CN116785428B

CN116785428B - 一种复方抗hpv生物蛋白及其应用

Info

Publication number: CN116785428B
Application number: CN202311060432.7A
Authority: CN
Inventors: 谢佰友; 韩楚霖
Original assignee: Zhejiang Elsen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Elsen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-08-22
Filing date: 2023-08-22
Publication date: 2024-01-09
Anticipated expiration: 2043-08-22
Also published as: CN116785428A

Abstract

本发明提供了一种复方抗HPV生物蛋白及其应用，该复方抗HPV生物蛋白是以抗HPV单链IgY抗体为有效成分，其中，乳清蛋白具有免疫活性，能够完整地进入近端小肠，起到保护小肠粘膜的功能，可以有效辅助抗HPV单链IgY抗体的免疫效果；壳聚糖作为药物载体可以稳定抗HPV单链IgY抗体，促进药物吸收，延缓或控制药物的溶解速度，帮助药物达到靶器官，并且抗酸、抗溃疡，防止药物对胃的刺激；泊洛沙姆可以增加抗HPV单链IgY抗体在胃肠道中滞留时间增长，吸收增加，从而能提高药物的生物利用度，促进药剂的吸收。本发明首次针对HPV16 E7蛋白的抗HPV单链IgY抗体，该类抗体经济易得，制备和纯化过程简单，成本相对于IgG抗体而言更低，产量更高。

Description

一种复方抗HPV生物蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及HPV治疗技术领域，更具体地，涉及一种复方抗HPV生物蛋白及其应用。

背景技术

宫颈癌是全世界范围内常见的女性恶性肿瘤。持续感染高危型人乳头瘤病毒（HPV）是发生宫颈癌的明确危险因素。HPV16是最常见的高危型HPV 之一。HPV编码的E6和E7早期癌蛋白的检测具有重要的生物学意义。然而目前尚无商业化、可应用于临床检测HPV16E7抗体。

卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk ,IgY)是指特定抗原刺激禽类Ｂ淋巴细胞，由Ｂ细胞分化成浆细胞并由此分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体。卵黄抗体具有性质稳定、特异性强、制备成本低、口服安全等优点在家禽、家畜传染病的防治中已得到广泛的应用。

HPV蛋白敷料作为新型创面敷料既可以作为预防HPV感染的方式，又可以辅助治疗，无任何副作用，市场空间巨大。但是目前HPV蛋白敷料的疗效缓慢，并不能达到十分有效地中和HPV病毒的目的。

发明内容

针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种复方抗HPV生物蛋白及其应用。

具体而言，本发明首先是提供了一种复方抗HPV生物蛋白，所述复方抗HPV生物蛋白由以下重量比的原料组成：40-50%抗HPV病毒的特异性IgY抗体、5-10%乳清蛋白、10-20%壳聚糖和5-10%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

优选地，所述复方抗HPV生物蛋白由以下重量比的原料组成：40%抗HPV单链IgY抗体、5%乳清蛋白、10%壳聚糖和5%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

优选地，所述复方抗HPV生物蛋白由以下重量比的原料组成：45%抗HPV单链IgY抗体、8%乳清蛋白、15%壳聚糖和8%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

优选地，所述复方抗HPV生物蛋白由以下重量比的原料组成：50%抗HPV单链IgY抗体、10%乳清蛋白、20%壳聚糖和10%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

本发明的另一个目的在于提供了一种抗HPV单链IgY抗体，所述抗HPV单链IgY抗体是本发明首次分离纯化得到，所述抗HPV单链IgY抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，进一步地，将密码子优化后，抗HPV单链IgY抗体的编码序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供了所述复方抗HPV生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下过程：

（1）按照重量比称取相关原料；

（2）首先将乳清蛋白、壳聚糖和泊洛沙姆在温水孵育中缓慢溶解于蒸馏水中，其间需要不断低温搅拌，得溶液A；

（3）将抗HPV单链IgY抗体加入步骤（2）中的溶液A中，低温搅拌混合均匀，得溶液B；

（4）将溶液B经真空冷冻干燥后，即得得到本发明所述的复方抗HPV生物蛋白。

优选地，所述复方抗HPV生物蛋白可以与常见的药用辅料复配，剂型不限于膏剂、或凝胶剂、或栓剂。

本发明的另一个目的在于提供了一种抗HPV单链IgY抗体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

（1）HPV16 E7全长蛋白获取：从HPV16全病毒质粒中扩增全长HPV16 E7（NC_001526.4）基因序列，将其扩增纯化产物与载体连接制备重组质粒，转化感受态细胞，并诱导表达HPV16 E7蛋白，经分离和纯化后得到HPV16 E7蛋白，经冷冻干燥后，将其至于-80℃保存备用。

