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CN116333117B - 抗表皮生长因子受体抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

抗表皮生长因子受体抗体及其制备方法和用途 Download PDF

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CN116333117B CN202111541690.8A CN202111541690A CN116333117B CN 116333117 B CN116333117 B CN 116333117B CN 202111541690 A CN202111541690 A CN 202111541690A CN 116333117 B CN116333117 B CN 116333117B
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Abstract

本发明提供了一种抗人表皮生长因子受体(EGFR)抗体或其抗原结合片段。本发明进一步提供了包含该抗体或其抗原结合片段的的双特异性分子或多特异性分子、免疫缀合物，以及编码该抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含该核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还提供了制备该抗体或其抗原结合片段的方法、包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物，以及在治疗疾病中使用该抗体或其抗原结合片段，或其药物组合物的方法和用途，本发明为针对EGFR的抗肿瘤或其它疾病或病症(例如炎症以及自身免疫性疾病)的治疗和/或预防提供了候选的特异性抗体药物。

Description

抗表皮生长因子受体抗体及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体或其抗原结合片段、编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、表达载体及宿主细胞、包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物及其用于治疗对象的用途或方法。
背景技术
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)，又称为ErbB-1或HER1，是ErbB受体酪氨酸激酶超家族成员之一，它是由原癌基因c-erbB编码的一种分子量约为170kDa的多功能跨膜糖蛋白，主要由参与配体结合的胞外区胞、跨膜区和具有酪氨酸激酶活性的胞内区构成，其中胞内区具有酪氨酸激酶活性(Modjtahedi et al.，Br.J.Cancer 73:228-235，1996；Herbst and Shin，Cancer 94:1593-1611，2002)。EGFR的已知配体包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(Transforming Growth Factor-α，TGF-α)、表皮调节素/EREG和HBEGF/肝素结合EGF、双向调节因子、β细胞素/BTC、上皮细胞有丝分裂蛋白(epigen)/EPGN，EGFR与配体结合后引发EGFR同二聚化或异二聚化，导致EGFR胞内酪氨酸激酶活性区发生自体磷酸化，磷酸化的EGFR募集衔接蛋白(例如GRB2)随之激活下游信号传导途径，进而调控多种细胞生理过程，例如，通过Ras诱导的MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路(例如，RAS-RAF-MEK-ERK)来调控细胞的增殖、分化、凋亡、炎症反应以及血管生成等生物学功能，通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路(PI3激酶-AKT)来调控细胞增殖和存活、细胞骨架重组、膜运输、细胞粘附和运动、血管再生及胰岛素作用，以及通过JAK/STAT途径来调控血液细胞对细胞因子的反应以及参与细胞发育、分化、增殖、凋亡和免疫调节等重要生物学过程(Atalay等，Ann.Oncology 14：1346-1363(2003)；Tsao和Herbst,Signal 4：4-9(2003)；Herbst和Shin,Cancer 94：1593-1611(2002)；Modjtahedi等，Br.J.Cancer 73：228-235(1996))。通过EGFR的配体结合也可以激活NF-κ-B信号传导级联，进而参与机体的炎症反应、免疫应答和调节细胞凋亡以及应激反应。EGFR与配体结合也可以直接磷酸化其它蛋白(例如RGS16)，从而激活其GTP酶活性，并可能将EGF受体信号传导至G蛋白偶联的受体信号传导。EGFR与配体结合还可以使MUC1磷酸化并增加其与SRC和CTNNB1/β-连环蛋白(catenin)的相互作用等，进而调控细胞生长和细胞粘附等生物学功能。
研究表明在多种实体肿瘤(例如，非小泡细胞肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、头颈癌、食道癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、肾癌等(Woodburn JR，PharmacolTher 1999；82:241-50；Yarden Y，Eur J Cancer 2001；37:S3-S8；Mendelsohn J等，Oncogene2000；19:6550-65))中存在EGFR高表达或异常表达，EGFR信号通路发生异常的可能机制包括EGFR过表达、EGFR突变、自分泌环的作用增强、配体表达的增加、受体下调机制的破坏、异常信号转导通路的激活等(Roza Zandi等，Cellular Signalling,2007,19:2013-2023)。EGFR在肿瘤细胞膜上的过度表达和/或增殖与肿瘤患者的不良预后、降低了的生存期和更高的肿瘤侵袭性相关。此外，EGFR也在正常组织(例如，皮肤、肝和胃肠道的上皮组织)中表达，但表达水平远低于肿瘤组织(Herbst和Shin，Cancer 94：1593-1611(2002))。
目前，靶向EGFR胞外域部分的单克隆抗体包括西妥昔单抗(Cetuximab，又称为IMC-225，Erbitux)、帕尼单抗(Panitumumab，又称为ABX-EGF)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab，又称为IMC-11F8)和Matuzumab(EMD72000)，可阻断EGFR受体与配体的结合进而抑制配体介导的EGFR酪氨酸激酶的活化或干扰EGFR二聚化的形成，由于阻断了受体-配体结合，处于肿瘤微环境中的肿瘤细胞或基质细胞中的EGFR信号传导途径所调控的肿瘤细胞生理过程被中断，从而抑制肿瘤细胞的生长、诱导凋亡、减少基质金属蛋白酶和血管上皮生长因子的产生，进而发挥抗肿瘤的作用(Fan Z等，1994；Abanell J等，2001；Prewett M等，1996；Huang SM等，1999；Fan Z等，1993a；Fan Z等，1993b)。此外，西妥昔单抗和耐昔妥珠单抗还会诱导EGFR内化和降解，引发EGFR+肿瘤细胞发生抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)(Kawaguchi Y等，1996；Kimura H等，2007)。ADCC取决于细胞FcγR与单克隆抗体之间的相互作用，触发包括NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、活化的T淋巴细胞以及粒细胞的先天免疫反应。受体内化下调可用的细胞表面受体的数量，并且可以因此影响EGFR活化。尽管帕尼单抗是采用转基因小鼠技术制备的全人源单克隆抗体，其作用机制为竞争性与肿瘤细胞上EGFR结合，阻断EGFR与配体EGF和TGFa结合，诱导EGFR内化，消除由EGFR介导的细胞效应，但是当帕尼单抗应用到人体内时可显著降低人鼠嵌合抗体的免疫原性，但是帕尼单抗是IgG2亚型抗体，与IgG1相比，IgG2的ADCC和/或CDC活性明显降低，以及IgG2亚型抗体的稳定性较差，这可能是在临床疗效方面帕尼单抗与西妥昔单抗相比没有显著优势的原因。
尽管目前已有上市了的靶向EGFR的抗体以及已有不少EGFR抗体正处于临床试验研究阶段，但是现有的抗体对EGFR+肿瘤的治疗并不是始终有效的，例如西妥昔单抗和帕尼单抗只对EGFR表达的KRAS野生型肿瘤有治疗效果，而对KRAS突变的肿瘤不具有抑制作用，因此限制了西妥昔单抗和帕尼单抗的临床应用。即使对西妥昔单抗或帕尼单抗具有治疗响应且受益于所述抗体的患者经过一段时间治疗后会对所述抗体产生抗性，产生抗性的原因之一是EGFR胞外结构域发生一种或多种突变。此外，由于多种正常组织也会表达EGFR，抗EGFR抗体在进行抗肿瘤治疗时也会靶向到表达EGFR的正常组织，导致例如皮肤损伤和/或过敏反应等副作用，有时严重的副作用会给患者带来生命危险。
考虑到目前更多的EGFR高表达或异常表达的实体肿瘤的治疗问题尚未得到解决，本领域希望开发出更多新的抗EGFR抗体来满足治疗需要。
发明内容
本发明提供了一种抗EGFR抗体及其制备方法和在EGFR过表达或表达异常病症中的应用。
一方面，本发明提供了一种能够特异性结合EGFR的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段特异性结合至人EGFR的胞外结构域。在某些实施例中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段特异性结合人EGFR，通过ELISA检测其EC50值不超过1nM，优选的是不超过0.5nM，更优选的是不超过0.05nM。在一些实施例中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段的结合活性与西妥昔单抗的相当。在某些实施例中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段以高亲和力结合至人EGFR，通过结合动力学检测其结合常数和解离常数，并拟合计算得到亲和力常数(KD)数值不超过1×10-8M，优选的KD值不超过5×10-9M。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段与其它人ErbB受体酪氨酸激酶，例如HER2、HER3和/或HER4不具有交叉反应活性。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段对表达EGFR的肿瘤细胞增殖活性具有抑制作用。在一些实施方式中，通过ELISA检测所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段对肿瘤细胞的IC50值不超过5nM。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO：2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：3所示的HCDR3中任意一个、两个或三个重链互补性决定区(HCDR)氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO：2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：3所示的HCDR3，或分别与所述HCDR1、HCDR2和HCDR3具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3中任意一个、两个或三个轻链互补性决定区(LCDR)氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3，或分别与所述LCDR1、LCDR2和LCDR3具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列，且与人EGFR保持特定的结合活性。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，或与所述重链可变区具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列，且与人EGFR保持特定的结合活性。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区，或与所述轻链可变区具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列，且与人EGFR保持特定的结合活性。
另一方面，本发明提供了编码本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段的核酸分子，以及包含所述核酸的表达载体和包含核酸或表达载体的宿主细胞。本发明还涉及使用所述宿主细胞制备本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段的方法。
另一方面，本发明还提供了使用包含核酸或表达载体的宿主细胞制备本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括(1)在宿主细胞中表达抗体，以及(2)从宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体。
另一方面，本发明提供了包含本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的双特异性分子或多特异性分子、免疫缀合物、嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒。
在一些实施方案中，所述双特异性分子或多特异性分子包含另一个功能性分子，其选自Fc受体、与癌症相关的抗原(TAA)或免疫检查点蛋白抗原具有特异性的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述双特异性分子或多特异性分子还可以进一步包括第三结合特异性，例如抗增强因子(EF)部分。
在一些实施方案中，所述的免疫缀合物包含治疗剂、或可检测标记物(例如，放射性同位素、发光标记物、荧光标记物或酶底物标记物)与本发明的抗体或其抗原结合片段偶联。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段，或包含本发明抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体或多特异性抗体、免疫缀合物、嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒，以及药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供了一种药盒，所述药盒包含有效量的本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的药物组合物，与一种或多种其它治疗剂，所述治疗剂选自化学治疗剂、抗癌剂以及免疫调节剂。
另一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段，或包括本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的药物组合物，或本发明抗体或其抗原结合片段与可检测标记物构成的免疫缀合物。
另一方面，本发明提供了一种本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防EGFR相关疾病或病症的药物组合物或制剂中的用途、制备用于诊断EGFR相关疾病或病症的诊断试剂中的用途。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症或其它EGFR相关疾病。在一些实施方式中，所述癌症包括但不限于黑色素瘤、肺癌(非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌或肾细胞癌、肝癌、食道癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌、头颈癌、胶质母细胞癌、皮肤癌及其它实体和/或转移性癌症。在一些实施方案中，所述其它EGFR相关疾病包括但不限于自身免疫疾病、牛皮癣、或炎症性关节炎(例如，类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮相关的关节炎、牛皮癣关节炎)、或除癌症之外的其它细胞增值性疾病(包括肾上腺皮质增生(库欣病)、先天性肾上腺皮质增生、子宫内膜增生、良性前列腺增生、乳腺增生、内膜增生、局灶性上皮增生(Heck氏病)、皮脂腺增生、代偿性肝增生以及任何其它细胞增殖性疾病)。
另一方面，本发明提供了一种治疗和/或预防EGFR相关疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段、或药物组合物、或药盒。在一些实施方案中，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段、药物组合物或药盒可以单独施用，或与一种或多种其它治疗剂或治疗手段联合施用，所述的其它治疗剂包括本发明公开的化学治疗剂、抗癌剂、免疫调节剂或本领域公知的治疗剂，所述的治疗手段包括但不限于外科手术、化学疗法、细胞毒性剂、光动力疗法、免疫调节或放射疗法。在一些实施方案中，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段、药物组合物或药盒可以与一种或多种其它治疗剂同时施用，也可以与另外的治疗剂分开施用。
