CN116983394B - 一种mRNA疫苗及其在瘤内递送增强肿瘤治疗效果中的应用 - Google Patents

Abstract

一种mRNA疫苗及其在瘤内递送增强肿瘤治疗效果中的应用，本发明经研究发现，递送某些细胞因子的mRNA可以改善小鼠肿瘤免疫微环境，增加肿瘤组织CD8+T的浸润，杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长。并且可以增强免疫检查点抑制剂anti‑PD‑1单抗及化疗药物奥沙利铂的肿瘤治疗效果。本发明的应用实现了通过利用mRNA抑制肿瘤的发展，以及mRNA与现有肿瘤治疗手段联合用药的治疗方法，并具有良好的前景和实用价值。为mRNA在肿瘤治疗领域中的开发提供了一定的参考和启示，并为肿瘤治疗的联合用药提供了新思路。

Description

一种mRNA疫苗及其在瘤内递送增强肿瘤治疗效果中的应用

技术领域

本发明涉及mRNA疗法的应用，尤其涉及一种mRNA疫苗及其在瘤内递送增强肿瘤治疗效果中的应用。

背景技术

目前肿瘤的治疗方式主要包括手术治疗、化疗、放疗、靶向治疗及免疫疗法。免疫疗法相比是一种新型治疗肿瘤的方式，主要通过增强或激活免疫细胞的功能杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。但是临床统计仅有20％～40％的患者能从PD-1免疫疗法中获益，因此还需要进一步的优化肿瘤的治疗方式。

mRNA疗法是基于分子生物学和免疫学的一种疗法，是通过设计合成目的基因的mRNA，利用递送系统递送到人体或动物体的一种方法技术。mRNA疗法具有多重优势，首先，mRNA疗法安全性高，mRNA不进入细胞核，在胞质中进行翻译表达；另外，mRNA易于通过生理代谢途径完全分解，因此不会成为宿主体内平衡的负担；其次，mRNA具有自我辅助特性，通过肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，干扰素-α(IFN-α)和免疫细胞分泌的其他细胞因子激活强烈而持久的适应性免疫反应；此外，mRNA理论上可以满足编码和表达各种蛋白质所需的所有遗传信息，且mRNA通过体外转录(IVT)过程合成，制造工艺简单，易于批量生产，同时mRNA研发周期短，能够快速开发新型治疗mRNA；最后，mRNA理论上可以翻译产生大量蛋白质，一定程度上降低了药物用量，这也促使多种mRNA可以一起施用。

mRNA疗法现主要被设计用于预防和治疗病毒感染及肿瘤，现已有多项mRNA疫苗进入到临床研究阶段，并有产品已经正式投入临床使用，例如针对SARS-CoV-2病毒的疫苗。用于癌症治疗的基因疗法可以涉及到输送能够杀伤或抑制癌细胞的基因、能够增强针对癌细胞免疫应答的基因、能够修复或代替基因突变或改变的基因、或能够使癌细胞对化疗或放疗更为敏感的基因，但是现有技术中的药物递送效率较低而且相对并不稳定，利用mRNA进行肿瘤内递送治疗肿瘤目前尚未见报道。

发明内容

针对现有研究内容的不足，本发明要解决的问题是提供一种mRNA疫苗及其在瘤内递送增强肿瘤治疗效果中的应用。

本发明提供的mRNA疫苗至少含有第一开放阅读框和第二开放阅读框，所述第一开放阅读框编码目的蛋白；所述第二开放阅读框表达选自CCL5、CXCL9、CXCL10、IL15、CXCL16、Myb基因序列中的一种或多种组合。

