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CN116284419A - 靶向人gucy2c蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

靶向人gucy2c蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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CN116284419A
CN116284419A CN202310122249.9A CN202310122249A CN116284419A CN 116284419 A CN116284419 A CN 116284419A CN 202310122249 A CN202310122249 A CN 202310122249A CN 116284419 A CN116284419 A CN 116284419A
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Abstract

本发明公开了一种靶向人GUCY2C蛋白的单克隆抗体及其应用；该单克隆抗体包括四组重链可变区和四组轻链可变区，且四组重链可变区氨基酸序列可分别与四组轻链可变区氨基酸序列组合双链使用。该单克隆抗体可以特异性识别人GUCY2C抗原，并且在人正常组织特异性良好，仅结合GUCY2C阳性组织，对其他组织器官不识别，无脱靶风险；同时，该单克隆抗体对天然构型状态及重组构型状态均具有良好的靶向性，具有良好的抗体药、多抗药及重组抗体蛋白应用前景能。

Description

靶向人GUCY2C蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域，特别是涉及一种靶向人GUCY2C蛋白的单克隆抗体及其应用，如，在生物材料及生物制剂中的应用。
背景技术
鸟苷酸环化酶C(guanylyl cyclase C,GUCY2C)是属于受体鸟苷酸环化酶家族的一种跨膜蛋白，被大肠杆菌热稳定肠毒素(STa)、鸟苷素和尿鸟苷素激活后，将胞外信息传送至胞内，参与调节肠道功能。GUCY2C表达于原发性结直肠癌细胞中，在转移性结直肠癌细胞中GUCY2C的表达是正常肠上皮细胞的2～10倍，另外在有结肠癌转移的淋巴结和肝脏组织中也均有表达。此外，GUCY2C在胰腺癌、胃癌和食道癌中(占比达到60％)也有表达，以上信息表明GUCY2C可以作为这些疾病的靶标。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，本发明所要解决的问题是提供一种靶向人GUCY2CCAR的单克隆抗体及其应用，也可以说是特异性抗体，该抗体特异性可以识别GUCY2C。
本发明的技术方案如下：
一种靶向人GUCY2C CAR的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区；其中，所述重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别选自如下任意一组：
第1组：所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列为GFTFSTYA，所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列为ISSGGST，所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列为TRGADY；所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列为QSLLYSSNQMNY，所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列为WAS，所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列为QQYSSYPLT；或
第2组：所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列为GYRFTSSW，所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列为IHPDRGII，所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列为ARWGQLGLRYAMDY；所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列为ESVDKYGISF，所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列为DAS，所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列为QQSKEVPLT；或
第3组：所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列为GFSLTSFG，所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列为IWSGGRK，所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列为VRHGTRPYWYFEV；所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列为QDISNY，所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列为YTS，所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列为QQGNSLPWT；或
第4组：所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列为GYTFTSYW，所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列为IYPGDGDT，所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列为AREDGYYDY；所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列为QSLLDSDGKTY，所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列为LVS，所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列为WQGTHFPQT。
上述单克隆抗体中，重链可变区和轻链可变区的各自对应氨基酸序列分别如下：
第1组中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或
第2组中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或
第3组中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或
第4组中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明还提供含有上述单克隆抗体的核酸分子以及含有该核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系等生物制剂，或者含有单克隆抗体的生物制剂；其中，重组载体还包括基因重组表达载体和嵌合抗原受体。
