CN116836277B

CN116836277B - 抗雌二醇抗体、检测雌二醇的试剂和试剂盒

Info

Publication number: CN116836277B
Application number: CN202210288765.4A
Authority: CN
Inventors: 孟媛; 钟冬梅; 游辉; 曹慧方
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-03-23
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2042-03-23
Also published as: CN116836277A

Abstract

本发明公开了一种抗雌二醇抗体、检测雌二醇的试剂和试剂盒，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗雌二醇抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区。该抗体为雌二醇的检测提供了重要的原料来源。

Description

抗雌二醇抗体、检测雌二醇的试剂和试剂盒

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗雌二醇抗体、检测雌二醇的试剂和试剂盒。

背景技术

雌二醇(Estradiol，E2)是一种A环为苯环的18碳类固醇激素，分子量272.4Da，为人体雌激素(Estrogen)的主要组成部分。血中70％的E2与性激素结合球蛋白(SHBG)结合，25％的E2与血浆白蛋白结合，其余为游离型。E2主要由卵巢滤泡、黄体及妊娠时胎盘产生，极少量由睾丸合成或为睾酮的代谢物，并成为男性雌激素的主要来源。E2的合成呈周期性变化，能够促进女性生殖器官的形成及发育，第二性征的出现及维持，并与孕激素协同形成月经周期。此外，还具有广泛的代谢调剂作用。

正常妊娠时，E2轻度升高，胎盘娩出后急剧下降。异常妊娠时，E2大都升高，如双胎或多胎妊娠以及糖尿病孕妇；若E2降低，则可能为妊娠高血压综合征重症、胎儿宫内死亡或葡萄胎等情况，宜结合其它检查予以确定。此外，引起E2升高的病理性原因还可能为卵巢癌(如卵巢颗粒层细胞瘤、卵巢胚瘤、卵巢脂肪样细胞瘤等)、心脏病(如心肌梗塞、心绞痛、冠状动脉狭窄)以及其他疾病(系统性红斑狼疮、肝硬化、男性肥胖症等)。引起E2降低的病理性因素较多，如卵巢发育低下、原发性卵巢衰竭、垂体性闭经或不孕、柯兴氏综合征、阿狄森氏病、恶性肿瘤、较大范围的感染、肾功能不全、脑及垂体的局灶性病变等。由此可见，E2对于临床疾病的诊断具有广泛的意义，是重要的评价指标之一。

目前，E2的检测方法主要有化学发光竞争法，其是基于抗体和抗原的特异性反应，同时利用发光物质(如吖啶酯、异鲁米诺等)对被检测信号进行放大和显示的一种免疫学检测方法。类似的免疫学检测方法还有酶联法、免疫比浊法、放射免疫法、荧光免疫层析法等，上述免疫学检测方法都需要针对E2的抗体。因此，本领域对于有效结合E2并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对现有抗雌二醇抗体来源少的问题，本申请提供一种亲和力和/或活性改善的抗雌二醇抗体，以改善雌二醇的检测，为雌二醇的检测提供重要的原料来源。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗雌二醇抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3和SEQ IDNO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或

b)氨基酸序列如SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:38所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3和SEQID NO:39至SEQ ID NO:41所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种抗雌二醇的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为上述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列。

为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种抗雌二醇的抗体，包括重链和/或轻链，所述重链包括上述的重链可变区和上述的重链恒定区；所述轻链包括上述的轻链可变区和上述的轻链恒定区。

为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其功能性片段。

为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种检测雌二醇的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种载体、一种细胞及一种制备上述抗体或其功能性片段的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为Anti-E2 7A4mut1至Anti-E2 7A4mut4的还原性SDS-PAGE的结果。

图2为Anti-E2 3C50mut1至Anti-E2 3C50mut3的还原性SDS-PAGE的结果。

具体实施方式

本发明提供了一种亲和力和/或活性改善的抗雌二醇抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。

在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。

在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。

在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。

在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段还包括如下框架区：

c)氨基酸序列如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:10所示的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4和SEQID NO:11至SEQ ID NO:14所示的LFR1、LFR2、LFR3、LFR4；或

d)氨基酸序列如SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:45所示的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4和SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:49所示的LFR1、LFR2、LFR3、LFR4；或

e)与c)或d)所示氨基酸序列具有至少80％同源性的框架区；

需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各框架区氨基酸序列可以与上述对应框架区具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

