CN115721645B - 去氢毛钩藤碱在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了去氢毛钩藤碱在制备抗癌药物中的应用，属于医药技术领域，尤其是涉及去氢毛钩藤碱在制备抗癌药物中的应用。本发现发现去氢毛钩藤碱可通过增强野生型p53稳定性和促进突变型p53降解而发挥抗癌活性，尤其是抗结直肠癌的活性；因此本发明的去氢毛钩藤碱针对抗癌药物具有显著贡献，并且本发明的去氢毛钩藤碱具有较好的低毒性，对医药领域的发展具有重要的作用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其是涉及去氢毛钩藤碱在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
p53编码的野生型p53蛋白是重要的肿瘤抑制因子,通过转录调控其下游多种抗癌因子而抑制肿瘤。研究发现，人类肿瘤中以p53突变最为常见，是多种肿瘤发生过程中常见的突变靶点。突变型p53不仅丧失了野生型p53原有的抑癌功能，还通过作用于其他转录因子而产生获得性致癌功能。此外，在多种癌症中，野生型p53多呈现低表达，而突变型p53呈现过度聚集。因此，靶向p53的小分子药物在癌症治疗中具有很好的开发前景。
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，其临床一线化疗药物5-氟尿嘧啶、卡培他滨、瑞戈非尼、西妥昔单抗等存在易产生耐药性以及治疗后易复发等问题，亟需寻找新的抗结直肠癌药物。p53是一种转录因子，也是重要的肿瘤抑制因子，通过调节下游靶基因发挥多种生物功能。据报道，p53突变或受到抑制均是结直肠癌的主要病理因素之一。因此靶向p53通路成为很有前景的抗结直肠癌药物研发方向。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出去氢毛钩藤碱在制备抗癌药物中的应用，以解决的问题。
去氢毛钩藤碱的结构式，如(I)所示：
化学式为C22H26N2O3；分子量为366.45。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
去氢毛钩藤碱在制备抗癌药物中的应用。
去氢毛钩藤碱在增强野生型p53稳定性和促进突变型p53降解的应用。
去氢毛钩藤碱能抑制HCT-8和SW620细胞增殖的IC50值分别为16.05μM、13.84μM。
去氢毛钩藤碱能引起HCT-8细胞G0/G1期周期阻滞。
去氢毛钩藤碱能诱导SW620其发生G2/M期周期阻滞。
去氢毛钩藤碱在HCT-8细胞中能够干预引起p-Rb降表达、p27升表达。
去氢毛钩藤碱能增强野生型p53结直肠癌细胞的p53的转录活性。
一种抗癌药物，包括作为活性成分的去氢毛钩藤碱和药学上可接受的载体。
癌症包括抗结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、软组织肿瘤、卵巢癌、脑瘤。
相对于现有技术，本发明所述的去氢毛钩藤碱在制备抗癌药物中的应用具有以下有益效果：
本发现发现去氢毛钩藤碱可通过增强野生型p53稳定性和促进突变型p53降解而发挥抗癌活性，尤其是抗结直肠癌的活性；因此本发明的去氢毛钩藤碱针对抗癌药物具有显著贡献，并且本发明的去氢毛钩藤碱具有较好的低毒性，对医药领域的发展具有重要的作用。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1中去氢毛钩藤碱抑制结直肠癌细胞增殖作用示意图；
图2为本发明实施例2中去氢毛钩藤碱诱导结直肠癌细胞周期阻滞作用示意图；
图3为本发明实施例3中去氢毛钩藤碱诱导结直肠癌细胞自噬作用示意图；
图4为本发明实施例4中去氢毛钩藤碱在p53野生型结直肠癌细胞中增强野生型p53稳定性和转录活性作用示意图；
图5为本发明实施例5中去氢毛钩藤碱在p53突变型结直肠癌细胞中促进突变型p53降解，并恢复其野生型p53转录活性作用示意图；
