CN115804853A - 包含rna分子的组合物及其在制备瘤内注射剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本公开属于生物医药领域，具体来说，本公开涉及一种包含RNA分子和水性溶液的组合物，组合物的用途，以及预防或治疗肿瘤的方法。本公开以包含特定浓度的金属盐组分的水性溶液溶解RNA分子，能够显著提高RNA分子在肿瘤细胞或肿瘤组织内表达目标多肽的效率，进而提高RNA分子体内的肿瘤免疫治疗效果。本公开首次发现了适合RNA分子，特别是环状RNA分子向瘤内递送的注射液成分，为肿瘤的临床免疫治疗提供了一种能够实现高效递送和表达的瘤内递送剂。

Description

包含RNA分子的组合物及其在制备瘤内注射剂中的用途

技术领域

本公开属于生物医药领域，具体来说，本公开涉及一种包含RNA分子和水性溶液的组合物，组合物的用途，以及预防或治疗肿瘤的方法。

背景技术

信使核糖核苷酸(messenger ribonucleotide acid，mRNA)技术的发展为肿瘤、基因缺陷疾病以及流行病预防等领域的诊疗带来了更多可能性，而新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)的暴发更是让mRNA疫苗成为当下研究的热点。mRNA可以在体外合成、转录，能够实现快速、高效的生产，且适合制备编码不同蛋白的mRNA分子。与蛋白药物相比，mRNA的表达量及表达时长可满足更多的应用需求，具有更高的药代动力学优势。与DNA相比，mRNA无需进入细胞核，表达速度更快，并且避免了其整合到宿主基因组中的风险，安全性更高。此外，根据应用需求还可设计mRNA分子使其具有高或低的免疫原性^[1]。

当环状的RNA中含有核糖体内部进入位点(Internal ribosome entry site，IRES)时，环状RNA可以与核糖体小亚基结合进而启动核糖体翻译，即可以编码蛋白的合成。这种可以编码蛋白合成的环状RNA被称为环状mRNA。环状mRNA由于其首尾相接的特性，RNaseR的不能对其进行有效的切除。所以相较于线性mRNA，环状mRNA有超长的半衰期即更稳定的表达。有研究表明编码相同蛋白的mRNA，环形的形态可以稳定表达48小时以上，而线性的形态只能表达不到20个小时。因此，环状mRNA作为一种新型的mRNA治疗工具，在疾病治疗领域有极大的发展前景。

mRNA在传染病疫苗、肿瘤免疫治疗、蛋白替代及基因编辑等领域具有重要的应用前景，受mRNA分子大小、电荷和mRNA易降解特性的影响，使其很难主动通过细胞膜从而进入细胞质，通常需借助不同的递送系统，将mRNA递送到相应的细胞内。目前，在mRNA的应用过程中面临一个重要的技术难题就是合适的递送系统的开发^[2]。例如，针对肿瘤免疫治疗的mRNA递送系统目前主要包含三个方面，第一类为适用于肿瘤疫苗(tumor vaccine)的递送系统，即将编码肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)的mRNA递送到抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)中；第二类为适用于工程化改造CAR-T细胞(chimericantigen receptors T cells)的递送系统，即将编码靶向肿瘤嵌合抗原受体的mRNA递送到T细胞中；第三类递送系统适用于将免疫治疗的药物递送到肿瘤细胞，如将编码细胞因子如IL-12的mRNA递送到肿瘤细胞中，或将编码抑癌基因如PTEN的mRNA递送到肿瘤细胞中^[3-4]。若编码功能蛋白的mRNA在肿瘤以外的其他组织或细胞的富集会产生难以预估的副反应，因此，目前这类递送系统面临的最大挑战是如何实现肿瘤靶向。

瘤内注射裸mRNA具有肿瘤细胞/组织的递送与表达的特异性，因此在mRNA应用于肿瘤治疗的过程中安全性得到保障。不依赖于递送系统的裸mRNA瘤内注射虽然具有肿瘤细胞/组织的递送与表达特异性，但其表达量并不高，限制了mRNA的肿瘤免疫治疗效果。

因此，如何提高mRNA在递送至体内后的表达效率，改善mRNA的临床治疗效果，是当前亟需解决的重要问题。

引用文献：

[1]Vallazza B et al.Recombinant messenger RNA technology and itsapplication in cancer immunotherapy,transcript replacement therapies,pluripotent stem cell induction,and beyond.Wiley Interdiscip Rev RNA.2015Sep-Oct；6(5):471-99.

[2]Gao M et al.Synthetic modified messenger RNA for therapeuticapplications.Acta Biomater.2021 Jun 13:S1742-7061(21)00394-9.

[3]Susannah L.Hewitt et al.Intratumoral IL12 mRNA Therapy PromotesTH1 Transformation of the Tumor Microenvironment.Clin Cancer Res December 12020(26)(23)6284-6298.

[4]Lin YX et al.Reactivation of the tumor suppressor PTEN by mRNAnanoparticles enhances antitumor immunity in preclinical models.Sci TranslMed.2021 Jun 23；13(599):eaba9772.

发明内容

发明要解决的问题

鉴于现有技术中存在的问题，例如，mRNA分子在递送于体内后在患病细胞、组织内的表达效率低，限制了mRNA的临床治疗效果的缺陷。为此，本公开提供了一种包含RNA分子和水性溶液的组合物，以水性溶液溶解RNA分子，能够显著提高RNA分子在肿瘤细胞或肿瘤组织内表达目标多肽的效率，进而提高RNA分子体内的肿瘤免疫治疗效果，为肿瘤的临床免疫治疗提供了一种能够实现高效递送和表达的瘤内递送剂。

用于解决问题的方案

第一方面，本公开提供了一种组合物，其中，所述组合物包括编码具有肿瘤预防或治疗活性的目标多肽的RNA分子，和溶解所述RNA分子的水性溶液；其中，以质量体积百分比计，所述水性溶液中包括钠盐0.09％～9％，钾盐0.012％～1.2％，和钙盐0.024％～2.4％。

在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物，其中，所述RNA分子选自线性RNA分子或环状RNA分子；优选地，所述RNA分子为环状RNA分子。

在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物，其中，所述RNA分子为裸露的RNA分子；优选地，所述RNA分子为裸露的环状RNA分子。

在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物，其中，所述钠盐为NaCl，所述钾盐为KCl，所述钙盐为CaCl₂；优选地，以质量体积百分比计，所述水性溶液包括：NaCl 0.9％，KCl 0.12％，以及CaCl₂ 0.24％；更优选地，所述水性溶液为林格氏液。

在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物，其中，所述环状RNA分子包括编码所述目标多肽的编码区，和与所述编码区可操作地连接的翻译起始元件；

可选地，所述翻译起始元件为IRES元件；

优选地，所述IRES元件包含如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：

(i)包含如SEQ ID NO：4-7任一序列所组成的组中的一种或多种序列的核苷酸序列；

(ii)包含如SEQ ID NO：4-7任一序列所示的序列的反向互补序列的核苷酸序列；

(iii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；

(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；

优选地，所述IRES元件选自如下(a₁)-(a₇)中的任一项：

(a₁)包含如SEQ ID NO：4所示序列的核苷酸序列；

(a₂)包含如SEQ ID NO：5所示序列的核苷酸序列；

(a₃)包含如SEQ ID NO：6所示序列的核苷酸序列；

(a₄)包含如SEQ ID NO：7所示序列的核苷酸序列；

(a₅)包含如SEQ ID NO：8所示序列的核苷酸序列；

(a₆)包含如SEQ ID NO：9所示序列的核苷酸序列；

(a₇)包含如SEQ ID NO：10所示序列的核苷酸序列。

在一些实施方式中，根据本公开所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子还包括如下的一种或多种元件：5’间隔区、3’间隔区、第二外显子、第一外显子；

可选地，所述环状RNA分子包括位于所述翻译起始元件上游的5’间隔区，和位于所述编码区下游的3’间隔区；

优选地，所述5’间隔区包含如下(b₁)-(b₂)中任一项所示的序列：

(b₁)如SEQ ID NO：11-12任一序列所示的核苷酸序列；

(b₂)与(b₁)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；

优选地，所述3’间隔区包含如下(c₁)-(c₂)中任一项所示的序列：

(c₁)如SEQ ID NO：13-15任一序列所示的核苷酸序列；

(c₂)与(c₁)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。

在一些实施方式中，根据本公开所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子还包括位于所述5’间隔区上游的第二外显子，和位于所述3’间隔区下游的第一外显子；

优选地，所述第二外显子包含如下(d₁)-(d₂)中任一项所示的序列：

(d₁)如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；

(d₂)与(d₁)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；

优选地，所述第一外显子包含如下(e₁)-(e₂)中任一项所示的序列：

(e₁)如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；

(e₂)与(e₁)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。

在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物，其中，所述组合物通过肿瘤内给药被施用于受试者体内；优选地，所述组合物是肿瘤内给药的注射剂。

