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CN108727503A - VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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CN108727503A
CN108727503A CN201710449087.4A CN201710449087A CN108727503A CN 108727503 A CN108727503 A CN 108727503A CN 201710449087 A CN201710449087 A CN 201710449087A CN 108727503 A CN108727503 A CN 108727503A
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vzv
flagellum
terminal
seq
fibroin
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Application number
CN201710449087.4A
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肖杨
刘昊智
毛普加
高媛
王雨
李津
吴克
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BRAVOVAX Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种VZV重组gE‑鞭毛素融合蛋白及其制备方法和应用，其中，所述融合蛋白至少包括鞭毛素蛋白的N端保守区、水痘‑带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE和鞭毛素蛋白的C端保守区。本发明提供的VZV重组gE‑鞭毛素融合蛋白较单独的重组前gE蛋白可以引起更高的抗体滴度，因此具有较好的免疫活性，可以激发细胞免疫和体液免疫，且不具有引发潜在感染的风险，为新型水痘蛋白疫苗的制备奠定了良好的免疫学基础。

Description

VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白及其制备方法和应用，属于生物制药领域，尤其是基因工程疫苗领域。
背景技术
一、水痘-带状疱疹病毒概述
水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)原发感染可引起水痘(chickenpox)和带状疱疹(herpes zoster，HZ)，具有较高的传染性和发病率。水痘是儿童时期常见的一种急性、高传染性疾病，患儿出现全身性皮疹，伴有发热、全身乏力等表现。带状疱疹常发生于中老年人，是一种出现在皮区的水疱病，其特征为神经疼痛及随神经支单侧分布的皮肤发疹。这两种疾病临床表现不同，却由同一种病毒引起，即水痘-带状疱疹病毒。VZV通过神经系统感染人体，经历两次病毒血症候，病毒到达皮肤表层，产生典型的疱疹样皮损，随后病毒进入周围神经系统，并且潜伏在脊神经节。待皮疹消退，患者痊愈后，有少量残存的病毒会终身潜伏于宿主的脊髓后根神经节、脑神经节及肠道神经节的神经细胞中。
VZV属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，是一种双链DNA病毒，仅有一个血清型。病毒核衣壳直径约80～120nm，呈二十面体，周围包绕一层内膜及一层部分来自细胞膜的包膜。整个VZV颗粒直径为180～200nm。核心DNA至少包含71个开放阅读框，其中2/3是体外复制所必需的，包括重要的8种糖蛋白、DNA复制相关蛋白、DNA解旋、衣壳包装等相关蛋白。VZV主要由皮损部位疱液中的病毒颗粒通过空气传播。经上呼吸道黏膜或结膜感染后进入机体，在局部细胞内复制，约4～6天即出现原发性病毒血症和前驱症状，约2周出现水疱疹。感染水痘一般以轻型和中型病例较多，常见并发症为皮肤的继发性细菌感染，偶见多种皮肤外表现，如肺炎、脑炎、小脑性共济失调等。
对于免疫功能不足或无免疫力的新生儿，水痘是一种严重的、涉及多器官的致死性感染。免疫抑制儿童患水痘后病情会加重。成人感染VZV少见，但症状常很严重，多并发弥散性结石性肺炎，病死率高达10％～40％。孕妇患水痘时，胎儿可被感染甚至形成先天性综合症(CVS)。
二、水痘疫苗概述
对于水痘和带状疱疹，主要是对症处理，无特效治疗方法，抗病毒药物，如阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦等，虽有助于水痘及HZ患者迅速康复，但不能终止病毒排出，无法预防隐性感染。而暴露VZV后给予过量的免疫球蛋白，对于中止或减轻疾病负担也是有限的，因此，疫苗在控制水痘感染方面发挥着重要作用，接种疫苗是最有效和最可靠的预防和控制水痘的手段。
水痘疫苗最早由日本的高桥(Takahashi)研究组于1974年研发成功。他们从1例3岁名叫Oka的水痘患儿体内分离出一株VZV，将其在人胚胎成纤维细胞34℃传11代，在豚鼠成纤维细胞37℃传12代和人二倍体成纤维细胞37℃传5代(WI-38和MRC-5)，成功减毒为活疫苗，称为Oka疫苗(vOka)。起初，vOka的安全性非常好，即使在免疫力部分损伤的白血病儿童和人类免疫缺陷病毒感染儿童中也没有出现严重不良反应，还显示处良好的免疫保护效果。但是接种vOka疫苗依次接种的免疫保护时间不够持久，且少数个体经依次接种未能达到有效保护状态。对那些年龄稍大如青春期的青少年，vOka的免疫效果低于1～12岁的儿童，因此对于学龄前儿童，需要对该疫苗进行二次接种。由于vOka是VZV减毒疫苗，因此还存在着一定的导致潜伏感染的风险。
VZV糖蛋白E亚单位疫苗是目前的水痘疫苗的主流研究方向，VZV基因组共有71个开放读码框架(openreadingframe，ORF)，编码糖蛋白E(gE)、gB、gH、gI、gC、gL、gK和gM共8种糖蛋白。其中gE由ORF68基因编码，属于I型膜蛋白，是生成感染性病毒颗粒的必需糖蛋白，也是VZV包膜和感染细胞膜中含量最丰富、抗原性最强的糖蛋白，存在于病毒颗粒的表面及被感染细胞的表面和胞质内，在病毒不同成熟阶段以不同的含糖多肽形式存在。在处于恢复期的水痘和带状疱疹患者血清中，VZV抗体主要针对gE、gB和gH，尤其是以gE为主要靶点诱导的细胞免疫和体液免疫，能保护动物免受病毒攻击。已有研究表明，VZV gE单克隆抗体可介导抗体依赖性的细胞毒性，在有外源性补体的情况下能中和病毒的感染性。
Toll样受体5(TLR5)是机体免疫系统中一类重要的跨膜受体Toll样受体家族成员，是鞭毛素蛋白的特异性受体。鞭毛素蛋白是革兰氏阴性菌鞭毛的主要结构蛋白。目前认为，鞭毛蛋白具有致炎作用，可通过TLR5引起局部或全身炎症反应，被其特异性受体TLR5识别后启动机体的先天性免疫反应和炎症反应，诱导单核-巨噬细胞、上皮细胞活化，释放前炎症因子，是具有潜力应用于临床的、强效的全身和粘膜免疫佐剂。