较好地，所述生物制剂为检测人GUCY2C蛋白浓度的试剂、检测人GUCY2C蛋白在肿瘤细胞表面表达程度的试剂或对人GUCY2C阳性细胞进行抗体介导的补体依赖或细胞依赖细胞毒反应试剂；该生物试剂含有抗体偶联毒素，对人GUCY2C阳性细胞进行杀伤、抗体偶联其他抗体制成靶向人GUCY2C及其他抗原多抗、抗体偶联其他蛋白制成靶向人GUCY2C的功能重组蛋白。
本发明提供的单克隆抗体，包括如下优点：
1、具有特异性识别人GUCY2C蛋白，部分组合具有人鼠双种属特异性；
2、该抗体具有良好的组织特异性，仅识别表达GUCY2C组织，对其他组织器官不识别，具有良好的检测用途前景；
3、该抗体制备的CAR-T对GUCY2C阳性靶细胞具有特异性杀伤功能，具有良好的细胞免疫疗法应用前景；
4、该抗体在天然构型状态及重组构型状态均具有良好的靶向性，具有良好的抗体药(ADC)、多抗药及重组抗体蛋白应用前景。
附图说明
图1a、1b、1c、1d分别表示实施例1中HGC27细胞GUCY2C表达阴性图谱、HGC27-hGUCY2C细胞表达hGUCY2C阳性图谱、K562细胞表达mGUCY2C阴性图谱、K562-mGUCY2C细胞表达mGUCY2C阳性图谱；
图2为鼠单抗亲和力检测结果；
图3a、3b、3c、3d为鼠单抗种属特异性检测结果；其中，图3a为鼠单抗与HGC27细胞结合活性曲线图；图3b为鼠单抗与HGC27-hGUCY2C细胞结合活性曲线图；图3c为鼠单抗与K562细胞结合活性曲线图；图3d为鼠单抗与K562-mGUCY2C细胞结合活性曲线图；
图4为鼠单抗组织特异性检测结果；
图5为CAR-GUCY2C结构；
图6为免疫细胞培养的扩增曲线；
图7a、7b、7c、7d、7e、7f分别为CAR的表达情况；其中，图7a为NT细胞(对照细胞)CAR表达阴性图谱；图7b为CAR-081细胞中CAR表达阳性率图谱；图7c为CAR-1H8细胞中CAR表达阳性率图谱；图7d为CAR-3F7细胞中CAR表达阳性率图谱；图7e为CAR-4D9细胞中CAR表达阳性率图谱；图7f为CAR-4E5细胞中CAR表达阳性率图谱；
图8a为CAR-T对HGC27细胞杀伤曲线图；
图8b为CAR-T对HGC27-hGUCY2C细胞杀伤曲线图。
具体实施方式
本发明中，单克隆抗体(也可以简称单抗)来源于鼠源，并以此对技术方案进行解说与描述。
本发明提供了一种靶向人GUCY2C CAR的单克隆抗体，包括重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)；其中，在所述氨基酸序列和核酸序列各自对应的重链可变区和轻链可变区中，CDR1、CDR2、CDR3分别为对应的氨基酸序列和核酸序列的三个互补决定区；本发明中，HCDR1、HCDR2和HCDR3表示重链可变区的三个互补决定区；LCDR1、LCDR2和LCDR3表示轻链可变区的三个互补决定区；
本发明中，重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列及核酸序列分别为如下任意一组:
第1组
A).HV核酸序列如SEQ ID NO:11所示：
ATGAACTTCGGGTTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAACTGAAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAATGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTC AGTACCTATGCCATGTCTTGGGTTCGTCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTG GCAGCACCTACTATTCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTTTCTGCAAATGATCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTACAAGAGGTGCGGACTACTGGGGGCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA；其中：
A-HCDR1表示GGATTCACTTTCAGTACCTATGCC；
A-HCDR2表示ATTAGTAGTGGTGGCAGCACC；
A-HCDR3表示ACAAGAGGTGCGGACTAC；
a).HV氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：
MNFGFSLIFLVLVLKGVQCELKLVESGGGLMKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYSDSVKGRFTISRDNARNILFLQMISLRSEDTAMYYCTRGADYWGQGTSVTVSS；其中：
a-HCDR1表示GFTFSTYA；
b-HCDR2表示ISSGGST；
c-HCDR3表示TRGADY；
B).LV核酸序列如SEQ ID NO:12所示：
ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGC CTTTTATATAGTAGCAATCAAATGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTTCTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCATCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTCTAGCTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA；其中：
B-LCDR1表示CAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAATGAACTAC；
B-LCDR2表示TGGGCATCC；
B-LCDR3表示CAGCAATATTCTAGCTATCCGCTCACG；
b).LV氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：
MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQMNYLAWYQQKPGQSPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLIISSVKAEDLAVYYCQQYSSYPLTFGAGTKLELK；其中：
b-LCDR1表示QSLLYSSNQMNY；
b-LCDR2表示WAS；
b-LCDR3表示QQYSSYPLT。
第2组
C).HV核酸序列如SEQ ID NO:13所示：
ATGAGCACTGAACACAGACACCTCACCATGAACTTCGGGTTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGTCTGTGCTGGTGAGGCCTGGAGGATCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGGTTCACCAGCTCCTGGATGCACTGGGCGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTCATCCTGATAGAGGTATTATAAACTATAATGAGAAATTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAACACGGCCTACGTGGATCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATGGGGACAACTCGGACTACGGTATGCTATGGACTACTGGGGTCGAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA；其中：
