CN116407526B

CN116407526B - 乳腺癌治疗药物、辅助治疗药物、抗肿瘤免疫激活剂及氧化三甲胺和其前体产物胆碱的用途

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Publication number: CN116407526B
Application number: CN202310226823.5A
Authority: CN
Inventors: 邵志敏; 王海; 赵超; 江一舟; 荣星喻; 周逸凡
Original assignee: Fudan University Shanghai Cancer Center
Current assignee: Fudan University Shanghai Cancer Center
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2023-03-10
Publication date: 2024-07-05
Anticipated expiration: 2043-03-10
Also published as: CN116407526A

Abstract

本发明公开了一种乳腺癌治疗药物、乳腺癌辅助治疗药物、乳腺癌抗肿瘤免疫激活药物以及氧化三甲胺和其前体产物胆碱的用途。本发明公开了氧化三甲胺和其前体产物胆碱可激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫，为三阴性乳腺癌免疫治疗效果不佳的临床困境提示新的治疗方法，提高临床免疫治疗疗效，逆转免疫治疗无效。

Description

乳腺癌治疗药物、辅助治疗药物、抗肿瘤免疫激活剂及氧化三甲胺和其前体产物胆碱的用途

技术领域

本发明属于肿瘤治疗领域，尤其涉及一种乳腺癌治疗药物、乳腺癌辅助治疗药物、乳腺癌抗肿瘤免疫激活药物以及氧化三甲胺和其前体产物胆碱的用途。

背景技术

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，严重危害当代女性生命健康。在乳腺癌各分子分型中，三阴性乳腺癌指的是雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体-2阴性的乳腺癌。尽管三阴性乳腺癌占整体乳腺癌的10％-15％，但它是乳腺癌各分子分型中恶性程度最高的亚型，复发转移风险较高，患者预后较差。而在目前现有的临床诊疗常规中，仅将化疗作为常规的治疗方案，缺乏更为有效的针对性治疗方案。

近年来，越来越多的临床试验尝试从靶向治疗等角度，试图解决三阴性乳腺癌预后不佳且缺乏有效治疗手段的困境，其中针对三阴性乳腺癌的免疫治疗被视为颇有临床应用前景的治疗方案。多项临床三期研究聚焦全身晚期和局部晚期三阴性乳腺癌，证实免疫治疗相较于化疗能够提高三阴性乳腺癌患者生存获益。

然而，尽管免疫治疗方案能够使部分三阴性乳腺癌患者得到生存获益，但相较于其他癌种如非小细胞肺癌或者黑色素瘤，三阴性乳腺癌患者整体的免疫治疗获益依旧较低。因此，如何提高整体三阴性乳腺癌患者免疫治疗疗效是亟待解决的临床问题。

为了进一步提高三阴性乳腺癌患者免疫治疗疗效，既往研究往往从人体本身的角度出发，探究人体或者肿瘤的自身因素对免疫治疗和免疫肿瘤微环境的影响。但近期的研究提示，在免疫微环境差距较大的两类亚型，基底样免疫抑制亚型(BLIS)和免疫调节亚型(IM)在基因组和表达谱层面的差异较小，但其肿瘤微环境和对肿瘤免疫治疗的反应性存在较大差异。

这一现象提示，除了人体自身和肿瘤本身的影响以外，还有其他因素也可能对三阴性乳腺癌的肿瘤微环境和免疫治疗疗效产生影响。作为肿瘤微环境的重要组成部分，共生菌群和肿瘤免疫微环境在空间位置上高度重合，但其影响功能和机制在既往乳腺癌研究中鲜有报道。

既往菌群与乳腺癌的研究主要集中在肠道菌群中，研究肠道菌群对口服药物肠道吸收与代谢的影响，未直接涉及菌群对乳腺癌肿瘤免疫的调控。而在肺癌、胰腺癌中，相关描述性研究提示共生菌群与肿瘤免疫微环境的相关性，但缺乏直接的因果关系证据与实验支撑。

由此，本项课题计划探究共生菌群对三阴性乳腺癌肿瘤免疫的调控作用与具体机制，为三阴性乳腺癌肿瘤免疫治疗疗效不佳的临床问题提供新的解决思路。

基于先前研究结果，本中心(复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科团队)构建了全球最大的360例三阴性乳腺癌多组学队列FUSCCTNBC，组学层面涉及基因组、表达谱、代谢组学等。在这基础上，本课题将进一步构建全球最大的三阴性乳腺癌宿主-微生物多组学图谱，探究共生菌群与宿主肿瘤免疫相关性。

此外，本中心在国内率先开展针对晚期经过多线治疗的难治性三阴性乳腺癌FUTURE临床试验。FUTURE临床试验是一项伞形治疗临床研究，其中有部分难治性三阴性乳腺癌患者接受免疫治疗。基于免疫治疗队列，本课题计划收集与免疫治疗疗效相关的临床样本，探究共生菌群相关代谢产物与免疫治疗疗效相关性。

发明内容

本发明公开了一种乳腺癌治疗药物、乳腺癌辅助治疗药物、乳腺癌抗肿瘤免疫激活药物以及氧化三甲胺和其前体产物胆碱的用途。

第一方面，本发明公开了一种乳腺癌治疗药物，其活性成分中含有氧化三甲胺和/或氧化三甲胺的前体产物胆碱。

进一步地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

第二方面，本发明公开了一种乳腺癌辅助治疗药物，其活性成分中含有氧化三甲胺和/或氧化三甲胺的前体产物胆碱。

进一步地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

第三方面，本发明公开了一种乳腺癌抗肿瘤免疫激活剂，其活性成分中含有氧化三甲胺和/或氧化三甲胺的前体产物胆碱。

进一步地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

第四方面，本发明公开了氧化三甲胺在治疗乳腺癌方面的应用。

进一步地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

第五方面，本发明公开了氧化三甲胺的前体产物胆碱在治疗乳腺癌方面的应用。

进一步地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

进一步地，氧化三甲胺通过激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫来发挥治疗作用。

进一步地，氧化三甲胺的前体产物胆碱通过激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫来发挥治疗作用。

第六方面，本发明公开了氧化三甲胺在制备治疗乳腺癌药物方面的应用。

进一步地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

进一步地，所述药物为提高三阴性乳腺癌免疫治疗疗效的药物，或者表述为所述药物为激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫来发挥治疗作用的药物。

第七方面，本发明公开了氧化三甲胺的前体产物胆碱在制备治疗乳腺癌方面的应用。

进一步地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

第八方面，本发明公开了一种药物组合物，包含氧化三甲胺和/或氧化三甲胺的前体产物胆碱，还包含PD-1抑制剂。

进一步地，所述PD-1抑制剂为抗PD-1抗体。

1.研究目的

1.1探究共生菌群通过何种途径调控三阴性乳腺癌肿瘤免疫微环境。

1.2从共生菌群角度对三阴性乳腺癌免疫治疗效果不佳的临床问题提供解决思路。

2.研究意义

2.1临床意义

从共生菌群角度出发，为三阴性乳腺癌免疫治疗效果不佳的临床困境提示新的治疗方法，提高临床免疫治疗疗效，逆转免疫治疗无效。

2.2科学意义

探究共生菌群在肿瘤微环境中发挥的功能，明确共生菌群与宿主肿瘤微环境间的调控机制。

3.创新性及应用前景

3.1概念领域突破创新

既往研究缺乏对乳腺肿瘤共生菌群的功能探究，未能明确这部分菌群在肿瘤发生发展中发挥的重要功能。本项目计划探究共生菌群在三阴性乳腺癌肿瘤免疫微环境中发挥的重要功能，明确共生菌群对肿瘤发展的调控作用。

既往大部分菌群和肿瘤的研究局限于相关性和描述性的分析，但具体因果关联，菌群通过何种细菌结构亦或是何种细菌代谢产物来调控肿瘤尚未明确。本课题提出菌群通过一个明确的特异性代谢产物来调控肿瘤免疫，这对菌群在肿瘤发生发展中的功能和意义是概念层面的突破。

3.2临床应用前景广阔

目前常见的菌群研究结果的临床转化主要是将细菌直接应用于人体，主要的方法包括粪菌移植和口服益生菌制剂。但在临床应用中这些方案常会面临严重的安全性和有效性问题。粪菌移植和口服益生菌制剂由于菌群类型不够明确，以往存在偶发的致死风险，也存在着定植改造效率较低的问题。

