附图说明
结合附图阅读本发明,通过下文的详细说明,使本发明得到最佳理解。强调一点,根据通常的做法,附图的各种特征曲线图不是按比例的。相反,为了清晰明了,各种特征曲线图的尺寸被人为地扩大或缩小。附图包括以下图示:
图1是表示修饰的Afu活瓣(Flap)内切核酸酶-1(FEN-1)的活性测定结果的曲线图。结果表明Afu FEN-1在激活前未显示可观察到的活性。X轴表示循环数。每个循环持续30秒。Y轴为6FAM的信号强度。当Afu FEN-1为活性的,6Fam探针裂解。因此,不发生通过BHQ1的6FAM的淬灭。当酶不存在或完全失活,6FAM信号应仍保持平坦。
图2是表示在95℃的温育部分恢复化学修饰的Afu FEN-1的内切核酸酶活性的曲线图。X轴表示循环数。每个循环持续30秒。Y轴为6FAM信号强度。
图3是表示柠康酸和顺乌头酸修饰的Afu FEN-1间的比较的曲线图。该曲线图表明顺乌头酸修饰的酶和柠康酸修饰的酶都不具有显著的内切核酸酶活性。X轴表示循环数。每个循环持续30秒。Y轴为6FAM的信号强度。
图4是表示在95℃温育10分钟可激活顺乌头酸修饰的酶以及柠康酸修饰的酶的曲线图。如图所示,柠康酸修饰的Afu FEN-1的内切核酸酶活性的恢复比顺乌头酸修饰的Afu FEN-1多60-70%。X轴表示循环数。每个循环持续30秒。Y轴为6FAM的信号强度。
图5是表示在pH 8.0和pH 8.7使用未修饰的酶进行扩增的曲线图。结果表明阈值循环数(Ct)和ΔRn均不受pH的显著影响。X轴为PCR循环数,Y轴表示SYBR
绿荧光染料信号强度的增加。SYBR
绿荧光染料特异地使双链DNA着色,靶核酸成功扩增后得到更多的双链DNA,导致信号增强。
图6是表示在pH 8.0和pH 8.7使用修饰的Taq DNA聚合酶扩增的曲线图。与未修饰的Taq DNA聚合酶相比,用修饰的Taq DNA聚合酶扩增受pH影响很大。例如,pH 8.7系统的Ct比pH 8.0系统高10个循环。X轴为PCR循环数,Y轴表示SYBR
绿荧光染料信号强度的增加。
图7是表示使用DNA聚合酶和6ng未修饰的Afu FEN-1内切核酸酶或可逆性化学修饰的Afu FEN-1内切核酸酶扩增靶核酸的曲线图。结果表明用6ng未修饰的Afu FEN-1进行PCR可成功检测靶核酸,但反应产生的信号比含有可逆性修饰的内切核酸酶的反应产生的信号明显更弱。X轴表示循环数,Y轴为6FAM的信号强度。
图8是表示用DNA聚合酶和10ng未修饰的Afu FEN-1内切核酸酶或可逆性化学修饰的Afu FEN-1内切核酸酶扩增靶核酸的曲线图。结果表明,10ng未修饰的Afu FEN-1完全无法检测靶核酸,与它不同的是10ng修饰的Afu FEN-1能成功检测。X轴表示循环数,Y轴为6FAM信号强度。
图9是表示在如实施例部分所述的快速热循环条件下,使用本发明修饰的DNA聚合酶(表示为c.酸修饰的)和使用酐修饰的热稳定DNA聚合酶扩增靶3序列(见表6)间的比较曲线图。X轴为PCR循环数,Y轴表示荧光染料信号强度的增加。各种酶的多重线表示重复的实验。
图10是表示在如实施例部分所述的快速热循环条件下,使用本发明修饰的DNA聚合酶(表示为c.酸修饰的)和使用酐修饰的热稳定DNA聚合酶扩增靶5序列(见表6)间的比较曲线图。X轴为PCR循环数,Y轴表示荧光染料信号强度的增加。各种酶的多重线表示重复的实验。
图11是表示在如实施例部分所述的快速热循环条件下,使用本发明修饰的DNA聚合酶(表示为c.酸修饰的)和使用酐修饰的热稳定DNA聚合酶扩增靶8序列(见表6)间的比较曲线图。X轴为PCR循环数,Y轴表示荧光染料信号强度的增加。各种酶的多重线表示重复的实验。
图12为用由羧酸和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)——一种水溶性碳二亚胺形成的活性酯修饰热稳定酶的示例性反应路线。将羧酸和EDC混合形成活性酯O-酰基异脲。该活性酯加至包含热稳定酶的酶组合物中时,主要通过酶的赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键来修饰热稳定酶。加热修饰酶导致酰胺键的水解和酶的激活。
图13为用由羧酸和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)形成的活性酯修饰热稳定酶的示例性反应路线。DCC是在水和有机溶剂中可溶的碳二亚胺。将羧酸和DCC混合形成活性酯——O-酰基异脲。该活性酯加至包含热稳定酶的酶组合物中时,主要通过酶的赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键来修饰热稳定酶。加热修饰酶导致酰胺键的水解和酶的激活。
图14为用由羧酸和N-乙基-3-苯基异噁唑-3’-磺酸盐(伍德沃德氏试剂K)形成的活性酯修饰热稳定酶的示例性反应路线。在碱性条件下伍德沃德氏试剂K转变成反应性的酮式烯酮亚胺(ketoketeneimine)。该反应中间体与羧酸形成烯醇酯。烯醇酯加至酶溶液中时很容易受到亲核攻击。烯醇酯与氨基例如热稳定酶的赖氨酸残基的ε-氨基,反应形成酰胺键。加热修饰酶导致酰胺键的水解和酶的激活。
图15为用N-酰基咪唑修饰热稳定酶的示例性反应路线。N-酰基咪唑由羧酸和N,N’-羰基二咪唑(CDI)形成。由于二氧化碳和咪唑的释放,由该反应得到的N-酰基咪唑产量较高。N-酰基咪唑与热稳定酶的氨基在合适的缓冲水溶液中高度反应形成酰胺键。加热修饰酶导致酰胺键的水解和酶的激活。
图16为用N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)酯修饰热稳定酶的示例性反应路线。sulfo-NHS酯由羧酸、碳二亚胺和sulfo-NHS形成。将羧酸和EDC混合得到活性酯O-酰基异脲。该活性酯进一步与sulfo-NHS反应形成更稳定的sulfo-NHS酯。活性sulfo-NHS酯加至包含热稳定酶的酶组合物中时,主要通过酶的赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键来修饰热稳定酶。加热修饰酶导致酰胺键的水解和酶的激活。
图17为用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯修饰酶的示例性反应路线。NHS酯由羧酸、碳二亚胺和NHS形成。将羧酸和EDC混合得到活性酯——O-酰基异脲。该活性酯进一步与NHS反应形成更稳定的NHS酯。活性NHS酯加至包含热稳定酶的组合物中时,主要通过由酶的赖氨酸残基的ε-氨基形成酰胺键来修饰热稳定酶。加热修饰酶导致酰胺键的水解和酶的激活。
图18表示当DCC用作零长交联剂时的可能的副反应。具体地说就是发生O-酰基异脲向N-酰基异脲的自发重排。O-酰基异脲为活性形式,而N-酰基异脲为非活性形式。
图19表示当DCC用作零长交联剂时的第二种可能的副反应。具体地说就是在氨基酸的存在下形成二氢唑酮。尽管二氢唑酮与氨基反应,但它并不作为零长交联剂发挥作用。取而代之地是开环酰胺键的形成产生不同的分子。
定义
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用以包含核苷酸的聚合形式,所述核苷酸是核糖核苷酸,或者是脱氧核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构。因此该术语包括三链、双链和单链DNA,以及三链、双链和单链RNA。它还包括多核苷酸的例如经甲基化和/或加帽的修饰和未修饰形式。更具体地说,术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)、嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任意其它种类的多核苷酸,和含非核苷酸骨架例如聚酰胺(如肽核酸(PNA)和聚吗啉(polymorpholino)(以Neugene的形式,可购自Anti-Virals,Inc.,Corvallis,Oreg.,)聚合物的其它聚合物,以及其它合成的序列特异的核酸聚合物,条件是聚合物在构型中含有核碱基(nucleobase),所述构型可使碱基配对和碱基层叠,这种情形存在于DNA和RNA中。
除非特别另外说明,术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”并不应以长度来区分,这些术语将互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此这些术语包括,例如3’-脱氧-2’,5’-DNA,寡脱氧核糖核苷酸N3’P5’磷酰胺、2’-O-烷基取代的RNA、双链和单链DNA以及双链和单链RNA,DNA:RNA杂交型和PNA与DNA或RNA的杂交型,还包括已知类型的修饰,例如本领域已知的标记、甲基化、“加帽”,类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的取代、核苷酸间(internucleotide)修饰例如以不带电的键(甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)、以带负电的键(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、和以带正电的键的修饰(如氨基烷基磷酰胺、氨基烷基磷酸三酯),含侧链部分例如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)的修饰,嵌入剂(如吖啶、补骨脂内酯等)的修饰、含螯合剂(如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含烷化剂(alkylator)的修饰、以修饰的键(如α-异头核酸等)修饰,以及多核苷酸或寡核苷酸的未修饰形式。具体而言,DNA为脱氧核糖核酸。
说明书全文中,使用缩写来指代核苷酸(也指代碱基),包括指代多种核苷酸的缩写。如本文所使用,G=鸟嘌呤、A=腺嘌呤、T=胸腺嘧啶、C=胞嘧啶,以及U=尿嘧啶。另外,R=嘌呤核苷酸(A或G)、Y=嘧啶核苷酸(C或T(U))、S=C或G、W=A或T(U)、M=A或C、K=G或T(U)、V=A、C或G、以及N=任意核苷酸(A、T(U)、C或G)。全文可使用小写或大写字母来指代核苷酸。还应理解的是,说明书中提供的DNA的核苷酸序列也代表RNA的核苷酸序列,其中T被U替换。
本文所使用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。
本文所使用的术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸组成的聚合物。当使用DNA序列的核苷酸提供核酸序列时,应理解为该序列包括互补的DNA序列,还进一步包括基于给定的DNA序列或其互补序列的RNA序列,其中尿嘧啶(U)替换了DNA序列或其互补序列中的胸腺嘧啶(T)。
两个核苷酸序列彼此“互补”是指这些分子共享碱基对组成的同源性。“互补”的核苷酸序列在合适的杂交条件下特异地结合,形成稳定的双链。例如当其中一序列的一片段以反平行意义结合到另一序列的一片段上,其中各序列的3’末端与另一序列的5’末端结合,并且一个序列的每个A、T(U)、G和C分别与另一序列的T(U)、A、C和G匹配,那么这两条序列就是互补的。RNA序列还可包括互补的G=U或U=G碱基对。因此,本发明中不需要完全的同源性来“互补”。通常当确定长度的分子至少有约85%(优选至少约90%,更优选至少约95%)核苷酸共享碱基对组成,两序列就足以互补。
