约1ng/mL到约2ng/mL、约5ng/mL到约15ng/mL、约5ng/mL到约10ng/mL、约10ng/mL到约20ng/mL、约10ng/mL到约15ng/mL或约15ng/mL到约20ng/mL IL-15。
在一些方面，MRM包含至少约0.1ng/mL、至少约0.2ng/mL、至少约0.3ng/mL、至少约0.4ng/mL、至少约0.5ng/mL、至少约0.6ng/mL、至少约0.7ng/mL、至少约0.8ng/mL、至少约0.9ng/mL、至少约1ng/mL、至少约2ng/mL、至少约3ng/mL、至少约4ng/mL、至少约5ng/mL、至少约6ng/mL、至少约7ng/mL、至少约8ng/mL、至少约9ng/mL、至少约10ng/mL、至少约11ng/mL、至少约12ng/mL、至少约13ng/mL、至少约14ng/mL、至少约15ng/mL、至少约16ng/mL、至少约17ng/mL、至少约18ng/mL、至少约19ng/mL或至少约20ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约0.1ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约0.2ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约0.3ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约0.5ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约0.6ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约0.7ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约0.8ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约0.9ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约1.0ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约2.0ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约3.0ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约4.0ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约5.0ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约6.0ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约7.0ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约8.0ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约9.0ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约10ng/mL IL-15。
在一些方面，MRM包含约50IU/mL到约500IU/mL IL-15。在一些方面，MRM包含约50IU/mL、约60IU/mL、约70IU/mL、约80IU/mL、约90IU/mL、约100IU/mL、约125IU/mL、约150IU/mL、约175IU/mL、约200IU/mL、约225IU/mL、约250IU/mL、约275IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL或约500IU/mL IL-15。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子和约300ng/mLIL-2。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子和约300ng/mL IL-2。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖和(v)约10ng/mL IL-2。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子和约300ng/mL IL-2和约290ng/mLIL-7。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约40mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、约300ng/mLIL-2和约290ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约290ng/mLIL-7。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约300ng/mL IL-2和(vi)约290ng/mL IL-7。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mLIL-15。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、约300ng/mLIL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mLIL-15。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约300ng/mL IL-2和(vi)约0.4ng/mL IL-15。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、约300ng/mLIL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mLIL-15。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子和约10ng/mL IL-2、约1ng/mLIL-7和约1ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、约300ng/mLIL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约300ng/mL IL-2、(vi)约290ng/mL IL-7和(vii)约0.4ng/mL IL-15。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100 5mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、约300ng/mLIL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mLIL-21。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约300ng/mL IL-2和(vi)约30ng/mL IL-21。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、约290ng/mLIL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mLIL-21。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约290ng/mL IL-7和(vi)约20ng/mL IL-21。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mLIL-21。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、约0.4ng/mLIL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约0.4ng/mL IL-15和(vi)约20ng/mL IL-21。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠(例如NaCl)、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖和(v)约10ng/mL IL-2。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、NaCl和约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约40mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约290ng/mL IL-7；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠(例如NaCl)、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约300ng/mL IL-2和(vi)约290ng/mL IL-7。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠(例如NaCl)、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约300ng/mL IL-2和(vi)约0.4ng/mL IL-15。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mLIL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、NaCl、约300ng/mLIL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、NaCl和约10ng/mL IL-2、约1ng/mL IL-7和约1ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2、约290ng/mL IL-7和约0.4ng/mL IL-15；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠(例如NaCl)、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约300ng/mL IL-2、(vi)约290ng/mL IL-7和(vii)约0.4ng/mL IL-15。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mLIL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、NaCl、约300ng/mL IL-2和约30ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠(例如NaCl)、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约300ng/mL IL-2和(vi)约30ng/mL IL-21。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mLIL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、NaCl、约290ng/mL IL-7和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠(例如NaCl)、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约290ng/mL IL-7和(vi)约20ng/mL IL-21。
在一些方面，MRM包含至少约30mM到至少约100mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含大于40mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约45mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约50mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约55mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约60mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约65mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约70mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约75mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约80mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约85mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含至少约90mM钾离子、NaCl、约0.4ng/mL IL-15和约20ng/mL IL-21；其中钾离子和NaCl的总浓度为110mM到140mM。在一些方面，MRM包含(i)至少约70mM钾离子、(ii)约60mM钠(例如NaCl)、(iii)约1.4mM钙、(iv)约16mM葡萄糖、(v)约0.4ng/mL IL-15和(vi)约20ng/mL IL-21。
II.G.T细胞培养基(例如代谢重编程培养基)
在一些方面，通过将钾离子添加到基础培养基中来制备MRM。使用任一基础培养基来培养免疫细胞(例如T细胞、NK细胞和/或TIL)。
在一些方面，MRM还包含一种或多种必需氨基酸。在一些方面，基础培养基包含一种或多种选自以下的必需氨基酸：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-谷氨酰胺或它们的任何组合。在一些方面，基础培养基包含L-谷氨酰胺。
在一些方面，MRM包含至少约0.01mM的一种或多种必需氨基酸。在一些方面，MRM包含约0.01mM到约10mM的一种或多种必需氨基酸。在一些方面，MRM包含约0.01mM到约10mM、约0.01mM到约9mM、约0.01mM到约8mM、约0.01mM到约7mM、约0.01mM到约6mM、约0.01mM到约5mM、约0.01mM到约4mM、约0.01mM到约3mM、约0.01mM到约2mM、约0.01mM到约1mM、约0.1mM到约10mM、约0.1mM到约9mM、约0.1mM到约8mM、约0.1mM到约7mM、约0.1mM到约6mM、约0.1mM到约5mM、约0.1mM到约4mM、约0.1mM到约3mM、约0.1mM到约2mM、约0.1mM到约1mM、约1mM到约10mM、约1mM到约9mM、约1mM到约8mM、约1mM到约7mM、约1mM到约6mM、约1mM到约5mM、约1mM到约4mM、约1mM到约3mM或约1mM到约2mM的一种或多种必需氨基酸。
在一些方面，MRM包含至少约0.01mM、至少约0.1mM、至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约2mM、至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM、至少约11mM、至少约12mM、至少约13mM、至少约14mM或至少约15mM或至少约50mM的一种或多种必需氨基酸。
在一些方面，MRM包含约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.1mM、约2.2mM、约2.3mM、约2.4mM、约2.5mM、约2.6mM、约2.7mM、约2.8mM、约2.9mM、约3.0mM、约3.1mM、约3.2mM、约3.3mM、约3.4mM、约3.5mM、约3.6mM、约3.7mM、约3.8mM、约3.9mM、约4.0mM、约4.1mM、约4.2mM、约4.3mM、约4.4mM、约4.5mM、约4.6mM、约4.7mM、约4.8mM、约4.9mM、约5.0mM、约5.1mM、约5.2mM、约5.3mM、约5.4mM、约5.5mM、约5.6mM、约5.7mM、约5.8mM、约5.9mM、约6.0mM、约6.1mM、约6.2mM、约6.3mM、约6.4mM、约6.5mM、约6.6mM、约6.7mM、约6.8mM、约6.9mM或约7.0mM的一种或多种必需氨基酸。
在一些方面，MRM包含L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含至少约0.01mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约0.01mM到约10mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约0.01mM到约10mM、约0.01mM到约9mM、约0.01mM到约8mM、约0.01mM到约7mM、约0.01mM到约6mM、约0.01mM到约5mM、约0.01mM到约4mM、约0.01mM到约3mM、约0.01mM到约2mM、约0.01mM到约1mM、约0.1mM到约10mM、约0.1mM到约9mM、约0.1mM到约8mM、约0.1mM到约7mM、约0.1mM到约6mM、约0.1mM到约5mM、约0.1mM到约4mM、约0.1mM到约3mM、约0.1mM到约2mM、约0.1mM到约1mM、约1mM到约10mM、约1mM到约9mM、约1mM到约8mM、约1mM到约7mM、约1mM到约6mM、约1mM到约5mM、约1mM到约4mM、约1mM到约3mM或约1mM到约2mM L-谷氨酰胺。
在一些方面，MRM包含至少约0.01mM、至少约0.1mM、至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约2mM、至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM、至少约11mM、至少约12mM、至少约13mM、至少约14mM或至少约15mM或至少约50mM L-谷氨酰胺。
在一些方面，MRM包含约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.1mM、约2.2mM、约2.3mM、约2.4mM、约2.5mM、约2.6mM、约2.7mM、约2.8mM、约2.9mM、约3.0mM、约3.1mM、约3.2mM、约3.3mM、约3.4mM、约3.5mM、约3.6mM、约3.7mM、约3.8mM、约3.9mM、约4.0mM、约4.1mM、约4.2mM、约4.3mM、约4.4mM、约4.5mM、约4.6mM、约4.7mM、约4.8mM、约4.9mM、约5.0mM、约5.1mM、约5.2mM、约5.3mM、约5.4mM、约5.5mM、约5.6mM、约5.7mM、约5.8mM、约5.9mM、约6.0mM、约6.1mM、约6.2mM、约6.3mM、约6.4mM、约6.5mM、约6.6mM、约6.7mM、约6.8mM、约6.9mM或约7.0mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约1.7mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约1.68mM L-谷氨酰胺。
在一些方面，MRM包含约0.14mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约0.15mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约1.76mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约1.83mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约1.84mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约1.97mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约2.05mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约2.11mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约2.18mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约5.41mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约5.47mM L-谷氨酰胺。在一些方面，MRM包含约<0.10mM L-谷氨酰胺。
在一些方面，MRM包含L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含至少约0.01mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约0.01mM到约10mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约0.01mM到约10mM、约0.01mM到约9mM、约0.01mM到约8mM、约0.01mM到约7mM、约0.01mM到约6mM、约0.01mM到约5mM、约0.01mM到约4mM、约0.01mM到约3mM、约0.01mM到约2mM、约0.01mM到约1mM、约0.1mM到约10mM、约0.1mM到约9mM、约0.1mM到约8mM、约0.1mM到约7mM、约0.1mM到约6mM、约0.1mM到约5mM、约0.1mM到约4mM、约0.1mM到约3mM、约0.1mM到约2mM、约0.1mM到约1mM、约1mM到约10mM、约1mM到约9mM、约1mM到约8mM、约1mM到约7mM、约1mM到约6mM、约1mM到约5mM、约1mM到约4mM、约1mM到约3mM或约1mM到约2mM L-谷氨酸。
在一些方面，MRM包含至少约0.01mM、至少约0.1mM、至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约2mM、至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM、至少约11mM、至少约12mM、至少约13mM、至少约14mM或至少约15mM或至少约50mM L-谷氨酸。
在一些方面，MRM包含约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.1mM、约2.2mM、约2.3mM、约2.4mM、约2.5mM、约2.6mM、约2.7mM、约2.8mM、约2.9mM、约3.0mM、约3.1mM、约3.2mM、约3.3mM、约3.4mM、约3.5mM、约3.6mM、约3.7mM、约3.8mM、约3.9mM、约4.0mM、约4.1mM、约4.2mM、约4.3mM、约4.4mM、约4.5mM、约4.6mM、约4.7mM、约4.8mM、约4.9mM、约5.0mM、约5.1mM、约5.2mM、约5.3mM、约5.4mM、约5.5mM、约5.6mM、约5.7mM、约5.8mM、约5.9mM、约6.0mM、约6.1mM、约6.2mM、约6.3mM、约6.4mM、约6.5mM、约6.6mM、约6.7mM、约6.8mM、约6.9mM或约7.0mM L-谷氨酸。
在一些方面，MRM包含约0.15mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约0.17mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约0.18mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约0.19mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约0.85mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约0.86mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约0.9mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约0.95mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约1.06mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约1.09mM L-谷氨酸。在一些方面，MRM包含约<0.10mM L-谷氨酸。
在一些方面，MRM包含二肽。在一些方面，MRM包含谷氨酰胺-谷氨酰胺(Gln-Gln)。在一些方面，MRM包含丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)。
在一些方面，MRM包含至少约0.1mM二肽(例如Ala-Gln)。在一些方面，MRM包含约0.1mM到约50mM二肽(例如Ala-Gln)。在一些方面，MRM包含约0.1mM到约40mM、约0.1mM到约35mM、约0.1mM到约30mM、约0.1mM到约25mM、约0.1mM到约20mM、约1mM到约20mM、约2mM到约20mM、约3mM到约20mM、约4mM到约20mM、约5mM到约20mM、约6mM到约20mM、约7mM到约20mM、约8mM到约20mM、约9mM到约20mM、约10mM到约20mM、约1mM到约10mM、约2mM到约10mM、约3mM到约10mM、约4mM到约10mM、约5mM到约10mM、约6mM到约10mM、约7mM到约10mM、约8mM到约10mM或约9mM到约10mM二肽(例如Ala-Gln)。
在一些方面，MRM包含至少约0.1mM、至少约1.0mM、至少约2mM、至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM、至少约9mM、至少约10mM、至少约11mM、至少约12mM、至少约13mM、至少约14mM、至少约15mM、至少约16mM、至少约17mM、至少约18mM、至少约19mM、至少约20mM、至少约25mM、至少约30mM或至少约50mM二肽(例如Ala-Gln)。
在一些方面，MRM包含约1mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM或约2.0mM二肽(例如Ala-Gln)。在一些方面，基础培养基包含约1.7mM二肽(例如Ala-Gln)。在一些方面，MRM包含约1.68mM二肽(例如Ala-Gln)。
在一些方面，MRM包含约6mM、约6.1mM、约6.2mM、约6.3mM、约6.4mM、约6.5mM、约6.6mM、约6.7mM、约6.8mM、约6.9mM、约7.0mM、约7.1mM或约7.2mM二肽(例如Ala-Gln)。在一些方面，MRM包含约6.8mM二肽(例如Ala-Gln)。在一些方面，MRM包含约6.81mM二肽(例如Ala-Gln)。在一些方面，MRM包含约6.9mM二肽(例如Ala-Gln)。在一些方面，MRM包含约6.96mM二肽(例如Ala-Gln)。在一些方面，MRM包含约7.0mM二肽(例如Ala-Gln)。
在一些方面，MRM包含小于约5mM氨(NH3)。在一些方面，MRM包含小于约4mM、小于约3.5mM、小于约3mM、小于约2.5mM、小于约2mM、小于约1.5mM、小于约1mM、小于约0.5mM、小于约0.4mM、小于约0.3mM、小于约0.2mM或小于约0.1mM氨。在一些方面，MRM包含约0.01mM氨到小于约2mM氨、约0.01mM氨到小于约1.9mM氨、约0.01mM氨到小于约1.8mM氨、约0.01mM氨到小于约1.7mM氨、约0.01mM氨到小于约1.6mM氨、约0.01mM氨到小于约1.5mM氨、约0.01mM氨到小于约1.4mM氨、约0.01mM氨到小于约1.3mM氨、约0.01mM氨到小于约1.2mM氨、约0.01mM氨到小于约1.1mM氨、约0.01mM氨到小于约1mM氨、约0.01mM氨到小于约0.9mM氨、约0.01mM氨到小于约0.8mM氨、约0.01mM氨到小于约0.7mM氨、约0.01mM氨到小于约0.6mM氨、约0.01mM氨到小于约0.5mM氨、约0.01mM氨到小于约0.4mM氨、约0.01mM氨到小于约0.3mM氨、约0.01mM氨到小于约0.2mM氨或约0.01mM氨到小于约0.1mM氨。在一些方面，MRM包含约1.2mM氨。在一些方面，MRM包含约1.25mM氨。在一些方面，MRM包含约1.259mM氨。在一些方面，MRM包含约1.28mM氨。在一些方面，MRM包含约1.3mM氨。在一些方面，MRM包含约0.3mM氨。在一些方面，MRM包含约0.34mM氨。在一些方面，MRM包含约0.35mM氨。在一些方面，MRM包含约0.36mM氨。在一些方面，MRM包含约0.37mM氨。在一些方面，MRM包含小于约0.3mM氨。在一些方面，MRM包含小于约0.29mM氨。在一些方面，MRM包含小于约0.28mM氨。在一些方面，MRM包含小于约0.278mM氨。在一些方面，MRM不包含氨。
在一些方面，MRM包含乳酸盐。在一些方面，MRM不包含乳酸盐。
在一些方面，MRM(例如二次TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)还包含CD3激动剂和/或CD28激动剂。CD3激动剂和/或CD28激动剂可刺激在培养基中培养的TIL。在一些方面，CD3激动剂可以是能够结合到CD3复合物并激活CD3的任一分子。在一些方面，CD3激动剂是小分子。在一些方面，CD3激动剂是蛋白质。在一些方面，CD3激动剂是抗CD3抗体。如本文所用的术语“抗CD3抗体”是指针对T细胞中的CD3复合物的抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括人类、人源化、嵌合或鼠类抗体。在一些方面，抗CD3抗体包括OKT-3(又称为莫罗单抗(muromonab))和UCHT-1。其它抗CD3抗体包括例如维西珠单抗(visilizumab)、奥昔组单抗(otelixizumab)和替利组单抗(teplizumab)。
术语“OKT-3”或“OKT3”是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物类似物或变体，包括人类、人源化、嵌合或鼠类抗体，并且包括市售形式，例如OKT-3(30ng/mL,MACS GMP CD3纯，Miltenyi Biotech公司,San Diego,Calif.,USA)和莫罗单抗或其变体、保守氨基酸取代、糖型或生物类似物。将能够产生OKT-3的杂交瘤保藏在欧洲认证细胞培养物保藏中心(European Collection of Authenticated CellCultures，ECACC)并指派目录号86022706。还将能够产生OKT-3的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)并指派ATCC登录号CRL 8001。
在一些方面，CD28激动剂可以是能够激活CD28或其下游通路的任一分子。在一些方面，CD28激动剂是小分子。在一些方面，CD28激动剂是蛋白质。在一些方面，CD28激动剂是抗CD28抗体。如本文所用的术语“抗CD28抗体”是指针对CD28并激活T细胞的抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括人类、人源化、嵌合或鼠类抗体。在一些方面，抗CD28抗体包括目录号100182-1(BPS Bioscicence)、目录号100186-1(BPS Bioscience)。
在一些方面，CD3激动剂和CD28激动剂一起添加到MRM中。在一些方面，CD3激动剂和CD28激动剂以一种组合物同时添加到MRM中。在一些方面，CD3激动剂和CD28激动剂按顺序添加。在一些方面，MRM(例如二次TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)包含和/或补充有包含CD3激动剂和CD28激动剂的取代物，例如TRANSACTTM。在一些方面，MRM包含至少约1:100TRANSACTTM。在一些方面，MRM包含至少约1:150TRANSACTTM。在一些方面，MRM包含至少约1:200TRANSACTTM。在一些方面，MRM包含至少约1:250TRANSACTTM。在一些方面，MRM包含至少约1:300TRANSACTTM。在一些方面，MRM包含至少约1:350TRANSACTTM。在一些方面，MRM包含至少约1:400TRANSACTTM。在一些方面，MRM包含至少约1:450TRANSACTTM。在一些方面，MRM包含至少约1:500TRANSACTTM。
