CN116693676B

CN116693676B - 抗肺炎支原体的抗体、检测肺炎支原体的试剂和试剂盒

Info

Publication number: CN116693676B
Application number: CN202210190273.1A
Authority: CN
Inventors: 孟媛; 钟冬梅; 唐丽娜; 曹慧方
Original assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Dongguan Pengzhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2022-02-28
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2042-02-28
Also published as: CN116693676A

Abstract

本发明公开了一种抗肺炎支原体的抗体、检测肺炎支原体的试剂和试剂盒，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗肺炎支原体的抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区。该抗体为肺炎支原体的检测提供了重要的原料来源。

Description

抗肺炎支原体的抗体、检测肺炎支原体的试剂和试剂盒

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗肺炎支原体的抗体、检测肺炎支原体的试剂和试剂盒。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是一种结构简单、无细胞壁，呈高度多形性的常见病原体，是人类支原体肺炎的病原体，通过呼吸道传播，儿童感染率较高。支原体肺炎又称原发性非典型肺炎、冷凝集阳性肺炎，为“非典型肺炎”中的一种，呈间质性肺炎及毛细支气管炎样改变，占儿童社区获得性肺炎的10％～40％，肺部病变呈融合性支气管肺炎、间质性肺炎，伴支气管炎。肺泡有少量炎症渗出物，并可发生灶性肺不张、肺实变和肺气肿。临床表现为顽固性剧烈咳嗽的肺部炎症。在发病初期常常被误诊，导致病情加重，甚至发展成致死性肺炎。在感染早期，若能准确地检测出肺炎支原体并将之清除，将会大大降低支原体肺炎的爆发率。肺炎支原体感染除引起肺炎外，还可引起肺外感染，如支气管炎、气管炎、咽炎、扁桃体炎等，还可诱发哮喘。因此，肺炎支原体的检测就显得尤为重要。

目前，肺炎支原体的检测方法主要有分离培养法、核酸检测、胶体金免疫层析法，其中胶体金免疫层析法是一种基于抗体和抗原的特异性反应，同时利用胶体金对被检测信号进行放大和显示的一种免疫学检测方法。类似的免疫学检测方法还有放射免疫法、酶联免疫分析法、化学发光法等。上述免疫学检测方法都需要针对于肺炎支原体的抗体。现在市场上针对肺炎支原体的抗体来源少，本领域对于有效且结合肺炎支原体并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对现在市场上抗肺炎支原体抗体来源少，本申请提供一种活性改善的抗肺炎支原体抗体，为肺炎支原体的准确检测提供重要的原料来源。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种抗肺炎支原体的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为上述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列。

为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种抗肺炎支原体的抗体，包括重链和/或轻链，所述重链包括上述的重链可变区，所述轻链包括上述的轻链可变区。

为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其功能性片段。

为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种检测肺炎支原体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物。

为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了上述的抗体或其功能性片段、上述的抗体偶联物或上述的试剂或试剂盒在肺炎支原体检测中的用途。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种载体、一种细胞及一种制备上述抗体或其功能性片段的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为Anti-MP-22A9mut1至Anti-MP-22A9mut6的还原性SDS-PAGE的结果。

具体实施方式

本发明提供了一种抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。上述抗体具有改善的亲和力和活性。

在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。

在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。

在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括：Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号系统。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建，Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。

在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。

在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段还包括氨基酸序列如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:10所示的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4和氨基酸序列如SEQ ID NO:11至SEQ IDNO:14所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，或与所述各序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。

需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区(SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13或14)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的HFR3如SEQ ID NO:21、24或27所示。

在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的LFR3如SEQ ID NO:30或33所示。

另一方面，本发明实施例提供一种抗肺炎支原体的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为上述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列为上述的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列。

在可选的实施方式中，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15、22、25或28所示；

在可选的实施方式中，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16、31或34所示。

在可选的实施方式中，所述抗体还包含恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为小鼠。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列(CH)如SEQ ID NO:17所示，所述轻链恒定区(CL)序列如SEQ ID NO:18所示。