图6为本发明实施例6中去氢毛钩藤碱在裸鼠皮下移植瘤模型中抑制肿瘤增殖，升表达野生型p53，降表达突变型p53作用示意图；
图7为本发明实施例7中采用siRNA技术敲低p53可削弱去氢毛钩藤碱对结直肠癌细胞的增殖抑制活性示意图；
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
本发明通过以下实施例能够证明：去氢毛钩藤碱能够在结直肠癌细胞中增强野生型p53稳定性和促进突变型p53降解的应用，其他癌症与结直肠癌的机理类似，因此也可证明去氢毛钩藤碱在其他癌症中起到作用。
实施例1：去氢毛钩藤碱抑制结直肠癌细胞增殖
采用MTT法检测去氢毛钩藤碱抑制细胞增殖效果，选取人源结直肠癌细胞系HCT-8(p53野生型)、SW620(p53突变型)。
细胞培养：结直肠癌细胞HCT-8和SW620，采用含10％FBS、1％青霉素、1％链霉素的RPMI-1640培养基进行培养，并放置于37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。细胞铺板：收集对数生长期细胞，计数后以密度为4×104细胞/ml、200μl/孔接种于96孔培养板，空白对照为不含细胞悬液的新鲜培养基。
给药处理：待细胞贴壁后设置给药组和对照组，给药组为0.5μl浓度梯度去氢毛钩藤碱溶液，药物终浓度为2、4、8、16、32、64μM(HCT-8细胞)，4、8、16、32、64、100μM(SW620细胞)，每个浓度设5个复孔，对照组为0.5μl的DMSO。摇匀，放入培养箱中培养48h。
检测：每孔加入20μl MTT溶液，混匀后置细胞培养箱中继续孵育4h，吸除上清液后加入150μl DMSO，震荡混匀，在酶标仪(λ＝490nm)测吸光度值。
数据分析：细胞存活率％＝(药物处理组OD值空白对照组OD值)/(DMSO对照组OD值空白对照组OD值)×100
结果：见图1所示：去氢毛钩藤碱能抑制HCT-8和SW620细胞增殖，去氢毛钩藤碱干预上述各细胞系24h的IC50值分别为43.87μM、22.59μM，去氢毛钩藤碱干预上述各细胞系48h的IC50值分别为16.05μM、13.84μM。
实施例2：去氢毛钩藤碱诱导结直肠癌细胞周期阻滞
细胞培养同实施例1。
细胞铺板：取对数生长期细胞，消化、计数后，以密度为2×105细胞/ml、2ml/孔接种于6孔板，摇匀后置37℃、5％CO2培养箱中孵育。
给药处理：待细胞贴壁后设置给药组和对照组，给药组为2μl浓度梯度去氢毛钩藤碱溶液，药物终浓度为8、16、32μM，每个浓度设3个复孔，对照组为2μl DMSO。摇匀，放入培养箱中培养48h。
固定：收集细胞，1000rpm离心5min，细胞沉淀用PBS洗涤，1000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀中加入250μl PBS重悬，将其缓慢滴入到750μl冰乙醇中，置4℃固定过夜。
染色：2500rpm离心5min，收集固定好的细胞，PBS清洗一遍，取细胞沉淀，加100μlPBS和200μl新鲜配置的PI染液，置4℃避光放置1h。
测定：染色后的细胞悬液用尼龙网过滤，立即采用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。Western blot检测相关蛋白：细胞铺板及给药方式同上，药物处理48h，收集细胞，RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，BCA法定量样品蛋白浓度，95℃加热5min使蛋白样品热变性后进行SDS-PAGE，电泳条件：60V，30min，100V，1h。电泳结束后进行转印，取转移到PVDF膜上的蛋白样品在5％脱脂奶粉中室温封闭1h，再依次进行一抗孵育、二抗孵育、显影和拍照。