在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物，其中，所述组合物在肿瘤细胞或肿瘤组织内具有提高的目标多肽的表达量。

在一些实施方式中，根据本公开所述的组合物在制备如下(f₁)-(f₃)至少一项中的用途：

(f₁)用于预防或治疗肿瘤的药物；

(f₂)用于预防或治疗肿瘤的注射剂；

(f₃)用于预防或治疗肿瘤的瘤内注射剂。

第二方面，本公开提供了一种包含RNA分子和林格氏液的组合物在制备用于预防或治疗肿瘤的瘤内注射剂中的用途；其中，所述RNA分子编码具有肿瘤治疗活性的目标多肽。

在一些实施方式中，根据本公开所述的用途，其中，所述RNA分子选自线性RNA分子或环状RNA分子；优选地，所述RNA分子为环状RNA分子；更优选地，所述环状RNA分子在所述林格氏液中的浓度为0.05μg/μl～50μg/μl。

在一些实施方式中，根据本公开所述的用途，其中，所述RNA分子为裸露的RNA分子，所述林格氏液增强所述裸露的RNA分子在肿瘤细胞或肿瘤组织内的目标多肽的表达量。

第三方面，本公开提供了一种预防或治疗肿瘤的方法，其中，所述方法包括向受试者施用第一方面所述的组合物；

可选地，所述施用方式选自口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，瘤内注射、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或系统性施用；

优选地，所述施用方式为瘤内注射施用。

发明的效果

在一些实施方式中，本公开提供的水性溶液作为RNA分子的溶剂，能够显著提高RNA分子向肿瘤细胞或肿瘤组织的递送效率，及RNA分子在肿瘤细胞或肿瘤组织内的表达量，提高RNA分子的临床肿瘤免疫治疗的效果。

在一些优选的实施方式中，包含环状RNA分子和水性溶液的组合物通过瘤内注射给药的方式被施用于受试者体内，实现在肿瘤组织或肿瘤细胞内的特异性表达，避免因为健康细胞或组织中表达导致的毒副作用；此外，瘤内注射给药的组合物能够实现在肿瘤细胞或肿瘤组织内的高效、稳定、持久表达具有肿瘤治疗活性的目标多肽，充分发挥对活体肿瘤的免疫治疗效果。

在一些优选的实施方式中，组合物中溶解环状RNA分子的水性溶液为林格氏液。本公开首次发现了以林格氏液溶解环状RNA分子，在通过瘤内注射的方式施用于肿瘤瘤体时，能够实现环状RNA分子向肿瘤细胞或肿瘤组织的高效递送；且与其他类型的溶剂相比，林格氏液作为环状RNA分子的溶解液能够显著提高环状RNA分子表达目标多肽的表达量，提高环状RNA分子的肿瘤杀伤、抑制效果。并且，通过瘤内注射施用溶解环状RNA分子的林格氏液具有高的肿瘤细胞或组织的表达特异性，具有高的临床安全性。

在一些优选的实施方式中，组合物中溶解的环状RNA分子为裸露的环状RNA分子，环状RNA分子不需要使用脂质体材料等递送载体的包裹，即能实现向肿瘤组织或细胞内的高效递送和表达，避免了由于递送载体包裹导致的生物安全性降低，具有安全性、稳定性和便利性高的优势。

附图说明

图1示出了不同注射溶液对瘤内注射环状mRNA表达的影响。

图2示出了不同注射溶液对瘤内注射环状mRNA表达luciferase生物发光定量比较结果。

图3示出了分别排除林格氏液中的单个成分后环状mRNA的瘤内表达情况。

图4示出了林格氏液和1×TE缓冲液用于线性mRNA瘤内注射的表达比较。

图5示出了不同给药途径对环状mRNA表达的影响，(A)瘤内注射环状LuciferasemRNA；(B)肿瘤周围皮下注射环状Luciferase mRNA；正常野生型小鼠(C)肿瘤周围皮内注射环状Luciferase mRNA；(D)肌肉注射环状Luciferase mRNA；(E)腹腔注射环状LuciferasemRNA；(F)尾静脉注射环状Luciferase mRNA。

具体实施方式

定义

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。

虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

在本公开中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

在本公开中，使用“m/v”表示质量体积百分比含量。

在本公开中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等能够使用的任何可行的水。

如本公开所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。

如本公开所使用的，术语“治疗活性”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的肿瘤或肿瘤的进展或严重性。“预防”包括对肿瘤或肿瘤症状的发生或发展的抑制。在本公开中，具有肿瘤预防或治疗活性的目标多肽包括但不限于：(i)抑制或杀伤肿瘤细胞的多肽，(ii)在受试者中诱导抗肿瘤免疫应答的多肽，和/或(iii)降低或消除肿瘤免疫抑制微环境的多肽。

如本公开所使用的，术语“RNA分子”包含能够翻译产生蛋白的任意种类的RNA分子。示例性的，RNA分子可以是线性mRNA，也可以是环状mRNA，可以是单链或双链的RNA分子等。

如本公开所使用的，术语“环状RNA”是一种呈封闭环形RNA分子。在一些实施方式中，本公开中的环状RNA分子由线状RNA分子的上游的5’端与下游的3’端连接形成环状。在一些实施方式中，本公开中的环状RNA分子由线状RNA分子的上游的5’端与下游的3’端连接形成环状。本公开中的环状RNA分子由环化前体RNA分子通过剪切和环化反应形成环状。

如本公开所使用的，术语“线状RNA”是指能够环化形成环状RNA的RNA前体，其一般由线状的DNA分子转录形成。

如本公开所使用的，术语“线性RNA”是指包括5’帽子结构(5’Cap)，3’多聚腺苷尾巴(PolyA tail)，5’非翻译序列(5’untranslational region，5’UTR)，3’非翻译序列(3’untranslational region，3’UTR)以及开放阅读框(Open reading frame，ORF)等结构的具有翻译功能的RNA。

如本公开所使用的，术语“翻译起始元件”是指能够能够招募核糖体，起始RNA 分子的翻译过程的任意的序列元件。示例性的，翻译起始元件为IRES元件、m6A修饰序列，或滚环翻译的起始序列等等。

如本公开所使用的，术语“IRES”(Internal ribosome entry site，IRES)又称内部核糖体进入位点，“内部核糖体进入位点”(IRES)属于翻译控制序列，通常位于所关注基因的5’端，并使得以帽非依赖性方式翻译RNA。经转录的IRES可直接结合核糖体亚单位，以使得mRNA起始密码子在核糖体中适当地取向以进行翻译。IRES序列通常位于mRNA的5’UTR中(起始密码子的正上游)。IRES在功能上取代对各种与真核生物翻译机制相互作用的蛋白因子的需求。

如本公开所使用的，术语“编码区”(Coding Region)是指能够转录信使RNA，并最终翻译为目标多肽、蛋白的基因序列。

如本公开所使用的，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。

如本公开所使用的，术语“上游”或“下游”是指沿编码区的蛋白翻译方向的上游及下游。

术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”互换使用。它们指聚合物形式的任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物。多核苷酸可以是单链或双链，并且如果为单链，可以是编码链或非编码(反义)链。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及核苷酸类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。可以在聚合后进一步修饰多核苷酸，如通过与标记组分缀合。核酸可以是重组多核苷酸或在自然界中不存在或与另一个多核苷酸以非自然布局连接的基因组来源、cDNA来源、半合成来源或合成来源的多核苷酸。

如本公开所使用的，术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。

示例性的，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。在某些实施方式中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(例如，多核苷酸)的整个长度上基本相同。

如本公开所使用的，术语“重组核酸分子”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中，且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”“重组蛋白”“融合蛋白”等。

如本公开所使用的，“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)本发明的组合物，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。

如本公开所使用的，“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触(例如给药)本发明的组合物，从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。

如本公开所使用的，术语“有效量”指本发明的重组核酸分子、重组表达载体、环化前体RNA、环状RNA、疫苗或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

如本公开所使用的，术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端黑素瘤，结节性黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖，脑瘤和脑癌，以及头颈癌，及相关转移。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括肺癌(例如非小细胞肺癌)、肝癌、胃癌或结肠癌，包括那些癌症的转移性形式。

术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

如本公开所使用的，本公开中的术语“放疗剂”包括使用引起DNA损伤的药物。放疗已广泛用于癌症和疾病治疗，并且包括通常称为γ射线、X射线的那些和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。

本公开中的术语“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的类别包括，但不限于：烷化剂、抗代谢产物、激酶抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂、抗-孕酮、雌激素受体下调剂、雌激素受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗-雄激素类、芳香化酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、抑制涉及异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。可用于本公开的治疗方法的化疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

技术方案

在本公开的技术方案中，说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示：

SEQ ID NO：1所示的序列为Luciferase蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO：2所示的序列为编码Luciferase蛋白的环状RNA分子的核苷酸序列；