在可选的实施方式中，所述e)框架区中的HFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

在可选的实施方式中，所述e)框架区中的LFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

在可选的实施方式中，所述e)框架区中的LFR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。

在可选的实施方式中，所述e)框架区中的HFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。

在可选的实施方式中，所述e)框架区中的LFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段以K_D≤10^-7M、K_D≤10^-8M、K_D≤10^- ⁹M、K_D≤10^-10M或K_D≤10^-11M的亲和力结合雌二醇。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段以K_D≤6.20×10^-8M、K_D≤5.31×10^-8M、K_D≤9.84×10^-9M、K_D≤2.90×10^-10M的亲和力结合雌二醇。

K_D的检测参考本发明实施例中的方法进行。

另一方面，本发明实施例提供一种抗雌二醇的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为上述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列为上述的HFR 1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR 1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列。

在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:23任一所示或如SEQ ID NO:54至SEQ ID NO:56任一所示。

在可选的实施方式中，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:24至SEQ ID NO:27任一所示或如SEQ ID NO:57至SEQ ID NO:59任一所示。

在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，且所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。

在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，且所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。

在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，且所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。

在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，且所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示。

在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示，且所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示。

在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示，且所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示。

在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示，且所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示。

在可选的实施方式中，所述抗体还包含恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、骆驼、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为羊。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:52所示或与其具有至少80％同源性，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:53所示或与其具有至少80％同源性。

需要说明的是，在其他的实施例中，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ IDNO:18、52、19、53)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。

上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

另一方面，本发明提供一种抗雌二醇的抗体，包括重链和/或轻链，所述重链包括上述的重链可变区和上述的重链恒定区；所述轻链包括上述的轻链可变区和上述的轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:28至SEQ ID NO:31任一所示或如SEQ ID NO:60至SEQ ID NO:62任一所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:35任一所示或如SEQ ID NO:63至SEQ ID NO:65任一所示。

在可选的实施方式中，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，且所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。

在可选的实施方式中，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，且所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。

在可选的实施方式中，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，且所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。

在可选的实施方式中，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，且所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示。

在可选的实施方式中，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示，且所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示。

在可选的实施方式中，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示，且所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示。

在可选的实施方式中，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示，且所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示。

另一方面，本发明提供一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其功能性片段。

在可选的实施方式中，上述抗体偶联物中所述抗体或其功能性片段标记有标记物。

在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。

在可选的实施方式中，所述标记物包括但不限于荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

在可选的实施方式中，上述抗体偶联物中所述抗体或其功能性片段包被至固相。

在可选的实施方式中，所述固相选自微球、板和膜。

在可选的实施方式中，所述固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。

在可选的实施方式中，所述固相为磁性微球。

另一方面，本发明提供一种检测雌二醇的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物。

另一方面，本发明提供上述试剂或试剂盒在雌二醇检测中的用途。

另一方面，本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。

另一方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。

另一方面，本发明提供含有上述载体的细胞。

另一方面，本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如上所述的细胞。

在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1 Anti-E2 7A4单克隆抗体的制备

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。

1重组质粒的构建

(1)抗体基因制备

从分泌Anti-E2 7A4单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆，各4个克隆送基因测序公司进行测序。

(2)Anti-E2 7A4抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在Kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为330bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为366bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

(3)重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM 3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.72kb的Light Chain基因片段和1.43kb的Heavy Chain基因片段。

Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

2稳定细胞株筛选

(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至40ug/100ul，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液(主要成分NaHCO3)稀释E2-Albumin偶联物(购自益缪诺，货号E202)至3ug/ml，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入鼠抗羊IgG-HRP，每孔100μL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μL/孔，含柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)，加入显色液B液(50μL/孔，含柠檬酸+EDTA·2Na+TMB+浓HCL)，10min；加入终止液(50μL/孔，含EDTA·2Na+浓H₂SO₄)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对E2-Albumin偶联物有活性。

(2)重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50μL、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μL、无菌水补至500μL，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至40ug/100ul，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测雌二醇，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

3重组抗体生产

(1)细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

(2)摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用protein A亲和层析柱进行亲和纯化。取6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳，在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。