已有部分文献报道采用基因重组技术表达该亚单位疫苗，但多数均在研发中，并未进入III期临床实验，其有效性和安全性均有待进一步确定。GSK公司以gE糖蛋白为主要成分，AS01B为佐剂，开发出一种新型亚单位HZ疫苗，在II期临床数据中，证实gE糖蛋白免疫剂量对细胞免疫的提升无显著差异，但是与抗体滴度呈正相关。水痘疫苗方面，部分学者一直在致力于研究融合蛋白表达gE蛋白，但还未取得实质性进展。因此，设计研究一款可以稳定高质量表达水痘gE蛋白的融合蛋白，是研发新型水痘疫苗的基础，也是目前迫切需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以VZV gE糖蛋白和鞭毛素蛋白融合基因为基础，获得一种VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的技术方案如下：所述融合蛋白至少包括鞭毛素蛋白的N端保守区、水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE和鞭毛素蛋白的C端保守区，其中：
所述融合蛋白的N端为鞭毛素蛋白的N端保守区的N端，所述融合蛋白的C端为鞭毛素蛋白的C端保守区的C端；
所述鞭毛素蛋白的N端保守区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，鞭毛素蛋白的C端保守区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示，所述水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
上述的融合蛋白主要的融合形式是鞭毛素蛋白的N端保守区的N端为所述融合蛋白的N端，鞭毛素蛋白的C端保守区的C端为所述融合蛋白的C端，其中鞭毛素蛋白的N端保守区的C端与所述水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE的N端相连，鞭毛素蛋白的C端保守区的N端与所述水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE的C端相连。
优选地，鞭毛素蛋白的N端保守区的N端为所述融合蛋白的N端，鞭毛素蛋白的C端保守区的C端为所述融合蛋白的C端，水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE通过连接肽连接鞭毛素蛋白的N端保守区和鞭毛素蛋白的C端保守区。
作为一种较佳的实施方式，所述融合蛋白N端保守区与水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE通过连接肽I连接，C端保守区与水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE通过连接肽II连接，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示。
优选地，连接肽I的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示。表达连接肽I的基因序列如序列表SEQ ID NO:6所示。
优选地，连接肽II的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示。表达连接肽II的基因序列如序列表SEQ ID NO:8所示。
优选地，表达如序列表SEQ ID NO:11所示的融合蛋白的核苷酸序列如序列表SEQID NO:10所示。
优选地，编码全序列鞭毛素蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
优选地，表达该融合蛋白核苷酸序列的核酸表达载体为质粒pET28a。
优选地，表达所述质粒的表达菌株为BL21。
本发明的第二个目的在于提供一种VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的制备方法，其制备方法包括如下步骤：
S1.设计引物，扩增VZV糖蛋白gE基因序列的引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示，扩增带组氨酸标签VZV糖蛋白gE基因序列的引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示，扩增gE-鞭毛素融合基因序列的引物序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，扩增带组氨酸标签的gE-鞭毛素融合基因序列的引物列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示，分别扩增VZV糖蛋白gE基因序列、沙门氏菌鞭毛素蛋白基因片段，并用融合PCR方法在基因末端添加HIS标签，目的基因拼接后，构建pET28a载体；
S2.将构建的pET28a-gE-鞭毛素转化至表达菌株BL21中，IPTG诱导，获得融合蛋白，收集菌体；
S3.大量诱导pET28a-gE-鞭毛素/BL21，破碎收集沉淀，用包涵体洗涤液重悬，离心；
S4.裂解缓冲液重悬沉淀，融合蛋白gE-鞭毛素用Ni2+柱变性、复性及纯化，得到纯化后的gE-鞭毛素蛋白。
优选地，S3具体为：
沉淀用包涵体洗涤液I重悬后于离心；沉淀再以包涵体洗涤液II重悬，冷藏放置后离心；沉淀用包涵体洗涤液III重悬，室温放置后离心；沉淀用Lysis buffer重悬。
更优选地，S3步骤中采用的包涵体洗涤液I具体为50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM EDTA及1mM PMSF；沉淀再以包涵体洗涤液II具体为2M尿素；沉淀用包涵体洗涤液III具体为50mM Tris-HCl、0.5％Triton X-100(v/v)、5mM EDTA及1mM PMSF；裂解缓冲液具体为Lysis buffer具体为100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl及8M urea，pH8.0。
上述实验步骤的具体操作实施均可参照现有技术进行，在此不再进行赘述。
本发明的第三个目的在于提供一种免疫组合物，所述免疫组合物包括权利要求1所述的融合蛋白。
本发明的第四个目的在于提供一种VZV疫苗，该疫苗包括权上述的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白。
本发明的第五个目的在于提供一种VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的应用，所述融合蛋白用于制备诱导针对VZV抗原的免疫反应的药物。
优选地，所述融合蛋白用于制备保护个体预防VZV感染的药物。
优选地，本发明中的融合蛋白可用于制备已感染VZV个体的治疗药物。
作为一种优选的实施方式，用于制备已感染VZV人体的治疗药物。
本发明中的融合蛋白具有VZV病毒的免疫原性，可作为预防及治疗由VZV引起的各类感染的抗原性物质，不限于上述应用中所述的内容，其他方面可参照现有技术，在此不做赘述。
与现有技术相比，本发明采用原核融合表达，成功诱导出融合蛋白gE-鞭毛素，SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白gE-鞭毛素主要为包涵体表达，经变性、复性后成功纯化出目的蛋白。本发明提供的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白较单独的重组前gE蛋白可引起更高的抗体滴度，因此具有较好的免疫活性。鞭毛素蛋白激活体内TLR5通路后可起到佐剂的效果，使得该融合蛋白兼具gE蛋白的免疫原性及佐剂活性，可以激发细胞免疫和体液免疫，且不具有引发潜在感染的风险，为新型水痘蛋白疫苗的制备奠定了良好的免疫学基础。