在一些方面，MRM(例如二次TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)包含和/或补充有TRANSACTTM替代物。人工抗原呈递细胞(aAPC)(例如基因工程化的人K562aAPC)可用于快速扩增TIL。在一些方面，aAPC是通过用包含编码CD70、CD80、CD86、41BB配体和OX40配体的基因的多顺反子慢病毒载体转导K562细胞来产生。K562细胞不表达HLA-A、HLA-B或HLA-DR分子，这使其在用上文所提及的共刺激配体转导时成为T细胞扩增的有力工具(参见例如Suhoski等人，Molecular therapy,2007)。在一些方面，二次TIL扩增和/或第三TIL扩增包括共培养TIL与aAPC+OKT3。在一些方面，二次TIL扩增和/或第三TIL扩增包括在OKT3(例如至少约30ng/mL OKT3)而非TRANSACTTM存在下共培养TIL与经辐照的APC(例如PBMC)。在一些方面，免疫细胞(例如TIL)对饲养细胞(例如aAPC)的比率为至少约1:50、至少约1:100、至少约1:150、至少约1:200、至少约1:250、至少约1:300、至少约1:350、至少约1:400、至少约1:450或至少约1:500。在一些方面，免疫细胞(例如TIL)对饲养细胞(例如aAPC)的比率为至少约1:100。在一些方面，免疫细胞(例如TIL)对饲养细胞(例如aAPC)的比率为至少约1:200。
在一些方面，MRM(例如二次TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)包含和/或补充有CD27配体(CD27L)。CD27配体(CD70)能够结合到其受体，然后在结合后，受体能够产生并长期维持T细胞免疫性。CD27是TNF受体超家族的成员。CD27是120kDa的跨膜同二聚体磷酸糖蛋白，似乎还具有共刺激作用。CD27L CD70是在T细胞和B细胞上响应抗原刺激表达的跨膜糖蛋白；因此，将其视为激活早期的标记物。在体外，T细胞上的CD27与B细胞上的CD70的相互作用在增殖方面增强T细胞激活，但仅分泌相对较低量的IL-2。基因敲除小鼠的研究已显示，CD27在原初T细胞激活中起次要作用，但对T细胞记忆的产生至关重要。
在一些方面，MRM(例如二次TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)包含约0.1μg/ml到约50μg/ml CD27L。在一些方面，MRM包含和/或补充有约0.1μg/ml到约40μg/ml、约0.1μg/ml到约30μg/ml、约0.1μg/ml到约20μg/ml、约0.1μg/ml到约10μg/ml、约0.1μg/ml到约5μg/ml、约1μg/ml到约10μg/ml、约2μg/ml到约10μg/ml、约3μg/ml到约10μg/ml、约4μg/ml到约10μg/ml、约5μg/ml到约10μg/ml、约1μg/ml到约9μg/ml、约1μg/ml到约8μg/ml、约1μg/ml到约7μg/ml、约1μg/ml到约6μg/ml、约1μg/ml到约5μg/ml、约3μg/ml到约7μg/ml、约4μg/ml到约6μg/ml、约3μg/ml到约6μg/ml或约4μg/ml到约7μg/ml CD27L。
在一些方面，MRM(例如二次TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)包含和/或补充有至少约0.1μg/ml、至少约1μg/ml、至少约2μg/ml、至少约3μg/ml、至少约4μg/ml、至少约5μg/ml、至少约6μg/ml、至少约7μg/ml、至少约8μg/ml、至少约9μg/ml、至少约10μg/ml、至少约11μg/ml、至少约12μg/ml、至少约13μg/ml、至少约14μg/ml、至少约15μg/ml、至少约16μg/ml、至少约17μg/ml、至少约18μg/ml、至少约19μg/ml、至少约20μg/ml、至少约25μg/ml、至少约30μg/ml或至少约50μg/ml CD27L。在一些方面，MRM包含和/或补充有至少约5μg/ml CD27L。
在一些方面，MRM(例如二次TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)包含和/或补充有4-1BB配体(4-1BBL)。4-1BBL(4-1BB配体CD137L)发现于APC(抗原呈递细胞)上并结合到4-1BB(又称为CD137)，它是属于TNF超家族的2型跨膜糖蛋白受体，在激活T淋巴细胞上表达。4-1BB配体可用于激活体外T细胞。在一些方面，MRM(例如二次TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)包含约0.1μg/ml到约50μg/ml CD27L。在一些方面，MRM包含和/或补充有约0.1μg/ml到约10μg/ml、约0.1μg/ml到约9μg/ml、约0.1μg/ml到约8μg/ml、约0.1μg/ml到约7μg/ml、约0.1μg/ml到约6μg/ml、约0.1μg/ml到约5μg/ml、约0.1μg/ml到约4μg/ml、约0.1μg/ml到约3μg/ml、约0.1μg/ml到约2μg/ml、约0.1μg/ml到约1μg/ml、1μg/ml到约10μg/ml、约1μg/ml到约5μg/ml、约1μg/ml到约4μg/ml、约1μg/ml到约3μg/ml或约1μg/ml到约2μg/ml4-1BBL。
在一些方面，MRM(例如二次TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)包含和/或补充有至少约0.1μg/ml、至少约0.2μg/ml、至少约0.3μg/ml、至少约0.4μg/ml、至少约0.5μg/ml、至少约0.6μg/ml、至少约0.7μg/ml、至少约0.8μg/ml、至少约0.9μg/ml、至少约1μg/ml、至少约1.1μg/ml、至少约1.2μg/ml、至少约1.3μg/ml、至少约1.4μg/ml、至少约1.5μg/ml、至少约1.6μg/ml、至少约1.7μg/ml、至少约1.8μg/ml、至少约1.9μg/ml、至少约μg/ml、至少约2μg/ml、至少约3μg/ml、至少约4μg/ml、至少约5μg/ml或至少约10μg/ml 4-1BBL。在一些方面，MRM包含和/或补充有至少约1μg/ml4-1BBL。
在一些方面，4-1BBL与CD27L一起添加到MRM中。在一些方面，4-1BBL与CD27L同时添加到MRM中。在一些方面，4-1BBL与CD27L按顺序添加到MRM中。在一些方面，扩增过程(例如二次扩增和/或最终扩增)期间所用的MRM包含TRANSACTTM、4-1BBL和CD27L。在一些方面，MRM包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L。在一些方面，扩增过程(例如二次扩增和/或最终扩增)期间所用的MRM包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L。
在一些方面，MRM(例如初始TIL培养基、二次TIL扩增培养基和/或第三(或最终)TIL扩增培养基)由选自以下的基础培养基修改而来：平衡盐溶液(例如PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、克里克培养基、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良达尔伯克培养基(IMDM)、M199、OpTmizerTMCTSTMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)、OPTMIZERTM完全培养基、IMMUNOCULTTMXF(STEMCELLTMTechnologies)、IMMUNOCULTTMXF、AIM V、TEXMACSTM培养基和它们的任何组合。在一些方面，基础培养基是不含血清的。在一些方面，基础培养基还包含免疫细胞血清替代物(ICSR)。举例来说，在一些方面，基础培养基包括补充有ICSR的OPTMIZERTM完全培养基、补充有ICSR的AIM V、补充有ICSR的IMMUNOCULTTMXF、补充有ICSR的RPMI、补充有ICSR的TEXMACSTM或它们的任何组合。在具体方面中，基础培养基包括OPTMIZERTM完全培养基。在一些方面，适宜基础培养基包括克里克培养基、培养基、/>T细胞扩增培养基(Sigma-Aldrich)、AIM/>培养基/>培养基(Miltenyi Biotech)、/>培养基(Stem Cell Technologies)、T细胞扩增XSFM(Irvine Scientific)、伊斯科夫培养基和/或RPMI-1640培养基。
本公开包括含有基础培养基、NaCl、KCl、钙和葡萄糖的MRM，其中NaCl的浓度介于约40mM与约80mM之间，KCl的浓度介于40mM与90mM之间，钙的浓度介于约0.5mM与约2.8mM之间，并且葡萄糖的浓度介于约10mM与约24mM之间。
在一些方面，MRM还包含免疫细胞。在一些方面，免疫细胞包含TIL。
在一些方面，MRM还包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的任何组合。在一些方面，MRM还包含IL-2和IL-21。在一些方面，IL-2的浓度为约200ng/ml到约400ng/ml(例如约200ng/ml、约300ng/ml或约400ng/ml)。在一些方面，IL-21的浓度为约20ng/ml到约40ng/ml(例如约20ng/ml、约30ng/ml或约40ng/ml)。
在一些方面，MRM还包含约2.5％血清补充物(CTSTMImmune Cell SR,ThermoFisher)、2mM L-谷氨酰胺、2mM L-glutamax、MEM非必需氨基酸溶液、Pen-strep、20μg/mlFUNGINTM、丙酮酸钠或它们的任何组合。在一些方面，MRM还包含O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐。在一些方面，MRM还包含激酶抑制剂。
在一些方面，MRM还包含CD3激动剂。在一些方面，CD3激动剂是抗CD3抗体。在一些方面，抗CD3抗体包括OKT-3。
在一些方面，MRM还包含CD28激动剂。在一些方面，CD28激动剂是抗CD28抗体。在一些方面，MRM还包含CD27配体(CD27L)。在一些方面，MRM还包含4-1BB配体(4-1BBL)。
在一些方面，本公开包括包含本文所公开MRM的细胞培养物、包含本文所公开MRM的细胞袋或包含本文所公开MRM的生物反应器。
II.H.细胞
本公开的一些方面是关于培养TIL的方法，所述方法包括将TIL放置于包含浓度大于5mM的钾离子的培养基中，如本文所公开。本公开的一些方面是关于培养TIL的方法，所述方法包括将TIL放置于包含浓度高于40mM的钾离子的培养基中，如本文所公开。本公开的一些方面是关于培养TIL的方法，所述方法包括将TIL放置于包含浓度为至少约50mM的钾离子的培养基中，如本文所公开。本公开的一些方面是关于培养TIL的方法，所述方法包括将TIL放置于包含浓度为至少约40mM到至少约90mM的钾离子的培养基中，如本文所公开。
本公开的一些方面是关于培养TIL的方法，所述方法包括将TIL放置于包含浓度高于40mM的钾离子和浓度小于100mM的NaCl的培养基中，如本文所公开。本公开的一些方面是关于培养TIL的方法，所述方法包括将TIL放置于包含浓度为至少约50mM的钾离子和浓度小于90mM的NaCl的培养基中，如本文所公开。本公开的一些方面是关于培养TIL的方法，所述方法包括将TIL放置于包含浓度为至少约40mM到至少约90mM的钾离子和浓度小于100mM到50mM的NaCl的培养基中，如本文所公开。
放置于MRM中的TIL可以是从需要疗法的受试者收集和/或分离的TIL。在一些方面，放置于培养基中的TIL在放置于本文所公开的MRM中之前已扩增。放置于培养基中的TIL可称为起始(初始，即患者样品、血球分离样品、血沉棕黄层)TIL。从将其在本文所公开的培养基中培养产生的TIL可称为所得(所培养)TIL。
在一些方面，TIL存在于从受试者获得的肿瘤样品中。因此，在一些方面，所述方法包括将肿瘤样品放置于本文所公开的MRM中。在标准TIL培养期间，将肿瘤样品(例如肿瘤活体组织切片或其片段)平铺于初始TIL培养基中，并且培养至少约14-19天。在一些方面，将肿瘤样品(例如肿瘤活体组织切片)在初始TIL培养中在MRM中培养至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天。在一些方面，初始TIL培养持续约14天。在一些方面，初始TIL培养持续足够天数直到产生约2×106到约10×106个细胞的细胞产量。
在一些方面，与初始TIL培养前CD8+TIL对非CD8+TIL的比例(例如CD8+TIL对CD4+TIL的比例)相比，在初始TIL培养后CD8+TIL对非CD8+TIL的比例增加。在一些方面，与在基础培养基或不包含增加的钾离子浓度的培养基(对照培养基)中进行初始TIL培养后CD8+TIL对非CD8+TIL的比例(例如CD8+TIL对CD4+TIL的比例)相比，在初始TIL培养后CD8+TIL对非CD8+TIL的比例增加。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约45倍或至少约50倍。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约40倍。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约50倍。
在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％或至少约500％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约20％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约40％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约60％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约80％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加至少约100％。
在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约20％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约30％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约40％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约50％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约60％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约70％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约75％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约80％。在一些方面，CD8+TIL的比例增加到培养物中TIL总数的至少约90％。
在一些方面，与初始TIL培养之前肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加约2倍到约500倍、约2倍到约250倍、约2倍到约200倍、约2倍到约150倍、约2倍到约100倍、约2倍到约90倍、约2倍到约80倍、约2倍到约70倍、约2倍到约60倍、约2倍到约50倍、约2倍到约40倍、约2倍到约30倍、约2倍到约20倍、约2倍到约10倍、约5倍到约200倍、约5倍到约150倍、约5倍到约100倍、约5倍到约90倍、约5倍到约80倍、约5倍到约70倍、约5倍到约60倍、约5倍到约50倍、约5倍到约40倍、约5倍到约30倍、约5倍到约20倍、约5倍到约10倍、约10倍到约150倍、约10倍到约100倍、约10倍到约90倍、约10倍到约80倍、约10倍到约70倍、约10倍到约60倍、约10倍到约50倍、约10倍到约40倍、约10倍到约30倍或约10倍到约20倍。在一些方面，与初始TIL培养之前肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约2倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约125倍、至少约150倍、至少约175倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍、至少约350倍、至少约400倍、至少约450倍或至少约500倍。在一些方面，与初始TIL培养之前肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约2倍。在一些方面，与初始TIL培养之前肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约3倍。在一些方面，与初始TIL培养之前肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约4倍。在一些方面，与初始TIL培养之前肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约5倍。在一些方面，与初始TIL培养之前肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约10倍。
在一些方面，与使用对照方法(例如，在包含少于40mM钾离子，例如4mM钾离子的培养基中)进行扩增之后肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加约2倍到约500倍、约2倍到约250倍、约2倍到约200倍、约2倍到约150倍、约2倍到约100倍、约2倍到约90倍、约2倍到约80倍、约2倍到约70倍、约2倍到约60倍、约2倍到约50倍、约2倍到约40倍、约2倍到约30倍、约2倍到约20倍、约2倍到约10倍、约5倍到约200倍、约5倍到约150倍、约5倍到约100倍、约5倍到约90倍、约5倍到约80倍、约5倍到约70倍、约5倍到约60倍、约5倍到约50倍、约5倍到约40倍、约5倍到约30倍、约5倍到约20倍、约5倍到约10倍、约10倍到约150倍、约10倍到约100倍、约10倍到约90倍、约10倍到约80倍、约10倍到约70倍、约10倍到约60倍、约10倍到约50倍、约10倍到约40倍、约10倍到约30倍或约10倍到约20倍。在一些方面，与使用对照方法(例如，在包含少于40mM钾离子，例如4mM钾离子的培养基中)进行扩增之后肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约2倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约125倍、至少约150倍、至少约175倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍、至少约350倍、至少约400倍、至少约450倍或至少约500倍。在一些方面，与使用对照方法(例如，在包含少于40mM钾离子，例如4mM钾离子的培养基中)进行扩增之后肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约2倍。在一些方面，与使用对照方法(例如，在包含少于40mM钾离子，例如4mM钾离子的培养基中)进行扩增之后肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约3倍。在一些方面，与使用对照方法(例如，在包含少于40mM钾离子，例如4mM钾离子的培养基中)进行扩增之后肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约4倍。在一些方面，与使用对照方法(例如，在包含少于40mM钾离子，例如4mM钾离子的培养基中)进行扩增之后肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约5倍。在一些方面，与使用对照方法(例如，在包含少于40mM钾离子，例如4mM钾离子的培养基中)进行扩增之后肿瘤反应细胞的数量相比，根据本文所公开的培养方法，培养物中肿瘤反应细胞的数量增加至少约10倍。
在一些方面，从人类受试者分离肿瘤样品。在一些方面，从人类受试者分离起始肿瘤样品，并且将其中的TIL扩增用于同种异体细胞疗法。在一些方面，从人类受试者分离肿瘤样品，并且将其中的TIL扩增用于自体细胞疗法。
II.I.TIL分离、扩增和收获
可根据本文所公开的方法(例如通过在本文所述的培养基中培养和/或扩增TIL)来修改TIL分离、培养和/或扩增的任一方法。
II.I.1.初始扩增
一般来说，从获自人类受试者的肿瘤样品获得TIL。可将从受试者获得肿瘤活体组织切片的任何方法用于本文所公开的方法中，只要肿瘤样品含有肿瘤和TIL的混合物即可。在一些方面，通过肿瘤切除分离肿瘤样品。在一些方面，通过针吸活检分离肿瘤样品(参见例如美国公布第US 2020/0277573号，其全文皆以引用的方式并入本文中)。在一些方面，肿瘤样品包含实体瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。在其它方面，肿瘤样品包含液体肿瘤，例如从恶性血液病获得的肿瘤。肿瘤可具有任一癌症类型，包括(但不限于)乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、宫颈癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌、肝癌(包括但不限于肝细胞癌)和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些方面，肿瘤包括黑色素瘤。在一些方面，肿瘤包括结直肠癌。在一些方面，肿瘤包括胰腺癌。在一些方面，肿瘤包括头颈癌。在一些方面，肿瘤包括宫颈癌。在一些方面，肿瘤包括卵巢癌。在一些方面，将肿瘤样品在TIL分离/扩增之前冷冻保存。在一些方面，肿瘤样品是新鲜的，例如未经冷冻保存。在一些方面，将肿瘤样品直接放置于MRM培养基中。
在一些方面，供体患者(例如从中获得肿瘤的受试者)是未经治疗的(即，患者尚未接受用于治疗肿瘤的先前疗法)。在一些方面，供体患者已接受一种或多种用于治疗肿瘤的先前疗法。在一些方面，受试者已接受至少一种先前疗法、至少两种先前疗法、至少三种先前疗法或至少四种先前疗法。在一些方面，受试者在一种或多种先前疗法后再发或是一种或多种先前疗法难治的。
在一些方面，受试者已接受一种或多种先前抗癌疗法。在一些方面，先前抗癌疗法包含标准护理疗法。在一些方面，先前抗癌疗法包含免疫疗法。在一些方面，先前疗法包含含有检查点抑制剂的免疫疗法。在一些方面，先前疗法包含含有抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、抗LAG-3抗体或它们的任何组合的免疫疗法。
在一些方面，在切除肿瘤样品之前，向受试者施用增强TIL分离和/或扩增的一种或多种疗法。在一些方面，向受试者施用激酶抑制剂或ITK抑制剂。激酶抑制剂和/或ITK抑制剂的实例可参见例如国际公布第WO2019217753号，其全文皆以引用的方式并入本文中。在一些方面，将激酶抑制剂和/或ITK抑制剂在初始扩增和/或第二扩增期间添加到培养基中。在一些方面，ITK抑制剂选自由以下组成的组：基于氨基噻唑的ITK抑制剂、基于苯并咪唑的ITK抑制剂、基于氨基嘧啶的ITK抑制剂、基于3-氨基吡啶-2-酮的ITK抑制剂、基于吲哚基吲唑的ITK抑制剂、基于吡唑基-吲哚的抑制剂、噻吩并吡唑抑制剂和靶向ATP口袋中的半胱氨酸-442的ITK抑制剂。在一些方面，ITK抑制剂选自由以下组成的组：依鲁替尼(ibrutinib)、达沙替尼(dasatinib)、博舒替尼(bosutinib)、尼罗替尼(nilotinib)、埃罗替尼(erlotinib)、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469和它们的任何组合。
在一些方面，将肿瘤样品切割成较小片段。在一些方面，一个或多个较小片段为至少约1mm2、至少约1.5mm2、至少约2mm2、至少约2.5mm2、至少约3mm2、至少约3.5mm2、至少约4mm2、至少约4.5mm2、至少约5mm2、至少约5.5mm2、至少约6mm2或至少约6.5mm2。在一些方面，一个或多个较小片段为至少约1mm3、至少约1.5mm3、至少约2mm3、至少约2.5mm3、至少约3mm3、至少约3.5mm3、至少约4mm3、至少约4.5mm3、至少约5mm3、至少约5.5mm3、至少约6mm3、至少约6.5mm3、至少约7mm3、至少约7.5mm3、至少约8mm3、至少约8.5mm3、至少约9mm3、至少约9.5mm3或至少约10mm3。在一些方面，通过在酶培养基(例如补充有谷氨酸盐(例如约2mM)、庆大霉素(gentamicine，例如约10mcg/mL)、DNase(例如约30单位/mL)和胶原酶(例如约1.0mg/mL)的RPMI 1640缓冲液或MRM)中培养肿瘤样品使肿瘤样品经受酶消化。在一些方面，通过以下方式产生肿瘤消化物：将肿瘤放置于酶培养基中和/或使肿瘤机械解离(即解聚)(例如约1分钟)，然后在37℃下在5％CO2中孵育(例如30分钟)，然后在上述条件下重复机械解离和孵育周期直到仅存在小的组织片。在该过程结束时，如果细胞悬浮液含有大量红血球或死细胞，则可使用FICOLL支链亲水性多糖实施密度梯度分离以去除这些细胞。可在任一培养基中实施机械和/或酶解离。在一些方面，机械和/或酶解离是在本文所公开的MRM培养基中实施。
在一些方面，机械解离包括将物理压力施加到切除的肿瘤。在一些方面，机械解离包括重复物理压力。在一些方面，每分钟施加重复物理压力至少约50次、至少约60次、至少约70次、至少约80次、至少约90次、至少约100次、至少约110次、至少约120次、至少约130次、至少约140次、至少约150次、至少约160次、至少约170次、至少约180次、至少约190次、至少约200次、至少约210次、至少约220次、至少约230次、至少约240次、至少约250次、至少约260次、至少约270次、至少约280次、至少约290次、至少约300次、至少约310次、至少约320次、至少约330次、至少约340次、至少约350次或至少约360次。在一些方面，每分钟施加重复物理压力至少约120至260次。在一些方面，施加的重复物理压力高达约6N/cm2、高达约5.5N/cm2、高达约5.0N/cm2、高达约4.5N/cm2、高达约4.0N/cm2、高达约3.5N/cm2、高达约3.0N/cm2。在一些方面，机械解离进行约90分钟或更短时间、约85分钟或更短时间、约80分钟或更短时间、约75分钟或更短时间、约70分钟或更短时间、约65分钟或更短时间、约60分钟或更短时间、约55分钟或更短时间或约50分钟或更短时间。在一些方面，在室温下施加机械解离。在一些方面，在小于室温下施加机械解离。在一些方面，根据国际公布第WO 2021/123832号中所公开的方法和/或使用其中所公开的装置施加机械解离，所述国际公布的全文皆以引用的方式并入本文中。
在一些方面，将肿瘤样品(即，切除的肿瘤组织样品或解离的肿瘤样品)或其片段放置于培养基(例如本文所公开的培养基)中，其中培养基还包含IL-2。在一些方面，培养基包含至少约4000IU/ml IL-2、至少约4500IU/ml IL-2、至少约5500IU/ml IL-2、至少约6000IU/ml IL-2或至少约6500IU/ml IL-2。在一些方面，培养基包含至少约600IU/ml IL-2。在一些方面，培养基包含至少约100ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约200ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约300ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约400ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约500ng/mL IL-2。在一些方面，培养基包含至少约600ng/mL IL-2。
在其它方面，将肿瘤样品或其片段放置于培养基(例如本文所公开的培养基)中，其中培养基还包含IL-21。在一些方面，培养基包含至少约1.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约2.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约3.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约4.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约5.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约6.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约7.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约8.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约9.0ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约10ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约15ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约20ng/mL IL-21。在一些方面，培养基包含至少约30ng/mL IL-21。
个别肿瘤片段可在单一培养室(例如孔)中一起培养，或个别肿瘤片段可在单独培养室(例如孔)中培养。用于促进TIL从所培养的肿瘤样品逃逸的标准培养基包括补充有以下物质的RPMI 1640：Glutamax(Gibco/Tnvitrogen；Carlsbad,Calif.)、1×Pen-Strep(Gibco/Invitrogen；Carlsbad,Calif.)、50μm 2-巯基乙醇(Gibco/Invitrogen；Carlsbad,Calif.)、20μg/ml庆大霉素(Gibco/Invitrogen；Carlsbad,Calif.)和1mM丙酮酸盐(Gibco/Invitrogen；Carlsbad,Calif.)。在一些方面，根据本公开来修改标准培养基。在一些方面，标准培养基包含补充有以下物质的CTSTMOpTimizerTM：血清补充物(CTSTMImmune Cell SR,Thermo Fisher)、L-谷氨酰胺(Gibco)、L-glutamax(Gibco)、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、Pen-strep(Gibco)、funginTM(InvivoGen)、丙酮酸钠(Gibco)、IL-2、IL-21、O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐(Sigma)或它们的任何组合。在一些方面，标准培养基包含补充有以下物质的CTSTMOpTimizerTM：约2.5％血清补充物(CTSTMImmune Cell SR,Thermo Fisher)、约2mML-谷氨酰胺(Gibco)、约2mM L-glutamax(Gibco)、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、Pen-strep(Gibco)、约20μg/ml funginTM(InvivoGen)、丙酮酸钠(Gibco)、约IL-2(300ng/mL)、约IL-21(30ng/ml)和约1mM O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐(Sigma)。