实施例2Anti-E2 3C50单克隆抗体的制备同上述实施例1。

实施例3亲和力及活性优化

实施例1和2得到的两株野生型单克隆抗体(Anti-E2 7A4及Anti-E2 3C50)虽然具备结合E2-Albumin偶联物的能力，但亲和力和抗体活性均不够理想，因而申请人通过对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行定向突变。即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计，根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应，将PCR产物克隆至载体，再按照实施例1所述的方法进行突变抗体的制备。经筛选，得到亲和力和抗体活性较各自野生型均显著提升的单克隆抗体，并命名为：Anti-E2 7A4mut1至Anti-E2 7A4mut4及Anti-E2 3C50mut1至Anti-E2 3C50mut3。所述各突变体的重链和轻链氨基酸序列分别如下表所示。

表1抗体序列

样品名称	重链序号	轻链序号
			Anti-E2 7A4mut1	SEQ ID NO:28	SEQ ID NO:32
Anti-E2 7A4mut2	SEQ ID NO:29	SEQ ID NO:33
			Anti-E2 7A4mut3	SEQ ID NO:30	SEQ ID NO:34
Anti-E2 7A4mut4	SEQ ID NO:31	SEQ ID NO:35
			Anti-E2 3C50mut1	SEQ ID NO:60	SEQ ID NO:63
Anti-E2 3C50mut2	SEQ ID NO:61	SEQ ID NO:64
			Anti-E2 3C50mut3	SEQ ID NO:62	SEQ ID NO:65

实施例4抗体的性能检测

1亲和力分析

利用AMC传感器，纯化出来的抗体用PBST稀释至一定浓度(Anti-E2 7A4及其突变体、对照1测试浓度为5ug/ml，Anti-E2 3C50及其突变体、对照2测试浓度为10ug/ml)，E2-Albumin偶联物(购自益缪诺，货号E202)用PBST进行梯度稀释：

运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mM pH 1.69Gly溶液及缓冲液3(PBST)进行传感器再生，输出数据。(KD表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。PBST主要成分Na2HPO4+NaCl+TW-20)。

表2亲和力数据

样品名称	KD(M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
				对照1	6.20E-08	5.14E+03	3.19E-05
Anti-E2 7A4mut1	9.84E-09	2.24E+04	2.20E-04
				Anti-E2 7A4mut2	1.88E-10	1.70E+06	3.20E-04
Anti-E2 7A4mut3	2.34E-10	1.63E+06	3.80E-04
				Anti-E2 7A4mut4	2.14E-10	2.06E+06	4.40E-04
对照2	5.31E-08	5.72E+03	3.04E-05
				Anti-E2 3C50mut1	2.66E-10	7.22E+05	1.92E-04
Anti-E2 3C50mut2	2.57E-10	7.40E+05	1.90E-04
				Anti-E2 3C50mut3	2.90E-10	7.25E+05	2.10E-04

2活性检测

包被液(主要成分NaHCO3)稀释E2-Albumin偶联物(购自益缪诺，货号E202)至一定浓度(Anti-E2 7A4及其突变体、对照1测试浓度为3ug/ml，Anti-E2 3C50及其突变体、对照2测试浓度为1ug/ml)，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的上述单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min-60min；洗涤液清洗5次，拍干；加入鼠抗羊IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液(PBS)清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔，含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L柠檬酸、0.07g/L乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲)，加入显色液B液(50μl/孔，含1.05g/L柠檬酸、0.186g/LEDTA·2Na、0.45g/L TMB和0.2ml/L浓HCl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/EDTA·2Na和10.2ml/L浓H₂SO₄)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果见下表。通过同样的方法，包被液稀释Albumin，验证上述单克隆抗体与Albumin的反应OD值低于0.05，与Albumin无交叉反应性。

表3活性数据

浓度(ng/ml)	125	62.5	31.3	15.63	7.81	0.00
							对照1	1.845	1.342	0.765	0.310	0.197	0.028
Anti-E2 7A4mut1	2.056	1.524	0.940	0.366	0.220	0.010
							Anti-E2 7A4mut2	2.245	1.940	1.687	0.953	0.497	0.065
Anti-E2 7A4mut3	2.270	2.158	1.605	0.979	0.508	0.023
							Anti-E2 7A4mut4	2.262	2.117	1.308	0.806	0.461	0.047
对照2	1.623	1.125	0.545	0.282	0.151	0.018
							Anti-E2 3C50mut1	2.138	2.082	1.594	0.809	0.395	0.012
Anti-E2 3C50mut2	2.238	2.182	1.632	0.826	0.424	0.012
							Anti-E2 3C50mut3	2.201	2.013	1.483	0.802	0.418	0.001

