CN116421592A - 视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用，属于生物技术领域。本发明首次发现视黄酸能够部分逆转化疗药物多柔比星导致PI3K/Akt过度激活和DNA损伤，减少多柔比星导致卵泡凋亡的数量。小鼠体内腹腔注射视黄酸同样能够部分逆转多柔比星导致的卵泡凋亡。视黄酸作为一种身体必需的营养元素，可以用于口服，具有良好的应用前景。

Description

视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用。

背景技术

癌症是公认的全球公共卫生问题。随着早期诊断技术和治疗方法的进步，辅助化疗的使用提高了癌症患者总体生存率和无病生存率。然而化疗会带来短期和长期后遗症。由于卵巢中的卵母细胞不可再生，女性卵巢储备对化疗十分敏感，90％以上女性患者在化疗后会发生不同程度的卵巢功能衰竭。目前这类患者激增且年轻化，治疗后生存率高，特别是重型再生障碍性贫血(简称重型再障，SAA)、地中海贫血等非恶性血液系统疾病，治愈率超过85％。她们在治愈后迫切希望能够恢复卵巢功能及生育力，提高自身生活质量、维护家庭稳定。目前针对这类年轻女性癌症患者的生育力保存需要通过卵巢组织冷冻保存，然后在化疗结束后择期移植回体内。该方案需要手术、增加DNA损伤的风险。因此，筛选能够在化疗的同时在体保护患者卵巢功能的口服药物变得越来越紧迫。

女性在出生时就已经建立不可再生的原始卵泡库，作为决定未来女性生殖潜力的卵巢储备。许多生长因子、细胞因子和蛋白质激酶参与调节原始卵泡的激活。前颗粒细胞中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号的激活可以增加KIT配体(KITL)的分泌。KITL与卵母细胞表面的KIT结合，激活卵母细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号，然后磷酸化叉头盒O3a(FOXO3a)，使其转运出细胞核，解除其对卵母细胞生长的抑制，卵泡开始生长。化疗药物可以通过直接损伤卵母细胞和颗粒细胞DNA使卵泡闭锁，或间接通过上调Akt磷酸化水平使原始卵泡加速耗竭，最终使卵巢储备损失，卵巢功能下降。动物研究显示，腹腔注射槲皮素能通过抑制PI3K/Akt/FOXO3a通路来减少环磷酰胺诱导的原始卵泡丢失。腹腔注射白藜芦醇可以恢复多柔比星处理后的原始卵泡数目并减少窦前卵泡和早期窦卵泡的DNA损伤和凋亡，从而其起到保护卵巢的作用。由此可见，抑制Akt磷酸化、降低卵巢DNA损伤有利于避免化疗药物对卵巢储备功能的损伤。但是目前还缺乏有效的口服药物来防止化疗对卵巢功能的损伤。

视黄酸(retinoic acid,RA)是脂溶性维生素A(视黄醇)的生物活性衍生物。视黄酸在组织中的分布和水平受到严格控制，由特定视黄醇和视黄醛脱氢酶负责调控合成，细胞色素P450 26亚家族(CYP26s)负责降解，从而维持视黄酸在体内的稳态。既往研究表明，视黄酸在雌性生殖系统中发挥了重要作用，如启动胚胎时期生殖细胞减数分裂、调节卵泡生长发育、调节胚胎期苗勒管的发育和调控妊娠期子宫内膜的容受性等。此外，在一项研究中发现视黄酸通过与Toll样受体9配体结合，能够阻止自发的、辐射性的以及多柔比星介导的人类B细胞凋亡。这些研究表明视黄酸在女性生殖系统疾病以及抗凋亡方面的的潜在应用价值，但是未见其在防止化疗药物损伤卵巢功能的应用的报道。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用。

进一步地，所述的卵巢功能保护药物为预防和/或治疗卵巢功能损伤的药物。

进一步地，所述的卵巢损伤包括医源性卵巢功能损伤。

进一步地，所述的医源性卵巢损伤包括由化疗引起的卵巢功能损伤。

进一步地，所述的化疗的药物包括多柔比星。

进一步地，所述的卵巢功能保护药物具有逆转或部分逆转PI3K/Akt过度激活、DNA损伤和减少卵泡凋亡的作用。

进一步地，所述的视黄酸包括视黄酸和视黄酸在药学上可接受的盐。

进一步地，所述的卵巢功能保护药物还包含药学上可接受的载体。

进一步地，所述的卵巢功能保护药物的有效剂量按视黄酸剂计算，给药0.1-1mg/kg/天。

进一步地，所述的卵巢功能保护药物的给药方式为口服或者肌内注射给药。

本发明发明人研究发现，化疗药物多柔比星能够过度激活卵母细胞内PI3K/Akt信号通路、增加卵母细胞DNA损伤，导致原始卵泡和生长卵泡凋亡。在体外新生小鼠卵巢培养实验中，视黄酸能够部分逆转化疗药物多柔比星导致PI3K/Akt过度激活和DNA损伤，减少多柔比星导致卵泡凋亡的数量。小鼠体内腹腔注射视黄酸同样能够部分逆转多柔比星导致的卵泡凋亡。这一发现扩充了视黄酸在女性生殖系统中的应用，为防止化疗药物损伤卵巢卵泡发育，以及生育力的在体保护提供新思路，同时也对保护化疗后女性患者的生活质量具有重要意义。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