另一方面，本发明提供了一种调节EGFR过表达细胞中EGFR活性的方法，包括使用本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段，或其药物组合物或药盒处在体内或体外引发一种或多种生物学活性，例如，抑制表达EGFR细胞中EGF或TGF-α诱导的自磷酸化；抑制自分泌EGF或TGF-α所诱导表达的EGFR细胞的激活；或抑制表达EGFR细胞的生长或增殖。
另一方面，本发明提供了一种检测待测样品中EGFR的含量或表达水平的方法，其包括将待测样品与本发明抗体或其抗原结合片段接触，并测定待测样品中EGFR的含量或表达水平，或使用本发明试剂盒检测待测样品中EGFR的含量或表达水平。
另一方面，本发明提供了一种在受试者中检测、诊断或监控EGFR相关疾病或病症的方法，所述方法包括：(1)使用本发明试剂盒检测从受试者获得的待测样本中EGFR的含量或表达水平，或将从受试者获得的待测样本与本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段接触，检测待测样本中EGFR的含量或表达水平；(2)诊断受试者是否存在EGFR相关疾病或病症或所述疾病或病症的状况。
通过下面的附图和具体实施方案中进一步说明本发明，本发明所公开的其它特征和优点将是显而易见，并且这些附图和具体实施方案不应被认为限制本发明的范围，并且本领域技术人员容易想到的改变将包括在本发明的精神和所附权利要求的保护范围内。在本申请中引用的所有参考文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
附图说明
图1.ELISA法检测抗EGFR抗体以及对照抗体(西妥昔单抗)分别与抗原hEGFR的结合活性。
图2.ELISA法分别检测抗EGFR抗体以及对照抗体与HER2(图2A)、HER3(图2B)和HER4(图2C)的交叉反应活性，其中与HER2、HER3和HER4交叉反应实验分别使用的对照抗体是Herceptin、patritumab和与HER4具有强交叉反应的抗EGFR抗体mAb1130(自制)。
图3.抗EGFR抗体以及对照抗体(西妥昔单抗)对A431细胞株增殖活性影响的检测。
图4.竞争性ELISA法检测抗EGFR抗体mAb1129与其它自制抗EGFR抗体的表位。
发明详述
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。
在本文中，“EGFR”可来源于任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，例如灵长类(例如人类、猴子)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。人EGFR的示例性序列包括全长人EGFR蛋白Genbank accession No.:NP_005219.2)，具体序列如下：
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA
本发明使用的人EGFR胞外域结构(ECD)蛋白的氨基酸序列如下：
LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCP
在本文中，术语“EGFR”旨在包含任何形式的EGFR，例如，(1)天然未经处理的EGFR分子、“全长”EGFR链或天然产生的EGFR变体，包括，例如，剪接变体或等位基因变体；(2)细胞内处理后产生的任何形式的EGFR；或(3)通过重组方法产生的EGFR亚单位的全长、片段(例如，截短形式，细胞外/跨膜结构域)或其修饰形式(如突变形式、糖基化/聚乙二醇化、His-tag/免疫荧光融合形式)。
在本文中，术语“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如受体)与其配对体(例如配体或抗体)之间相互作用的内在结合能力，即全部非共价相互作用总和的强度。除非另外陈述，如本文中使用的，“结合亲和力”是用于反映结合对的成员(例如受体和配体或抗体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用平衡解离常数(KD)表示，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别为K解离(Kdis或KOff)和K结合(Ka或Kon)的比值。亲和力可以通过本领域已知的常见方法来测量，包括本发明中所使用的方法。
在本文中，“抗体”是指包括一种或多种基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，这些进而分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体可以是任何同种型/类别(例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)或任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。典型的免疫球蛋白(例如抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。将轻链和重链二者分成结构同源性区和功能同源性区。所述术语“恒定”和“可变”是在结构和功能上使用。每条链的N端定义了主要负责抗原识别的具有约100至110个或更多个氨基酸的可变(V)区或结构域，主要负责抗原识别。本文中所使用的“抗体”是最广义的，包括各种抗体结构，只要它们能展现出所期望的抗原结合活性，所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。
抗体以完整的免疫球蛋白形式存在，或以各种由肽酶的消化产生的许多充分表征的片段形式存在。在本文中，术语抗体的“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)是指由含有一个、或两个、或两个以上CDR(互补性决定区)的抗体部分或者任何其他结合抗原(例如，IL-2蛋白)但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段可以与完整抗体一样结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合片段可以含有来自某特定人抗体的一个、或两个、或两个以上CDR，移接至来自一个、或两个、或两个以上不同人抗体的框架区。抗原结合片段包括不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv－dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(dsdiabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(双价的双功能抗体)、双价单链抗体(BsFv)、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗体、域抗体和双功能抗体(diabody)。例如，抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包括轻链可变区和轻链恒定区)与一条重链的可变区和CH1经二硫键结合起来的抗体片段。“Fab'”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。“F(ab')2”指的是Fab的二聚体。抗体的“Fc”片段，是由重链的CH2和CH3经二硫键连接而成的抗体片段。抗体的Fc片段负责多种不同的效应功能，如决定抗体在体内血清的半衰期、介导免疫反应，例如，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、激活补体依赖的细胞毒性(ComplementDependent Cytotoxicity，CDC)或抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(Antibody DependentCellular Phagocytosis，ADCP)，但不参与抗原的结合。抗体的“Fv”段，是指含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。“单链抗体”或“单链Fv抗体(scFv)”，是指由轻链可变区与重链可变区直接相连，或使用重组方法，通过一个肽链连接而成的工程化抗体/单一蛋白质链形式，其中轻链可变区和重链可变区配对形成单价分子，即scFv(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA、85:5879(1988))。“(dsFv)2”含有三条肽链：是指两个VH基团间通过一条多肽衔接物相连，并通过二硫键与两个VL基团结合。“双特异性ds双功能抗体”含有VL1-VH2(由一个多肽衔接物相连)和VH1-VL2(也是由一个多肽衔接物相连)，两者在VH1和VL1间通过二硫键结合。“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv”含有三条多肽链：VH1-VH2片段，其中两者的重链通过多肽衔接物(如：长的弹性衔接物)相连，并通过二硫键分别与VL1和VL2片段结合，每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。“scFv二聚体”是双价双功能抗体或双价单链抗体(BsFv)，含有二聚化的两个VH-VL(由多肽衔接物连接)片段，其中一个片段的VH与另一个片段的VL协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向结合相同抗原(或抗原结合表位)或不同抗原(或抗原结合表位)。在另一些实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，含有相互连接的VL1-VH2(由多肽衔接物连接)和VH1-VL2(由多肽衔接物连接)，其中VH1和VL1协作，VH2和VL2协作，且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。“单链抗体Fv-Fc(scFv-Fc)”，是指scFv与抗体Fc片段组成的工程化抗体。“骆驼化单域抗体(Camelized single domainantibody)”、“重链抗体”或“HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)”都是指含有两个VH域而不含有轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.,J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,J Biotechnol.Jun；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；U.S.Patent No.6,005,079)。重链抗体最初是在驼科(包括骆驼、单峰驼和美洲驼)中发现的。虽然缺失轻链，但骆驼化抗体(camelized antibodies)具有抗原结合的全部功能(Hamers-Casterman C.等，Nature.Jun 3；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等，“Heavy-chain antibodies in Camelidae：a case of evolutionaryinnovation,”Immunogenetics.Apr；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等，Immunology.May；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变区(VHH域)是目前已知的最小的获得性免疫所产生的抗原结合单位(Koch-Nolte F.等，FASEB J.Nov；21(13):3490-8.Epub 2007Jun15(2007))。“纳米抗体”是由一个来自重链抗体的VHH域和两个恒定区CH2和CH3组成的一种抗体片段。“域抗体”是指仅含有一条重链可变区或一条轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或两个以上VH域由一个多肽衔接物共价结合并形成双价域抗体。双价域抗体的两个VH域可靶向作用于相同或不同的抗原。“双功能抗体(diabody)”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段含有在同一条多肽链上相连的VH域和VL域(如VH-VL或VL-VH)(Holliger P.等，Proc Natl Acad Sci USA.Jul 15；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。这两个抗体结合位点可靶向结合相同或不同的抗原(或抗原结合表位)。
本发明抗EGFR抗体包括全长抗体的全部或其抗原结合片段(参照上文的定义)，并且任选地包含能够与EGFR配体如EGF竞争性结合EGFR的抗体可变区的全部或部分，并任选地包括由V基因和/或D基因和/或J基因编码的一个、或两个、或两个以上区。
在本文中，术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异型四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N末端至C末端，每条重链具有可变区(VH，也称为可变重域或重链可变域)，接着是3个恒定域(CH1、CH2和CH3，也称为重链恒定区)。类似地，从N末端至C末端，每条轻链具有可变区(VL，也称为可变轻域或轻链可变域或轻链可变区)，接着是恒定轻域(也称为轻链恒定区，CL)。免疫球蛋白的重链可以分成α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以分成称为kappa(κ)和lambda(λ)。免疫球蛋白一般由通过免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。
在本文中，术语“轻链可变区(VL)”和可变重链(VH)分别是指分别指包含VL或VH的多肽。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。内源性VL由基因区段V(可变)和J(连接)编码，并且内源性VH由V、D(多样性)和J编码。VL或VH都包括高变区CDR(互补性决定区)和构架区(FR)。术语“可变区”或“V区”可互换地使用，是指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重链可变区或轻链可变区。V区可以是天然存在的、重组的或合成的。在本文中，抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区有时可统称为“抗体可变区”或“抗体链”。如本文提供和进一步描述的，“抗体轻链可变区”或“抗体重链可变区”和/或“抗体可变区”和/或“抗体链”任选地包含引入半胱氨酸残基的多肽序列。
在本文中，术语“互补决定区(CDR)”或“高变区(HVR)”可以互换使用，是指抗体可变区中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。CDR是抗体的靶蛋白结合位点，CDR在结构上与靶蛋白的表位互补，因此该结合位点具有结合这种靶蛋白的特异性。通常，天然的四链抗体包含六个CDR,三个在VH中(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及三个在VL中(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。除了CDR的其余VL或VH区，即框架区(FR)具有较少的氨基酸序列变异(Kuby,Immunology[免疫学],第4版,第4章,W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],纽约,2000)。
