CN116425665A - Taq酶可逆修饰剂、化学修饰Taq酶及其制备方法和PCR试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种Taq酶可逆修饰剂、化学修饰Taq酶及其制备方法和PCR试剂盒。本申请中，所述Taq酶可逆修饰剂的结构如式(Ⅰ)所示，其中，R1、R2和R3如本申请上下文所述。本申请的提供的Taq酶可逆修饰剂修饰的Taq酶活性相比使用N‑乙氧羰基‑2,3‑二取代丁烯二酰亚胺修饰的Taq酶活性更好。
Description
技术领域
本发明涉及即使检测领域，特别涉及Taq酶可逆修饰剂、化学修饰Taq酶及其制备方法和PCR试剂盒。
背景技术
Taq酶是进行PCR的最常用工具酶，但是由于它在常温下还是具有部分活性，所以经常会出现非特异的扩增产物，尤其是当PCR反应体系中有大量非特异DNA存在的时候。目前常使用化学修饰法修饰Taq酶，即使用Taq酶可逆修饰剂与Taq酶反应，经过修饰后的热启动酶活性可在室温被抑制，高温条件下能迅速恢复其高活性，避免常温下出现非特异性扩增。
现有技术中，常使用二羧酸酐作为Taq酶可逆修饰剂修饰Taq酶。此外，专利US2007224611A1中公开了下式3化合物(N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺)，作为嗜热酶的可逆修饰剂，并公开了其制备和纯化方法。
但发明人经过研究发现，经过上述方法制备和纯化获得Taq酶可逆修饰剂修饰Taq酶活性较差。因此，本领域尚需寻找修饰效果更优的Taq酶可逆修饰剂以及提高Taq酶可逆修饰剂修饰效果的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Taq酶可逆修饰剂。
本发明的的另一目的在于提供一种经上述Taq酶可逆修饰剂修饰的Taq酶。
本发明的的另一目的在于提供一种含有上述经所述Taq酶可逆修饰剂修饰的Taq酶的PCR试剂盒。
本发明的的另一目的在于提供一种提高上述经所述Taq酶可逆修饰剂修饰的Taq酶活性的方法。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种Taq酶可逆修饰剂，所述Taq酶可逆修饰剂的结构如式(Ⅰ)所示
其中，R1为C3-6烷基；
R2和R3分别独立地为C1-6烷基。
在一些优选的方案中，
R1为未取代的C3-6直链烷基；
和/或，R2和R3分别独立地为C1-4烷基。
在一些优选的方案中，
R1为正丙基、正丁基、正戊基或正己基。
在一些优选的方案中，
R2和R3分别独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基。
在一些优选的方案中，所述R1为正己基。
在一些优选的方案中，所述Taq酶可逆修饰剂的结构如式(Ⅱ)所示
在一些优选的方案中，所述Taq酶可逆修饰剂由3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗产品使用高效液相色谱纯化获得。
本发明第二方面提供了一种化学修饰Taq酶，所述化学修饰Taq酶经本发明第一方面所述的Taq酶可逆修饰剂修饰。
本发明第三方面提供了一种PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒包括本发明第二方面所述的化学修饰Taq酶。
本发明第四方面提供了一种制备本发明第三方面提供的化学修饰Taq酶的方法，所述方法包括步骤：将野生型Taq酶和本发明第一方面所述的Taq酶可逆修饰剂混合。
在一些优选的方案中，所述混合在振荡器中进行，所述混合的时间为15至30秒。
本发明第五方面提供了一种提高化学修饰的Taq酶的活性的方法，所述方法包括步骤：
将制备所得的化学修饰剂粗产品溶液使用高效液相色谱纯化，再与待修饰的Taq酶进行修饰反应。
在一些优选的方案中，所述化学修饰剂为式(Ⅱ)所示化合物
在一些优选的方案中，所述方法包括步骤：
(1)将式(Ⅱ)所示化合物粗产品溶液使用制备型高效液相色谱法纯化，收集目标馏分；和
(2)将步骤(1)所得目标馏分萃取后旋蒸，获得纯化的式(Ⅰ)所示化合物；和
(3)使步骤(2)所得纯化的式(Ⅱ)所示化合物与待修饰的Taq酶进行修饰反应，即可。
在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述制备型高效液相色谱法所用色谱柱为C18色谱柱。
在一些优选的方案中，所述制备型高效液相色谱法所用流动相为水和乙腈的混合溶液。
在一些优选的方案中，所述制备型高效液相色谱法采用梯度洗脱方式进行。
在一些优选的方案中，所述流动相流速为3.5至4.5mL/分钟，例如4mL/分钟。
在一些优选的方案中，所述C18色谱柱填料粒度为2μm～10μm，例如2μm、5μm或10μm。
在一些优选的方案中，所述梯度洗脱的程序为：在时间段t内，使流动相中乙腈的体积百分含量从10％匀速变化至100％；所述t为25至35分钟，例如30分钟。
在一些优选的方案中，所述目标馏分为保留时间为15至19分钟的洗脱液，例如保留时间为17至18分钟的洗脱液。
在一些优选的方案中，步骤(2)中，所述萃取使用的萃取剂为二氯甲烷。
在一些优选的方案中，步骤(3)中，所述修饰反应包括步骤：将步骤(2)所得纯化的式(Ⅱ)所示化合物与待修饰的Taq酶混合。
在一些优选的方案中，所述混合使用振荡器进行，所述振荡器振荡的时间为15至30秒，例如20秒。
