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CN116536284B - Mccp pdhC单克隆抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒 - Google Patents

Mccp pdhC单克隆抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒 Download PDF

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CN116536284B CN202310461674.0A CN202310461674A CN116536284B CN 116536284 B CN116536284 B CN 116536284B CN 202310461674 A CN202310461674 A CN 202310461674A CN 116536284 B CN116536284 B CN 116536284B
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Abstract

本发明属于血清学检测技术领域，公开了一种MccppdhC单克隆抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒，尤其涉及一种MccppdhC重组蛋白、特异性识别山羊支原体山羊肺炎亚种pdhC的单克隆抗体、分泌特异性识别MccppdhC单克隆抗体的杂交瘤细胞株Mccp‑H6以及利用MccppdhC重组蛋白和特异性识别Mccp pdhC的单克隆抗体制备的检测Mccp抗体的竞争ELISA试剂盒。本发明的Mccp pdhC单克隆抗体与山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体均不发生反应，保证反应特异性，比检测Mccp抗体的间接血凝试剂盒具有更高的特异性和敏感性，避免样本来源的种属限制。

Description

Mccp pdhC单克隆抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒
技术领域
本发明属于血清学检测技术领域，尤其涉及一种山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶(pdhC)单克隆抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒。
背景技术
目前，山羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprinepleuropneumonia，CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae，Mccp)引起的一类严重呼吸道疫病，主要危害山羊和一些野生羊，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病之一。超急性病例出现轻微症状后1～3d死亡；急性病例表现为高烧(41～43℃)，剧烈频繁的咳嗽，一般在7～10d内死亡。新发疫区发病率达60％，死亡率90％。老疫区常呈慢性发病经过，主要表现为长期咳嗽和消瘦。急性和亚急性疾病剖检变化特征是单边浆液纤维素性胸膜肺炎并伴有严重的胸腔积液。CCPP流行区域横跨亚洲、中东、非洲40多个国家，主要表现为呼吸系统症状，与小反刍兽疫、巴氏杆菌病以及绵羊肺炎支原体羊肺炎等多种疫病症状相似，且临床表现多样、复杂，需要通过实验室诊断才能确诊。
Mccp属于丝状支原体簇，该簇还包括山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种、丝状支原体丝状亚种、李奇氏支原体，其中Mccp、山羊支原体山羊亚种和丝状支原体山羊亚种是羊源支原体，丝状支原体丝状亚种和李奇氏支原体是牛源支原体。该簇各成员间具较高的基因组学一致性，容易产生血清学交叉反应。另外，Mccp与感染山羊的绵羊肺炎支原体之间也存在一定的血清学交叉反应。
准确诊断一直是CCPP防控的关键技术难题之一，养羊业亟需特异、敏感的诊断方法。挖掘Mccp特异性诊断分子，进而建立准确、有效的诊断方法来研发诊断试剂，是有效防控CCPP的技术支撑条件之一。目前，我国实现商业化的血清学检测技术为间接血凝(IHA)试剂盒，该试剂盒用纯化的Mccp胞外多糖作为抗原，致敏绵羊红细胞，制备成间接血凝抗原，用来检测血清抗体。该试剂盒操作简便，价格低廉，但由于载体红细胞供体个体及制备批次的差异，对其批次稳定性有一定影响，导致不同批次试剂之间的特异性和敏感性存在缺陷；并且，IHA试剂盒与山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种的阳性血清有程度不一的交叉反应。为克服上述技术缺陷，亟需设计一种基于特异性抗原靶标的血清学技术，以期实现对Mccp的特异性、敏感性的血清学检测和诊断。