结果：见图2所示，去氢毛钩藤碱能引起HCT-8细胞G0/G1期周期阻滞，而对SW620细胞，去氢毛钩藤碱能诱导其发生G2/M期周期阻滞(图2A)。Western blot结果显示，HCT-8细胞中，去氢毛钩藤碱干预引起p-Rb降表达、p27升表达。在SW620细胞中，去氢毛钩藤碱干预后引起Cyclin B1和cdc2降表达(图2B)。
实施例3：去氢毛钩藤碱诱导结直肠癌细胞自噬
细胞培养、细胞铺板和给药处理方法同实施例2。
检测方法：1000rpm离心5min收集细胞，细胞沉淀用500μl的Wash Buffer清洗细胞一次，1000g离心5min，细胞沉淀用适量的Stain Buffer重悬。取90μl细胞悬液，加入10μlMDC染液(10×)，轻轻混匀，37℃避光染色60min后离心，1000g，5min，细胞沉淀用500μlWash Buffer清洗两次，1000g离心5min，弃上清，再加入100μl的Wash Buffer重悬细胞，滴加于载玻片上，荧光显微镜下拍照记录。
Western blot检测自噬相关蛋白：方法同实施例2种Western blot法。结果：见图3所示，去氢毛钩藤碱干预HCT-8和SW620细胞48h，MDC染色结果显示四种细胞均呈现显著的绿色荧光(图3A)。Western blot结果显示，去氢毛钩藤碱干预HCT-8、和SW620细胞48h后，LC3BII/I比例均显著升高(图3B)。以上结果表明去氢毛钩藤碱能诱导HCT-8、SW620细胞自噬。
实施例4：去氢毛钩藤碱增强野生型p53结直肠癌细胞中p53的稳定性和转录活性
细胞培养以及铺板和加药方法同实施例2
反转录PCR：收集细胞，1000rpm离心5min，取细胞沉淀，加入500μlTrizol混悬，室温静置5min，加入氯仿150μl，震荡15s，室温静置5min，4℃下12000g离心15min，吸取上层水相150μl，加入150μl异丙醇，混匀后静置10min，4℃下12000g离心15min，弃上清，采用75％乙醇(DEPC水配制)清洗2次，7500g离心5min，弃上清，沉淀静置5min，适量DEPC水溶解后进行RNA定量。取RNA 500ng，采用GenStar逆转录试剂盒进行反转录；
荧光定量PCR：实验所用p21引物序列为：
正向5’-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3’；
反向5’-AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3’；
MDM2引物序列为：
正向5’-AGTAGCAGTGAATCTACAGGGA-3’；
反向5’-CTGATCCAACCAATCACCTGAAT-3’；
GAPDH引物序列为：
正向5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’；
反向5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’。
配制PCR反应溶液，向PCR小管中加入引物、cDNA、DEPC水以及TB Green Premix ExTaq II，反应体系总体积为20μl，采用CFX96系统按照GenStar试剂盒说明书设定反应条件，利用2-△△Ct相对定量法进行结果分析。相对表达量＝2-(给药组待测基因Ct平均值-给药组GAPDH Ct平均值)-(对照组待测基因Ct平均值-对照组GAPDH Ct平均值)。
p53蛋白半衰期检测：待细胞贴壁后，对照组给予放线菌酮CHX，给药组给予去氢毛钩藤碱和放线菌酮CHX共处理，分别在药物干预0，0.5，1，2，3h收集HCT-8细胞，裂解后提取总蛋白，定量并进行Western blot检测。Western blot检测p53蛋白表达：方法同实施例2。
结果：如图4所示，在p53野生型结直肠癌细胞HCT-8中，去氢毛钩藤碱能以时间依赖性和剂量依赖性方式升高p53蛋白水平(图4A)。在p53半衰期检测中，与放线菌酮CHX处理组相比，去氢毛钩藤碱能明显减慢放线菌酮引起的p53蛋白表达水平降低(图4B)，表明去氢毛钩藤碱能够延长p53半衰期，增加其稳定性。去氢毛钩藤碱干预HCT-8细胞48h，细胞中p21和MDM2的mRNA水平逐渐升高(图4C)，表明在野生型p53结直肠癌细胞中，去氢毛钩藤碱能增强p53的转录活性。