SEQ ID NO：3所示的序列为编码Luciferase蛋白的线性RNA分子的核苷酸序列；

SEQ ID NO：4所示的序列为CVB3 IRES的核苷酸序列；

SEQ ID NO：5所示的序列为EV24 IRES的核苷酸序列；

SEQ ID NO：6所示的序列为EV29 IRES的核苷酸序列；

SEQ ID NO：7所示的序列为EV33 IRES的核苷酸序列；

SEQ ID NO：8所示的序列为EV24与CVB3嵌合IRES的核苷酸序列；

SEQ ID NO：9所示的序列为EV29与CVB3嵌合IRES的核苷酸序列；

SEQ ID NO：10所示的序列为EV33与CVB3嵌合IRES的核苷酸序列；

SEQ ID NO：11所示的序列为5’间隔区序列1的核苷酸序列；

SEQ ID NO：12所示的序列为5’间隔区序列2的核苷酸序列；

SEQ ID NO：13所示的序列为3’间隔区序列1的核苷酸序列；

SEQ ID NO：14所示的序列为3’间隔区序列2的核苷酸序列；

SEQ ID NO：15所示的序列为3’间隔区序列3的核苷酸序列；

SEQ ID NO：16所示的序列为I类PIE系统的外显子原件1(E1)的核苷酸序列；

SEQ ID NO：17所示的序列为I类PIE系统的外显子元件2(E2)的核苷酸序列；

SEQ ID NO：18所示的序列为I类PIE系统的5’内含子的核苷酸序列；

SEQ ID NO：19所示的序列为I类PIE系统的3’内含子的核苷酸序列；

SEQ ID NO：20所示的序列为5’同源臂序列1(H1)的核苷酸序列；

SEQ ID NO：21所示的序列为5’同源臂序列2(H2)的核苷酸序列；

SEQ ID NO：22所示的序列为3’同源臂序列1的核苷酸序列；

SEQ ID NO：23所示的序列为3’同源臂序列2的核苷酸序列。

包含RNA分子和水性溶液的组合物

本公开提供的组合物包括具有肿瘤预防或治疗活性的目标多肽的RNA分子，和溶解所述RNA分子的水性溶液；其中，所述水性溶液中包括钠盐0.09％～9％(m/v)，钾盐0.012％～1.2％(m/v)，和钙盐0.024％～2.4％(m/v)。

示例性的，水性溶液中的钠盐浓度为0.09％(m/v)、0.5％(m/v)、0.9％(m/v)、1％(m/v)、2％(m/v)、3％(m/v)、4％(m/v)、5％(m/v)、6％(m/v)、7％(m/v)、8％(m/v)等等。水性溶液中的钾盐浓度为0.02％(m/v)、0.04％(m/v)、0.06％(m/v)、0.08％(m/v)、0.12％(m/v)、0.16％(m/v)、0.18％(m/v)、0.2％(m/v)、0.4％(m/v)、0.6％(m/v)、0.8％(m/v)、1.0％(m/v)等等。水性溶液中的钾盐浓度为0.04％(m/v)、0.06％(m/v)、0.08％(m/v)、0.12％(m/v)、0.14％(m/v)、0.18％(m/v)、0.20％(m/v)、0.24％(m/v)、0.28％(m/v)、0.3％(m/v)、0.4％(m/v)、0.5％(m/v)、0.6％(m/v)、0.7％(m/v)、0.8％(m/v)、1％(m/v)、2％(m/v)等等。

在本公开中，水性溶液溶解RNA分子后，能够显著提高RNA分子向肿瘤组织内的递送效率，提高目标多肽在肿瘤组织或肿瘤细胞中的表达量，为RNA分子向肿瘤的瘤内递送提供了一种安全、有效、简单、可靠的递送方式。

对于水性溶液中的钠盐、钾盐和钙盐，可以是本领域中适合向体内施用的各类型的钠盐、钾盐和钙盐。例如，钠盐、钾盐和钙盐可以相互独立地为氯化盐、硫酸盐等等。在一些实施方式中，钠盐为NaCl，钾盐为KCl，钙盐为CaCl₂。本公开发现，包含NaCl、KCl以及CaCl₂的盐溶液适合作为溶解RNA分子，并且将RNA分子向瘤内递送的水性溶液。

在一些优选的实施方式中，水性溶液包含：NaCl 0.9％(m/v)，KCl 0.12％(m/v)，以及CaCl₂ 0.24％(m/v)。本公开发现，包含上述盐浓度的水性溶液能够实现RNA分子向瘤内的高效递送，以及具有肿瘤预防或治疗活性的目标多肽在肿瘤细胞或肿瘤组织内的高效表达。并且，NaCl、KCl和CaCl₂的任一成分对于实现RNA分子在瘤内的高效递送和表达均是必不可少的。

在一些具体的实施方式中，水性溶液由NaCl 0.9％(m/v)、KCl 0.12％(m/v)、CaCl₂ 0.24％(m/v)，以及溶解上述金属盐成分的水组合形成。在另外一些具体的实施方式中，水性溶液中还可以包含其他金属盐成分，例如NaHCO₃。

在一些更为具体的实施方式中，水性溶液为林格氏液。本公开首次发现了林格氏液能够作为RNA分子向瘤内递送的溶解液，显著提高RNA分子通过瘤内注射递送到瘤体内的表达量，提高RNA分子的临床肿瘤免疫治疗效果。

在本公开中，溶解于水性溶液中的RNA分子可以是线性RNA分子或环状RNA分子。虽然RNA分子溶解后可以通过皮内给药、上皮内给药、皮下给药、静脉内给药、动脉内给药、腹腔给药、腹膜内给药、结点内给药等多种给药方式递送于患者体内。然而，对于肿瘤免疫治疗而言，若编码功能蛋白的mRNA在肿瘤以外的其他组织或细胞的富集会产生难以预估的副反应。因此，瘤内注射给药的方式对于实现RNA分子在肿瘤细胞/组织内的特异性递送、表达具有重要意义。目前，对于适合RNA分子瘤内递送的注射液配方还未见报道。

本公开通过瘤内注射的方式，向肿瘤模型小鼠的瘤内递送溶解有RNA分子的水性溶液；发现无论是环状RNA分子还是线性RNA分子，以水性溶液溶解后均能实现其在肿瘤内特异性的高表达，具有重要的临床应用前景。

在一些实施方式中，RNA分子为裸露的RNA分子。本公开中的RNA分子不需要以脂质体材料等进行包裹，仅将其溶解于水性溶液中，即能实现向肿瘤细胞或肿瘤组织内的高效递送、表达，避免了由于使用递送载体材料导致的毒副作用，具有临床安全性高、生产成本低、目标多肽的表达效率高等优势，适合大规模的推广、使用。

在一些实施方式中，RNA分子为环状RNA分子。本公开首次发现了适合向体内施用环状RNA分子的水性溶液。水性溶液溶解环状RNA分子后可通过注射给药的方式施用于肿瘤患者的瘤内，瘤内注射给药的包含有环状RNA分子的水性溶液可实现环状RNA分子在肿瘤细胞或肿瘤组织内稳定、高效、持久的表达，充分发挥对肿瘤的杀伤、抑制效果。

在一些具体的实施方式中，溶解环状RNA分子的水性溶液为林格氏液。本公开中发现，与使用其他成分的溶剂溶解环状RNA分子相比，以林格氏液溶解环状RNA分子后向瘤内注射施用，能够显著提高环状RNA分子在瘤内的表达量，为环状RNA分子的瘤内施用提供了一种安全、有效的递送溶液。

在一些更为具体的实施方式中，林格氏液溶解的环状RNA分子为裸露的环状RNA分子。本公开中发现，以林格氏液溶解裸露的环状RNA分子，即能实现向肿瘤细胞或肿瘤组织内的高效递送，并且环状RNA分子在肿瘤组织或肿瘤细胞内能够高效表达具有肿瘤预防或治疗活性的目标多肽，具有高的临床施用的安全性和有效性。

在一些实施方式中，林格氏液中溶解的环状RNA分子的浓度为0.05μg/μl～50μg/μl，示例性的，环状RNA分子的浓度为0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.25μg/μl、0.3μg/μl、0.6μg/μl、0.8μg/μl、2μg/μl、4μg/μl、6μg/μl、9μg/μl、11μg/μl、12μg/μl、14μg/μl、18μg/μl、22μg/μl、25μg/μl、30μg/μl、32μg/μl、35μg/μl、38μg/μl、40μg/μl、42μg/μl、46μg/μl、48μg/μl等等。此外，林格氏液中溶解的环状RNA分子的含量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和环状RNA分子在个体中激发所需反应的能力而变动。