本发明第六方面提供了一种式(Ⅰ)化合物的用途，用于：
(i)制备Taq酶可逆修饰剂；
(ii)可逆修饰Taq酶。
本发明实施方式相对于现有技术而言，至少具有下述有益效果：
(1)本发明的提供的Taq酶可逆修饰剂修饰的Taq酶活性相比使用N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰的Taq酶活性更好；
(2)本发明的提供的化学修饰Taq酶稳定性高；
(3)本发明的提供的提高化学修饰的Taq酶的活性的方法，可以以一种低成本的简便的方式大幅提高化学修饰的Taq酶的活性，尤其是经式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示化合物修饰的Taq酶的活性。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品的HPLC图；
图2是根据本发明实施例中3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品的LC-MS谱图；
图3是根据本发明实施例中3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯1H MNR谱图；
图4是根据本发明实施例中3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯修饰的DNA聚合酶、野生型DNA聚合酶和不加DNA聚合酶酶活性熔解曲线图；
图5是根据本发明实施例中0.8x实验组和对照组酶活性测试结果图；
图6是根据本发明实施例中1.0x实验组和对照组酶活性测试结果图；
图7是根据本发明实施例中1.2x实验组和对照组酶活性测试结果图；
图8是根据本发明实施例中0.8x实验组和对照组加速稳定性结果图；
图9是根据本发明实施例中1.0x实验组和对照组加速稳定性结果图；
图10是根据本发明实施例中1.2x实验组和对照组加速稳定性结果图。
具体实施方式
本发明人经过详细的研究，发现经丁烯二酰亚胺类修饰剂(如下式A)修饰的Taq酶活性显著好于常用的二羧酸酐修饰的Taq酶，在丁烯二酰亚胺类修饰剂中，N端的取代基R1显著影响修饰效果，例如，本发明测试例中验证的3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯修饰的Taq酶的活性显著好于N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰的Taq酶。
(
其中，R1、R2和R3分别独立地选自烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、卤素、胺基、氨基、硝基、酰胺基或酰氧基。)
3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯修饰的Taq酶活性显著好于二羧酸酐或N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰的Taq酶。
本发明所述的提高化学修饰的Taq酶的活性的方法处理的丁烯二酰亚胺类修饰剂，其酶活性更好且稳定性高，优选地，经过本发明所述的提高化学修饰的Taq酶的活性的方法处理的3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯修饰的Taq酶活性显著高于不经处理的3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯修饰的Taq酶。
本发明的一些实施方式中提供了一种Taq酶可逆修饰剂，所述Taq酶可逆修饰剂的结构如式(Ⅰ)所示
其中，R1为C3-6烷基；
R2和R3分别独立地为C1-6烷基。
在一些优选的方案中，
R1为未取代的C3-6直链烷基；
和/或，R2和R3分别独立地为C1-4烷基。
在一些优选的方案中，
R1为正丙基、正丁基、正戊基或正己基。
在一些优选的方案中，
R2和R3分别独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基。
在一些优选的方案中，所述R1为正己基。
在一些优选的方案中，所述Taq酶可逆修饰剂的结构如式(Ⅱ)所示
在一些优选的方案中，所述Taq酶可逆修饰剂由3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗产品使用高效液相色谱纯化获得。
本发明的一些实施方式中提供了一种化学修饰Taq酶，所述化学修饰Taq酶经本发明第一方面所述的Taq酶可逆修饰剂修饰。
本发明的一些实施方式中提供了一种PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒包括本发明第二方面所述的化学修饰Taq酶。
本发明的一些实施方式中提供了一种制备本发明第三方面提供的化学修饰Taq酶的方法，所述方法包括步骤：将野生型Taq酶和本发明第一方面所述的Taq酶可逆修饰剂混合。
在一些优选的方案中，所述混合在振荡器中进行，所述混合的时间为15至30秒。
本发明的一些实施方式中提供了一种提高化学修饰的Taq酶的活性的方法，所述方法包括步骤：
将制备所得的化学修饰剂粗产品溶液使用高效液相色谱纯化，再与待修饰的Taq酶进行修饰反应。
在一些优选的方案中，所述化学修饰剂为式(Ⅱ)所示化合物
在一些优选的方案中，所述方法包括步骤：