在一些方面，将肿瘤样品或其片段在初始培养中培养至少约1周、至少约2周或至少约3周。在一些方面，将肿瘤样品或其片段培养至少约2周。如本文所用的“肿瘤样品”是指肿瘤组织和/或解聚的肿瘤组织(即，源自肿瘤组织的机械和/或化学解聚的细胞悬浮液)。在一些方面，将肿瘤样品或片段在初始培养中培养约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天。
在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或片段与肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂接触。在一些方面，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂、OX40激动剂、CD27激动剂、GITR激动剂、HVEM激动剂、CD95激动剂或它们的任何组合。在一些方面，TNFRSF激动剂是美国公布第US 2020/0121719 A1号中所公开的任一TNFRSF激动剂，所述美国公布的全文皆以引用的方式并入本文中。在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其片段与约10-500ng/ml 4-1BB配体接触。在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其片段与约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约125ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约250ng/ml、约300ng/ml、约350ng/ml、约400ng/ml、约450ng/ml、约500ng/ml、约550ng/ml、约600ng/ml、约650ng/ml、约700ng/ml、约750ng/ml、约800ng/ml、约850ng/ml、约900ng/ml、约950ng/ml、约1000ng/ml或约1100ng/ml 4-1BB配体接触。在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其片段与约100ng/ml 4-1BB配体接触。在一些方面，在初始培养的约第3天、在初始培养的约第4天、在初始培养的约第5天、在初始培养的约第6天或在初始培养的约第7天，使肿瘤样品或其片段与4-1BB配体接触。在一些方面，在初始培养的约第5天，使肿瘤样品或其片段与4-1BB配体接触。
在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其片段与TRANSACTTM接触。在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其片段与TRANSACTTM(例如约1:50、约1:100、约1:150、约1:200、约1:250、约1:300、约1:350或约1:400)接触。在一些方面，在初始培养的约第4天、在初始培养的约第5天、在初始培养的约第6天或在初始培养的约第7天，使肿瘤样品或其片段与TRANSACTTM接触。在一些方面，在初始培养的约第5天，使肿瘤样品或其片段与TRANSACTTM接触。在一些方面，初始培养还包括使肿瘤样品或其片段与4-1BB配体和和TRANSACTTM。在一些方面，在初始培养的约第3天，使肿瘤样品或其片段与4-1BB配体和TRANSACTTM接触。在一些方面，在初始培养的约第4天，使肿瘤样品或其片段与4-1BB配体和TRANSACTTM接触。在一些方面，在初始培养的约第5天，使肿瘤样品或其片段与4-1BB配体和TRANSACTTM接触。在一些方面，在初始培养的约第6天，使肿瘤样品或其片段与4-1BB配体和TRANSACTTM接触。在一些方面，在初始培养的约第7天，使肿瘤样品或其片段与4-1BB配体和TRANSACTTM接触。在一些方面，在初始培养的约第8天，使肿瘤样品或其片段与4-1BB配体和TRANSACTTM接触。
在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约1×105到至少约1×108个、至少约5×105到至少约1×108个、至少约1×106到至少约1×108个、至少约2×106到至少约1×108个、至少约3×106到至少约1×108个、至少约4×106到至少约1×108个、至少约5×106到至少约1×108个、至少约1×105到至少约5×107个、至少约5×105到至少约10×106个、至少约1×106到至少约10×106个、至少约2×106到至少约10×106个、至少约3×106到至少约10×106个、至少约4×106到至少约10×106个或至少约5×106到至少约10×106个细胞/所培养片段。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约2×106-10×106个细胞/片段。
在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约1×105个、至少约2×105个、至少约3×105个、至少约4×105个、至少约5×105个、至少约6×105个、至少约7×105个、至少约8×105个、至少约9×105个、至少约1×106个、至少约2×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约10×106个细胞/片段。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约2×106个细胞/片段。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约3×106个细胞/片段。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约4×106个细胞/片段。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约5×106个细胞/片段。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约6×106个细胞/片段。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约7×106个细胞/片段。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约8×106个细胞/片段。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约9×106个细胞/片段。在一些方面，在初始培养物中培养肿瘤样品或其片段直到初始培养物中的细胞产量达到至少约10×106个细胞/片段。在一些方面，使细胞(例如TIL)在初始培养后通过筛滤器。在一些方面，使细胞(例如TIL)在初始培养后通过至少约10μm、至少约15μm、至少约20μm、至少约25μm、至少约30μm、至少约35μm、至少约40μm、至少约45μm、至少约50μm筛滤器。在一些方面，使细胞(例如TIL)在初始培养后通过约40μm筛滤器。
在一些方面，在一个或多个透气烧瓶(例如，GREX烧瓶)中实施初始扩增步骤。在一些方面，在静态GREX中实施初始扩增步骤。在一些方面，在搅拌罐中实施初始扩增。在一些方面，在生物反应器中实施初始扩增步骤。在一些方面，在封闭系统(例如使用GREX封闭系统)中实施初始扩增。
II.I.2.二次扩增
在一些方面，使TIL经受二次扩增。在一些方面，在一个或多个透气烧瓶(例如，GREX烧瓶)中实施二次扩增步骤。在一些方面，在不打开封闭系统下，使TIL过渡到二次扩增。在一些方面，在使TIL进行到二次扩增之前，针对肿瘤特异性细胞溶解活性筛选第一次扩增的TIL。在一些方面，在进行到二次扩增之前，针对一种或多种生物标记物的表达筛选TIL。在一些方面，生物标记物包含一种或多种基因的表达，所述一种或多种基因通常是由更原初的TIL(例如CD8+、CD27+、CD3+、CD95+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+、TCF7+或它们的任何组合)表达。在一些方面，在进行到二次扩增之前，针对PD-1的表达筛选TIL。在一些方面，在使TIL进行到二次扩增之前，不对第一次扩增的TIL进行筛选。在一些方面，使在初始扩增中获得的所有TIL经受二次扩增。在一些方面，在进行到二次扩增之前，汇集第一次扩增的TIL。
在一些方面，使用快速扩增方案(REP)使TIL经受二次扩增。参见例如Dudley等人，Science 298:850-54(2002)；Dudley等人，J.Clin.Oncol.23:2346-57(2005)；Dudley等人，J.Clin.Oncol.26:5233-39(2008)；Riddell等人，Science 257:238-41(1992)；和Dudley等人，J.Immunother.26:332-42(2003)，所述文献中每一者的全文皆以引用的方式并入本文中。在一些方面，使TIL在饲养淋巴细胞和白细胞介素-2(IL-2)、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合存在下使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增。在某些方面，使TIL在IL-2、IL-15和IL-21存在下快速扩增。在一些方面，快速扩增期间培养基中IL-2的浓度低于初始培养期间培养基中IL-2的浓度。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度小于300ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约50ng/ml、约55ng/ml、约60ng/ml、约65ng/ml、约70ng/ml、约73.6ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约85ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约105ng/ml、约110ng/ml、约115ng/ml、约120ng/ml、约125ng/ml、约130ng/ml、约135ng/ml、约140ng/ml、约145ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml或约275ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约50ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约55ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约60ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约65ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约70ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约73.6ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约75ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约80ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约85ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约90ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约95ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-2的浓度为约100ng/ml。
在一些方面，快速扩增期间培养基中IL-21的浓度低于初始培养期间培养基中IL-21的浓度。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度小于30ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约1ng/ml、约2ng/ml、约3ng/ml、约4ng/ml、约5ng/ml、约6ng/ml、约7ng/ml、约8ng/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约11ng/ml、约12ng/ml、约13ng/ml、约14ng/ml、约15ng/ml、约16ng/ml、约17ng/ml、约18ng/ml、约19ng/ml、约20ng/ml、约21ng/ml、约22ng/ml、约23ng/ml、约24ng/ml、约25ng/ml、约26ng/ml、约27ng/ml、约28ng/ml或约29ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约5ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约6ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约7ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约8ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约9ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约10ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约11ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约12ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约13ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约14ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-21的浓度为约15ng/ml。
在一些方面，快速扩增期间培养基中IL-15的浓度为约0.1ng/ml、约0.2ng/ml、约0.3ng/ml、约0.4ng/ml、约0.5ng/ml、约0.6ng/ml、约0.7ng/ml、约0.8ng/ml、约0.9ng/ml、约1.0ng/ml、约1.1ng/ml、约1.2ng/ml、约1.3ng/ml、约1.4ng/ml、约1.5ng/ml、约1.6ng/ml、约1.7ng/ml、约1.8ng/ml、约1.9ng/ml、约2.0ng/ml、约2.25ng/ml、约2.5ng/ml、约2.75ng/ml、约3.0ng/ml、约3.5ng/ml、约4.0ng/ml、约4.5ng/ml或约5.0ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.1ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.2ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.3ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.4ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.5ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.6ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.7ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.8ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约0.9ng/ml。在一些方面，快速扩增期间IL-15的浓度为约1.0ng/ml。
非特异性T细胞受体刺激物可包括例如OKT3(例如约30ng/ml)，它是小鼠单克隆抗CD3抗体(可从Raritan,N.J.或Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany获得)。在一些方面，通过在T细胞生长因子(例如约200-400IU/ml的T细胞生长因子，例如300IU/ml IL-2或IL-15)存在下，用一种或多种抗原(包括其抗原部分，例如表位，或可任选地从载体表达的癌细胞，例如人类白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如约0.3μMMART-1:26-35(27L)或gp100:209-217(210M))体外刺激外周血单个核细胞(PBMC)来快速扩增TIL。在一些方面，通过使用TRANSACTTM刺激来扩增TIL。在一些方面，体外诱导的TIL是通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的癌症的相同抗原刺激来快速扩增。在一些方面，可用辐照的自体淋巴细胞或用辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2来刺激TIL。
在一些方面，在第二扩增期间通过在包含TRANSACTTM和任选地4-1BBL和/或CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在第二扩增期间通过在包含TRANSACTTM、4-1BBL和CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在第二扩增期间通过在包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。
在一些方面，一个或多个TIL在TIL扩增之前、期间或之后进行基因修饰。TIL的基因修饰可使用所属领域中已知的任何方法来达成。在一些方面，使用Cas9核酸内切酶(CRISPR；参见例如US2017067021A1，其全文皆以引用的方式并入本文中)、TALEN、锌指核酸内切酶、定点诱变或它们的任何组合来修饰一个或多个TIL。在一些方面，一个或多个TIL进行基因修饰以破坏或除去人类细胞因子诱导的含SH2蛋白(CISH；参见例如US10406177B2，其全文皆以引用的方式并入本文中)的表达。在一些方面，一个或多个TIL是使用AAV来修饰，例如，一个或多个TIL包含AAV。在一些方面，一个或多个TIL是使用慢病毒或反转录病毒来修饰。在一些方面，一个或多个TIL进行基因修饰以表达外源修饰或工程化的T细胞受体(TCR)。在一些方面，一个或多个TIL进行基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，一个或多个TIL进行基因修饰以表达CD86。在一些方面，一个或多个TIL进行基因修饰以表达OX40L。在一些方面，一个或多个TIL进行基因修饰以表达4-1BBL。在一些方面，一个或多个TIL进行基因修饰以表达抗PD1抗体。
在一些方面，在还包含肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)激动剂的培养基中扩增TIL。任一TNFRSF激动剂可用于本文所公开的方法中。TNFRSF激动剂的非限制性实例可参见例如US20200121719A1，其全文皆以引用的方式并入本文中。在一些方面，TNFRSF激动剂是在初始培养后添加。在一些方面，TNFRSF激动剂是在第二和/或或最终扩增期间添加。
在一些方面，在还包含4-1BB激动剂的培养基中扩增TIL。任一4-1BB激动剂可用于本文所公开的方法中。在一些方面，4-1BB激动剂包括4-1BB抗体。4-1BB激动剂的非限制性实例可参见例如US20200032209A1，其全文皆以引用的方式并入本文中。在一些方面，4-1BB激动剂是在初始培养后添加。在一些方面，4-1BB激动剂是在第二或最终扩增期间添加。
在一些方面，在第二扩增期间通过在包含TRANSACTTM和任选地4-1BBL和/或CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在第二扩增期间通过在包含TRANSACTTM、4-1BBL和CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在第二扩增期间通过在包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L的培养基中培养细胞来刺激TIL。
在一些方面，在还包含腺苷a2a受体拮抗剂的培养基中扩增TIL。任一腺苷a2a受体拮抗剂可用于本文所公开的方法中。腺苷a2a受体拮抗剂的非限制性实例可参见例如US20210137930A1，其全文皆以引用的方式并入本文中。在一些方面，腺苷a2a受体拮抗剂选自由以下组成的组：韦帕南特(vipadenant)、CPI-444(西弗南特(ciforadenant))、SCH58261、ZM241385、SCH420814、SYN115、8-CSC、KW-6002、A2A受体拮抗剂1、ADZ4635、ST4206、KF21213、SCH412348和7MMG-49、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶体或前药和它们的组合。在一些方面，腺苷a2a受体拮抗剂是在初始培养期间添加。在一些方面，腺苷a2a受体拮抗剂是在第二和/或或最终扩增期间添加。
在一些方面，在还包含AKT通路抑制剂(AKTi)的培养基中扩增TIL。任一AKTi可用于本文所公开的方法中。可用于本公开中的AKTi的非限制性实例可参见例如WO2020096927，其全文皆以引用的方式并入本文中。在一些方面，AKTi选自由以下组成的组：阿氟色替(afuresertib)、优普色替(uprosertib)、帕他色替(ipatasertib)、AT7867、AT13148和其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶体或前药。在一些方面，AKTi是mTOR抑制剂，例如AZD8055或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶体或前药。在一些方面，AKTi是PI3K抑制剂，例如LY294002或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶体或前药。在一些方面，AKTi是在初始培养期间添加。在一些方面，AKTi是在第二和/或或最终扩增期间添加。
在一些方面，通过使所扩增TIL与一个或多个抗原呈递细胞接触来再激活或刺激所扩增细胞。任一抗原呈递细胞可用于本文所公开的方法中。在一些方面，抗原呈递细胞是进行基因修饰的细胞。在一些方面，抗原呈递细胞包含细胞表面上的肿瘤抗原或其片段。在一些方面，使所扩增TIL与在细胞表面上包含一种以上的肿瘤抗原或其片段的抗原呈递细胞接触。
在一些方面，抗原呈递细胞(APC)进行基因工程化。在一些方面，APC进行基因工程化，用于一个或多个转基因(例如抗原或刺激信号)的可调谐表达。在一些方面，APC是根据WO2020/086742中所公开的方法进行基因工程化，所述文献的全文皆以引用的方式并入本文中。在一些方面，APC进行基因工程化以表达一种或多种刺激分子。在一些方面，APC进行基因工程化以表达CD86、OC40L、4-1BBL或它们的任何组合。在一些方面，APC是美国专利No.US 10,415,015号中所公开的APC，所述美国专利的全文皆以引用的方式并入本文中。
在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约1×107到至少约50×107个、至少约2×107到至少约40×107个、至少约3×107到至少约30×107个、至少约4×107到至少约25×107个、至少约5×107到至少约20×107个、至少约1×107到至少约20×107个、至少约2×107到至少约20×107个、至少约3×107到至少约20×107个或至少约4×107到至少约20×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约5×107到至少约20×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约1×107个、至少约2×107个、至少约3×107个、至少约4×107个、至少约5×107个、至少约6×107个、至少约7×107个、至少约8×107个、至少约9×107个、至少约10×107个、至少约11×107个、至少约12×107个、至少约13×107个、至少约14×107个、至少约15×107个、至少约16×107个、至少约17×107个、至少约18×107个、至少约19×107个或至少约20×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约5×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约6×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约7×107个细胞。在一些方面，在二次扩增中培养TIL直到二次TIL培养基中的细胞产量达到至少约8×107个细胞。在一些方面，在二次扩增中培养TIL直到二次TIL培养基中的细胞产量达到至少约9×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约10×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约15×107个细胞。在一些方面，在二次TIL培养基中培养TIL直到二次扩增中的细胞产量达到至少约20×107个细胞。
在一些方面，使TIL经受最终扩增。在一些方面，在不打开封闭系统(例如GREX封闭系统)下，使TIL从二次扩增过渡到最终扩增。在一些方面，在一个或多个透气烧瓶(例如，GREX烧瓶)中实施最终扩增步骤。在一些方面，二次扩增对应于REP方案的第一阶段(即，REP方案直到细胞分裂)，最终扩增对应于REP方案的第二阶段(即，细胞分裂之后的REP方案)。因而，在一些方面，二次扩增具有约3到7天(例如，约5天、约6天或约7天)的持续时间，并且最终扩增具有约3到7天(例如，约5天、约6天或约7天)的持续时间。
在一些方面，最终扩增期间的培养基包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或它们的组合。在某些方面，最终扩增期间的培养基包含IL-2、IL-15和IL-21。在一些方面，最终扩增期间培养基中IL-2的浓度低于初始培养期间培养基中IL-2的浓度。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度小于300ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约50ng/ml、约55ng/ml、约60ng/ml、约65ng/ml、约70ng/ml、约73.6ng/ml、约75ng/ml、约80ng/ml、约85ng/ml、约90ng/ml、约95ng/ml、约100ng/ml、约105ng/ml、约110ng/ml、约115ng/ml、约120ng/ml、约125ng/ml、约130ng/ml、约135ng/ml、约140ng/ml、约145ng/ml、约150ng/ml、约175ng/ml、约200ng/ml、约225ng/ml、约250ng/ml或约275ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约50ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约55ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约60ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约65ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约70ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约73.6ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约75ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约80ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约85ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约90ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约95ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-2的浓度为约100ng/ml。
在一些方面，最终扩增期间培养基中IL-21的浓度低于初始培养期间培养基中IL-21的浓度。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度小于30ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约1ng/ml、约2ng/ml、约3ng/ml、约4ng/ml、约5ng/ml、约6ng/ml、约7ng/ml、约8ng/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约11ng/ml、约12ng/ml、约13ng/ml、约14ng/ml、约15ng/ml、约16ng/ml、约17ng/ml、约18ng/ml、约19ng/ml、约20ng/ml、约21ng/ml、约22ng/ml、约23ng/ml、约24ng/ml、约25ng/ml、约26ng/ml、约27ng/ml、约28ng/ml或约29ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约5ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约6ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约7ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约8ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约9ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约10ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约11ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约12ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约13ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约14ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-21的浓度为约15ng/ml。
在一些方面，最终扩增期间培养基中IL-15的浓度为约0.1ng/ml、约0.2ng/ml、约0.3ng/ml、约0.4ng/ml、约0.5ng/ml、约0.6ng/ml、约0.7ng/ml、约0.8ng/ml、约0.9ng/ml、约1.0ng/ml、约1.1ng/ml、约1.2ng/ml、约1.3ng/ml、约1.4ng/ml、约1.5ng/ml、约1.6ng/ml、约1.7ng/ml、约1.8ng/ml、约1.9ng/ml、约2.0ng/ml、约2.25ng/ml、约2.5ng/ml、约2.75ng/ml、约3.0ng/ml、约3.5ng/ml、约4.0ng/ml、约4.5ng/ml或约5.0ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-15的浓度为约0.1ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-15的浓度为约0.2ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-15的浓度为约0.3ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-15的浓度为约0.4ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-15的浓度为约0.5ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-15的浓度为约0.6ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-15的浓度为约0.7ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-15的浓度为约0.8ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-15的浓度为约0.9ng/ml。在一些方面，最终扩增期间IL-15的浓度为约1.0ng/ml。