（2）产蛋鸡免疫程序：初次免疫原为HPV16 E7蛋白(500µg) 加等体积弗氏完全佐剂( Freunds complete adjuvant, FCA) 充分混匀成乳剂, 常规碘酒、酒精消毒产蛋鸡胸部和翅膀下的4 个点分布式肌内注射2 ml 乳化液进行免疫。随后加强免疫的抗原为HPV16E7蛋白(250µg) 加弗氏不完全佐剂( Freunds incomplete adjuvant, FIA) 充分混匀间隔2周加强免疫2次。在加强免疫1 周后，收集鸡蛋，4 ℃下保存备用。

（3）特异性IgY抗体的分离和纯化：分离收集蛋的蛋黄液，并加入5倍体积的PBS缓冲液，随后加入3.5%（w/v）的PEG-6000，静置30min，经5000g离心后20min；采用脱脂棉过滤上清液，同时向上清液中加入硫酸铵盐析，使硫酸铵的饱和度达40％-50％，在4℃下静置12h；静置后离心，弃去上清液，得到沉淀物，按每毫升沉淀物加5-7ml PBS缓冲液溶解得到溶解液；将溶解液装入透析袋用蒸馏水透析除铵离子，最后一次改用PBS缓冲液透析；透析液除菌过滤，即得特异性的IgY抗体提取液；经冷冻干燥后，将其至于-80℃保存备用。

（4）将步骤（3）中制备得到的特异性的IgY抗体送至北京安必奇生物公司进行测序分析，将特异性的IgY抗体的轻重链经过多肽连接子偶联即可得到所述抗HPV单链IgY抗体。

优选地，所述多肽连接子包括(GGGS)n重复单元。

进一步优先地，所述多肽连接子包括GGGSGGGS。

进一步地，本发明还提供了上述抗HPV单链IgY抗体在制备复方抗HPV生物蛋白中的应用。

进一步地，本发明还提供了一种预防或治疗HPV病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括复方抗HPV生物蛋白。

优选地，所述试剂盒或试剂中还包括记载有执行所述治疗方法步骤的说明书。

优选地，上述所述检测HPV病毒的类型为HPV 16型。

本发明的优点如下：

（1）本发明首次提供的一种复方抗HPV生物蛋白，该复方抗HPV生物蛋白是以抗HPV单链IgY抗体为有效成分，其中，乳清蛋白具有免疫活性，能够完整地进入近端小肠，起到保护小肠粘膜的功能，可以有效辅助抗HPV单链IgY抗体的免疫效果；壳聚糖作为药物载体可以稳定抗HPV单链IgY抗体，促进药物吸收，延缓或控制药物的溶解速度，帮助药物达到靶器官，并且抗酸、抗溃疡，防止药物对胃的刺激；泊洛沙姆可以增加抗HPV单链IgY抗体在胃肠道中滞留时间增长，吸收增加，从而能提高药物的生物利用度，促进药剂的吸收。

（2）本发明首次针对HPV16 E7蛋白的抗HPV单链IgY抗体，该类抗体经济易得，制备和纯化过程简单，成本相对于IgG抗体而言更低，产量更高。

附图说明

图1是本发明实施例1-3、5对HPV16病毒的中和试验。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

一种复方抗HPV生物蛋白，所述复方抗HPV生物蛋白由以下重量比的原料组成：

40%抗HPV单链IgY抗体、5%乳清蛋白、10%壳聚糖和5%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

其中，抗HPV单链IgY抗体是本发明首次分离纯化得到，所述抗HPV单链IgY抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，进一步地，将密码子优化后，抗HPV单链IgY抗体的编码序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

45%抗HPV单链IgY抗体、8%乳清蛋白、15%壳聚糖和8%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

实施例3

50%抗HPV单链IgY抗体、10%乳清蛋白、20%壳聚糖和10%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

实施例4

实施例1-3任一项所述复方抗HPV生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下过程：

（1）按照实施例1-3任一项所述重量比称取相关原料；

实施例5

一种抗HPV单链IgY抗体的制备方法，包括如下步骤：

（4）将步骤（3）中制备得到的特异性的IgY抗体送至北京安必奇生物公司进行测序分析，将特异性的IgY抗体的轻重链经过多肽连接子偶联即可得到所述抗HPV单链IgY抗体。其中所述多肽连接子包括(GGGS)_n重复单元。