化疗的使用提高了癌症患者总体生存率和无病生存率，但是化疗药物可以损伤卵泡及卵巢血管及间质，最终使卵巢储备损失，严重损害女性卵巢功能，对于具有生育需求的女性影响重大。而目前女性癌症患者的生育力保存治疗手段会延后癌症治疗，或对患者身体造成进一步损伤。因此，寻找一种口服药物在体保护年轻女性癌症卵巢储备、防止化疗药物损伤卵巢功能十分有必要。在本研究中我们发现视黄酸能够部分逆转化疗药物多柔比星导致PI3K/Akt过度激活和DNA损伤，减少多柔比星导致卵泡凋亡的数量。小鼠体内腹腔注射视黄酸同样能够部分逆转多柔比星导致的卵泡凋亡。视黄酸作为一种身体必需的营养元素，可以用于口服，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为出生3天(3dpp)新生小鼠卵巢添加多柔比星、多柔比星+本发明视黄酸体外培养4天的形态观察(a)及卵泡统计图(b)；其中，在视黄酸+多柔比星组，视黄酸5小时预培养后再加入多柔比星(标尺：50μm)。

图2为3dpp新生小鼠卵巢添加多柔比星、多柔比星+本发明视黄酸体外培养1天，凋亡标志物γ-H2AX免疫荧光染色(a)及单张切面凋亡信号阳性细胞数目均值统计图(b)；其中，在视黄酸+多柔比星组，视黄酸5小时预培养后再加入多柔比星(标尺：50μm)。

图3为3dpp新生小鼠卵巢添加多柔比星、多柔比星+本发明视黄酸体外培养1天，蛋白免疫印迹(a)及相对蛋白表达量统计图(b)；其中，在视黄酸+多柔比星组，视黄酸5小时预培养后再加入多柔比星。

图4为4dpp新生小鼠腹腔注射多柔比星、多柔比星+视黄酸至小鼠6dpp卵巢形态观察(a)及卵泡计数统计图(b)；其中，在视黄酸+多柔比星组，视黄酸预注射1天后再共注射多柔比星(标尺：50μm)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一、体外培养相关试剂配制

1.1药物溶液配制

避光状态下将50mg视黄酸粉末加入1mL DMSO，配制为视黄酸溶液；将1mg多柔比星粉末加入10mL纯水，配制为多柔比星溶液。待固体充分溶解后，用0.22μm滤器过滤，封口膜封口并分装，在-20℃条件下保存。

1.2DMEM/F12培养基配制(表1)

表1.DMEM/F12培养基

待固体全部溶解后，用0.22μm滤器过滤，在超净台中操作，用封口膜封口，在4℃条件下保存。

1.3磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered solution,PBS)配制(表2)

表2.PBS缓冲液

高压灭菌，4℃保存。

2.免疫荧光相关试剂配制

2.1 10％封闭血清配制

驴血清与PBS以1:10比例，按需配制。

2.2一抗配制

相应一抗：10％封闭血清以1:200比例，按需配制。

2.3二抗配制

根据一抗种属，相应二抗：PBS以1:200比例，按需配制。

2.4DAPI工作液配制

DAPI储存液：PBS以1:200比例，按需配制。

2.5柠檬酸缓冲液工作液配制(表3、表4、表5)

表3.0.1M柠檬酸(A液)

表4.0.1M柠檬酸钠(B液)

表5.柠檬酸工作液

二、小鼠卵巢的分离和体外培养，小鼠腹腔注射

1.小鼠卵巢的分离及培养

1.1手术器械(眼科直剪、10cm有齿镊、尖头镊、1mL注射器)、90mm培养皿、六孔板等置于超净台紫外照射30m分钟，细胞间紫外灯照射30分钟。

1.2本实验以出生3天的ICR雌鼠(3dpp)，用颈椎脱臼的方法处死小鼠，腹部70％酒精消毒,脐部做V字型切口打开腹腔，沿双肾上沿将小鼠分为头尾两部分，将尾部放到预冷的PBS里。