需要说明的是，在其他的实施例中，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ IDNO:17或18)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。

上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

另一方面，本发明提供一种抗肺炎支原体的抗体，包括重链和/或轻链，所述重链包括上述的重链可变区和上述的重链恒定区；所述轻链包括上述的轻链可变区和上述的轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:19、23、26或29所示。

在可选的实施方式中，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20、32或35所示。

另一方面，本发明提供一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其功能性片段。

在可选的实施方式中，上述抗体偶联物中所述抗体或其功能性片段标记有标记物。

在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。

在可选的实施方式中，所述标记物包括但不限于荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

在可选的实施方式中，上述抗体偶联物中所述抗体或其功能性片段包被至固相。

在可选的实施方式中，所述固相选自微球、板和膜。

在可选的实施方式中，所述固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。

在可选的实施方式中，所述固相为硝酸纤维素膜。

另一方面，本发明提供一种检测肺炎支原体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物。含有上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物的试剂或试剂盒具有改善的检测灵敏度、特异性和准确性。

另一方面，本发明提供上述抗体或其功能性片段、抗体偶联物或上述的试剂或试剂盒在肺炎支原体检测中的用途。

另一方面，本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。

另一方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。

另一方面，本发明提供含有上述核酸或载体的细胞。

另一方面，本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如上所述的细胞。

在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1Anti-MP-22A9单克隆抗体的制备

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。

1重组质粒的构建

(1)抗体基因制备

从分泌抗肺炎支原体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆，各4个克隆送基因测序公司进行测序。

(2)Anti-MP-22A9抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在Kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为321bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为363bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

(3)重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM 3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.72kb的Light Chain基因片段和1.42kb的Heavy Chain基因片段。

Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

2稳定细胞株筛选

(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

质粒用超纯水稀释至40ug/100ul，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液(主要成分NaHCO3)稀释肺炎支原体天然抗原(购自Microbix)至3ug/ml，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μL/孔，含柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)，加入显色液B液(50μL/孔，含柠檬酸+EDTA·2Na+TMB+浓HCL)，10min；加入终止液(50μL/孔，含EDTA·2Na+浓H₂SO₄)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对肺炎支原体有活性。

(2)重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50μL、DNA 100μg/管、PuvI酶10μL、无菌水补至500μL，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

质粒用超纯水稀释至40ug/100ul，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μL质粒与700μL细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

3重组抗体生产

(1)细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

(2)摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取3μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图所示，在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD，另一条Mr为28KD。

实施例2抗体活性优化

实施例1得到的Anti-MP-22A9单克隆抗体虽然具备结合肺炎支原体的能力，但抗体活性不够理想，因而申请人通过对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行定向突变。即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计，根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR反应，将PCR产物克隆至载体，再按照实施例1所述的方法进行突变抗体的制备。经筛选，得到抗体活性显著提升的单克隆抗体，并命名为：Anti-MP-22A9mut1至Anti-MP-22A9mut6。各单克隆抗体的氨基酸序列如下表1所示：

表1抗体序列

样品名称	重链序号	轻链序号
			Anti-MP-22A9mut1	SEQ ID NO:19	SEQ ID NO:20
Anti-MP-22A9mut2	SEQ ID NO:23	SEQ ID NO:20
			Anti-MP-22A9mut3	SEQ ID NO:26	SEQ ID NO:20
Anti-MP-22A9mut4	SEQ ID NO:29	SEQ ID NO:20
			Anti-MP-22A9mut5	SEQ ID NO:29	SEQ ID NO:32
Anti-MP-22A9mut6	SEQ ID NO:29	SEQ ID NO:35