对比直接将细菌用于治疗，细菌相关代谢产物则具有更可控的安全性，更可靠的可重复性和稳定性。有着非常强的临床转化价值，这也为菌群研究结果的肿瘤治疗临床转化提供了一个新的方向和思路。

3.3菌群产物功能多样

在既往研究中，氧化三甲胺(TMAO)的主要功能是对人体造成炎性损伤，主要包括心血管风险和慢性肾炎。

而在本项研究中，TMAO能够在三阴性乳腺癌肿瘤中能改善肿瘤内免疫的低反应性，从而活化瘤内抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长，提出了TMAO对人体的正面积极作用。这一结果提示对于细菌及细菌代谢性产物会随着不同的组织类型，不同的人体生理病理状态而发生改变，揭示了在不同人体环境下菌群产物功能的多样性。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是研究一“构建三阴性乳腺癌肿瘤微环境菌群及其代谢物图谱”技术路线图。

图2是研究二“TMAO与底物胆碱激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫的临床关联性研究”临床转化研究技术路线图。

图3是研究三“TMAO通过诱导肿瘤细胞焦亡激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长”动物实验表型部分路线图。

图4是研究四“TMAO通过诱导肿瘤细胞焦亡激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长”分子实验机制部分路线图。

图5是共生菌群是三阴性乳腺癌肿瘤微环境的重要组成部分。

图6是三阴性乳腺癌不同肿瘤微环境下共生菌群组成不同。

图7是细菌特异性代谢产物氧化三甲胺在免疫激活的肿瘤微环境中富集。

图8是梭菌目菌属与TMAO水平密切相关且TMAO特异性代谢酶CutC与抗肿瘤免疫活化密切相关。

图9是TMAO高水平提示更好的免疫治疗疗效。

图10是瘤内注射TMAO显著抑制肿瘤生长，并促进瘤内CD8 T细胞浸润。

图11是瘤内注射TMAO后CD8 T细胞与IFNγ⁺CD8 T浸润均增加。

图12是瘤内注射TMAO后瘤内抗肿瘤细胞因子水平上调。

图13是瘤内注射TMAO在66cl4细胞造模的移植瘤模型中同样抑制肿瘤生长并激活瘤内抗肿瘤免疫。

图14是RNAseq数据提示TMAO处理后肿瘤细胞凋亡通路和炎性通路同时被上调。

图15是TMAO处理后肿瘤细胞发生焦亡。

图16是胆碱激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫。

具体实施方式

为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。

须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

1.研究一：绘制三阴性乳腺癌微生物多组学图谱，又称为构建三阴性乳腺癌肿瘤微环境菌群及其代谢物图谱(其技术路线图见图1)

1.1三阴性乳腺癌微生物组图谱的队列构建：

本研究中旨在补充三阴性乳腺癌中局部菌群研究的缺乏。利用本中心三阴性乳腺癌患者自然队列中360例样本，选用微生物组学算法计算获得每个样本共生菌群的相对丰度，用Lefse分析对不同微环境样本的差异菌群进行分析。1.2三阴性乳腺癌微生物代谢组学图谱的队列及算法：

利用本中心三阴性乳腺癌自然队列中330例非靶代谢组学数据，综合参考既往文献定义微生物相关代谢产物，依据不同肿瘤微环境筛选差异代谢产物。1.3验证差异菌群梭菌目在免疫激活的肿瘤微环境中存在：

1.3.1细菌的分离培养：

碾碎新鲜乳腺肿瘤组织，利用梭菌目选择性培养基BHI培养基，在厌氧培养箱内涂板培养梭菌，挑取所有单克隆通过质谱鉴定菌种，明确梭菌目下主要差异菌种。

1.3.2 16s rDNA验证差异菌种：

取三阴性乳腺癌肿瘤组织，提取肿瘤组织内细菌DNA,16s rDNA全长测序验证差异菌为梭菌目菌种，且结果可与算法结果和培养结果相匹配。

1.3.3Fish染色明确三阴性乳腺癌内共生菌群与肿瘤微环境在空间位置上高度重合。

1.4体外细菌培养验证细菌与代谢产物关系：

将1.3.1分离培养并鉴定得到的梭菌目菌属，在液体培养基中扩增，给予合成氧化三甲胺(TMAO)前体产物三甲胺(TMA)的必须原料胆碱，培养后取上清，通过靶向代谢检测培养基内是否有TMA存在。

具体实验过程如下：

材料与方法

1.)实验材料与仪器设备

1.1)复旦大学附属肿瘤医院三阴性乳腺癌临床队列基本信息

本研究中使用的未经治疗的三阴性乳腺癌肿瘤组织样本，来自复旦大学附属肿瘤医院的组织样本库与复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科的样本库，采样方案获得复旦大学附属肿瘤医院伦理委员会的审批与通过。每位患者充分了解样本的用途并已经签署知情同意书。本发明回顾性收集了360例三阴性乳腺癌的样本。该样本均为复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科手术中新鲜切取的组织，并按照复旦大学附属肿瘤组织库的规定进行严格保存，满足测序的要求。该样本均经过复旦大学病理科免疫组化分析的验证，确定其免疫组化分型为三阴性乳腺癌。在整理样本与相关临床数据后，将其定义为复旦大学附属肿瘤医院三阴性乳腺癌队列(Fudan University Shanghai Cancer Center Triple Negative BreastCancer，FUSCC-TNBC)样本。该队列来源均为女性，平均年龄为53±11岁。具体队列信息见于本课题组先前发表文章(DOI:

10.1016/j.ccell.2019.02.001)。

1.2)主要试剂试剂盒

1.3)主要实验仪器设备

a)杂交炉

b)厌氧工作站

c)厌氧培养箱

d)聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)基因扩增仪

e)凝胶电泳仪

f)Illumina Hiseq 4000platform

2.)实验方法

2.1)荧光原位杂交染色(Fluorescence in situ hybridization，FISH)i.试剂准备及配方：

a.杂交缓冲液

b.二甲苯

c.95％乙醇，90％乙醇，70％乙醇

d.引物溶解：

引物：EUB338 5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'5'端Cy3标记。引物用

TE溶液溶解，储存浓度100μmol(-20℃避光保存)。

洗涤缓冲液

ii.组织脱蜡与水化

取患者三阴性乳腺癌术后石蜡组织切片，依次在以下溶液中按顺序各放置10分钟，每换一个溶液，用纸巾吸干残存多余溶液。

iii.杂交染色

a.水浴50-56℃加热杂交缓冲液。

b.用杂交缓冲液将引物稀释到工作浓度10nM。

c.将水化后的切片放置于湿盒中，底部加少量水。

d.疏水笔在切片上画上疏水圈，每张切片疏水圈内滴加150μl染色液，50℃培养箱中杂交过夜(不要超过16小时)。

e.水浴50-56℃加热洗涤缓冲液。

f.用洗涤液洗涤切片两次。

g.复染：用洗涤缓冲液溶解DAPI，室温染色10分钟。

h.用洗涤液洗涤切片两次。

iv.树脂封片，荧光显微镜观察。

2.2)人肿瘤组织样本的消化

本实验使用美天旎人肿瘤组织解离试剂盒(Tumor Dissociation kit，human，Cat#130-095-929)。

i.消化液的配制

a.3ml RPMI 1640(无血清)稀释试剂盒中酶H

b.3ml RPMI 1640(无血清)稀释试剂盒中酶R

c.1ml试剂盒中溶液A稀释试剂盒中酶A

所有稀释后的酶-20℃保存，按合适比例分装，防止反复冻融，稀释后的酶保质期为6个月。

d.消化工作液的配制

ii.肿瘤组织的消化

a.在厌氧工作站中打开新鲜的三阴性乳腺癌手术样品。

b.去除癌组织周围的脂肪和坏死区域。

c.用工作台内电子天平称取0.2g肿瘤组织样品。

d.将样品尽可能剁碎后，在培养皿中加入2.5ml消化工作液

e.确认厌氧工作站站内37摄氏度恒温，并将样品放置在工作站中消化1小时。

f.1小时后样品中不存在明显的颗粒。

g.过滤样品到15ml离心管中，并进行接下来的实验。

2.3)人肿瘤组织样本中厌氧菌的分离与培养

i.培养基的配制

液体培养基

固体培养基

*所有培养基需高温高压灭菌。

ii.三阴性乳腺癌新鲜样本中厌氧菌的扩增

取100μl肿瘤消化液接种到2ml的BHI(0.05％半胱氨酸)培养基中，37℃恒温厌氧培养箱中静置培养24小时。

iii.三阴性乳腺癌新鲜样本中厌氧菌的分离

a.取100μl扩增后的样本，涂抹到BHI(0.05％半胱氨酸)琼脂糖固体培养基上，每个扩增的样品涂抹6块固体培养基。

b.涂抹后的琼脂糖培养基倒扣静置在37℃恒温厌氧培养箱中培养5-9天。

c.从第5天起每天观察琼脂糖培养基上有没有新增的单克隆。

1)三阴性乳腺癌新鲜样本中单克隆厌氧菌的扩增。

a.用无菌200μl移液器吸嘴挑取琼脂糖培养基的新增单克隆，接种至3ml BHI(0.05％半胱氨酸)液体培养基中。

b.37℃恒温厌氧培养箱中静置培养5-14天。

2.4)细菌DNA抽提

本实验室利用DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit(Cat#12855-50)抽提细菌基因组DNA。