1.3在体视显微镜下操作，将小鼠卵巢连同周围结缔组织一起取出，并用1mL注射针头将卵巢周围的结缔组织剥离干净。

2.小鼠卵巢的体外培养

2.1在六孔板的孔中加入3mL DMEM/F12培养基，对照组加入1.8μL的DMSO；多柔比星组加入1.5μL多柔比星溶液，终浓度为0.05μg/mL；视黄酸+多柔比星组加入1.8μL视黄酸和1.5μL多柔比星溶液，视黄酸终浓度为1μM，多柔比星终浓度为0.05μg/mL，吹打混匀，孔内上放入0.44μm培养膜，放在37℃培养箱孵育30分钟。

2.2将分离好的卵巢放到培养膜上，置于37℃、5％ CO₂恒温培养箱中培养；

2.3培养4天：每两天换一次液。

3.小鼠腹腔注射

1.1腹腔注射液配制：将50mg视黄酸溶于1ml芝麻油，配制为视黄酸注射液；将1mg多柔比星溶于10mL 0.9％生理盐水，配制为多柔比星注射液。

1.2腹腔注射方案：对照组：新生小鼠3dpp开始注射相应体积的芝麻油，每日2次，注射3天。多柔比星组：新生小鼠4dpp开始注射多柔比星，每日2次，单次注射剂量为0.05mg/kg，注射2天。视黄酸+多柔比星组：新生小鼠3dpp开始注射视黄酸，每日2次，单次注射剂量为0.3mg/kg，注射3天；小鼠4dpp开始共注射多柔比星，每日2次，单次注射剂量为0.05mg/kg，注射2天。取小鼠6dpp卵巢进行下一步实验。

1.3腹腔注射方法：称取小鼠体重并用微量注射器吸取相应体积药物。小鼠头朝下，食指与无名指夹住小鼠下肢根部，拇指与食指固定住上肢及头部并轻轻拉伸，使小鼠腹部皮肤紧张。微量注射器针尖平面朝上,平行扎入皮下进针少许,再将注射器呈45°角刺入腹腔，感觉有落空感后，注射相应药品。

三、苏木精染色

1.卵巢石蜡包埋

1.1样品的固定：培养4天的小鼠卵巢在4％的多聚甲醛中4℃固定12-16小时；

1.2酒精浓度梯度脱水和透明：70％酒精，80％酒精，95％酒精/伊红染液，95％酒精，无水酒精，无水乙醇/二甲苯(体积1：1)，二甲苯，每个梯度5分钟，最后的二甲苯用滤纸吸干。

1.3浸蜡和包埋：60℃水浴浸蜡3小时，将组织转移到铁制石蜡盒中，盖上包埋盒，取出置于室温凝固。

2.切片

2.1打开切片机，将切片厚度调整为5μm，固定蜡块后开始连续切片。

2.2展片：蜡带在42℃水浴锅充分的伸展后用载玻片捞起。

2.3烤片：42℃过夜。

3苏木精染色

3.1脱蜡复水：将附着组织的玻片依次经过二甲苯，二甲苯，无水酒精，无水酒精，95％酒精，80％酒精，70％酒精。每个梯度各5分钟，最后用去离子水冲洗。

3.2染色：用苏木精染液染1分30秒，用去离子水冲洗。

3.3脱水封片：玻片依次经过70％酒精，80％酒精，95％酒精，无水酒精，无水酒精，二甲苯，二甲苯，每个梯度各3分钟，中性树脂封片。

4玻片扫描，对染色的连续切片进行计数，每连续5张切片取一张进行计数，最终的统计结果是将计数结果相加后乘以5。异常的卵泡表现为：凋亡的卵母细胞和或≥2个凋亡的颗粒细胞、卵泡呈现非对称形态。

四、免疫荧光染色

1.卵巢组织蜡块切片、脱蜡、复水。

2.抗原修复：切片放入柠檬酸缓冲液工作液，在微波炉经过高火4min，低火4min×3,自然冷却至室温。

3.洗片：PBS 5min×2。

4.封闭：10％驴血清室温封闭1h。

5.孵育一抗：4℃过夜。

6.洗片：PBS 5min×6。

7.孵育二抗：37℃1小时，从此步骤开始均需避光操作。

8.洗片：PBS 5min×6。

9.DAPI：孵育1min。

10.洗片：PBS 5min×3。

11.封片：20μL抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片。

12.激光共聚焦显微镜拍照。每3张切面拍一张荧光照片，一个卵巢对5张切面进行计数统计，计算切面均值。

五、免疫蛋白印迹

1.蛋白提取与浓度测定。

2.聚丙烯酰胺凝胶、电泳液、转膜液配制。

3.蛋白上样20μg，电泳60V 40分钟，100V 1小时。

4.转膜100V 1小时。

5.5％脱脂牛奶室温封闭1小时。

6.相应一抗4℃过夜孵育。

7.相应种属二抗室温孵育1小时。

8.曝光成像，计算相对蛋白表达量。

六、结果

1.卵巢卵泡计数结果

1.1 3dpp新生小鼠卵巢体外培养4天结果如图1所示，其中：a为对照组、多柔比星组、视黄酸+多柔比星组之间卵巢形态学比较。黄色箭头指向凋亡的颗粒细胞，红色箭头指向凋亡的卵母细胞。标尺：50μm。b为异常卵泡计数统计。与对照组相比，多柔比星组异常卵泡数显著增多(75±15vs 936.67±196.36，p<0.01)，视黄酸+多柔比星组异常卵泡数显著增多(75±15vs 556.67±129.65，p<0.01)。与多柔比星组相比，视黄酸+多柔比星组异常的卵泡数量显著下降(936.67±196.36vs 556.67±129.65，p<0.05)。