实施例3活性及性能鉴定

1活性鉴定

包被液(主要成分NaHCO3)稀释肺炎支原体天然抗原(购自Microbix)至2ug/ml，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的上述单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min-60min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液(PBS)清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔，含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L柠檬酸、0.07g/L乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲)，加入显色液B液(50μl/孔，含1.05g/L柠檬酸、0.186g/LEDTA·2Na、0.45g/L TMB和0.2ml/L浓HCl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/EDTA·2Na和10.2ml/L浓H₂SO₄)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果表明，Anti-MP-22A9mut1至Anti-MP-22A9mut8的活性均高于对照。

具体结果见下表2。

表2活性数据

样品浓度(ng/ml)	15	7.5	3.75	1.88	0.94	0
							对照	1.321	0.629	0.403	0.212	0.118	0.015
Anti-MP-22A9mut1	1.924	1.391	0.619	0.391	0.205	0.013
							Anti-MP-22A9mut2	2.235	1.604	0.899	0.534	0.386	0.021
Anti-MP-22A9mut3	2.157	1.666	0.906	0.512	0.359	0.016
							Anti-MP-22A9mut4	1.976	1.471	0.758	0.401	0.207	0.012
Anti-MP-22A9mut5	2.027	1.677	0.814	0.536	0.315	0.011
							Anti-MP-22A9mut6	2.009	1.419	0.627	0.339	0.207	0.011

2性能评价

将上述抗体分别作为包被抗体，另一株特异性识别肺炎支原体的单克隆抗体作为标记株，在胶体金层析平台上比较不同株包被抗体性能差异。Anti-MP-22A9mut2至Anti-MP-22A9mut6的性能均优于Anti-MP-22A9mut1，Anti-MP-22A9mut1性能优于对照。具体性能见下表：

表3性能评价数据

3稳定性考核

将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表4为抗体考核21天的酶免活性检测OD结果。

表4稳定性数据

样品浓度(ng/ml)	7.5	1.88	0
				4℃，21天样品	1.598	0.484	0.052
-80℃，21天样品	1.562	0.459	0.048
				37℃，21天样品	1.602	0.499	0.036

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本申请涉及的部分氨基酸序列如下所示：

编号	序列片段
		SEQ ID NO:1	TYNMH
SEQ ID NO:2	YVHPGYGITYYSQKFKG
		SEQ ID NO:3	SYYGYSYWFF
SEQ ID NO:4	KASENVGSYVA
		SEQ ID NO:5	GASNRYT
SEQ ID NO:6	GQTYNYPY

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市朋志生物科技有限公司

<120> 抗肺炎支原体的抗体、检测肺炎支原体的试剂和试剂盒

<130> P2022022CN01

<160> 35

<170> PatentIn version 3.3

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Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg

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Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr

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Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys

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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

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50 55 60

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65 70 75 80

Met Ile Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

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Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Val Ser Met Ser Val Gly

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Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ser Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Arg Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Thr Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 17

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

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Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

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Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

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195 200 205

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210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

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245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

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Ser Pro Gly Lys

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<223> 人工序列

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Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

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Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

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Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

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65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

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<211> 445

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 19

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Val His Pro Gly Tyr Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

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65 70 75 80

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Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

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Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

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290 295 300

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

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Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

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405 410 415

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20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

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210

<210> 21

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

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Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Leu

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

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Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

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<213> Artificial Sequence

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<223> 人工序列

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1 5 10 15

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20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Val His Pro Gly Tyr Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

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115 120 125

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130 135 140

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Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

210 215 220

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

290 295 300

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

305 310 315 320

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

340 345 350

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

355 360 365

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

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Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

405 410 415

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

420 425 430

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435 440 445

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 24

Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Leu

1 5 10 15

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<210> 25

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 25

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

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<211> 445

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 26

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

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20 25 30

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35 40 45

Gly Tyr Val His Pro Gly Tyr Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

210 215 220

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

290 295 300

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

305 310 315 320

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

340 345 350

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

355 360 365

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

385 390 395 400

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

405 410 415

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

420 425 430

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 27

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 27

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Leu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Ile Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 28

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 28

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Val His Pro Gly Tyr Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Leu Leu Ser Ser Ile Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Tyr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 29

<211> 445

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 29

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Val His Pro Gly Tyr Gly Ile Thr Tyr Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Leu Leu Ser Ser Ile Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Tyr Tyr Gly Tyr Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