CDR和FR的位置可以使用本领域熟知的多种定义方法确定，例如，Kabat、Chothia、IMGT和Contact(参见，例如，Kabat等人1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学相关蛋白序列],第五版,U.S.Department of Health and HumanServices[美国卫生与公众服务部],NIH公开号91-3242,Johnson等,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature[自然],342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227:799-817(1992；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-748(1997)；Lefranc,M.-P.等,IMGT,The InternationalImMunoGeneTics Database；Nucleic Acids Research 27(1999)209–212；MacCallum,R.M.等.J.Mol.Biol.262(1996):732-745.)。抗原结合位点的定义还在以下文献中描述：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],28:219-221(2000)；和Lefran,M.P.,Nucleic AcidsRes.[核酸研究],29:207-209(2001)；(免疫遗传学(IMGT)编号)Lefranc,M.-P.,TheImmunologist[免疫学家],7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育与比较免疫学],27,55-77(2003)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.[酶学方法],203:121-153(1991)；和Rees等人,于：Sternberg M.J.E.(编辑),Protein Structure Prediction[蛋白结构预测],Oxford University Press[牛津大学出版社],Oxford[牛津],141-172(1996)。本发明包含任何一种定义方法来确定本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段中的CDR，表1显示了使用不同定义方法所确定的抗体CDR的氨基酸残基。涵盖特定CDR的确切氨基酸残基数量随CDR的序列而变化。在明确了抗体可变区的氨基酸序列情况下，本领域技术人员能够通过包括不限于所述定义的常规方法确定所述抗体的CDR。
表1.不同定义方法确定的CDR
CDR Kabat Chothia IMGT Contact
HCDR1 31-35 26-32 27-38 30-35
HCDR2 50-65 52-56 56-65 47-58
HCDR3 95-102 95-102 105-117 93-101
LCDR1 24-34 24-34 27-38 30-36
LCDR2 50-56 50-56 56-65 46-55
LCDR3 89-97 89-97 105-117 89-96
此外，Kabat等人还定义了针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员能够明确地将此“Kaba编号”系统应用到任何抗体的可变区序列，而无需依赖于抗体序列本身以外的任何实验数据来确定可变区序列。
在本文中，术语“Fc区”或“Fc结构域”是指免疫球蛋白重链的C末端区域，其至少含有恒定区的一部分，例如除了第一恒定区(CH1)之外的免疫球蛋白重链恒定区。本文所使用的Fc区包括天然序列Fc区和/或Fc区变体，并且可以是本发明抗EGFR抗体的一部分。在本领域中应理解，Fc区的边界可以变化，然而，人IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基端包含第226位半胱氨酸残基或第230位脯氨酸残基，其根据EU编号系统/方案，如见于Kabat等人)(1991,NIH公开91-3242,National Technical Information Service[国家技术信息服务],斯普林菲尔德,弗吉尼亚州)。
在本文中，术语“单克隆抗体”是指从基本上具有同质性的抗体群中所获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变之外，构成抗体群中的各个抗体是相同的。单克隆抗体表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。此外，相比于通常包含针对不同决定子(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。修饰语“单克隆”指从实质上均质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。举例来说，根据本发明技术使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人,《自然》256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制得，或可以通过重组DNA方法制得(参见例如，美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等人,《自然》352:624-628(1991)以及Marks等,《分子生物学杂志》222:581-597(1991)中所描述的技术从噬菌体抗体库中分离。
在本文中，术语“重组”在提及例如细胞或核酸、蛋白质或载体时使用时，指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或更改天然核酸或蛋白质而加以修饰，或所述物质来源于如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞表现细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因或表现以其它方式异常表现、低表现或完全不表现的天然基因。
在本文中，术语“嵌合抗体”是指含有源自两种不同抗体的序列的抗体(例如，美国专利US4,816,567)，所述抗体通常源自不同物种。例如，嵌合抗体包含人类和啮齿动物抗体片段，通常是人类恒定区和小鼠可变区。用于产生嵌合抗体的方法包含本领域一般技术人员已知的常规重组DNA和基因转染技术(例如Morrison,S.L.等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》81(1984)6851-6855；US 5,202,238和US 5,204,244。)
本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段可以选自以下任一个形式、或两个、或两个以上形式，包括嵌合形式、非人形式、人源化形式或全人形式，只要所述形式能够与人EGFR特异性结合，并抑制人EGFR介导的生物学功能。
在本文中，术语“特异性结合”或“结合特异性”或“对…具有特异性”或“结合””是指结合反应，该结合反应决定了蛋白质和其他生物制剂的异质群体(例如，在生物样品(例如血液、血清、血浆或组织样品))中，靶分子(或蛋白或抗原)的存在，也就是说此结合对于靶分子是具有选择性的，并且能区分开那些不期望的或非特异性的相互作用。例如，与靶分子(其可以是抗原)特异性结合的抗体是相比于该抗体与其它靶分子结合，该抗体结合该靶分子时具有更大亲和力、结合活性、更容易和/或持续时间更长。在某些实施例中，通过ELISA法测量，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段呈现出与西妥昔单抗相似的结合活性。
“不具有交叉反应”，即不与除特异性靶分子/蛋白的其它分子/蛋白结合。在某些实施例中，通过ELISA法检测发现，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段与同家族其它人ErbB受体酪氨酸激酶(例如HER2、HER3和/或HER4)不结合。
如本文所用的，术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白决定区。表位通常由分子的化学活性表面组群如氨基酸或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于在变性溶剂的存在下与前者的结合丧失，但是与后者的结合不会丧失。
如本文所用的，术语“表位结合结构域”或“抗原结合结构域”或“抗原结合区”可互换使用，是指与靶表位上的结合位点特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、使稳定/使不稳定、空间分布)的结合分子的部分(例如，抗体或者其表位结合片段或衍生物)。本发明中“抗原结合区”也指保留与EGFR表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、使稳定/使不稳定、空间分布)的抗体的一个、或两个、或两个以上片段。
在本文中，氨基酸取代包括保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代，保守氨基酸取代涉及用同类(例如化学性质或功能相似)中的另一个氨基酸进行置换，非保守取代涉及用另一类中的氨基酸置换这一类别中的一种的氨基酸。本领域一般技术人员可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行保守氨基酸取代。例如，(i)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸(Ala，A)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、缬氨酸(Val，V)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)和蛋氨酸(Met，M)；(ii)极性中性氨基酸包括甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)和谷氨酰胺(Gln，Q)；(iii)带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)和组氨酸(His，H)；(iv)带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)。非保守氨基酸取代，可能以亲生物大分子的性质或功能发生很大变化。一般预期使多肽性质发生最大变化的取代包括但不限于：(a)例如丝氨酸或苏氨酸等亲水性残基取代(或被取代)例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸等疏水性残基；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代(或被取代)任何其它氨基酸残基；(c)例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基等具有正电性侧链的残基取代(或被取代)例如谷氨酰基或天冬氨酰基等负电性残基；或(d)例如苯丙氨酸等具有庞大侧链的残基取代(或被取代)例如甘氨酸等不具侧链的残基。如本领域所知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著改变，因此可保持蛋白质的生物活性。尽管对引入氨基酸序列突变的位点或区域可以预先确定，但非保守取代所带来的潜在的生物大分子性质或功能的改变却是无法预见的。
在本文中，在两个或更多个核酸或多肽序列中，术语“相同的”或“同一性”或“同一性百分比”或“百分比序列同一性”可以互换使用，是指在进行氨基酸序列(或核酸序列)比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTN,BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)，也可参见，Altschul S.F.等、J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站，可参见，Higgins D.G.等，Methods inEnzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。)
在本文中，当涉及核酸(或多核苷酸)或蛋白时，术语“分离的”表示该核酸或蛋白基本上不含在天然状态下与其结合的其他细胞组分，优选处于同质状态，例如，分离的核酸或蛋白可以是从天然或自然环境中移出的。分离的核酸或蛋白可以是冻干的或者是水溶液。通常，其纯度和均质性可以使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳或色谱法，例如高效液相色谱法)来确定的。作为制剂中的主要成分。蛋白基本上是通过纯化得到的。术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳凝胶中基本上产生一条带。特别地，这意味着核酸或蛋白为至少85％纯度、更优选地至少95％纯度、以及最优选地至少99％纯度。就本发明而言，在一些实施方案中，在宿主细胞中表达的重组蛋白则被视为是分离的，同样也适用于通过任何本领域技术人员熟知的技术分开、分级(fractionate)、或部分或基本纯化的天然的或重组的蛋白。在一些实施方案中，“分离的抗体””指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性地结合人EGFR的分离的抗体基本上不含特异性地结合除人EGFR之外的抗原的抗体)。然而，特异性地结合人EGFR的分离的抗体可以与其它抗原(如来自其它物种的EGFR分子，例如小鼠EGFR)具有交叉反应性。而且，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学物质。在一些实施方案中，包含在载体中的编码本发明多肽或蛋白(例如抗EGFR抗体)的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的其它例子包括在异源宿主细胞中包含的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或基本地)的多核苷酸。分离的多核苷酸包括在普遍含有该多核苷酸分子的细胞中所含有的多核苷酸分子，但该多核苷酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的其它染色体位置。本发明分离的多核苷酸或核酸还包括合成生成的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节性元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文所用的，术语“多肽”是指氨基酸及其等同物的聚合物，而不是指产物的具体长度；因此，“肽”和“蛋白质”包含在多肽的定义内。多肽的定义内还包含本文定义的“抗体”。
除非上下文另外指示，否则“衍生物”是相对于第二多肽(也称为“变体”)具有一个、或两个、或两个以上非保守或保守氨基酸取代的多肽或其片段；或通过共价连接第二分子，例如通过连接异源多肽，或通过糖基化、乙酰化、磷酸化等修饰的多肽或其片段。“衍生物”的定义还可以包含例如含有一种或多种氨基酸(例如，非天然氨基酸等)的类似物的多肽、具有未经取代的连接的多肽以及本领域已知的(天然的和非天然存在的)其它修饰。
在本文中，术语“表达载体”或“载体”是指可将编码某蛋白的多核苷酸或核酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。
在本文中，术语“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸或核酸和/或载体的细胞。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本申请中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
在本文中，术语“EC50”，也称为半数最大有效浓度，是指在特定暴露时间后，能达到50％最大(即，基线值和最大值之间的50％)生物效应(如结合或抑制等)所对应的抗体浓度。EC50值可通过本领域已知的方法来测量，例如，夹心法如ELISA、免疫印迹、流式细胞术和其他结合分析。
在本文中，术语“IC50”，也称为半数最大抑制浓度，是指相对于没有抗体时，将特定的生物学或生化功能抑制50％时所对应的抗体的浓度。
在本文中，术语“受试者”、“患者”或“个体”可以互换使用，包括但不限于：哺乳动物，包含例如人、非人灵长类动物(例如，猴)、小鼠、猪、牛、山羊、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、猴、绵羊或其它非人类哺乳动物；非哺乳动物，包含例如非哺乳类脊椎动物，如鸟(例如，鸡或鸭)或鱼；以及非哺乳类无脊椎动物。在一些实施例中，本发明的用途或方法所涉及的受试者和药物组合物用于(预防性地和/或治疗性地)治疗非人类动物。
在本文中，对某种疾病或症状的“治疗(treating或treatment)”是指减轻某种疾病或症状，降低某种疾病或症状兴起或发展的速度，减少发展出某种疾病或症状的风险，或延迟与某种疾病或症状相关的症状发展，减少或终止与某种疾病或症状相关的症状，产生某种疾病或症状的完全或部分的逆转，治愈某种疾病或症状，或以上的组合。
在本文中，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有家族病史的受试者是预防性方案的候选者。通常，术语“预防”是指在病征或症状发生前，特别是在具有风险的受试者中发生前的药物施用。
本文所使用的“EGFR相关”疾病或症状是指由EGFR表达或活性增加或减少引起、加剧或以其他方式与之相关的任何疾病或症状。在某些实施方案中，EGFR相关的病症是癌症。