附图说明
图1是本发明提供的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的PCR扩增图。
图2是本发明提供的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的双酶切扩增图。
图3是本发明提供的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图4是本发明提供的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的Western blot结果图。
图5是本发明提供的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白纯化图。
图6是本发明提供的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白用鼠抗His Tag单克隆抗体Western blot鉴定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的一种VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
本实施例中采用的试剂及菌株如下所示：
Max DNA PolymeragE-鞭毛素，DL5000购自takara；
限制性内切酶NcoI/XhoI购自New England Biolabs；
实验所用到的DNA胶回收、质粒小提、产物回收试剂盒均购自北京天根；
鼠抗His Tag和羊抗鼠IgG购自碧云天；
培养基相关的蛋白胨、酵母提取物和Agar power购自OXIOD；
相关的抗生素均购自上海生工；
蛋白电泳Marker和琼脂糖凝胶购自GENVIEW；
实施例中的相关菌株均为本实验室保存。
实施例1
1.引物的设计及合成
根据NCBI中Oka株VZV糖蛋白gE和沙门氏菌鞭毛素蛋白基因序列，进行设计优化，选择鞭毛蛋白DNA保守区域的序列及连接序列的截断和拼接，构建至pET28a载体上，命名为pET28a-gE-鞭毛素。
涉及到的序列如下：
gE蛋白DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，具体如下：
ATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGCTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTATACGA
gE蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，具体如下：
MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGA
沙门氏菌鞭毛素蛋白基因序列如序列表SEQ ID NO：3所示，具体如下：
ATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCACTGGGCACTGCTATCGAGCGTTTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGACAGGCGATTGCTAACCGTTTTACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCGAATGGTACTAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGTGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATTGATTTAAAAGAAATCAGCTCTAAAACACTGGGACTTGATAAGCTTAATGTCCAAGATGCCTACACCCCGAAAGAAACTGCTGTAACCGTTGATAAAACTACCTATAAAAATGGTACAGATCCTATTACAGCCCAGAGCAATACTGATATCCAAACTGCAATTGGCGGTGGTGCAACGGGGGTTACTGGGGCTGATATCAAATTTAAAGATGGTCAATACTATTTAGATGTTAAAGGCGGTGCTTCTGCTGGTGTTTATAAAGCCACTTATGATGAAACTACAAAGAAAGTTAATATTGATACGACTGATAAAACTCCGTTGGCAACTGCGGAAGCTACAGCTATTCGGGGAACGGCCACTATAACCCACAACCAAATTGCTGAAGTAACAAAAGAGGGTGTTGATACGACCACAGTTGCGGCTCAACTTGCTGCAGCAGGGGTTACTGGCGCCGATAAGGACAATACTAGCCTTGTAAAACTATCGTTTGAGGATAAAAACGGTAAGGTTATTGATGGTGGCTATGCAGTGAAAATGGGCGACGATTTCTATGCCGCTACATATGATGAGAAAACAGGTGCAATTACTGCTAAAACCACTACTTATACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAACTGGAGCTGTGAAATTTGGTGGCGCAAATGGTAAATCTGAAGTTGTTACTGCTACCGATGGTAAGACTTACTTAGCAAGCGACCTTGACAAACATAACTTCAGAACAGGCGGTGAGCTTAAAGAGGTTAATACAGATAAGACTGAAAACCCACTGCAGAAAATTGATGCTGCCTTGGCACAGGTTGATACACTTCGTTCTGACCTGGGTGCGGTTCAGAACCGTTTCAACTCCGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAATAACCTGTCTTCTGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCAACCGAAGTCTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGTTCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGTTA
鞭毛素蛋白的N端保守区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，具体为：
MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANGTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKEISSKTLGLDKLNVQDAYT
鞭毛素蛋白的C端保守区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：5所示，具体为：
HNFRTGGELKEVNTDKTENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSSARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR
扩增VZV糖蛋白gE基因序列的引物如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，gE-F序列为SEQ ID NO：5，gE-R序列为SEQ ID NO：6：
gE-F：GGAATTCATGGGGACAGTTAATAAACCTGT
gE-R：TTATCGTATAAGTGGTGACGTT
扩增带组氨酸标签VZV糖蛋白gE基因序列的引物如序列表SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示，gE-F序列为SEQ ID NO：7，gE-F-R(HIS)序列为SEQ ID NO：8：
gE-F：GGAATTCATGGGGACAGTTAATAAACCTGT
gE-F-R(HIS)：
CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTATCGTATAAGTGGTGACGTT
扩增gE-鞭毛素融合基因序列的引物如序列表SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，gE(RH)-F序列为SEQ ID NO：9，gE(RH)-R序列为SEQ ID NO：10：
gE(RH)-F：GGAATTCATGGCACAAGTCATTAATACA
gE(RH)-R：CCGCTCGAG TTA ACGCAGTAAAGAGAGGACGTTTTGC
扩增带组氨酸标签的gE-鞭毛素融合基因序列的引物如序列表SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示，gE-F-(RH)-F序列为SEQ ID NO：11，gE-F-(RH)-R(HIS)SEQ ID NO：12：
gE-F-(RH)-F：GGAATTCATGGCACAAGTCATTAATACA
gE-F-(RH)-R(HIS)：CCGCTCGAG TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACG
由以上引物对，扩增VZV糖蛋白gE基因序列及gE-鞭毛素融合基因序列，并用融合PCR方法在基因末端添加HIS标签，再构建pET28a载体。
融合后的Fusion蛋白的DNA序列如序列表SEQ ID NO：10所示，具体如下：
ATGGCACAAGTCATTAATACAAACAGCCTGTCGCTGTTGACCCAGAATAACCTGAACAAATCCCAGTCCGCACTGGGCACTGCTATCGAGCGTTTGTCTTCCGGTCTGCGTATCAACAGCGCGAAAGACGATGCGGCAGGACAGGCGATTGCTAACCGTTTTACCGCGAACATCAAAGGTCTGACTCAGGCTTCCCGTAACGCTAACGACGGTATCTCCATTGCGCAGACCACTGAAGGCGCGCTGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTGCGTGAACTGGCGGTTCAGTCTGCGAATGGTACTAACTCCCAGTCTGACCTCGACTCCATCCAGGCTGAAATCACCCAGCGCCTGAACGAAATCGACCGTGTATCCGGCCAGACTCAGTTCAACGGCGTGAAAGTCCTGGCGCAGGACAACACCCTGACCATCCAGGTTGGTGCCAACGACGGTGAAACTATCGATATTGATTTAAAAGAAATCAGCTCTAAAACACTGGGACTTGATAAGCTTAATGTCCAAGATGCCTACACCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGGGGACAGTTAATAAACCTGTGGTGGGGGTATTGATGGGGTTCGGAATTATCACGGGAACGTTGCGTATAACGAATCCGGTCAGAGCATCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCACGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGCTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTATACGAGGTGGTGG TGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGATCCCATAACTTCAGAACAGGCGGTGAGCTTAAAGAGGTTAATACAGATAAGACTGAAAACCCACTGCAGAAAATTGATGCTGCCTTGGCACAGGTTGATACACTTCGTTCTGACCTGGGTGCGGTTCAGAACCGTTTCAACTCCGCTATCACCAACCTGGGCAATACCGTAAATAACCTGTCTTCTGCCCGTAGCCGTATCGAAGATTCCGACTACGCAACCGAAGTCTCCAACATGTCTCGCGCGCAGATTCTGCAGCAGGCCGGTACCTCCGTTCTGGCGCAGGCGAACCAGGTTCCGCAAAACGTCCTCTCTTTACTGCGT
融合蛋白DNA序列表达出的蛋白序列如序列表SEQ ID NO：11所示，蛋白结构具体为鞭毛蛋白保守区域-连接肽-gE蛋白区域-连接肽-鞭毛蛋白保守区域-His标签。具体如下：
MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANGTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKEISSKTLGLDKLNVQDAYTGGGGSGGGGSASGGGGSGGGGSMGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRASVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVVYFNGHVEAVAYTVVSTVDHFVNAIEERGFPPTAGQPPATTKPKEITPVNPGTSPLIRGGGGSGGGGSGSHNFRTGGELKEVNTDKTENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSSARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLRHHHHHH
其中下划线部分为连接肽的基因序列及表达的氨基酸序列。
将合成的融合基因用PCR和酶切鉴定后测序。根据合成融合基因序列设计引物，扩增目的融合基因。将融合基因pET28a-gE-鞭毛素用NcoI/XhoI双切后，经1％琼脂糖电泳观察。琼脂糖电泳结果如图1及图2所示，图1为PCR扩增电泳结果，图2为双酶切电泳结果，从电泳结果中可知，PCR扩增和双酶切均获得预期大小，约为2600bp，将测序的结果与原始序列比对，无基因突变。
2.目的蛋白的表达及纯化