本文所使用的术语“分离的”,在分离的化合物的内容中使用时,是指在不同于化合物天然存在环境的环境中的目标化合物。“分离的”意在包括样品中的化合物,所述样品为基本富集了目标化合物和/或其中目标化合物被部分或基本纯化的样品。术语“分离的”包括这样一种情况,即所列出的物质不伴有至少一些它在天然状态下通常伴有的物质,优选地,在给定的样品中,所列出的物质以重量计占总蛋白的至少约0.5%,更优选更少约5%。例如,就多核苷酸而言,术语“分离的”通常是指完全或部分缺乏天然状态下通常与其结合的序列,或者如同它天然存在形式但有异源序列与之结合的序列,或者从染色体解离的分子。
本文所使用的术语“纯化的”是指列举的物质构成蛋白质总重的至少大约75%,优选至少大约80%,尤其优选至少大约90%。如本文所使用的,术语“基本纯”是指从其天然环境中移出的化合物至少60%不含,优选75%不含,最优选90%不含它天然结合的其它成分。
多核苷酸“源于”或“特异于”指定序列,例如靶核酸的靶序列,是指与指定的核苷酸序列相应(即相同或互补)的、含至少大约6个核苷酸连续序列的多核苷酸序列,优选至少有大约8个核苷酸、更优选至少有大约10-12个核苷酸、更优选至少有大约15-20个核苷酸。所得的多核苷酸不一定以物理方式来源于目标核苷酸序列,而可以任何方式产生,包括但不限于化学合成、复制、逆转录或转录方式,这基于多核苷酸所“源于”或“所特异于”的区域的碱基序列所提供的信息。“源于”或“特异于”指定序列的多核苷酸包括相对于原始多核苷酸而言的有义或反义方向。
本文所使用的用于描述核酸分子的术语“重组”是指基因组、cDNA、哺乳动物、细菌、病毒、半合成、合成的或其他来源的多核苷酸,根据其来源、操作手段、或两者的结合,它与其天然状态时所结合的所有或部分多核苷酸不结合。对蛋白质或多肽而言,所使用的术语“重组”是指通过重组多核苷酸表达产生的多肽。
“DNA依赖的DNA聚合酶”是根据DNA模板合成互补的DNA拷贝的酶。实例包括源于大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶I和噬菌体T7DNA聚合酶。所有已知的DNA依赖的DNA聚合酶需要互补的引物以启动合成。但合适的条件下,DNA依赖的DNA聚合酶可由RNA模板合成互补的DNA拷贝。
“DNA依赖的RNA聚合酶”或“转录酶”是由具有(通常双链)启动子序列的双链或部分双链DNA分子合成RNA多拷贝的酶。在启动子附近的下游特定位置开始以5’至3’方向合成RNA分子(“转录物”)。转录酶的实例为来自大肠杆菌和噬菌体T7、T3和SP6的DNA依赖的RNA聚合酶。
“RNA依赖的DNA聚合酶”或“逆转录酶”是由RNA模板合成互补的DNA拷贝的酶。所有已知的逆转录酶也具有由DNA模板获得互补DNA拷贝的能力;因此,它们既是RNA依赖的DNA聚合酶又是DNA依赖的DNA聚合酶。在RNA模板和DNA模板上启动合成时均需要引物。
“RNA酶H”为降解RNA:DNA双链的RNA部分的酶。该酶可以是内切核酸酶或者外切核酸酶。通常大多逆转录酶除了它们的聚合酶活性外还包含RNA酶H的活性。然而,可获得无相关聚合酶活性的其它来源的RNA酶H。由RNA酶H介导的RNA的降解可导致RNA脱离于RNA:DNA复合体,或者RNA酶H可在多个位置切割RNA从而使部分RNA解链或者允许酶使部分RNA解旋。
本文所使用的术语“靶核酸区域”或“靶核酸”或“靶分子”是指具有待检测(如通过扩增)的“靶序列”的核酸分子。靶核酸可以是单链或双链,除了靶序列外可以包括或不包括其它序列(例如靶核酸可以包括或不包括上游核酸序列或5’侧翼序列,可以包括或不包括上游或3’侧翼序列,在某些实施方案中可以不包括相对于靶序列的上游(5’)或下游(3’)核酸序列。)。经扩增检测时,这些除了靶序列以外的其它序列可以随着或不随靶序列扩增。
术语“靶序列”是指待检测(如通过扩增)的靶核酸的特定核苷酸序列。靶序列可包括靶分子内所含的探针杂交区域,探针将在所需的条件下与其形成稳定的杂交体。“靶序列”还可包括寡核苷酸引物所复合的并且可用靶序列作模板而延伸的复合序列。当靶核酸原本为单链,术语“靶序列”还指与靶核酸中存在的“靶序列”互补的序列。如果“靶核酸”原本为双链,术语“靶序列”是指正链(+)和负链(-)。而且,当“靶序列”的序列是本文所提供的,应理解的是该序列可以是DNA或RNA。因此,当提供的是DNA序列时,也要考虑RNA序列,RNA序列很容易通过将“U”替换DNA序列的“T”获得。
本文所使用的术语“引物”或“寡核苷酸引物”是指将其置于诱导引物延伸产物合成的条件下时,发挥启动互补核酸链合成作用的寡核苷酸,所述诱导引物延伸产物合成的条件为例如,在核苷酸和聚合作用诱导物例如DNA或RNA聚合酶的存在下,并且在合适的温度、pH、金属浓度、和盐浓度时。通常引物长度与它们在合成引物延伸产物中的用途相适应,通常引物长度范围在8至100个核苷酸,如10至75、15至60、15至40、18至30、20至40、21至50、22至45、25至40等,更典型的范围在18-40、20-35、21-30个核苷酸长度、以及在所述范围之间的任何长度。典型的引物范围可为10-50个核苷酸长度,例如15-45、18-40、20-30、21-25等,以及在所述范围之间的任何长度。在某些实施方案中,通常引物不超过大约10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸长度,更通常地不超过大约10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度,更通常地不超过大约10、12、15、20、21、22、23、24或25个核苷酸长度。
为了扩增中的最大效率,引物通常为单链,但也可为双链。如果为双链,在用于制备延伸产物之前,通常首先处理引物使之解链。一般通过加热来作用于该变性步骤,但也可使用碱来进行,然后中和。因此,“引物”与模板互补,并且通过与模板以氢键结合或杂交得到引物/模版复合物,使聚合酶启动合成,在DNA合成过程中通过加入在其与模板互补的3’末端连接的共价结合的碱基来延长上述复合物。
本文所使用的术语“引物对”是指第一和第二引物,它们具有适合基于核酸的靶核酸扩增的核酸序列。该引物对通常包括具有与靶核酸的前一部分序列相同或类似序列的第一引物和具有与靶核酸的第二部分互补的第二引物,用以扩增靶核酸或其片段。除非另外特别指出,此处“第一”和“第二”引物的提出是任意的。例如,第一引物可以指定为“正向引物”(该引物自靶核酸的5’末端开始合成核酸)或者指定为“反向引物”(该引物从由正向引物开始合成的延伸产物的5’末端开始合成核酸)。同样,第二引物可指定为正向引物或反向引物。
本文所使用的术语“引物延伸”既指使用引物作为起始点通过单个三磷酸核苷的聚合而得的DNA的合成,也指向引物中加入其它的寡核苷酸来延伸引物。本文所使用的术语“引物延伸”意在包括连接两个寡核苷酸以形成更长的产物,该产物可在将来的扩增循环中用作靶。本文所使用的术语“引物”意在包括连接所介导的扩增过程中所使用的寡核苷酸,该寡核苷酸通过在邻近位点杂交的另外的寡核苷酸的连接得到延长。
引物可包含能检测或固定引物但不改变对引物启动DNA合成很重要的引物基本特性的其它特征。例如,引物在5’末端可包含不与靶核酸杂交但促进扩增产物克隆的其它核酸序列。与模板足够互补可以发生杂交的引物区域在本文中称为杂交区域。
术语“非特异性扩增”是指使得引物与非靶序列的序列杂交,而后用作引物延伸的底物的非靶序列的核酸序列扩增。引物与非靶序列的杂交称为“非特异性杂交”,它可在较低温度、预反应条件的严格性降低时发生。
术语“反应混合物”是指含有进行既定反应所必需的试剂的溶液。“扩增反应混合物”是指含有进行扩增反应所必需的试剂的溶液,它通常包括在合适的缓冲液中的寡核苷酸引物和DNA聚合酶或连接酶。“PCR反应混合物”通常含有在合适的缓冲液中的寡核苷酸引物、热稳定DNA聚合酶、dNTP和二价金属阳离子。若反应混合物包括进行反应所需要的所有试剂,则反应混合物称为完全的反应混合物,若它只含有部分所需要的试剂,则称为不完全的反应混合物。本领域普通技术人员应知道,为了方便、储存稳定性的原因,以及为了根据用途而独立调整组分浓度,反应组分通常以各自的溶液储存,每种溶液含有所有组分的一部分,而且应知道,在反应前将反应组分混合得到完全的反应混合物。
如本文所使用,在本文中互换使用的术语“探针”或“寡核苷酸探针”是指由多核苷酸组成的结构,如上述定义,该结构含有与存在于靶核酸分析物(如核酸扩增产物)中的核酸序列互补的核酸序列。探针的多核苷酸区域可由DNA和/或RNA和/或合成的核苷酸类似物组成。探针长度通常与其在靶核酸的所有靶序列或部分靶序列的特异检测中的用途相适应,通常长度范围在8至100个核苷酸之间,如8至75、10至74、12至72、15至60、15至40、18至30、20至40、21至50、22至45、25至40等,更通常地,范围在18-40、20-35、21-30个核苷酸长,以及所述范围间的任意长度。通常探针范围在10-15个核苷酸长,如15-45、18-40、20-30、21-28、22-25等,以及所述范围间的任意长度。在某些实施方案中,通常探针不超过大约10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸长,更通常地,不超过大约10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40个核苷酸长,更通常地不超过大约10、12、15、20、21、22、23、24或25个核苷酸长。
本文所考虑的探针包括含有可检测标记的探针。例如,“寡核苷酸探针”用于5’核酸酶检测如TaqManTM检测时,探针包括至少一种荧光剂和至少一种猝灭剂,该探针可被反应中使用的聚合酶的5’内切核酸酶活性消化,以检测任何扩增的靶寡核苷酸序列。在此情况下,寡核苷酸探针在其5’末端附近应具有足够数目的磷酸二酯键,以便所使用的5’至3’核酸酶活性可有效地降解结合的探针从而分离荧光剂和猝灭剂。在TMA技术中使用寡核苷酸探针时,如以下所述,它应被适当地标记。
本文所使用的术语“标记”和“可检测的标记”是指能检测的分子,包括但不限于,放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、生色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(如生物素、抗生物素蛋白、链霉菌抗生物素蛋白或半抗原)等。术语“荧光剂”是指能在可检测的范围内显示荧光的物质或物质的一部分。
术语“进行杂交”和“杂交”是指在足以通过沃森-克里克(watson-crick)碱基对互补形成复合物的核苷酸序列间形成复合物。引物与靶(模板)“杂交”时,该复合物(或杂交体)对于满足例如DNA聚合酶为启动DNA合成所需的引导功能而言足够稳定。
术语“严格的条件”是指引物优先与互补结合的匹配部分杂交或与其特异结合,并且较低程度地或完全不与其它序列杂交或结合的条件。另一种表达,本文所使用的术语“严格的杂交条件”是指在互补结合的成员间产生双链的相适应的条件,例如在探针与样品的互补靶之间,例如双链核酸探针如DNA探针和存在于样品中的它们相应的核酸靶如存在于样品中的相应的mRNA分析物之间。