进一步的，所述目的蛋白可选自针对肿瘤的蛋白，包括但不限于：EpCAM、抗-CTLA-4、抗-PD1、抗-PDL1、A2A、抗-FGF2、抗-FGFR/FGFR2b、抗-SEMA4D、CCL5、CD137、CD200、CD38、CD44、CSF-1R、CXCL10、CXCL13、内皮素B受体、IL-15、IL-21、IL-35、ISRE7、LFA-1、NG2(也称为SPEG4)、SMAD、STING、ΤGFβ和VCAM1的蛋白质；IFNγ、IFNα、ΙFΝβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8和GM-CSF的促炎细胞因子等。

进一步的，所述第二开放阅读框表达CCL5、CXCL9、CXCL10、IL15、CXCL16、Myb基因序列中的组合；

进一步的，所述第二开放阅读框表达CCL5、CXCL9的融合蛋白，其中，上述两种序列之间经生物信息学分析后，对其进行截短和替代，将各自的优化序列通过RRKK连接形成带正电的双亲性结构，便于与带负电的磷脂双分子层固定和插入，具体序列如SEQ ID NO.1(SPYSDTTPACFAYIARPLPRHIKEYFYTSGKCSNAVVFVTARKNRQVCANPEKKWVAREY INSLEMSRRKKTPVAVRKGRCCISTNQGTIHALQSLKDLKQFAPSPSCAEKIEIIATLAKNGV QTCLNAPDSADAV)所示。

进一步的，所述第二开放阅读框表达CCL5、CXCL9、CXCL10、IL15、CXCL16、Myb基因序列中的优化序列组合，其中，上述6种序列之间经生物信息学分析后，对其进行截短和替代，将各自的优化序列通过RRKK、GS重复单元、AA或者直接连接形成带正电的双亲性结构，便于与带负电的磷脂双分子层固定和插入，具体序列如SEQ ID NO.2(SPYSDTATPCFAYIARPLPRHIKEYFYTSGKCSNAVVFVTARKNRQVCANPEKKWVAREYI NSLEMSRRKKTPVAVRKGRCCISTNQGTIHLQSLKDLKQFPSPSACAEKIEIIATLAKNGVQTCLNAPDSADAVAARCTCISISNQPVNPRSLEKEIIPASQFCPRVEIIATMKKAGEKRCLNPESKAINLLKAPHLRSISIQCYLCLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANSLSNGNVTESGCKTQPGNGNEGSVTGSCYCGKRISSDSPPSVQFMNRLRKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGNKDPWVQEL MSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLPTSPPISQASEGASSDIHTPAQMLLSTLQSTQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHTAGHSLAAGPEAGENQKQPEGS)所示。

进一步的，所述mRNA疫苗还包括5’-帽结构、3’端聚腺苷酸序列、5’UTR和3’UTR中的至少一种；

优选地，5’-帽结构优选包括ARCA、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG、m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG、m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP；

优选地，3’端聚腺苷酸序列的长度为50-200个A，更优选为80-200个A；

优选地，5’UTR的长度为10-200个核苷酸，更优选为15-100个核苷酸；

优选地，3’UTR包括来源于提供稳定的mRNA的基因的3’UTR或来源于提供稳定的mRNA的基因的3’UTR的同源物，片段或变体，包括但不限于：血红蛋白HBA2的3’UTR序列或β-珠蛋白3’-UTR序列；

优选地，所述mRNA含有经过修饰的核苷酸和/或未经修饰的核苷酸，所述修饰包括L-核苷修饰和/或2’-O-甲基化修饰。

进一步的，所述mRNA疫苗可以与骨架载体相连接，所述骨架载体选自pVAX1系列载体、或pVR系列载体、pcDNA系列载体。所述pVAX1系列载体、或pVR系列载体、或pcDNA系列载体用于融合蛋白的表达，从而用于制备蛋白疫苗或DNA疫苗。另以pVAX1或pVR载体或pcDNA系列载体作为mRNA的表达载体，在动物细胞内表达编码融合蛋白的mRNA，以制备mRNA疫苗。