将测序正确的pET28a-gE-鞭毛素转化至表达菌株BL21中。将pET28a-gE-鞭毛素/BL21接种至5ml LB(AMP+)培养基中，37℃、220rps摇床培养过夜；取1ml转接至100ml LB(AMP+)培养基中，37℃、220rps摇床培养约3h，OD约等于0.4；加入终浓度的1mM的IPTG，继续37℃、220rps摇床培养4h；将诱导的菌液以10000rpm离心10min，收集菌体。
将沉淀用30ml的PBS重悬，以常规的超声波破碎的方法300W、工作5s间隙5s、总时长1h；将超声波破碎的菌液以12000rpm离心10min，分别收集沉淀和上清；通过蛋白电泳分析S素蛋白表达情况，以空载为对照组。
3.Western blot检测蛋白表达
将诱导破碎后的gE-鞭毛素蛋白以空载、全菌、上清和沉淀的顺序上样，经10％SDS-PAGE分离蛋白后，电转至PVDF膜上，用5％脱脂奶粉(100mlPBST中加入5g脱脂奶粉)于4℃中封闭过夜；加入经5％脱脂奶粉以1：2000稀释后的鼠抗HIS，放置37℃中孵育1h，用PBST洗涤3次，每次5min；加入经5％脱脂奶粉以1：2000稀释后的兔抗鼠IgG，放置37℃中孵育1h，用PBST洗涤3次，每次5min；用DAB显色，自来水终止。
4.融合蛋白gE-鞭毛素复性和纯化
大量诱导表达菌，并破碎收集沉淀。沉淀用包涵体洗涤液I(50mM Tris-HCl、150mMNaCl、5mM EDTA、1mM PMSF)重悬后于4℃中6000g离心15min；沉淀再以包涵体洗涤液II(2M尿素)重悬，4℃中放置15min，4℃中6000g离心30min；沉淀用包涵体洗涤液III(50mM Tris-HCl、0.5％Triton X-100(v/v)、5mM EDTA、1mM PMSF)重悬，室温放置20min，4℃中6000g离心15min；沉淀用ddH2O重悬洗涤，4℃中6000g离心15min；最后沉淀用Lysis buffer(100mMNaH2PO4、10mM Tris-HCl、8M urea、pH8.0)重悬。
将经Lysis buffer重悬后的液体于4℃中6000g离心15min，去上清，用0.45μm滤膜过滤后在纯化住上复性和纯化：①将取2ml Ni+填料于纯化柱中，用5倍柱体积ddH2O洗涤，再用5倍柱体积Lysis buffer活化；②将过滤后的上清加入纯化柱中，4℃缓慢摇床吸附2h；③配置含0-7M urea的Lysis buffer，按照高浓度到低浓度进行蛋白柱上复性；④用5倍柱体积Wash buffer(50mM NaH2PO4、30mM NaCl、20mM咪唑、pH8.0)洗涤；⑤最后用Elutionbuffer(50mM NaH2PO4、30mM NaCl、250mM咪唑、pH8.0)洗脱目的蛋白；⑥SDS-PAGE和Westernblot分析蛋白。
SDS-PAGE电泳显示，重组表达菌株在95KD，117KD出现清晰的条带，如图3所示，重组表达的蛋白与预测蛋白大小相匹配。如图4所示，重组蛋白与Western blot检测大小一致，表明了融合蛋白以包涵体形式存在。
5.Western blot检测纯化后融合蛋白样品
根据3.Western blot检测蛋白表达中Western blot的检测方法，对复性纯化后的样品进行检测。
大量诱导表达菌，经变性、复性和纯化，蛋白样品用250mM咪唑洗脱后，SDS-PAGE检测结果显示在95KD处出现明显条带，软件分析后其纯度达到85％(图5)。应用鼠抗His Tag单克隆抗体Western blot鉴定，结果可见约95KD有特异性目的条带(图6)。
动物实验检测VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的抗原性
选取6-8周BALB/C雌性小鼠，在标准动物饲养中心饲养。采用蛋白定量试剂盒对纯化后的gE蛋白和重组gE-鞭毛素融合蛋白进行蛋白定量，并调整浓度为0.5mg/ml和0.8mg/ml。将实验小鼠分为6组，每组8只，每隔两周免疫一次，具体免疫方式及实验结果如表1所示，每次免疫前采取小鼠静脉血，利用ELISA检测血清中抗体。用纯化的gE蛋白和重组gE-鞭毛素融合蛋白包被，加不同稀释度的免疫小鼠血清，二抗为HRP-IgG，ABTS显色后，经OD410nm测定中和抗体含量,生理盐水为阴性对照。
由表1实验结果可知：以重组单独的gE蛋白为抗原的免疫小鼠血清中和抗体滴度在免疫后3、5周分别为1:91，1:102；而以VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白为抗原的免疫小鼠血清中和抗体滴度在免疫后3、5周分别为1:216，1:267；可见以重组gE-鞭毛素融合蛋白为抗原的免疫小鼠可以明显产生更高滴度的中和抗体。
表1：小鼠实验抗体滴度(GMT)
单独的gE蛋白 重组gE-鞭毛素融合蛋白 阴性对照
免疫3周 1：91 1：216 0
免疫5周 1：102 1：267 0
综上，本发明提供的重组gE-鞭毛素融合蛋白可用于制备预防或治疗活体由于感染水痘病毒引起的机体反应的药物，尤其是人体。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉博沃生物科技有限公司
<120> VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白及其制备方法和应用
<130> 2017
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
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<223> VZV糖蛋白gE基因序列
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atggggacag ttaataaacc tgtggtgggg gtattgatgg ggttcggaat tatcacggga 60
acgttgcgta taacgaatcc ggtcagagca tccgtcttgc gatacgatga ttttcacatc 120
gatgaagaca aactggatac aaactccgta tatgagcctt actaccattc agatcatgcg 180
gagtcttcat gggtaaatcg gggagagtct tcgcgaaaag cgtacgatca taactcacct 240
tatatatggc cacgtaatga ttatgatgga tttttagaga acgcacacga acaccatggg 300
gtgtataatc agggccgtgg tatcgatagc ggggaacggt taatgcaacc cacacaaatg 360
tctgcacagg aggatcttgg ggacgatacg ggcatccacg ttatccctac gttaaacggc 420
gatgacagac ataaaattgt aaatgtggac caacgtcaat acggtgacgt gtttaaagga 480
gatcttaatc caaaacccca aggccaaaga ctcattgagg tgtcagtgga agaaaatcac 540
ccgtttactt tacgcgcacc gattcagcgg atttatggag tccggtacac cgagacttgg 600