a.将样品转入2ml离心管中，拧紧样品，从厌氧工作站中转出，并立即放入离心机中4℃，8000g离心样品30分钟。

b.弃上清加入溶液750μl Powerbead溶液，转入试剂盒提供的“Powerbead Tube”中，加入60μl溶液C1，颠倒混匀后涡旋仪上最大强度涡旋10分钟。

c.10000g 4度离心30秒，转移上清至干净的2ml离心管。

d.加入250μl溶液C2，涡旋5秒，4度冰箱中孵育5分钟左右。

e.10000g离心1分钟，转移600μl上清到新的2ml离心管中。加入200μl溶液C3，涡旋5秒，4度冰箱中孵育5分钟左右。

f.10000g离心1分钟，转移750μl上清到新的2ml离心管中。加入1200μl溶液C4，涡旋5秒。

g.混匀转移675μl到“MB Spin Column”中，10000g离心1分钟，弃废液，重复两次。

h.加500μl溶液C5，10000g离心30s。弃废液。

i.空管10000g离心1分钟。

j.转移吸附柱到新的干净的1.5ml离心管上，加50μl TE溶液。10000g离心1分钟。

k.用Nanodrop2000分光光度计仪器检测DNA浓度与纯度。

2.5)聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)

本实验室一般情况下利用DreamTaq DNA polymerase(Cat#EP0703)作为PCR体系的扩增酶。

i.PCR体系(总体积25μl)

ii.PCR扩增程序

iii.本章节使用引物

2.6)PCR产物凝胶电泳

i.溶液配制

50ΔTAE溶液

ii.凝胶配制及电泳

按照目的条带片段，选择适合浓度的琼脂糖凝胶进行配置后，150V电泳30分钟左右。本实验室常规采用天能核酸染料(170-3001)。电泳后凝胶用凝胶成像仪拍摄保存。

2.7)RNA测序

首先利用Agilent 2100芯片对FUSCC-TNBC队列的样本进行质控。尔后按照试剂生产厂商对于Illumina TruSeq Stranded Total RNA LT Ribo-Zero Gold的要求进行RNA建库流程。后续在Illumina Hiseq平台中完成RNA测序，并将得到的fastq文件与人类基因组文库匹配完成后输出FPKM的结果，用于后续的分析。具体测序流程见于本课题组先前发表文章(DOI:

10.1016/j.ccell.2019.02.001)。

2.8)微生物相关代谢产物检测

于前述复旦大学附属肿瘤医院三阴性乳腺癌队列中，选取258例样本行极性代谢物检测。此258例样本均包含RNA测序(RNA sequencing，RNA-seq)与极性非靶代谢物的检测数据。将乳腺肿瘤组织经过液氮冷冻与匀浆离心后，在装配UPLC BEH Amide滤柱的1290Infinity Series UHPLC系统(Agilent Technologies)中完成色谱检测。后续，利用6550QTOF质谱仪对代谢物数据进行捕获。代谢原始数据经由ProteoWizard转换为mzXML格式，并通过R包XCMS(version 3.2)的处理，最终获得极性非靶代谢物丰度的数据。具体分析流程见于本课题组先前发表文章(DOI:10.1038/s41422-022-00614-0)

进一步地，基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)、Bioml、GmREPO和其他数据库，并结合已发表文献和宏基因组测序数据，定义超过3700种的细菌相关代谢产物。结合本队列中的极性代谢产物测序结果，在本队列中共发现92种微生物相关代谢产物。

2.9)免疫组化

i.组织脱蜡与水化

ii.抗原修复

本实验室常规使用Abcam公司生产的Antigen Retrieval缓冲液(100×Citrate缓冲液，Cat#ab93678)。

1:100稀释抗原缓冲液，将水化后的石蜡切片放入抗原修复液中，微波炉高火使其沸腾，低火保持沸腾，修复20分钟。

自来水冲淋容器10分钟。

A.封闭

a.将切片放置于湿盒中，底部加少量水。

b.疏水笔在切片上画上疏水圈，每张切片疏水圈内滴加150μl山羊血清封闭液，室温20分钟后，PBS洗涤一次。

B.染色

a.1:200用抗原缓冲液稀释一抗anti-FMO3(Abcam，ab126711)。

b.在疏水圈中滴加50μl稀释后的一抗，冰箱内孵育过夜。

c.室温复温45分钟。

d.PBS洗涤3次，每次5分钟。

e.1:1000稀释goat anti-rabbit HRP二抗。

f.在疏水圈中滴加50μl稀释后的二抗，室温内孵育1-2小时。

g.PBS洗涤3次，每次5分钟。

h.DAB显色5-10分钟。

i.PBS冲洗10分钟。

j.复染苏木精1分钟。

k.盐酸酒精分化。

l.自来水冲洗10-15分钟。

C.封片后镜检。

3.)生物信息学计算方法

3.1)PathSeq

RNA测序测序数据的来源是复旦大学附属医院三阴性乳腺癌队列的360例患者肿瘤组织，且在原始的RNA测序数据中，未移除原核生物来源的RNA序列。GATK PathSeq算法被用于在人源组织中，匹配微生物组相关的序列，包括细菌、病毒、古菌和真菌。在序列匹配完成后，该算法会进一步基于不同的生物学分类层次，将序列匹配到不同种的微生物组。

在本研究中，利用的人源序列参考数据集包括5个部分来自GATK数据库的GRCh38(https://software.broadinstitute.org/gatk/download/bundle，hg38/v0)，来自IMGT的Virus Contig(chrEBV)和Immuno Polymorphism Database(IPD)，GENCODE转录组(humanv25；

https://www.gencodegenes.org)，人源断点连接序列(GenBank accessionsKY503218-KY5808060)和NCBI UniVec克隆载体序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/vecscreen/univec/)。

细菌层面的相对丰度计算方法如下：某一细菌在样本中相对丰度＝(基因组中独特匹配区域数量Δ1,000,000)/(细菌reads匹配到的总数×细菌基因组大小)。得到的相对丰度数据按照每个样本行均一化，最终得到每个样本中细菌的相对丰度。

3.2)物种差异分析

线性判别分析(Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe)算法被用于探寻不同分组样本中的微生物组差异分析。为了定义在免疫调节型与非免疫调节型样本中的显著差异微生物，LDA(linear discriminant analysis)阈值设为2，Kruskal-Wallis检验与Wilcoxon检验的α值设为0.05。3.3)基因集富集分析与基因集差异分析

在基因集富集分析中，使用R包GSVA用于单样本基因集富集分析，并将FDR＜0.25，且nominal p＜0.05定义为显著富集。所有的分析流程均基于R(v.3.6.1，https://cran.r- project.org/)展开。

3.4)免疫细胞定量

基于复旦大学附属肿瘤医院三阴性乳腺癌队列的RNA-seq数据，利用CIBERSORT(Cell-type Identification by Estimating Relative Subsets of RNA Transcripts，https://cibersort.stanford.edu/)工具中的绝对定量模式，对肿瘤组织样本中免疫细胞亚群丰度进行定量分析。