在一些方面，最终扩增包括刺激。在一些方面，刺激与二次扩增期间所用的刺激相同。在一些方面，在最终扩增期间通过在包含TRANSACTTM、4-1BBL、CD27L或它们的任何组合的MRM中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在最终扩增期间通过在包含TRANSACTTM和任选地4-1BBL和/或CD27L的MRM中培养细胞来刺激TIL。在一些方面，在最终扩增期间通过在包含至少约1:100TRANSACTTM、至少约1μg/ml 4-1BBL和至少约5μg/ml CD27L的MRM中培养细胞来刺激TIL。
在一些方面，在静态GREX中实施最终扩增步骤。在一些方面，在搅拌罐中实施最终扩增。在一些方面，在生物反应器中实施最终扩增步骤。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40×109到至少约100×109个、至少约40×109到至少约90×109个、至少约40×109到至少约80×109个、至少约40×109到至少约70×109个、至少约40×109到至少约60×109个、至少约40×109到至少约50×109个、至少约10×109到至少约100×109个、至少约20×109到至少约100×109个、至少约30×109到至少约100×109个、至少约30×109到至少约50×109个或至少约35×109到至少约45×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40×109到至少约100×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40×109个、至少约45×109个、至少约50×109个、至少约55×109个、至少约60×109个、至少约65×109个、至少约70×109个、至少约75×109个、至少约80×109个、至少约85×109个、至少约90×109个、至少约95×109个或至少约100×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约40×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约50×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约60×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约70×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约80×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约90×109个细胞。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量达到至少约100×109个细胞。
在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约7天到至少约21天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约7天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约8天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约9天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约10天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约11天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约12天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约13天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约14天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约15天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约16天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约17天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约18天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约19天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约20天。在一些方面，继续最终扩增直到最终TIL培养基中的细胞产量持续至少约21天。
在一些方面，二次扩增和最终扩增合并成单个二次扩增。在一些方面，单个二次扩增包含二次扩增和最终扩增的所有方面。在一些方面，单个二次扩增发生在封闭系统(例如，GREX封闭系统)中，其中所述封闭系统在单个二次扩增期间不打开。在一些方面，一旦细胞达到高度汇合，则在单个二次扩增期间细胞分裂。
在一些方面，扩增过程(例如，(i)初始扩增过程、二次扩增过程和最终扩增过程；或(ii)初始扩增过程和单个二次扩增过程)的整个持续时间是22天或更短。使用较短的扩增过程产生年轻TIL赋予所得TIL组合物各种益处。因而，本文所公开的培养条件和方法赋予针对年轻TIL所鉴定的那些组合物额外的益处，例如增加干细胞样特征、扩大克隆多样性、提高细胞溶解活性和/或增加CD8+细胞扩增。
II.I.3.收获和冷冻保存
在一些方面，收获所扩增TIL。TIL可使用任一方法、包括通过离心来收获。在一些方面，TIL是使用自动化系统来收获。细胞收获机和/或细胞处理系统可从多种来源购得，并且任何基于细胞的收获机可用于本文所公开的方法中。在一些方面，细胞收获机和/或细胞处理系统是基于膜的细胞收获机。在一些方面，细胞收获是使用细胞处理系统(例如LOVO系统(Fresenius Kabi))来实施。在一些方面，细胞收获机和/或细胞处理系统可在封闭无菌系统中实施细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其它细胞处理步骤。
在一些方面，收获是从封闭系统生物反应器实施的。在一些方面，采用封闭系统进行TIL扩增。在一些方面，采用单一生物反应器。在一些方面，封闭系统生物反应器是单一生物反应器。在开放和封闭系统中离体扩增TIL的方法的实例可参见例如美国专利No.10,166,257号，其全文皆以引用的方式并入本文中。
在一些方面，将所扩增TIL冷冻保存。TIL可使用任何方法冷冻保存。冷冻保存哺乳动物细胞(包括TIL)的多种方法已阐述于例如(i)General Protocol for theCryopreservation of Mammalian Cells,UNC(2007)，可在unclineberger.org/tissueculture/protocols/general-protocol-for-the-cryopr eservation-of-mammalian-cells/上获得；和(ii)Clarke等人，Improved post-thaw recovery ofperipheral blood stem/progenitor cells using anovel intracellular-likecryopreservation solution,Cytotherapy 2009-6-6，可在sigmaaldrich.com/catalog/papers/19499402上获得；所述文献中每一者的全文皆以引用的方式并入本文中。
在一些方面，根据以下方法培养TIL：
(1)从受试者分离肿瘤样品，并且将肿瘤切割成片段和/或机械或化学解聚。
(2)然后在初始培养物中培养所得肿瘤样品或其片段，所述初始培养物包含进一步补充有300ng/mL或6000IU/ml IL-2和30ng/ml IL-21的本文所公开的代谢重编程培养基。
(3)任选地，在开始初始培养后第5天，使TIL与TRANSACTTM(1:200)和100ng/mL 4-1BB配体接触，然后将TIL再培养5-9天或直到达到约10×106到约200×106个细胞。然后汇集TIL。
(4)然后将步骤3的至少0.5×106个TIL与100-200倍过量的辐照的PBMC饲养细胞混合并在补充有30ng/ml抗CD3抗体(例如OKT3)、75ng/mL IL-2、10ng/mL IL-21和0.4ng/mLIL-15的培养基(例如本文所公开的代谢重编程培养基)中培养。继续该二次(REP)培养直到获得TIL的治疗有效量，如本文所述。
III.本公开的组合物
本公开的一些方面是关于包含TIL群体的组合物，所述TIL群体富集CD8+TIL。在一些方面，组合物包含根据本文所公开的任一方法培养的TIL群体。在一些方面，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约20％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约30％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约40％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约50％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约60％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约70％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约80％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约90％的TIL是CD8+TIL。在一些方面，至少约95％的TIL是CD8+TIL。
本公开的一些方面是关于包含扩增TIL群体的组合物，其中与使用对照方法(例如在包含浓度小于约5mM的钾离子的培养基中培养)扩增的TIL群体的克隆多样性相比，扩增TIL群体具有增加的克隆多样性。在一些方面，扩增TIL群体的克隆多样性与肿瘤样品中TIL的克隆多样性相同。在一些方面，扩增TIL群体的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约99％到约100％、至少约98％到约100％、至少约97％到约100％、至少约96％到约100％、至少约95％到约100％、至少约94％到约100％、至少约93％到约100％、至少约92％到约100％、至少约91％到约100％、至少约90％到约100％、至少约85％到约100％、至少约80％到约100％、至少约75％到约100％、至少约70％到约100％、至少约65％到约100％、至少约60％到约100％、至少约55％到约100％、至少约50％到约100％、至少约45％到约100％或至少约40％到约100％。在某些方面，扩增TIL群体的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约95％。在某些方面，扩增TIL群体的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约90％。在某些方面，扩增TIL群体的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约85％。在某些方面，扩增TIL群体的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约80％。在某些方面，扩增TIL群体的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约75％。在某些方面，扩增TIL群体的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约70％。在某些方面，扩增TIL群体的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约60％。在某些方面，扩增TIL群体的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约50％。在某些方面，扩增TIL群体的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约40％。
在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.5、小于约0.45、小于约0.4、小于约0.35、小于约0.3、小于约0.275、小于约0.25、小于约0.225、小于约0.2、小于约0.175、小于约0.15、小于约0.125、小于约0.1、小于约0.075、小于约0.07、小于约0.06或小于约0.05。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.5。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.4。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.3。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.275。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.25。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.24。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.23。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.22。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.21。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.2。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.19。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.18。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.17。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.16。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.15。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.14。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.13。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.12。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.11。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.1。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.09。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.08。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.07。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.06。在一些方面，如通过辛普森克隆性所测量，扩增TIL群体的克隆多样性评分小于约0.05。
在一些方面，与使用对照方法(例如，在包含少于40mM钾离子，例如4mM钾离子的培养基中)扩增或培养的肿瘤反应TIL克隆的选择性扩增相比，本文所述的方法选择性地使肿瘤反应TIL克隆的扩增增加约2倍到约500倍、约2倍到约250倍、约2倍到约200倍、约2倍到约150倍、约2倍到约100倍、约2倍到约90倍、约2倍到约80倍、约2倍到约70倍、约2倍到约60倍、约2倍到约50倍、约2倍到约40倍、约2倍到约30倍、约2倍到约20倍、约2倍到约10倍、约5倍到约200倍、约5倍到约150倍、约5倍到约100倍、约5倍到约90倍、约5倍到约80倍、约5倍到约70倍、约5倍到约60倍、约5倍到约50倍、约5倍到约40倍、约5倍到约30倍、约5倍到约20倍、约5倍到约10倍、约10倍到约150倍、约10倍到约100倍、约10倍到约90倍、约10倍到约80倍、约10倍到约70倍、约10倍到约60倍、约10倍到约50倍、约10倍到约40倍、约10倍到约30倍或约10倍到约20倍。在一些方面，本文所述的方法选择性地使肿瘤反应TIL克隆的扩增增加约2倍。在一些方面，本文所述的方法选择性地使肿瘤反应TIL克隆的扩增增加约5倍。在一些方面，本文所述的方法选择性地使肿瘤反应TIL克隆的扩增增加约10倍。
在一些方面，本文所述的方法选择性地使肿瘤反应TIL克隆的扩增增加，其中克隆多样性维持。在一些方面，本文所述的方法选择性地使肿瘤反应TIL克隆增加约2倍到约50倍，其中克隆多样性维持约70％到约100％。在一些方面，本文所述的方法选择性地使肿瘤反应TIL克隆增加约2倍，其中克隆多样性维持约70％到约100％。在一些方面，本文所述的方法选择性地使肿瘤反应TIL克隆增加约5倍，其中克隆多样性维持约70％到约100％。在一些方面，本文所述的方法选择性地使肿瘤反应TIL克隆增加约10倍，其中克隆多样性维持约70％到约100％。
在一些方面，TIL展现指示低分化表型的一种或多种生物标记物的表达增加。在一些方面，TIL展现增加的TCF7表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现TCF7表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现TCF7表达增加至少约40倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+TCF7+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是TCF7+。
在一些方面，TIL展现增加的CD45RO表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD45RO表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD45RO表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+CD45RO+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD45RO+。
在一些方面，TIL展现增加的CD62L表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD62L表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD62L表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+CD62L+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD62L+。
在一些方面，TIL展现增加的CD27表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+CD27+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD27+。
在一些方面，TIL展现增加的CD62L和CD27表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD62L和CD27表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+/CD62L+/CD27+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD62L+CD27+。
在一些方面，TIL展现增加的CD28表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD28表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD28表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+/CD28+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD28+。
在一些方面，TIL展现增加的CD27和CD28表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27和CD28表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27和CD28表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+CD27+CD28+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+。
在一些方面，TIL展现增加的CD27、CD28、PD1和CD103表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27、CD28、PD1和CD103表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27、CD28、PD1和CD103表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+CD27+CD28+PD1+CD103+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+PD1+CD103+。
在一些方面，TIL展现增加的CD27、CD28、PD1和TCF7表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27、CD28、PD1和TCF7表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27、CD28、PD1和TCF7表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+CD27+CD28+PD1+TCF7+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+PD1+TCF7+。
在一些方面，TIL展现增加的CD27、CD28、PD1、CD103和TCF7表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27、CD28、PD1、CD103和TCF7表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD27、CD28、PD1、CD103和TCF7表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+CD27+CD28+PD1+CD103+TCF7+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD27+CD28+PD1+CD103+TCF7+。
在一些方面，TIL展现增加的CD39表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD39表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD39表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+CD39+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD39+。
在一些方面，TIL展现增加的CD39和PD1表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD39和PD1表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD39和PD1表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+CD39+PD1+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD39+PD1+。
在一些方面，TIL展现增加的PD1表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现PD1表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现PD1表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的免疫细胞是CD8+/PD1+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是PD1+。
在一些方面，TIL展现增加的PD1和CD27表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现PD1和CD27表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现PD1和CD27表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+PD1+CD27+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是PD1+CD27+。
在一些方面，TIL展现增加的CD103表达。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD103表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍或至少约15倍。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现CD103表达增加至少约10倍。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％的TIL是CD8+/CD103+TIL。在一些方面，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的CD8+TIL是CD103+。
在一些方面，与根据常规方法培养的相当免疫细胞相比，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)具有增加的低分化细胞数。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现增加的一种或多种干细胞样表型典型标记物表达。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的代谢重编程培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)群体与根据常规方法(例如在含有小于5mM K+的培养基中)培养的相当细胞相比具有增加的效应物样细胞数。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的代谢重编程培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)群体与根据常规方法(例如在含有小于5mM K+的培养基中)培养的相当细胞相比具有增加的干细胞样和效应物样细胞数。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)与根据常规方法培养的细胞相比展现更大的增殖潜能。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)在移植到受试者中后展现增加的体内活力。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现增加的细胞效力。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)展现减少的细胞耗竭。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)在移植到受试者中后展现增加的体内持久性。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)在移植到受试者中后展现增加的体内活性。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL(例如CD8+TIL)在移植到受试者中后展现更耐久的体内反应。在一些方面，受试者是人。
在一些方面，组合物中至少约5％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约10％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约15％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约20％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约25％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约30％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约35％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约40％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约45％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约50％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约55％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约60％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约65％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。在一些方面，组合物中至少约70％的TIL(例如CD8+TIL)具有干细胞样表型。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL(例如CD8+TIL)后，干细胞样TIL(例如CD8+TIL)占培养物中TIL(例如CD8+TIL)总数的至少约10％到至少约70％。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL(例如CD8+TIL)后，干细胞样TIL(例如CD8+TIL)占培养物中TIL(例如CD8+TIL)总数的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约70％。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL(例如CD8+TIL)后，干细胞样TIL(例如CD8+TIL)占培养物中CD8+TIL总数的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约70％。