agctttttgc cgtcattaac ctgtacggga gacgcagcgc ccgccatcca gcatatatgc 660
ttaaaacata caacatgctt tcaagacgtg gtggtggatg tggattgcgc ggaaaatact 720
aaagaggatc agttggccga aatcagttac cgttttcaag gtaagaagga agcggaccaa 780
ccgtggattg ttgtaaacac gagcacactg tttgatgaac tcgaattaga cccccccgag 840
attgaaccgg gtgtcttgaa agtacttcgg acagaaaaac aatacttggg tgtgtacatt 900
tggaacatgc gcggctccga tggtacgtct acctacgcca cgtttttggt cacctggaaa 960
ggggatgaaa aaacaagaaa ccctacgccc gcagtaactc ctcaaccaag aggggctgag 1020
tttcatatgt ggaattacca ctcgcatgta ttttcagttg gtgatacgtt tagcttggca 1080
atgcatcttc agtataagat acatgaagcg ccatttgatt tgctgttaga gtggttgtat 1140
gtccccatcg atcctacatg tcaaccaatg cggttatatt ctacgtgttt gtatcatccc 1200
aacgcacccc aatgcctctc tcatatgaat tccggttgta catttacctc gccacattta 1260
gcccagcgtg ttgcaagcac agtgtatcaa aattgtgaac atgcagataa ctacaccgca 1320
tattgtctgg gaatatctca tatggagcct agctttggtc taatcttaca cgacgggggc 1380
accacgttaa agtttgtaga tacacccgag agtttgtcgg gattatacgt ttttgtggtg 1440
tattttaacg ggcatgttga agccgtagca tacactgttg tatccacagt agatcatttt 1500
gtaaacgcaa ttgaagagcg tggatttccg ccaacggccg gtcagccacc ggcgactact 1560
aaacccaagg aaattacccc cgtaaacccc ggaacgtcac cacttatacg a 1611
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<212> Protein
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<223> VZV糖蛋白gE氨基酸序列
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esswvnrges srkaydhnsp yiwprndydg flenahehhg vynqgrgids gerlmqptqm 120
saqedlgddt gihviptlng ddrhkivnvd qrqygdvfkg dlnpkpqgqr lievsveenh 180
pftlrapiqr iygvrytetw sflpsltctg daapaiqhic lkhttcfqdv vvdvdcaent 240
kedqlaeisy rfqgkkeadq pwivvntstl fdeleldppe iepgvlkvlr tekqylgvyi 300
wnmrgsdgts tyatflvtwk gdektrnptp avtpqprgae fhmwnyhshv fsvgdtfsla 360
mhlqykihea pfdlllewly vpidptcqpm rlystclyhp napqclshmn sgctftsphl 420
aqrvastvyq ncehadnyta yclgishmep sfglilhdgg ttlkfvdtpe slsglyvfvv 480
yfnghveava ytvvstvdhf vnaieergfp ptagqppatt kpkeitpvnp gtsplir 537
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<212> DNA
<213> Salmonella
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<223> 沙门氏菌鞭毛素蛋白基因序列
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tcccagtccg cactgggcac tgctatcgag cgtttgtctt ccggtctgcg tatcaacagc 120
gcgaaagacg atgcggcagg acaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt 180
ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240
gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgcg 300
aatggtacta actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360
aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag 420
gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tattgattta 480
aaagaaatca gctctaaaac actgggactt gataagctta atgtccaaga tgcctacacc 540
ccgaaagaaa ctgctgtaac cgttgataaa actacctata aaaatggtac agatcctatt 600
acagcccaga gcaatactga tatccaaact gcaattggcg gtggtgcaac gggggttact 660
ggggctgata tcaaatttaa agatggtcaa tactatttag atgttaaagg cggtgcttct 720
gctggtgttt ataaagccac ttatgatgaa actacaaaga aagttaatat tgatacgact 780
gataaaactc cgttggcaac tgcggaagct acagctattc ggggaacggc cactataacc 840
cacaaccaaa ttgctgaagt aacaaaagag ggtgttgata cgaccacagt tgcggctcaa 900
cttgctgcag caggggttac tggcgccgat aaggacaata ctagccttgt aaaactatcg 960
tttgaggata aaaacggtaa ggttattgat ggtggctatg cagtgaaaat gggcgacgat 1020