4.)统计学分析

针对临床样本队列相关的统计学分析方法如下。在对比连续性变量的统计学分析中，使用Student’s t检验，变异分析(analysis of variance，ANOVA)和Mann-WhitneyWilcoxon检验比较其差异的显著性。在对比分类变量的统计学分析中，使用Pearson’schi-square检验和Fisher’s exact检验比较其差异的显著性。为了计算两个变量的相关性，本发明使用配对Spearman’s相关性分析。以上所有的分析流程均基于R(v.3.6.1，https://cran.r-project.org/)展开。

对于体外实验中的统计学分析，则基于GraphPad Prism软件(GraphPadSoftware)9.0.0版本展开。为了比较两组间的差异，使用双尾非配对的Student’s t检验。

2.研究二：探究TMAO与三阴性乳腺癌患者免疫治疗疗效的相关性，又称为TMAO与底物胆碱激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫的临床关联性研究(其技术路线图见图2)

2.1研究队列及方法：

选用本中心FUTURE队列(ClinicalTrials.gov identifier:NCT03805399)C臂中免疫治疗的患者，基于非靶代谢筛选和靶向代谢分析不同免疫治疗疗效患者的差异细菌相关代谢产物。

2.2验证差异代谢产物与免疫激活的相关性：

分离差异代谢产物高丰度患者的血PBMC，磁珠分选其CD8 T细胞，体外与人源乳腺癌细胞共培养，通过LDH释放试验及流式细胞检测其对乳腺癌细胞的杀伤功能。

具体实验过程如下：

材料与方法

1.1)三阴性乳腺癌患者免疫治疗队列

本研究收集了来自FUTURE临床试验(ClinicalTrials.gov识别号:NCT03805399，一项基于分型和基因组生物学标志物引导的Ib/II期伞形研究)的12例患者血液样本。该队列中患者均为三阴性乳腺癌女性患者，均经过免疫治疗联合化疗，中位年龄为57±8岁。血液样本的收集方案得到了复旦大学附属肿瘤医院伦理委员会的同意，并且每位患者均了解样本用于科研，并签署知情同意文件。该队列中患者的治疗信息来自复旦大学附属肿瘤医院病史系统的整理。

2.)实验方法

2.1)三阴性乳腺癌患者血浆靶向代谢检测

a)依据复旦大学附属肿瘤医院伦理委员会伦理审核通过的实验方法，采集FUTURE临床试验入组患者的全血，采集使用紫头管(抗凝剂为EDTA)。样本运输过程中避免剧烈碰撞挪动，以防溶血

b)实验室收到全血样本后，常温1300rpm，离心20分钟，快升缓降。

c)离心后的样本可分为三层，上层半透明微黄为患者血浆。

d)取200微升上层血浆，用液氮急速冷冻。样品冷冻后可用于靶向代谢检测。

3.)统计学分析

针对临床样本队列相关的统计学分析方法如下。在对比连续性变量的统计学分析中，本发明使用Student’s t检验，ANOVA和Mann-Whitney Wilcoxon检验比较其差异的显著性。在对比分类变量的统计学分析中，使用Pearson’schi-square检验和Fisher’s exact检验比较其差异的显著性。为了计算两个变量的相关性，本发明使用配对Spearman’s相关性分析。以上所有的分析流程均基于R(v.3.6.1，https://cran.r-project.org/)展开。

对于体内与体外实验中的统计学分析，则基于GraphPad Prism软件(GraphPadSoftware)9.0.0版本展开。为了比较两组间间的差异，本发明使用双尾非配对的Student’st检验。为了比较肿瘤体积生长曲线的差异，使用Two-way ANOVA with Tukey’s检验。为了比较肿瘤内浸润细胞，肿瘤组织中的细胞因子水平，乳酸脱氢酶释放水平和瘤内TMAO水平的差异，使用One-way ANOVA with Bonferroni’s检验对显著性进行分析。其余特殊的统计学分析已在特殊分析部分具体论述。

3.研究三：体内实验验证微生物代谢产物TMAO抑制肿瘤生长，又称为TMAO通过诱导肿瘤细胞焦亡激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长动物实验表型部分(其技术路线图见图3)

研究一，二证实TMAO高表达与肿瘤免疫的激活密切相关。后续拟验证微生物代谢产物TMAO是否具有抑制肿瘤生长的功能，选用4T1和66cl4细胞系分别造小鼠移植瘤模型，通过瘤内注射和腹腔注射分别模拟局部TMAO高水平及全身TMAO高水平，观察TMAO高含量是否可以抑制肿瘤细胞增殖。通过流式细胞术检测造模用药后小鼠肿瘤，血液及脾脏内Th1细胞，Treg细胞，CD8 T细胞，IFNγ+CD8 T细胞，M1型巨噬细胞，M2型巨噬细胞占比改变，综合IFNγ，TNFα，IL-2，IL-10等细胞因子Elisa结果，评估TMAO用药后小鼠抗肿瘤免疫水平。在单用TMAO的同时设置TMAO联用PD-1抑制剂的治疗组，观察上调TMAO水平是否可以逆转三阴性乳腺癌的免疫治疗无效。

4.研究四：验证TMAO通过诱导肿瘤细胞焦亡激活抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长，又称为TMAO通过诱导肿瘤细胞焦亡激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长分子实验机制部分(其技术路线图见图4)

初步体外实验结果发现TMAO刺激细胞后细胞出现焦亡的特殊涨破形态，RNA-seq提示TMAO刺激后细胞caspase 3相关焦亡通路呈明显上调。综上推测TMAO可能通过焦亡激活肿瘤免疫，从而抑制肿瘤生长。

为验证此假说，本发明拟通过细胞实验验证TMAO刺激后焦亡的发生。主要方法包括，PI染色后从形态学和荧光染色比例上综合定量评估肿瘤细胞焦亡的比例，运用Westernblot验证焦亡关键蛋白caspase 3及GSDME是否被切割活化，LDH释放实验用于区别焦亡和晚期凋亡。

其次，将验证TMAO导致的肿瘤细胞焦亡发生是不是TMAO活化抗肿瘤免疫的关键机制，本发明选择KO乳腺癌细胞GSDME基因后建立小鼠移植瘤模型，观察小鼠瘤内免疫细胞浸润活化情况和细胞因子水平变化情况。

为了验证TMAO诱导的焦亡是通过活化抗肿瘤免疫来抑制肿瘤生长的，本发明拟在小鼠接受TMAO刺激的同时加用CD8抗体抑制剂，探究抑制抗肿瘤免疫活化时TMAO是否还具有抑制肿瘤生长的能力。综合上述体内实验，本发明拟证实TMAO是否通过焦亡活化抗肿瘤免疫，通过焦亡活化的抗肿瘤免疫是否是抑制肿瘤增殖的关键。

研究三和四的具体实验过程如下：

材料与方法

1.)实验材料与仪器设备

1.1)细胞来源

本实验使用了4T1、66Cl4、MDA-MB-231和HEK-293T三种细胞系，其来源如下：

1.2)动物来源及饲养条件

本实验使用了BALB/c和NOD-SCID两种小鼠。

6-8周龄雌性BALB/c于SPF条件下饲养，饲养过程遵循12小时日照12小时黑暗循环，饲养室始终保持温度20-22℃，湿度50％-70％。小鼠可自由获取饲料和饮水，喂食没有限制。所有饲料，垫料和饮水均经辐射或高压蒸汽灭菌，符合SPF标准。本论文动物实验方案经上海实验动物中心(Shanghai Laboratory Animal Center，SLAC)伦理委员会批准通过。

1.3)主要试剂及试剂盒

1.4)主要实验仪器设备

a)二氧化碳细胞培养箱

b)超净台

c)低温水平离心机

d)低温高速离心机

e)美天旎gentleMACS^TMOcto Dissociator with Heaters

f)FACScan细胞流式仪

g)BD LSRFortessa细胞流式仪

h)Luminex 200System

i)化学发光成像系统

j)全自动吸收光酶标仪

k)Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪

l)高内涵成像分析系统

2.)实验方法

2.1)细胞培养与传代

本实验使用的永生化细胞系4T1、66cl4、MDA-MB-231和HEK-293T培养条件相同，使用杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)，培养基中添加10％热休克后的血清和1％青霉素-链霉素(双抗)，所有细胞均定期进行支原体检测，确保无支原体感染。细胞融合度达到80％即进行传代，传代细胞经PBS洗涤后，由胰酶消化，吹打成单细胞悬液后，离心PBS洗涤后1:4传代。细胞每两天换液一次，培养箱恒温37℃，CO₂浓度维持5％。小鼠淋巴结内分离的CD8⁺细胞的培养条件在后续方法学中详细论述。