在一些实施方式中，包含RNA分子和水性溶液的组合物通过肿瘤内给药被施用于受试者体内。与皮内给药、皮下给药、腹腔给药、肌肉给药等施用方式相比，肿瘤内给药可保证RNA分子在肿瘤细胞、组织中高特异性地表达目标多肽，避免RNA分子在健康细胞、组织中的非特异性表达导致的毒副作用。并且，本公开中水性溶液溶解RNA分子在瘤内给药时具有高的表达效率，可保证肿瘤的临床免疫治疗效果。

在一些优选的实施方式中，水性溶液溶解RNA分子被制作为注射剂；进一步的，水性溶液溶解环状RNA分子被制作为注射剂。本公开首次发现了适合环状RNA分子瘤内注射施用的注射剂成分，为环状RNA分子在肿瘤临床免疫治疗中的应用提供的重要的应用基础。

在本公开中，环状RNA分子编码具有肿瘤预防或治疗活性的目标多肽，本公开对具有肿瘤预防或治疗活性的多肽的序列不进行具体限定，只要其具有相应的多肽活性即可。

在一些实施方式中，具有肿瘤免疫预防或治疗活性的多肽为细胞因子。示例性的，细胞因子包括但不限于白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。环状RNA分子通过表达细胞因子，能够有效激活机体的免疫系统，杀伤肿瘤细胞，实现对肿瘤的治疗。

在一些实施方式中，具有肿瘤免疫预防或治疗活性的多肽为抗原结合片段。更具体的，具有肿瘤免疫治疗活性的多肽为与肿瘤抗原特异性结合的抗原结合片段。示例性的，肿瘤抗原包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、AFP、CEA、PSCA、GD2、NKG2D、BCMA、EGFR、Her2、EGFRvⅢ、CD171、FAP、IL13Rα2、VEGFR1、VEGFR2、GPC-3、Mesothelin、claudin 18.2、EpCAM、MUC1、MUC16、EPHA2、EPHA3、CD133、PSMA。环状RNA分子通过靶向肿瘤细胞表面抗原或特定受体，从而阻断肿瘤生长因子信号通路，发挥杀伤肿瘤细胞的作用。

在本公开中，抗原结合片段包括与肿瘤抗原特异性结合的抗体，或是包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。

进一步的，抗原结合片段包括涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体(例如，scFv)、完整抗体、Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)₂；线性抗体；单结构域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。

在一些实施方式中，环状RNA分子还包括与编码区可操作地连接的翻译起始元件。在本公开中，翻译起始元件可以是能够招募核糖体，起始环状RNA分子的翻译过程的任意的序列元件。示例性的，翻译起始元件为IRES元件、m6A修饰序列，或滚环翻译的起始序列等等。

在一些具体的实施方式中，翻译起始元件为IRES元件，IRES元件连接于编码区的上游，能够有效起始编码区翻译表达目标多肽。

在一些优选地实施方式中，IRES元件包含如SEQ ID NO：4-7任一序列所组成的组中的一种或多种序列的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IRES元件为SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的CVB3 IRES、SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的EV24 IRES、SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的EV29 IRES、SEQID NO：7所示核苷酸序列的EV33 IRES。在一些实施方案中，IRES元件包含CVB3v IRES与EV24 IRES、EV29 IRES和EV33 IRES中任意一种的嵌合体序列。在一些实施方式中，IRES元件包含CVB3v与EV24 IRES的嵌合体序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。在一些实施方式中，IRES元件包含CVB3v与EV29 IRES的嵌合体序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。在一些实施方式中，IRES元件包含CVB3v与EV33 IRES的嵌合体序列，其核苷酸序列如SEQID NO：10所示。本公开的IRES元件能够提高目标多肽的表达效率，包含IRES元件的环状RNA分子以水性溶液向瘤内注射递送，可在肿瘤细胞、肿瘤组织的高效、持久表达。

在一些实施方式中，环状RNA分子还包括如下的一种或多种元件：5’间隔区、3’间隔区、第二外显子、第一外显子。通过设置其他的一种或多种的表达元件，可以通过多种环化方式得到环状RNA分子，并进一步提高裸露的环状RNA分子在以水性溶液递送至瘤内后表达目标多肽的组织特异性和表达效率。

在一些实施方式中，所述环状RNA分子包括位于所述翻译起始元件上游的5’间隔区，和位于所述表达调控元件下游的3’间隔区。在一些优选地实施方式中，5’间隔区序列为与SEQ ID NO：11-12任一序列所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。在一些优选地实施方式中，3’间隔区序列为与SEQ ID NO：13-15任一序列所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些实施方式中，环状RNA分子还包括位于所述5’间隔区上游的第二外显子，和位于所述3’间隔区下游的第一外显子。在一些优选地实施方式中，第二外显子序列为与SEQID NO：17所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。在一些优选地实施方式中，第一外显子序列为与SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些优选地实施方式中，环状RNA分子包含顺次连接的如下所示元件：第二外显子、5’间隔区、IRES元件、编码区、3’间隔区和第一外显子。

本公开中通过选择特定序列的5’间隔区、3’间隔区、IRES元件、第二外显子以及第一外显子，得到的环状RNA分子以裸露状态溶解于林格氏液中，通过瘤内注射施用的方式递送于受试者体内，通过多因素的协调作用，实现环状RNA分子在瘤内的高特异性和高效率表达，为实现高效的肿瘤杀、抑制效果。

在一些实施方式中，环状RNA分子溶解于林格氏液的注射剂可以与其他的肿瘤治疗剂联合施用，以进一步提高肿瘤的临床免疫治疗的效果。

示例性的，肿瘤治疗剂选自放疗剂、化疗剂、免疫调节剂、细胞毒性剂、抗体、疫苗中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，肿瘤治疗剂为免疫调节剂“免疫调节剂”包含免疫检查点调节剂，例如免疫检查点蛋白受体及其配体介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式等等。此外，“免疫调节剂”还包括白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等细胞因子，均可以达到增强肿瘤患者或病原体感染者机体免疫应答与免疫调节的效果。

在一些实施方式中，本公开提供了一种环化前体RNA分子，能够环化形成上述的环状RNA分子。

在一些具体的实施方式中，环化前体RNA分子还包括位于第二外显子上游的5’同源臂，5’同源臂序列为与SEQ ID NO：20-21任一序列所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些具体的实施方式中，环化前体RNA分子还包括位于第一外显子序列下游的3’同源臂序列。3’同源臂序列为与SEQ ID NO：22-23任一序列所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些具体的实施方式中，环化前体RNA分子还包括位于第二外显子与5’同源臂之间的3’内含子，3’内含子序列为与SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些具体的实施方式中，环化前体RNA分子还包括位于第一外显子与3’同源臂之间的5’内含子，5’内含子序列为与SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。

在一些具体的实施方式，环化前体RNA分子包括顺次连接的如下所示序列：

5’同源臂、3’内含子、第二外显子、5’间隔区、IRES元件、编码区、3’间隔区、第一外显子、5’内含子和3’同源臂。

环化前体RNA分子通过如下过程成环：利用内含子的核酶特性，在GTP的引发下，5’内含子与第一外显子的连接处发生断裂；第一外显子的核酶裂口进一步攻击3’内含子与第二外显子的连接处，使该处发生断裂，3’内含子解离，第一外显子和第二外显子连接形成环状RNA。

医药用途

本公开提供了包含RNA分子和水性溶液的组合物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物。利用水性溶液溶解的RNA分子可在施用于体内后高表达具有肿瘤预防或治疗活性的目标多肽，发挥肿瘤的预防、治疗效果。

在一些具体的实施方式中，组合物由水性溶液溶解环状RNA分子形成。进一步的，组合物由裸露的环状RNA分子溶解于水性溶液中得到。

在一些更为具体的实施方式中，组合物由裸露的环状RNA分子溶解于林格氏液中得到。与其他成分的溶剂相比，环状RNA分子溶解于林格氏液中具有更高的目标多肽的表达量，并且仅以裸露的环状RNA分子即能实现高效的递送和表达。

在一些具体的实施方式中，组合物被制作为注射剂。进一步的，组合物被制作为向瘤内注射施用的瘤内注射剂。

受体内复杂生理环境的影响，在体外能够实现RNA分子高效表达的溶液体系在向体内施用后，难以保证在体内同样具有高的表达和递送效果。特别地，对于肿瘤而言，受其复杂肿瘤微环境的影响，目前尚未发现向瘤体内注射施用环状RNA分子的注射剂。本公开中以林格氏液溶解裸露的环状RNA分子，通过瘤内注射施用的方式，可实现环状RNA分子向瘤内的高效递送，环状RNA分子在受试者体内高效、稳定表达，有效激活机体抗肿瘤的免疫应答，抑制、杀伤肿瘤细胞，充分发挥对肿瘤的免疫治疗效果。

在一些具体的实施方式中，本公开中的林格氏液溶解环状RNA分子的注射剂用于治疗实体肿瘤，示例性的，实体肿瘤包括但不限于：肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌、肾癌、淋巴癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、前列腺癌、宫颈癌、胆管癌、食管癌、黑色素瘤等。