进一步的，本发明同时提供一种mRNA疫苗在制备肿瘤治疗药物中的应用，该mRNA递送至体内可以使机体产生免疫反应，起到瘤内递送增强肿瘤治疗效果。

进一步的，本发明还提供了所述mRNA疫苗在用于制备预防、治疗、和/或改善选自癌症或肿瘤疾病，退行性疾病抗原、特应性疾病抗原、自体免疫疾病，传染病，或过敏症或过敏性疾病的任何疾病和病症的药物的用途。

有益效果

本发明公开了一种mRNA疫苗及其在瘤内递送增强肿瘤治疗效果中的应用，本发明经研究发现，递送某些细胞因子的mRNA可以改善小鼠肿瘤免疫微环境，增加肿瘤组织CD8+T的浸润，杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长。并且可以增强免疫检查点抑制剂anti-PD-1单抗及化疗药物奥沙利铂的肿瘤治疗效果。本发明的应用实现了通过利用mRNA抑制肿瘤的发展，以及mRNA与现有肿瘤治疗手段联合用药的治疗方法，并具有良好的前景和实用价值。为mRNA在肿瘤治疗领域中的开发提供了一定的参考和启示，并为肿瘤治疗的联合用药提供了新思路。本发明还利用该mRNA开发了一种疫苗，以mRNA作为疫苗的主要成分具有研发快速、安全性高、易产业化等优点；以mRNA作为疫苗的主要成分制备工艺简单，无需使用细胞增殖病毒或生产重组蛋白；使用极小剂量能达到足够的保护效果，在安全性、有效性方面优于现有的疫苗技术。

附图说明

图1为利用脂质体1(Liposome 1)瘤内递送CC mRNA抑制肿瘤生长；

图2为利用脂质体1瘤内递送CM mRNA抑制肿瘤生长；

图3为利用脂质体1(Liposome 1)尾静脉递送抑制肿瘤生长；

图4为利用脂质体1(Liposome 1)递送CCL5-CXCL9 mRNA增强PD-1单抗的抗肿瘤作用；

图5为利用脂质体1递送CM mRNA增强PD-1单抗的抗肿瘤作用；

其中，图A为模式图；图B为接种后麻醉小鼠，拍照；图C为接种后肿瘤随时间增长效果图；图D为接种后小鼠体重随时间增长效果图；图E为接种后处死小鼠肿瘤实物图；F为接种后处死小鼠肿瘤重量标准增长差异示意图。

图6是联合用药肿瘤组织CCL5、CXCL9表达增加，其中，图6ACCL5在MC38皮下移植瘤中的表达；图6B为CXCL9在MC38皮下移植瘤中的表达；图6C为Western blot检测CXCL9在MC38皮下移植瘤中的表达。

图7为联合用药肿瘤组织CD8⁺T细胞浸润结果示意图，其中，图7A为免疫组化分析CD8⁺T细胞在MC38皮下移植瘤中的分布；图7B为免疫荧光分析CD8⁺T细胞在MC38皮下移植瘤中的分布。

实施例

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、质粒、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

其中：LNP购自Mirus；小鼠结肠癌细胞系：MC38购自Invitrogen；奥沙利铂(Oxaliplatin，OXA)购自MCE；anti-PD-1单抗购自Bio X Cell；IgG购自Sigma Aldrich。

本发明实施例中涉及的质粒有：pcs2-EGFP、pcs2-CCL5、pcs2-CXCL9、pcs2-CXCL10、pcs2-IL15、pcs2-CXCL16、pcs2-Myb，其构建均采用常规分子生物学方法，不再赘述。

实施例1构建mRNA疫苗的体外转录质粒，建立体外转录体系

根据现有技术中上述CCL5、CXCL9、CXCL10、IL15、CXCL16及Myb的已知序列，对其进行生物信息学分析，将各自的优化序列通过RRKK、GS重复单元、AA或者直接连接形成带正电的双亲性结构，便于与带负电的磷脂双分子层固定和插入，设计了两条具体序列：

序列1：CCL5-CXCL9 mRNA，简称为CC mRNA，其具体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