2.2)小鼠乳腺癌细胞的原位注射

i.肿瘤细胞的处理

a.4T1、66cl4或MDA-MB-231提前1-2天传代，确保肿瘤种植当天细胞融合度在70％-80％左右，同时进行支原体PCR检测，确保细胞支原体阴性。

b.PBS洗涤细胞两次后胰酶消化细胞约3分钟，2倍体积带血清培养基终止消化。

c.离心，PBS洗涤细胞两次后用合适体积的PBS重悬细胞。

d.细胞计数，细胞调整细胞浓度到每25μl 0.5Δ10⁶个细胞。

e.取等体积基质胶(无细胞因子)加入细胞中，均匀混匀后冰上放置，尽快注射。

ii.乳腺癌细胞原位注射

a.小鼠气麻后仰卧位固定，下腹中线开口，不要剪破腹膜。

b.钝性分离左侧腹股沟部位，找到腹股沟乳腺脂肪垫。

c.用胰岛素针注射50μl体积均匀细胞悬液。

d.缝合腹部开口。

e.麻醉苏醒。

iii.手术后第1-5天观察伤口愈合情况，防止感染和脱线情况发生。

2.3)肿瘤生长曲线的监测

一般成功造模第6天(4T1细胞系)和第9天(66cl4细胞系)后，肿瘤生长成可肉眼观察并进行测量的大小。肿瘤测量使用游标卡尺，测量肿瘤长径(L)和宽径(W)并记录。每3天测量一次肿瘤，并按以下公式计算肿瘤大小：

肿瘤体积＝0.5Δ长径(L)Δ宽径的平方(W²)。

2.4)小鼠瘤内注射及腹腔注射

本实验采用药物，给药方法及浓度

瘤内注射为多点注射，每次注射体积20μl，腹腔注射每次注射体积为100μl。在本发明中，术语“抗PD-1抗体”和“PD-1抗体”均表示相同的含义，其英文均为anti-PD-1antibody；“CD8抗体”与“抗CD8抗体”也为同一物质。

2.5)小鼠肿瘤组织的消化

本实验使用美天旎鼠肿瘤组织解离试剂盒(Tumor Dissociation kit，mouse，Cat#130-096-730)

i.消化液的配制

a.3ml RPMI-1640培养基(无血清)稀释试剂盒中酶H。

b.2.7ml RPMI-1640培养基(无血清)稀释试剂盒中酶R。

c.1ml试剂盒中溶液A稀释试剂盒中酶A。

d.消化工作液的配制

ii.肿瘤组织的消化

a)小鼠处死后完整取下肿瘤。

b)去除癌组织周围的脂肪和坏死区域。

c)用工作台内电子天平称取最大1g肿瘤组织样品。

d)将样品尽可能剁碎后，转移至C管中(美天旎gentleMACS C Tube)并加入2.5ml消化工作液(工作液37℃预热)。

e)拧紧管口，转移样品至gentleMACS^TMOcto Dissociator with Heaters上。

f)选择37C_m_TDK_2程序，并运行。

g)程序运行结束后取下C管。加入PBS冲洗并将样品转移至细胞过滤网上，过滤消化后的肿瘤组织到50ml离心管中，从细胞滤网上加入PBS到管口。

h)300g离心细胞7分钟，PBS洗涤细胞两次。

i)细胞计数，合适体积PBS重悬细胞并至于冰上。

2.6)小鼠肿瘤微环境内免疫细胞的分离

本实验室采用密度梯度离心法分离肿瘤内免疫细胞，针对4T1形成的肿瘤，采用40％Percoll:80％Percoll的分离体系。

i.溶液配置

100％Percoll(100ml)

40％Percoll(100ml)

80％Percoll(100ml)

Percoll使用前需平衡至室温。

ii.密度梯度离心

a)离心消化后得到的肿瘤细胞悬液，用合适体积的40％Percoll重悬细胞。

b)调整移液器为最小速度，将移液管插入管底，缓慢加入等体积80％Percoll。保证两者界面尽量不被扰动。

c)室温2300转缓升缓降离心23分钟。

d)用移液器吸取界面层细胞到新的15ml离心管，加满常温PBS，重悬细胞。

e)300g常温离心细胞10分钟。

f)弃上清，15ml PBS重悬细胞，离心洗涤两次。

g)合适体积冰MACS buffer重悬细胞，并计数。进入后续步骤。

2.7)流式细胞术

i.溶液配置

MACS缓冲液

ii.封闭

a.取2×10⁶个2.6中分离得到的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrationlymphocytes，TIL)，用50μl冰MACS buffer稀释。

b.1:100体积加入CD16/CD32封闭抗体。

c.冰上孵育10分钟。

d.以下所有过程严格避光。

iii.死活染色

a.本实验室常规使用U底96孔板染色，200μl冰PBS重悬，300g离心5分钟，洗涤两次。

b.1：20000用PBS(不含血清)稀释LIVE/DEAD Fixable DEAD Cell Stain。

c.50μl死活染色液重悬细胞，冰上染色10分钟。

d.表面抗原染色

e.200μl冰PBS重悬，300g离心5分钟，洗涤两次。

f.按抗体滴定实验结果提示的最佳比例用MACS buffer稀释表面染色抗体，每个染色Panel的表面染色抗体混合在1管内。

g.50μl表面染色液重悬细胞，室温染色30分钟。

h.200μl冰MACs buffer重悬，300g离心5分钟，洗涤两次。

iv.固定与破膜

a.本实验室常规使用eBioscience Foxp3/转录因子染色缓冲液套件(赛默飞，Cat#00-5523-00)进行固定破膜。

b.按1(Fixation/Permeabilization Concentrate):3

(Fixation/Permeabilization Diluent)配制固定液。

c.用200μl固定液重悬细胞。冰箱内孵育60分钟或室温孵育30分钟。

d.(若没有胞内抗原染色，离心后用500μl MACs buffer重悬固定后的细胞即可上机检测。)

e.离心，弃上清。

f.按1:10的比例用ddH₂O稀释Permeabilization Buffer(10×)制备破膜液。

g.200μl破膜液洗涤细胞两次，每次常温600g离心细胞4分钟。

v.胞内抗原染色

a.按抗体滴定实验结果提示的最佳比例用MACS buffer稀释胞内染色抗体，每个染色Panel的胞内染色抗体混合在1管内。

b.50μl胞内染色液重悬细胞，室温染色30分钟。

c.200μl破膜液重悬，600g离心5分钟，洗涤两次。

d.500μl MACs buffer重悬胞内染色后的细胞准备上机检测。

vi.流式仪器检测

a.用对应颜色的anti-CD19抗体和脾单细胞悬液制备单染管。

b.通过单染管设置适合电压并调节补偿。

c.进行样本检测，保存facs文件，进行结果分析。

2.8)免疫组化

i.组织脱蜡与水化

取患者三阴性乳腺癌术后石蜡组织切片，依次在以下溶液中按顺序各放置10分钟，每换一个溶液，用纸巾吸干残存多余溶液

ii.抗原修复

本实验室常规使用Abcam的Antigen Retrieval缓冲液(100×Citrate缓冲液，Cat#ab93678)。

a)1:100稀释抗原缓冲液，将水化后的石蜡切片放入抗原修复液中，微波炉高火使其沸腾，低火保持沸腾，修复20分钟。

b)自来水冲淋容器10分钟。

iii.封闭

a)将切片放置于湿盒中，底部加少量水。

b)疏水笔在切片上画上疏水圈，每张切片疏水圈内滴加150μl山羊血清封闭液，室温20分钟后，PBS洗涤一次。

iv.染色

a)1:200用抗原缓冲液稀释一抗anti-CD8或anti-GSDME。

b)在疏水圈中滴加50μl稀释后的一抗，冰箱内孵育过夜。

c)室温复温45分钟。

d)PBS洗涤3次，每次5分钟。

e)1:1000稀释goat anti-rabbit HRP二抗。

f)在疏水圈中滴加50μl稀释后的二抗，室温内孵育1-2小时。

g)PBS洗涤3次，每次5分钟。

h)DAB显色5-10分钟。

i)PBS冲洗10分钟。

j)复染苏木精1分钟。

k)盐酸酒精分化。

l)自来水冲洗10-15分钟。

v.封片后镜检。

2.9)肿瘤组织内细胞因子水平的检测

本论文中肿瘤组织内细胞因子水平检测使用ProcartaPlex Mouse CyotokinePanel(eBioscience，Cat#EPX360-26092-901)在Luminex 200System(R&D System)平台上检测。肿瘤组织在检测前，用电子天平称取20mg左右，加入Cell lysis buffer(Invitrogen，Cat#EPX-999999-000)，匀浆机-20℃匀浆10分钟，离心取上清进行检测。