本文所使用的术语“结合对”是指彼此特异结合的第一和第二分子,例如能形成核酸双链的互补的多核苷酸对。样品中结合对的第一成员与结合对的第二成员“特异性结合”的证据是第一成员与第二成员(反之亦然)结合的亲合性和特异性要大于与样品中的其他组分结合。结合对成员间的结合一般为非共价结合。
“选择性结合”是指分子优选与目标靶结合或者以较强的亲合性与靶而非其它分子结合。例如,DNA分子与基本互补的序列结合,而不与不相关的序列结合。
在核酸杂交内容中(例如在阵列、Sourthern或Northern杂交中),“严格的杂交”和“严格的杂交洗涤条件”是序列依赖性的,并且在不同的环境参数下不同。用于在本发明范围内鉴定核酸的严格的杂交条件可包括,例如42℃时在含50%甲酰胺、5×SSC和1%SDS的缓冲液中杂交,或者65℃时在含5×SSC和1%SDS的缓冲液中杂交,两者均在65℃时用0.2×SSC和0.1%SDS洗涤。示例的严格的杂交条件还可包括37℃时在40%甲酰胺、1M NaCl和1%SDS的缓冲液中杂交,并在45℃时在1×SSC中洗涤。或者,采用在65℃下,0.5M NaHPO4、7%十二烷基硫酸钠(SDS)、1mnM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交,并在68℃下,0.1×SSC/0.1%SDS中洗涤。其它严格的杂交条件还包括在60℃或以上,3×SSC(450mM氯化钠/45mM柠檬酸钠)中杂交,或者在42℃在含30%甲酰胺、1M NaCl、0.5%肌氨酸钠、50mM MES、pH 6.5的溶液中温育。本领域普通技术人员很容易认识到,备选的但等同的杂交和洗涤条件可用于提供类似严格的条件。
在某些实施方案中,洗涤条件的严格性决定了确定核酸是否与探针特异结合的条件。用于鉴定核酸的洗涤条件包括例如在pH 7的盐浓度约0.02摩尔,温度为至少约50℃或约55℃至约60℃;或者盐浓度大约为0.15M NaCl,72℃约15min;或者盐浓度大约为0.2×SSC,温度至少在约50℃或约55℃至约60℃,约15至约20分钟;或者,杂交复合物用含有0.1%SDS的盐浓度约2×SSC的溶液室温洗涤15min两次;然后用含0.1%SDS的0.1×SSC在68℃洗涤15min两次;或者等效条件。严格的洗涤条件还可以是例如42℃下0.2×SSC/0.1%SDS。在核酸分子为脱氧寡核苷酸(“寡聚物(oligo)”)的情况下,严格的条件可包括在6×SSC/0.05%焦磷酸钠中在37℃(对于14个碱基寡聚物而言)、48℃(对于17个碱基寡聚物而言)、55℃(对于20个碱基寡聚物而言)、以及60℃(对于23个碱基寡聚物而言)洗涤。参见Sambrook、Ausubel或Tijssen(以下引用)的等效的杂交和洗涤条件的详细说明和试剂与缓冲液,例如SSC缓冲液和等效试剂和条件。
严格的杂交条件为至少与上述代表性条件一样严格的杂交条件,其中如果条件的严格程度达到上述特定严格条件的至少约80%,典型地至少约90%,就认为条件至少与上述条件一样严格。其它严格杂交条件在本领域是已知的,也可以被适宜地使用。
双链DNA的“解链温度”或“Tm”定义为由于加热或者其它的碱基对间氢键离解例如经酸或碱处理等,DNA丧失一半螺旋结构的温度。DNA分子的Tm取决于它的长度和它的碱基组成。GC碱基对丰富的DNA分子具有的Tm比AT碱基对丰富的分子高。当温度降低到低于Tm,分离的互补的DNA链自发地再结合或退火而形成双链DNA。最高核酸杂交率在低于Tm的大约25℃发生。Tm可用以下关系估算:Tm=69.3+0.41(GC)%(Marmur et al.(1962)J.Mol.Biol.5:109-118)。
本文所使用的术语“有机基团”和“有机根”意为任何含碳基团,包括可分为脂基(aliphatic group)、环基、芳基、及其官能化衍生物和/或其各种组合的烃基。术语“脂基”是指饱和或不饱和的线型或分支烃基,包括例如烷基、烯基和炔基。术语“烷基”是指取代的或未取代的、饱和线性或分支的烃基或烃链(如C1至C8)包括,例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、异丙基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基等。合适的取代基包括羧基、保护的羧基、氨基、保护的氨基、卤素、羟基、保护的羟基、硝基、氰基、单取代氨基、保护的单取代氨基、二取代氨基、C1至C7烷氧基、C1至C7酰基、C1至C7酰氧基等。术语“取代的烷基”是指上述定义的烷基被以下基团取代一至三次,所述基团为:羟基、保护的羟基、氨基、保护的氨基、氰基、卤素、三氟甲基、单取代氨基、二取代氨基、低级烷氧基、低级烷基硫代、羧基、保护的羧基或者羧基、氨基和/或羟基盐。与杂芳环的取代基一起使用的术语“取代的(环烷基)烷基”和“取代的环烷基”,如下文定义,被“取代的烷基”所列的相同的基团取代。术语“烯基”是指含一个或多个碳-碳双键的不饱和线型或分支烃基,如乙烯基。术语“炔基”是指含一个或多个碳-碳叁键的不饱和线型或分支烃基。术语“环基”是指闭环烃基,分为脂环基、芳基或杂环基。术语“脂环基”是指具有与那些脂基相似性质的环烃基。术语“芳香基”或“芳基”是指单或多环芳香烃基,可包括一个或多个杂原子,下文将进一步定义。术语“杂环基”是指其中环上一个或多个原子为非碳元素(如氮、氧、硫等)的闭环烃基,下文将进一步定义。
“有机基团”可官能化或者另包括其它与保护或未保护的羧基、氨基、羟基等有机基团结合的其它官能度(functionality)。例如词组“烷基”意在不仅包括单纯的开链饱和的烃烷基取代基如甲基、乙基、丙基、叔丁基等,还包括这样一些烷基取代基,它们带有本领域已知的其他取代基,如羟基、烷氧基、烷基磺酰基、卤素原子、氰基、硝基、氨基、羧基等。因此“烷基”包括醚、酯、卤代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羟基烷基、磺烷基等。
术语“卤”和“卤素”是指氟、氯、溴或碘基团。可以有一个或多个相同或不同的卤素。特别关注的卤素包括氯和溴基团。
术语“卤代烷基”是指被一个或多个卤原子取代的上述定义的烷基。卤原子可以相同或者不同。术语“二卤代烷基”是指被两个可以相同或不同的卤原子取代的上述定义的烷基。术语“三卤代烷基”是指被三个可以相同或不同的卤素基团取代的上述定义的烷基。术语“全卤代烷基”是指其中烷基的每个氢原子已被卤原子替换的上述定义的卤代烷基。术语“全氟代烷基”是指其中烷基的每个氢原子已被氟替换的上述定义的卤代烷基。
术语“环烷基”是指单、二或三环的饱和环,该饱和环完全饱和或部分不饱和。所述基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基(adamantyl)、环辛基、顺式-或反式-萘烷、二环[2.2.1]庚-2-烯、环己-1-烯基、环戊-1-烯基、1,4-环辛二烯基等。
术语“(环烷基)烷基”意为取代上述一个环烷基环的上述定义的烷基基团。所述基团的实例包括(环己基)甲基、3-(环丙基)-正丙基、5-(环戊基)己基、6-(金刚烷基)己基等。
术语“取代的苯基”是指一个或多个部分取代,在某些实例中被一个、两个或三个部分取代的苯基,所述部分选自卤素、羟基、保护的羟基、氰基、硝基、三氟甲基、C1至C7烷基、C1至C7烷氧基、C1至C7酰基、C1至C7酰氧基、羧基、氧羧基、保护的羧基、羧甲基、保护的羧甲基、羟甲基、保护的羟甲基、氨基、保护的氨基、(单取代)氨基、保护的(单取代)氨基、(二取代)氨基、氨甲酰基(carboxamide)、保护的氨甲酰基、N-(C1至C6烷基)氨甲酰基、保护的N-(C1至C6烷基)氨甲酰基、N,N-二(C1至C6烷基)氨甲酰基、三氟甲基、N-((C1至C6烷基)磺酰)氨基、N-(苯磺酰)氨基或取代或未取代的苯基,得到例如联苯基或萘基。
术语“取代的苯基”的实例包括单或二(卤代)苯基,例如2,3或4-氯苯基、2,6-二氯苯基、2,5-二氯苯基、3,4-二氯苯基、2,3或4-溴苯基、3,4-二溴苯基、3-氯-4-氟苯基、2,3或4-氟苯基等;单或二(羟基)苯基,例如2,3或4-羟苯基、2,4-二羟苯基、其保护的羟基衍生物等;硝基苯基,例如2,3或4-硝基苯基;氰基苯基,例如2,3或4-氰基苯基;单或二(烷基)苯基,例如2,3或4-甲苯基、2,4-二甲苯基、2,3或4-(异丙基)苯基、2,3或4-乙苯基、2,3或4-(正丙基)苯基等;单或二(烷氧基)苯基,例如2,6-二甲氧苯基、2,3或4-(异丙氧)苯基、2,3或4-(叔丁氧)苯基、3-乙氧-4-甲氧苯基等;2,3或4-三氟甲基苯基;单或二羧基苯基或(保护的羧基)苯基,例如2,3或4-羧基苯基或2,4-二(保护的羧基)苯基;单或二(羟甲基)苯基或(保护的羟甲基)苯基,例如2,3或4-(保护的羟甲基)苯基或3,4-二(羟甲基)苯基;单或二(氨甲基)苯基或(保护的氨甲基)苯基,例如2,3或4-(氨甲基)苯基或2,4-(保护的氨甲基)苯基;或者单或二(N-(甲磺酰氨基))苯基,例如2,3或4-(N-(甲磺酰氨基))苯基。术语“取代的苯基”还表示其中取代基不同的二取代苯基,例如3-甲基-4-羟苯基、3-氯-4-羟苯基、2-甲氧基-4-溴苯基、4-乙基-2-羟苯基、3-羟基-4-硝基苯基、2-羟基-4-氯苯基等。
术语“(取代的苯基)烷基”是指与上述烷基相连的上述取代的苯基。所述基团包括的实例,例如2-苯基-1-氯乙基、2-(4’-甲氧苯基)乙基、4-(2’,6’-二羟苯基)正己基、2-(5’-氰基-3’-甲氧苯基)正戊基、3-(2’,6’-二甲苯基)正丙基、4-氯-3-氨苄基、6-(4’-甲氧苯基)-3-羧基(正己基)、5-(4’-氨甲基苯基)-3-(氨甲基)正戊基、5-苯基-3-氧代-正戊-1-基、(4-羟萘-2-基)甲基等。
以上所指出的术语“芳香的”或“芳基”是指六元碳环。也是以上所指出的,术语“杂芳基”表示具有1至4个杂原子的任选取代的五元或六元环,所述杂原子例如氧、硫和/或氮原子,尤其是氮,单独为环原子或者与硫或氧共同为环原子。
而且,上述任选取代的五元或六元环可任选与芳香五元或六元环系统稠合。例如,环可任选地与例如吡啶或三唑系统等芳香的五元或六元环系统稠合,优选与苯环稠合。
以下环系统为以术语“杂芳基”表示的杂环(取代或未取代的)基的实例:噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡咯烷基、咪唑基、异噁唑基、三唑基、噻二唑基(thiadiazolyl)、噁二唑基(oxadiazolyl)、四唑基、噻三唑基、噁三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、噁嗪基、三嗪基、噻二嗪基(thiadiazolyl)、四唑并、1,5-[b]哒嗪基和嘌呤基(purinyl),以及苯并稠合的衍生物例如苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基和吲哚基。
上述任选取代的杂环的取代基为一至三个卤素、三卤代甲基、氨基、保护的氨基、氨基盐、单取代氨基、二取代氨基、羧基、保护的羧基、羧化物盐、羟基、保护的羟基、羟基的盐、低级烷氧基、低级烷基硫代、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、(环烷基)烷基、取代的(环烷基)烷基、苯基、取代的苯基、苯基烷基、和(取代的苯基)烷基。杂芳基的取代基同前文所定义,或者当为三卤甲基时可以是三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基或三碘甲基。与上述杂芳环取代基一起使用的,“低级烷氧基”是指C1至C4烷氧基、类似地,“低级烷基硫代”是指C1至C4烷基硫代基团。