C-HCDR1表示GGCTACAGGTTCACCAGCTCCTGG；
C-HCDR2表示ATTCATCCTGATAGAGGTATTATA；
C-HCDR3表示GCAAGATGGGGACAACTCGGACTACGGTATGCTATGGACTAC；
c).HV氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示：
MSTEHRHLTMNFGFSLIFLVLVLKGVQCQVQLQQPGSVLVRPGGSVKLSCKASGYRFTSSWMHW AKQRPGQGLEWIGEIHPDRGIINYNEKFKDKATLTVDTSSNTAYVDLSSLTSEDSAVYYCARWGQLGL RYAMDYWGRGTSVTVSS；其中：
c-HCDR1表示GYRFTSSW；
c-HCDR2表示IHPDRGII；
c-HCDR3表示ARWGQLGLRYAMDY；
D).LV核酸序列如SEQ ID NO:14所示：
ATGGAGAAAGACACACTCCTGCTATGGGTCCTGCTTCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCCAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGT GTTGATAAATATGGCATTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTTTG ATGCATCCAACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGGGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCACCCTATGGAGGAAGATGACAGTGGAATGTACTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAACCTGGAGCTGAAA；其中：
D-LCDR1表示GAAAGTGTTGATAAATATGGCATTAGTTTT；
D-LCDR2表示GATGCATCC；
D-LCDR3表示CAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGCTCACG；
d).LV氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示：
MEKDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASESVDKYGISFMNWFQQKP GQPPKLLIFDASNQGSGVPARFRGSGSGTDFSLNIHPMEEDDSGMYFCQQSKEVPLTFGAGTNLELK；
其中：
d-LCDR1表示ESVDKYGISF；
d-LCDR2表示DAS；
d-LCDR3表示QQSKEVPLT。
第3组
E).HV核酸序列如SEQ ID NO:15所示：
ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTCCTATCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTCGGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTA ACTAGCTTTGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATTTGGAGTGGTG GAAGGAAAGACTATAATGCAGTTTTCGTATCCAGGCTGAGCATCAGTAAGGACAATTCCAAGAGCCGAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAAGCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGTCAGACACGGTACTAGACCCTACTGGTAC TTCGAAGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA；其中：
E-HCDR1表示GGTTTCTCATTAACTAGCTTTGGT；
E-HCDR2表示ATTTGGAGTGGTGGAAGGAAA；
E-HCDR3表示GTCAGACACGGTACTAGACCCTACTGGTACTTCGAAGTC；
e).HV氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示：
MAVLGLLFCLVTFPSCVLSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSFGVHWVRQSPGKGL EWLGVIWSGGRKDYNAVFVSRLSISKDNSKSRVFFKMNSLQANDTAIYYCVRHGTRPYWYFEVWGAGT TVTVSS；其中：
e-LCDR1表示GFSLTSFG；
e-LCDR2表示IWSGGRK；
e-LCDR3表示VRHGTRPYWYFEV；
F).LV核酸序列如SEQ ID NO:16所示：
ATGATTGCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGACATTGTGATGACCCAAACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGAC ATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCACGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGGCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATTCGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA；其中：
F-HCDR1表示CAGGACATTAGCAATTAT；
F-HCDR2表示TACACATCA；
F-HCDR3表示CAACAGGGTAATTCGCTTCCGTGGACG；
f).LV氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示：
MIASAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTV KLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIGTYFCQQGNSLPWTFGGGTKLEIK；其中：
f-LCDR1表示QDISNY；
f-LCDR2表示YTS；
f-LCDR3表示QQGNSLPWT。
第4组
G).HV核酸序列如SEQ ID NO:17所示：
ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCAGTAACTTCAGGTGTCTACTCACAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTT ACTAGCTACTGGATGCAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAG ATGGTGATACTAGGTACACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGAAGATGGTTACTACGATTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA；其中：