ttctatgccg ctacatatga tgagaaaaca ggtgcaatta ctgctaaaac cactacttat 1080
acagatggta ctggcgttgc tcaaactgga gctgtgaaat ttggtggcgc aaatggtaaa 1140
tctgaagttg ttactgctac cgatggtaag acttacttag caagcgacct tgacaaacat 1200
aacttcagaa caggcggtga gcttaaagag gttaatacag ataagactga aaacccactg 1260
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cagaaccgtt tcaactccgc tatcaccaac ctgggcaata ccgtaaataa cctgtcttct 1380
gcccgtagcc gtatcgaaga ttccgactac gcaaccgaag tctccaacat gtctcgcgcg 1440
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neidrvsgqt qfngvkvlaq dntltiqvga ndgetididl keissktlgl dklnvqdayt 180
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hnfrtggelk evntdktenp lqkidaalaq vdtlrsdlga vqnrfnsait nlgntvnnls 60
sarsriedsd yatevsnmsr aqilqqagts vlaqanqvpq nvlsllr 107
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<212> Protein
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<223> 连接肽II氨基酸序列
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ggggsggggs gs 12
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<223> 融合蛋白基因序列
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gcgaaagacg atgcggcagg acaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt 180
ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240
gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgcg 300
aatggtacta actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360
aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag 420
gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tattgattta 480
aaagaaatca gctctaaaac actgggactt gataagctta atgtccaaga tgcctacacc 540
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ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctgga tcccataact tcagaacagg cggtgagctt 2280
aaagaggtta atacagataa gactgaaaac ccactgcaga aaattgatgc tgccttggca 2340
caggttgata cacttcgttc tgacctgggt gcggttcaga accgtttcaa ctccgctatc 2400
accaacctgg gcaataccgt aaataacctg tcttctgccc gtagccgtat cgaagattcc 2460
gactacgcaa ccgaagtctc caacatgtct cgcgcgcaga ttctgcagca ggccggtacc 2520
tccgttctgg cgcaggcgaa ccaggttccg caaaacgtcc tctctttact gcgt 2574
<210> 11
<211> 864
<212> Protein
<213> Unknown
<220>
<223> 融合蛋白氨基酸序列
<400> 11
maqvintnsl slltqnnlnk sqsalgtaie rlssglrins akddaagqai anrftanikg 60
ltqasrnand gisiaqtteg alneinnnlq rvrelavqsa ngtnsqsdld siqaeitqrl 120
neidrvsgqt qfngvkvlaq dntltiqvga ndgetididl keissktlgl dklnvqdayt 180
ggggsggggs asggggsggg gsmgtvnkpv vgvlmgfgii tgtlritnpv rasvlryddf 240
hidedkldtn svyepyyhsd haesswvnrg essrkaydhn spyiwprndy dgflenaheh 300
hgvynqgrgi dsgerlmqpt qmsaqedlgd dtgihviptl ngddrhkivn vdqrqygdvf 360
kgdlnpkpqg qrlievsvee nhpftlrapi qriygvryte twsflpsltc tgdaapaiqh 420
iclkhttcfq dvvvdvdcae ntkedqlaei syrfqgkkea dqpwivvnts tlfdeleldp 480
peiepgvlkv lrtekqylgv yiwnmrgsdg tstyatflvt wkgdektrnp tpavtpqprg 540
aefhmwnyhs hvfsvgdtfs lamhlqykih eapfdlllew lyvpidptcq pmrlystcly 600
hpnapqclsh mnsgctftsp hlaqrvastv yqncehadny tayclgishm epsfglilhd 660
ggttlkfvdt peslsglyvf vvyfnghvea vaytvvstvd hfvnaieerg fpptagqppa 720
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qvdtlrsdlg avqnrfnsai tnlgntvnnl ssarsrieds dyatevsnms raqilqqagt 840
svlaqanqvp qnvlsllrhh hhhh 864
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gE-F