术语“(单取代)氨基”是指含一个取代基的氨基,所述取代基选自苯基、取代的苯基、烷基、取代的烷基、C1至C4酰基、C2至C7烯基、C2至C7取代的烯基、C2至C7炔基、C7至C16烷基芳基、C7至C16取代的烷基芳基和杂芳基。(单取代)氨基还可拥有包括在术语“保护的(单取代)氨基”中的氨基保护基团。术语“(二取代)氨基”是指含两个取代基的氨基,所述取代基选自苯基、取代的苯基、烷基、取代的烷基、C1至C7酰基、C2至C7烯基、C2至C7炔基、C7至C16烷基芳基、C7至C16取代的烷基芳基和杂芳基。这两个取代基可以相同或者不同。
术语“杂芳基(烷基)”表示在任何位置被以上所述的杂芳基取代的上述定义的烷基。
术语“评价”包括任何形式的测量,包括确定某要素存在或不存在。术语“测定”、“测量”、“评估”、“评价”和“检测”可互换使用,包括定量和定性测定。评价可以是相对的或者绝对的。“评价……存在”包括确定某要素存在的量,和/或测定它是否存在。如本文所使用的,术语“测定”、“测量”、“评估”、“评价”和“检测”可互换使用,包括定量测定和定性测定。
“精密度”是指对于给定的样品,一项检测重复给出相同或相当的结果的能力。
“准确度”是指在同时含阳性和阴性样品的盲组中,一项检测正确检测靶分子的能力。
具体实施方式
本发明提供可逆性修饰的热稳定酶组合物。还提供制备主题组合物的方法,例如通过用羧酸修饰剂修饰热稳定酶。本发明还提供使用可逆性修饰的热稳定酶组合物的方法,以及包含可逆性修饰的热稳定酶组合物的试剂盒和系统。
在进一步描述本发明之前,应该理解的是因为实施方案当然是可以变化的,所以本发明不限于具体所述的实施方案。还应理解的是本文所使用的命名法是只是为了描述具体的实施方案,而不应认为是限制本发明,因为本发明的范围只受随附权利要求的限制。
当给定一个数值范围时,应理解为在该范围的上限和下限之间的所有中间数值(以下限为单位隔十分之一取值)也具体公开,除非上下文另有明确说明。在所述范围中的任何所述值或中间值和所述范围中的任何其它所述值或中间值之间的每个较小的范围包括在本发明范围内。这些较小的范围的上限和下限可独立地包括在范围内或排除在范围外,任一界限、两界限均不或两界限均包括在较小范围内的每个范围,也包括在本发明内,除非任何界限被明确排除在所述范围之外。所述范围包括一个或两个界限的,排除所包括的一个或两个界限的范围也包括在本发明中。
除非另外定义,本文所使用的技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。尽管任何与本发明所述的方法和材料类似或相当的方法和材料可用于实施或测试本发明,但在此优选的方法和材料得到描述。本文所提及的所有出版物通过引用的方式纳入本文用以公开和描述引用出版物所相关的方法和/或材料。应该理解,在出现矛盾的情况下,本发明的公开内容应取代所引用的出版物的任何公开内容。
必须注意的是,除非本文另外清楚地指明,在本文和随附的权利要求中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括所提及物的复数形式。因此,例如提及“一种酶”,则包括很多种此类酶,提及“该引物”则包括指一个或多个引物,以及本领域普通技术人员已知的其等同物等。还应注意的是,权利要求可撰写成排除任何可选要素。因此,本声明意在作为使用如“只”、“仅仅”等与叙述权利要求有关的排除性措辞或作为使用“否定性”限制的先行基础。
本文所论述的出版物只是在本申请提交日以前公开的。本文没有任何内容可解释为承认本发明无权根据现有发明标注早于这些出版物的日期。而且,所给的出版日期可能与实际出版日期不同,该实际出版日期可能需要独立地予以证实。
可逆地灭活热稳定酶组合物
如上述所指出的,本发明提供可逆性修饰的热稳定酶组合物。本发明所使用的术语“热稳定酶”是指对热相对稳定的酶。热稳定酶可经受用于除去修饰剂基团的高温——通常在50℃以上——温育,而不遭受不可逆地活性丧失。本发明方法中可用的修饰的热稳定酶包括,例如,热稳定聚合酶例如热稳定DNA聚合酶或热稳定RNA聚合酶、热稳定RNA酶H、热稳定DNA核酸酶例如热稳定DNA内切核酸酶、热稳定DNA连接酶、热稳定逆转录酶、热稳定解旋酶、热稳定RecA等。
在某些实施方案中,所述热稳定酶为热稳定DNA聚合酶。术语“热稳定DNA聚合酶”是指对热相对稳定、并且催化三磷酸核苷聚合以形成与靶序列的一条核酸链互补的引物延伸产物的酶。该酶从引物的3’末端启动合成反应,并沿着朝向模板的5’末端的方向继续直至合成终止。美国专利4,889,818、美国专利5,352,600、美国专利5,079,352、PCT/US90/07639、PCT/US91/05753、PCT/US91/0703、PCT/US91/07076、共同未决的美国专利申请08/062,368、WO 92/09689和美国专利5,210,036中描述了纯化的热稳定DNA聚合酶,各篇通过引用的方式纳入本文。
在某些实施方案中,热稳定酶源于水生栖热菌、嗜热栖热菌、海栖热袍菌、敏捷气热菌、风产液菌、闪烁古生球菌、热坚芽孢杆菌、生氢氧化碳嗜热菌、热自养甲烷杆菌ΔH、詹氏甲烷球菌、炽热甲烷嗜热菌、冰岛热棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈热球菌、Pyrococcushorihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隐蔽热网菌、嗜酸热硫化叶菌、硫磺矿硫化叶菌、热硫化氢热厌氧杆菌、速生热球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcuskodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcuspeptonophilus、90N-7热球菌、TY热球菌、斯氏热球菌、Thermococcuszilligii、嗜酸热原体、Thermus brokianus、Thermus caldophilusGK24、黄栖热菌、红色栖热菌或者它们的突变体。
在某些实施方案中,热稳定酶为热稳定核酸酶,例如热稳定DNA内切核酸酶。在进一步的实施方案中,热稳定核酸酶是来源于闪烁古生球菌的热稳定DNA核酸酶。术语“热稳定内切核酸酶”是指对热相对稳定、并催化DNA分子或RNA分子中核酸间磷酸二酯键水解的酶。
因此,本发明提供已被可逆地灭活的热稳定酶的酶组合物。本文所使用的术语“可逆地灭活”是指通过与导致酶共价修饰(也称化学修饰)的化合物反应而已被灭活的酶,其中修饰剂化合物在适宜的条件下可被除去。
主题酶组合物的一个特征为,修饰的热稳定酶组合物在水性缓冲液中在大约50℃以上的温度温育,包括从约55℃至约100℃,例如约60℃至约95℃、约65℃至约90℃、约70℃至约85℃,包括约80℃以上的温度,使得酶活性至少增加两倍,包括至少增加约三倍、增加约五倍、增加约7倍、增加约10倍,增加约15倍、增加约20倍或更多。缓冲液可配成25℃时约pH 7至约pH 9,包括约pH 7.25至约pH 8.75、约pH 7.5至约pH 8.8、约pH 7.75至约pH 8.25以及大约pH 8.0。
在某些实施方案中,在配制的25℃时约pH 7至约pH 9的水性缓冲液中,在约50℃以上的温度温育修饰的热稳定酶组合物,使酶活性在约20分钟以内至少增加两倍。在其它实施方案中,在配制的25℃时约pH 7至约pH 8的水性缓冲液中,在约50℃以上的温度温育修饰的热稳定酶组合物,使酶活性在约20分钟以内至少增加两倍。
制备主题酶组合物的方法
可使用任何便利的方法制备主题组合物。在典型的实施方案中,如上文所述,通过在足以产生所需酶组合物的条件下,用羧酸修饰剂修饰起始的热稳定酶组合物来制备组合物。
导致修饰剂化合物去除的反应不一定是修饰反应的逆向反应。只要该反应使修饰剂化合物去除,且恢复酶的功能,就可认为该酶是被可逆地灭活的。
根据本发明,用活化的羧酸修饰试剂修饰热稳定酶,其中试剂与酶的反应使得至少一个羧酸基团与热稳定酶的至少一个胺基例如赖氨酸残基的ε-胺基共价连接。在某些实施方案中用零长交联剂或其与sulfo-NHS或NHS化合物联合处理活化羧酸。适用于本发明的羧酸可以是任何可被零长交联剂单独或与其sulfo-NHS或NHS联合活化的,并与热稳定酶形成共价键,而导致热稳定酶灭活的羧酸。
合适的羧酸试剂包括以下通式
其中R为H、取代或未取代的苯基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂芳基、或者取代或未取代的烷基例如取代或未取代的饱和线型或分支烃基或烃链(例如C1至C8),包括例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基。
示例的羧酸试剂包括以下物质:
对修饰任意具体热稳定酶的羧酸试剂的选择,取决于酶的热稳定性和核酸检测步骤所需的温度。具体而言,修饰的热稳定酶的激活作用不应对反应混合物所包含的成分例如模板核酸、dNTP、NAD,或者对用于核酸检测的混合物中的其它蛋白分子例如可用于改进检测的载体蛋白如BSA或明胶造成显著损害。羧酸修饰剂和热稳定酶间形成的共价键的稳定性依赖于对羧酸试剂的选择。
根据本发明的某些实施方案,羧酸试剂与热稳定酶的结合是由零长交联剂介导的。用零长交联剂进行羧酸活化。零长交联剂是指介导羧酸和酶间共价键的形成而不在该键中增加其它原子的化合物。
合适的零长交联剂与羧酸反应以形成-C(O)R1-OR2,其中R1为良好的离去基团。良好的离去基团的实例为:氧琥珀酰亚胺基、氧磺酰琥珀酰亚胺基、1-氧苯并三唑基;R2选自(C4-C20)芳基、环烷基(例如环己烷)、杂环烷基、(C5-C20)芳基、(C5-C20)芳基、被一个或多个相同或不同的吸电子基(例如-NO2、-F、-Cl、-CN、-CF3等)取代的(C5-C20)芳基、杂芳基、被一个或多个相同或不同的吸电子基取代的杂芳基、正二烷基氨基烷基(例如3-二甲氨基丙基)和N-吗啉甲基。合适的化合物的实例包括但不限于碳二亚胺试剂,例如二环己基碳二亚胺(DCC),二异丙基碳二亚胺(DIC),1-甲基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC),1-环己基-3-(2-吗啉乙基)碳二亚胺(CMC),脲(uranium)试剂例如TSTU(O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐)、HBTU((O-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐),活化剂例如1-羟基苯三唑(HOBt),为得到羧酸NHS的酯的N-羟基琥珀酰亚胺;碳二亚胺联合NHS或sulfo-NHS;伍德沃德氏试剂K;N,N’-羰基二咪唑(CDI);TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐);TFFH(N,N’,N”,N”’-四甲基脲2-氟-六氟磷酸盐);PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷-磷六氟磷酸盐);EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉);DIPCDI(二异丙基碳二亚胺);MSNT(1-(均三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1,2,4-三唑);以及芳基磺酰卤化物如三异丙基苯磺酰氯。