实施例6

通过Elisa方法检测了实施例1-3复方抗HPV生物蛋白组合物和实施例5中的抗HPV单链IgY抗体对HPV16病毒的中和效果，对照组为由10%乳清蛋白、20%壳聚糖和10%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。结果如图1所示，试验结果表明本发明实施例1-3复方抗HPV生物蛋白组合物可以有效中和人乳头瘤病毒HPV16，相比于单独实施例5中的抗HPV单链IgY抗体而言，实施例1-3复方抗HPV生物蛋白显示与HPV16更强的中和作用，能有效抑制HPV16病毒，具备良好的临床应用前景。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种复方抗HPV生物蛋白，所述复方抗HPV生物蛋白由以下重量比的原料组成：40-50%抗HPV单链IgY抗体、5-10%乳清蛋白、10-20%壳聚糖和5-10%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％；

其中，抗HPV单链IgY抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，进一步地，将密码子优化后，抗HPV单链IgY抗体的编码序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的复方抗HPV生物蛋白，其特征在于，所述复方抗HPV生物蛋白由以下重量比的原料组成：40%抗HPV单链IgY抗体、5%乳清蛋白、10%壳聚糖和5%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

3.如权利要求1所述的复方抗HPV生物蛋白，其特征在于，所述复方抗HPV生物蛋白由以下重量比的原料组成：45%抗HPV单链IgY抗体、8%乳清蛋白、15%壳聚糖和8%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

4.如权利要求1所述的复方抗HPV生物蛋白，其特征在于所述复方抗HPV生物蛋白由以下重量比的原料组成：50%抗HPV单链IgY抗体、10%乳清蛋白、20%壳聚糖和10%泊洛沙姆以及余量蒸馏水配置成100％。

5. 一种抗HPV单链IgY抗体，其特征在于，所述抗HPV单链IgY抗体的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，进一步地，将密码子优化后，抗HPV单链IgY抗体的编码序列如SEQ ID NO.2所示。

6.权利要求5所述的抗HPV单链IgY抗体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

（1）HPV16 E7全长蛋白获取：从HPV16全病毒质粒中扩增全长HPV16 E7 NC_001526.4基因序列，将其扩增纯化产物与载体连接制备重组质粒，转化感受态细胞，并诱导表达HPV16E7蛋白，经分离和纯化后得到HPV16 E7蛋白，经冷冻干燥后，将其至于-80℃保存备用；

（2）产蛋鸡免疫程序：初次免疫原为HPV16 E7蛋白500µg 加等体积弗氏完全佐剂Freunds complete adjuvant充分混匀成乳剂, 常规碘酒、酒精消毒产蛋鸡胸部和翅膀下的4 个点分布式肌内注射2 ml 乳化液进行免疫，随后加强免疫的抗原为HPV16 E7蛋白250µg 加弗氏不完全佐剂Freunds incomplete adjuvant充分混匀间隔2周加强免疫2次，在加强免疫1 周后，收集鸡蛋，4 ℃下保存备用；

（3）特异性IgY抗体的分离和纯化：分离收集蛋的蛋黄液，并加入5倍体积的PBS缓冲液，随后加入3.5% w/v的PEG-6000，静置30min，经5000g离心后20min；采用脱脂棉过滤上清液，同时向上清液中加入硫酸铵盐析，使硫酸铵的饱和度达40％-50％，在4℃下静置12h；静置后离心，弃去上清液，得到沉淀物，按每毫升沉淀物加5-7ml PBS缓冲液溶解得到溶解液；将溶解液装入透析袋用蒸馏水透析除铵离子，最后一次改用PBS缓冲液透析；透析液除菌过滤，即得特异性的IgY抗体提取液；经冷冻干燥后，将其至于-80℃保存备用；

（4）将步骤（3）中制备得到的特异性的IgY抗体进行测序分析，将特异性的IgY抗体的轻重链经过多肽连接子偶联即可得到所述抗HPV单链IgY抗体。

7.权利要求1-4任一项所述的复方抗HPV生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下过程：

（1）按照重量比称取相关原料；

（4）将溶液B经真空冷冻干燥后，即得得到所述的复方抗HPV生物蛋白。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述复方抗HPV生物蛋白与常见的药用辅料复配，剂型是膏剂、或凝胶剂、或栓剂。