术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现预防或改善与疾病或病症有关的症状和/或减轻疾病或病症严重程度的剂量或浓度。本发明的制剂、抗体或其抗原结合片段或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也可被认为是制剂、抗体或其抗原结合片段或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。
在本文中，术语“药学上可接受的”或“药用可接受的”是指所指的载剂、溶媒、稀释剂、辅料和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与受试者相兼容。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值，或在一个实施方式中为小10％的下限和大10％的上限，或在另一个实施方式中为小15％的下限和大15％的上限，或在另一个实施方式中为小20％的下限和大20％的上限。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”或“含有”或“具有”可互换使用，意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”或“含有”或“具有”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。
在以下章节中将更详细地描述本发明的各个方面。
1、本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段
一方面，本发明提供了一种抗EGFR抗体或其抗原结合片段，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人EGFR的胞外结构域。
本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段特异性结合至人EGFR的胞外结构域，通过ELISA检测其EC50值不超过1nM，优选地，不超过0.5nM，更优选地，不超过0.05nM。本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段具有与西妥昔单抗相当的人EGFR结合活性。
本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段还能够以高亲和力结合至人EGFR胞外结构域，通过抗原-抗体结合动力学检测本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段与人EGFR之间的结合常数和解离常数并进行拟合计算，得到的亲和力常数(KD)数值不超过1×10-8M，优选的KD值不超过5×10-9M。
本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段与其它人ErbB受体酪氨酸激酶，例如，HER2(又称为ErbB2)、HER3(又称为ErbB3)、和/或HER4(又称为ErbB4)不具有交叉反应活性(或不结合)。所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段与非靶蛋白(例如Her2/ERBb2，Her3/ERBb3或Her4/ERBb4)的结合程度与所述抗体或其抗原结合片段与EGFR的结合相比低大约10％以上，其可以通过本领域已知方法确定，如ELISA、荧光激活细胞分选(FACS)分析或者放射性免疫沉淀法(RIA)。
因此，在一些实施方案中，本文所使用的“特异性结合”是指分子(例如本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段)结合特定多肽(例如人EGFR)或特定多肽的表位，而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。
本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段能够抑制表达EGFR肿瘤细胞的增殖。在某些实施方式中，通过ELISA法检测，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段对肿瘤细胞的IC50值不超过5nM。
本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段的表位不同于本发明其它自制抗EGFR抗体(例如mAb1126、mAb1127和mAb1128)。在某些实施方式中，通过竞争EILSA法检测，本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段mAb1129不与本发明其它自制抗EGFR抗体(例如mAb1126、mAb1127和mAb1128)竞争。
本发明的抗体还可以任选地包括F(ab)2、F(ab’)2、Fab、Fab’、scFv、单结构域抗体等。本发明的抗体可以是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体，可以是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和抗体片段，只要所述抗体能特异性识别人EGFR，尤其是人EGFR的胞外结构域，并能抑制人EGFR在表达EGFR肿瘤细胞中所介导的生物学功能，例如肿瘤细胞的生长或增殖。
在另一方面，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含CDR(互补性决定区)，其包含重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR3(HCDR3)中的一个或多个或其变异体，和/或轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)中的一个或多个或其变异体，所述变异体包括人源化抗体或本发明所述的任何其它变异体，且与人EGFR保持特定的结合活性。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，IMGT编号系统所定义的HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ ID NO:1所示的HCDR1，SEQ IDNO:2所示的HCDR2，SEQ ID NO:3所示的HCDR3具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。Kabat编号系统所定义的HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ ID NO:9所示的HCDR1，SEQ ID NO:10所示的HCDR2，SEQ ID NO:11所示的HCDR3具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。Chothia编号系统所定义的HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ ID NO:14所示的HCDR1，SEQ ID NO:15所示的HCDR2，SEQ ID NO:11所示的HCDR3具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。Contact编号系统所定义的HCDR1、HCDR2和HCDR3包含分别与SEQ ID NO:16所示的HCDR1，SEQ ID NO:17所示的HCDR2，SEQ ID NO:18所示的HCDR3具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，IMGT编号系统所定义的LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别与SEQ ID NO:4所示的LCDR1，SEQ IDNO:5所示的LCDR2，SEQ ID NO:6所示的LCDR3具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。Kabat或Chothia编号系统所定义的LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别与SEQ ID NO:12所示的LCDR1，SEQ ID NO:13所示的LCDR2，SEQ ID NO:6所示的LCDR3具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。Contact编号系统所定义的LCDR1、LCDR2和LCDR3包含分别与SEQ ID NO:19所示的LCDR1，SEQ ID NO:20所示的LCDR2，SEQ ID NO:21所示的LCDR3具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，其中，所述重链可变区包含由IMGT编号系统所定义的如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2和SEQ ID NO:3所示的HCDR3，或由Kabat编号系统所定义的如SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR3，或由Chothia编号系统所定义的如SEQ ID NO:14所示的HCDR1、SEQ ID NO:15所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR3，或由Contact编号系统所定义的如SEQ ID NO:16所示的HCDR1、SEQ ID NO:17所示的HCDR2和SEQ ID NO:18所示的HCDR3中的任意一个、两个或三个；所述轻链可变区包含由IMGT编号系统所定义的如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、SEQ IDNO:5所示的LCDR2和SEQ ID NO:6所示的LCDR3，或由Kabat或Chothia编号系统所定义的如SEQ ID NO:12所示的LCDR1、SEQ ID NO:13所示的LCDR2和SEQ ID NO:6所示的LCDR3，或由Contact编号系统所定义的如SEQ ID NO:19所示的LCDR1、SEQ ID NO:20所示的LCDR2和SEQID NO:21所示的LCDR3中的任意一个、两个或三个。
在特定的实施方式中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含(1)由IMGT编号系统所确定的如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，SEQ ID NO：2所示的HCDR2，和SEQ ID NO：3所示的HCDR3，以及SEQ ID NO:4所示的LCDR1，SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和SEQ ID NO:6所示的LCDR3氨基酸序列；或(2)由Kabat编号系统所确定的如SEQ ID NO:9所示的HCDR1，SEQ IDNO：10所示的HCDR2，和SEQ ID NO：11所示的HCDR3，以及SEQ ID NO:12所示的LCDR1，SEQ IDNO:13所示的LCDR2，和SEQ ID NO:6所示的LCDR3氨基酸序列；或(3)由Chothia编号系统所确定的如SEQ ID NO:14所示的HCDR1，SEQ ID NO：15所示的HCDR2，和SEQ ID NO：11所示的HCDR3，以及SEQ ID NO:12所示的LCDR1，SEQ ID NO:13所示的LCDR2，和SEQ ID NO:6所示的LCDR3氨基酸序列；或(4)由Contact编号系统所确定的如SEQ ID NO:16所示的HCDR1，SEQID NO：17所示的HCDR2，和SEQ ID NO：18所示的HCDR3，以及SEQ ID NO:19所示的LCDR1，SEQID NO:20所示的LCDR2，和SEQ ID NO:21所示的LCDR3氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7所示的重链可变区，或与所述重链可变区具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列，且与人EGFR保持特定的结合活性。
在一些实施方式中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区，或与所述轻链可变区具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列，且与人EGFR保持特定的结合活性。
在一些实施方式中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和/或SEQ ID NO:8所示的轻链可变区，或分别与所述重链可变区和轻链可变区具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列，且与人EGFR保持特定的结合活性。
本发明使用的示例性编号系统/定义方法所确定的本发明抗体CDR区氨基酸序列汇总于表2，本发明抗体CDR区序列还可以通过任何其它对抗体氨基酸残基进行编号和定义CDR的既有方法所定义。
表2由不同编号系统定义的抗体CDR区的氨基酸序列及其ID号
此外，还可以将结合至人EGFR的其它抗EGFR抗体的重链可变区和/或轻链可变区序列(或CDR序列)与本发明的抗EGFR抗体的重链可变区和/或轻链可变区序列(或CDR序列)进行“混合和匹配”。优选地，当将重链可变区序列和轻链可变区序列(或这些链内的CDR)进行混合和匹配时，来自特定的VH/VL对的VH序列被结构相似的VH序列进行替代。同样地，优选地，来自特定的VH/VL对的VL序列被结构相似的VL序列进行替代，从而产生更多的抗EGFR抗体。
因此，在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包括：
(a)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；以及
(b)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或者，另一个抗EGFR抗体的VL，其中，该抗体特异性地结合人EGFR。
或者，本发明的抗体或其抗原结合片段包括：
(a)重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或者，另一个抗EGFR抗体的VL，其中，该抗体特异性地结合人EGFR；以及
(b)轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段还包括框架区(FrameworkRegion，FR)，所述框架区包括重链框架区和/或轻链框架区。在一些实施方式中，所述重链框架区选自小鼠或人抗体重链框架区，和/或所述轻链框架区选自小鼠或人抗体轻链框架区。在具体实施方式中，所述重链框架区选自小鼠重链框架区，以及所述轻链框架区选自小鼠轻链框架区。
在另一个实施方式中，本发明的抗体包含具有CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的重链和/或轻链可变区序列，所述序列与本发明的抗EGFR抗体的氨基酸序列相差一个或多个氨基酸残基保守修饰。本领域可理解的是，某些保守序列的修饰不会使抗体失去或降低抗原结合能力，例如，可以产生基本上不降低人EGFR结合活性的保守修饰。参见例如，Brummell等，(1993)Biochem 32：1180-8；de Wildt等，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov等，(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870；Hall等，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley和O’Connell，(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy等，(1998)Int.Immunol.10：341-6；以及Beers等，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。
因此，在一个实施方式中，抗体包含含有CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的重链可变区和/或含有CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR1序列包含SEQ ID NO:1、9、14或16所示的序列和/或其保守修饰；和/或
(b)重链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO:2、10、15或17所示的序列和/或其保守修饰；和/或
(c)重链可变区CDR3序列包含SEQ ID NO:3、11或18所示的序列及其保守修饰；和/或
(d)轻链可变区CDR1序列包含SEQ ID NO:4、12或19所示的序列及其保守修饰；和/或
(e)轻链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO:5、13或20所示的序列及其保守修饰；和/或
(f)轻链可变区CDR3序列包含SEQ ID NO:6或21所示的序列及其保守修饰；以及