实施例

本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

下述实施例涉及的实验动物和实验方法如下：

B16F10肿瘤模型

实验动物：6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重18-22克，研究前在饲养室适应至少三天。小鼠可自由获取食物和无菌水。

饲养环境：维持12h明12h暗昼夜交替，湿度维持在40～70％且日湿度差<5％；温度维持于20～25℃。按照实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

B16F10细胞购于南京科佰生物技术有限公司，培养于DMEM高糖培养基，加入10％FBS(Fatal Bovine Serum，胎牛血清)和1％PS(Penicillin-Streptomycin Solution，青霉素-链霉素溶液)。DMEM高糖培养基和FBS购自Biological Industries，PBS购自HyClone。细胞计数：采用台盼蓝(Trypan Blue Solution，购自SIGMA)与细胞悬液1:1混合后，使用Countstar细胞计数仪计数。收集细胞时，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(gibco，REF.12605-010)消化细胞，重悬于添加了Matrigel(Corning)的磷酸盐缓冲液(PBS，上海源培生物科技股份有限公司)中，每只雌性C57BL/6J小鼠右侧腋下皮下接种1×10⁶/150μl的B16F10细胞。在肿瘤体积长到100mm³左右时进行瘤内注射。

MC38肿瘤模型

实验动物：6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重18-22克，研究前在饲养室适应至少三天。小鼠可自由获取食物和无菌水。

饲养环境：维持12h明12h暗昼夜交替，湿度维持在40～70％且日湿度差<5％；温度维持于20～25℃。按照实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

MC38细胞购自南京科佰生物技术有限公司，培养于DMEM高糖培养基，加入10％FBS(Fatal Bovine Serum，胎牛血清)和1％PS(Penicillin-Streptomycin Solution，青霉素-链霉素溶液)。DMEM高糖培养基和FBS购自Biological Industries，PBS购自HyClone。细胞计数：采用台盼蓝(Trypan Blue Solution，购自SIGMA)与细胞悬液1:1混合后，使用Countstar细胞计数仪计数。收集细胞时，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)消化细胞，重悬于添加了Matrigel(Corning)的磷酸盐缓冲液(PBS，上海源培生物科技股份有限公司)中，每只雌性C57BL/6J小鼠右侧腋下皮下接种1×10⁶/150μl的MC38细胞。在肿瘤体积长到100mm³左右时进行瘤内注射。

用于瘤内注射的mRNA制备

1、环状mRNA制备：

合成与构建含有表达目的基因Firefly Luciferase的，用于生成环状RNA的DNA质粒载体，该步骤委托苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成与克隆。此处所使用的构建环状RNA的DNA载体，包含T7启动子，5’同源臂，3’内含子，第二外显子E2，5’间隔区，IRES元件，luciferase序列编码区，下游间隔区，5’内含子，第一外显子E1，3’同源臂，以及可用于质粒线性化的酶切位点XbaI。通过质粒抽提试剂盒(天根无内毒素小量中提试剂盒)获得质粒，采用限制性内切酶XbaI进行质粒线性化。采用体外转录合成环状mRNA前体RNA。转录体系如下：

表1

试剂	体积
		10xReaction Buffer	2μL
ATP(20mM)	2μL
		CTP(20mM)	2μL
UTP(20mM)	2μL
		GTP(20mM)	2μL
Xba I单酶切线性化DNA	XμL(500-1000ng)
		T7 RNA Polymerase	2μL
RNA inhibitor	2μL
		RNA Nuclease free，H2O	Total 20μL

T7 RNA聚合酶采用PureScribe^TM T7 High Yield RNA Synthesis Kit(江苏普瑞康生物医药有限公司)。所得转录产物使用硅膜离心柱法纯化(Thermo，GeneJET RNAPurification Kit)。RNA环化得到环状mRNA，条件如下:

表2

溶液	体积
		mRNA	25μg RNA溶液
GTP solution(20mM)	50μl
		GTP buffer	补足至500μl

将上述溶液于55℃加热15min，环化RNA产物使用硅膜离心柱法纯化(Thermo，GeneJET RNA Purification Kit)，获得环状mRNA，测定OD值。

2、线性mRNA的合成步骤如下：

pUC57-TRNP-EGFP-DASP质粒酶切线性化及模板纯化方法同(2)-2)。采用APExBio试剂盒HyperScribe^TM All in One mRNA Synthesis Kit II通过体外转录合成Cap1结构的线性mRNA，采用假尿嘧啶进行核苷修饰。最终得到Cap1结构，带PolyA尾且具有假尿嘧啶核苷修饰的线性mRNA。

环状mRNA分装后放于-90℃冰箱，注射当天解冻，配制相应的2×注射溶液，并用该2×溶液和无酶水、环状mRNA配制成相应的1×注射溶液，分装后用于瘤内注射。

线性mRNA分装后放于-90℃冰箱，注射当天解冻，配制相应的2×注射溶液，并用该2×溶液和无酶水、线性mRNA配制成相应的1×注射溶液，分装后用于瘤内注射。

小鼠活体成像

荷瘤小鼠瘤内注射不同溶液的编码luciferase的mRNA后，4到6小时进行小动物活体生物发光成像检测。小鼠腹腔注射D-luciferin(150mg/kg，Promega)的PBS溶液后，放入含有2.5％异氟烷的麻醉仓中麻醉。待小鼠麻醉以后，将其转移到小动物活体成像仪(IVISspectrum imaging system，PerkinElmer)中，并将小鼠鼻子放在含有2.5％异氟烷的管道中。腹腔注射底物10分钟后进行成像、拍照，并用Living Image软件计算目标部位(regionof interest，ROI)的生物发光信号值(photons/second)。

实施例1.筛选适用于环状mRNA瘤内注射的溶液

1.1实验方法

用灭菌无酶水配制如下溶液：1.8％氯化钠溶液、2×PBS溶液、2×林格氏液、2×TE缓冲液。按照下表配制溶解在不同溶液中的mRNA。

表3

mRNA全程放置在冰上，整个操作过程在超净台中进行。配制完毕后，将溶液小心混匀后，分装在八联管中，每管40μL。

皮下接种B16F10肿瘤细胞的小鼠随机分组，瘤内注射40μL溶解在不同溶液中的编码luciferase的mRNA后，6小时后进行小动物活体成像，检测生物发光的信号值，并对ROI进行定量分析。

1.2实验结果

通过使用实验室常用的缓冲液PBS、1×TE缓冲液、0.9％NaCl溶液以及林格氏液分别配置mRNA注射液，并对荷瘤小鼠进行瘤内注射10μg编码luciferase的mRNA溶液。通过小动物活体成像检测小鼠瘤内生物化学发光值。生物发光值的大小直接反映了瘤内luciferase的表达量高低。如图1和图2所示，不同溶液配制的mRNA溶液进行瘤内注射后，mRNA的表达量有差异。林格氏液可显著提高mRNA瘤内注射的表达量。

实施例2.确定林格氏液中促进环状mRNA瘤内注射表达的关键成分

2.1实验方法

用灭菌无酶水配制如下溶液：9％氯化钠溶液、2.4％氯化钙溶液、1.2％氯化钾溶液、2％碳酸氢钠溶液，按照下表配制溶解在不同溶液中的mRNA。

表4

皮下接种B16F10肿瘤细胞的小鼠随机分组，每组3只小鼠，瘤内注射40μL溶解在不同溶液中的编码luciferase的mRNA后，6小时候进行小动物活体成像，检测生物发光的信号值。

2.2实验结果

林格氏液主要成分包括氯化钠、氯化钾、氯化钙和碳酸氢钠，通过分别去除上述特定成分验证促进瘤内注射mRNA表达的关键成分。如图3结果所示，去除氯化钙和氯化钾对瘤内注射mRNA的表达影响最显著，去除碳酸氢钠对瘤内注射mRNA表达未见显著影响。而去除氯化钠对瘤内注射mRNA的表达有一定的影响。由于氯化钠是林格氏液中含量最多的成分，去除氯化钠后会影响整个溶液的渗透压等性质。

实施例3.林格氏液同样适用于线性mRNA的瘤内注射

3.1实验方法

按照下表配制线性和环状mRNA的瘤内注射液。皮下接种MC38的荷瘤小鼠随机分为两组，每组瘤内注射线性或环状mRNA各40μL。4小时后，小鼠腹腔注射luciferin底物，10分钟后进行生物发光成像。

表5

3.2实验结果

如图4所示，与常用的1×TE缓冲液作为比较，采用林格氏液作为瘤内mRNA注射液时，mRNA表达量显著提升。因此，林格氏液除了可以应用在环状mRNA瘤内注射以外，也适用于线性mRNA的瘤内注射。