序列2：CCL5-CXCL9-CXCL10-IL15-CXCL16-Myb mRNA，简称为CM mRNA，其具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

交由华大基因生物合成后将其目的序列插入到pcDNA3.1中，构建pcDNA3.1-CC和pcDNA3.1-CM质粒，进一步测序验证保藏。

为了验证该mRNA疫苗的递送效果，将EGFP蛋白作为指示物，将其PCR扩增后利用限制性内切酶插入到上述表达框的N端，以实现转录后的共同表达。其中，EGFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3(MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTL VNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLAD HYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDEL)所示，获得pcDNA3.1-GFP-CC和pcDNA3.1-GPF-CM质粒。

mRNA体外转录采用常规分子生物学方法，具体操作方法如下：

(1)质粒线性化

对载体进行双酶切至线性

酶切体系：

37℃水浴锅酶切3h后，琼脂糖凝胶电泳检测载体酶切情况，与未经酶切的载体进行对比观察质粒是否酶切完全，将酶切好的条带切下进行胶回收，提纯DNA用于后续mRNA体外转录的模板。

(2)mRNA体外转录

试剂：

SP6 RNA聚合酶、10x RNA聚合酶buffer(碧云天)；RNAase inhibitor(vazyme)；ATP溶液、CTP溶液、GTP溶液、UTP溶液、溶液、cap(核芯生物)；DNase I(天根生物)；乙酸铵粉末(生工生物)；其他有机溶剂：酚/氯仿/异戊醇、75％乙醇(DEPC水配置)、氯仿、异丙醇；其他耗材：无RNAase 1.5ml EP管

前期准备：

NTP混合液1：ATP、CTP、UTP(或)混合液，终浓度各为10mM。

NTP混合液2：GTP、CAP混合液，GTP终浓度为10mM，CAP终浓度为8mM。

乙酸铵溶液配置为5M。

合成体系(以10μL为例)：

合成步骤(除非另有说明，Ep管皆为无RNAase管，水指DEPC水)：

①室温加完体系内试剂后充分混匀，瞬离，37℃孵育2h；

②加入DNA酶I及Buffer混匀瞬离25℃消化10min，充分去除线性DNA模板；

③消化后，加DEPC水至150μL，加150μL酚/氯仿/异戊醇(吸下层溶液)，混匀呈乳浊

液，离心使其分层，可以用微型掌上离心机。也可12000rpm 1min；

④吸取最上层的水相置于另一个1.5ml离心管，加入150μL氯仿，混匀成乳浊液，离心

使其分层；

⑤吸取最上层的水相置于另一个1.5ml离心管，加入15μL 5M Ammonium acetate(乙酸铵)(上层水相体积的1/10)加入165μL异丙醇，混匀后放置在-20℃冰箱中1h，期间