(1)将式(Ⅱ)所示化合物粗产品溶液使用制备型高效液相色谱法纯化，收集目标馏分；和
(2)将步骤(1)所得目标馏分萃取后旋蒸，获得纯化的式(Ⅰ)所示化合物；和
(3)使步骤(2)所得纯化的式(Ⅱ)所示化合物与待修饰的Taq酶进行修饰反应，即可。
在一些优选的方案中，步骤(1)中，所述制备型高效液相色谱法所用色谱柱为C18色谱柱。
在一些优选的方案中，所述制备型高效液相色谱法所用流动相为水和乙腈的混合溶液。
在一些优选的方案中，所述制备型高效液相色谱法采用梯度洗脱方式进行。
在一些优选的方案中，所述流动相流速为3.5至4.5mL/分钟，例如4mL/分钟。
在一些优选的方案中，所述C18色谱柱填料粒度为2μm～10μm，例如2μm、5μm或10μm。
在一些优选的方案中，所述梯度洗脱的程序为：在时间段t内，使流动相中乙腈的体积百分含量从10％匀速变化至100％；所述t为25至35分钟，例如30分钟。
在一些优选的方案中，所述目标馏分为保留时间为15至19分钟的洗脱液，例如保留时间为17至18分钟的洗脱液。
在一些优选的方案中，步骤(2)中，所述萃取使用的萃取剂为二氯甲烷。
在一些优选的方案中，步骤(3)中，所述修饰反应包括步骤：将步骤(2)所得纯化的式(Ⅱ)所示化合物与待修饰的Taq酶混合。
在一些优选的方案中，所述混合使用振荡器进行，所述振荡器振荡的时间为15至30秒，例如20秒。
在一些实施方式提供了一种式(Ⅰ)化合物的用途，用于：
(i)制备Taq酶可逆修饰剂；
(ii)可逆修饰Taq酶。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施一、3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯的制备
室温下，向30.5g 2,3-二甲基马来酸酐在1LN,N-二甲基甲酰胺中的溶液中添加77.6g 1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷。将混合物加热到100℃后搅拌30min。然后降至室温，加如3L水猝灭反应，并且用10L乙酸乙酯萃取所得溶液。用3L盐水洗涤合并的有机提取物，在Na2SO4上干燥，过滤，并在真空中浓缩得到粗残渣。通过硅胶柱层析法(洗脱液：己烷/AcOEt＝3/1)纯化残余物，得到白色固体的23.3g粗2,3-二甲基马来酰亚胺，待用。0℃下，向23.3g粗2,3-二甲基马来酰亚胺的170ml无水二氯甲烷的溶液中添加34.8g三乙胺和42.5g氯甲酸正己酯，加毕，升温至室温，将混合物搅拌20分钟。通过添加3L饱和NH4Cl水溶液使反应猝灭，所得溶液用10L乙酸乙酯萃取。用3L盐水洗涤合并的有机提取物，在Na2SO4上干燥，过滤，并在真空中浓缩得到3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗产品。
实施二、3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯精制
精制方式1：
使用乙腈水溶液溶解3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗品，0.45μm的微孔滤膜过滤，C18作为固定相,填料粒度为2μm，以水:乙腈＝90:10的流动相体系平衡系统5min，上样，洗脱约7min后开始接收目标组分，接收约1min，将收集目的馏分用二氯甲烷萃取，收集有机相除盐，经旋转蒸发仪处理后得到无色透明液体即为3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品，经HPLC检测，纯度为99.4％。
HPLC分析检测方法如下：
上述HPLC所得图谱见图1，
纯化后的3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯LC-MS谱图见图2
纯化后的3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯1H MNR谱图见图3。
精制方式2：
使用乙腈/水溶液溶解实施例1中的3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗品,0.45μm的微孔滤膜过滤,C18作为固定相,填料粒度为5μm,以水:乙腈＝90:10的流动相体系平衡系统15min,上样,洗脱约15min后开始接收目标组分,接收约2min，将收集目的馏分用二氯甲烷萃取，收集有机相除盐，经旋转蒸发仪处理得到无色透明液体即为3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品，经检测，纯度为99.2％。
HPLC分析检测方法如下：
精制方式3：
使用20％乙腈/水溶液溶解3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗品，0.45μm的微孔滤膜过滤，使用C18作为固定相，填料粒度为10μm，以水:乙腈＝90:10的流动相体系平衡系统20min，上样，洗脱约35min后开始接收目标组分,接收约5min,将收集目的馏分用二氯甲烷萃取，收集有机相除盐，经旋转蒸发仪处理后,得到无色透明液体即为3,4-二甲基-2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品，经检测，纯度为99.1％.