2.10)淋巴结内CD8⁺T细胞的分选

本实验采用CD8a⁺T cell Isolation Kit，mouse试剂盒(美天旎，Cat#130-104-075)进行肿瘤引流区域内CD8⁺T细胞的分选。该试剂盒为阴选试剂盒，第一次实验室需用流式检测分选效率，确保实验操作正确。

i.制备淋巴结单细胞悬液，

a.处死荷瘤小鼠后将肿瘤引流区域淋巴结取下，至于细胞滤网上研磨。

b.用PBS冲洗研磨后的细胞滤网。

c.离心，用适当体积的冰MACS buffer重悬细胞，并细胞计数。

ii.分选CD8⁺T细胞

a.取1×10⁷个细胞，离心，用40μl MACS buffer重悬细胞。

b.加入10μl Biotin-Antibody Cocktail。混匀并冷藏室内孵育5分钟。混匀过程不要产生气泡。

c.加入30μl MACS buffer，混匀。

d.加入20μl Anti-Biotin Microbeads。混匀并冷藏室内孵育10分钟。混匀过程不要产生气泡。

e.将LS柱放置在MACS Separator上，下方对应位置放置15ml离心管。

f.3ml MACS buffer润洗LS柱。

g.样品中加入1ml MACS buffer重悬混匀，将样本加入LS柱上。

h.3ml MACS buffer洗涤LS柱两次。

i.15ml离心管内收集的液体，100g离心10分钟。

j.弃上清，合适体积MACS buffer重悬，计数。

2.11)肿瘤细胞与CD8⁺T细胞的共培养

a)培养基的配置

b)提前24小时在96孔板中接种66cl4 scramble或66cl4-shGsdme1细胞，每孔5000个细胞。

c)取20000个分选得到的CD8⁺T细胞，离心后用配制好的培养基重悬。

d)共培养24小时。

e)光镜下拍摄。

f)取培养基上清，离心后检测上清中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)含量。

2.12)细胞上清乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)检测

a)本实验室使用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒(Promega Cat#G1780)检测培养上清中的乳酸脱氢酶含量。

b)所有实验需要设置阳性对照孔，该孔细胞不需加药处理，但需要预留。设置阴性对照孔，不用铺种细胞，直接加入对应培养基培养相同时间。

c)检测时间提前45分钟，用Lysis Solution(10×)裂解阳性对照孔内细胞。

d)250g离心细胞培养板3分钟，取上清。

e)取50μl上清到平底96孔板中，用多道移液器尽快加入50μl CytoTox96Reagent。

f)避光室温孵育30分钟。

g)观察颜色，防止反应过分。

h)加入50μl Stop solution。多道移液器加入，时间越短越好。

i)490nm激光下读板。

j)按以下公式计算药物或CD8⁺T细胞的毒作用。

k)％Cytotoxicity＝(试验孔读数-阴性对照孔读数)/(阳性对照孔读数-阴性对照孔读数)

2.13)碘化丙啶染色

本实验室该三项染色均使用市售商品化试剂盒。

细胞于6孔板内处理后，适当时间进行染色，染色和检验步骤严格遵照商品提供的操作指南。

2.14)粪便细菌DNA提取

a.本实验是采用DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit(Qiagen，Cat#

12855-50)抽提人和小鼠基因组DNA。

b.取0.25g左右粪便加入溶液750μl Powerbead溶液，转入试剂盒提供的“Powerbead Tube”中，加入60μl溶液C1，颠倒混匀后涡旋仪上最大强度涡旋10分钟。

c.10000g 4度离心30秒，转移上清至干净的2ml离心管。

d.加入250μl溶液C2，涡旋5秒，4度冰箱中孵育5分钟左右。

h.加500μl溶液C5，10000g离心30s。弃废液。

i.空管10000g离心1分钟。

k.用NanoDrop 2000分光光度计检测DNA浓度与纯度。

2.15)粪便16S rDNA测序

本实验所有16S rDNA测序在抽提DNA后完成。16S rDNA质检后，测序片段为V3+V4可变区段，扩增引物如下

7bp左右样品特异的barcode会添加在每个样本的引物前，扩共扩增25个循环后，扩增子纯化后质检。质检通过的样品在llumina MiSeq platform with MiSeq ReagentKit v3平台上测序。测序得到的数据经QIIME2 2019.4(https://docs.qiime2.org/ 2019.4/tutorials/)处理，获得OTU，cut off值为97％。不同OTU匹配到种属信息使用feature-classifier插件的classify-sklearn naive Bayes taxonomy classifier。参考数据库为SILVA Release 132。

2.16)小鼠胆碱给药方法

胆碱给与方式为在小鼠饲料中添加。对照组饲料为AIN93G标准饲料，在此饲料中添加入1％的胆碱合成高胆碱饲料，后续完成SPF化。

2.17)小鼠血浆样本的处理

a)小鼠深度麻醉后取血至Eppendorf试管中，无需抗凝剂。

b)室温静置30分钟。

c)常温1300rpm，离心20分钟，快升缓降。

d)离心后的样本取上层半透明微黄者血浆。

e)取20μl上层血浆，用液氮急速冷冻。样品冷冻后可用于靶向代谢检测。

3)统计学分析

结果：

研究一：构建三阴性乳腺癌肿瘤微环境菌群及其代谢物图谱三阴性乳腺癌共生菌群是肿瘤微环境的重要组成部分(图5和6)

FISH染色发现共生菌群与肿瘤微环境在空间位置上高度重合，提示共生菌群是三阴性乳腺癌肿瘤微环境的重要组成部分。利用本中心360例三阴性乳腺癌多组学队列数据，绘制了三阴性乳腺癌宿主-微生物多组学图谱，并发现乳腺癌共生菌群的组成存在个体差异，提示不同乳腺共生菌群结构在不同个体乳腺癌发生发展中可能发挥不同的功能。

基于先前的三阴性乳腺癌分型研究，发现在三阴性乳腺癌中存在一类特殊的亚型，IM亚型。相较于别的亚型，其特征是在微环境中富集免疫细胞与细胞因子，并且有更高的可能性从免疫治疗中获益。基于微生物组学数据，本发明发现梭菌目菌属在免疫相对激活的IM亚型中富集，提示梭菌目与激活的肿瘤免疫相关。此外，梭菌目菌属的高丰度也提示三阴性乳腺癌患者更好的生存预后，提示梭菌目菌属与激活的三阴性乳腺癌肿瘤微环境和良好转归相关。

菌群相关特异性代谢产物TMAO与激活的肿瘤微环境相关(图7和8)

菌群代谢是菌群影响人体免疫的重要途径之一。基于回顾性大队列中肿瘤组织的非靶代谢数据，本发明定义了249种菌群相关代谢产物。通过火山图分析，发现细菌相关特异性代谢产物氧化三甲胺(TMAO)在IM亚型中显著富集，且IM亚型中的浓度显著高于非IM亚型组。表达谱通路分析提示，高TMAO丰度的样本中，T细胞相关的通路显著激活，同样也提示TMAO与三阴性乳腺癌激活的肿瘤免疫微环境相关。

为了进一步验证代谢产物TMAO与菌群的关联，本发明联合分析微生物组学数据与代谢组学数据，发现梭菌目菌属高丰度也与高TMAO浓度相关，而三阴性乳腺癌组织中TMAO相关的特异性菌群代谢基因CutC基因的表达也与CD8 T细胞浸润成正相关，提示代谢谱数据和微生物组学数据的相关性。

具体结果如下：

1.三阴性乳腺癌中定植肿瘤共生菌群

为了了解肿瘤共生菌群在三阴性乳腺癌中的功能与角色，本发明首先通过16SrDNA的荧光原位杂交染色(Fluorescence in situ hybridization，FISH)来明确肿瘤共生菌群与三阴性乳腺癌的空间位置关联。通过三阴性乳腺癌患者来源的FISH染色结果，发现肿瘤共生菌存在于三阴性乳腺癌组织中(图5A)。