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：由于间接血凝(IHA)试剂盒载体红细胞供体个体以及制备批次的差异，对IHA试剂盒批次稳定性有一定影响，导致不同批次试剂之间的特异性和敏感性存在缺陷；并且，IHA试剂盒与山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种的阳性血清有程度不一的交叉反应。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种Mccp pdhC单克隆抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒，尤其涉及一种特异性识别山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶(pdhC)的单克隆抗体、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株Mccp-H6，以及利用MccppdhC重组蛋白和Mccp-H6杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体制备的检测Mccp抗体的竞争ELISA试剂盒。
本发明是这样实现的，一种Mccp pdhC重组蛋白的制备方法，Mccp pdhC重组蛋白的制备方法包括：在NCBI上获取Mccp pdhC基因序列，标记为S1；将Mccp pdhC基因序列中的TGA突变为TGG，优化密码子序列，标记为S2；合成S2基因序列，利用BamHI和XhoI限制性内切酶克隆进pET-28a质粒，阳性重组质粒转化进感受态大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组表达菌BL21-28a-pdhC；将BL21-28a-pdhC重组表达菌株在37℃，200r/min的条件下培养至OD600值为0.6～0.8，利用0.1mM IPTG诱导6h，得到可溶性表达的Mccp pdhC重组蛋白；利用Ni-NTAAgarose柱进行纯化，得到纯化的Mccp pdhC重组蛋白。
进一步，Mccp pdhC基因序列登录号为JMJI01000040.1，Mccp pdhC基因位于4889bp～6205bp，基因序列全长为1317bp，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
进一步，S2的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述Mccp pdhC重组蛋白的制备方法，以及制备得到的Mccp pdhC重组蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述Mccp pdhC重组蛋白的特异性识别MccppdhC的杂交瘤细胞株，特异性识别Mccp pdhC的杂交瘤细胞株的筛选方法包括：将MccppdhC重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比混合，对BALB/c雌性小鼠进行第一次免疫；后续每间隔2周进行一次免疫，共免疫4次；第4次免疫后2周采集小鼠的血清，利用MccppdhC重组蛋白作为抗原，间接ELISA检测小鼠血清的效价，以P/N≥2.1判定为阳性，效价达到1:50000以上免疫合格；获取免疫合格的小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，融合比为5:1，筛选融合成功并分泌特异性Mccp pdhC的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
进一步，第2～4次免疫所使用的佐剂为弗氏不完全佐剂，Mccp pdhC重组蛋白与弗氏不完全佐剂的体积比为1:1，抗原剂量均为100μg/只/次。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述特异性识别Mccp pdhC的杂交瘤细胞株的筛选方法筛选得到的特异性识别Mccp pdhC的杂交瘤细胞株，特异性识别Mccp pdhC的杂交瘤细胞株命名为Mccp-H6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202333。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述特异性识别Mccp pdhC的杂交瘤细胞株的特异性识别Mccp pdhC的单克隆抗体制备方法，特异性识别Mccp pdhC的单克隆抗体制备方法包括：将特异性识别Mccp pdhC的杂交瘤细胞株Mccp-H6接种于BALB/c雌性小鼠腹腔；获取小鼠腹水，离心，收集中间层淡黄色腹水，纯化后获得特异性识别Mccp pdhC的单克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述特异性识别Mccp pdhC的单克隆抗体制备方法制备得到的特异性识别Mccp pdhC的单克隆抗体，特异性识别Mccp pdhC的单克隆抗体与Mccp pdhC蛋白特异性结合，并与Mccp阳性血清竞争性结合pdhC蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述Mccp pdhC重组蛋白和特异性识别MccppdhC的单克隆抗体制备得到的检测Mccp抗体的竞争ELISA试剂盒，检测Mccp抗体的竞争ELISA试剂盒包括：