(g)该抗体特异性地结合人EGFR。
上述本发明的抗体具有一种或多种如下功能特性，例如，高特异性结合至人EGFR，以及对表达EGFR的肿瘤细胞增殖具有抑制作用。
本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以用具有同一侧链族的其它氨基酸残基来进行保守氨基酸取代，并且可以使用本文所述的功能测定方法来检测经改变的抗体所保留的上述功能。
在各实施方式中，所述抗体可以是小鼠、人、人源化的或嵌合的抗体。
在另一方面，可以使用具有本发明抗EGFR抗体的一个或多个VH/VL序列抗体作为起始材料来进行工程化修饰，以制备成本发明抗体。可以通过对一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内的一个或多个氨基酸残基进行修饰来对抗体进行工程化，例如，对一个或多个CDR区和/或一个或多个框架区内的一个或多个氨基酸残基进行修饰。
在一些实施方案中，通过CDR移植来对本发明抗IL-2抗体可变区进行工程化改造。抗体主要通过重链和轻链的六个CDR的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，各个抗体之间的CDR区内的氨基酸序列比CDR区之外的序列(例如FR)更加多样化。因为CDR区的氨基酸序列负责抗体与抗原大多数的相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达重组抗体以模拟特定的天然存在抗体的特性，所述表达载体包含将来自特定的天然存在抗体的CDR序列移植到另一个具有不同特性抗体的FR序列(参见例如Riechmann等，(1998)Nature 332：323-327；Jones等，(1986)Nature 321：522-525；Queen等，(1989)Proc.Natl.Acad.U.S.A.86:10029-10033。还可参见，美国专利号:US 5,225,539；US 5,530,101；US 5,585,089；US5,693,762和US6,180,370)。
在一些实施方案中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含本发明所述的HCDR1区、HCDR2区和HCDR3区的氨基酸序列，该轻链可变区包含本发明所述的LCDR1区、LCDR2区和LCDR3区的氨基酸序列。尽管所述抗体包含本发明单克隆抗体的VH和VL的CDR区序列，但它们也可以包含不同的框架区序列。
此类框架区序列可以从DNA公共数据库或已公开的涉及种系抗体基因序列的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“VBase”人种系序列数据库中(可在互联网上从www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase处获得)；以及，Kabat等，(1991)，同前；Tomlinson等，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；及Cox等，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836；以引用的方式将其各自的内容明确地并入本文。
可以使用本领域技术人员公知的称为Gapped BLAST的序列相似性搜索方法中的一种，基于经编译的蛋白序列数据库对抗体氨基酸序列进行比较(Altschul等，(1997)，同前)。
用于本发明抗体中优选的框架序列是与本发明抗体使用的框架序列在结构上相似的(或同源性高的)受体框架区。在一些实施方案中，可以将VH或VL的CDR1区序列、CDR2区序列和CDR3区序列分别移植到受体框架区，所述的受体框架区具有与其所在种系免疫球蛋白基因相同或同源性最高的序列；或者可以将CDR序列移植到与种系序列相比包含一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现在某些情况下，使框架区内的氨基酸残基发生突变以维持或增强抗体的抗原结合能力(参见例如，美国专利号：5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在另一些实施方案中，可变区修饰是使VH和/或VL CDR1区、CDR2区和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性(例如结合活性)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且能够以本领域已知的体外或体内检测方法来评价所述突变对抗体结合能力或其它功能性质的影响。例如，引入的修饰可以是非保守修饰(如本领域已知的)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，优选氨基酸取代。特别地，CDR区内不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基发生突变。
在一个实施方式中，本发明提供了分离的抗EGFR抗体或其抗原结合片段，所述的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含：(a)VH CDR1区，其包含本发明的序列或者具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；和/或(b)VH CDR2区，其包含本发明的序列或者具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；和/或(c)VH CDR3区，其包含本发明的序列或者具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；所述轻链可变区包含：(d)VLCDR1区，其包含本发明的序列或者具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；和/或(e)VL CDR2区，其包含本发明的序列或者具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；和/或(f)VL CDR3区，其包含本发明的序列或者具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明的工程化抗体还可以包括对VH和/或VL框架区氨基酸残基进行修饰(例如，用于改善抗体的特性)的抗体。特别地，进行此类框架区氨基酸残基修饰可以降低抗体的免疫原性。例如，一种方式是将一个或多个框架区氨基酸残基“回复突变”至相应的种系序列。更具体地，体细胞突变所产生的抗体可以包含与该抗体来源的种系序列不同的框架区。
另一类型的框架区氨基酸残基修饰包含在框架区内、或者在一个或多个CDR区内有一个或多个氨基酸残基突变，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该策略也称为“脱免疫”，并在美国专利公开号20030153043中进一步详细地描述。
另外，除了对框架区或CDR区氨基酸残基进行修饰以外，还可以对本发明的抗体的Fc区进行工程化修饰，以改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，还可以对本发明的抗体进行化学修饰(例如，可以将一个或多个化学基团连接至所述抗体)，或者对其进行修饰以改变其糖基化，再次改变所述抗体的一种或多种功能特性。
在一个实施方式中，将CH1的铰链区进行修饰，以使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变(例如，增加或减少)。该方法在美国专利号5,677,425中进一步描述。例如，CH1铰链区中半胱氨酸残基的数目被改变有利于轻链和重链的组装或者提高抗体的稳定性。
此外，每种抗体都具有特有的等电点(pI)，等电点通常在pH 6和9.5之间。IgG1抗体的pI通常为pH 7-9.5，而IgG4抗体的pI通常为pH 6-8。pI值在正常范围之外的抗体在体内可能存在部分去折叠和不稳定性的情况。因此，优选得到pI值在正常范围内的抗EGFR抗体，或通过突变带电荷氨基酸残基来实现所述抗体pI值在正常范围内。
在另一方面，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段还可以包含恒定区，所述恒定区包括抗体重链恒定区和轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区。本发明的重链恒定区包括人IgG重链恒定区Fc区的天然和/或突变蛋白形式，还包括含有促进二聚体形成的铰链区的多肽截短形式。在某些实施方案中，Fc区包含抗体CH2和CH3域。包含Fc部分的融合蛋白(和由此形成的低聚物)提供了容易通过蛋白A或蛋白G柱上的亲和色谱法纯化的优点，以及延长血清半衰期。优选的Fc区来源于人IgG，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
抗体的Fc区的一个功能是在抗体结合其标靶时与免疫系统产生“效应功能”，包括产生抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。ADCC和ADCP通过Fc与免疫细胞表面上Fc受体(FcR)的结合来介导；CDC通过Fc与例如C1q等补体系统的蛋白质结合来介导。效应功能可以通过各种方法来评估，如Fc受体结合试验、C1q结合试验和细胞裂解试验。
2、筛选获得本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的方法
可以使用多种技术来筛选获得本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段，例如杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等。在一些实施方案中，本发明通过构建噬菌体展示文库并对目的抗原进行淘选(panning)，从抗体文库中筛选出识别目的抗原的抗体。可利用多种本领域已知的噬菌体展示方法来产生本发明的抗体，例如，美国专利号5,223,409、5,622,699和6,068,829公开了用于制备噬菌体文库的方法。也可根据“AntibodyPhage Display：Methods and Protocols(Philippa M.O′Brien，Robert Aitken编辑)”中所描述的方法来构建噬菌体展示文库。在一些实施方式中，可以将编码抗体可变区的核酸插入至噬菌体外壳蛋白基因中，使得噬菌体将该抗体可变区展示在其表面，同时，在噬菌体内部含有编码该抗体可变区的核酸，从而实现抗体可变区表型和基因型之间的联系。
关于抗体(或单链抗体)的筛选，在噬菌体展示中，抗体(或单链抗体)的VH和/或VL区的较大文库可在丝状噬菌体颗粒的表面上表达，由此使其配对形成结合域。可根据与目的抗原识别和结合及其所展示的结合域，从文库中筛选出噬菌体。
在一些实施方式中，可使用目的抗原免疫接种小鼠，并从小鼠成熟B细胞中扩增获得抗体可变区基因，通过噬菌体展示技术将小鼠抗体可变区展示在噬菌体表面，构建噬菌体展示文库，并通过特定靶分子(例如，用于免疫接种小鼠的目的抗原)进行淘选，检测噬菌体表面所展示的抗体可变区与所述靶分子的相互作用，通过体外选择的方法筛选并扩增抗体可变区文库，所述体外选择类似于天然选择。
在一些实施方式中，所述淘选可以通过噬菌体感染宿主细菌并在所述宿主中繁殖扩增来实现。所述宿主细菌可分泌表面展示有抗体可变区的噬菌体，而不会被噬菌体裂解。所扩增的噬菌体可按需要再次暴露至靶分子，并收集用于额外轮次的淘选。还可以进行多轮淘选直至得到选择性或特异性结合靶分子的子群体。可通过对应于噬菌体基因组中的抗体可变区基因进行测序来确定抗体可变区的氨基酸序列(Arap等，1998，Smith等，1985)。
在特定的实施方式中，本发明通过噬菌体文库的构建和淘选获得本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段，具体地，从经免疫的小鼠脾脏组织中得到抗体可变区基因，并连接在噬菌体表面结构蛋白基因III上，利用共表达方式，使之参与噬菌体组装并展示在噬菌体表面，形成噬菌体展示文库的技术。使用噬菌体展示文库，针对特定靶分子(例如，用于免疫接种小鼠的抗原)，通过多轮吸附-洗脱-扩增的重复过程，可富集能特异性结合靶分子的噬菌体，再通过基因测序技术得到相应的DNA序列信息，进而推断抗体可变区的氨基酸序列。
3、多核苷酸、载体和宿主细胞
一方面，本发明提供了一种编码抗EGFR抗体或其抗原结合片段的核酸。本发明还包括编码本文所述氨基酸序列的多核苷酸变异体。核酸可以存在于完整的细胞中、或细胞裂解物中，或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术从其它细胞成分或其它污染物(例如其它的细胞核酸或蛋白质)中纯化得到时，核酸是“分离的”或“基本上是纯的”。在优选的实施方式中，核酸是cDNA分子。
在一些实施方案中，本发明的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤表达的抗体，可以通过标准的聚合酶链反应(PCR)扩增或cDNA克隆技术获得cDNA，所述cDNA编码该杂交瘤制得的抗体的轻链和重链。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从该基因文库回收编码此类抗体的核酸。
在另一些实施方案中，对应于本发明所述的氨基酸序列、用作核酸分离的探针或引物或者数据库提供可查询的核苷酸序列可以通过氨基酸序列回译来获得。PCR程序可以用以分离和扩增编码本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的DNA序列。界定DNA片段组合的所需末端的寡核苷酸用作5'和3'引物。寡核苷酸可以另外含有限制内切核酸酶的识别位点，以促进扩增DNA片段组合插入表达载体中。PCR技术参见于Saiki等人，Science 239:487(1988)；Recombinant DNA Methodology,Wu等人编辑,Academic Press,In c.,Sa n Diego(1989),第189-196页；PCR Pro to cols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人编辑,Academic Press,Inc.(1990)。
本发明的核酸分子包括单股和双股形式DNA和RNA，以及对应的互补序列，包括分离的核酸分子，优选来源于至少一次呈基本上纯的形式分离并且数量或浓度能够通过标准生物化学法鉴别、操作和回收其组分核苷酸序列的DNA或RNA(例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1989)中所述的方法)。优选地，此类序列包括以不常存在于真核基因中的内部非翻译序列或内含子中断的开放阅读框的形式所提供和/或构建。非翻译DNA的序列可以存在于开放阅读框的5'或3'，其中所述序列不干扰编码区的操控或表达。
本发明优选的核酸分子包括编码抗EGFR抗体或其抗原结合片段VH和VL序列或CDR区的核酸分子。一旦获得编码VH和VL区的DNA片段，就可以通过标准的重组DNA技术进一步重组这些DNA片段，例如，将可变区的基因转换成全长抗体链的基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些重组中，将此编码VL或VH的DNA片段连接至编码另一蛋白(例如，抗体恒定区或柔性接头)的DNA片段。正如本发明所使用的，术语“可操作性地连接”旨在将两个DNA片段接合，从而使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在读码框内。
通过将编码VH的DNA可操作性地连接至编码重链恒定区(包括CH1、CH2和CH3)的DNA分子，可以将编码VH区的分离的DNA转换成编码全长重链的基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的，并且可以通过标准的PCR扩增技术获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD的恒定区，但是最优选是IgG1或IgG4的恒定区。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA操作性地连接至仅编码重链CH1恒定区的DNA分子。
通过将编码VL区的DNA操作性地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可以将编码VL区的分离的DNA转换成编码全长轻链的基因或Fab轻链基因。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的，并且可以通过标准的PCR扩增技术获得包含这些区域的DNA片段。在优选的实施方式中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了生成scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段操作性地连接至编码柔性接头(例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一个DNA片段，从而可以将VH和VL序列表达为连续的单链蛋白，即，VL和VH区由柔性接头连接(参见例如，Bird等，(1988)Science 242：423-426；Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等，(1990)Nature348：552-554)。