在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约1.5倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约2.0倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约2.5倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约3.0倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约3.5倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约4.0倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的细胞数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约4.5倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约5.0倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约5.5倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约6.0倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约6.5倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的细胞数相比增加至少约7.0倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的细胞数相比增加至少约7.5倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约8.0倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL(例如CD8+TIL)数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约9.0倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的细胞数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约10倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的细胞数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约15倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的细胞数与培养前组合物中的TIL(例如CD8+TIL)数相比增加至少约20倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL数与培养前组合物中的TIL数相比增加至少约30倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL数与培养前组合物中的细胞数相比增加至少约40倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL数与培养前组合物中的TIL数相比增加至少约50倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL数与培养前组合物中的TIL数相比增加至少约75倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL数与培养前组合物中的TIL数相比增加至少约100倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL数与培养前组合物中的TIL数相比增加至少约500倍。在一些方面，组合物中具有干细胞样表型的TIL数与培养前组合物中的TIL数相比增加至少约1000倍。
在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL(例如CD8+TIL)后，培养物中TIL(例如CD8+TIL)总数的至少约10％到至少约70％是CD39-/TCF7+T细胞。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL(例如CD8+TIL)后，培养物中TIL(例如CD8+TIL)总数的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％或至少约40％是CD39-/TCF7+TIL(例如CD8+TIL)。
在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD95的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的不表达CD45R0的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD45RA的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CCR7的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD62L的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达TCF7的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD3的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD27的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD45RA的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD95和CD45RA的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD45RA和CCR7的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD95、CD45RA和CCR7的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD45RA、CCR7和CD62L的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7和CD62L的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD45RA、CCR7、CD62L和TCF7的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7、CD62L和TCF7的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27并且是CD45RO低的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27并且是CD45RO低的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27并且不表达CD45RO的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7和CD27并且不表达CD45RO的TIL。
在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的不表达CD39和CD69的TIL。在一些方面，细胞组合物包含增加的百分比的表达CD8并且不表达CD39和CD69的TIL。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL后，培养物中TIL总数的至少约10％到至少约40％是CD39-/CD69-TIL。在一些方面，在根据本文所公开的方法培养TIL后，培养物中TIL总数的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％或至少约40％是CD39-/CD69-TIL。
在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)表达至少两种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)表达至少三种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)表达至少四种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)表达一种或多种干细胞样标记物和至少两种效应物样标记物。在一些方面，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约40％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约50％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约60％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约70％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约75％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约80％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约85％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约90％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约95％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约96％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约97％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约98％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，至少约99％的TIL表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。
在一些方面，干细胞样标记物选自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+和它们的任何组合。在一些方面，干细胞样标记物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+和TCF7+或它们的任何组合。在一些方面，TIL表达CD45RO低。在一些方面，干细胞样标记物包括本文所列的一个或多个基因作为基因签名的一部分(参见上文；参见例如Gattinoni,L.等人，Nat Med 17(10):1290-1297(2011)或Galletti等人，Nat Immunol 21,1552-1562(2020))。在一些方面，效应物样标记物选自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+和它们的任何组合。在一些方面，效应物样标记物包括选自由以下组成的组的STAT靶：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2和它们的任何组合。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)是CD45RA+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)是CD62L+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)是TCF7+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)是CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)是CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)是CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。在一些方面，根据本文所公开的方法和/或在本文所公开的培养基中培养的TIL(例如CD8+TIL)是CD45RA+、CD45RO低、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。
在一些方面，TIL包含一种或多种选自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+和它们的任何组合的标记物，和一种或多种选自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+和它们的任何组合的标记物。在一些方面，TIL包含一种或多种选自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+和它们的任何组合的标记物，和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，TIL包含一种或多种干细胞样标记物，和一种或多种选自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+和它们的任何组合的标记物。在一些方面，效应物样标记物包括选自由以下组成的组的STAT靶：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2和它们的任何组合。
在一些方面，表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的TIL是T干/效应(TSE)细胞。在一些方面，TSE细胞保持低分化状态(例如表达一种或多种干细胞样标记物、能够增殖、能够分化或它们的任何组合)，并且细胞具有效应功能(例如表达一种或多种效应物样标记物、能够靶向和/或杀伤肿瘤细胞、展现多功能性或它们的组合)。在一些方面，本文所公开的TSE细胞表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。在一些方面，本文所公开的TSE细胞表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。在一些方面，TSE细胞是CD45RO低的。
本公开的一些方面是关于包含一个或多个TSE细胞的扩增TIL群体。在一些方面，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约40％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约50％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约60％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约70％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约75％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约80％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约85％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约90％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约95％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约98％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，至少约99％的扩增TIL群体是TSE细胞。在一些方面，群体中约100％的扩增TIL群体是TSE细胞。
本公开的一些方面是关于TIL，其表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，TIL表达至少两种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，TIL表达至少三种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，TIL表达至少四种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。在一些方面，TIL表达一种或多种干细胞样标记物和至少两种效应物样标记物。在一些方面，干细胞样标记物选自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+和它们的任何组合。在一些方面，干细胞样标记物选自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、TCF7+和它们的任何组合。在一些方面，干细胞样标记物包括本文所列的一个或多个基因作为基因签名的一部分(参见上文；参见例如Gattinoni,L.等人，Nat Med 17(10):1290-1297(2011)或Galletti等人，NatImmunol 21,1552-1562(2020))。在一些方面，效应物样标记物选自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+和它们的任何组合。在一些方面，TIL表达CD45RA+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，TIL表达CD62L+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，TIL表达TCF7+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，TIL表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，TIL表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。在一些方面，TIL表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、CD45RO低、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。
本公开的一些方面是关于包含TIL群体的细胞组合物，其中TIL群体包含(i)表达一种或多种干细胞样标记物的第一TIL亚群(例如干细胞样TIL)和(ii)表达一种或多种效应物样标记物的第二TIL亚群(例如效应物样TIL)，其中TIL群体包含与在对照培养基中培养的TIL群体相比较高百分比(即干细胞样TIL数/TIL总数)的表达一种或多种干细胞样标记物的第一TIL亚群。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL产生这些细胞组合物。在一些方面，根据本文所公开的方法培养的TIL具有增加的表达，例如较高百分比的表达GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT和/或NKG7的TIL，和减少的表达，例如较低百分比的表达IL-32的TIL。NKG7最高的细胞已显示为更好的杀手(Malarkannan等人，2020Nat.Immuno.)，而IL-32较高的细胞已显示具有激活诱导的细胞死亡(Goda等人，2006Int.Immunol)。在一些方面，具有较高GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT和/或NKG7表达的TIL是表达效应物样标记物的CD8+TIL。在一些方面，具有较低IL-32表达的TIL是表达效应物样标记物的CD8+TIL。
本公开的一些方面是关于细胞组合物，所述细胞组合物包含表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的TIL。本公开的一些方面是关于细胞群，所述细胞群包含TIL，例如表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的TIL。在一些方面，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的细胞组合物包含表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的TIL。
在一些方面，表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的TIL是T干/效应(TSE)细胞。在一些方面，TSE细胞保持低分化状态(例如表达一种或多种干细胞样标记物、能够增殖、能够分化或它们的任何组合)，并且细胞具有效应功能(例如表达一种或多种效应物样标记物、能够靶向和/或杀伤肿瘤细胞或它们的组合)。在一些方面，本文所公开的TSE细胞表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。在一些方面，本文所公开的TSE细胞表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、STAT5+和STAT3+。在一些方面，本文所公开的TSE细胞表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。在一些方面，本文所公开的TSE细胞表达CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、CD45RO低、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+和STAT3+。本公开的一些方面是关于包含一个或多个TSE细胞的扩增TIL群体。在一些方面，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约40％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约50％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约60％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约70％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约75％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约80％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约85％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约90％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约95％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约98％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，至少约99％的扩增TIL是TSE细胞。在一些方面，约100％的扩增TIL是TSE细胞。
在一些方面，TIL是工程化TIL。如本文所用的“工程化”TIL是指已以一定方式(例如根据本文所公开的方法)操纵，从而赋予TIL一种或多种并非天然TIL所特有的物理和/或功能性质的TIL。举例来说，在一些方面，工程化TIL可通过修饰TIL以表达与细胞异源的一种或多种蛋白质(例如嵌合抗原受体或T细胞受体)来产生，以使得工程化TIL并非天然的。在一些方面，工程化TIL可通过以特定方式(例如在高血钾性培养基中培养)培养TIL来产生，其中所得工程化TIL具有一种或多种在天然细胞中未显示的物理和/或功能性质。
在一些方面，初始培养后的细胞组合物包含至少约2×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约10×106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的细胞组合物包含约2×106到约10×106个、例如约2×106个、约3×106个、约4×106个、约5×106个、约6×106个、约7×106个、约8×106个、约9×106个或约10×106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约2×106个细胞(例如TIL)到约3×106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约3×106个细胞(例如TIL)到约4×106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约4×106个细胞(例如TIL)到约5×106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约5×106个细胞(例如TIL)到约6×106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约6×106个细胞(例如TIL)到约7×106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约7×106个细胞(例如TIL)到约8×106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约8×106个细胞(例如TIL)到约9×106个细胞(例如TIL)。在一些方面，初始培养后的组合物包含约9×106个细胞(例如TIL)到约10×106个细胞(例如TIL)。
在一些方面，第二TIL扩增后的细胞组合物包含至少约5×107个、至少约3×107个、至少约4×107个、至少约5×107个、至少约6×107个、至少约7×107个、至少约8×107个、至少约9×107个、至少约10×107个、至少约11×107个、至少约12×107个、至少约13×107个、至少约14×107个、至少约15×107个、至少约16×107个、至少约17×107个、至少约18×107个、至少约19×107个或至少约20×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的细胞组合物包含约5×107到约20×107个、例如约5×107个、约6×107个、约7×107个、约8×107个、约9×107个、约10×107个、约11×107个、约12×107个、约13×107个、约14×107个、约15×107个、约16×107个、约17×107个、约18×107个、约19×107个或约20×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约5×107到约6×107个细胞(例如TIL)、约6×107到约7×107个细胞(例如TIL)、约7×107到约8×107个细胞(例如TIL)、约8×107到约9×107个细胞(例如TIL)、约9×107到约10×107个细胞(例如TIL)、约10×107到约11×107个细胞(例如TIL)、约11×107到约12×107个细胞(例如TIL)、约12×107到约13×107个细胞(例如TIL)、约13×107到约14×107个细胞(例如TIL)、约14×107到约15×107个细胞(例如TIL)、约15×107到约16×107个细胞(例如TIL)、约16×107到约17×107个细胞(例如TIL)、约17×107到约18×107个细胞(例如TIL)、约18×107到约19×107个细胞(例如TIL)或约19×107到约20×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约5×107到约6×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约6×107到约7×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约7×107到约8×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约8×107到约9×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约9×107到约10×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约10×107到约11×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约11×107到约12×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约12×107到约13×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约13×107到约14×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约14×107到约15×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约15×107到约16×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约16×107到约17×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约17×107到约18×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约18×107到约19×107个细胞(例如TIL)。在一些方面，第二扩增后的组合物包含约19×107到约20×107个细胞(例如TIL)。
在一些方面，最终TIL扩增后的细胞组合物包含至少约40×109个、至少约50×109个、至少约60×109个、至少约70×109个、至少约80×109个、至少约90×109个或至少约100×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的细胞组合物包含约40×109到约100×109个、例如约40×109个、约50×109个、约60×109个、约70×109个、约80×109个、约90×109个或约100×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约40×109到约50×109个细胞(例如TIL)、约50×109到约60×109个细胞(例如TIL)、约60×109到约70×109个细胞(例如TIL)、约70×109到约80×109个细胞(例如TIL)、约80×109到约90×109个细胞(例如TIL)或约90×109到约100×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约40×109到约50×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约50×109到约60×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约60×109到约70×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约70×109到约80×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约80×109到约90×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，最终扩增后的组合物包含约90×109到约100×109个细胞(例如TIL)。