在一个实施方案中,零长交联剂为碳二亚胺,例如EDC、CMC、DCC、DIC。在进一步的实施方案中,羧酸试剂为顺乌头酸或者柠康酸。图12中提供了使用EDC的示例反应路线。图13中提供了使用DCC的示例反应路线。碳二亚胺与羧酸试剂形成活性酯。然后活性酯可与热稳定酶分子共价结合。该修饰作用使至少一个羧酸基团和热稳定酶的至少一个胺基如ε-胺基共价结合。EDC和CMC为水溶性的,而DCC在水和有机溶剂中均可溶。DIC不溶于水但可溶于有机溶剂。由于许多羧酸在水和有机溶剂中均可溶,因此可在水性溶剂或有机溶剂或水性/有机混合溶剂中进行羧酸活化。所有分子和反应产物应是稳定的,并且没有显著例如结构重排的副反应。在某些实施方案中,由于在水溶液中形成的活性酯可能会水解,因而在有机溶剂中进行活化,所述有机溶剂例如DMF、DMSO、丙酮、二噁烷、乙腈、THF等。
在另一个实施方案中,零长交联剂为N-乙基-3-苯基异噁唑盐-3’-磺酸盐(伍德沃德氏试剂K)。在进一步的实施方案中,羧酸试剂为顺乌头酸或者柠康酸。图14中提供了使用伍德沃德氏试剂K的示例反应路线。在碱性条件下,首先伍德沃德氏试剂K转变为反应性酮式烯酮亚胺,后者然后用于与羧酸试剂形成烯醇酯。烯醇酯对亲核反应高度敏感。当亲核基团为胺基如赖氨酸的ε-胺基时,结果形成酰胺键。由于烯醇酯迅速水解,对于酶修饰反应建议使用新鲜制备的烯醇酯。
又一个实施方案中,零长交联剂为N,N’-羰基二咪唑(CDI)。在进一步的实施方案中,羧酸试剂为顺乌头酸或柠康酸。在图15中提供了使用CDI的示例反应路线。CDI含有两个酰基咪唑基团,是活性很强的羰基化试剂。羧酸基团与CDI反应形成胺基高反应性N-酰基咪唑。二氧化碳和咪唑的释放使得该反应不可逆,致使产率很高。当胺基攻击N-酰基咪唑时,N-酰基咪唑释放咪唑。结果形成酰胺键。使用CDI激活羧酸应在非水溶剂中进行,这是由于即使是很小的比例,CDI也在水中迅速水解释放二氧化碳和咪唑。无水有机溶剂是活化反应的典型溶剂。
在某些实施方案中,用零长交联剂和可在修饰条件下形成具较高稳定性的活性分子的另一分子进行羧酸试剂活化。在一个实施方案中,第二种分子为sulfo-NHS。图16中提供了使用sulfo-NHS的示例反应路线。第二种化合物例如sulfo-NHS的用途是在水溶液中反应导致较少的sulfo-NHS酯水解,以及由此sulfo-NHS酯重排减少。EDC是广泛使用的水溶性零长交联剂。它与羧酸试剂形成活性酯O-酰基异脲。然而,O-酰基异脲化合物在水溶液中不稳定并且迅速水解(Hoare,1967,JBC,242:2447-2453)。这种快速水解使酶修饰效率较低。然而,sulfo-NHS存在时,O-酰基异脲与sulfo-NHS反应生成与胺基快速反应的亲水性分子sulfo-NHS酯(Staros et al.,1986,Anals.Biochem.,156:220-222)。sulfo-NHS酯在水溶液中以较低的速率水解。它在水中非凡的稳定性使其成为水环境中的酶修饰反应的非常有效的中间体。除了它在稳定性上的优点外,sulfo-NHS酯没有在某些其它活性酯上观察到的副反应。DCC是最频繁使用的偶联试剂之一。已有报道有至少两个与DCC相关的副反应,一个是活性O-酰基异脲自发重排形成非活性N-酰基异脲(图18),另一个是形成不再作为零长交联剂发挥作用的二氢唑酮(图19)。另一个零长交联剂DIC,与DCC作用方式相似。DCC所发生的所有副反应可能同样在DIC上也会发生。相比而言,使用sulfo-NHS酯则与这类问题无关。
在另一个实施方案中,所述分子为NHS。图16中提供了使用sulfo-NHS的示例反应路线。使用NHS的好处与sulfo-NHS基本相同。主要不同是水溶性。与NHS相比,sulfo-NHS和其酯具有改善的水溶性。如果活性酯不在水溶液中形成,NHS可替换sulfo-NHS而不显著影响修饰过程。
热稳定酶的修饰可在一步反应中进行,其中羧酸活化和热稳定酶的修饰同时发生。另外,热稳定酶的修饰可在两步过程中进行。第一步为羧酸试剂的活化,第二步为用预活化的羧酸修饰热稳定酶。为了完全避免零长交联剂和预活化羧酸试剂的水解,第一步可在有机溶剂中进行。在该反应路线中,预活化羧酸的产量可以非常高。不存在水分子时,预活化的羧酸试剂可储存较长时间而不被破坏。第二步是用预活化的羧酸试剂修饰热稳定酶。因为活化的羧酸试剂是预先形成的,所以不需要使用高浓度的反应物就可达到有效的修饰。这就使得使用具有较差水溶性的零长交联剂成为可能。这对控制对于修饰反应很关键的反应体系pH也更容易些。
用途
主题组合物可用于多种不同的用途中,下文对代表性用途作更详细的评述。在代表性的实施方案中,本发明提供使用可逆性修饰的热稳定酶进行核酸检测(如引物延伸)的方法,该方法是将包含靶核酸的样品与一种反应混合物接触,所述反应混合物包含与靶核酸互补的第一引物、修饰的热稳定酶例如修饰的热稳定聚合酶(例如修饰的热稳定DNA聚合酶或修饰的热稳定RNA聚合酶)和核苷酸(例如核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸),将得到的混合物在约50℃以上的温度温育一段时间,该时间内修饰的热稳定聚合酶足以被激活,以便聚合酶由第一引物和靶核酸制得引物延伸产物。
同样,本发明的方法包括含有可逆性修饰的热稳定酶的反应混合物的使用和先于核酸检测方法或作为核酸检测方法的一部分,如扩增反应,使反应混合物耐受高温温育。高温温育导致羧酸基团的释放和热稳定酶的激活。
温度升高和伴随的pH降低导致羧酸基团从修饰的氨基释放。扩增反应通常在室温配制的pH 7.0至约pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中进行。室温时,碱性反应缓冲液条件对修饰形式的热稳定酶有利。尽管室温时反应缓冲液的pH被调到pH 7.0至pH 9.0,但Tris-HCl反应缓冲液的pH随着升高的温度而降低。由于高温反应条件而发生的pH的改变取决于所使用的缓冲液。在Good et al.,1966,Biochemistry 5(2):467-477中报道了对于生物反应中所用的各种缓冲剂的pH的温度依赖性,该内容通过引用的方式纳入本文。就Tris缓冲剂而言,pKa即缓冲范围的中点pH的变化,与温度的关系如下:ΔpKa/℃=-0.031。例如在25℃配制的Tris-HCl缓冲液在温度升至95℃以使温育激活时pKa下降2.17。
尽管引物延伸反应(如扩增反应)通常在Tris-HCl缓冲液中进行,但延伸反应可以在pH随温度而显示较小或较大变化的缓冲液中进行。根据所使用的缓冲剂,可能需要较稳定或较不稳定的修饰酶。例如,使用导致较不稳定的修饰酶的修饰试剂,在缓冲液pH改变较小时可以使足够的酶活性恢复。以上所提供的用各种试剂修饰的酶的相对稳定性的经验性比较,对适于在具体的缓冲液中使用的修饰酶的选择作出指导。
在本发明的方法中,通过在等于或高于在引物延伸反应中所使用的引物杂交(退火)温度下进行温育,完成修饰酶的激活,以确保延伸特异性。恢复酶活性所需的温育时间的长度取决于温度和反应混合物的pH,取决于修饰的热稳定酶的稳定性,所述稳定性取决于制备修饰酶时所使用的修饰剂。可使用大范围的温育条件,对每个反应凭经验确定最佳条件。一般,在约50℃以上的温度下在扩增反应缓冲液中进行温育约10秒至约20分钟。未举例说明的酶复活的温育条件的优化,也未举例说明的反应混合物的温育条件的优化,可通过遵循本文所提供的教导的常规实验来确定。
显而易见的是,对本文所述的检测方法的设计可进行多种变化,许多形式在本领域都是已知的。以下说明内容仅作为指导内容提供,本领域普通技术人员使用本领域公知的技术可很容易地修改所述的方案。
侵入检测法(Invader assay)
在某些实施方案中,可逆性修饰的热稳定酶是可逆性修饰的热稳定核酸酶,例如热稳定内切核酸酶。在所述的实施方案中,可逆性修饰的热稳定核酸酶可用于核酸信号检测分析,例如侵入检测法。侵入检测法是信号扩增方法,公开于美国专利6,348,314、6,090,543、6,001,567、5,985,557、5,846,717和5,837,450中,其公开内容通过引用的方式全文纳入本说明书。它不涉及靶核酸序列扩增或修饰。在它的线型形式中,部分重叠的两个寡核苷酸与靶核酸分子杂交并形成可裂解的结构。杂交探针的酶解产生可检测的信号。裂解本身也可在热力学上促进从靶序列除去裂解的探针。靶核酸序列存在时,探针经历杂交和裂解的循环。信号强度与样品中存在的靶核酸序列的量成线性比例。在一系列裂解中,从第一个反应裂解的产物又一次与两个另外的寡核苷酸形成第二个裂解结构。第二个裂解结构的裂解进一步放大信号(Hall etal,2000,PNAS,97(15):8272-8277)。实现杂交探针裂解的酶为热稳定活瓣内切核酸酶。与其它热稳定酶一样,活瓣内切核酸酶在大范围温度内时活性的,除了所需的裂解靶核酸结构外还可裂解许多核酸结构。存在于反应体系中的寡核苷酸(有些为较高浓度)可形成大量分子内结构和分子间结构。它们中的多数只在低温稳定。这些结构的裂解要么导致背景较高,要么导致可检测信号较低。减少或者完全消除这些不需要的裂解可显著改善检测分析的质量。如本文所公开的活瓣内切核酸酶的化学修饰是避免这类问题的好方法。尽管它不能防止寡核苷酸形成裂解结构,但它可防止这些结构裂解。在反应温度,这些结构不可能足够稳定而不会引起上述检测分析的任何问题。
RNA分子对热敏感,尤其在二价金属离子存在时。因此,使用可逆性修饰的(例如可逆地灭活的)热稳定内切核酸酶是理想的。然而,当前的方法需要在高温例如95℃时延长温育时间以完成激活。这种条件增加了破坏RNA分子的机会,这将间接减小检测的灵敏度。由此,本发明提供了使用多种修饰剂的化学修饰方法。所述的多种修饰剂使得有可能选择可形成具有适当稳定性的酰胺键、从而可在温和条件下进行活化反应的修饰剂。这表明了本发明优于先前的化学修饰方法的重要有利之处。
环形探针检测法(CPA)
如美国专利5,403,711、5,011,769中所公开的,在环形探针检测中,将RNA酶H(优选热稳定RNA酶H)和含核糖核苷酸的探针用于DNA序列检测。RNA酶H是特异地裂解杂交到脱氧核糖核苷酸分子上的核糖核苷酸分子的酶。核糖核苷酸分子的裂解使得RNA分子从DNA分子解离。随后新的完整的RNA探针将结合到靶序列上并被裂解。重复这个过程导致可检测的信号的产生。虽然热稳定RNA酶H的活性的最佳温度较高,但通常它在低温具有显著活性水平。含核糖核苷酸的探针的非特异性杂交将通过RNA酶H引起杂交探针的酶解,这样要么导致高背景,要么导致假阳性的结果。根据本发明可逆性修饰的热稳定RNA酶H将显著改进本检测方法。
聚合酶链反应(PCR)
本发明的方法尤其适于减少PCR中的非特异性扩增。然而,本发明不限于任何具体的扩增系统。