<400> 12
ggaattcatg gggacagtta ataaacctgt 30
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gE-R
<400> 13
ttatcgtata agtggtgacg tt 22
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gE-F
<400> 14
ggaattcatg gggacagtta ataaacctgt 30
<210> 15
<211>
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gE-F-R（HIS）
<400> 15
ccgctcgagt tagtggtggt ggtggtggtg ttatcgtata agtggtgacg tt 52
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gE-F-（RH）-F
<400> 16
ggaattcatg gcacaagtca ttaataca 28
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gE-（RH）-R
<400> 17
ccgctcgagt taacgcagta aagagaggac gttttgc 37
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gE-F-（RH）-F
<400> 18
ggaattcatg gcacaagtca ttaataca 28
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> gE-F-（RH）-R（HIS）
<400> 19
ccgctcgagt tagtggtggt ggtggtggtg acg 33

Claims (10)

1.一种VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白至少包括鞭毛素蛋白的N端保守区、水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE和鞭毛素蛋白的C端保守区，其中：
所述融合蛋白的N端为鞭毛素蛋白的N端保守区的N端，所述融合蛋白的C端为鞭毛素蛋白的C端保守区的C端；
所述鞭毛素蛋白的N端保守区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，鞭毛素蛋白的C端保守区的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示，所述水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白，其特征在于：编码所述水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1所述的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白，其特征在于：鞭毛素蛋白的N端保守区的N端为所述融合蛋白的N端，鞭毛素蛋白的C端保守区的C端为所述融合蛋白的C端，水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE通过连接肽连接鞭毛素蛋白的N端保守区和鞭毛素蛋白的C端保守区。
4.如权利要求3所述的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白N端保守区与水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE通过连接肽I连接，C端保守区与水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白gE通过连接肽II连接，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示。
5.如权利要求4所述的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白，其特征在于：表达如序列表SEQ IDNO:11所示的融合蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示。
6.制备根据权利要求1～5任一所述的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、设计引物，扩增VZV糖蛋白gE基因序列的引物序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示，扩增带组氨酸标签VZV糖蛋白gE基因序列的引物序列如SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示，扩增gE-鞭毛素融合基因序列的引物序列如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示，扩增带组氨酸标签的gE-鞭毛素融合基因序列的引物列如SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示，分别扩增VZV糖蛋白gE基因序列、沙门氏菌鞭毛素蛋白基因片段，并用融合PCR方法在基因末端添加HIS标签，目的基因拼接后，构建pET28a载体；
S2、将构建的pET28a-gE-鞭毛素转化至表达菌株BL21中，IPTG诱导，获得融合蛋白，收集菌体；
S3、大量诱导pET28a-gE-鞭毛素/BL21，破碎收集沉淀，用包涵体洗涤液重悬，离心；
S4、裂解缓冲液重悬沉淀，融合蛋白gE-鞭毛素经变性、复性及纯化步骤后，得到纯化后的gE-鞭毛素蛋白。
7.根据权利要求6所述的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的制备方法，其特征在于，S3具体为：沉淀用包涵体洗涤液I重悬后于离心；沉淀再以包涵体洗涤液II重悬，冷藏放置后离心；沉淀用包涵体洗涤液III重悬，室温放置后离心；沉淀用Lysis buffer重悬。
8.根据权利要求6所述的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白的制备方法，其特征在于：S3步骤中的包涵体洗涤液I具体为50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM EDTA及1mM PMSF；沉淀再以包涵体洗涤液II具体为2M尿素；沉淀用包涵体洗涤液III具体为50mM Tris-HCl、0.5％TritonX-100(v/v)、5mM EDTA及1mM PMSF；裂解缓冲液具体为Lysis buffer具体为100mMNaH2PO4、10mM Tris-HCl及8M urea，pH8.0。
9.一种免疫组合物，其特征在于：所述免疫组合物包括权利要求1～8任一所述的融合蛋白。
10.一种VZV疫苗，其特征在于：包括权利要求1～9任一所述的VZV重组gE-鞭毛素融合蛋白。
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