预冷离心机至4℃；

⑥4℃离心12000rpm 15min，离心后可以在离心管一侧看到白色沉淀；

⑦吸去液体，注意要小心，枪头需要放置在沉淀的对面吸液体，不可野蛮将沉淀吸走，

这一步可以留存10μL液体，避免沉淀被弃除；

⑧加入700μL 70％乙醇，4℃离心1200rpm 10min；

⑨小心吸去液体，开盖晾5-10min；

⑩加DEPC水溶解，取1μL定量。

(3)对体外转录的mRNA去双链

实验前准备：配置色谱缓冲液:10mM HEPES(pH 7.2)，0.1mM EDTA，125mM NaCl，and 16％(v/v)ethanol。

①纤维素预洗：0.1g纤维素/mL色谱缓冲液，剧烈摇晃下孵育10min；

②取120μL悬浊液(0.14g纤维素)至干净的EP管，12000g 1min，尽可能去掉上层液体；

③加入100μL色谱缓冲液，剧烈摇晃重新悬浮纤维素，5min，12000g 1min，尽可能去掉上层液体；

④转录产物加完DNase I孵育完后，直接溶于100μL色谱缓冲液，加入到EP管中，室温充分混匀mRNA和纤维素大约1h，涡旋仪上操作；

⑤转移EP管中所有成分到离心柱中，12000g 1min，吸取流出液，加入1/10体积的乙酸铵，等体积异丙醇抽提纯化。

实施例2：利用脂质体1(Liposome 1)瘤内递送GFP、GFP-CC mRNA、GFP-CM mRNA抑制小鼠MC38肿瘤生长

将6周龄的C57BL/6小鼠分为四组，每组6只小鼠，皮下荷瘤MC38细胞系1×10⁶/100μl·只，荷瘤10天后肿瘤体积达到30mm³左右进行mRNA瘤内递送。实验分为两大组，每一大组中分别包括两组：第一大组中一组为对照组1(4只小鼠)，瘤内递送脂质体1包装的EGFPmRNA(5.5μg/只小鼠)；另一组为实验组1(4只小鼠)，瘤内递送脂质体1包装的GFP-CC(2.5μg/只小鼠)；第二大组中一组为对照组2(6只小鼠)，瘤内递送脂质体1包装的EGFP mRNA(5.5μg/只小鼠)；另一组为实验组2(6只小鼠)，瘤内递送脂质体1包装的GFP-CM(2.5μg/只小鼠)。每三天注射一次mRNA，总共注射三剂。这期间每隔一天测量一次小鼠的体重和肿瘤的长与宽，根据公式V＝π*(length*width²)/6计算肿瘤的体积大小，实验结束后处死小鼠并取出肿瘤并将解剖出的肿瘤进行拍照称重。

结果表明：对于CCL5-CXCL9 mRNA而言，(1)绿色荧光蛋白都在肿瘤部位有表达，随着mRNA注射时间的增长，实验组小鼠肿瘤组织的生长明显放缓(图1C)。最终的解剖结果也显示，实验组的成瘤小鼠在注射mRNA后肿瘤生长受到抑制(图1E)。将解剖出的肿瘤进行称重，发现实验组中肿瘤重量明显低于对照组，统计分析表明，二者存在显著差异(p<0.05)(图1F)。(2)在整个实验过程中，两组小鼠体重均呈现稳步增长，因此可排除小鼠生长状况对实验结果的影响(图1D)。

对于CCL5-CXCL9-CXCL10-IL15-CXCL16-Myb mRNA而言，同样显示上述类似的结论：(1)绿色荧光蛋白都在肿瘤部位有表达，随着mRNA注射时间的增长，实验组小鼠肿瘤组织的生长明显放缓(图2C)。最终的解剖结果也显示，实验组的成瘤小鼠在注射mRNA后肿瘤生长受到抑制(图2E)。将解剖出的肿瘤进行称重，发现实验组中肿瘤重量明显低于对照组，统计分析表明，二者存在显著差异(p<0.05)(图2F)。(2)在整个实验过程中，两组小鼠体重均呈现稳步增长，因此可排除小鼠生长状况对实验结果的影响(图2D)。

而且两者对比而言，CM mRNA的肿瘤抑制效果要明显的好于CC mRNA，这一点尤其是可以从肿瘤抑制的大小可以直观而清楚地看出(图1或图2的E图)，从统计结果上也同时验证了这一点，这说明CCL5-CXCL9-CXCL10-IL15-CXCL16-Myb的多重靶向效果要优于CCL5-CXCL9的效果，而且进一步的研究发现，优化后的CM mRNA的肿瘤抑制效果要好于序列未经优化、直接相连的上述几种趋化因子转录形成的mRNA(约27％的提升)，且效果稳定。