HPLC分析检测方法如下：
实施三、3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗品和精制品修饰Taq酶
取3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗制品与野生型DNA聚合酶混合，并使用振荡器振荡20秒，即得到被3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗制品修饰的DNA聚合酶。
将3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗制品换成实施例二中精制方式1、2、3精制所得的3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品即得到被3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品修饰的DNA聚合酶修饰的DNA聚合酶。
对比例一、N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰Taq酶
取N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺与野生型DNA聚合酶混合，并使用振荡器振荡20秒，即得到被N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰的DNA聚合酶。
实施例四、PCR反应体系配制和PCR实验方法
以人单链核酸片段为模板，对待测Taq DNA聚合酶进行的DNA聚合酶活性检测，具体操作步骤如下：
(1)引物和模板的设计及合成
参考GenBank上登录的16号染色体基因序列，设计单链核酸序列及与单链核酸互补的一条引物：
单链核酸序列：
GAGCCCGCCGCCCGGCCCCGCGCAGGCCCCGCCCGGGACTCCCCTGCGGTCCAGGCCGCGCCCCGGGCTCCGCGCCAGCCAATGAGCGCCGCCCGGCCGGGCGTGCCCCCGCGCCCCAAGCATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGGCCGGCACTCTTCTGGTCCCCACAGACTC(SEQ ID NO：1)
引物序列：5'-GAGTCTGTGGGGAG-3'(SEQ ID NO：2)，两者均为人工合成。
(2)PCR反应前模板与引物的处理
分别将合成后的模板和引物，用灭菌的纯化水或是1*TE(pH8.0)适量稀释到50pmol/ul，保存备用。
镁离子最佳浓度为5mmol/L、热启动DNA聚合酶(或热启动DNA聚合酶修饰物)最佳用量为5U/反应、UNG酶最佳用量为0.1U/反应、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)最佳浓度为0.24mmol/L。
(3)PCR反应体系的配制
取PCR反应管加入10倍PCR缓冲液5μL，加入氯化镁使工作液浓度为5mmol/L、加入dNTPs使工作液浓度为0.24mmol/L，加入荧光染料使工作液浓度为1％，加入模板使工作液浓度为50pmol/ul，加入引物使工作液浓度为5pmol/ul，加入待检测的DNA聚合酶(或经3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯修饰的DNA聚合酶)使工作液浓度为2.5U，然后加纯化水补至50μL。
(4)PCR反应
将上述步骤(3)所配制的各体系放入荧光定量PCR仪器中进行反应，反应条件为：37℃孵育60min。
测试例1、对DNA聚合酶的封闭活性测试
使用经精制后的3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯修饰的DNA聚合酶，测量其对DNA聚合酶的封闭活性。具体方法如下：
将部分互补的引物加入qPCR体系里中，分别向其中加入经精制后的3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯修饰的DNA聚合酶酶，未修饰的DNA聚合酶裸酶作为阳性对照，完全不加酶作为阴性对照，37℃孵育60分钟，得到裸酶活性测试熔解曲线，见图4。
图4，NTC为不加酶体系，PC为裸酶体系，由图1可得，经过3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯封闭后的酶与无酶曲线基本重合，可见3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯能完全封闭聚合酶活性。
测试例二、酶活性测试
分别使用3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗制品、3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品、N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰四种热启动酶(ABI、Bioline、Biog和国产热启动Taq酶)，每个化学修饰物的加入量分别为0.8x、1.0x和1.2x。
将部分互补的引物加入qPCR体系里中，分别向体系中加入经3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗制品修饰的热启动Taq酶(ABI、Bioline、Biog和国产热启动Taq酶)、经3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品修饰的热启动Taq酶作为实验组，以N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰四种热启动Taq酶作为对照组，37度孵育60分钟。热启动DNA聚合酶修饰物配置如下表1。