(1)包被Mccp pdhC重组蛋白的酶标板2块，规格96孔/块，4℃保存；
(2)25倍PBST浓缩液1瓶，规格60mL/瓶；
(3)标准阳性血清1管，规格0.6mL/管，4℃保存；
(4)标准阴性血清1管，规格0.6mL/管，4℃保存；
(5)鼠单克隆抗体工作液1瓶(12mL/瓶)，4℃保存；
(6)HRP标记羊抗鼠二抗工作液1瓶(25mL/瓶)，4℃保存；
(7)TMB底物显色液1瓶(25mL/瓶)，4℃保存；
(8)终止液1瓶(15mL/瓶)，4℃保存；
(9)封板膜2张；
(10)说明书1份。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明的优越性包括以下方面：
1.以可溶性表达的Mccp pdhC蛋白作为抗原，免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，筛选得到分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株AtF8，保藏编号为CCTCCNO:C202333。
2.将CCTCC NO:C202333细胞株接种小鼠腹腔，收集小鼠腹水纯化抗体，得到纯化的与Mccp pdhC特异性结合的单克隆抗体，该抗体与山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体均不发生反应，保证反应特异性。
3.本发明涉及的试剂盒以Mccp pdhC作为抗原，以制备的特异性单克隆抗体作为竞争抗体，制备Mccp竞争ELISA抗体检测试剂盒，比目前用于检测Mccp血清抗体的间接血凝试剂盒具有更高的特异性和敏感性。
4.本发明涉及的试剂盒应用Mccp pdhC重组蛋白的单克隆抗体作为竞争抗体，可以检测多种动物来源的血清抗体，避免了样本来源的种属限制。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明制备得到的特异性识别Mccp pdhC的单克隆抗体可以与Mccp pdhC蛋白特异性结合，并且还可以与Mccp阳性血清竞争性结合pdhC蛋白。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
开发成商业化的Mccp竞争ELISA抗体检测试剂盒，可对目前养羊业中使用的Mccp灭活疫苗的免疫效果进行评价，也可对未免疫Mccp疫苗的羊进行血清学调查。目前养羊业中亟需该产品，实现商业化后预计销售额为150万元/年。
(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
本发明应用竞争ELISA技术，并组装试剂盒。试剂盒中以鼠源单克隆抗体作为竞争抗体，该单克隆抗体与Mccp pdhC发生特异性反应，而与山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种以及绵羊肺炎支原体均不发生反应，具有非常好的特异性。目前国内还没有相关的产品，填补了国内的技术空白。
(3)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
敏感性、特异性检测Mccp血清抗体的诊断试剂一直是养羊业中亟需的产品，但目前国内没有理想的相关产品实现商业化。本发明的技术方案解决了养羊业生产中一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题。
(4)本发明的技术方案克服了技术偏见：
本发明的技术方案为竞争ELISA技术，以鼠源单克隆抗体作为竞争抗体，易于大量制备和生产。该技术可实现高通量检测，相关专业人员根据说明书就可操作，具有普遍性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的基于Mccp pdhC重组蛋白的鼠单克隆抗体制备方法流程图；
图2是本发明实施例提供的利用SDS-PAGE鉴定Mccp pdhC重组蛋白纯化的示意图；M：PM2510相对分子质量标准；1～9：破碎上清、流穿液、10mM咪唑洗脱液、20mM咪唑洗脱液、50mM咪唑洗脱液、100mM咪唑洗脱液、200mM咪唑洗脱液、500mM咪唑洗脱液、1M咪唑洗脱液；
图3是本发明实施例提供的Mccp pdhC重组蛋白单克隆抗体的纯化示意图；
图中：M、蛋白Marker相对分子质量标准；1、纯化的pdhC重组蛋白单克隆抗体。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种Mccp pdhC单克隆抗体、杂交瘤细胞株及试剂盒，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供了一种特异性识别Mccp pdhC的单克隆抗体，以及分泌这种单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株命名为杂交瘤细胞株Mccp-H6，Hybridoma cell lineMccp-H6，于2023年2月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C202333；该培养物已于2023年3月15日由本保藏中心收到，并登记入册。根据您(们)的请求，由该日起保存三十年，在期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五年。该培养物的存活性本保藏中心于2023年3月20日检测完毕，结果为存活。