1.2 3dpp小鼠腹腔注射结果如图4所示，a为对照组、多柔比星组、视黄酸+多柔比星组之间卵巢形态学比较。箭头指向异常的卵泡。标尺：50μm。b为异常卵泡计数统计。与对照组相比，多柔比星组异常卵泡数显著增多(38.33±17.56vs 260±20，p<0.001),视黄酸+多柔比星组异常卵泡数显著增多(38.33±17.56vs 166.67±30.55，p<0.01)。与多柔比星组相比，视黄酸+多柔比星组异常的卵泡数量显著下降(260±20vs 166.67±30.55，p<0.05)。

2.免疫荧光染色计数结果

3dpp新生小鼠卵巢体外培养1天结果如图2所示，其中：a为对照组、多柔比星组、视黄酸+多柔比星组γ-H2AX免疫荧光染色图。白色箭头指向凋亡信号阳性细胞。标尺：50μm。b为平均每张切面凋亡信号阳性细胞数目统计图。与对照组相比，多柔比星组凋亡信号数目显著升高(2.63±1.40vs 8.87±0.50，p<0.01)。与多柔比星组相比，视黄酸+多柔比星组凋亡信号数目显著下降(8.87±0.50vs 4.75±0.25，p<0.001)。

3.免疫印迹蛋白条带灰度值分析

3dpp新生小鼠卵巢体外培养1天结果如图3所示，其中：a为蛋白免疫印迹图。b为蛋白相对表达量统计图。与对照组相比，多柔比星组磷酸化Akt(p-Akt)蛋白相对表达量显著上升(p<0.05)，γ-H2AX蛋白相对表达量显著上升(p<0.05)，视黄酸+多柔比星组磷酸化Akt蛋白相对表达量显著减少(p<0.05)。与多柔比星组相比，视黄酸+多柔比星组磷酸化Akt蛋白相对表达量显著减少(p<0.001)，γ-H2AX蛋白相对表达量显著减少(p<0.05)。

本发明对3dpp新生小鼠卵巢添加多柔比星、视黄酸+多柔比星或不添加药物培养1天或4天，视黄酸早于多柔比星5小时或1天添加。培养卵巢组织连续切片统计分析表明，视黄酸能够显著降低多柔比星导致的异常卵泡增多。免疫荧光及蛋白免疫印迹结果显示视黄酸能够能够抑制多柔比星导致的PI3K/Akt过度激活，并降低γ-H2AX蛋白表达。对4dpp新生小鼠腹腔注射多柔比星、视黄酸+多柔比星或生理盐水，卵巢组织连续切片统计分析表明视黄酸能够显著降低多柔比星导致的异常卵泡增多。以上结果表明视黄酸能够对多柔比星处理的小鼠卵巢起保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用，其特征在于：

所述的卵巢功能保护药物为预防和/或治疗卵巢功能损伤的药物。

3.根据权利要求2所述的视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用，其特征在于：

所述的卵巢损伤包括医源性卵巢功能损伤。

4.根据权利要求3所述的视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用，其特征在于：

所述的医源性卵巢损伤包括由化疗引起的卵巢功能损伤。

5.根据权利要求4所述的视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用，其特征在于：

所述的化疗的药物包括多柔比星。

6.根据权利要求1-5任一项所述的视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用，其特征在于：

所述的卵巢功能保护药物具有逆转或部分逆转PI3K/Akt过度激活、DNA损伤和减少卵泡凋亡的作用。

7.根据权利要求1-5任一项所述的视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用，其特征在于：

所述的视黄酸包括视黄酸和视黄酸在药学上接受的盐。

8.根据权利要求1-5任一项所述的视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用，其特征在于：

所述的卵巢功能保护药物还包含药学上可接受的载体。

9.根据权利要求1-5任一项所述的视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用，其特征在于：

所述的卵巢功能保护药物的有效剂量按视黄酸剂计算，给药0.1-1mg/kg/天。

10.根据权利要求1-5任一项所述的视黄酸在制备卵巢功能保护药物中的应用，其特征在于：

所述的卵巢功能保护药物的给药方式为口服或者肌内注射给药。

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