在一些方面，适于施用于受试者的细胞组合物包含至少约2×109个、至少约3×109个、至少约4×109个、至少约5×109个、至少约6×109个、至少约7×109个、至少约8×109个、至少约9×109个或至少约1×1010个或至少约10×1010个或至少约15×1010个或至少约20×1010个或至少约25×1010个或至少约30×1010个CD8+TIL。在一些方面，适于施用于受试者的细胞组合物包含至少约2×109个CD8+TIL。在一些方面，适于施用于受试者的细胞组合物包含至少约5×109个CD8+TIL。在一些方面，适于施用于受试者的细胞组合物包含至少约9×109个CD8+TIL。在一些方面，适于施用于受试者的细胞组合物包含至少约1×1010个CD8+TIL。在一些方面，适于施用于受试者的细胞组合物包含至少约10×1010个CD8+TIL。在一些方面，适于施用于受试者的细胞组合物包含至少约20×1010个CD8+TIL。在一些方面，适于施用于受试者的细胞组合物包含至少约30×1010个CD8+TIL。
在一些方面，本文所公开的方法产生组合物，所述组合物包含至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％活力的TIL。
IV.治疗方法
本公开的一些方面是关于根据本文所公开的任一方法培养的TIL群体。在一些方面，TIL是肿瘤浸润T细胞。在一些方面，TIL包含CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些方面，TIL包含CD8+T细胞。在一些方面，TIL富集肿瘤反应性(例如肿瘤特异性)TIL。在一些方面，TIL富集干细胞样TIL。
在一些方面，将包含TIL群体的组合物施用于有需要的受试者。在一些方面，将使用本文所公开的方法制备的TIL施用于受试者来治疗癌症，例如肿瘤。在一些方面，治疗方法包括向受试者施用有效量的本公开的TIL组合物，例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或干细胞样TIL的TIL群体)的组合物。
本公开还提供了刺激受试者对靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫反应的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的TIL组合物，例如根据本文所公开的方法制备的TIL群体，例如富集CD8+TIL的TIL群体。
在一些方面，以本公开的细胞组合物施用的TIL群体包含自体TIL。
在一些方面，所述方法包括向受试者施用至少约1×104个、至少约5×104个、至少约1×105个、至少约5×105个、至少约1×106个、至少约2×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个、至少约1×107个、至少约5×107个、至少约1×108个TIL。在一些方面，所述方法包括向受试者施用至少约1×104个、至少约5×104个、至少约1×105个、至少约5×105个、至少约1×106个、至少约2×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个、至少约1×107个、至少约5×107个、至少约1×108个、至少约1×109个、至少约2×109个、至少约3×109个、至少约4×109个、至少约5×109个、至少约6×109个、至少约7×109个、至少约8×109个、至少约9×109个、至少约1×1010个、至少约10×1010个、至少约15×1010个、至少约20×1010个、至少约25×1010个或至少约30×1010个细胞。在一些方面，细胞是TIL。在一些方面，TIL是CD8+TIL。
在一些方面，所述方法包括施用至少约10×109个、至少约20×109个、至少约30×109个、至少约40×109个、至少约50×109个、至少约60×109个、至少约70×109个、至少约80×109个、至少约90×109个或至少约100×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约10×109到约100×109个、例如约10×109个、约20×109个、约30×109个、约40×109个、约50×109个、约60×109个、约70×109个、约80×109个、约90×109个或约100×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约10×109到约20×109个细胞(例如TIL)、约20×109到约30×109个细胞(例如TIL)、约30×109到约40×109个细胞(例如TIL)、约40×109到约50×109个细胞(例如TIL)、约50×109到约60×109个细胞(例如TIL)、约60×109到约70×109个细胞(例如TIL)、约70×109到约80×109个细胞(例如TIL)、约80×109到约90×109个细胞(例如TIL)或约90×109到约100×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约10×109到约20×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约20×109到约30×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约30×109到约40×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约40×109到约50×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约50×109到约60×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约60×109到约70×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约70×109到约80×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约80×109到约90×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，所述方法包括施用约90×109到约100×109个细胞(例如TIL)。在一些方面，TIL是CD8+TIL。
在一些方面，TIL是以至少约2:1、至少约2.5:1、至少约3:1、至少约3.5:1或至少约4:1的TIL对肿瘤细胞比率施用。在一些方面，TIL是以至少约2:1的TIL对肿瘤细胞比率施用。在一些方面，TIL是以至少约2.5:1的TIL对肿瘤细胞比率施用。在一些方面，TIL是以至少约3:1的TIL对肿瘤细胞比率施用。在一些方面，TIL是以至少约3.5:1的TIL对肿瘤细胞比率施用。在一些方面，TIL是以至少约4:1的TIL对肿瘤细胞比率施用。
在一些方面，与参考肿瘤体积相比，施用本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或干细胞样TIL))会减小受试者的肿瘤体积。在一些方面，参考肿瘤体积是施用工程化细胞之前受试者的肿瘤体积。在其它方面，参考肿瘤体积是未接受施用的相应受试者的肿瘤体积。在一些方面，与参考肿瘤体积相比，受试者的肿瘤体积在施用后减小至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
在一些方面，治疗肿瘤包括减小受试者的肿瘤重量。在一些方面，施用本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或干细胞样TIL))可在施用于受试者时减小受试者的肿瘤重量。在一些方面，与参考肿瘤重量相比，肿瘤重量在施用后减小至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。在一些方面，参考肿瘤重量是施用本公开的细胞组合物之前受试者的肿瘤重量。在其它方面，参考肿瘤重量是未接受施用的相应受试者的肿瘤重量。
在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或干细胞样TIL))施用于受试者(例如患有肿瘤)可增加受试者的肿瘤和/或肿瘤微环境(TME)中TIL(例如CD8+TIL)的数量和/或百分比。在一些方面，肿瘤和/或TME中TIL(例如CD8+TIL)的数量和/或百分比与参考(例如未接受本公开的细胞组合物的受试者或施用本公开的细胞组合物之前的同一受试者的相应值)相比，增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％、至少约210％、至少220％、至少约230％、至少约240％、至少约250％、至少约260％、至少约270％、至少约280％、至少约290％或至少约300％或更大。
在一些方面，将本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或干细胞样TIL))施用于受试者(例如患有肿瘤)相对于施用包含根据常规方法制备(例如在不包含至少约40mM到至少约90mM、例如至少50mM的钾离子浓度的培养基中培养)的细胞的相似细胞疗法的受试者免疫反应的持续时间，可增加受试者免疫反应的持续时间。在一些方面，与参考(例如施用包含根据常规方法制备(例如在不包含至少50mM钾离子浓度的培养基中培养)的细胞的相似细胞疗法的受试者)相比，免疫反应的持续时间增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或至少约1000％或更大。在一些方面，与参考(例如施用包含根据常规方法制备(例如在不包含至少约40mM到至少约90mM、例如至少50mM钾离子浓度的培养基中培养)的细胞的相似细胞疗法的受试者)相比，免疫反应的持续时间增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍或更大。
除上述外，施用本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或干细胞样TIL))可具有有助于肿瘤治疗的其它效应。
如本文所述，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))可用于治疗多种癌症类型，例如衍生自包括以下的癌症的肿瘤：乳腺癌、头颈癌、子宫癌、脑癌、皮肤癌、肾癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾脏癌、胰腺癌、甲状腺癌、食管癌、眼癌、胃(stomach、gastric)癌、胃肠癌、卵巢癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或它们的组合。在一些方面，癌症包括实体瘤。在一些方面，癌症包括衍生自以下的实体瘤：黑色素瘤、结肠癌、肺癌、宫颈癌、胃肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、头颈部小细胞癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、睾丸生殖细胞肿瘤、胃腺癌、皮肤黑色素瘤、间皮瘤、肾透明细胞癌、宫颈鳞状细胞癌和子宫内膜腺癌、食管癌、膀胱尿路上皮癌、浸润性乳腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠腺癌或它们的任何组合。在一些方面，癌症包括黑色素瘤。在一些方面，癌症包括结直肠癌。在一些方面，癌症包括结肠癌。在一些方面，癌症包括胰腺癌。在一些方面，癌症包括头颈癌。在一些方面，癌症包括宫颈癌。在一些方面，癌症包括卵巢癌。在一些方面，癌症包括肺癌。在一些方面，癌症包括胃肠癌。在一些方面，癌症包括乳腺癌。在一些方面，癌症包括前列腺癌。在一些方面，癌症包括肝癌。在一些方面，癌症包括骨癌。在一些方面，癌症包括头颈部小细胞癌。在一些方面，癌症包括肺鳞状细胞癌。在一些方面，癌症包括肺腺癌。在一些方面，癌症包括胰腺癌。在一些方面，癌症包括头颈部鳞状细胞癌。在一些方面，癌症包括睾丸生殖细胞肿瘤。在一些方面，癌症包括胃腺癌。在一些方面，癌症包括皮肤黑色素瘤。在一些方面，癌症包括间皮瘤。在一些方面，癌症包括肾透明细胞癌。在一些方面，癌症包括宫颈鳞状细胞癌。在一些方面，癌症包括子宫内膜腺癌。在一些方面，癌症包括食管癌。在一些方面，癌症包括膀胱尿路上皮癌。在一些方面，癌症包括浸润性乳腺癌。在一些方面，癌症包括乳头状肾细胞癌。在一些方面，癌症包括结肠腺癌。在一些方面，癌症包括子宫癌。在一些方面，癌症包括脑癌。在一些方面，癌症包括甲状腺癌。在一些方面，癌症包括食管癌。在一些方面，癌症包括眼癌。在一些方面，癌症包括胃(stomach、gastric)癌。在一些方面，癌症包括胃肠癌。在一些方面，癌症包括肉瘤。在一些方面，癌症包括白血病。在一些方面，癌症包括淋巴瘤。在一些方面，癌症包括骨髓瘤。
因此，本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的黑色素瘤的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的结直肠癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的结肠癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的胰腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的头颈癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的宫颈癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的卵巢癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的肺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的胃肠癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的乳腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的前列腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的肝癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的骨癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的头颈部小细胞癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的肺鳞状细胞癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的肺腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的胰腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的头颈部鳞状细胞癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的睾丸生殖细胞肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的胃腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的皮肤黑色素瘤的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的间皮瘤的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的肾透明细胞癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的宫颈鳞状细胞癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的子宫内膜腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的食管癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的膀胱尿路上皮癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的浸润性乳腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的乳头状肾细胞癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的结肠腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的子宫癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的脑肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的食管癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的甲状腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的眼癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的胃(stomach、gastric)癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的胃肠癌的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的肉瘤的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的白血病的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。本公开的一些方面是关于治疗有需要的受试者的骨髓瘤的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的细胞组合物。
在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))可与其它治疗剂(例如抗癌剂和/或免疫调节剂)组合使用。因此，在一些方面，治疗本文所公开肿瘤的方法包括施用本公开的细胞组合物与一种或多种其它治疗剂的组合。
在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))可与一种或多种抗癌剂组合使用，使得可靶向免疫通路的多个元件。在一些方面，抗癌剂包括免疫检查点抑制剂(即阻断通过特定免疫检查点通路的信号传导)。
可用于本发明方法中的免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括CTLA-4拮抗剂(例如抗CTLA-4抗体)、PD1拮抗剂(例如抗PD1抗体、抗PD-L1抗体)、TIM-3拮抗剂(例如抗TIM-3抗体)或它们的组合。在一些方面，检查点抑制剂是PD1拮抗剂。在一些方面，检查点抑制剂是抗PD1抗体。组合治疗的全面和非限制性清单详细公开于本申请别处。
在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是在施用其它治疗剂之前或之后施用于受试者。在其它方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与其它治疗剂同时施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))和其它治疗剂可作为药学上可接受的载体中的单一组合物同时施用。在其它方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))和其它治疗剂是作为单独组合物同时施用。
在一些方面，受试者是非人动物，例如大鼠或小鼠。在一些方面，受试者是人。
在一些方面，本文所公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))可与其它治疗剂(例如抗癌剂和/或免疫调节剂)组合使用。因此，在一些方面，治疗本文所公开肿瘤的方法包括向受试者施用本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))与一种或多种其它治疗剂的组合。所述剂可包括例如化学治疗药物、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、手术程序、辐射程序、共刺激分子激活剂、免疫检查点抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或它们的任何组合。
在一些方面，本文所公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))可与标准护理治疗(例如手术、辐射和化学疗法)组合使用。本文所述的方法亦可用作维持疗法，例如意图防止肿瘤发生或复发的疗法。
在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))可与一种或多种抗癌剂组合使用，使得可靶向免疫通路的多个元件。这类组合的非限制性实例包括：增强肿瘤抗原呈递的疗法(例如树突细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特(imiquimod))；例如通过抑制CTLA-4和/或PD1/PD-L1/PD-L2通路和/或清除或阻断Treg或其它免疫抑制细胞(例如骨髓源性抑制细胞)来抑制负免疫调控的疗法；例如使用刺激CD-137、OX-40和/或CD40或GITR通路和/或刺激T细胞效应功能的激动剂来刺激正免疫调控的疗法；增加全身性抗肿瘤T细胞频率的疗法；例如使用CD25拮抗剂(例如达利珠单抗(daclizumab))或通过离体抗CD25珠粒清除来清除或抑制Treg(例如肿瘤中的Treg)的疗法；影响肿瘤中的抑制骨髓细胞功能的疗法；增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如蒽环)；另一过继性T细胞或NK细胞转移，包括基因工程化的细胞，例如进行工程化以表达嵌合抗原受体的细胞(CAR-T疗法)；抑制代谢酶(例如吲哚胺双加氧酶(IDO)、双加氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法；逆转/防止T细胞无反应性或耗竭的疗法；触发肿瘤位点的先天性免疫激活和/或发炎的疗法；施用免疫刺激细胞因子；阻断免疫阻抑性细胞因子；或它们的任何组合。
在一些方面，抗癌剂包括免疫检查点抑制剂(即阻断经由特定免疫检查点通路的信号传导)。可用于本发明方法中的免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括CTLA-4拮抗剂(例如抗CTLA-4抗体)、PD1拮抗剂(例如抗PD1抗体、抗PD-L1抗体)、TIM-3拮抗剂(例如抗TIM-3抗体)或它们的组合。这类免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括以下：抗PD1抗体(例如纳武单抗(nivolumab，)、派姆单抗(pembrolizumab，/>MK-3475)、匹利珠单抗(pidilizumab，CT-011)、PDR001、MEDI0680(AMP-514)、TSR-042、REGN2810、JS001、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、BGB-A317、BI 754091、SHR-1210和它们的组合)；抗PD-L1抗体(例如阿替利珠单抗(atezolizumab，/>RG7446；MPDL3280A；RO5541267)、德瓦鲁单抗(durvalumab，MEDI4736、/>)、BMS-936559、阿维鲁单抗(avelumab，/>)、LY3300054、CX-072(Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035、MDX-1105和它们的组合)；和抗CTLA-4抗体(例如伊匹单抗(ipilimumab，)、曲美木单抗(tremelimumab，替西莫单抗(ticilimumab)；CP-675,206)、AGEN-1884、ATOR-1015和它们的组合)。
在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与PD1拮抗剂组合施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与抗PD1抗体组合施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与纳武单抗组合施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与派姆单抗组合施用于受试者。
在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与PD-L1拮抗剂组合施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与抗PD-L1抗体组合施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与阿替利珠单抗组合施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与德瓦鲁单抗组合施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与阿维鲁单抗组合施用于受试者。
在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与CTLA-4拮抗剂组合施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与抗CTLA-4抗体组合施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与伊匹单抗组合施用于受试者。在一些方面，本公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与曲美木单抗组合施用于受试者。
在一些方面，抗癌剂包括免疫检查点激活剂(即促进通过特定免疫检查点通路的信号传导)。在一些方面，免疫检查点激活剂包括OX40激动剂(例如抗OX40抗体)、LAG-3激动剂(例如抗LAG-3抗体)、4-1BB(CD137)激动剂(例如抗CD137抗体)、GITR激动剂(例如抗GITR抗体)、TIM3激动剂(例如抗TIM3抗体)或它们的组合。在一些方面，其它治疗剂包括细胞因子。在一些方面，细胞因子包括IL-2、Il-21、Il-7、Il-15或它们的任何组合。
在一些方面，本文所公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是在施用其它治疗剂之前或之后施用于受试者。在其它方面，本文所公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与其它治疗剂同时施用于受试者。在一些方面，本文所公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))和其它治疗剂可作为药学上可接受的载体中的单一组合物同时施用。在其它方面，本文所公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))和其它治疗剂是作为单独组合物同时施用。在一些方面，本文所公开的其它治疗剂和细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是依序施用。
在一些方面，本文所公开的细胞组合物(例如包含根据本文所公开的方法制备的TIL群体(例如富集CD8+TIL、干细胞样TIL、肿瘤特异性TIL和/或原初TIL))是与检查点抑制剂(例如抗PD1抗体)组合施用于受试者。在一些方面，细胞组合物是在检查点抑制剂(例如抗PD1抗体)之前施用。在一些方面，细胞组合物是在检查点抑制剂(例如抗PD1抗体)之后施用。
在一些方面，在接受细胞组合物之前向受试者施用淋巴细胞清除疗法。任一淋巴细胞清除疗法可用于本文所公开的方法中。在一些方面，淋巴细胞清除疗法包含化学疗法。在一些方面，淋巴细胞清除疗法包含环磷酰胺。在一些方面，淋巴细胞清除疗法包含氟达拉滨。在一些方面，淋巴细胞清除疗法包含环磷酰胺和氟达拉滨。在一些方面，淋巴细胞清除疗法是在细胞组合物之前至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天或至少约14天施用。
实施例
实施例1.方法
培养基制备：向T细胞条件培养基(TCM)补充免疫细胞血清替代物(ThermoFisher)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、2mM Glutamax(Gibco)、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、丙酮酸钠(Gibco)、200IU/mL IL-2；120IU/ml IL-7；20IU/ml IL-15。
对于低渗条件培养基，通过添加不含NaCl、葡萄糖和钙的RPMI来调整含有不同浓度的钠、钾、葡萄糖和钙的TCM培养基。将所定义的不含NaCl的RPMI添加到TCM后，最终浓度介于以下范围内：NaCl(40-80mM)、KCl(40-80mM)、钙(0.5-2.8mM)、葡萄糖(10-24mM)和渗透压(约250-260mOsmol)。参见表1。
表1.含有不同浓度的钾、钠、葡萄糖和钙的低渗条件培养基
*张力是基于下式计算：2×(K的浓度+NaCl的浓度)
我们还通过用不同钾浓度维持恒定张力条件(250mOsmol-低渗，280mOsmol-等渗，320mOsmol-高渗)来测试张力对T细胞的影响。低渗条件中的最终浓度是NaCl(35-75mM)、KCl(50-90mM)，等渗条件中的最终浓度是NaCl(50-90mM)、KCl(50-90mM)，高渗条件中的最终浓度是NaCl(70-110mM)、KCl(50-90mM)。参见表2。
表2.含有不同浓度的钾和NaCl的低渗、等渗、高渗溶液
*张力是根据下式计算：张力＝([K]+[NaCl])×2
其中“[K]”是培养基的钾浓度并且“[NaCl]”是培养基的氯化钠浓度。
细胞培养和转导：在T细胞条件培养基-TCM、基础培养基或低渗条件培养基中用TransAct(Miltenyi)激活健康供体冷冻保存的人CD4和CD8细胞。在TCM、基础培养基或低渗条件培养基中激活24小时后，用慢病毒颗粒转导T细胞以在Grex板(Wilson Wolf)中引入嵌合抗原受体(抗CD19 CAR)。在转导后第二天，向T细胞补充新鲜培养基以稀释TransAct并结束T细胞激活。取决于细胞生长和密度，通过抽出Grex板中的一半培养基向T细胞进给温热的2×细胞因子培养基。第7天，将细胞收获，计数并通过流式细胞术分析干性标记物的表达。
细胞内细胞因子测定：第7天，将T细胞洗涤并放置于对照培养基中并使其在布雷菲德菌素(brefeldin)A存在下经受5小时的豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)再刺激以测量细胞内细胞因子IL-2、IFNγ和TNFα。在含有可固定活/死溶液的FACS缓冲液中用表面抗体染色对T细胞染色。在固定和透化后，用针对细胞内细胞因子的相应抗体对细胞染色。使用流式细胞术评价细胞内细胞因子表达的量化。
经由流式细胞术测量干性表型CAR表达：第7天，经由流式细胞术评价来自相应处理的活T细胞。首先用细胞染色缓冲液洗涤细胞并用抗CCR7在37℃下染色15分钟。此后，将针对数种其它抗原的抗体(如下文所详述)的2×主混合物添加到细胞中并在4℃下孵育20分钟。用细胞染色缓冲液洗涤细胞并用foxp3染色试剂盒(ebioscience)根据制造商的方案透化。固定后，将细胞针对TCF7在4℃下染色20分钟，此后通过aurora(cytek)上的流式细胞术分析细胞。以下是用于评价干性标记物的抗体的清单：CD8(BD-#563795)、CD4(BD-#612936)、CD27(BD-#612829)、CD3(Thermo-#612893)、CD28(Biolegend-#302936)、CD62L、CAR-EGFR(Thermo-#352911)、CD45RO(BD#564290)、CD39(Biolegend-#328236)、TCF7(Cellsignaling-#14456)、CCR7(BD-#562381)、CD127(Bio legend-#351324)、CD45RA(BD-#560673)。