3稳定性考核

将上述突变抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述突变抗体稳定。下表为考核21天的酶免活性检测OD结果。

表4稳定性数据

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本申请涉及的部分氨基酸序列如下所示：

序列编号	序列片段
		SEQ ID NO:1	GNAIT
SEQ ID NO:2	GVDNRGSAYYSPALRS
		SEQ ID NO:3	GVWGVDGAGYAH
SEQ ID NO:4	SGSSSNVGSHSVD
		SEQ ID NO:5	GTRNRPS
SEQ ID NO:6	ATSDSTTMT
		SEQ ID NO:36	NNAVT
SEQ ID NO:37	GMDSSGRSYLNLALRS
		SEQ ID NO:38	GVWDGQYKNYAH
SEQ ID NO:39	SGSSSNIGRHGVE
		SEQ ID NO:40	AMSIRPS
SEQ ID NO:41	ASSDDENYS

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 抗雌二醇抗体、检测雌二醇的试剂和试剂盒

<130> P2022035CN01

<160> 65

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Gly Asn Ala Ile Thr

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Gly Val Asp Asn Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ala Leu Arg Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

Gly Val Trp Gly Val Asp Gly Ala Gly Tyr Ala His

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser His Ser Val Asp

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

Gly Thr Arg Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

Ala Thr Ser Asp Ser Thr Thr Met Thr

1 5

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Ser

20 25 30

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Val Pro Glu Trp Leu Gly

1 5 10

<210> 9

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Ser

1 5 10 15

Leu Tyr Gly Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg

20 25 30

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

Asp Tyr Trp Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Thr

1 5 10

<210> 11

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

Gln Ala Val Val Thr Gln Leu Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys

20

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

Trp Phe Gln Lys Leu Ser Glu Ser Gly Leu Arg Ile Val Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 13

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 14

Tyr Ile Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Thr Ala Leu

1 5 10

<210> 15

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 15

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Ile Ser

20 25 30

<210> 16

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 16

Gln Ala Val Val Thr Gln Leu Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Thr Cys

20

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 17

Trp Phe Gln Lys Leu Ser Glu Ser Gly Leu Arg Ile Val Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 18

<211> 327

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 18

Ala Ser Thr Thr Pro Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr

65 70 75 80

Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Gly Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Lys Cys Ser Lys Pro Pro Cys

100 105 110

Val Ser Arg Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ser

115 120 125

Leu Met Ile Thr Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

130 135 140

Gly Gln Gly Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val

145 150 155 160

Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

165 170 175

Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Asp His Trp Thr

180 185 190

Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Ser Lys Gly Leu Pro Ala

195 200 205

Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Ala Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro

210 215 220

Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr

225 230 235 240

Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala

245 250 255

Val Glu Trp Gln Arg Ala Arg Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly

260 265 270

Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Arg Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Tyr Ala

290 295 300

Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys

325

<210> 19

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 19

Gly Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr

1 5 10 15

Glu Glu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr

35 40 45

Ile Asn Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys

65 70 75 80

Ser Lys Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Thr Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

100 105

<210> 20

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 20

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Asn

20 25 30

Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Val Asp Asn Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Tyr Gly Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Trp Gly Val Asp Gly Ala Gly Tyr Ala His Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Thr

115 120

<210> 21

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 21

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Ile Ser Gly Asn

20 25 30

Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Val Asp Asn Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Tyr Gly Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Trp Gly Val Asp Gly Ala Gly Tyr Ala His Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Thr

115 120

<210> 22

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 22

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Asn

20 25 30

Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Val Asp Asn Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Tyr Gly Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Trp Gly Val Asp Gly Ala Gly Tyr Ala His Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Thr

115 120

<210> 23

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 23

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Asn

20 25 30

Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Val Asp Asn Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Tyr Gly Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Trp Gly Val Asp Gly Ala Gly Tyr Ala His Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Thr