实施例4.不同给药途径对环状mRNA表达的影响

1.1实验方法

对于B1F10肿瘤模型小鼠，分别进行瘤内、肿瘤周围皮下以及皮内注射10μg编码Firefly luciferase的环状mRNA；对于正常野生型小鼠，分别肌肉、腹腔以及尾静脉注射10μg环状Luciferase的mRNA。6h后小鼠腹腔内注射荧光素的水溶液(1×PBS缓冲液溶解环状mRNA形成)，活体荧光成像。通过荧光强度分析，不同给药途径对环状mRNA表达的影响。

1.2实验结果

图5示出了不同给药途径对环状mRNA表达的影响，如图5中B和C所示，肿瘤周围皮下和皮内注射环状mRNA，未见有明显表达。其他给药方式如肌肉注射(D)、腹腔注射(E)和静脉注射(F)等，均未检测到荧光。而进行瘤内注射(A)的小鼠，整个瘤体呈现明显的荧光。因此，在没有递送系统的前提下，环状mRNA的给药方式会显著影响环状mRNA的表达，瘤内注射环状mRNA这一方法是可行的。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州科锐迈德生物医药科技有限公司

<120> 包含RNA分子的组合物及其在制备瘤内注射剂中的用途

<130> 6A23-2183138I-SU

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 550

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Luciferase蛋白序列

<400> 1

Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro

1 5 10 15

Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg

20 25 30

Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu

35 40 45

Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala

50 55 60

Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val

65 70 75 80

Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu

85 90 95

Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg

100 105 110

Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val

115 120 125

Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro

130 135 140

Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly

145 150 155 160

Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe

165 170 175

Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile

180 185 190

Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val

195 200 205

Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp

210 215 220

Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val

225 230 235 240

Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu

245 250 255

Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu

260 265 270

Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val

275 280 285

Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr

290 295 300

Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser

305 310 315 320

Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile

325 330 335

Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr

340 345 350

Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe

355 360 365

Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val

370 375 380

Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly

385 390 395 400

Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly

405 410 415

Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe

420 425 430

Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln

435 440 445

Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile

450 455 460

Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu

465 470 475 480

Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys

485 490 495

Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu

500 505 510

Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly

515 520 525

Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys

530 535 540

Gly Gly Lys Ile Ala Val

545 550

<210> 2

<211> 2572

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 环状RNA分子序列

<400> 2

aaaauccguu gaccuuaaac ggucgugugg guucaagucc cuccaccccc acgccggaaa 60

cgcaauagcc gaaaaaacaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa caaaaaaaaa accaaaacac 120

auuaaaacag ccuguggguu gaucccaccc acagggccca cugggcgcua gcacucuggu 180

aucacgguac cuuugugcgc cuguuuuaua cuuccucccc caacugcaac uuagaaguaa 240

cacaaaccga ucaacaguca gcguggcaca ccagccacgu uuugaucaaa cacuucuguu 300

accccggacu gaguaucaau agacugcuca cgcgguugaa ggagaaaacg uucguuaucc 360

ggccaacuac uucgagaaac cuaguaacgc cauggaaguu guggaguguu ucgcucagca 420

cuaccccagu guagaucagg uugaugaguc accgcauucc ccacggguga ccguggcggu 480

ggcugcguug gcggccugcc cauggggaaa cccaugggac gcucuuauac agacauggug 540

cgaagagucu auugagcuag uugguagucc uccggccccu gaaugcggcu aaucccaacu 600

gcggagcaua cacucucaag ccagagggua gugugucgua augggcaacu cugcagcgga 660

accgacuacu uugggugucc guguuucauu uuauuccuau acuggcugcu uauggugaca 720

auugagagau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacuaa cagagcuauu 780