实施例3：利用脂质体1(Liposome 1)尾静脉递送GFP、GFP-CC mRNA抑制肿瘤生长

将6周龄的C57BL/6小鼠分为两组，每组4只小鼠，皮下荷瘤MC38细胞系1×10⁶/100μl·只，荷瘤10天后肿瘤体积达到30mm³左右进行mRNA尾静脉递送。一组为对照组，尾静脉递送脂质体包装的EGFP mRNA(5.5μg/只小鼠)；另一组为实验组，尾静脉递送脂质体包装的GFP-CC mRNA(2.5μg/只小鼠)。每三天注射一次mRNA，总共注射三剂。这期间每隔一天测量一次小鼠的体重和肿瘤的长与宽，根据公式V＝π*(length*width²)/6计算肿瘤的体积大小，实验结束后处死小鼠并取出肿瘤并将解剖出的肿瘤进行拍照称重。

结果表明：(1)绿色荧光蛋白都在肿瘤部位有表达，随着mRNA注射时间的增长，实验组小鼠肿瘤组织的生长明显放缓(图3C)。最终的解剖结果也显示，实验组的成瘤小鼠在注射mRNA后肿瘤生长受到抑制(图2E)。将解剖出的肿瘤进行称重，发现实验组中肿瘤重量明显低于对照组，统计分析表明，二者存在显著差异(p<0.05)(图3F)。(2)在整个实验过程中，两组小鼠体重均呈现稳步增长，因此可排除小鼠生长状况对实验结果的影响(图3D)。

而且与上述直接瘤内递送的效果相比，具体参见图1C、3C；1F和3F，尾部静脉注射效果不如直接递送的效果，这也符合本领域的常规预期，但效果都远好于对照组，说明CCL5-CXCL9可以有效的实现肿瘤细胞的靶向定位，将目的蛋白准确、有效、稳定的运输到特定肿瘤位置，实现肿瘤的定向治疗。而且所携带的外源蛋白也可以稳定的表达，可以根据需要将其中的GFP替换为其他肿瘤治疗相关蛋白，实现一箭双雕的效果。这也同时证实了本申请所涉及到的mRNA疫苗可以实现远距离的基因定位，并不要求在瘤内注射即可实现较好的肿瘤治疗效果。

实施例4利用脂质体1(Liposome 1)递送CC mRNA、CM mRNA增强PD-1单抗的抗肿瘤作用

将6周龄的C57BL/6小鼠组，皮下荷瘤MC38细胞系1×10⁶/100μl·只，荷瘤10天后肿瘤体积达到30mm³左右进行mRNA瘤内递送。实验分为两大组，每一大组中分别包括两组：第一大组中一组为对照组1(4只小鼠)，瘤内递送脂质体1包装的EGFP mRNA(5.5μg/只小鼠)；另一组为实验组1(4只小鼠)，瘤内递送脂质体1包装的GFP-CC(2.5μg/只小鼠)；第二大组中一组为对照组2(6只小鼠)，瘤内递送脂质体1包装的EGFP mRNA(5.5μg/只小鼠)；另一组为实验组2(6只小鼠)，瘤内递送脂质体1包装的GFP-CM(2.5μg/只小鼠)。对照组1、实验组1、实验组2的小鼠都同时腹腔注射免疫检查点抑制剂anti-PD-1单抗，100μg/只小鼠。对照组2的小鼠腹腔注射对照IgG，200μg/只小鼠。mRNA及单抗每三天注射一次，总共注射三剂。这期间每隔一天测量一次小鼠的体重和肿瘤的长与宽，根据公式V＝π*(length*width²)/6计算肿瘤的体积大小，实验结束后处死小鼠并取出肿瘤并将解剖出的肿瘤进行拍照称重。