在典型的实施方案中,使用可逆地灭活的热稳定DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增中所用的退火温度一般为约55℃-75℃,预反应的温育在等于活高于退火温度下进行,优选约90℃以上。扩增反应混合物优选在约90℃-100℃时温育最长大约12分钟,以在温度循环前激活DNA聚合酶。时间长度可以是约5秒至约12分钟间的任意时间,包括约30秒至约11分钟、约45秒至约10.5分钟、约1分钟至约10分钟、约1.5分钟至约9.4分钟、约2分钟至约9分钟、约2.5分钟至约8.5分钟、约3分钟至约8分钟、约3.5分钟至约7.5分钟、约4分钟至约7分钟、约4.5分钟至约6.5分钟、约5分钟至约6分钟。对典型的PCR扩增适宜的预反应温育条件,以及不同的预反应温育条件对扩增的影响在实施例中进行描述。
典型的PCR扩增的第一步由靶核酸双链的热变性构成。样品核酸变性所需的确切条件根据样品核酸的长度和组成决定。通常在90℃-100℃温育约10秒,最多至约4分钟,对样品核酸完全变性是有效的。开始的变性步骤可作为预反应的温育以激活可逆性修饰的热稳定DNA聚合酶。然而,根据起始变性步骤的时间和温度,根据用于激活DNA聚合酶的修饰剂,DNA聚合酶活性的恢复可能是不完全的。如果需要最大程度地恢复酶活性,可延长预反应的温育时间,或者,备选地,增加扩增的循环数。
在本发明某些实施方案中,选择在起始温育步骤中仅可恢复部分酶活性的修饰酶和起始变性条件。每个涉及高温变性步骤的随后的PCR循环使得酶活性进一步恢复。因此酶活性的激活延迟到扩增的起始循环以后。已观察到这种DNA聚合酶活性的“驰豫时间”(“time release”),从而进一步降低非特异性扩增。已知过量的DNA聚合酶有助于非特异型扩增。在本发明方法中,DNA聚合酶活性量在扩增起始阶段(此时靶序列数量很少)较低,这就减少了形成的非特异型延伸产物的量。DNA聚合酶最大活性存在于扩增后期,此时靶序列数量较多,存在的最大活性能产生较高的扩增量。如果有必要,可增加扩增循环数来补偿在起始循环中存在的较低量的DNA聚合酶活性。改变扩增循环数对扩增的影响显示于实施例中。
本发明方法的一个优点是该方法不需要在起初制备反应混合物后处理反应混合物。因此该方法对用于自动扩增系统,以及与原位扩增方法一同使用是理想的,其中在起始变性步骤后加入试剂或者使用蜡垒是不方便的或者不实际的。
适于包括扩增反应的每种引物延伸反应的样品制备方法,在本领域中已有描述(参见例如Sambrook et al.,同上,以及以上引用的描述扩增方法的参考文献)。制备用于靶序列的PCR扩增的样品的简单快速的方法在Higuchi,1989,PCR Technology(Erlich主编,StocktonPress,New York)和PCR Protocols,18-20章(Innis et al.,主编,Academic Press,1990)中有描述,通过引用的方式将两篇文献均纳入本文。本领域普通技术人员可选择并凭经验优化合适的方案。
检测扩增产物的方法已广泛描述于文献中。标准方法包括通过凝胶电泳或者通过与寡核苷酸探针杂交的分析。探针和扩增的核酸间所形成的杂交体的检测可以多种形式进行,包括斑点印迹检测形式和反向斑点印迹检测形式。参见Saiki et al,1986,Nature 324:163-166;Saikiet al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6230;PCT专利申请89/11548;美国专利5,008,182和5,176,775;PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications(Innis et al.主编,AcademicPress,San Diego,Calif.):337-347;每篇内容通过引用的方式纳入本文。使用微孔板的反向斑点印迹反方法在共同未决的美国申请141,355;美国专利5,232,829;Loeffelholz et al.,1992,J.Clin.Microbiol.30(11):2847-2851;Mulder et al.,1994,J.Clin.Microbiol.32(2):292-300;和Jackson et al.,1991,AIDS 5:1463-1467中有描述,每篇内容通过引用的方式纳入本文。
连接酶链反应(LCR)
与PCR类似,LCR(Wu and Wallace,1989,Genomics 4:560-569和Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)为涉及热循环的指数式靶扩增方法。LCR相关的低灵敏度检测至少部分归因于热稳定酶在低于其反应温度的温度时的剩余活性。在LCR中,不能区分非模板引导的扩增和模板引导的扩增。如本文公开的可逆性修饰的热稳定连接酶可消除低温时非模板引导的连接。
滚环扩增(RCA)、链替代扩增反应(SDA)、单引物等温扩增(SPIA+)、指数式单引物等温扩增(X-SPIA+)、环介导扩增(LAMP)
可得益于本发明可逆性修饰的热稳定酶的其它扩增方法包括但不限于以下方法:滚环扩增(RCA)(美国专利5,854,033、6,183,960、6,210,884、6,344,329)、链替代扩增反应(SDA)(美国专利5,270,184)、单引物等温扩增(SPIA+)(美国专利5,916,779)、指数式单引物等温扩增(X-SPIA+)(美国专利6,251,639)、环介导扩增(LAMP)(美国专利6,410,278)。上述等温扩增步骤的一个共同组成部分是强链替代活性的DNA聚合酶的使用。在这些技术中使用最广泛的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶大片段。多数反应在60~65℃温度进行。虽然热启动应能改善扩增的特异性、灵敏度和定量化,但还没有已经报道的热启动系统。
总之,还没有热启动技术已经用于任何等温检测技术。这是部分因为现在的热启动技术无法被这类检测技术采用。激活过程要么是完成不充分,要么是对于该过程太苛刻。本发明提供了大量修饰剂。本发明的应用可实现扩增的热启动,从而改善这些检测方法。
依赖核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)和自主序列复制系统(3SR)
可得益于本发明的可逆性修饰的热稳定酶的其它核酸检测方法包括下述等温检测方法,例如依赖核酸系列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、以及自主序列复制系统(3SR)。这些方法主要用于在恒温下扩增靶RNA分子。扩增包括:(i)RNA模板引导的互补DNA(cDNA)的酶合成,(ii)RNA/DNA异源双链中的RNA链的RNA酶H降解,(iii)双链DNA的合成,(iv)体外转录中单链RNA合成,以及(v)步骤(i)至(iv)的重复以扩增靶核酸。
因为这些检测术的灵敏度和定量结果不如PCR,所以热启动酶的应用将会大大有益于这类方法。例如,能在升高的温度下激活的可逆性修饰的热稳定酶将有效较少和消除副反应。这将改善检测的灵敏度。没有热启动系统时,事实上扩增反应在所有组分混合后立即启动。由于样品和标准品之间不同的扩增开始时间,以及快速扩增动力学,致使准确和精确定量非常困难。使用能在升高的温度下激活的可逆性修饰的热稳定酶,将使所有扩增反应同时间开始,从而改进定量。
作为一般的可逆的蛋白修饰方法,本发明也可应用于其它方法。例如美国专利6,274,981和6,699,981描述了用磷酸酶切除寡核苷酸的3’-磷酸的方法和它在PCR中的应用。不存在可逆性修饰的热稳定酶时,磷酸酶与3’磷酸化的寡核苷酸混合后立即就发生去磷酸化。磷酸的切除可具有害作用。在上述方法中应用本发明可有效控制所述反应,改善效果。
因此,本发明不限于任何具体的核酸检测系统。当开发了其它的系统时,那些系统可受益于实施本发明。例如,Abramson and Myers,1993,Current Opinion in Biotechnology 4:41-47出版的一项有关扩增系统的调查,其内容通过引用的方式纳入本文。
试剂盒
本发明还提供试剂盒即包含对实施本发明方法有益的组分的多容器单元。在某些实施方案中,试剂盒包括可逆性修饰的热稳定酶。在某些实施方案中,所述热稳定酶为热稳定聚合酶,例如热稳定DNA聚合酶或者热稳定RNA聚合酶、热稳定RNA酶H、热稳定DNA核酸酶如热稳定DNA内切核酸酶、热稳定DNA连接酶、热稳定逆转录酶、热稳定解旋酶、热稳定RecA等。在典型的实施方案中,所述热稳定酶是热稳定DNA聚合酶。在其它实施方案中,热稳定酶为热稳定DNA核酸酶如热稳定DNA内切核酸酶。在某些实施方案中,所述热稳定酶源于水生栖热菌、嗜热栖热菌、海栖热袍菌、敏捷气热菌、风产液菌、闪烁古生球菌、热坚芽孢杆菌、生氢氧化碳嗜热菌、热自养甲烷杆菌ΔH、詹氏甲烷球菌、炽热甲烷嗜热菌、冰岛热棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈热球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隐蔽热网菌、嗜酸热硫化叶菌、硫磺矿硫化叶菌、热硫化氢热厌氧杆菌、速生热球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus kodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7热球菌、TY热球菌、斯氏热球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸热原体、Thermus brokianus,Thermuscaldophilus GK24,黄栖热菌、红色栖热菌或者它们的突变体。
而且,方案中可以存在所要求的或者所需的与试剂盒组分一起使用的其它试剂,其它试剂包括但不限于:补充的核酸对、单链结合蛋白和PCR扩增试剂(例如核苷酸、缓冲剂、阳离子等)等。试剂盒的组分可存在于分离的容器中,或者一种或多种组分存在于相同的容器中,其中容器是储存容器和/或在试剂盒被设计用于该检测的检测中使用的容器。
除了以上组分,主题试剂盒还可包括实施主题方法的用法说明。这些用法说明可以多种形式存在于主题试剂盒中,试剂盒中可存在一种或多种用法说明。这些用法说明可存在的一种形式是将信息印刷于合适的介质或基底上,例如印有该信息的纸张、试剂盒包装、包装的插页等。再一种形式是其上记录了该信息的计算机可读介质,例如软盘、CD等。又一种可存在的形式是在远端站点经因特网访问该信息的网络地址。试剂盒中可存在任何便利的形式。
系统
如上所述,本发明还提供了用于实施主题方法的系统。例如,在某些实施例方案中,试剂盒包括可逆性修饰的热稳定酶。在某些实施方案中,所述热稳定酶为热稳定聚合酶,例如热稳定DNA聚合酶或者热稳定RNA聚合酶、热稳定RNA酶H、热稳定DNA核酸酶如热稳定DNA内切核酸酶、热稳定DNA连接酶、热稳定逆转录酶、热稳定解旋酶、热稳定RecA等。在典型的实施方案中,所述热稳定酶为热稳定DNA聚合酶。在其它实施方案中,所述热稳定酶为热稳定核酸酶,例如热稳定DNA内切核酸酶。在其它实施方案中,所述热稳定酶源于水生栖热菌、嗜热栖热菌、海栖热袍菌、敏捷气热菌、风产液菌、闪烁古生球菌、热坚芽孢杆菌、生氢氧化碳嗜热菌、热自养甲烷杆菌ΔH、詹氏甲烷球菌、炽热甲烷嗜热菌、冰岛热棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈热球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隐蔽热网菌、嗜酸热硫化叶菌、硫磺矿硫化叶菌、热硫化氢热厌氧杆菌、速生热球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus kodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7热球菌、TY热球菌、斯氏热球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸热原体、Thermus brokianus、Thermuscaldophilus GK24、黄栖热菌、红色栖热菌或它们的突变体。