auauaucuuu uuguuggguu uauaccacuu agcuugaaag agguuaaaac ucuacauuac 840

auuuuaauac ugaacaccgc aaaauggagg augccaagaa caucaagaag ggcccugccc 900

cuuucuaccc ucuggaggau ggcacagcug gagagcagcu gcacaaagcc augaagaggu 960

augcccuggu gccuggcacc auugccuuca cagaugccca cauugaggug gacaucaccu 1020

augcugagua cuuugagaug ucugugaggc uggcugaggc caugaagagg uauggccuga 1080

acaccaacca uaggauugug gugugcucug agaacagccu gcaguucuuc augccugugc 1140

ugggagcccu guucauugga guggcugugg ccccugccaa ugacaucuac aaugagaggg 1200

agcugcugaa cagcaugggc aucucucagc cuacaguggu cuuugugagu aaaaagggcc 1260

ugcagaagau ccugaaugug cagaagaagc ugccuaucau ucagaagauc aucaucaugg 1320

acagcaagac agacuaccaa ggcuuucaga gcauguacac cuuugugaca agccaccugc 1380

cuccuggcuu caaugaguau gacuuugugc cugagagcuu ugauagggac aagaccauug 1440

cccugaucau gaauagcucu ggcagcacug gccugccuaa gggaguggcc cugccucaua 1500

ggacagccug ugugagguuc agccaugcua gggacccuau cuuuggcaau cagaucaucc 1560

cugacacagc cauccugucu guggugcccu uccaucaugg cuuuggcaug uucaccaccc 1620

ugggcuaccu gaucuguggc uuuagggugg ugcugaugua uagguuugag gaggagcugu 1680

uccugaggag ccugcaagac uacaagauuc agucugcccu gcuggugccu acccuguuca 1740

gcuucuuugc caagagcacc cugauugaca aguaugaccu gagcaaccug caugagauug 1800

ccucuggagg agccccucuc agcaaagagg ugggagaggc uguggccaag agguuccacc 1860

ugccuggcau uaggcaaggc uauggccuga cagagaccac cucugccauc cugaucaccc 1920

cugagggaga ugacaagccu ggagcugugg gcaagguggu accauucuuu gaggccaagg 1980

ugguggaccu ggacacuggc aagacccugg gagugaauca gaggggagag cuguguguga 2040

ggggcccuau gaucaugucu ggcuauguga acaacccuga ggccaccaau gcccucauug 2100

acaaggaugg auggcugcac ucuggagaca uugccuacug ggaugaggau gagcacuucu 2160

ucauugugga uaggcugaag agccugauca aguacaaggg cuaccaagug gccccugcug 2220

agcuugagag cauccugcug cagcacccua acaucuuuga ugcuggagug gcuggcuugc 2280

cugaugauga ugcuggagag cugccugcug cugugguggu gcuggagcau ggcaagacca 2340

ugacagagaa ggagauugug gacuaugugg cuagccaagu gaccacagcc aagaagcuga 2400

ggggaggagu gguguuugug gaugaggugc cuaagggccu gacuggcaag cuggaugcua 2460

ggaagauuag ggagauccug aucaaggcca agaagggagg caagauugcu gugugaaaaa 2520

aacaaaaaac aaaacggcua uuaugcguua ccggcgagac gcuacggacu ua 2572

<210> 3

<211> 2128

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 线性RNA分子序列

<400> 3

gacucacuau uuguuuucgc gcccaguugc aaaaaguguc gccuaggguu ggccaaucua 60

cucccaggag cagggagggc aggagccagg gcugggcaua aaagucaggg cagagccauc 120

uauugcuuac auuugcuucu gacacaacug uguucacuag caaccucaaa cagacaccgg 180

auccgccgcc accauggagg augccaagaa caucaagaag ggcccugccc cuuucuaccc 240

ucuggaggau ggcacagcug gagagcagcu gcacaaagcc augaagaggu augcccuggu 300

gccuggcacc auugccuuca cagaugccca cauugaggug gacaucaccu augcugagua 360

cuuugagaug ucugugaggc uggcugaggc caugaagagg uauggccuga acaccaacca 420

uaggauugug gugugcucug agaacagccu gcaguucuuc augccugugc ugggagcccu 480

guucauugga guggcugugg ccccugccaa ugacaucuac aaugagaggg agcugcugaa 540

cagcaugggc aucucucagc cuacaguggu cuuugugagu aaaaagggcc ugcagaagau 600

ccugaaugug cagaagaagc ugccuaucau ucagaagauc aucaucaugg acagcaagac 660

agacuaccaa ggcuuucaga gcauguacac cuuugugaca agccaccugc cuccuggcuu 720

caaugaguau gacuuugugc cugagagcuu ugauagggac aagaccauug cccugaucau 780

gaauagcucu ggcagcacug gccugccuaa gggaguggcc cugccucaua ggacagccug 840

ugugagguuc agccaugcua gggacccuau cuuuggcaau cagaucaucc cugacacagc 900

cauccugucu guggugcccu uccaucaugg cuuuggcaug uucaccaccc ugggcuaccu 960

gaucuguggc uuuagggugg ugcugaugua uagguuugag gaggagcugu uccugaggag 1020

ccugcaagac uacaagauuc agucugcccu gcuggugccu acccuguuca gcuucuuugc 1080

caagagcacc cugauugaca aguaugaccu gagcaaccug caugagauug ccucuggagg 1140

agccccucuc agcaaagagg ugggagaggc uguggccaag agguuccacc ugccuggcau 1200

uaggcaaggc uauggccuga cagagaccac cucugccauc cugaucaccc cugagggaga 1260

ugacaagccu ggagcugugg gcaagguggu accauucuuu gaggccaagg ugguggaccu 1320

ggacacuggc aagacccugg gagugaauca gaggggagag cuguguguga ggggcccuau 1380

gaucaugucu ggcuauguga acaacccuga ggccaccaau gcccucauug acaaggaugg 1440

auggcugcac ucuggagaca uugccuacug ggaugaggau gagcacuucu ucauugugga 1500

uaggcugaag agccugauca aguacaaggg cuaccaagug gccccugcug agcuugagag 1560

cauccugcug cagcacccua acaucuuuga ugcuggagug gcuggcuugc cugaugauga 1620

ugcuggagag cugccugcug cugugguggu gcuggagcau ggcaagacca ugacagagaa 1680

ggagauugug gacuaugugg cuagccaagu gaccacagcc aagaagcuga ggggaggagu 1740

gguguuugug gaugaggugc cuaagggccu gacuggcaag cuggaugcua ggaagauuag 1800

ggagauccug aucaaggcca agaagggagg caagauugcu gugugaaagc uuagcucgcu 1860

uucuugcugu ccaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug 1920

ggggauauua ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc 1980

auugcgcaua ugacuagcuc gcuuucuugc uguccaauuu cuauuaaagg uuccuuuguu 2040

cccuaagucc aacuacuaaa cugggggaua uuaugaaggg ccuugagcau cuggauucug 2100

ccuaauaaaa aacauuuauu uucauugc 2128

<210> 4

<211> 741

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IRES元件序列

<400> 4

uuaaaacagc cuguggguug aucccaccca caggcccauu gggcgcuagc acucugguau 60

cacgguaccu uugugcgccu guuuuauacc cccuccccca acuguaacuu agaaguaaca 120

cacaccgauc aacagucagc guggcacacc agccacguuu ugaucaagca cuucuguuac 180

cccggacuga guaucaauag acugcucacg cgguugaagg agaaagcguu cguuauccgg 240

ccaacuacuu cgaaaaaccu aguaacaccg uggaaguugc agaguguuuc gcucagcacu 300

accccagugu agaucagguc gaugagucac cgcauucccc acgggcgacc guggcggugg 360

cugcguuggc ggccugccca uggggaaacc caugggacgc ucuaauacag acauggugcg 420

aagagucuau ugagcuaguu gguaguccuc cggccccuga augcggcuaa uccuaacugc 480

ggagcacaca cccucaagcc agagggcagu gugucguaac gggcaacucu gcagcggaac 540

cgacuacuuu ggguguccgu guuucauuuu auuccuauac uggcugcuua uggugacaau 600

ugagagaucg uuaccauaua gcuauuggau uggccauccg gugacuaaua gagcuauuau 660

auaucccuuu guuggguuua uaccacuuag cuugaaagag guuaaaacau uacaauucau 720

uguuaaguug aauacagcaa a 741

<210> 5

<211> 682

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IRES元件序列

<400> 5

uuaaaacagc cuguggguug cacccaccca cagggcccac agggcgcuag cacucuggua 60

ucacgguacc uuugugcgcc uguuuuauua ccccuucccc aauugaaaau uagaagcaau 120

gcacaccgau caacagcagg cguggcgcac cagucacguc ucgaucaagc acuucuguuu 180

ccccggaccg aguaucaaua gacugcucac gcgguugaag gagaaagugu ucguuauccg 240

gcuaaccacu ucgagaaacc caguaacacc augaaaguug caggguguuu cgcucagcac 300

uuccccagug uagaucaggu cgaugaguca ccgcguuccc cacgggcgac cguggcggug 360

gcugcguugg cggccugccu auggguuaac ccauaggacg cucuaauaca gacauggugc 420

gaagaguuua uugagcuggu uaguaucccu ccggccccug aaugcggcua auccuaacug 480

cggagcacgu gccuccaauc caggggguug caugucguaa cggguaacuc ugcagcggaa 540

ccgacuacuu uggguguccg uguuuccuuu uauucuuaua cuggcugcuu auggugacaa 600

ucgaggaauu guuaccauau agcuauugga uuggccaucc ggugucuaac agagcgauua 660

uauaccucuu uguuggauuu au 682

<210> 6

<211> 742

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IRES元件序列

<400> 6

uuaaaacagc cuguggguug aucccaccca cagggcccac ugggcgcuag cacucuggua 60

ucacgguacc uuugugcgcc uguuuuauac uuccuccccc aacugcaacu uagaaguaac 120

acaaaccgau caacagucag cguggcacac cagccacguu uugaucaaac acuucuguua 180

ccccggacug aguaucaaua gacugcucac gcgguugaag gagaaaacgu ucguuauccg 240

gccaacuacu ucgagaaacc uaguaacgcc auggaaguug uggaguguuu cgcucagcac 300

uaccccagug uagaucaggu ugaugaguca ccgcauuccc cacgggugac cguggcggug 360

gcugcguugg cggccugccc auggggaaac ccaugggacg cucuuauaca gacauggugc 420

gaagagucua uugagcuagu ugguaguccu ccggccccug aaugcggcua aucccaacug 480

cggagcauac acucucaagc cagaggguag ugugucguaa ugggcaacuc ugcagcggaa 540

ccgacuacuu uggguguccg uguuucauuu uauuccuaua cuggcugcuu auggugacaa 600

uugagagauu guuaccauau agcuauugga uuggccaucc ggugacuaac agagcuauua 660

uauaucuuuu uguuggguuu auaccacuua gcuugaaaga gguuaaaacu cuacauuaca 720

uuuuaauacu gaacaccgca aa 742

<210> 7

<211> 737

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IRES元件序列

<400> 7

uuaaaacagc cuguggguug aucccaccca cagggcccau ugggcgcuag cacucuggua 60

ucacgguacc cuugugcgcc uguuuuaugu cccuucccuc aacuguaacu uagaaguaac 120

gcacaccgau caacagucag cguggcacac cagccauguu uugaucaagc acuucuguua 180

ccccggaccg aguaucaaca gacugcucac gcgguugaag gagaaagugu ucguuauccg 240

gccaacuacu ucgaaaaacc uaguaacacc auggaaguug cagaguguuu cgcucagcac 300

uaccccagug uagaucaggu cgaugaguca ccgcaucccc cacgggcgac cguggcggug 360

gcugcguugg cggccugccu augggggaac ccauaggacg cucuaauaca gacauggugc 420

gaagagucca uugagcuagu ugguaguccu ccggccccug aaugcggcua auccuaacug 480

cggagcacac accuucaagc cagagggcag ugugucguaa cgggcaacuc ugcagcggaa 540

ccgacuacuu uggguguccg uguuucauuu uauucuuaua cuggcugcuu auggugacaa 600

uugagagauu guuaccauau agcuauugga uuggccaucc agugacuagc agagcuauua 660

uauaccucuu uguuggguuu auaccaccua auuugaaaga aguuaaaaca uuagaauuca 720

uuauuaaauu gaauaca 737

<210> 8

<211> 683

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IRES元件序列

<400> 8

uuaaaacagc cuguggguug cacccaccca cagggcccac agggcgcuag cacucuggua 60

ucacgguacc uuugugcgcc uguuuuauua ccccuucccc aauugaaaau uagaagcaau 120

gcacaccgau caacagcagg cguggcgcac cagucacguc ucgaucaagc acuucuguuu 180

ccccggaccg aguaucaaua gacugcucac gcgguugaag gagaaagugu ucguuauccg 240

gcuaaccacu ucgagaaacc caguaacacc augaaaguug caggguguuu cgcucagcac 300

uuccccagug uagaucaggu cgaugaguca ccgcguuccc cacgggcgac cguggcggug 360

gcugcguugg cggccugccu auggguuaac ccauaggacg cucuaauaca gacauggugc 420

gaagaguuua uugagcuggu uaguaucucc uccggccccu gaaugcggcu aauccuaacu 480

gcggagcaca cacccucaag ccagagggca gugugucgua acgggcaacu cugcagcgga 540

accgacuacu uugggugucc guguuuccuu uuauucuuau acuggcugcu uauggugaca 600

aucgaggaau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugucuaa cagagcgauu 660