结果表明：无论是采用CC mRNA还是CM mRN，随着mRNA与免疫检查点抑制剂anti-PD-1单抗注射时间的增长，实验组小鼠肿瘤组织的生长明显放缓(图4C、5C)。最终的解剖结果也显示，实验组的成瘤小鼠在注射mRNA后使免疫检查点抑制剂anti-PD-1单抗的肿瘤抑制效果更加明显，增强了其抗肿瘤效果(图4E、5E)。将解剖出的肿瘤进行称重，发现实验组中肿瘤重量明显低于对照组，统计分析表明，二者存在显著差异(p<0.05)(图4F、5F)。(2)在整个实验过程中，两组小鼠体重均呈现稳步增长，因此可排除小鼠生长状况对实验结果的影响(图4D、5D)。进一步的比较发现，常规的IgG抗体在肿瘤治疗过程中的效果并不理想，并不能使肿瘤的重量和大小发生明显降低(图5E、5F)。而且与单独用药的比较结果类似，CMmRNA的肿瘤抑制效果要明显的好于CC mRNA。

进一步的，对上述动物实验中获得的肿瘤组织利用本领域的常规操作进行免疫组化和石蜡切片的制作(参见《分子生物学手册》)，通过免疫组化分析递送mRNA组小鼠各自与免疫检查点抑制剂anti-PD-1单抗联用下CCL5在MC38皮下移植瘤中的表达发现，实验组小鼠肿瘤组织的CCL5的表达水平相较对照组而言明显增加(图6A)、CXCL9的表达水平相较对照组而言明显增加(图6B)；上述结果与Western blot分析结果相一致，都证实了经过治疗后的肿瘤组织中CXCL9的表达水平有明显提升(图6C)。

取解剖后的肿瘤组织进行石蜡切片的制作，通过免疫组化在显微镜下观察小鼠肿瘤组织内的CD8⁺T的分布(参见《分子生物学手册》)，结果显示，实验组的CD8⁺T淋巴细胞数量多于对照组(图7A)；通过免疫荧光分析也证明实验组的CD8⁺T淋巴细胞数量多于对照组(图7B)，上述趋化因子可能通过招募CD8⁺T向肿瘤组织浸润，改善肿瘤组织的免疫微环境，增强免疫检查点抑制剂anti-PD-1单抗的杀伤肿瘤细胞能力，进一步抑制肿瘤组织生长。

综上所述，本发明的两个mRNA疫苗(CC mRNA和CM mRNA)无论是单独用药还是与其他肿瘤药物共同用药，都可以实现可以在体外和体内局部安全有效地递送mRNA，不会发生泄露，而且，能够导致局部长时间蛋白质产生和刺激强抗原特异性的T细胞反应，可以用于有效治疗癌症、传染病疫者其它疾病。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种组合物，其包含配制在药学上可接受的载体中的有效量的信使核糖核酸(mRNA)，其特征在于，该信使核糖核酸表达CCL5、CXCL9的重组融合蛋白，其序列如SEQ IDNO.1所示；或者，表达CCL5、CXCL9、CXCL10、IL15、CXCL16、Myb基因的重组融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的组合物中信使核糖核酸(mRNA)的核酸。

3.包含权利要求2所述核酸的序列的DNA重组载体。

4.一种mRNA疫苗，其特征在于所述mRNA疫苗包含权利要求1所述的组合物、权利要求1所述的组合物中信使核糖核酸(mRNA)、权利要求2所述的核酸、和/或权利要求3所述的重组载体。

5.权利要求4所述的一种mRNA疫苗在制备治疗、和/或改善选自癌症或肿瘤疾病的药物的用途，其特征在于所述mRNA疫苗可以实现将肿瘤治疗蛋白递送至体内可以使机体产生免疫反应，起到瘤内递送增强肿瘤治疗效果，其中癌症或肿瘤疾病为结肠癌。

6.一种抗肿瘤剂，其特征在于，所述抗肿瘤剂中包含权利要求1所述的组合物中信使核糖核酸(mRNA)、权利要求2所述的核酸、和/或权利要求3所述的重组载体，还包含另外的免疫抑制阻滞剂，所述免疫抑制阻滞剂是免疫检查点抑制剂，选自由抗PD1抗体、抗PD-L1抗体以及抗CTLA4抗体构成的群中的至少一种抗体，其中，所述肿瘤为结肠癌。