2.绘制三阴性乳腺癌肿瘤共生菌群图谱

在证明三阴性乳腺癌中存在有活性的肿瘤共生菌群后，本发明进一步解析三阴性乳腺癌肿瘤共生菌群的特征。本发明利用PathSeq算法，基于复旦大学附属肿瘤医院三阴性乳腺癌队列360例的RNA测序(RNA sequencing，RNA-seq)数据，计算得到肿瘤共生菌群各门、纲、目、科和属层面的微生物丰度。其中，在属层面丰度最高的细菌类别是拟杆菌属(Bacteroides)、假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter)等(图5B)。

3.免疫调节型三阴性乳腺癌中富集梭菌目菌属

为了进一步研究三阴性乳腺癌瘤内细菌与肿瘤免疫的关联，结合PathSeq算法得到的肿瘤共生菌群数据，本发明基于线性判别分析发现相较于非免疫调节型，在免疫调节型三阴性乳腺癌中显著富集的菌属包括经黏液真杆菌属(Blautia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)等，均属于梭菌目菌属(图6A)。此外，梭菌目菌属高丰度也与三阴性乳腺癌患者更好的生存预后相关(图6B)。

这一结果一方面提示梭菌目菌属与免疫调节型三阴性乳腺癌和更加激活的三阴性乳腺癌肿瘤微环境相关；另一方面激活性免疫微环境中富集的菌属大都属于梭菌目下也提示三阴性乳腺癌肿瘤共生菌属可能以梭菌目为统一菌目共同发挥调节性作用，影响人体的生理病理状态。

4.免疫调节型三阴性乳腺癌中富集菌群相关代谢物TMAO

作为免疫系统的一部分，抗肿瘤免疫与肿瘤共生细菌的关联的研究处于起步阶段，肿瘤共生细菌如何调控肿瘤免疫的途径与机制尚未明确。因此，本发明进一步探究肿瘤共生细菌通过何种途径影响三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫。

基于258例三阴性乳腺癌患者来源样本的极性非靶代谢组的数据，检测发现了92种菌群相关代谢产物。随后进一步对比免疫调节型与非免疫调节型三阴性乳腺癌的菌群相关代谢产物差异，发现在IM亚型中富集包括氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide，TMAO)在内的菌群相关代谢产物(图7A)。而将三阴性乳腺癌按照瘤内TMAO高低进行分组后，本发明发现高瘤内TMAO组相较于低瘤内TMAO组，抗肿瘤免疫相关的通路激活，提示TMAO与抗肿瘤免疫功能相关。

TMAO的关键调节过程由细菌代谢酶胆碱三甲胺裂合酶(Choline trimethylamineLyase，cutC)进行调控，并且表达cutC基因的菌属大都富集在梭菌目下。研究证实梭菌目菌属丰度越高，肿瘤内TMAO的丰度越高，且在免疫调节型三阴性乳腺癌中，cutC基因的相对丰度较高(图8)。这些结果提示TMAO可能与免疫调节型三阴性乳腺癌相关。

TMAO是一类主要受到细菌代谢调节的代谢产物。细菌以胆碱、肉碱等为底物，通过细菌携带的代谢酶cutC(由细菌cutC基因编码)催化底物代谢为三甲胺(Trimethylamine，TMA)，并进一步主要由人体细胞中黄素单加氧酶3(Flavin Containing DimethylanilineMonoxygenase 3，FMO3)催化产生TMAO。其代谢的限速步骤为由cutC将胆碱代谢为TMA，该步骤发生在细菌中且cutC只由细菌表达，真核细胞不表达，因此被先前的研究定义为细菌相关的代谢产物。

研究二：TMAO与底物胆碱激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫的临床关联性研究

TMAO高水平提示更好的临床肿瘤免疫治疗疗效(图9)

基于针对回顾性大队列的相关性分析，本发明发现TMAO与激活的肿瘤免疫微环境相关。为了更进一步寻找TMAO与免疫治疗疗效相关性，本发明在FUTURE免疫治疗队列中进行验证，发现相较于免疫治疗疗效不佳的患者，免疫治疗疗效较好的患者TMAO浓度更高。TMAO更高浓度提示靶病灶经免疫治疗后具有更高退缩比例，也提示患者能够更加持久地从免疫治疗中获益。

具体结果如下：

1.高血浆TMAO浓度与三阴性乳腺癌患者更好免疫治疗疗效相关

为了实现研究成果到临床应用的转化，本发明进一步探究临床可及的转化与应用治疗策略。本发明选择本中心牵头的晚期三阴性乳腺癌免疫治疗队列，每位患者均在开始治疗前收集外周血样本，并完成外周血TMAO浓度的靶向代谢检测。根据五个免疫治疗周期后患者的疗效评估，将患者分为疾病进展组(PD)与部分缓解组(PR)(图9A)。相较于疗效较差的疾病进展组，疗效较好的部分缓解组中患者的外周血TMAO浓度更高(图9A)。根据患者外周血中TMAO浓度的中位数，将患者分为高外周血TMAO组和低外周血TMAO组，相关性分析结果提示患者肿块退缩的比例与外周血血浆TMAO浓度成正比(图9B)。基于临床晚期三阴性乳腺癌免疫治疗队列的研究提示，高外周血血浆TMAO浓度与三阴性乳腺癌患者更好的免疫治疗疗效相关。

2.高血浆TMAO浓度与三阴性乳腺癌患者更长免疫治疗生存周期相关

除了免疫治疗效果与肿瘤退缩比例以外，免疫治疗对患者生存期的影响也非常关键。本发明基于晚期三阴性乳腺癌免疫治疗队列，将患者根据外周血TMAO浓度的中位数分为高外周血TMAO组和低外周血TMAO组，并基于患者肿瘤组织大小的变化情况。相较于低外周血TMAO组，高外周血TMAO组患者的无进展生存期更长，患者从免疫治疗中获益的时间更长(图9C)。

研究三和四：TMAO与其底物胆碱通过诱导肿瘤细胞焦亡激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长

体内实验证实TMAO能够提高三阴性乳腺癌肿瘤免疫治疗疗效(图10-13)

综合先前的数据分析，发现TMAO与肿瘤免疫激活和免疫治疗疗效相关，因此后续本发明将基于体内体外模型对TMAO的功能与机制进行探究。既往研究提示小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞移植瘤模型单用免疫治疗疗效不佳，因此后续选用该动物模型进行体内表型验证。根据肿瘤生长曲线，发现相较于单用PD-1抑制剂组，TMAO联用PD-1抑制剂能够显著抑制肿瘤生长。而肿瘤组织免疫组化结果也提示相较于单用PD-1抑制剂组，TMAO联用PD-1抑制剂能够提高瘤内CD8 T细胞浸润。

通过流式数据验证，发现TMAO能够促进瘤内杀伤性T细胞，也就是IFNγ⁺CD8 T细胞浸润。

本发明不仅通过免疫细胞浸润，也通过瘤内炎性因子水平来观察瘤内抗肿瘤免疫的激活情况。发现IFNγ、TNFα等细胞因子水平上升，提示CD8 T抗肿瘤功能强化，也同样佐证相较于单用PD-1抑制剂治疗组，TMAO联用PD-1抑制剂能够激活三阴性乳腺癌肿瘤免疫微环境，并提高免疫治疗疗效。

此外，本发明也利用66cl4三阴性乳腺癌细胞系造模，得到相似的结论，同样验证TMAO能够抑制肿瘤增殖并且增加抗肿瘤免疫细胞的在肿瘤内的占比，上调抗肿瘤细胞因子的瘤内水平，与在4t1细胞系中的发现相佐证。

TMAO通过焦亡途径激活肿瘤免疫(图14和15)

先前动物实验提示菌群特异性代谢产物TMAO能够激活小鼠体内肿瘤免疫。为了进一步探究TMAO通过何种机制激活肿瘤免疫，本发明基于RNA-SEQ数据发现TMAO刺激后，肿瘤细胞凋亡和炎性通路激活，推测TMAO通过诱导炎性凋亡，也就是焦亡激活肿瘤免疫。