本发明实施例提供的制备Mccp pdhC重组蛋白的方法包括：在NCBI上获取MccppdhC基因序列，基因序列登录号为JMJI01000040.1，pdhC基因位于4889～6205bp，基因序列全长为1317bp，标记为S1。将Mccp pdhC基因序列中的TGA突变为TGG，优化密码子序列，标记为S2。由武汉金开瑞生物工程有限公司合成S2基因序列，利用BamHI和XhoI限制性内切酶克隆进pET-28a质粒，阳性重组质粒转化进感受态大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组表达菌BL21-28a-pdhC。将BL21-28a-pdhC菌株在37℃，200r/min培养至OD600值为0.6～0.8，用0.1mMIPTG诱导6h，得到可溶性表达的pdhC重组蛋白，用Ni-NTA Agarose柱进行纯化，得到纯化的pdhC重组蛋白；经灰度扫描分析，纯度在90％以上。
如图1所示，本发明实施例提供的基于Mccp pdhC重组蛋白的鼠单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
S101，选择6～8周龄的BALB/c雌性小鼠5只，pdhC重组蛋白与弗氏完全佐剂1:1混合，进行第一次免疫；
S102，后续每间隔2周进行一次免疫，pdhC重组蛋白与弗氏不完全佐剂的体积比为1:1；共免疫4次，抗原剂量均为100μg/只/次；
S103，第4次免疫后2周采集小鼠血清，用pdhC重组蛋白作为抗原，间接ELISA检测小鼠血清效价，P/N≥2.1判定为阳性，效价达1:50000以上免疫合格；
S104，取免疫合格的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，融合比例为5:1，筛选融合成功的杂交瘤细胞株，并筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明筛选到的一株特异性识别Mccp pdhC的杂交瘤细胞株命名为Mccp-H6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202333。
本发明实施例还提供一种Mccp pdhC单克隆抗体的制备方法，首先向小鼠腹腔注射液体石蜡，1～2周后，将特异性识别Mccp pdhC的CCTCC NO:C202333细胞株接种到BALB/c雌性小鼠的腹腔，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，离心，收集中间层淡黄色腹水，纯化后获得单克隆抗体。该单克隆抗体可以与Mccp pdhC蛋白特异性结合，并且可以与Mccp阳性血清竞争性结合pdhC蛋白。
本发明实施例同时提供一种利用pdhC重组蛋白及其单克隆抗体制备竞争ELISA抗体检测试剂盒的方法以及用前述方法制备的试剂盒，该试剂盒包括：
(1)包被Mccp pdhC重组蛋白的酶标板2块(96孔/块)，4℃保存；
(2)25倍PBST浓缩液1瓶(60mL/瓶)；
(3)标准阳性血清1管(0.6mL/管)，4℃保存；
(4)标准阴性血清1管(0.6mL/管)，4℃保存；
(5)鼠单克隆抗体工作液1瓶(12mL/瓶)，4℃保存；
(6)HRP标记羊抗鼠二抗工作液1瓶(25mL/瓶)，4℃保存；
(7)TMB底物显色液1瓶(25mL/瓶)，4℃保存；
(8)终止液1瓶(15mL/瓶)，4℃保存；
(9)封板膜2张；
(10)说明书1份。
(一)Mccp pdhC抗原制备
首先利用Pull-down和LC-MS技术筛选特异性抗原靶标。根据Protein G试剂盒说明书，先将Mccp阴性血清吸附到磁珠上，该磁珠分别与Mccp F38、1801和1601菌株破碎后的上清共孵育，然后取上清，此步骤可最大限度淘汰掉与阴性血清结合的非特异性抗原。将获取的上清与结合了Mccp阳性血清的磁珠在4℃过夜孵育，经washingbuffer洗杂后，取磁珠送样进行LC-MS分析，筛选出种内高保守，种间特异且可信值高的靶标蛋白。结合LC-MS提供的Peptides、PSMs、Unique Peptides、Area以及Score Sequest HT这五个方面进行综合筛选，匹配到的肽段越多，Unique Peptides越多，信号及打分越高则越可信。通过对以上五个方面的综合排名，Mccp pdhC排名第一，确定为靶标蛋白。