auauaccucu uuguuggauu uau 683

<210> 9

<211> 742

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IRES元件序列

<400> 9

uuaaaacagc cuguggguug aucccaccca cagggcccac ugggcgcuag cacucuggua 60

ucacgguacc uuugugcgcc uguuuuauac uuccuccccc aacugcaacu uagaaguaac 120

acaaaccgau caacagucag cguggcacac cagccacguu uugaucaaac acuucuguua 180

ccccggacug aguaucaaua gacugcucac gcgguugaag gagaaaacgu ucguuauccg 240

gccaacuacu ucgagaaacc uaguaacgcc auggaaguug uggaguguuu cgcucagcac 300

uaccccagug uagaucaggu ugaugaguca ccgcauuccc cacgggugac cguggcggug 360

gcugcguugg cggccugccc auggggaaac ccaugggacg cucuuauaca gacauggugc 420

gaagagucua uugagcuagu ugguaguccu ccggccccug aaugcggcua auccuaacug 480

cggagcacac acccucaagc cagagggcag ugugucguaa cgggcaacuc ugcagcggaa 540

ccgacuacuu uggguguccg uguuucauuu uauuccuaua cuggcugcuu auggugacaa 600

uugagagauu guuaccauau agcuauugga uuggccaucc ggugacuaac agagcuauua 660

uauaucuuuu uguuggguuu auaccacuua gcuugaaaga gguuaaaacu cuacauuaca 720

uuuuaauacu gaacaccgca aa 742

<210> 10

<211> 737

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IRES元件序列

<400> 10

uuaaaacagc cuguggguug aucccaccca cagggcccau ugggcgcuag cacucuggua 60

ucacgguacc cuugugcgcc uguuuuaugu cccuucccuc aacuguaacu uagaaguaac 120

gcacaccgau caacagucag cguggcacac cagccauguu uugaucaagc acuucuguua 180

ccccggaccg aguaucaaca gacugcucac gcgguugaag gagaaagugu ucguuauccg 240

gccaacuacu ucgaaaaacc uaguaacacc auggaaguug cagaguguuu cgcucagcac 300

uaccccagug uagaucaggu cgaugaguca ccgcaucccc cacgggcgac cguggcggug 360

gcugcguugg cggccugccu augggggaac ccauaggacg cucuaauaca gacauggugc 420

gaagagucca uugagcuagu ugguaguccu ccggccccug aaugcggcua auccuaacug 480

cggagcacac acccucaagc cagagggcag ugugucguaa cgggcaacuc ugcagcggaa 540

ccgacuacuu uggguguccg uguuucauuu uauucuuaua cuggcugcuu auggugacaa 600

uugagagauu guuaccauau agcuauugga uuggccaucc agugacuagc agagcuauua 660

uauaccucuu uguuggguuu auaccaccua auuugaaaga aguuaaaaca uuagaauuca 720

uuauuaaauu gaauaca 737

<210> 11

<211> 50

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5'间隔区序列

<400> 11

aaaaaacaaa aacaaaaaaa acaaaaaaac aaaaaaaaaa ccaaaacaca 50

<210> 12

<211> 50

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5'间隔区序列

<400> 12

aaaaacaaaa aacaaaaaaa aaaccaaaaa aacaaaaaaa acaaaacaca 50

<210> 13

<211> 25

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'间隔区序列

<400> 13

aaaaaaacaa aaaaacaaaa caaac 25

<210> 14

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'间隔区序列

<400> 14

aaaaacaaaa aacaaaacaa ac 22

<210> 15

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'间隔区序列

<400> 15

aaaaaacaaa aaacaaaac 19

<210> 16

<211> 16

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 第一外显子序列

<400> 16

agacgcuacg gacuua 16

<210> 17

<211> 51

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 第二外显子序列

<400> 17

aaaauccguu gaccuuaaac ggucgugugg guucaagucc cuccaccccc a 51

<210> 18

<211> 114

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5'内含子序列

<400> 18

aataattgag ccttaaagaa gaaattcttt aagtggatgc tctcaaactc agggaaacct 60

aaatctagtt atagacaagg caatcctgag ccaagccgaa gtagtaatta gtaa 114

<210> 19

<211> 131

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'内含子序列

<400> 19

aacaatagat gacttacaac taatcggaag gtgcagagac tcgacgggag ctaccctaac 60

gtcaagacga gggtaaagag agagtccaat tctcaaagcc aataggcagt agcgaaagct 120

gcaagagaat g 131

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5'同源臂序列

<400> 20

accgtcagtt gctcactgtg c 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5'同源臂序列

<400> 21

accgtgctat gtccacgtgt c 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'同源臂序列

<400> 22

gcacagtgag caactgacgg a 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'同源臂序列

<400> 23

gacacgtgga catagcacgg a 21

Claims (14)

1.一种组合物，其中，所述组合物包括编码具有肿瘤预防或治疗活性的目标多肽的RNA分子，和溶解所述RNA分子的水性溶液；其中，以质量体积百分比计，所述水性溶液中包括钠盐0.09％～9％，钾盐0.012％～1.2％，和钙盐0.024％～2.4％。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述RNA分子选自线性RNA分子或环状RNA分子；优选地，所述RNA分子为环状RNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述RNA分子为裸露的RNA分子；优选地，所述RNA分子为裸露的环状RNA分子。

4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其中，所述钠盐为NaCl，所述钾盐为KCl，所述钙盐为CaCl₂；优选地，以质量体积百分比计，所述水性溶液包括：NaCl 0.9％，KCl0.12％，以及CaCl₂ 0.24％；更优选地，所述水性溶液为林格氏液。

5.根据权利要求2或3所述的组合物，其中，所述环状RNA分子包括编码所述目标多肽的编码区，和与所述编码区可操作地连接的翻译起始元件；

可选地，所述翻译起始元件为IRES元件；

优选地，所述IRES元件包含如下(i)-(iv)组成的组中的任一项：

(i)包含如SEQ ID NO：4-7任一序列所组成的组中的一种或多种序列的核苷酸序列；

(ii)包含如SEQ ID NO：4-7任一序列所示的序列的反向互补序列的核苷酸序列；

(iii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；

(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；

优选地，所述IRES元件选自如下(a₁)-(a₇)中的任一项：

(a₁)包含如SEQ ID NO：4所示序列的核苷酸序列；

(a₂)包含如SEQ ID NO：5所示序列的核苷酸序列；

(a₃)包含如SEQ ID NO：6所示序列的核苷酸序列；

(a₄)包含如SEQ ID NO：7所示序列的核苷酸序列；

(a₅)包含如SEQ ID NO：8所示序列的核苷酸序列；

(a₆)包含如SEQ ID NO：9所示序列的核苷酸序列；

(a₇)包含如SEQ ID NO：10所示序列的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子还包括如下的一种或多种元件：5’间隔区、3’间隔区、第二外显子、第一外显子；

可选地，所述环状RNA分子包括位于所述翻译起始元件上游的5’间隔区，和位于所述编码区下游的3’间隔区；

优选地，所述5’间隔区包含如下(b₁)-(b₂)中任一项所示的序列：

(b₁)如SEQ ID NO：11-12任一序列所示的核苷酸序列；

(b₂)与(b₁)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；

优选地，所述3’间隔区包含如下(c₁)-(c₂)中任一项所示的序列：

(c₁)如SEQ ID NO：13-15任一序列所示的核苷酸序列；

(c₂)与(c₁)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。

7.根据权利要求6所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子还包括位于所述5’间隔区上游的第二外显子，和位于所述3’间隔区下游的第一外显子；

优选地，所述第二外显子包含如下(d₁)-(d₂)中任一项所示的序列：

(d₁)如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；

(d₂)与(d₁)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；

优选地，所述第一外显子包含如下(e₁)-(e₂)中任一项所示的序列：

(e₁)如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列；

(e₂)与(e₁)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。

8.根据权利要求1-7任一项所述的组合物，其中，所述组合物通过肿瘤内给药被施用于受试者体内；优选地，所述组合物是肿瘤内给药的注射剂。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述组合物在肿瘤细胞或肿瘤组织内具有提高的目标多肽的表达量。

10.根据权利要求1-9任一项所述的组合物在制备如下(f₁)-(f₃)至少一项中的用途：

(f₁)用于预防或治疗肿瘤的药物；

(f₂)用于预防或治疗肿瘤的注射剂；

(f₃)用于预防或治疗肿瘤的瘤内注射剂。

11.一种包含RNA分子和林格氏液的组合物在制备用于预防或治疗肿瘤的瘤内注射剂中的用途；其中，所述RNA分子编码具有肿瘤治疗活性的目标多肽。

12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述RNA分子选自线性RNA分子或环状RNA分子；优选地，所述RNA分子为环状RNA分子；更优选地，所述环状RNA分子在所述林格氏液中的浓度为0.05μg/μl～50μg/μl。

13.根据权利要求11或12所述的用途，其中，所述RNA分子为裸露的RNA分子，所述林格氏液增强所述裸露的RNA分子在肿瘤细胞或肿瘤组织内的目标多肽的表达量。

14.一种预防或治疗肿瘤的方法，其中，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1-9任一项所述的组合物；

可选地，所述施用方式选自口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，瘤内注射、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或系统性施用；

优选地，所述施用方式为瘤内注射施用。

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