115 120

<210> 24

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 24

Gln Ala Val Val Thr Gln Leu Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser His

20 25 30

Ser Val Asp Trp Phe Gln Lys Leu Ser Glu Ser Gly Leu Arg Ile Val

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln

65 70 75 80

Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Ser Thr Thr

85 90 95

Met Thr Tyr Ile Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Thr Ala Leu

100 105 110

<210> 25

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 25

Gln Ala Val Val Thr Gln Leu Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser His

20 25 30

Ser Val Asp Trp Phe Gln Lys Leu Ser Glu Ser Gly Leu Arg Ile Val

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln

65 70 75 80

Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Ser Thr Thr

85 90 95

Met Thr Tyr Ile Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Thr Ala Leu

100 105 110

<210> 26

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 26

Gln Ala Val Val Thr Gln Leu Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser His

20 25 30

Ser Val Asp Trp Phe Gln Lys Leu Ser Glu Ser Gly Leu Arg Ile Val

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln

65 70 75 80

Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Ser Thr Thr

85 90 95

Met Thr Tyr Ile Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Thr Ala Leu

100 105 110

<210> 27

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 27

Gln Ala Val Val Thr Gln Leu Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser His

20 25 30

Ser Val Asp Trp Phe Gln Lys Leu Ser Glu Ser Gly Leu Arg Ile Val

35 40 45

Leu Tyr Gly Thr Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln

65 70 75 80

Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Ser Thr Thr

85 90 95

Met Thr Tyr Ile Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Thr Ala Leu

100 105 110

<210> 28

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 28

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Asn

20 25 30

Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Val Asp Asn Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Tyr Gly Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Trp Gly Val Asp Gly Ala Gly Tyr Ala His Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Ser Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly Asp Thr Ser Ser Ser Ile

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr Phe Ile Cys Asn Val Ala

195 200 205

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Asp Tyr Ser Lys Cys Ser Lys Pro Pro Cys Val Ser Arg Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ser Leu Met Ile Thr Gly Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Gly Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

290 295 300

Ala Leu Pro Ile Gln His Asp His Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val His Ser Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile

325 330 335

Ser Arg Ala Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala

340 345 350

Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu

355 360 365

Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Ala

370 375 380

Arg Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu

385 390 395 400

Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys

405 410 415

Ser Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 29

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 29

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Ile Ser Gly Asn

20 25 30

Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Val Asp Asn Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Tyr Gly Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Trp Gly Val Asp Gly Ala Gly Tyr Ala His Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Ser Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly Asp Thr Ser Ser Ser Ile

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr Phe Ile Cys Asn Val Ala

195 200 205

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Asp Tyr Ser Lys Cys Ser Lys Pro Pro Cys Val Ser Arg Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ser Leu Met Ile Thr Gly Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Gly Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

290 295 300

Ala Leu Pro Ile Gln His Asp His Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val His Ser Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile

325 330 335

Ser Arg Ala Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala

340 345 350

Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu

355 360 365

Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Ala

370 375 380

Arg Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu

385 390 395 400

Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys

405 410 415

Ser Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 30

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 30

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Asn

20 25 30

Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Val Asp Asn Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Tyr Gly Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Trp Gly Val Asp Gly Ala Gly Tyr Ala His Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Ser Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly Asp Thr Ser Ser Ser Ile

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr Phe Ile Cys Asn Val Ala

195 200 205

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Asp Tyr Ser Lys Cys Ser Lys Pro Pro Cys Val Ser Arg Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ser Leu Met Ile Thr Gly Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Gly Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

290 295 300

Ala Leu Pro Ile Gln His Asp His Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val His Ser Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile

325 330 335

Ser Arg Ala Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala

340 345 350

Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu

355 360 365

Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Ala

370 375 380

Arg Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu

385 390 395 400

Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys

405 410 415

Ser Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 31

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 31

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Asn

20 25 30

Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Val Asp Asn Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Ser Pro Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Tyr Gly Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Arg Gly Val Trp Gly Val Asp Gly Ala Gly Tyr Ala His Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Ser Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly Asp Thr Ser Ser Ser Ile

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr Phe Ile Cys Asn Val Ala

195 200 205

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Asp Tyr Ser Lys Cys Ser Lys Pro Pro Cys Val Ser Arg Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ser Leu Met Ile Thr Gly Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Gly Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

290 295 300

Ala Leu Pro Ile Gln His Asp His Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val His Ser Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile

325 330 335

Ser Arg Ala Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala

340 345 350

Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu

355 360 365

Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Ala

370 375 380

Arg Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu

385 390 395 400

Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys

405 410 415

Ser Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 32

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 32

Gln Ala Val Val Thr Gln Leu Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser His

20 25 30

Ser Val Asp Trp Phe Gln Lys Leu Ser Glu Ser Gly Leu Arg Ile Val

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln

65 70 75 80

Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Ser Thr Thr

85 90 95

Met Thr Tyr Ile Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Thr Ala Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu Glu

115 120 125

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn

145 150 155 160

Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys

180 185 190

Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys

195 200 205

Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

210 215

<210> 33

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 33

Gln Ala Val Val Thr Gln Leu Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser His

20 25 30

Ser Val Asp Trp Phe Gln Lys Leu Ser Glu Ser Gly Leu Arg Ile Val

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln

65 70 75 80

Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Ser Thr Thr

85 90 95

Met Thr Tyr Ile Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Thr Ala Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu Glu

115 120 125

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn

145 150 155 160

Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys

180 185 190

Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys

195 200 205

Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

210 215

<210> 34

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 34

Gln Ala Val Val Thr Gln Leu Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser His

20 25 30

Ser Val Asp Trp Phe Gln Lys Leu Ser Glu Ser Gly Leu Arg Ile Val

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln

65 70 75 80

Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Ser Thr Thr

85 90 95

Met Thr Tyr Ile Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Thr Ala Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu Glu

115 120 125

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn

145 150 155 160

Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys

180 185 190

Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys

195 200 205

Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

210 215

<210> 35

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 35

Gln Ala Val Val Thr Gln Leu Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser His

20 25 30

Ser Val Asp Trp Phe Gln Lys Leu Ser Glu Ser Gly Leu Arg Ile Val

35 40 45

Leu Tyr Gly Thr Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln

65 70 75 80

Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Ser Thr Thr

85 90 95

Met Thr Tyr Ile Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Thr Ala Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu Glu

115 120 125

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn

145 150 155 160

Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys

180 185 190

Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys

195 200 205

Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

210 215

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 36

Asn Asn Ala Val Thr

1 5

<210> 37

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 37

Gly Met Asp Ser Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Ala Leu Arg Ser

1 5 10 15

<210> 38

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 38

Gly Val Trp Asp Gly Gln Tyr Lys Asn Tyr Ala His

1 5 10

<210> 39

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 39

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg His Gly Val Glu

1 5 10

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 40

Ala Met Ser Ile Arg Pro Ser

1 5

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 41

Ala Ser Ser Asp Asp Glu Asn Tyr Ser

1 5

<210> 42

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 42

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile

20 25 30

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 43

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Val Pro Glu Trp Leu Gly

1 5 10

<210> 44

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 44

Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Asn Ser Val Ser Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 45

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 45

Asp Phe Leu Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 46

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 46

Gln Ser Met Leu Thr Gln Arg Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys

20

<210> 47

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 47

Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Leu Gly Leu Arg Ile Ile Met Ser

1 5 10 15

<210> 48

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 48

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 49

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 49

Tyr Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 50

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列

<400> 50

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Leu

20 25 30

<210> 51

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 51

Gln Ser Met Leu Thr Gln Arg Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Thr Cys

20

<210> 52

<211> 331

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 52

Ala Ser Thr Thr Pro Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr

65 70 75 80

Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro

100 105 110

Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe

145 150 155 160

Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His

180 185 190

Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu

195 200 205

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln

210 215 220

Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu

225 230 235 240

Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu

260 265 270

Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr

275 280 285

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly

290 295 300

Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

305 310 315 320

Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys

325 330

<210> 53

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 53

Gly Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr

1 5 10 15

Glu Glu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr

35 40 45

Ile Asn Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys

65 70 75 80

Ser Lys Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Thr Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

100 105

<210> 54

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 54

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asn Asn

20 25 30

Ala Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Met Asp Ser Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Ser Leu Asn Ser Val Ser Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Val Trp Asp Gly Gln Tyr Lys Asn Tyr Ala His Asp Phe Leu

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 55

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 55

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Leu Asn Asn

20 25 30

Ala Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Met Asp Ser Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Ser Leu Asn Ser Val Ser Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Val Trp Asp Gly Gln Tyr Lys Asn Tyr Ala His Asp Phe Leu