115 120 125

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

130 135 140

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

210 215 220

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

290 295 300

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

305 310 315 320

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

340 345 350

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

355 360 365

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

385 390 395 400

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

405 410 415

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

420 425 430

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 30

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 30

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Ile Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys

20 25 30

<210> 31

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 31

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Val Ser Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ser Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Arg Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr Ile Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Thr Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 32

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 32

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Val Ser Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ser Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Arg Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr Ile Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Thr Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 33

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 33

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys

20 25 30

<210> 34

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 34

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Val Ser Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ser Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Arg Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Thr Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 35

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 35

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Val Ser Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Ser Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Arg Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Thr Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

Claims

1.一种抗肺炎支原体的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括：重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列依次如SEQ IDNO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包括氨基酸序列如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:10所示的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4和氨基酸序列如SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:14所示的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，或与所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。

3. 根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的HFR3如SEQ ID NO:21、24或27所示。

4. 根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的LFR3如SEQ ID NO:30或33所示。

5.一种抗肺炎支原体的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4的序列结构，所述轻链可变区含有LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4的序列结构，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR 1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为权利要求1中所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列，所述HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列为权利要求2中所述的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列。

6.一种抗肺炎支原体的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区氨基酸序列选自如下任一组合：

。

7.根据权利要求1至6任一所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包含恒定区。

8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区。

9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。

10.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

11.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为小鼠。

12.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:17所示或与其具有至少80％同源性；所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:18所示或与其具有至少80％同源性。

13.根据权利要求1至6任一所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

14.一种抗肺炎支原体的抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链包括权利要求5至6中任一项所述的重链可变区和权利要求8，9，12中任一项所述的重链恒定区；所述轻链包括权利要求5至6中任一项所述的轻链可变区和权利要求8，9，12中任一项所述的轻链恒定区。

15.一种抗肺炎支原体的抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链和轻链的氨基酸序列选自如下任一组合：

。

16.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包括权利要求1至15任一项所述的抗体或其抗原结合片段及抗体偶联物，所述偶联物选自标记物。

17.根据权利要求16所述的抗体偶联物，其特征在于，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

18.根据权利要求17所述的抗体偶联物，其特征在于，所述荧光染料选自荧光素类染料、罗丹明类染料、Cy系列染料、Alexa系列染料和蛋白类染料。

19.根据权利要求17所述的抗体偶联物，其特征在于，所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

20.根据权利要求17所述的抗体偶联物，其特征在于，所述放射性同位素选自²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、^94mTc、^99mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、^110mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

21.根据权利要求17所述的抗体偶联物，其特征在于，所述化学发光试剂选自鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、吖啶酯、二氧环乙烷、洛粉碱和过氧草酸盐。

22.根据权利要求17所述的抗体偶联物，其特征在于，所述纳米颗粒类标记物选自纳米颗粒和胶体。

23.根据权利要求22所述的抗体偶联物，其特征在于，所述纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

24.根据权利要求22所述的抗体偶联物，其特征在于，所述胶体选自胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

25.根据权利要求24所述的抗体偶联物，其特征在于，所述胶体金属选自胶体金、胶体银和胶体硒。

26.根据权利要求16所述的抗体偶联物，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包被至固相。

27.根据权利要求26所述的抗体偶联物，其特征在于，所述固相选自微球、板和膜。

28.根据权利要求27所述的抗体偶联物，其特征在于，所述固相选自磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。

29.一种检测肺炎支原体的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1至15任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求16至28任一项所述的抗体偶联物。

30.权利要求1至15任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求16至28任一项所述的抗体偶联物或权利要求29所述的试剂或试剂盒在制备检测肺炎支原体产品中的用途。

31.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求1至15任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

32.一种载体，其特征在于，其含有权利要求31所述的核酸。

33.一种细胞，其特征在于，其含有权利要求31所述的核酸或权利要求32所述的载体。

34.一种制备权利要求1至15任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求33所述的细胞。