在NCBI上获取Mccp pdhC基因序列，基因序列登录号为JFAD01000018.1，pdhC基因位于4889bp～6205bp，基因序列全长为1317bp，标记为S1。将Mccp pdhC基因序列中的TGA突变为TGG，优化密码子序列，标记为S2。由武汉金开瑞生物工程有限公司合成S2基因序列，利用BamHI和XhoI限制性内切酶克隆进pET-28a质粒，阳性重组质粒转化进感受态大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组表达菌BL21-28a-pdhC。将BL21-28a-pdhC菌株在37℃，200r/min培养至OD600值为0.6～0.8，用0.1mM IPTG诱导6h。诱导后的菌液离心沉淀，用pH 7.4PBS洗涤沉淀、重悬，然后超声波破碎菌体，再离心，取上清，得到可溶性表达的pdhC重组蛋白，用Ni-NTAAgarose柱进行纯化，得到纯化的pdhC重组蛋白；经灰度扫描分析，纯度在90％以上。
其中，S1的核苷酸序列为：
atgttcaaagttaaatttgctgacataggtgaaggtctaacagaaggaacagtcgctgaagttttagttaaagttggtgatgttgttaaagaaggacaatcattatactttgttgaaactgataaagtaaatagtgaaatacctgctccagtggctggaaaaattgcagtaattaacattaaagctggacaagaaattaaagttggagatgtagtaatggaaattgaagatggatcaggtgcatctgcaactagtgaaccaaaagctgaagctaaatcagaagctaaagttgaagtagttgaagaaaatgctagtgtagttggtgctactccagtttcaaatgatgtaattgttagaaaacaaacaactacagttaataaatcaagtgctattaaagctacacctttagcaagaaaagttgctgctgatttaaatattgatttatctttagttactccaactggaccaaatcaaagaattttagttgctgatattaaaaatcatcaagcttcatcaactcaatcagctagtcaaccaattagtcaaccagctccaactccaagtccatctgctcatcaaacaattgctccaacaattaaagttgttgagccaagtacacctttatcttgagatgaagttccaatgaatggtgttagaaaagctaca gtaaaagcaatgacaaaatcacatactgaaattgctgcatttactggtatgaaaaacactgacattactgaaactcacaaaatgagaactgaattaaaagatcatgctgcagctagtggaattaaattaacttacttagcatttattattaaagctgttgctaaatcattacgtgatatgccaaatattaatgtaagaggtgattttgcaaataacaaaatccaatttatgcacaacattaatattggaattgcagtagatacaccaaacggattaatggttccagttattaaaggtgctgatcatttaagtgtatttgaaattgcaattaaaattagtgaactagcaaataaggctaaagatggtaaattaacaagagctgaaatgactgaagcaacatttactgtttcaaactttggttcagtaggattagattatgctactcctattattaactcgccagagtctgctattttaggagttggtacaatgtctcaaactcctttatatattaatggtgaattacaaaaaagatttataatgccattatcaatgacttgcgatcatagaatcattgatggtgctgatgctggaagatttttaattaaagtacaagattacttatcaaaaccagttttattgtttatgtaa
S2的核苷酸序列为：
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(二)Mccp pdhC单克隆抗体的制备
选择6～8周龄的BALB/c雌性小鼠5只，pdhC重组蛋白与弗氏完全佐剂1:1混合，进行第一次免疫；后续每间隔2周进行一次免疫，所用的佐剂为弗氏不完全佐剂，pdhC重组蛋白与弗氏不完全佐剂的体积比为1:1；共免疫4次，抗原剂量均为100μg/只/次。第4次免疫后2周采集小鼠的血清，用pdhC重组蛋白作为抗原，间接ELISA检测小鼠血清的效价，以P/N≥2.1判定为阳性，效价达到1:50000以上免疫合格。取免疫合格的小鼠的脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，融合比例为5:1，分别在融合后的第7天和第10天对融合后的细胞进行半换液和全换液。在全换液后的第三天，用间接ELISA方法筛选可分泌抗Mccp pdhC蛋白抗体的杂交瘤细胞。对在第一次筛得的阳性孔全换液，进行第二次筛选。将第二次筛选仍为阳性的孔扩大培养并进行冻存，同时连续进行3～5次亚克隆，直至阳性率为100％，并将阳性细胞株冻存于液氮罐。