本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段通过以下步骤来制备：使用盒或PCR诱变或本领域一般技术人员已知的其它技术对编码抗EGFR抗体或其抗原结合片段的DNA中的核苷酸进行位点特异性诱变以产生编码变异体的DNA，此后在如本文中概述的细胞培养物中表达重组DNA。然而，抗EGFR抗体或其抗原结合片段可以通过使用已建立的技术体外合成来制备。
如本领域技术人员所已知的，由于遗传密码的简并，本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段由极其大量的核酸进行编码，每个部分的核酸都在本发明的范围内并且可以使用标准技术制成。因此，鉴别了特定的氨基酸序列，本领域的技术人员可以通过以不改变本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段氨基酸序列的方式来简单对其各自的编码序列进行一个或多个密码子修饰以制备许多不同的核酸。具体地说，简并密码子替代可以通过用混合碱基和/或脱氧核糖残基替代一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置而产生的序列来实现(参见Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
另一方面，本发明还提供了编码本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的核酸的表达载体。
可以将编码本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的核酸构建在合适的载体中，以导入宿主细胞进行目的蛋白的表达。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。载体中编码目标蛋白的核酸与启动子可操作地连接，即核酸表达控制序列(例如，启动子、信号序列或转录调节因子结合位点的阵列)与另一个核酸序列之间的功能性连接，并因此该控制序列控制其他核酸序列的转录和/或翻译。
合适的载体包括质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于病毒颗粒、质粒、脂质体或蛋白外壳。
另一方面，本发明还提供了包含编码本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的核酸或表达载体的宿主细胞。
该细胞可以是真核细胞，例如，哺乳动物宿主细胞，包括但不限于，SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7,ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))、幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))、猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCCCCL75)、人肝细胞(HepG 2，HB 8065)、小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TRI细胞(Mathe r等，Anna ls N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))、MRC5细胞、FS4细胞、或人肝癌细胞系(Hep G2)。
宿主细胞用上述表达或克隆载体转化，以产生抗EGFR抗体或其抗原结合片段，并在以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因为目的适当改良的常规营养培养基中进行培养。在另一些实施方式中，抗体可借由本领域已知的同源重组产生。
4、本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的制备方法
本发明提供了使用所述宿主细胞制备本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段的方法。
所述方法包括将编码本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的核酸或表达载体转染到宿主细胞中，并在培养基中培养宿主细胞一段时间以表达本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段。不受限制地，商业上可获得的培养基可以用作培养基。
优选地，表达的抗EGFR抗体或其抗原结合片段可分泌到培养宿主细胞生长的培养基中。使用标准蛋白质纯化的方法从培养基中回收抗体，例如通过离心或超滤除去杂质，或通过亲和色谱法纯化所得物；还可以使用其他纯化技术，例如凝胶电泳法、透析法、硫酸铵沉淀法、盐析法、阴离子或阳离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法和羟基磷灰石色谱法。
5、双特异性分子/多特异性分子
本发明还提供了一种双特异性分子，其包含本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段与另一个功能性分子(例如另一种诸如Fab’片段的多肽或蛋白)连接，从而形成与多个结合位点或结合(靶)表位结合的双特异性分子或多特异性分子。例如，本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种其它结合分子，例如另一种抗体、抗原结合片段、多肽或结合模拟物功能性连接，所述功能性连接包括化学耦联、基因融合、非共价缔合或其它方式)。
在一个实施方式中，所述另一个功能性分子可以是Fc受体(FcR)，例如人FcγRIII(CD16)、FcδRⅠ(CD64)或FcαR(CD89)，因此，本发明的双特异性分子或多特异性分子可以同时靶向于表达FcγR、FcαR或FcεR的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和表达EGFR的肿瘤细胞。
在一个实施方式中，所述另一个功能性分子选自对与癌症相关的抗原(TAA)或免疫检查点蛋白抗原具有特异性的抗体或其抗原结合片段，所述与癌症相关的抗原可以选自HER2、HER3、VEGF、VEGFR、c-Met、TFR(转铁蛋白受体)、IGF-1R(人胰岛素-样生长因子I受体)等；所述免疫检查点蛋白抗原可以选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD137、CD47等。
在一个实施方式中，除了上述功能性分子的结合特异性和抗EGFR结合特异性，本发明双特性分子或多特异性分子可以进一步包括第三结合特异性。第三特异性可以是抗增强因子(EF)部分，例如，所述分子可以结合至参与细胞毒活性的表面蛋白，并由此增加对靶细胞的免疫应答。所述的抗增强因子部分可以是抗体(包括scFv)，抗增强因子部分可以与FcR或靶细胞抗原结合。此外，抗增强因子部分结合的靶细胞可以不同于第一和第二结合特异性分子所结合的靶细胞，例如，抗增强因子部分可以与细胞毒T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4或ICAM-1)或其它对靶细胞产生增强的免疫应答的免疫细胞结合。
在本文中，所使用的术语“靶细胞”是指本发明分子(例如抗EGFR抗体或其抗原结合片段、双特异性分子或多特异性分子)靶向于受试者体内任何不良的细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是过表达EGFR的细胞，过表达EGFR的细胞一般包括肿瘤细胞(例如，膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、头颈癌等)。其它过表达EGFR的细胞还可以包括分别在关节炎和牛皮癣治疗中作为靶细胞的滑膜成纤维细胞和角质形成细胞。
本发明的双特异性分子可以具有许多不同的形式。例如，双特异性分子保留了传统的抗体形式，不同的是，它不具有相同特异性的两个结合臂，而是具有不同特异性的两个结合臂，每个结合臂可以是由通过肽链连接的两个单链抗体片段(scFv)组成，以构建为双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)2结构。双特异性分子还可以包括通过肽基接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其它形式的双特异性分子可以通过基因工程、体细胞杂交或化学合成的方法制备得到。参见例如，Kufer等，同前；Cao和Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6)，635-644(1998)；以及van Spriel等，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)，及其引用的参考文献。
6、免疫缀合物、嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒
一方面，本发明提供了一种包含本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物，其包含与治疗剂或可检测标记物(例如，放射性同位素、发光标记物、荧光标记物或酶底物标记物)偶联的本发明的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段可与治疗剂缀合形成免疫缀合物，例如抗体-药物偶联物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒素(包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、MMAE、MMAF、DM1、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌、米托蒽醌、米特拉霉素、放线菌素D、1-脱氢蛋白甾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔)、烷基化试剂(例如，三氯甲烷、氯丁硫脲、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、丁磺酰亚胺、二溴硝基苯、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶去甲肼)、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、微管蛋白粘合剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素(如放线菌素、博来霉素、米特拉霉素和蒽霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(如长春新碱、长春花碱)。可以如美国专利号7,087,600、6,989,452和7,129,261；PCT公开文本WO02/096910、WO 07/038,658、WO 07/051,081、WO 07/059,404、WO 08/083,312和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317、20060004081和20060247295所述的方法制备ADC，以引用的方式将其公开内容并入本文。
在一些实施方案中，本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段可以与放射性同位素(例如，123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、2 12Bi和32P、其他镧系元素)偶联形成治疗EGFR相关疾病或病症的细胞毒放射性药物。
在一些实施方案中，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段可以与荧光标记物(例如，荧光素、罗丹明、丹西尔、藻红蛋白或德州红)、或酶底物标记物(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、或发光标记物(例如地高辛素、生物素/亲和素)偶联，以检测待测样品中的EGFR表达水平。
另一方面，本发明还提供了包含本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒。
7、药物组合物
本发明提供了药物组合物，该组合物包含本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段(或免疫缀合物、或双特异分子/多特异分子、或嵌合抗原受体、或工程化T细胞受体、或溶瘤病毒)，以及药学上可接受的载体。
在本文中，所使用的术语“药学上可接受的”是指当含有活性成分的组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的分子(例如，单抗、双特异性分子/多特异性分子、免疫缀合物)相容，即能与其混合而通常情况下不会大幅度降低组合物的效果。
所述药物组合物可以包含任选药物可接受的赋形剂或稳定剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂或其组合。在如下中教导了选择和使用合适的赋形剂，Gennaro编著，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Lippincott Williams&Wilkins 2003)，以引用的方式将其公开内容并入本文。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致的疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给药(例如，通过注射或输注)。鉴于不同的给药途径，可以将活性成分包被在材料中以保护其免受酸和可能使其失活的其它自然条件的作用。如本发明所使用的，术语“肠胃外给药”是非肠内和局部的给药方式，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径(例如，局部、表皮或粘膜给予途径)给药，例如，鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给药。
药物组合物可以是无菌水性溶液或分散剂。所述药物组合物也能够配制为溶液、微乳液、脂质体、或其它适合高药物浓度的有序结构的组合形式。
可以与载体材料组合以形成单一剂型的活性成分的量是依据受试者和特定的给药方式所确定的，并且通常也是能够产生治疗效果的组合物的量。通常，与药学上可接受的载体形成的组合物包含约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％、最优选约1％至约30％的活性成分。
调整剂量方案以提供最佳的预期反应(例如治疗反应)。例如，可以单个剂量一次性给药，可以随时间给予多次分开剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。为了给药方便和达到剂量统一，以剂量单位形式配制肠胃外给药的组合物是非常有好处的。如本发明所使用的，剂量单位形式是指生理区分的单位，其适合作为治疗受试者的单位剂量；每个单位剂量包含预定量的活性成分，所述活性成分的预定量是通过计算活性成分与所需的药物载体一起施用产生预期治疗效果而得到的。另外，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段也可以作为缓释制剂给药，这样可减少给药频率。
本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段，或包含抗EGFR抗体或其抗原结合片段的组合物给药剂量的范围可为约0.0001mg/kg至100mg/kg体重，通常为0.01mg/kg至50mg/kg体重。
本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段、或双特异分子/多特异分子、或免疫缀合物、或嵌合抗原受体、或工程化T细胞受体、或溶瘤病毒的“治疗有效剂量”优选可使得疾病症状严重性降低、疾病症状无进展期的频率和持续时间增加、或预防由疾病困扰所造成的机体损伤或失能。例如，相对于未经治疗的受试者，荷瘤受试者的“治疗有效剂量”优选抑制肿瘤生长至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、还可以更优选至少约80％。治疗性抗体的治疗有效量可以减少肿瘤的大小、或改善受试者的症状，所述受试者通常是人或其它哺乳动物。“治疗有效剂量”还可以根据各种因素和情况来确定，所述的各种因素包括但不限于配制方法、给药方法、年龄、体重、患者的性别、身体或病理状况、饮食、给药时间、给药间隔、给药途径、排泄率、反应敏感性和过往疾病史等。本领域中的一种常规方法包括根据目标病灶大小、受试者症状的严重程度和特定的组合物或选择的给药途径等因素，来判断所述的治疗有效量。
药物组合物可以选择控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson编著，Marcel Dekker,Inc.，纽约，1978。