实施例2.制备培养基和培养TIL的方法
对照培养基：市售T细胞培养基(例如CTSTMOPTIMIZERTM、IMMUNOCULTTM或TEXMACSTM)。
代谢重编程培养基(“MRM”)：使用不含NaCl的T细胞培养基来调整T细胞培养基的无机盐离子浓度。MRM的最终浓度是以下：NaCl(40-80mM)、KCl(40-90mM)、钙(0.5-2.8mM)、葡萄糖(10-24mM)和渗透压(约250-340mOsmol)。
用于初始培养以及二次和最终TIL扩增的TIL培养基制备：向对照培养基或MRM补充2.5％血清补充物(CTSTMImmune Cell SR,Thermo Fisher)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、2mML-glutamax(Gibco)、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)、Pen-strep(Gibco)、20μg/ml FUNGINTM(InvivoGen)、丙酮酸钠(Gibco)和1mM O-乙酰基-L-肉碱盐酸盐(Sigma)。
初始TIL培养：图1是大体上绘示本文所述培养TIL的方法的某些方面的示意图。将平均大小为1-10mm3的从多个肿瘤类型(结肠癌、肺癌、肝细胞癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和前列腺癌)手术切除的多个肿瘤接种于24孔板中的2ml如上文所述的对照培养基或MRM中，二者皆补充有IL-2(300ng/mL)和IL-21(30ng/ml)。在热夹套孵育器中在含有5％CO2的37℃孵育器中培养肿瘤片段直到可见群落形成。每3天补足补充有IL-2(300ng/mL)和IL-21(30ng/ml)的新鲜培养基(对照或MRM)，这取决于细胞的生长。这一方法在初始培养结束时产生约2×106-10×106个细胞/片段的产量。使用于分析的细胞亚组通过40μm筛滤器并使用多色彩流式细胞术使用多种生物标记物(包括CD62L、CD27、CD28、CD45RO、CD39、TIM3、CD127、PD1、CD103、CD45RA和TCF7)进行表型分型。
二次TIL扩增：当来自初始培养的细胞产量达到约2×106-10×106个细胞/所培养片段时(通常在约第14天到第19天)，通过添加1:100T细胞TRANSACTTM(Miltenyi Biotec)、5μg/ml重组人CD27配体(R&Dsystems)和1μg/ml重组人4-1BB配体/TNFSF9(R&D systems)刺激在对照培养基或MRM中培养的TIL，两种培养基皆补充有IL-2(73.6ng/ml)、IL-21(10ng/ml)和IL-15(0.4ng/ml)。将细胞维持在培养物中直到获得约5×107到20×107个细胞(在刺激后约7到11天)。在二次扩增时段结束时，使用多色彩流式细胞术使用多种生物标记物(包括CD62L、CD27、CD28、CD45RO、CD39、TIM3、CD127、PD1、CD103、CD45RA和TCF7)分析TIL。仅分析活细胞和CD3+细胞。
最终TIL扩增：当培养物达到约5×107到20×107个细胞的产量时，将在对照培养基或MRM中培养的TIL转移到补充有IL-2(73.6ng/ml)、IL-21(10ng/ml)和IL-15(0.4ng/ml)的新鲜对照培养基。用1:100TRANSACTTM(Miltenyi Biotec)、5μg/ml重组人CD27配体(R&Dsystems)和1μg/ml重组人4-1BB配体/TNFSF9(R&D systems)第二次刺激TIL。在静态GREX或搅拌罐中培养细胞直到达成约10×109-100×109个细胞/片段的产量(约14天)并用多色彩流式细胞术分析多种生物标记物，包括CD62L、CD27、CD28、CD45RO、CD39、TIM3、CD127、PD1、CD103、CD45RA和TCF7。为了检查细胞的多功能性，用PMA/离子霉素(1:500)将所得TIL刺激4小时并使用以下标记物实施细胞内染色：CD4、CD8、CD27、IL2、IFNγ、TNFα和TCF7。仅分析活细胞和CD3+细胞。
实施例3.MRM可扩增CD8+、肿瘤反应性、低分化TIL
使TIL如实施例1中所述生长(图1)。初始TIL培养(即14天)后，实施多参数流式细胞术以量化存在于细胞培养物中的CD4+TIL和CD8+TIL的百分比。与在对照培养基中培养的细胞相比，在MRM中培养的细胞显著富集约20％-80％的CD8+TIL(图2A-2C和未显示的数据)。尽管CD4+TIL能够根除实体瘤，但针对肿瘤的优异的细胞溶解活性主要由CD8+TIL调介。肿瘤细胞主要表达I类MHC相关的肿瘤抗原，所述I类MHC相关的肿瘤抗原由CD8+TIL识别。因此，在TIL疗法输注产品中具有较大的CD8+TIL比例在治疗上是有益的。与在对照培养基中培养的TIL相比，使用MRM培养TIL意外地富集CD8+TIL(图2C)。
在MRM中在初始培养结束时(约第14天)获得的TIL还展示了肿瘤反应性TIL的数种细胞表面标记物(例如CD39、CD103、CD226和/或PD1)的一致表达。与在对照培养基中培养的TIL相比，MRM中的初始培养产生CD39和PD1表达增强(大于20％)的TIL(图2A-2B)。先前所用的方法显示，PD1表达在PD1亚组中在初始TIL培养期间完全丧失，这指示肿瘤反应性TIL的不期望丧失(参见例如Poschke等人，Oncoimmunology 5(12):e1240859(2016)；和Gros等人，JCI 124(5):2246-59(2014))。我们观察到，在T细胞刺激后维持PD1表达依赖于供体(数据未显示)。对肿瘤反应性的其它标记物(包括CD39和CD103)的表达获得相似的结果(参见图2A-2B和图5A-5B和未显示的数据)。然而，在整个TIL过程中维持在第14天时观察到的克隆谱(数据未显示)。
在MRM中培养的CD4+TIL和CD8+TIL中，我们还观察到PD1(指示肿瘤反应性代谢状态)和CD27的共表达(图3A-3E)。在原初和记忆定型T细胞上组成型表达的CD27表达指示T细胞的干细胞样表型。先前报告指示，CD27表达在CD8+T细胞中在T细胞刺激后的细胞扩增期间减少(参见例如Tran等人，J.Immunotherapy31(8):742-51(2008)；和Rosenberg等人，Clinical Cancer Research17(13):4550-557(2011)；Huang等人，J.Immunology 176(12):7726-35(2006))。相反，本文所公开的在MRM中培养的TIL在整个培养过程中保持CD27表达，这允许选择性扩增干细胞样肿瘤反应性克隆。如预期的，并非所有的CD27+细胞皆在第14天时共表达PD1，这指示并非所有干细胞样细胞皆展示肿瘤反应性代谢状态。
TIL的抗肿瘤功能和存活依赖于由TCR、细胞因子和共刺激受体接收的合并信号。这些信号中任一者的不充分暴露将导致TIL的无反应性和萎缩。先前所用的培养和扩增TIL的方法导致TIL中的CD27表达损失。然而，已显示，在输注产品中维持CD27表达的TIL(例如在最低限度扩增的TIL中)与过继性T细胞疗法后的肿瘤消退相关(参见例如Tran等人，J.Immunotherapy 31(8):742-51(2008)；和Rosenberg等人，Clinical Cancer Research17(13):4550-557(2011))。另外，共刺激受体(例如CD27和CD28)的表达升高与体内治疗功效相关(Tran等人，J.Immunotherapy 31(8):742-51(2008)；Geltink等人，Cell 171,385-397(2017))。这些共刺激受体的表达还与年轻TIL培养物相关联的干性和较长端粒长度相关。与先前所用的方法(例如对照培养基)相反，使用本文所述的MRM使具有CD27和CD28表达的TIL富集到数种肿瘤类型的TIL总数的约20％到约80％(图4和未显示的数据)。CD27和CD28的富集并非CD8+T细胞亚组所独有，并且也在CD4+亚组中观察到(数据未显示)。
CD27和CD62L的表达与低分化T细胞相关联并与将T细胞有效输送到肿瘤组织和淋巴结相关。CD27、CD28和CD62L的表达还与较长端粒长度相关，端粒长度间接与TIL的年龄和体内治疗功效相关(参见例如Tran等人，J.Immunotherapy 31(8):742-51(2008)；和Rosenberg等人，Clinical Cancer Research 17(13):4550-557(2011))。然而，如本文所公开在MRM中培养的TIL在整个过程中维持CD27和CD62L表达，这与最低限度培养的TIL的CD27和CD62L表达相似。我们观察到与在对照培养基中培养的CD27和CD62L表达相比，在MRM中培养的TIL中CD27和CD62L表达增加约50％(数据未显示)。
认为调介免疫检查点阻断后的肿瘤消退的肿瘤反应性克隆衍生自表达PD1和转导因子TCF-7的CD8+T细胞(Im等人，Nature537:417-21(2016)；和Feldman等人，Cell 175(4):998-1013(2018))。本文所公开在MRM中培养的TIL展示肿瘤反应性TIL生物标记物(PD1和CD103)的富集，同时TCF7表达水平高4倍到50倍(图5A-5C、图6D、图6H、图10)。TCF7的表达指示更多干细胞样细胞。尽管表达PD1，但这些细胞在进一步刺激后保留增殖能力并维持低分化细胞(图6A-6H)。
实施例4：MRM保持TIL的肿瘤反应性
肿瘤本质上是异质的并通常含有例如KRAS、P53和BRAF(公共新抗原)的基因的常见突变。如本文所公开的使用MRM的方法富集识别这类新抗原的TIL。
从患有胰腺癌(它是一种主要具有含KRASG12V、KRASG12C和KRASG12D突变的肿瘤细胞的癌症)的患者获得肿瘤切除物。将上文所提及KRAS热点突变的HPLC纯化的9聚体、10聚体和25聚体肽纯化并用于对从患者匹配的外周血单核细胞产生的不成熟树突细胞(DC)进行脉冲。将这些肽池脉冲的DC与从同一胰腺癌患者获得的TIL共培养并根据上文实施例中所述的方法培养。在MRM中培养TIL导致大约多30％的CD8+T细胞与CD27、CD28、PD1和TCF-7显著共表达(图7A-7H)。这些结果指示，本文所公开的MRM保持识别公共抗原的肿瘤反应性TCR克隆。
如预期的，用野生型KRAS肽进行脉冲的TIL未产生KRAS特异性TIL的特异性扩增。然而，我们一致地观察到在MRM中培养的TIL的CD27、CD28、PD1和TCF7表达增加。这些结果指示，在MRM中培养细胞保持识别公共新抗原的TIL的生长和增殖(图8A-8H)。
在该扩增过程期间维持CD8+TIL和与肿瘤反应性相关的标记物(CD39和PD1)的优先富集(图9A-9B)。这些结果显示，MRM甚至在初始培养后仍进一步增强肿瘤反应性TIL中的PD1表达。另外，根据本文所公开的方法在MRM中培养的TIL展现TCF7表达增加50倍以上，如通过qPCR所测量(图10)。所述数据与TCF7的作用一致，TCF7是再刺激后TIL的自我更新和增殖爆发所需的主转录调控因子。
据报告，TIL中CD103的表达与具有高突变抗原负荷的肿瘤中的TIL浸润相关联。除CD39和PD1表达外，我们的数据证实，在MRM中扩增TIL会增加PD1+CD39+CD103+细胞的数量(图11A-11L)，同时还增加干性相关基因的表达。因此，在MRM中培养TIL可足以增加所得扩增的细胞产物中具有肿瘤反应性和高干细胞样细胞比例的细胞数。
本文所呈现的数据证实，在MRM中扩增TIL产生不仅干性增加、且与肿瘤反应性相关的数种细胞表面标记物的表达也增加的细胞群。使用MRM的本文所述方法产生具有改良的治疗产品的特征和性质的TIL。
实施例5.治疗方法
用于输注的TIL来源于患者的从原发性或转移性肿瘤或淋巴结切除的肿瘤。如上文实施例1中所述，通过将小肿瘤片段(约1-10mm3)平铺于含有MRM的24孔板中来起始TIL培养。使这些片段生长直到获得约2×106到约10×106个细胞/肿瘤片段(通常约2-3周)。将所有片段的所得细胞汇集并以2×106个/孔的密度平铺用于T细胞刺激，例如通过添加TRANSACTTM和任选地CD27激动剂、41BB激动剂和/或OX-40激动剂。将细胞维持于培养物中直到获得约5×107到约20×107个细胞。例如使用TRANSACTTM和任选地CD27激动剂、41BB激动剂和/或OX-40激动剂进一步刺激这些细胞以使输注产品的细胞数增加约1000-2000倍(约1-150×109个TIL)。
在施用TIL输注产品之前，向患者施用例如包含环磷酰胺和氟达拉滨的淋巴细胞清除治疗。除TIL输注外，患者海可在输注如本文所公开培养的TIL后接受抗PD1检查点抑制剂(例如派姆单抗或纳武单抗)。
实施例6.克隆多样性的分析
为了评价根据上文所公开的方法在MRM中培养的TIL的克隆多样性，在对照培养基或代谢重编程培养基(MRM)中培养肿瘤片段和从肿瘤片段获得的TIL。使用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN)从肿瘤和TIL样品分离总基因组DNA并使用用于TCRβ和CDR3区域的Immuno-seq(Adaptive Biotechnologies,Seattle,WA)进行测序。
通过辛普森克隆性√∑pi2评价样品的多样性度量，其中pi是给定样品中克隆i的比例丰度。在肿瘤片段(“肿瘤”)、在对照培养基中培养的TIL(“对照”)和在MRM中培养的TIL(“MRM”)中检查辛普森克隆性和生产性重排(图12)。在MRM中培养的TIL(扩增后)展示约0.04的辛普森克隆性，这指示高克隆多样性，与在肿瘤片段中所见相似(图12)。维持TCRβ多样性代表保持浸润肿瘤并具肿瘤反应性的TIL克隆型。相反，在对照培养基中培养的TIL明显丢失克隆多样性并且展示约0.4的辛普森克隆性(即明显不太多样的克隆性，这指示许多肿瘤反应性克隆在使用对照培养基的培养过程中丢失)(图12)。
使用图12中所呈现的数据产生差异丰度(DA)绘图(ImmunoSeq,AdaptiveBiotechnolgies)。这类DA分析计算任一对样品的TCR重叠(参见例如Emerson等人，J.Path.(2013)，其全文皆以引用的方式并入本文中)、莫氏指数(Morisita’s Index)和雅卡尔指数(Jaccard Index)。这些绘图显示，与肿瘤对在MRM中扩增的TIL(图13B)相比，克隆的差异丰度在肿瘤对在对照培养基中扩增的TIL之间显著不同(图13A)。
与在对照培养基中培养的TIL相比，存在于肿瘤片段中的TIL谱在MRM过程中培养的TIL中高约4倍。在扩增时，TIL通常被具有优先增殖潜能的罕见克隆型超越(这些克隆在图13A-13B中显示沿y轴扩增)。相反，在MRM中培养的TIL显示存在于肿瘤中的广谱克隆型的显著更佳的保持和扩增。TIL群体的克隆多样性的保持和扩增对有效疗法的最佳化至关重要。
为了进一步分析TIL克隆多样性，比较初始肿瘤消化物中的前50种最具优势的普遍TCR与在对照培养基对MRM中扩增的TIL。在MRM中培养保持优势(即普遍)和稀有TIL克隆型。图13D中的细胞系密度显示，在MRM中扩增的大多数T细胞克隆识别肿瘤抗原，而其在对照培养基中培养的T细胞克隆中不识别肿瘤抗原(图13C)。与在对照培养基中培养的T细胞克隆相比，大多数优势肿瘤克隆是由在MRM中扩增的T细胞克隆识别，如通过图13D的虚线上方的连接所指示(图13C)。在前50种优势肿瘤TCR中，与57％保持在MRM中培养的TIL中(图13D)相比，2％保持在对照培养基中培养的TIL中(图13C)。这些数据证实，MRM扩增的TIL比在对照培养基中扩增的TIL保留更真实的初始肿瘤TCR克隆型表示。
实施例7.MRM保持TIL的肿瘤反应性
评估使用本文所述的方法产生的TIL保持KRAS突变体反应性的能力。将在对照培养基或MRM中扩增的TIL与已用突变体KRAS肽进行脉冲的自体树突细胞(DC)混合。10天后，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从TIL分离总基因组DNA并使用用于TCRβ和CDR3区域的Immuno-seq(Adaptive Biotechnologies,Seattle,WA)对TCR-Vb CDR3基元测序并分析。图14显示，在MRM中培养的TIL保持KRAS突变体反应性，而在对照培养基中培养的TIL无法保持KRAS突变体反应性。具体来说，在MRM中培养的TIL共享与在来自肿瘤片段的TIL中所见相似的CDR3氨基酸基元。在对照培养基中培养的TIL中未检测到所述基元。因此，数据显示，在MRM中培养保持原始肿瘤片段中所表示的TIL克隆型。
实施例8.使用MRM产生的TIL展示增加的肿瘤识别和肿瘤杀伤
获得从黑色素瘤获得的TIL并用如上文所述的对照培养基或MRM扩增。自体肿瘤细胞来源于与TIL相同的黑色素瘤样品。简单地说，通过酶消化黑色素瘤片段(使用胶原酶和DNAse)、平铺所得单细胞悬浮液、然后使长出的细胞连续传代来产生黑色素瘤细胞系。评价来源于黑色素瘤的TIL响应黑色素瘤源性细胞系产生炎症性细胞因子的能力。将使用对照培养基或MRM产生的TIL与自体黑色素瘤细胞系共培养24小时。将来自自体黑色素瘤细胞系的100,000个肿瘤细胞平铺于48孔板中的300ul完全RPMI培养基(含有10％FBS)中并孵育过夜。第二天，去除上清液并添加TIL(在肿瘤细胞不存在下平铺一些TIL作为对照)。24小时后，从孔收集培养基上清液并使用MSD测量所分泌的干扰素γ和TNF-α。另外，将用MRM产生的TIL在对照培养基中孵育过夜，并且通过MSD评价IL-2分泌。这些数据显示，根据发炎细胞因子产生，使用MRM扩增的TIL展现显著增加的对自体肿瘤细胞有反应的能力(图15A-15B)。另外，使用MRM产生的TIL在稳态且无刺激下分泌显著更多的IL-2，这指示这些细胞更适合。
还评价来源于黑色素瘤的TIL杀伤黑色素瘤源性细胞系的能力。通过用胰蛋白酶剥离肿瘤细胞并通过流式细胞术对活细胞计数来评价在共培养后剩余的活肿瘤细胞数。基于该活肿瘤细胞计数，计算TIL的肿瘤杀伤％(相对于未经历TIL共培养的肿瘤细胞孔归一化)。使用MRM产生的TIL显示显著更佳的杀伤肿瘤细胞的能力(图15C)。
如上文所述重复上述实验，然而，用W6/32抗体处理一些孔以阻断I类HLA相互作用。图15D展示，使用MRM产生的TIL识别自体肿瘤细胞依赖于I类HLA相互作用，这是因为阻断I类会消除干扰素γ产生的增加。
实施例9.离体肿瘤细胞的TIL清除率
将患者自体黑色素瘤肿瘤细胞以10,000个细胞/孔平铺于xCELLigence阻抗测定孔板中。第二天，将在对照培养基或MRM中扩增的匹配TIL以不同的效应T细胞(E)对肿瘤细胞(T)比率(包括1:1、2:1和4:1)添加到板中。随时间监测肿瘤细胞的TIL清除率。图16显示，在一系列相对剂量下，与在对照培养基中培养的TIL相比，在MRM中培养的TIL在离体测定中展示优异的肿瘤细胞溶解，其中在MRM中培养的效应T细胞对肿瘤细胞的4:1比率引起完全肿瘤根除。
实施例10.离体肿瘤细胞的TIL清除率
比较遵循标准TIL扩增方法产生的非小细胞肺癌(NSCLC)TIL与根据本文所公开的方法在MRM中产生的TIL。尽管对照工艺产生的TIL高度富集CD8+T细胞，但这些细胞并不富集干细胞样CD8+CD39-CD69-T细胞群，并且表达低水平的中央记忆标记物和共刺激受体CD27(图17A-17D)。对照扩增工艺产生具有富集的干细胞样CD8+CD39-CD69-T细胞和较高共刺激受体CD27表达的T细胞产物，但导致CD8+T细胞的扩增减少。在MRM中培养的TIL产生具有增强的CD8+CD39-CD69-干细胞样T细胞丰度、中央记忆标记物(CD45RO+CD62L+)和显著较高的共刺激受体CD27表达的高度富集的CD8+T细胞群(图17E-17H)。这些标记物共同证实与临床反应相关联的干细胞样细胞的属性。
具有增强的干细胞样性质(包括保留关键共刺激受体CD27、端粒延长、记忆细胞表型和存在富集CD39-/CD69-CD8+T细胞的细胞群)的TIL产物与改良的临床反应相关。T细胞的其它分化状态相关的特征(包括分泌多功能细胞因子和表达共刺激受体CD28的能力)也与抗肿瘤效力相关联。在MRM中扩增的TIL展现有利的表型属性，包括与黑色素瘤、NSCLC和结直肠癌中的对照TIL扩增过程相比，增加的CD8+CD39-CD69-T细胞丰度(图18A-18C)。
实施例11.MRM中的TIL培养
本文所呈现的数据显示，在包含增加的钾的培养基中培养TIL产生具有增加的CD8+TIL扩增和增加的干性的TIL群体，这是相对于在具有较低水平的钾(例如小于约40mM钾离子，例如5mM钾离子)的培养基中培养的TIL来说的。另外，数据表明，培养基中超高水平的钾(例如大于约80mM、大于约90mM或大于约100mM钾离子)可减少TIL产量，这可能归因于TIL生长和扩增减少，数据未显示。为了进一步表征MRM对TIL培养的影响，(1)将在初始扩增阶段期间在对照培养基(包含55mM钾离子的等渗RPMI制剂)中培养TIL，然后在最终扩增阶段期间在MRM培养基中培养，所述MRM培养基包含介于50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)的钾离子和介于50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)的NaCl；(2)将在初始扩增阶段期间在MRM培养基中培养TIL，所述MRM培养基包含介于50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)的钾离子和介于50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)的NaCl，然后在最终扩增阶段期间在对照培养基中培养；和(3)将在初始扩增阶段期间在MRM培养基中培养TIL，所述MRM培养基包含介于50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)的钾离子和介于50-70mM之间的NaCl，然后在最终扩增阶段期间在MRM培养基中培养，所述MRM培养基包含介于50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)的钾离子和介于50-70mM之间(例如50mM、55mM、60mM、65mM或70mM)的NaCl。在所有实验中，初始培养条件还将包括6000IU/mL IL-2，并且最终培养条件还将包括3000IU/mL IL-2。将表征根据该方法培养的TIL的干性和效应标记物的表达、细胞毒性和产量。
实施例12克隆多样性的分析
为了评价根据上文所公开的方法在MRM中培养的TIL的克隆多样性，在对照培养基或代谢重编程培养基(MRM)中培养肿瘤片段和从肿瘤片段获得的TIL。使用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN)从肿瘤和TIL样品分离总基因组DNA并使用用于TCRβ和CDR3区域的Immuno-seq(Adaptive Biotechnologies,Seattle,WA)进行测序。
通过辛普森克隆性√∑pi2评价非小细胞肺癌(NSCLC)和黑色素瘤样品的多样性度量，其中pi是给定样品中克隆i的比例丰度。对于NSCLC和黑色素瘤，在肿瘤片段(“肿瘤”)、在对照培养基中培养的TIL(“对照”)和在MRM中培养的TIL(“MRM”)中检查辛普森克隆性和生产性重排(分别为图19A和图19B)。在MRM中培养的TIL(扩增后)展示约0.28(对于NSCLC)和约0.38(对于黑色素瘤)的辛普森克隆性，这指示高克隆多样性(图19A和图19B)。维持TCRβ多样性代表保持浸润肿瘤并具肿瘤特异性的TIL克隆型。相反，在对照培养基中培养的TIL明显丢失克隆多样性并且展示约0.65(对于NSCLC)和约0.8(对于黑色素瘤)的辛普森克隆性(即明显不太多样的克隆性，这指示许多肿瘤特异性克隆在使用对照培养基的培养过程中丢失)(图19A和图19B)。
***
应了解，意图使用具体实施方式部分而非发明内容和摘要部分来解释权利要求书。发明内容和摘要部分可阐述本发明人所预期的本公开的一个或多个但非所有例示性实施方案，因此不欲以任何方式限制本公开和所附权利要求书。
上文已借助说明实施所指定功能和其关系的功能构建块来阐述本公开。为便于描述，本文已任意定义这些功能构建块的边界。可定义替代边界，只要所指定功能和其关系适当实施即可。
特定实施方案的前述描述将如此充分地揭露本公开的一般性质，以致于在不背离本公开的一般概念的情况下，他人通过应用所属领域中众所周知的知识、无需过多实验即可容易地修改和/或改编这类特定实施方案的各种应用。因此，基于本文所呈现的教示和指导，这类改编和修改意图在所公开实施方案的等效物的含义和范围内。应理解，本文的片语或术语是出于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或片语将由所属领域的技术人员根据教示和指导来解释。
本公开的广度和范围不应由任一上述例示性实施方案限制，而只应根据所附权利要求书和其等效内容来定义。
本申请通篇中所引用的所有引用参考文献(包括文献参考文献、美国或外国专利或专利申请和网站)的内容皆以引用的方式明确并入本文中，如同其全文是出于任一目的而写入本文一样，其中引用的参考文献也是如此。当出现任何不一致时，以本文字面公开的材料为准。
序列表
<110> 莱尔免疫制药公司
<120> 培养免疫细胞的方法
<130> 4385.043PC07
<150> US 63/273,138
<151> 2021-10-28
<150> US 63/181,218
<151> 2021-04-28
<150> US 63/167,592
<151> 2021-03-29
<150> US 63/165,023
<151> 2021-03-23
<150> US 63/153,922
<151> 2021-02-25
<150> US 63/146,477
<151> 2021-02-05
<150> US 63/198,933
<151> 2020-11-23
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> KRAS肽序列
<400> 1
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<210> 2
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<223> KRAS肽序列
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1 5

Claims (155)

1.一种离体或体外培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法，所述方法包括将异质TIL群体放置于包含浓度为约30mM到约100mM的钾离子的代谢重编程培养基(“MRM”)中。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述异质TIL群体在放置于所述MRM中后富集CD8+TIL。
3.一种增加CD8+TIL的数量或百分比的离体或体外方法，所述方法包括在包含浓度为约30mM到约100mM的钾离子的MRM中培养异质TIL群体。
4.一种制备CD8+富集的TIL群体的方法，所述方法包括在包含浓度为约30mM到约100mM的钾离子的MRM中离体或体外培养异质TIL群体。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述异质TIL群体包含CD4+TIL和CD8+TIL。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述异质TIL群体从获自受试者的一个或多个肿瘤样品获得。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述肿瘤样品经受初始TIL培养。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述初始TIL培养包括在所述MRM中培养所述肿瘤样品。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述MRM在所述初始TIL培养期间还包含IL-2。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述MRM在所述初始TIL培养期间还包含IL-7、IL-15、IL-21或它们的任何组合。
11.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述MRM在所述初始TIL培养期间包含IL-2和IL-21。
12.如权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述初始TIL培养持续至少约14-19天。
13.如权利要求7至12中任一项所述的方法，其中所述初始TIL培养持续至少约14天。
14.如权利要求7至13中任一项所述的方法，其中与所述初始TIL培养前CD8+TIL对非CD8+TIL的比例相比，在所述初始TIL培养后CD8+TIL对非CD8+TIL的比例增加。
15.如权利要求7至14中任一项所述的方法，其中在所述初始TIL培养后刺激所述TIL。
16.如权利要求15所述的方法，其中通过将所述TIL与CD3激动剂和/或CD28激动剂一起培养来刺激所述TIL。
17.如权利要求6至16中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品包含肿瘤活体组织切片。
18.如权利要求6至17中任一项所述的方法，其中将所述肿瘤样品在培养之前片段化。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在培养所述异质TIL群体后，所述群体中的所述TIL的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％是CD8+TIL。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中在培养所述异质TIL群体后，所述群体中的所述TIL的至少约50％是CD8+TIL。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述MRM还包含钠离子、钙离子、葡萄糖或它们的任何组合。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述MRM还包含细胞扩增剂。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞扩增剂包括GSK3B抑制剂、ACLY抑制剂、PI3K抑制剂、AKT抑制剂或它们的任何组合。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述PI3K抑制剂包括LY294002、匹替利司、CAL101、IC87114或它们的任何组合。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述AKT抑制剂包括MK2206、A443654、AKTi-VIII或它们的任何组合。
26.如权利要求3至25中任一项所述的方法，其中钾离子的浓度为至少约30mM、至少约35mM、至少约40mM、至少约45mM、至少约50mM、至少约55mM、至少约60mM、至少约65mM、至少约70mM、至少约75mM、至少约80mM、至少约85mM、至少约90mM、至少约95mM或至少约100mM。
27.如权利要求3至26中任一项所述的方法，其中钾离子的浓度为约30mM到约100mM、约30mM到约90mM、约30mM到约80mM、约30mM到约70mM、约30mM到约60mM、约30mM到约50mM、约40mM到约100mM、约40mM到约90mM、约40mM到约80mM、约40mM到约70mM、约40mM到约60mM或约40mM到约50mM。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中钾离子的浓度为约40mM到约90mM。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中钾离子的浓度为约50mM到约90mM。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中钾离子的浓度为约50mM到约80mM。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述MRM还包含钠离子。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约25mM到约100mM。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约30mM到约40mM、约30mM到约50mM、约30mM到约60mM、约30mM到约70mM、约30mM到约80mM、约40mM到约50mM、约40mM到约60mM、约40mM到约70mM、约40mM到约80mM、约50mM到约55mM、约50mM到约60mM、约50mM到约65mM、约50mM到约70mM、约50mM到约75mM、约50mM到约80mM、约55mM到约60mM、约55mM到约65mM、约55mM到约70mM、约55mM到约75mM、约55mM到约80mM、约60mM到约65mM、约60mM到约70mM、约60mM到约75mM、约60mM到约80mM、约70mM到约75mM、约70mM到约80mM或约75mM到约80mM。