实施例5：去氢毛钩藤碱促进突变型p53结直肠癌细胞中突变型p53的降解并恢复其野生型p53转录活性
细胞培养以及铺板和加药方法同实施例2
反转录PCR、荧光定量PCR同实施例4
Western blot检测p53蛋白表达：方法同实施例2
结果：见图5所示，在p53突变型结直肠癌细胞SW620中，去氢毛钩藤碱能以时间依赖性和剂量依赖性方式降低p53蛋白水平(图5A)。蛋白酶体抑制剂PS341和去氢毛钩藤碱共处理SW620细胞，PS341可缓解去氢毛钩藤碱引起的p53降解(图5B)，且去氢毛钩藤碱对p53的降解活性在加入MDM2抑制剂Nutlin-3a后也得到显著缓解(图5C)，表明在SW620中，去氢毛钩藤碱能诱导p53发生蛋白酶体降解。去氢毛钩藤碱干预SW620细胞48h，细胞中p53下游靶基因p21和MDM2的mRNA水平明显升高(图5D)，表明在突变型p53结直肠癌细胞中，去氢毛钩藤碱能够恢复p53的转录活性。
实施例6：去氢毛钩藤碱能调节p53通路、抑制裸鼠体内移植瘤增殖
裸鼠饲养：BALB/c裸鼠饲养于天津医科大学实验动物科学部SPF级实验动物饲养室。
裸鼠皮下移植瘤模型建立：对数增长期HCT-8和SW620细胞，分别取200μl细胞悬液(密度为1×107个/ml)接种于裸鼠右前肢皮下，待移殖瘤体积达到约15mm×15mm，手术取出肿瘤组织，在无菌环境下切割成体积约为8～10mm3的瘤块，然后用穿刺针将瘤块分别移植到另一批裸鼠右前肢皮下。每2天测量一次裸鼠体重和肿瘤体积，待肿瘤生长到约60mm3开始给药，给药组给予去氢毛钩藤碱的剂量为20mg/kg，隔天给药，给药18天后处死裸鼠，收集肿瘤组织。
免疫组化染色：按常规免疫组化染色方法开展，取小鼠肿瘤组织依次进行脱水→包埋→切片→烤片(60℃，30min)→脱蜡(依次用二甲苯、无水乙醇、酒精、PBS溶液浸泡)→灭活内源性过氧化物酶(适量内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10min)→抗原修复(在1×tris-EDTA抗原修复液中微波煮沸10min，4次/min)系列操作后，再进行一抗(Ki67或p53抗体孵育，4℃过夜)、二抗(37℃孵育20min)孵育，DAB显色后再用苏木素复染，梯度脱水后用中性树胶封片。
结果：见图6所示，去氢毛钩藤碱能显著抑制HCT-8和SW620细胞的裸鼠皮下瘤体积(图6A、D)，对小鼠体重无明显影响(图6B、E)，IHC检测结果显示，HCT-8细胞皮下瘤组织中，与对照组相比，去氢毛钩藤碱给药组Ki67表达量降低，p53表达量升高(图6C)；在SW620细胞皮下瘤组织中，与对照组相比，去氢毛钩藤碱组Ki67、p53表达量均降低(图6F)。以上结果表明去氢毛钩藤碱能调节p53通路并抑制裸鼠体内结直肠癌增殖且显示低毒性。
实施例7：去氢毛钩藤碱抗结直肠癌作用与其对p53的调控密切相关细胞培养、细胞铺板方法同实施例2。
细胞转染：细胞贴壁后更换不含血清的新鲜培养基饥饿2h，用Opti-MEM制备一定浓度的Lipo 2000及siRNA p53，室温放置5min，两者混匀后再放置30min，并将其滴加入细胞中，100μl/孔，转染6h后，弃上层培基，加入含10％FBS的新鲜培基培养过夜，12h后进行药物处理，设置阴性对照组(NC)，siRNA p53组，去氢毛钩藤碱单用组(HST，32μM)，siRNA p53联合去氢毛钩藤碱处理组。
MTT法检测细胞增殖能力，方法同实施例1。
结果：见图7所示，siRNA p53可显著减弱去氢毛钩藤碱对HCT-8和SW620细胞的增殖抑制作用，表明去氢毛钩藤碱抗结直肠癌作用与其对p53的调控密切相关。
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