向BALB/C小鼠腹腔注射1mL高压灭菌的液体石蜡致敏，7天后腹腔注射1.0×106个长势良好的阳性杂交瘤细胞。每天观察小鼠腹腔变化，待其胀至行动不便时，进行腹水采集。所得腹水经TherMccp的ProteinA/G纯化柱纯化后，进行SDS-PAGE观察纯度，并测定浓度，-80℃保存备用。本发明实施例提供的利用SDS-PAGE鉴定Mccp pdhC重组蛋白表达和纯化示意图如图2所示；本发明实施例提供的Mccp pdhC重组蛋白单克隆抗体的纯化如图3所示，M为蛋白Marker相对分子质量标准，1为纯化的pdhC重组蛋白单克隆抗体。
(三)Mccp pdhC竞争ELISA抗体检测方法的建立
经棋盘滴定试验，确定Mccp pdhC重组蛋白的最佳包被浓度为1μg/mL，100μL/孔；血清为原倍，50μL/孔；单克隆抗体的稀释倍数为1:12800，50μL/孔，孵育时间30min；HRP标记羊抗鼠抗体的稀释倍数为1:20000，100μL/孔，孵育时间30min。底物溶液TMB为100μL/孔，孵育时间15min；终止液为50μL/孔，加入后立即检测OD450值。
抗原的包被程序为：将-75℃冻存的抗原融化，用pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，转入4℃过夜。次日甩掉抗原液，洗涤后以5％BSA封闭，100μL/孔，37℃温育30min，再洗涤。然后加入蛋白稳定剂，100μL/孔，室温孵育10min，甩干，在超净台内吹1h。最后放入包装袋内，抽成真空。
本发明涉及的试剂盒中的标准阳性血清的制备方法是：选择1岁龄左右的山羊，用灭活的Mccp 1601株与弗氏完全佐剂1:1混合，进行第一次免疫；间隔2周后，用灭活的Mccp1601株与弗氏不完全佐剂1:1混合，进行第二次免疫；再间隔2周后，用灭活的Mccp 1601株与弗氏不完全佐剂1:1混合，进行第三次免疫；免疫抗原剂量均为500μg/只/次。阴性血清为既没有免疫过Mccp疫苗，又没有感染过Mccp的健康绵羊血清。
本发明的检测试剂盒中的HRP标记羊抗鼠抗体购买于Sigma公司；单克隆抗体稀释液、酶标抗体稀释液、TMB显色液、终止液、50倍浓缩洗涤液均购自于中国农业科学院兰州兽研生物有限公司。
(四)Mccp pdhC竞争ELISA抗体检测试剂盒
各种试剂完备后组装成检测Mccp pdhC血清抗体的竞争ELISA试剂盒。建议试剂盒中包括：包被Mccp pdhC重组抗原的酶标板2块(96孔/块)；25倍PBST浓缩液1瓶(60mL/瓶)；标准阳性血清1管(0.6mL/管)；标准阴性血清1管(0.6mL/管)；单克隆抗体工作液1瓶(25mL/瓶)；HRP标记羊抗鼠二抗工作液1瓶(25mL/瓶)；TMB底物显色液1瓶(25mL/瓶)；终止液1瓶(15mL/瓶)；封板膜2张；说明书1份。试剂盒4℃保存，保存期为6个月。试剂盒可检测180份血清。
(五)试剂盒的使用方法示例
1.将试剂盒从4℃冰箱中取出，平衡至室温。用双蒸水将25倍洗涤液稀释至1倍使用浓度。
2.取出酶标板，按待检血清的数量确定需要的酶标板条，剩余的板条放入包装袋中，4℃保存。拆封的酶标板最好在10天内用完。
3.加样：标准阳性血清、标准阴性血清各2孔，50μL/孔；待检血清样品加1孔，50μL/孔。
4.加入单克隆抗体工作液，50μL/孔。
5.温育：用封板膜封住酶标板，放入37℃温箱中孵育30min。
6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去。如此重复4次，拍干。
7.加入HRP标记羊抗鼠二抗工作液，100μL/孔。
8.温育：操作同5。
9.洗涤：操作同6。
10.显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色5min。
11.终止：加入终止液，50μL/孔。
12.测定：立即用酶标仪在450nm波长下测量各孔的吸光度(OD450值)。
13.结果判定
①计算同一酶标板上阳性、阴性血清对照孔和每份待检血清孔的OD450值，根据以下公式计算标准阳性、阴性血清及待检血清的抑制率(PI)。PI＝(1-样品OD450平均值/标准阴性血清OD450平均值)×100％。
②标准阳性血清的PI>70％，标准阴性血清的OD450>1.0，试验成立，否则该次试验结果无效。
③待测血清样本，PI≥50％，为阳性；PI<50％，为阴性。
为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
与间接血凝试剂盒相比，本发明的技术方案在检测Mccp血清抗体时具有更高的敏感性和特异性，应用实施例如下：
敏感性：选择6月龄左右的山羊2只，用灭活的Mccp M1601株与弗氏完全佐剂1:1混合，进行免疫，抗原剂量为500μg/只。免疫2周后采集血清，每间隔1周采集1次，共采集3次。用间接血凝试剂盒和本发明中的竞争ELISA技术分别检测上述血清样品，结果显示：3次采集的血清，竞争ELISA技术均检测为阳性；间接血凝试剂盒仅对第一次采集的血清检测为阳性，血清效价为1:8，对第二次和第三次采集的血清检测结果均为阴性，说明本发明的竞争ELISA技术敏感性高于间接血凝试剂盒。