34.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM或约80mM。
35.如权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约55mM。
36.如权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约60mM。
37.如权利要求31至36中任一项所述的方法，其中所述钠离子的浓度为约65mM。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述MRM还包含葡萄糖。
39.如权利要求38所述的方法，其中葡萄糖的浓度大于约10mM。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中葡萄糖的浓度为约10mM到约25mM、约10mM到约20mM、约15mM到约25mM、约15mM到约20mM、约15mM到约19mM、约15mM到约18mM、约15mM到约17mM、约15mM到约16mM、约16mM到约20mM、约16mM到约19mM、约16mM到约18mM、约16mM到约17mM、约17mM到约20mM、约17mM到约19mM或约17mM到约18mM。
41.如权利要求38至40中任一项所述的方法，其中葡萄糖的浓度为约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM或约25mM。
42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述MRM还包含钙离子。
43.如权利要求42所述的方法，其中钙离子的浓度大于约0.4mM。
44.如权利要求42或43所述的方法，其中钙离子的浓度为约0.4mM到约2.5mM、约0.5mM到约2.0mM、约1.0mM到约2.0mM、约1.1mM到约2.0mM、约1.2mM到约2.0mM、约1.3mM到约2.0mM、约1.4mM到约2.0mM、约1.5mM到约2.0mM、约1.6mM到约2.0mM、约1.7mM到约2.0mM、约1.8mM到约2.0mM、约1.2mM到约1.3mM、约1.2mM到约1.4mM、约1.2mM到约1.5mM、约1.2mM到约1.6mM、约1.2mM到约1.7mM、约1.2mM到约1.8mM、约1.3mM到约1.4mM、约1.3mM到约1.5mM、约1.3mM到约1.6mM、约1.3mM到约1.7mM、约1.3mM到约1.8mM、约1.4mM到约1.5mM、约1.4mM到约1.6mM、约1.4mM到约1.7mM、约1.4mM到约1.8mM、约1.5mM到约1.6mM、约1.5mM到约1.7mM、约1.5mM到约1.8mM、约1.6mM到约1.7mM、约1.6mM到约1.8mM或约1.7mM到约1.8mM。
45.如权利要求42至44中任一项所述的方法，其中钙离子的浓度为约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.4mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM或约2.0mM。
46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述MRM包含约40mM到约90mM钾离子和
(i)约40mM到约80mM钠离子；
(ii)约10mM到约24mM葡萄糖；
(iii)约0.5mM到约2.8mM钙离子；或
(iv)(i)-(iii)的任何组合。
47.一种扩增从人类受试者获得的TIL的方法，所述方法包括：
a.在初始TIL培养基中培养所述TIL；
b.在二次TIL培养基中培养所述TIL；
c.在第三(或最终)TIL培养基中培养所述TIL，
其中所述初始TIL培养基、所述二次TIL扩增培养基和/或所述第三TIL扩增培养基是MRM。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述初始TIL培养基和所述二次TIL扩增培养基是高血钾性的且所述第三TIL扩增培养基不是高血钾性的。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中所述初始TIL培养基还包含IL-2。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述初始TIL培养基还包含IL-21。
51.如权利要求47至50中任一项所述的方法，其中所述初始TIL培养基还包含T细胞补充物、血清替代物、谷氨酰胺、谷氨酰胺取代物(例如Glutamax(L-丙氨酸-L-谷氨酰胺))、非必需氨基酸、抗生素(例如青霉素、链霉素或二者)、抗真菌剂(例如FUNGINTM)和/或丙酮酸钠。
52.如权利要求47至51中任一项所述的方法，其中将所述TIL在所述初始TIL培养基中培养至少约1周、至少约2周或至少约3周。
53.如权利要求47至52中任一项所述的方法，其中在所述初始TIL培养基中培养所述TIL直到所述初始培养物中的细胞产量达到至少约1×105个、至少约2×105个、至少约3×105个、至少约4×105个、至少约5×105个、至少约6×105个、至少约7×105个、至少约8×105个、至少约9×105个、至少约1×106个、至少约2×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约10×106个细胞/片段。
54.如权利要求47至53中任一项所述的方法，其中在(b)中的所述二次TIL培养基中或之前，用CD3激动剂、CD28激动剂或二者刺激所述TIL。
55.如权利要求47至54中任一项所述的方法，其中在所述二次TIL培养基中或之前，用CD27激动剂进一步刺激所述TIL。
56.如权利要求47至55中任一项所述的方法，其中在所述二次TIL培养基中或之前，用4-1BB激动剂进一步刺激所述TIL。
57.如权利要求53至56中任一项所述的方法，其中在所述刺激后，将所述TIL培养至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天或至少约26天。
58.如权利要求47至57中任一项所述的方法，其中在所述二次培养基中培养所述TIL直到细胞产量达到至少约1×107个、至少约2×107个、至少约3×107个、至少约4×107个、至少约5×107个、至少约6×107个、至少约7×107个、至少约8×107个、至少约9×107个、至少约10×107个、至少约11×107个、至少约12×107个、至少约13×107个、至少约14×107个、至少约15×107个、至少约16×107个、至少约17×107个、至少约18×107个、至少约19×107个或至少约20×107个细胞。
59.如权利要求47至58中任一项所述的方法，其中在所述第三TIL培养基中，用CD3激动剂、CD28激动剂、CD27激动剂和/或4-1BB激动剂刺激所述TIL。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述第三TIL培养基不是高血钾性的。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中将所述TIL在所述第三TIL培养基中培养至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天或至少约21天。
62.一种增加肿瘤反应性TIL的方法，所述方法包括：
a.将一个或多个肿瘤片段在初始TIL培养基中培养长达约14到19天，所述初始TIL培养基是高血钾性的并包含IL-2和任选地IL-21，由此从所述肿瘤片段获得TIL；
b.在添加(i)CD3激动剂和(ii)CD28激动剂、CD27激动剂、4-1BB激动剂或它们的任何组合后，将所述TIL在二次TIL培养基中培养约7天到至少约14天，所述二次TIL培养基是高血钾性的；
c.在添加(i)CD3激动剂和(ii)CD28激动剂、CD27激动剂、4-1BB激动剂或它们的任何组合后，将所述TIL在第三TIL培养基中培养约14天到至少约21天，所述第三TIL培养基不是高血钾性的。
63.如权利要求1至62中任一项所述的方法，其中相对于在不是高血钾性的对照培养基中培养后TIL群体中的TCF7表达，所述TIL在所述MRM中培养后展现增加的TCF7表达。
64.如权利要求1至63中任一项所述的方法，其中相对于在不是高血钾性的对照培养基中培养后CD8+CD62L+TIL的比例，所述TIL群体在所述MRM中培养后包含增加的CD8+CD62L+TIL比例。
65.如权利要求1至64中任一项所述的方法，其中相对于在不是高血钾性的对照培养基中培养后CD8+PD1+TIL的比例，所述TIL群体在所述MRM中培养后包含增加的CD8+PD1+TIL比例。
66.一种免疫细胞的组合物，所述组合物包含如权利要求1至65中任一项所述的方法培养的一个或多个CD8+TIL。
67.如权利要求66所述的组合物，其中所述免疫细胞的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％是CD8+TIL。
68.一种包含免疫细胞群的组合物，其中所述免疫细胞的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％是CD8+TIL。
69.如权利要求66至68中任一项所述的组合物，其中所述细胞的至少约50％是CD8+TIL。
70.如权利要求66至69中任一项所述的组合物，其中相对于在不是高血钾性的对照培养基中培养后免疫细胞群中的TCF7表达，所述细胞在所述MRM中培养后展现增加的TCF7表达。
71.如权利要求66至70中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％是CD8+/CD62L+TIL。
72.如权利要求66至71中任一项所述的组合物，其中在所述初始TIL培养结束时获得的所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是PD1+。
73.如权利要求66至72中任一项所述的组合物，其中在所述初始TIL培养结束时获得的所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是CD39+。
74.如权利要求66至73中任一项所述的组合物，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是CD27+。
75.如权利要求66至74中任一项所述的组合物，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是CD28+。
76.如权利要求66至75中任一项所述的组合物，其中在所述初始TIL培养结束时获得的所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是PD1+CD39+。
77.如权利要求66至76中任一项所述的组合物，其中在所述初始TIL培养结束时获得的所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是PD1+CD27+。
78.如权利要求66至77中任一项所述的组合物，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是CD27+CD62L+。
79.如权利要求66至78中任一项所述的组合物，其中在所述初始TIL培养结束时获得的所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是CD27+CD28+CD103+PD1+TCF7+。
80.如权利要求66至79中任一项所述的组合物，所述组合物包含至少约2×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约1×107个细胞。
81.如权利要求66至80中任一项所述的组合物，所述组合物包含至少约1×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约1×107个CD8+细胞。
82.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用TIL群体，其中根据权利要求1至65中任一项所述的方法培养所述TIL群体。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述TIL群体富集CD8+TIL。
84.如权利要求82或83所述的方法，其中所述TIL群体中所述TIL的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％是CD8+TIL。
85.如权利要求82至84中任一项所述的方法，其中所述TIL群体中所述TIL的至少约50％是CD8+TIL。
86.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求66至71中任一项所述的组合物。
87.如权利要求82至86中任一项所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。
88.如权利要求82至87中任一项所述的方法，其中所述癌症包括源自以下的实体瘤：黑色素瘤、结肠癌、肺癌、宫颈癌、胃肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、头颈部小细胞癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、睾丸生殖细胞肿瘤、胃腺癌、皮肤黑色素瘤、间皮瘤、肾透明细胞癌、宫颈鳞状细胞癌和子宫内膜腺癌、食管癌、膀胱尿路上皮癌、浸润性乳腺癌、乳头状肾细胞癌、结肠腺癌或它们的任何组合。
89.如权利要求82至88中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少约2×109个、至少约3×109个、至少约4×109个、至少约5×109个、至少约6×109个、至少约7×109个、至少约8×109个、至少约9×109个或至少约1×1010个或至少约10×1010个或至少约15×1010个或至少约20×1010个或至少约25×1010个或至少约30×1010个细胞。
90.如权利要求82至89中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少约1×109个、至少约3×109个、至少约4×109个、至少约5×109个、至少约6×109个、至少约7×109个、至少约8×109个、至少约9×109个或至少约1×109个CD8+细胞。
91.如权利要求82至90中任一项所述的方法，所述方法还包括施用检查点抑制剂。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述检查点抑制剂是在施用所述细胞群后施用于所述受试者。
93.如权利要求91或92所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括CTLA-4拮抗剂、PD1拮抗剂、TIM-3拮抗剂或它们的组合。
94.如权利要求91至93中任一项所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括抗CTLA-4抗体、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM-3抗体或它们的组合。
95.如权利要求92至94中任一项所述的方法，所述方法还包括施用检查点激活剂。
96.如权利要求90至95中任一项所述的方法，其中所述检查点抑制剂是在施用所述TIL群体后施用于所述受试者。
97.如权利要求95或96所述的方法，其中所述检查点激活剂包括OX40激动剂、LAG-3激动剂、4-1BB(CD137)激动剂、GITR激动剂、TIM3激动剂或它们的组合。
98.如权利要求95或96所述的方法，其中所述检查点激活剂包括抗OX40抗体、抗LAG-3抗体、抗CD137抗体、抗GITR抗体、抗TIM3抗体或它们的组合。
99.如权利要求92至98中任一项所述的方法，所述方法还包括施用细胞因子。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述细胞因子是在施用所述TIL群体后施用于所述受试者。
101.如权利要求99或100所述的方法，其中所述细胞因子是IL-2。
102.如权利要求99至101中任一项所述的方法，所述方法还包括在施用所述细胞群之前向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包含环磷酰胺、氟达拉滨或环磷酰胺和氟达拉滨二者。
104.如权利要求1至65中任一项所述的方法，其中与放置于对照培养基中的异质TIL群体的克隆多样性相比，所述异质TIL群体在放置于所述MRM中后具有增加的克隆多样性。
105.如权利要求1至65和104中任一项所述的方法，其中所述异质TIL群体在放置于所述MRM中后的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约99％到约100％、至少约98％到约100％、至少约97％到约100％、至少约96％到约100％、至少约95％到约100％、至少约94％到约100％、至少约93％到约100％、至少约92％到约100％、至少约91％到约100％、至少约90％到约100％、至少约85％到约100％、至少约80％到约100％、至少约75％到约100％、至少约70％到约100％、至少约65％到约100％、至少约60％到约100％、至少约55％到约100％、至少约50％到约100％、至少约45％到约100％或至少约40％到约100％。
106.如权利要求1至65、104和105中任一项所述的方法，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述异质TIL群体在放置于所述MRM中后的克隆多样性评分小于约0.5、小于约0.45、小于约0.4、小于约0.35、小于约0.3、小于约0.275、小于约0.25、小于约0.225、小于约0.2、小于约0.175、小于约0.15、小于约0.125、小于约0.1、小于约0.075、小于约0.07、小于约0.06或小于约0.05。
107.如权利要求1至65和104至106中任一项所述的方法，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述异质TIL群体在放置于所述MRM中后的克隆多样性评分小于约0.3。
108.如权利要求1至65和104至107中任一项所述的方法，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述异质TIL群体在放置于所述MRM中后的克隆多样性评分小于约0.25。
109.如权利要求1至65和104至108中任一项所述的方法，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述异质TIL群体在放置于所述MRM中后的克隆多样性评分小于约0.2。
110.如权利要求1至65和104至109中任一项所述的方法，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述异质TIL群体在放置于所述MRM中后的克隆多样性评分小于约0.1。
111.如权利要求66至81中任一项所述的组合物，其中所述CD8+TIL的克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约99％到约100％、至少约98％到约100％、至少约97％到约100％、至少约96％到约100％、至少约95％到约100％、至少约94％到约100％、至少约93％到约100％、至少约92％到约100％、至少约91％到约100％、至少约90％到约100％、至少约85％到约100％、至少约80％到约100％、至少约75％到约100％、至少约70％到约100％、至少约65％到约100％、至少约60％到约100％、至少约55％到约100％、至少约50％到约100％、至少约45％到约100％或至少约40％到约100％。
112.如权利要求66至81和111中任一项所述的组合物，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述CD8+TIL的克隆多样性评分小于约0.5、小于约0.45、小于约0.4、小于约0.35、小于约0.3、小于约0.275、小于约0.25、小于约0.225、小于约0.2、小于约0.175、小于约0.15、小于约0.125、小于约0.1、小于约0.075、小于约0.07、小于约0.06或小于约0.05。
113.如权利要求66至81、111和112中任一项所述的组合物，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述CD8+TIL的克隆多样性评分小于约0.3。
114.如权利要求66至81和111至113中任一项所述的组合物，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述CD8+TIL的克隆多样性评分小于约0.25。
115.如权利要求66至81和111至114中任一项所述的组合物，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述CD8+TIL的克隆多样性评分小于约0.2。
116.如权利要求66至81和111至115中任一项所述的组合物，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述CD8+TIL的克隆多样性评分小于约0.1。
117.一种扩增TIL群体，其克隆多样性是肿瘤样品中TIL的克隆多样性的至少约99％到约100％、至少约98％到约100％、至少约97％到约100％、至少约96％到约100％、至少约95％到约100％、至少约94％到约100％、至少约93％到约100％、至少约92％到约100％、至少约91％到约100％、至少约90％到约100％、至少约85％到约100％、至少约80％到约100％、至少约75％到约100％、至少约70％到约100％、至少约65％到约100％、至少约60％到约100％、至少约55％到约100％、至少约50％到约100％、至少约45％到约100％或至少约40％到约100％。
118.一种扩增TIL群体，如通过辛普森克隆性所测量，其克隆多样性评分小于约0.5、小于约0.45、小于约0.4、小于约0.35、小于约0.3、小于约0.275、小于约0.25、小于约0.225、小于约0.2、小于约0.175、小于约0.15、小于约0.125、小于约0.1、小于约0.075、小于约0.07、小于约0.06或小于约0.05。
119.如权利要求117或118所述的扩增TIL群体，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述克隆多样性评分小于约0.3。
120.如权利要求117至119中任一项所述的扩增TIL群体，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述克隆多样性评分小于约0.25。
121.如权利要求117至120中任一项所述的扩增TIL群体，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述克隆多样性评分小于约0.2。
122.如权利要求117至121中任一项所述的扩增TIL群体，其中如通过辛普森克隆性所测量，所述克隆多样性评分小于约0.1。
123.如权利要求117至122中任一项所述的扩增TIL群体，所述扩增TIL群体包含至少约至少约2×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约1×107个细胞。
124.如权利要求117至123中任一项所述的扩增TIL群体，所述扩增TIL群体包含至少至少约1×106个、至少约3×106个、至少约4×106个、至少约5×106个、至少约6×106个、至少约7×106个、至少约8×106个、至少约9×106个或至少约1×107个CD8+细胞。
125.如权利要求117至124中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述扩增TIL的至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％是CD8+TIL。
126.如权利要求117至125中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述扩增TIL的至少约50％是CD8+TIL。
127.如权利要求117至126中任一项所述的扩增TIL群体，其中相对于在不是高血钾性的对照培养基中培养后免疫细胞群中的TCF7表达，所述扩增TIL在所述MRM中培养后展现增加的TCF7表达。
128.如权利要求117至127中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述扩增TIL的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或至少约75％是CD8+/CD62L+TIL。
129.如权利要求124至128中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是PD1+。
130.如权利要求124至129中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是CD39+。
131.如权利要求124至130中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是CD27+。
132.如权利要求124至131中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是CD28+。
133.如权利要求124至132中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是PD1+CD39+。
134.如权利要求124至133中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是PD1+CD27+。
135.如权利要求124至134中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是CD27+CD62L+。
136.如权利要求124至135中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述CD8+TIL的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％是CD27+CD28+CD103+PD1+TCF7+。
137.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用如权利要求111至116中任一项所述的组合物或如权利要求117至136中任一项所述的扩增TIL群体。
138.如权利要求66至81和111至116中任一项所述的组合物或如权利要求117至136中任一项所述的扩增TIL群体，所述组合物或所述扩增TIL群体包含表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的至少一种免疫细胞。
139.如权利要求66至81、111至116和138中任一项所述的组合物或如权利要求117至136和138中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述干细胞样标记物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+或它们的任何组合。
140.如权利要求66至81、111至116、138和139中任一项所述的组合物或如权利要求117至136、138和139中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述效应物样标记物包括pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+或它们的任何组合。
141.如权利要求66至81、111至116、138和139中任一项所述的组合物或如权利要求117至136、138和139中任一项所述的扩增TIL群体，其中组合物或群体中至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的扩增TIL包含表达一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物的至少一种免疫细胞。
142.一种TIL，所述TIL包含一种或多种干细胞样标记物和一种或多种效应物样标记物。
143.如权利要求142所述的TIL，其中所述干细胞样标记物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+或它们的任何组合。
144.如权利要求142或143所述的TIL，其中所述效应物样标记物包括pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+或它们的任何组合。
145.一种扩增TIL群体，所述扩增TIL群体包含如权利要求142至144中任一项所述的TIL。
146.如权利要求145所述的扩增TIL群体，其中所述扩增TIL细胞的至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％包含如权利要求142至144中任一项所述的TIL。
147.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求142至144中任一项所述的TIL或如权利要求145或146所述的扩增TIL群体和药学上可接受的载体。
148.一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求142至144中任一项所述的TIL、如权利要求145或146所述的扩增TIL群体或如权利要求147所述的药物组合物。
149.如权利要求148所述的方法，其中所述疾病或疾患是癌症。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、结直肠癌、胰腺癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌和它们的任何组合。
151.一种制备如权利要求142至144中任一项所述的TIL的方法，所述方法包括在培养基中在适宜条件下培养免疫细胞。
152.如权利要求1至65、82至110和137中任一项所述的方法、如权利要求66至81、111至116和138至141中任一项所述的组合物或如权利要求117至136中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述MRM包含NaCl，其中钾离子和NaCl的总浓度介于110mM与140mM之间。
153.如权利要求1至65、82至110和137中任一项所述的方法、如权利要求66至81、111至116和138至141中任一项所述的组合物或如权利要求117至136中任一项所述的扩增TIL群体，其中相对于在对照培养基中培养后CD39-/CD69-TIL的比例，所述TIL群体在所述MRM中培养后包含增加的CD39-/CD69-TIL比例。
154.如权利要求1至65、82至110和137中任一项所述的方法、如权利要求66至81、111至116和138至141中任一项所述的组合物或如权利要求117至136中任一项所述的扩增TIL群体，其中所述TIL群体中TIL总数的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％或至少约40％是CD39-/CD69-。
155.如权利要求7至65、82至110和137中任一项所述的方法，其中所述初始培养持续至少约11天。
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