而且,方案中可以存在所要求的或者所需的与系统组分一起使用的其它试剂,其它试剂包括但不限于:补充的核酸对、单链结合蛋白和PCR扩增试剂(例如核苷酸、缓冲剂、阳离子等)等。
实施例
为了就如何实现和使用本发明向本领域普通技术人员提供完整的公开和说明,提出以下实施例,以下实施例并不意在限制发明人所认为的他们的发明的内容,也不意在表示以下实验为所有的或唯一的完成的实验。我们已努力确保所使用的数字的准确性(例如,用量、温度等),但还应对一些实验误差和偏差作出解释。除非另外指明,份数是重量份、分子量是均重分子量、温度是摄氏度、压力是大气压或接近大气压。
实施例1
活瓣内切核酸酶-1和Taq DNA聚合酶的制备
闪烁古生球菌的DNA获自ATCC(49558D)。如Hosfield et al.所述(Hosfield,1998,JBC 275(22):16420-16427),经PCR克隆编码闪烁古生球菌的活瓣内切核酸酶-1(Afu FEN-1)的基因。克隆的序列通过直接测序验证。将Afu FEN-1基因克隆到pET-28(Noragen)中。根据Hosfield et al.的方法并进行少许修改,完成Afu FEN-1蛋白过量表达和纯化。
水生栖热菌株YT-1获自ATCC(25104)。用来自GeneBank(AcessionNo.J04639)的序列经PCR克隆水生栖热菌(Taq)的DNA聚合酶基因。质粒pET-28用于构建表达载体。按照Lawyer et al.所述的方法(Lawyeret al.,1989,JBC 264(11):6427-37;Lawyer et al.1989,PCR Meth.Appl.2(4):275-87)进行Taq DNA聚合酶纯化。
实施例2
使用柠康酸修饰Afu FEN-1
使用柠康酸修饰Afu FEN-1在含有20mM MOPS、pH 8.0和100mMKCl的缓冲液中进行。将Afu FEN-1的浓度调至1mg/ml。
将柠康酸(Aldrich)和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)(Aldrich)溶于N,N’-二甲基-甲酰胺(DMF)(Fisher,测序级)中,浓度为1M。在1.5ml Eppendorf管中混合100μl 1M的柠康酸和200μl 1M的DCC。混合物在室温温育1小时。然后混合物在室温以12,000rpm离心20分钟。弃去沉淀物,保留上清液用于修饰Afu FEN-1。
将一体积的活化的柠康酸与99体积的Afu FEN-1混合。然后混合物在室温温育1小时得到化学灭活的Afu FEN-1。
实施例3
修饰的Afu FEN-1的活性测定
测定修饰的Afu FEN-1的活瓣内切核酸酶活性。不含酶的对照反应混合物含有30mM Tris HCl pH8.0、3mM Mg2+,400nM 5-ROX(Sigma),0.01%吐温-20,以下核酸18SI、18SP、18ST(参见表1的序列信息)各100nM。18SI和18SP均由与18ST互补的序列组成。18SI位于18SP的上游,并与18SP重叠1个核苷酸。当18SP是完整的,18SP的6Fam荧光被猝灭。在Afu FEN-1的存在下,含有18SI、18SP和18ST的复合物中的18SP被Afu FEN-1裂解。该裂解导致6FAM荧光增强。向25l的反应中加入10ng化学修饰的Afu FEN-1。用相同量的未修饰酶作对照。
在ABI Prism 7000上进行活性测定,以实时检测荧光强度的改变。温育条件为以下条件的20个循环:(59℃,1秒->60℃,29秒)×20个循环。预计的温育条件为60℃10min,每30秒搜集数据。然而,生产商的软件不允许这种操作。如图1所示,修饰的Afu FEN-1未显示可观察得到的活瓣内切核酸酶活性。
温育之后,反应混合物再在95℃孵育10min,然后按以下条件循环30次:59,1秒->60℃,59秒。这是为了热激活修饰的Afu FEN-1,并在此之后测定它的活性。图2表明化学修饰的Afu FEN-1在95℃下温育,部分恢复活瓣内切核酸酶的活性。
表1
18SI |
5’-GGA ATG AGT CCA CTT TAA ATC CTT TAA C-3’(SEQ IDNO:01) |
18SP |
5’-6FAM CGA GGA TCC ATT GGA GGG CAA G BHQ1(SEQ IDNO:02) |
18ST |
5’-CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAAGTG GAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G-3’(SEQ IDNO:03) |
实施例4
使用顺乌头酸修饰Afu FEN-1
在含20mM MOPS、pH 8.0和100mM KCl的缓冲液中进行修饰。将Afu FEN-1的浓度调至1mg/ml。
将顺乌头酸(Aldrich)和DCC(Aldrich)溶于N,N’-二甲基-甲酰胺(DMF)(Fisher,测序级)中,浓度为1M。在1.5ml Eppendorf管中混合100μl 1M的顺乌头酸、100μl 1M的DCC和100μl DMF。混合物在室温温育1小时。然后混合物在室温以12,000rpm离心20分钟。弃去沉淀物,保留上清液用于修饰Afu FEN-1。
将一体积的活化的柠康酸与99体积的Afu FEN-1混合。室温温育1小时得到化学灭活的Afu FEN-1。
实施例5
柠康酸和顺乌头酸修饰的Afu FEN-1间的比较
化学修饰的酶的不同应用需要稳定性不同的酰胺键。由此,对于特定的应用应选择适宜的羧酸。另外,酰胺键的稳定性影响到对修饰的蛋白质的储藏条件确定。
活化的羧酸可与胺基形成酰胺键。对于具体胺基,羧酸的结构影响酰胺键的稳定性。羧酸结构对酰胺键稳定性的影响是可以合理预测的。例如,顺乌头酸含三个羧基。每个羧基与DCC反应形成稳定的酯中间体。然而,三个羧基的反应性不相等。由于立体效应,预计顺乌头酸的3-羧基是与零长交联剂最具有反应性的基团。当顺乌头酸与DCC在反应混合物中的摩尔比大约为1时,对于每个DCC分子都有三个羧基。预计DCC和3-羧基之间形成的活性酯浓度比由其它两羧基的任一羧基形成的活性酯的浓度高。
尽管活化的羧酸的结构可通过多种分析方法确定。根据Palacian(Palacian et al.,1990,MCB,97:101-111),3-羧基形成的酰胺键比其它两个羧基形成的酰胺键更稳定,更难于被破坏。脱酰基反应应比柠康酸更困难。因此激活作用的相对容易程度可以揭示活化羧酸的组成。
如实施例2和4,用羧酸或顺乌头酸制备修饰的Afu FEN-1。实施例3中描述了活瓣内切核酸酶-1测定和激活条件。图3表明顺乌头酸修饰的酶和柠康酸修饰的酶均没有任何显著的活瓣内切核酸酶活性。但如图4所示,激活后,两种修饰的酶均可通过在95℃温育10min而被活化。如图4所示柠康酸修饰的Afu FEN-1的活瓣内切核酸酶活性比顺乌头酸修饰的Afu FEN-1所恢复的多60~70%。
实施例6
使用柠康酸的NHS酯修饰FEN-1
将DCC、柠康酸和NHS(Aldfich)均溶于DMF,浓度为1M。在1.5ml的管中将200μl DCC、200μl NHS和100μl柠康酸混合。然后混合物室温温育1小时。然后混合物在室温以12,000rpm离心20分钟。弃去沉淀物,保留上清液用于修饰Afu FEN-1。
将待修饰的Afu FEN-1置于含20mM MOPS、pH 8.0和100mM KCl的缓冲液中。Afu FEN-1的浓度调至1mg/ml。将一体积的活化的柠康酸与99体积的Afu FEN-1混合。然后混合物在室温温育1小时得到灭活的Afu FEN-1。
实施例7
使用柠康酸的sulfo-NHS酯修饰FEN-1
sulfo-NHS酯常用于酰化反应。sulfo-NHS酯具有与NHS酯相同的特异性和反应性。sulfo-NHS酯和NHS酯间的不同之处在于水溶性和水溶液中该化合物的稳定性。具体而言,sulfo-NHS酯的亲水性比NHS酯更强。因此,水溶液中sulfo-NHS酯的水解比NHS酯慢。因此,使用sulfo-NHS酯介导酰化反应是有利的。
将DCC、柠康酸和sulfo-NHS(Pierce)均溶于DMF,浓度为1M。在1.5ml的管中将200μl DCC、200μl sulfo-NHS和100μl柠康酸混合。然后混合物室温温育1小时。然后混合物在室温以12,000rpm离心20分钟。弃去沉淀物,保留上清液用于修饰Afu FEN-1。
将待修饰的Afu FEN-1置于含20mM MOPS、pH 8.0和100mM KCl的缓冲液中。Afu FEN-1的浓度调至1mg/ml。将一体积的活化的柠康酸与99体积的Afu FEN-1混合。然后混合物在室温温育1小时得到灭活的Afu FEN-1。
实施例8
使用柠康酸修饰Taq DNA聚合酶
将DCC、柠康酸和NHS(Aldrich)均溶于DMF,浓度为1M。在1.5ml的管中将200μl DCC、200μl NHS和100μl柠康酸混合。然后混合物室温温育1小时。然后混合物在室温以12,000rpm离心20分钟。弃去沉淀物,保留上清液用于修饰Afu FEN-1。
然后将纯化的Taq DNA聚合酶在20mM MOPS、pH 8.0和100mM KCl中调节至1mg/ml。将一体积的活化的柠康酸与99体积的Taq DNA聚合酶混合。然后混合物在室温温育1小时得到灭活的Taq DNA聚合酶。
实施例9
修饰酶激活作用的pH依赖性
已有报道,较高的温度和较低的pH均促进脱酰基反应(Nieto etal.,1983,Biochem.Biophys.Acta.,749:204-210)。在热启动PCR系统中两个因素都存在。在PCR中最常用的缓冲液——Tris缓冲液,在温度升高时明显变得更酸。已测定,每升高1度(℃)pH下降0.031。例如,如果Tris溶液在22℃时的pH为8.0,当温度达到95℃时溶液pH下降到5.74。
测定修饰的Taq DNA聚合酶激活作用的pH依赖性。25μl PCR反应混合物含有25mM Tris pH 8.0或8.7,30mM KCl,3.0mM Mg2+,dATP、dCTP、dGTP和TTP各0.2mM,400nM 5-ROX,1xSybr Green,0.30ng源于K562细胞(Promega)的人基因组DNA,引物各200nM(参见表2序列信息),以及10ng修饰或未修饰的Taq DNA聚合酶。扩增靶为18S核糖体RNA基因。所有反应在一个平板上进行。热循环条件包括95℃10min,之后按(95℃,15秒->60℃,30秒)循环40次。在ABI Prism7000上完成扩增。
表2
18SF |
5’-CGA GGC CCT GTA ATT GGA A-3’(SEQ ID NO:04) |
18SR |
5’-CGG CTG CTG GCA CCA GA-3’(SEQ ID NO:05) |