可以通过如下的医疗装置来传输治疗性药物组合物，所述医疗装置选自：(1)无针皮下注射装置(例如，美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824和4,596,556)；(2)微型输注泵，例如，美国专利4,487,603公开了以控制速率来分散药物的可植入微量滴注泵；(3)透皮装置(美国专利号4,486,194)；(4)输注设备，例如，美国专利号4,447,233公开了以精确滴注速率运送药物的药物输注泵，美国专利4,447,224公开了可变流量的且能连续运送药物的可植入滴注泵；以及(5)渗透装置，例如美国专利号4,439,196公开了一种具有多室容器的渗透性药物运输系统；美国专利4,475,196公开了怡红渗透性药物运输系统，均以引用的方式将其公开内容并入本文。
在某些实施方式中，可以配制本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段以确保在体内适宜的生物分布。例如，为了确保本发明的治疗性抗体能够穿过血脑屏障(BBB)(如有需要的话)，可以将其配制成脂质体，所述脂质体可以包括一个或多个选择性运送到特定细胞或器官组织的靶向部分，以增强靶向性药物的选择性运送。参见例如，美国专利号4,522,811、5,374,548、5,416,016和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman等，(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais等，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoe等，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier等，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen和Laukkanen，(1994)FEBS Lett.346：123；以及Killion和Fidler，(1994)Immunomethods 4：273。
8、药盒/组合产品、试剂盒
一方面，本发明提供了一种药盒，其包含本发明抗EGFR抗体或抗原结合片段的药物组合物，与一种或多种其它治疗剂。
在一些实施方案中，所述治疗剂包括化学治疗剂，包括但不限于长春花生物碱、微管形成破坏剂(如秋水仙碱和其衍生物)、抗血管生成剂、治疗性抗体、EGFR靶向剂、酪氨酸激酶靶向剂(如酪氨酸激酶抑制剂)、过渡金属络合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物(如核苷类似物)、烷基化剂、铂类试剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯、类视黄醇(如全反式视黄酸或其衍生物)、格尔德霉素或其衍生物(如17-AAG)以及本领域中公认的其它标准化学治疗剂。在一些具体实施方式中，所述化学治疗剂包含以下一种或多种，例如，阿霉素、秋水仙碱、环磷酰胺、放线菌素、博莱霉素、柔红霉素、表阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、甲基-CCNU、顺铂、依托泊苷、干扰素、喜树碱和其衍生物、胆甾醇对苯乙酸氮芥、紫杉烷和其衍生物(例如，紫杉醇、太平洋紫杉醇和其衍生物、多西紫杉醇(taxotere)和其衍生物等)、拓扑替康、长春碱、长春新碱、他莫昔芬、哌泊舒凡、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康、HKP、奥他赛、吉西他滨、奥沙利铂、长春瑞滨、/>卡培他滨、/>拉帕替尼、索拉非尼、埃罗替尼、本领域中已知的化学治疗剂等。在一些实施例中，化学治疗剂是包括含硫代秋水仙碱衍生物和载体蛋白(如白蛋白)的纳米颗粒的组合物。
在一些实施方式中，化学治疗剂是抗癌剂，所述抗癌剂包括但不限于微管破坏物、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素治疗物、激酶抑制剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于EGFR抑制剂、HER2抑制剂、HER3抑制剂、IGFR抑制剂和Met抑制剂)、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡的激活剂(包括但不限于IAP抑制剂、Bcl2抑制剂、MC11抑制剂、TRAIL抑制剂、CHK抑制剂)、或任何抗血管生成的药物；
在一些实施方案中，所述治疗剂包括免疫调节剂，包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、CTLA-4、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR抑制剂。
在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，例如可用于分离或检测待测样品中EGFR水平，所述试剂盒包括本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段，或包括本发明药物组合物，或本发明抗体或其抗原结合片段与可检测标记物构成的免疫缀合物。
在本文中，所使用的术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。
为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段与检测标记物构成的免疫缀合物之外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA或western印记试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均包含在本发明中的，只要其利用了本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段作为识别或结合EGFR的试剂。
在所述试剂盒中还可包含容器以及在容器上或与该容器相关联的标签或使用说明书。例如，所述容器含有包含至少一种本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段的内容物，可包括含有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体的另外的容器。所述标签或使用说明书可提供关于所述组合物的描述以及预期的体外或诊断应用方面的指导，例如，所述标签可指示试剂盒内容物的预期用途，可提供在试剂盒外包装上或与试剂盒一起提供，或是以其它方式随试剂盒提供的任何文字、销售材料或记录材料；所述使用说明书可提供例如诊断关于EGFR上调和/或EGFR相关的疾病或病症。
在获得了本发明提供的抗EGFR抗体或其抗原结合片段和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测待测样品中EGFR或其含量，从而得知待测样品的供体是否存在EGFR过表达的相关疾病或病症。
9、治疗用途和方法
一方面，本发明涉及本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段在用于制备治疗和/或预防EGFR相关疾病或病症的药物组合物或制剂、制备用于诊断EGFR相关疾病或病症的诊断试剂中的用途，所述疾病或病症包括癌症或其它EGFR相关疾病。
在一些实施方案中，所述癌症包括但不限于黑色素瘤、肺癌(非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌或肾细胞癌、肝癌、食道癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌、头颈癌、胶质母细胞癌、皮肤癌及其它实体和/或转移性癌症。
在一些实施方案中，其它EGFR相关疾病包括但不限于自身免疫疾病、牛皮癣、或炎症性关节炎(例如，类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮相关的关节炎、牛皮癣关节炎)。
在一些实施方案中，其它EGFR相关疾病还包括细胞增殖性疾病，所述细胞增殖性疾病除了癌症之外还包括：肾上腺皮质增生(库欣病)、先天性肾上腺皮质增生、子宫内膜增生、良性前列腺增生、乳腺增生、内膜增生、局灶性上皮增生(Heck氏病)、皮脂腺增生、代偿性肝增生以及任何其它细胞增殖性疾病。
另一个方面，本发明提供了治疗或预防EGFR相关疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段、药物组合物或药盒，所述疾病或病症包括癌症或其它EGFR相关疾病。
在一些实施方案中，所述癌症包括但不限于黑色素瘤、肺癌(非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌或肾细胞癌、肝癌、食道癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌、头颈癌、胶质母细胞癌、皮肤癌及其它实体和/或转移性癌症。
在一些实施方案中，其它EGFR相关疾病包括但不限于自身免疫疾病、牛皮癣、或炎症性关节炎(例如，类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮相关的关节炎、牛皮癣关节炎)。
在一些实施方案中，其它EGFR相关疾病包括细胞增殖性疾病，所述细胞增殖性疾病除了癌症之外还包括：肾上腺皮质增生(库欣病)、先天性肾上腺皮质增生、子宫内膜增生、良性前列腺增生、乳腺增生、内膜增生、局灶性上皮增生(Heck氏病)、皮脂腺增生、代偿性肝增生以及任何其它细胞增殖性疾病。
在一些实施方案中，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段、药物组合物或药盒可以单独施用，或与一种或多种其它治疗剂或治疗手段联合施用。
在一些实施方式中，所述的其它治疗剂包括本发明公开的化学治疗剂、抗癌剂、免疫调节剂或本领域公知的治疗剂。
在一些实施方式中，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段、药物组合物或药盒可以与一种或多种其它治疗剂同时施用，也可以与另外的治疗剂分开施用，例如在另外治疗剂之前或之后施用本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段、药物组合物或药盒，所述另外的治疗剂可以与本发明抗EGFR抗体或抗原结合片段、药物组合物或药盒具有相同的给药途径，也可以是不同的给药途径。
在一些实施方式中，本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段、药物组合物或药盒可以与其它治疗手段联合施用，所述其它治疗手段包括但不限于外科手术、化学疗法、细胞毒性剂、光动力疗法、免疫调节或放射疗法。
另一个方面，本发明提供了一种调节EGFR过表达细胞中EGFR活性的方法，所述方法包括使用本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段、或药物组合物、或药盒在体内或体外引发一种或多种如下生物学活性，例如，抑制表达EGFR细胞中EGF或TGF-α诱导的自磷酸化；抑制自分泌EGF或TGF-α所诱导表达的EGFR细胞的激活；或抑制表达EGFR细胞的生长或增殖。在一些实施方案中，所述方法是抑制EGFR过表达细胞的生长或增殖，其包括将本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段、或药物组合物，或药盒处理所述细胞，所述细胞包括但不限于本发明所述的肿瘤细胞。
另一个方面，本发明提供了一种检测待测样品中EGFR的含量或表达水平的方法，其包括：(1)使用本发明试剂盒检测待测样品中EGFR的含量或表达水平(定量或定性的)；或将待测样品与本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段接触，并测定待测样品中的EGFR含量或表达水平(定量或定性的)；(2)将样品中EGFR的含量或表达水平与对照样品(例如，与待测样品来源于相同组织的正常细胞，或与此正常细胞的EGFR表达水平相当的细胞)的EGFR的含量或表达水平进行比较，其中与对照样品相比待测样品表达更高水平的EGFR则可判断为存在与EGFR相关的疾病或病症。
另一个方面，本发明提供了一种在受试者中检测、诊断或监测EGFR相关疾病或病症的方法，所述方法包括：(1)使用本发明试剂盒检测从受试者获得的待测样本中EGFR的含量或表达水平(定量或定性的)，或将从受试者获得的待测样本与本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段接触，检测待测样本中EGFR的含量或表达水平(定量或定性的)；(2)将待测样本中EGFR的含量或表达水平与对照样品(例如，与待测样本来源于相同组织的正常细胞，或与此正常细胞的EGFR表达水平相当的细胞)的EGFR的含量或表达水平进行比较，其中与对照样品相比待测样本表达更高水平的EGFR则可判断为受试者患有与EGFR相关的疾病或病症，或者受试者所患有与EGFR相关疾病或病症的状况。
10、技术效果
本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段可与人EGFR特异性结合，且与其它人ErbB受体酪氨酸激酶(例如HER2、HER3、HER4)不发生交叉反应。本发明提供的抗EGFR抗体或其抗原结合片段对表达EGFR的肿瘤细胞增殖活性具有抑制作用，表明本发明的抗EGFR抗体或其抗原结合片段能够阻断EGFR介导的信号传导通路，从而表现出抑制肿瘤细胞生长的活性，但本发明提供的抗EGFR抗体或其抗原结合片段结合人EGFR的能力和/或抑制表达EGFR肿瘤细胞增殖的能力低于西妥昔单抗，表明当本发明抗EGFR抗体或其抗原结合片段应用到人体内时，可以降低其皮肤毒性，扩大治疗窗口。
综上，本发明提供的抗EGFR抗体或其抗原结合片段可作为治疗性抗体的候选者，也适合用于开发为双特异性分子或多特异性分子，可降低其皮肤毒性，扩大治疗窗口。
通过以下的实施例进一步阐释了本发明，其不应被解释为进一步限制。本申请全文中引用的所有附图和所有参考文献、专利和专利申请的内容以引用的方式明确地并入本文。
实施例
实施例1使用噬菌体展示技术筛选、制备小鼠抗EGFR单克隆抗体
1、免疫小鼠
使用自制的C-末端具有his标签的人EGFR胞外域蛋白全长(即hEGFR/ECD-his)作为免疫原，选择三只6～8周龄BALB/c雌性健康小鼠(购自上海吉辉实验动物饲养有限公司)进行免疫接种。按照表3所示的免疫流程对小鼠进行免疫，具体的免疫方法如下：
第一次免疫：在免疫前4天对Balb/c小鼠进行采血。第0天，将免疫原与完全弗氏佐剂充分混合乳化后，对Balb/c小鼠进行多点皮下注射，每只小鼠接种抗原量约20μg。
第二次免疫：第14天，将免疫原与完全弗氏佐剂充分混合乳化后，对Balb/c小鼠进行多点皮下注射，每只小鼠接种抗原量约20μg。
第三次免疫：第28天，将免疫原与完全弗氏佐剂充分混合乳化后，对Balb/c小鼠进行多点皮下注射，每只小鼠接种抗原量约20μg。并在第35天时对小鼠进行尾静脉采血，包被抗原进行常规的间接ELISA检测血清抗体滴度。
间接ELISA法的步骤如下：
(1)包被：将自制抗原hEGFR/ECD-his用包被液PBS稀释为1μg/ml包被96孔酶标板(100μl/孔)，4℃孵育过夜；
(2)封闭：弃去包被液，用PBST(含有浓度为0.05％的Tween 20)洗板1次，加入封闭液1％BSA(150μl/孔)，37℃孵育1小时；
(3)洗板：弃去封闭液，PBST洗板；
(4)血清样品孵育：按照体积比为1:10000,1:20000,1:40000,1:80000,1:160000,1:320000,1:640000,1:1280000比例用封闭液稀释免疫小鼠血清,并以100μl/孔加入到96孔板中，37℃孵育1小时；
(5)酶标抗体孵育：弃上清，用PBST洗板，加入用1％BSA所稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Jackson),100μl/孔，室温孵育1小时；
(6)显色：弃上清，用PBST洗板，加底物TMB，室温避光后加入2M盐酸终止；
(7)比色测量：使用酶标仪测定，在450nm处检测抗原抗体结合OD值。
根据血清滴度，第40天左右进行加强免疫，将20μg免疫原对每只Balb/c小鼠进行腹腔注射。
完成上述小鼠免疫后，小鼠尾静脉取血，按照1:10000,1:20000,1:40000,1:80000,1:160000,1:320000,1:640000,1:1280000比例稀释免疫小鼠血清，并使用抗原蛋白进行常规的间接ELISA检测血清抗体滴度，选取血清效价达到1:1280000或更优的血清效价小鼠，准备后续实验。
脾细胞的制备：在最后一次免疫后的第4天，根据标准动物方案，在无菌条件下采集免疫小鼠，碾碎，直至没有组织结块且细胞均匀为止，以获得单细胞悬液，计数备用。
表3 Balb/c小鼠的免疫流程
流程名称 时间 免疫剂量/途径
免疫前采血 T＝-4天
第一次免疫 T＝0天 20μg/每只，s.c.
第二次免疫 T＝14天 20μg/每只，s.c.
第三次免疫 T＝28天 20μg/每只，s.c.
采血检测 T＝35天
加强免疫 T＝40±2天 20μg/每只，i.p.