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 56

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 56

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asn Asn

20 25 30

Ala Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Met Asp Ser Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Ser Leu Asn Ser Val Ser Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Val Trp Asp Gly Gln Tyr Lys Asn Tyr Ala His Asp Phe Leu

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 57

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 57

Gln Ser Met Leu Thr Gln Arg Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg His

20 25 30

Gly Val Glu Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Leu Gly Leu Arg Ile Ile

35 40 45

Met Ser Ala Met Ser Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Asp Asp Glu Asn

85 90 95

Tyr Ser Tyr Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 58

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 58

Gln Ser Met Leu Thr Gln Arg Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg His

20 25 30

Gly Val Glu Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Leu Gly Leu Arg Ile Ile

35 40 45

Met Ser Ala Met Ser Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Asp Asp Glu Asn

85 90 95

Tyr Ser Tyr Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 59

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 59

Gln Ser Met Leu Thr Gln Arg Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg His

20 25 30

Gly Val Glu Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Leu Gly Leu Arg Ile Ile

35 40 45

Met Ser Ala Met Ser Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Asp Asp Glu Asn

85 90 95

Tyr Ser Tyr Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 60

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 60

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asn Asn

20 25 30

Ala Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Met Asp Ser Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Ser Leu Asn Ser Val Ser Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Val Trp Asp Gly Gln Tyr Lys Asn Tyr Ala His Asp Phe Leu

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly Asp Thr Ser Ser Ser Ile

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr Phe Ile Cys Asn Val Ala

195 200 205

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Gly Cys

210 215 220

Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr

245 250 255

Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln

260 265 270

Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val

275 280 285

Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

290 295 300

Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly

305 310 315 320

Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser

355 360 365

Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr

385 390 395 400

Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

405 410 415

Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser

435 440 445

Lys Pro Pro Gly Lys

450

<210> 61

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 61

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Leu Asn Asn

20 25 30

Ala Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Met Asp Ser Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Ser Leu Asn Ser Val Ser Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Val Trp Asp Gly Gln Tyr Lys Asn Tyr Ala His Asp Phe Leu

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly Asp Thr Ser Ser Ser Ile

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr Phe Ile Cys Asn Val Ala

195 200 205

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Gly Cys

210 215 220

Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr

245 250 255

Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln

260 265 270

Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val

275 280 285

Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

290 295 300

Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly

305 310 315 320

Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser

355 360 365

Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr

385 390 395 400

Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

405 410 415

Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser

435 440 445

Lys Pro Pro Gly Lys

450

<210> 62

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 62

Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asn Asn

20 25 30

Ala Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Val Pro Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Gly Met Asp Ser Ser Gly Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Ala Leu Arg

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Ser Leu Asn Ser Val Ser Ser Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Val Trp Asp Gly Gln Tyr Lys Asn Tyr Ala His Asp Phe Leu

100 105 110

Gly Pro Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly Asp Thr Ser Ser Ser Ile

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr Phe Ile Cys Asn Val Ala

195 200 205

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Gly Cys

210 215 220

Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr

245 250 255

Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln

260 265 270

Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val

275 280 285

Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

290 295 300

Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly

305 310 315 320

Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser

355 360 365

Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr

385 390 395 400

Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

405 410 415

Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser

435 440 445

Lys Pro Pro Gly Lys

450

<210> 63

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 63

Gln Ser Met Leu Thr Gln Arg Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg His

20 25 30

Gly Val Glu Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Leu Gly Leu Arg Ile Ile

35 40 45

Met Ser Ala Met Ser Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Asp Asp Glu Asn

85 90 95

Tyr Ser Tyr Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu Glu

115 120 125

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn

145 150 155 160

Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys

180 185 190

Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys

195 200 205

Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

210 215

<210> 64

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 64

Gln Ser Met Leu Thr Gln Arg Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg His

20 25 30

Gly Val Glu Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Leu Gly Leu Arg Ile Ile

35 40 45

Met Ser Ala Met Ser Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Asp Asp Glu Asn

85 90 95

Tyr Ser Tyr Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu Glu

115 120 125

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn

145 150 155 160

Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys

180 185 190

Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys

195 200 205

Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

210 215

<210> 65

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 65

Gln Ser Met Leu Thr Gln Arg Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Arg His