表1、DNA聚合酶修饰物配制
0.8x实验组和对照组测试结果见图5；1.0x实验组和对照组测试结果见图6；1.2x实验组和对照组测试结果见图7。
图5、图6和图7中，CT值从大到小依次是ABI、Bioline、Biog和国产热启动Taq酶。
从qPCR曲线原始曲线可以看出，不论是ABI、Bioline、Biog还是国产热启动Taq酶，使用3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品修饰的热启动Taq酶CT值最靠前，荧光值较高，其次是3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗制品修饰的热启动Taq酶，以N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰的热启动Taq酶CT值最靠后。可见使用3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品修饰的热启动Taq酶能完全封闭聚合酶活性，性能显著优于粗制品和N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰的热启动Taq酶。经计算，使用3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品修饰的热启动Taq酶酶活性为268U/ul，而使用N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰的热启动Taq酶的活性仅为221U/ul，酶活性提升21.8％。
测试例三、加速稳定性测试
分别使用3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品修饰的热启动Taq酶、3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗制品修饰的热启动Taq酶、N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰的热启动Taq酶进行加速稳定性测试。
图8是根据本发明实施例中0.8x实验组和对照组加速稳定性结果图；图9是根据本发明实施例中1.0x实验组和对照组加速稳定性结果图；图10是根据本发明实施例中1.2x实验组和对照组加速稳定性结果图。图8、图9和图10中，CT值从大到小依次是ABI、Bioline、Biog和国产热启动Taq酶。
结果显示：用3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯纯品修饰的热启动Taq酶、3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗制品修饰的热启动Taq酶、N-乙氧羰基-2,3-二取代丁烯二酰亚胺修饰的热启动Taq酶在37℃保存7天后表现出基本一致的稳定性。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gagcccgccg cccggccccg cgcaggcccc gcccgggact cccctgcggt ccaggccgcg 60
ccccgggctc cgcgccagcc aatgagcgcc gcccggccgg gcgtgccccc gcgccccaag 120
cataaaccct ggcgcgctcg cgggccggca ctcttctggt ccccacagac tc 172
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gagtctgtgg ggag 14
Claims (11)
1.一种Taq酶可逆修饰剂，其特征在于，所述Taq酶可逆修饰剂的结构如式(Ⅰ)所示
其中，R1为C3-6烷基；
R2和R3分别独立地为C1-6烷基。
2.根据权利要求1所述的Taq酶可逆修饰剂，其特征在于，
R1为未取代的C3-6直链烷基；
和/或，R2和R3分别独立地为C1-4烷基。
3.根据权利要求1所述的Taq酶可逆修饰剂，其特征在于，
R1为正丙基、正丁基、正戊基或正己基；
和/或，R2和R3分别独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基。
4.根据权利要求1所述的Taq酶可逆修饰剂，其特征在于，所述R1为正己基。
5.根据权利要求1所述的Taq酶可逆修饰剂，其特征在于，所述Taq酶可逆修饰剂的结构如式(Ⅱ)所示
6.根据权利要求5所述的Taq酶可逆修饰剂，其特征在于，所述Taq酶可逆修饰剂由3,4-二甲基-2,5-二羰基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸己酯粗产品使用高效液相色谱纯化获得。
7.一种化学修饰Taq酶，其特征在于，所述化学修饰Taq酶经权利要求1至6中任一项所述的Taq酶可逆修饰剂修饰。
8.一种PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒包括权利要求7所述的化学修饰Taq酶。
9.一种制备权利要求7所述的化学修饰Taq酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将野生型Taq酶和如权利要求1至6中任一项所述的Taq酶可逆修饰剂混合。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述混合在振荡器中进行，所述混合的时间为15至30秒。
11.一种式(Ⅰ)化合物的用途，其特征在于，用于：
(i)制备Taq酶可逆修饰剂；
(ii)可逆修饰Taq酶。
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