首先从形态学角度进行验证，发现TMAO处理后4T1细胞出现典型的焦亡形态，细胞膜出现典型的涨破，并且PI染料摄取率显著上调。LDH释放实验也提示TMAO能够提高细胞焦亡比例。此外，本发明也通过Western Blot验证TMAO能够提高切割活化后的焦亡通路的关键蛋白caspase 3和GSDME蛋白量，提示TMAO处理后，肿瘤细胞焦亡通路激活。

胆碱激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫(图16)

胆碱是TMAO的前体代谢产物。研究团队通过给小鼠喂食TMAO前体代谢产物胆碱提高血浆TMAO和瘤内水平，并且证实补充胆碱摄入可以激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫，提高免疫治疗疗效。

具体实验结果如下：

1.体内实验证实TMAO抑制三阴性乳腺癌生长

在研究一中，本发明基于三阴性乳腺癌临床样本的多组学队列进行分析，发现梭菌目菌属以及梭菌目菌相关的代谢产物TMAO与三阴性乳腺癌激活的抗肿瘤免疫微环境相关。因此，本发明基于临床样本数据分析得到的相关性提出假设：细菌相关代谢物TMAO通过激活三阴性乳腺癌的抗肿瘤免疫，抑制三阴性乳腺癌生长，提高三阴性乳腺癌免疫治疗效果。

本发明选择了鼠源三阴性乳腺癌细胞系4T1细胞系，使用BALB/c小鼠进行造模，将肿瘤细胞注射入小鼠乳腺脂肪垫中，构建移植瘤模型。将小鼠分为4组接受以下不同的治疗：1)生理盐水联合IgG；2)生理盐水联合小鼠抗PD-1抗体(anti-PD-1)；3)TMAO联合IgG；4)TMAO联合小鼠抗PD-1抗体。其中生理盐水是TMAO的对照，两者采用瘤内注射的方式进行给药；IgG是小鼠PD-1抗体的对照，两者采用腹腔注射方式给药(图10)。

小鼠肿瘤生长曲线结果提示，与对照组相比，单用anti-PD-1并不能显著抑制三阴性乳腺癌体内模型的生长，这与临床上三阴性乳腺癌免疫治疗效果不佳的情形相印证。在都不使用抗PD-1抗体的情况下，使用TMAO相比于使用生理盐水能够显著抑制三阴性乳腺癌体内模型的生长速度。而TMAO与anti-PD-1的联用相较于单用anti-PD-1也能够显著抑制肿瘤的生长(图10A)。因此，三阴性乳腺癌细胞移植瘤模型提示TMAO可以有效抑制三阴性乳腺癌的生长并提高三阴性乳腺癌免疫治疗效果。

2.TMAO治疗激活小鼠三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫

研究一结果提示TMAO与三阴性乳腺癌激活的抗肿瘤免疫微环境与激活的免疫通路相关，因此推测TMAO是通过激活三阴性乳腺癌的抗肿瘤免疫进一步抑制三阴性乳腺癌的生长。

本发明首先验证TMAO治疗是否可以激活瘤内抗肿瘤免疫。利用免疫组化染色和流式细胞术来评估以上4组小鼠在接受不同治疗后瘤内免疫微环境的差异。免疫组化和流式细胞术分析结果显示单用anti-PD-1并不能有效提高瘤内CD8⁺T细胞的浸润，而相较于对照组，瘤内注射TMAO能够提高CD8⁺T细胞在肿瘤中的浸润比例。同时联用TMAO和anti-PD-1与单用anti-PD-1相比也可以有效地增加肿瘤内CD8⁺T的浸润(图10B,图11)。

同时，本发明利用ELISA技术对4种不同治疗方法的肿瘤组织内干扰素γ、肿瘤坏死因子α和白介素2的细胞因子水平进行检测，结果发现相较于对照组，TMAO处理组肿瘤组织内干扰素γ、肿瘤坏死因子α和白介素2的含量显著增加。同时，单独使用anti-PD-1没有影响肿瘤组织内干扰素γ和肿瘤坏死因子α的水平，但联用TMAO和anti-PD-1与单独使用anti-PD-1相比，组织内干扰素γ和肿瘤坏死因子α的水平也显著上调(图12)。综上所述，本发明验证了TMAO治疗可以激活小鼠肿瘤内的抗肿瘤免疫。

为了更全面地探究上述结论，本发明选择了第二种鼠源三阴性乳腺癌细胞系66cl4细胞系，使用BALB/c小鼠进行造模，将肿瘤细胞注射入小鼠乳腺脂肪垫中，构建移植瘤模型。将小鼠分为4组接受以下不同的治疗：1)生理盐水联合IgG；2)生理盐水联合小鼠抗PD-1抗体(anti-PD-1)；3)TMAO联合IgG；4)TMAO联合小鼠抗PD-1抗体。其中生理盐水是TMAO的对照，两者采用瘤内注射的方式进行给药；IgG是小鼠抗PD-1抗体的对照，两者采用腹腔注射方式给药(图13)。与4T1细胞系中的结果类似，同样发现TMAO可以抑制66cl4细胞系造模的三阴性乳腺癌细胞生长，提高抗肿瘤免疫治疗反应(图13)。

3.TMAO激活肿瘤细胞焦亡通路

为了进一步探究TMAO激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫的分子机制，本发明将肿瘤细胞在TMAO处理前后的RNA进行测序，并基于基因富集分析(Gene Set EnrichmentAnalysis)发现肿瘤细胞中凋亡与干扰素相关抗肿瘤免疫通路激活(图14)，这一结果提示TMAO可能与焦亡(又称炎性凋亡)相关。

在用TMAO处理在66cl4与4T1三阴性乳腺癌细胞系时，观察到细胞出现了“气球样”的形态改变，并通过碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色实验验证气球样改变细胞膜通透性(图15A,B)。同时发现，TMAO处理后肿瘤细胞上清中乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，LDH)含量增加(图15C)。而基于蛋白印迹分析的结果也同样提示，TMAO能够激活GSDME蛋白介导的焦亡通路。

4.口服胆碱可抑制三阴性乳腺癌生长并激活抗肿瘤免疫

肠道菌群可以通过其代谢功能，将胆碱，左旋肉碱和甜菜碱等代谢底物转化为TMA。TMA进一步在肝脏中代谢产生TMAO。因此，口服TMAO相关的代谢底物，以期上调TMAO浓度，是可行的临床转化手段。

推测口服胆碱可激活三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫。基于此，本发明设计动物实验，在小鼠乳腺脂肪垫中接种三阴性乳腺癌细胞系的移植瘤模型，并将小鼠分为6组，以普通饲料作为高胆碱饲料的对照，以普通饮用水作为添加3，3二甲基-1-丁醇(3,3-dimethyl-1-butanol，DMB)饮用水的对照，以IgG作为anti-PD-1的饲料(图16A)。与对照组相比，高胆碱饲料能够显著提高瘤内TMAO浓度，抑制小鼠体内三阴性乳腺癌移植瘤模型的生长。而DMB能够显著降低瘤内TMAO浓度，显著降低高胆碱饲料的肿瘤抑制作用(图16B,C)。

为了进一步探究小鼠移植瘤模型中免疫微环境的改变，本发明将小鼠肿瘤组织消化成单细胞并进行流式细胞术荧光染色。与对照组相比，高胆碱饲料能够显著提高小鼠肿瘤内CD8⁺T细胞的浸润和干扰素γ⁺CD8⁺T细胞的比例。而与高胆碱饲料组相比，DMB饮用水+高胆碱饲料能够显著降低小鼠肿瘤内CD8⁺T细胞的浸润和干扰素γ⁺CD8⁺T细胞的比例(图16D,E)。此外，TMAO浓度与梭菌目菌属丰度呈正相关，提示胆碱的抗肿瘤免疫功能是受到菌群调控的(图16F)。以上小鼠体内实验提示口服胆碱能够显著抑制三阴性乳腺癌的生长，并激活CD8⁺的抗肿瘤免疫，是临床切实可行的治疗手段。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.氧化三甲胺在制备治疗乳腺癌药物方面的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为提高三阴性乳腺癌免疫治疗疗效的药物。

3.氧化三甲胺的前体产物胆碱在制备治疗乳腺癌药物方面的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为提高三阴性乳腺癌免疫治疗疗效的药物。

5.一种包含氧化三甲胺和/或氧化三甲胺的前体产物胆碱，还包含PD-1抑制剂的药物组合物在制备治疗乳腺癌药物组合物方面的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括提高三阴性乳腺癌免疫治疗疗效的药物。