特异性：选择6月龄左右的山羊6只，随机分为3组，2只/组，每组羊分别免疫山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体，免疫抗原剂量为500μg/只/次。免疫方式为：用灭活的菌株与弗氏完全佐剂1:1混合，进行免疫；间隔2周后采集血清，每间隔1周采集1次，共采集3次。用间接血凝试剂盒和本发明中的竞争ELISA技术分别检测上述血清样品，结果显示：3次采集的血清，竞争ELISA技术均检测为阴性；间接血凝试剂盒对第一次采集的血清检测结果为阳性，血清效价为1:8，对第二次和第三次采集的血清检测结果为阴性，说明本发明的竞争ELISA技术特异性高于间接血凝试剂盒。
本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
(一)试剂盒的敏感性
经间接血凝试剂盒检测抗体效价为1:16的Mccp阳性血清，将其作1:10、1:20、1:40、1:80共4个稀释度，用本发明中的试剂盒检测每个稀释梯度的样品，检验试剂盒能检测出的最低抗体效价。结果表明，将阳性血清稀释至1:40时仍可检测出阳性，说明试剂盒有较高的敏感性。
(二)试剂盒的特异性
用试剂盒检测丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体的阳性血清、绵羊肺炎支原体，以及大肠杆菌、沙门氏菌的阳性血清，结果均为阴性，说明该试剂盒所用的pdhC抗原与感染山羊的其他支原体以及常见细菌(大肠杆菌和沙门氏菌)的阳性血清之间不存在交叉反应，试剂盒有良好的特异性。
(三)试剂盒的重复性
取26份Mccp阳性血清和26份阴性血清，用同批次试剂盒在不同时间相同条件下重复检测三次，判定结果完全相同；用3批次试剂盒检测上述血清，判定结果完全相同；这些结果说明试剂盒重复性较好。
(四)试剂盒的符合率
经间接血凝试剂盒鉴定的80份阳性血清和60份阴性血清，用试剂盒进行检测，验证该试剂盒与间接血凝试剂盒的符合率。结果表明，试剂盒与间接血凝试剂盒的符合率为90.7％(127/140)。
(五)试剂盒的保存期
用同批次制备的试剂盒每间隔2周检测相同的15份阳性血清和15份阴性血清。结果表明，保存6个月的试剂盒对同一份血清的检测结果相同，说明试剂盒的保存期至少为6个月。
(六)试剂盒检测田间血清样品
利用本发明中的试剂盒检测了采自10个养殖场的山羊血清共300份，检测结果如表1所示。
表1本发明的试剂盒与间接血凝试剂盒检测田间血清样品
由检测结果可知，用本发明中的试剂盒和间接血凝试剂盒分别检测上述300份田间血清，两种方法的符合率为91.3％(105+169/300)，说明本发明涉及的试剂盒完全可以代替间接血凝试剂盒检测Mccp血清抗体，在生产中推广应用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种由MccppdhC重组蛋白和特异性识别MccppdhC的单克隆抗体制备得到的检测Mccp抗体的竞争ELISA试剂盒，其特征在于，检测Mccp抗体的竞争ELISA试剂盒包括：
(1)包被MccppdhC重组蛋白的酶标板2块，规格96孔/块，4℃保存；
(2)25倍PBST浓缩液1瓶，规格60mL/瓶；
(3)标准阳性血清1管，规格0.6mL/管，4℃保存；
(4)标准阴性血清1管，规格0.6mL/管，4℃保存；
(5)兔多克隆抗体工作液1瓶，规格12mL/瓶，4℃保存；
(6)HRP标记驴抗兔二抗工作液1瓶，规格25mL/瓶，4℃保存；
(7)TMB底物显色液1瓶，规格25mL/瓶，4℃保存；
(8)终止液1瓶，规格15mL/瓶，4℃保存；
(9)封板膜2张；
(10)说明书1份；
MccppdhC重组蛋白的制备方法包括：在NCBI上获取MccppdhC基因序列，标记为S1；将MccppdhC基因序列中的TGA突变为TGG，优化密码子序列，标记为S2；合成S2基因序列，利用BamHI和XhoI限制性内切酶克隆进pET-28a质粒，阳性重组质粒转化进感受态大肠杆菌BL21，得到重组表达菌BL21-28a-pdhC；将BL21-28a-pdhC重组表达菌株在37℃，200r/min的条件下培养至OD 600 值为0.6～0.8，利用0.1mMIPTG诱导6h，得到可溶性表达的MccppdhC重组蛋白；利用Ni-NTAAgarose柱进行纯化，得到纯化的MccppdhC重组蛋白；
S2的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
MccppdhC基因序列登录号为JMJI01000040.1，MccppdhC基因位于4889～6205bp，基因序列全长为1317bp，核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
特异性识别Mccp pdhC的单克隆抗体制备方法包括：将特异性识别MccppdhC的杂交瘤细胞株Mccp-H6接种于BALB/c雌性小鼠腹腔；获取小鼠腹水，离心，收集中间层淡黄色腹水，纯化后获得特异性识别MccppdhC的单克隆抗体；
所述杂交瘤细胞株Mccp-H6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C202333。
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