20 25 30

Gly Val Glu Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Leu Gly Leu Arg Ile Ile

35 40 45

Met Ser Ala Met Ser Ile Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser Asp Asp Glu Asn

85 90 95

Tyr Ser Tyr Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu Glu

115 120 125

Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn

145 150 155 160

Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys

180 185 190

Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys

195 200 205

Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

210 215

Claims

1.一种抗雌二醇的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3和SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或

b)氨基酸序列如SEQ ID NO:36至SEQ ID NO:38所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3和SEQIDNO:39至SEQ ID NO:41所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还包括如下框架区：

c)氨基酸序列如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:10所示的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4和SEQIDNO:11至SEQ ID NO:14所示的LFR1、LFR2、LFR3、LFR4；

d)氨基酸序列如SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:45所示的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4和SEQIDNO:46至SEQ ID NO:49所示的LFR1、LFR2、LFR3、LFR4；或

e)与c)或d)所示氨基酸序列具有至少80％同源性的框架区。

3.根据权利要求2所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述e)框架区中的HFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或50所示。

4.根据权利要求2所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述e)框架区中的LFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16或51所示。

5.根据权利要求2所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述e)框架区中的LFR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。

6.根据权利要求2所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段以KD≤10^-8M的亲和力结合雌二醇。

7.一种抗雌二醇的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为权利要求1中所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列为权利要求2～6任一项中所述的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列。

8.一种抗雌二醇的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区选自如下任一组合：

组合重链可变区轻链可变区 1 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:24 2 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:25 3 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:26 4 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:27 5 SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:57 6 SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:58 7 SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:59

。

9.根据权利要求1至8任一项所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区。

10.根据权利要求9所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区。

11.根据权利要求10所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。

12.根据权利要求10所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

13.根据权利要求10所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为羊。

14.根据权利要求10所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:52所示或与其具有至少80％同源性，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:53所示或与其具有至少80％同源性。

15.根据权利要求1至8任一所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

16.一种抗雌二醇的抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链包括权利要求7～8任一项中所述的重链可变区和权利要求10～14任一项中所述的重链恒定区；所述轻链包括权利要求7～8任一项中所述的轻链可变区和权利要求10～14任一项中所述的轻链恒定区。

17.一种抗雌二醇的抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链和轻链选自如下任一组合：

组合重链轻链 1 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:32 2 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:33 3 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:34 4 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:35 5 SEQ ID NO:60 SEQ ID NO:63 6 SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:64 7 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:65

。

18.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包括权利要求1-17任一项所述的抗体或其功能性片段。

19.根据权利要求18所述的抗体偶联物，其特征在于，所述抗体或其功能性片段标记有标记物。

20.根据权利要求19所述的抗体偶联物，其特征在于，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

21.根据权利要求20所述的抗体偶联物，其特征在于，所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物。

22.根据权利要求20所述的抗体偶联物，其特征在于，所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

23.根据权利要求20所述的抗体偶联物，其特征在于，所述放射性同位素选自²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

24.根据权利要求20所述的抗体偶联物，其特征在于，所述化学发光试剂选自鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

25.根据权利要求20所述的抗体偶联物，其特征在于，所述纳米颗粒类标记物选自纳米颗粒和胶体。

26.根据权利要求25所述的抗体偶联物，其特征在于，所述纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

27.根据权利要求25所述的抗体偶联物，其特征在于，所述胶体选自乳胶、胶体硒、胶体金属、分散型染料和染料标记的微球。

28.根据权利要求27所述的抗体偶联物，其特征在于，所述胶体金属选自胶体金和胶体银。

29.根据权利要求18所述的抗体偶联物，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包被至固相。

30.根据权利要求29所述的抗体偶联物，其特征在于，所述固相选自微球、板和膜。

31.根据权利要求30所述的抗体偶联物，其特征在于，所述固相选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。

32.一种检测雌二醇的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1-17任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求18～31任一项所述的抗体偶联物。

33.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求1-17任一项所述的抗体或其功能性片段。

34.一种载体，其特征在于，其含有编码权利要求1-17任一项所述的抗体或其功能性片段的核酸片段。

35.一种细胞，其特征在于，其含有权利要求33所述的核酸或权利要求34所述的载体。

36.一种制备权利要求1-17任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求35所述的细胞。