图5表示使用未修饰的酶的扩增。阈值循环数(Ct)和ΔRn均不受pH的显著影响。图6表示使用修饰的Taq DNA聚合酶的扩增。相对于未修饰的Taq DNA聚合酶,用修饰的Taq DNA聚合酶扩增则受到pH的较大影响。例如,pH 8.7的系统的Ct改变值比pH g.0的系统高出近10个循环。该结果表明pH对于修饰酶的激活的重要性。
实施例10
在非Tris缓冲系统中使用修饰的Taq DNA聚合酶的PCR扩增
虽然化学修饰的DNA聚合酶提供了最严格的热启动性能,但在PCR中使用化学修饰的DNA聚合酶还是限于小片段的扩增。完成最佳PCR扩增的另一个因素是pH。未修饰的热稳定DNA聚合酶的缓冲液pH一般为pH 8.3~9.0,取决于酶的来源和各厂商的配方。没有一个用于PCR的商购缓冲液pH低于pH 8.0。另外,缓冲液pH 8.0对于聚合酶的活性事实上是欠佳的。非最适pH是例如AmpliTaq Gold不能扩增大的核酸的原因之一。
为了PCR扩增的高保真性,可使用具有校正活性的热稳定DNA聚合酶例如Pfu DNA聚合酶(Stratagene)、Vent&Deep Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)。一般而言,这类酶更偏好较高的pH缓冲系统,例如pH 8.8,以达到大核酸的高保真扩增。
具体而言,pH在PCR效率中的作用最显著见于DNA合成步骤中。对于大片段的扩增,引物延伸的优选温度为72℃。对于小片段,两步骤PCR是最常见的,其中引物退火和引物延伸通常在60℃进行。
而且,不同的缓冲系统,温度对pH的影响也不同。例如,当温度升高1℃,Tris和MOPS的pH分别下降0.031和0.009。表3显示不同温度的Tris和MOPS的pH。在表3中,22℃时的pH可用pH计测得。其它温度时的pH根据各缓冲液pKa的变化计算。
表3
根据表3,如果22℃时MOPS缓冲液的pH大约为7.25至7.50,那么缓冲液在60℃时的pH将会是6.91至7.16。该pH对于扩增小片段时有益的。如果MOPS缓冲液的pH在约7.50至7.75,那么该缓冲液适于扩增大核酸片段。为了确定本发明的修饰酶是否可用于大核酸片段的扩增或高保真的核酸扩增,测定不同的MOPS缓冲液系统的适用度。
在不同的应用环境中使用主题酶的一个障碍是不同反应体系的pH是否允许修饰酶的有效激活。为解决这个问题,设计如下系列实验。
25μl PCR反应混合物含有25mM Tris pH 8.0或者25mM MOPSpH 7.25、7.50和7.75。剩余成分为30mM KCl,3.0mM Mg2+,dATP、dCTP、dGTP和TTP各0.2mM,400nM 5-ROX,1xSybr Green,0.30ng源于K562细胞(Promega)的人基因组DNA,引物各200nM(参见表2序列信息),和10ng未修饰的或修饰的Taq DNA聚合酶。扩增靶为18S核糖体RNA基因。所有反应在一个平板上进行。热循环条件包括95℃10min,之后按(95℃,15秒->60℃,30秒)循环40次。在ABI Prism 7000上完成扩增。结果在表4中给出。
表4
相比于其中酶无法良好激活(实施例9)的pH 8.70的Tris缓冲液中的修饰的Taq DNA聚合酶,同样修饰的Taq DNA聚合酶在pH 7.25至7.75的MOPS缓冲液中被良好激活并发挥作用。该结果表明主题发明的可逆性修饰的热稳定酶可用于多种扩增过程。
实施例11
截断型Taq DNA聚合酶的制备和修饰
Taq DNA聚合酶有两个结构域。第一个结构域是DNA聚合酶结构域,第二个结构域是5’->3’核酸酶结构域。N末端核酸酶结构域的缺失产生具有较高复制保真性和热稳定性的截断型Taq DNA聚合酶(Barnes,1992,Gene 112:29-35;Lawyer et al.,1993,PCR Methods App.2(4):275-287)。截断型Taq DNA聚合酶已成功用于大核酸片段的扩增。
编码截断型Taq DNA聚合酶的基因(Barnes,1992)被亚克隆至pET-28表达载体。然后含该缺失突变体的pET-28表达载体被转化至BL21(DE3)细胞系以表达截断型Taq DNA聚合酶。采用Lawyer所述的纯化方案纯化过量表达的截断型Taq DNA聚合酶(Lawyer,1993)。
按照实施例2所述进行重组截断型Taq DNA聚合酶的修饰。
实施例12
使用DNA聚合酶和Afu FEN-1内切核酸酶的定量PCR
使用缺乏5’核酸酶活性的DNA聚合酶和活瓣内切核酸酶-1的、并且在美国专利6,528,254和6,548,250中描述的定量PCR,两篇专利的公开内容通过引用的方式全文纳入本说明书。内切核酸酶FEN-1能裂解许多二级结构,例如裂解形成分子内或分子间二级结构的引物和/或探针。如果发生这种裂解,它会对扩增和/或信号检测产生消极影响。所述分子内或分子间结构在较低温度时比在较高温度时更稳定。因此内切核酸酶造成的裂解更有可能在低温时发生。因此,在升高的温度下变为具有活性的可逆化学修饰的FEN-1在较低温度时有助于减少或者甚至阻止这类裂解。因而使用该可逆化学修饰的内切核酸酶可改善扩增和信号检测。
25μl PCR反应混合物含有15mM Tris pH 8.0,4.0mM Mg2+,dATP、dCTP、dGTP和TTP各0.2mM,400nM 5-ROX,1xSybr Green,1.5ng人基因组DNA(ABI),引物各400nM,100nM探针(参见表5序列信息)以及10ng修饰的截断型Taq DNA聚合酶(实施例11)和6ng或10ng修饰的或未修饰的Afu FEN-1。扩增靶是10号染色体上的基因片段。热循环条件包括25℃,15分钟->95℃,10分钟,和按以下条件循环45次:95℃,15秒->60℃,1分钟。在ABI Prism 7000上完成扩增。
表5
正向 |
5’-TGC TGA ATT TCC ATC TCT GAG TTC-3’(SEQ ID NO:06) |
反向 |
5’-GCA GGA TTC AGT GCC AGA AAG-3’(SEQ ID NO:07) |
探针 |
5’-FAM-TAC CAC GCT TTT TC-DQ-MGB-3’(SEQ ID NO:08) |
当采用6ng未修饰的Afu FEN-1的PCR成功用于检测靶核酸时,该反应较含有可逆性修饰的内切核酸酶而言产生显著较弱的信号(图7)。当反应中使用的Afu FEN-1的浓度增加到10ng时,修饰的和未修饰的酶间的差异更显著。该结果表明不同于完全无法检测靶核酸的10ng未修饰的Afu FEN-1,用10ng修饰的Afu FEN-1检测是成功的(图8)。
实施例13
羧酸修饰的DNA聚合酶与二羧酸酐修饰的DNA聚合酶间的比较
以下研究比较了主题发明的可逆的热稳定DNA聚合酶和按美国专利5,677,152所述使用二羧酸酐修饰的聚合酶间的有效性(例如反应速度和反应敏感性)。
25μl PCR反应混合物含有Tris缓冲液pH 8.0,4.0mM Mg2+,dATP,dCTP,dGTP和TTP各0.2mM,400nM 5-ROX,300pg人基因组DNA(ABI),引物各200,400或800nM,200nM探针(参见表6序列信息和加入的各种引物的量),以及10ng修饰的Taq DNA聚合酶(实施例8)。UnivesalTaqMan PCR Master Mix(Part Number 4304437)购自Applied Biosystem(ABI)。基本混合液(master mix)包含AmpliTaq Gold即一种用二羧酸酐修饰的Taq DNA聚合酶。表6列出扩增靶。标准ABI热循环方案是95℃,10min,然后按以下条件循环50次:95℃,15s->60℃,1min。快速热循环方案是95℃,5min,然后按以下条件循环50次:95℃,5s->60℃,30s、在ABI Prism 7000上完成扩增。结果在表7至表9以及图9-11中给出。
表6
表7:羧酸修饰的DNA聚合酶的快速热循环方案与标准热循环方案的比较
表8:采用快速热循环方案的羧酸修饰的DNA聚合酶和酐修饰的DNA聚合酶间的比较
*:4个中有2个未扩增。
表9:羧酸修饰的DNA聚合酶(快速热循环方案)和酐修饰的DNA聚合酶(标准热循环方案)间的比较
结果表明羧酸修饰的热稳定DNA聚合酶比酐修饰的热稳定DNA聚合酶更快速并且更敏感。例如,表8表明采用标准热循环方案时羧酸修饰的热稳定DNA聚合酶的Ct值比酐修饰的热稳定DNA聚合酶的Ct值低。多数情况下,在羧酸修饰的热稳定DNA聚合酶介导的反应中的Ct值比酐修饰的热稳定DNA聚合酶介导的反应的Ct值低大约整数2至14。而且,表9表明酐修饰的热稳定DNA聚合酶介导的反应为得到相当的Ct,该反应要采用标准热循环方案,而羧酸修饰的热稳定DNA聚合酶介导的反应可采用快速热循环来完成。
在标准方案下,酐修饰的酶(购自ABI)与羧酸修饰的Taq DNA聚合酶表现得几乎同样好(表9)。但采用快速热循环条件时观察到两个体系的显著差异(表8)。图9-11表示三种代表性的结果。图9表示快速热循环条件下靶3的扩增结果。在进行比较的8个靶中,ABI的PCR混合液对于靶3的作用最好。ABI的基本混合物的Ct仍有1.5个循环的滞后。在靶5上观察到更大的Ct差异即7.37(图10)。在快速循环条件下,ABI的试剂基本无法检测到靶。图11表示靶8的等位基因1的扩增结果。
排除因仪器不同而不同的加热和冷却时间,快速条件使反应时间缩短36.3分钟或53%。许多情况下都非常想要得到快速结果,例如临床应用、可疑样品中的有害微生物和病毒的检测。甚至在基础研究应用中,它可以用于高通量检测。因此,该结果表明羧酸修饰的热稳定酶比酐修饰的酶在快速条件下作用更佳。
前文内容只是说明本发明的原理。应理解的是,本领域普通技术人员将能制定虽然没有在本文得到明确描述或表现,但体现了本发明的原理各种方案,这些方案包括在本发明的精神和范围内。此外,本文列举的所有实施例和条件用语主要意在帮助读者理解本发明的原理和有助于发明者改进该技术的概念,它们应被理解为不限于所述的特别列举的实施例和条件。另外,列举了本发明的原理、具体方面和实施方案及其实施例的本文的叙述,意在包括它们的结构和功能等同物。另外,应理解的是,所述等同物包括现在已知的等同物和将来开发出的等同物即任何不论结构如何而发挥相同作用的所开发的成分。因此本发明的范围不应限于本文所示和描述的例举实施方案。更确切地,本发明的范围和精神通过附随地权利要求项来体现。
序列表
<110>毕万里
<120>可逆性修饰的热稳定酶组合物及其制备方法和使用方法
<130>NSTR-001WO
<150>60/578,442
<151>2004-06-09
<160>35
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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ctcg 64
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gaaacgcatc tcactgtcat tctatt 26
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caccatactt catggcaagg act 23
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