取脾脏 T＝终免+4天
2、构建抗EGFR的噬菌体抗体展示文库
从免疫小鼠脾脏细胞中提取RNA，利用逆转录PCR(RT-PCR)得到全套抗体的轻、重链可变区cDNA，根据抗体轻、重链可变区两端的保守序列涉及特异性引物，分别使用重链可变区(VH)引物和轻链可变区(VL)引物扩增VH和VL，并在设计引物时分别在VH的下游引物序列和VL的上游引物序列引入引物连接子(linker)序列(连接子的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS)，将VH和VL通过重叠延伸SOE-PCR技术将VH和VL基因片段拼接扩增，以得到单链抗体(scFv)基因片段。
以SfiⅠ酶切scFv基因片段并纯化，将所述基因片段连接到pSEX81噬菌粒载体上，并将其通过电转化仪转化到宿主大肠杆菌TG1感受态细胞中，再通过M13KO7辅助噬菌体超染，使宿主大肠杆菌生产含有ScFv的噬菌体，经离心沉淀、过滤上清液后得到噬菌体展示的scFv文库。
3、淘选与EGFR特异性结合的噬菌体抗体
将所得到scFv文库加入到抗原hEGFR/ECD-his包被的免疫管中，于4℃下静置孵育过夜，经封闭、清洗、洗脱后，用1M Tris(pH8.0)中和，并侵染染处于对数生长期的TG1大肠杆菌细胞，经培养后收集菌体细胞，并加入M13KO7辅助噬菌体进行感染，重复3-5轮“吸附-洗脱-扩增”的淘选，富集得到抗人EGFR噬菌体展示抗体文库，挑取单菌落扩大培养，并进行菌液PCR鉴定和单克隆phage-ELISA鉴定后进行基因测序，得到能与所述抗原特异性结合的scFv，其VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4、制备抗EGFR抗体的方法
将上述步骤获得的scFv的VH和VL分别克隆到人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:22所示)和人κ轻链恒定区(SEQ ID NO:23所示)，即将含有编码VH和人IgG1重链恒定区的核苷酸序列以及含有编码VL和人κ轻链恒定区的核苷酸序列分别构建为重链表达载体和轻链表达载体，并将重链表达载体和轻链表达载体按1∶1进行混合，瞬时转染至处于对数生长期的Expi-CHOS细胞中，并置于32℃中培养10天。收集细胞上清液，离心沉淀细胞，过滤，并通过Protein A亲和层析纯化抗体，并将此抗体命名为mouse anibody1129(简写为mAb1129)。
实施例2 ELISA检测抗EGFR抗体与抗原hEGFR/ECD-his的结合活性
ELISA检测方法如下：
(1)包被：用1×PBS缓冲液稀释hEGFR/EDC-his抗原至1μg/ml，并以100μl/孔加入到96孔酶标板中，4℃孵育过夜；
(2)封闭：弃去包被液，用PBST缓冲液(含有0.1％Tween20)洗板，每孔加入150μl封闭液(含有1％BSA(Sigma)的PBST)，37℃孵育1小时；
(3)洗板：弃去封闭液，PBST洗板；
(4)孵一抗：每孔加入100μl含有梯度稀释后不同浓度(即用含有1％BSA的PBST缓冲液进行3倍梯度稀释，以1μg/mL作为起始浓度，稀释至最低浓度约为0.0004μg/mL)的待测样品，包括实施例1制备得到的小鼠抗EGFR抗体和对照抗体西妥昔单抗，37℃孵育1小时；
(5)洗涤：PBST缓冲液洗板；
(6)孵二抗：每孔加入100μl以1∶10000稀释于封闭液中的anti-hIgG Fc-HRP(Jackson)，室温孵育1小时；
(7)显色：弃上清，用PBST缓冲液洗板，每孔加入100μL TMB显色液，室温避光孵育3-10分钟；
(8)终止：每孔加入50μL 2M盐酸终止液；
(9)读数测量：将96孔酶标板置于酶标仪中检测，并在450nm处读取OD值。
检测结果如图1和表4所示，抗EGFR抗体mAb1129与抗原hEGFR的结合活性EC50值约为0.01993μg/mL，略低于西妥昔单抗的EC50值。
表4 ELISA检测抗EGFR抗体与抗原hEGFR/ECD-his的结合活性
实施例3 ELISA检测抗EGFR抗体与同家族其它人ErbB受体酪氨酸激酶的交叉反应活性
按照实施例2所述方法分别检测抗EGFR抗体mAb1129与同家族其它人ErbB受体家族成员(包括HER2、HER3和HER4)的交叉反应活性，其中抗EGFR抗体和对照抗体的起始浓度为2μg/mL，并进行3倍梯度浓度稀释；ELISA检测mAb1129与HER2交叉反应所使用的对照抗体是Herceptin，与HER3交叉反应的对照抗体是Patritumab，与HER4交叉反应的对照抗体是与HER4具有强交叉反应的抗EGFR抗体mAb1130(自制)。
检测结果如图2所示，抗EGFR抗体mAb1129均不与HER2(图2A)、HER3(图2B)和HER4(图2C)具有交叉反应活性(或不结合)。
实施例4抗EGFR抗体生物学活性检测
使用A431细胞株(ATCC)检测抗EGFR抗体的生物学活性，检测方法如下：
(1)用胰酶消化、充分吹打并收集处于对数生长期的A431细胞，离心去除上清；
(2)用含有1％FBS的DMEM培养基将细胞沉淀重悬至1.25×105/mL，并将细胞悬液以80μL每孔接种到96孔细胞培养板中；
(3)用含有1％FBS的DMEM培养基将待测样品，包括抗EGFR抗体mAb1129以及对照组样品西妥昔单抗和mAb1127(自制)稀释至500μg/mL，并作1∶3梯度稀释；
(4)将稀释好的待测样品以20μL每孔加入到含有细胞的96孔细胞培养板中，并轻拍混匀，待测样品起始终浓度为100μg/mL；
(5)将细胞培养培养板置于37℃，5％CO2孵箱中静置培养4天；
(6)待细胞培养结束后，每孔加入2.0(南京诺唯赞，货号DD1101-02)细胞活力检测试剂，通过测定ATP量来对活细胞进行定量以检测细胞增殖活性；
(7)将细胞培养板置于酶标仪中，读取各孔化学发光值。
检测结果如图3和表5所示，抗EGFR抗体mAb1129能抑制A431细胞的增殖，但其IC50值高于对照抗体西妥昔单抗，表明抗EGFR抗体mAb1129对A431细胞增殖的抑制作用低于西妥昔单抗。
表5抗EGFR抗体抑制A431细胞增殖的检测
实施例5竞争性ELISA法检测抗EGFR抗体表位
使用竞争性ELISA法检测抗EGFR抗体mAb1129与其它自制的抗EGFR抗体的表位，方法如下：
(1)包被：用1×PBS缓冲液稀释hEGFR/EDC-his抗原至1μg/ml，并以100μl/孔加入到96孔酶标板中，4℃孵育过夜；
(2)封闭：弃去包被液，用PBST缓冲液(含有0.1％Tween20)洗板，每孔加入150μl封闭液(含有1％BSA(Sigma)的PBST)，37℃孵育1小时；
(3)洗板：弃去封闭液，PBST洗板；
(4)孵一抗：每孔加入100μl含有梯度稀释后不同浓度(即用含有1％BSA的PBST缓冲液进行3倍梯度稀释，以50μg/mL作为起始浓度，稀释至最低浓度约为0.068μg/mL)的待测样品，包括实施例1制备得到的小鼠抗EGFR抗体，37℃孵育1小时；再加入0.5μg/mL Biotin标记的自制的抗EGFR抗体mAb1126、mAb1128或mAb1127，以及本发明抗体mAb1129，混匀后37℃继续孵育1小时；
(5)洗涤：PBST缓冲液洗板；
(6)孵二抗：每孔加入100μl以1∶10000稀释于封闭液中的SA-HRP(Jackson)，室温孵育1小时；
(7)显色：弃上清，用PBST缓冲液洗板，每孔加入100μL TMB显色液，室温避光孵育3-10分钟；
(8)终止：每孔加入50μL，2M盐酸终止液；
(9)读数测量：将96孔酶标板置于酶标仪中检测，并在450nm处读取OD值。
检测结果如图4所示，本发明抗EGFR抗体mAb1129不与其它任何一株自制的抗EGFR抗体竞争，表明mAb1129与其它自制的抗EGFR抗体的表位不一致。
实施例6抗EGFR抗体与抗原hEGFR/ECD-his的结合动力学检测
通过分子相互作用仪(ForteBio,型号Qke)对实施例1筛选得到的抗EGFR抗体与抗原hEGFR/EGFR-his的结合动力学进行检测，具体方法如下：
1)用1×PBS溶液将待检测抗体稀释至3μg/mL，并以200mL每孔加入96孔黑板内；
2)用1×PBS溶液将人EGFR蛋白稀释至20μg/mL，并作1∶2梯度稀释后，以200mL每孔加入同一个96孔黑板内；
3)将盛有待测样品的96孔黑板和Protein A检测探针放置于机器内；
4)设置程序，使Protein A探针结合待测抗体至信号达1.5nm，随后进行与人EGFR的结合、解离检测，时间分别为300s和300s；
5)每一循环完毕后设置将探针浸没于10mM甘氨酸缓冲液(pH 1.5)中使探针再生，并开始下一循环检测；
6)待检测完毕后使用分析软件对相应抗体与抗原之间的结合常数和解离常数进行拟合计算，并得到亲和力常数数值。
检测结果如表6所示，抗EGFR抗体mAb1129能以高亲和力与hEGFR胞外域结构蛋白结合，其结合亲和力KD值约为2.03×10-9M。
表6抗EGFR抗体与抗原结合动力学分析结果
(Full R2表示拟合曲线与实测曲线的相似度)
尽管本发明已通过一个或多个实施方式来描述，但是应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，并且本发明说明书旨在涵盖落在所附权利要求的精神和宽范围内的所有替代、修改和变动。本发明所引用的所有参考文献均通过引用整体的方式并入本发明中。

Claims (16)

1.一种抗人表皮细胞生长因子（EGFR）抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述的重链可变区具有CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述的轻链可变区具有CDR1区、CDR2区和CDR3区，
当由IMGT编号系统定义时，所述重链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：1、2和3所示，所述轻链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区氨基酸序列分别如SEQ ID NOs: 4、5和6所示；或
当由Kabat编号系统定义时，所述重链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：9、10和11所示，所述轻链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区氨基酸序列分别如SEQ ID NOs: 12、13和6所示；或
当由Chothia编号系统定义时，所述重链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：14、15和11所示，所述轻链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区氨基酸序列分别如SEQ ID NOs: 12、13和6所示；或
当由Contact编号系统定义时，所述重链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区氨基酸序列分别如SEQ ID NOs：16、17和18所示，所述轻链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区氨基酸序列分别如SEQ ID NOs: 19、20和21所示。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NOs: 7和8所示。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，进一步包含免疫球蛋白恒定区，所述免疫球蛋白恒定区是人IgG的恒定区。
4.如权利要求1或2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其具有以下一个或多个特征，
（1）特异性结合至人EGFR胞外结构域ECD，通过ELISA检测其EC50值不超过1nM；
（2）与其它人ErbB受体酪氨酸激酶不具有交叉反应活性，所述其它人ErbB受体酪氨酸激酶包括HER2、HER3和/或HER4；
（3）对表达EGFR的肿瘤细胞增殖活性具有抑制作用，通过ELISA检测所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段对肿瘤细胞的IC50值不超过5nM；
（4）与人EGFR胞外结构域ECD结合亲和力常数KD数值不超过1×10-8M。
5.如权利要求1或2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是小鼠、嵌合或人源化抗体。
6.一种核酸，其编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
7.一种表达权利要求6所述核酸的表达载体。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的表达载体。
9.一种使用权利要求8所述的宿主细胞制备权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含以下步骤（1）在所述的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段，和（2）从所述的宿主细胞或细胞培养物中分离所述的抗体或其抗原结合片段。
10.一种免疫缀合物，其特征在于，其包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和可检测标记物，所述的可检测标记物包括放射性同位素、发光标记物、荧光标记物或酶底物标记。
11.一种药物组合物，其包括权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。
12.一种药盒，其包含权利要求11所述的药物组合物，与一种或多种其它治疗剂，所述治疗剂选自化学治疗剂、抗癌剂、免疫调节剂。
13.一种试剂盒，其包括权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求10所述的免疫缀合物，或权利要求11所述的药物组合物。
14.一种如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在用于制备治疗EGFR相关的疾病或病症的药物组合物或制剂中的用途，所述疾病或病症是癌症，所述癌症是黑色素瘤、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌或肾细胞癌、肝癌、食道癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌、头颈癌、胶质母细胞癌或皮肤癌。
15.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测待测样品中EGFR含量或表达水平的试剂盒中的用途。
16.一种如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断EGFR相关疾病或病症的诊断试剂中的用途，其中，所述EGFR相关疾病或病症是实体癌症，所述实体癌症是黑色素瘤、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌或肾细胞癌、肝癌、食道癌、胆囊癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌、头颈癌、胶质母细胞癌或皮肤癌。
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