G-HCDR1表示GGCTACACCTTTACTAGCTACTGG；
G-HCDR2表示ATTTATCCTGGAGATGGTGATACT；
G-HCDR3表示GCAAGAGAAGATGGTTACTACGATTAC；
g).HV氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示：
MECNWILPFILSVTSGVYSQVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGL EWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAREDGYYDYWGQGTTLT VSS；其中：
g-HCDR1表示GYTFTSYW；
g-HCDR2表示IYPGDGDT；
g-HCDR3表示AREDGYYDY；
H).LV核酸序列如SEQ ID NO:18所示：
ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACCAACGGTGATATCATGATGACCCAAACTCCACTCTCTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGC CTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA；其中：
H-LCDR1表示CAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATAT；
H-LCDR2表示CTGGTGTCT；
H-LCDR3表示TGGCAAGGTACACATTTTCCTCAGACG；
h).LV氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：
MMSPAQFLFLLVLWIRETNGDIMMTQTPLSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQR PGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK；
其中：
h-LCDR1表示QSLLDSDGKTY；
h-LCDR2表示LVS；
h-LCDR3表示WQGTHFPQT。
本发明中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3前各自对应字母A、B、C、D、E、F、G、H、a、b、c、d、e、f、g、h等，只是序号标识号，仅限于区别作用，别无其他含义。
本发明中，对于单克隆抗体的氨基酸序列，在使用时还可以进行如下相应组合选择。
比如，重链可变区HV的氨基酸序列a)、c)、e)、g)中的任一可分别与轻链可变区LV的氨基酸序列b)、d)、f)、h)中的任一组合双链使用；或所述氨基酸序列a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)中的任一单链使用。
具体地，对于氨基酸双链组合使用，如，当重链可变区HV的氨基酸序列为a)时，轻链可变区LV的氨基酸序列则为序列b)；或者，当重链可变区HV的氨基酸序列为c)时，轻链可变区LV的氨基酸序列则为序列d)；或者，当重链可变区HV的氨基酸序列为e)时，轻链可变区LV的氨基酸序列则为序列f)；或者，当重链可变区HV的氨基酸序列为g)时，轻链可变区LV的氨基酸序列则为序列h)等多种组合双链使用。
相应地，单克隆抗体的核酸序列在使用时也可进行如下相应组合选择：重链可变区HV的核酸序列A)、C)、E)、G)中的任一可分别与轻链可变区LV的核酸序列B)、D)、F)、H)中的任一组合双链使用；或所述核酸序列A)、B)、C)、D)、E)、F)、G)、H)中的任一单链使用。具体地，对于核酸双链组合使用，如，当重链可变区HV的核酸序列为A)时，轻链可变区LV的核酸序列则为序列B)；或者，当重链可变区HV的核酸序列为C)时，轻链可变区LV的核酸序列则为序列D)；或者，当重链可变区HV的核酸序列为E)时，轻链可变区LV的核酸序列则为序列F)；或者，当重链可变区HV的核酸序列为G)时，轻链可变区LV的核酸序列则为序列H)等多种组合双链使用。
在一实施例中，单克隆抗体中的轻、重链可变区中的氨基酸序列配对使用并表达为鼠单抗时，优选表达配对组如下任意一组：
1).氨基酸序列a)和氨基酸序列b)配对，表达纯化鼠单抗命名为1H8；
2).氨基酸序列c)和氨基酸序列d)配对，表达纯化鼠单抗命名为3F7；
3).氨基酸序列e)和氨基酸序列f)配对，表达纯化鼠单抗命名为4D9；
4).氨基酸序列g)和氨基酸序列h)配对，表达纯化鼠单抗命名为4E5。
在本发明一实施例中，对于鼠单抗的基因构建质粒表达框后，表达框是通过递送系统转入293T细胞进行抗体表达；其中，递送系统可以是慢病毒、逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送系统、电转导及转座子中的一种。
在另一个实施例中，可以将发酵纯化的鼠单抗与GUCY2C阳性细胞共孵育，以验证鼠单抗的亲和力及特异性；或者，将发酵纯化的鼠单抗与组织切片和正常组织芯片进行免疫组化检测，以验证鼠单抗组织交叉反应特异性。
在其中一个实施例中，可以将鼠单抗轻、重链可变区串联成为scFv序列，构建靶向人GUCY2C的嵌合抗原受体；该嵌合抗原受体包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域；其中：
1)、嵌合抗原受体的胞外结构域包括抗原结合结构域；该抗原结合结构域包括scFv，且scFv为1H8、3F7、4D9、4E5的轻重链可变区；
2)、嵌合抗原受体的跨膜结构域包括CD28的铰链区和CD28的跨膜结构域、CD8的铰链区和4-1BB的跨膜结构域、CD8铰链区和ICOS的跨膜结构域等；其中，嵌合抗原受体的跨膜结构域为CD28的铰链区和CD28的跨膜结构域、CD8的铰链区和4-1BB的跨膜结构域或4-1BB或者ICOS的共刺激结构域；
3)、嵌合抗原受体的细胞内结构域包括共刺激信号传导区、细胞因子受体胞内区和CD3ζ链部分；其中，共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分；共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子；细胞内结构域可以为CD28、4-1BB、ICOS的共刺激结构域中的任一个与胞内激活信号CD3ζ的组合。
本发明中，单克隆抗体在进行人源化或其他动物源性改造时，三个补决定区CDR1、CDR2、CDR3中，氨基酸序列和/或核酸序列的改变不超过20％；或者，单克隆抗体在进行人源化或其他动物源性改造时，三个补决定区的CDR1、CDR2、CDR3中，氨基酸序列和/或核酸序列的改变为0。
本发明中，重组细胞系为免疫细胞，可以是包括T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、gamma-delta T细胞、TIL细胞、TCR-T细胞中的任一种免疫细胞。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时，NK细胞、NKT细胞、TIL、gamma-delta T细胞等同于T细胞(或T细胞可替换NK细胞)。
本发明上述任一项的靶向人GUCY2C单克隆抗体，可制成药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，均具有较好的成形效果，同时保持良好的药效；如，应用于生物材料和/或生物制剂中。
单克隆抗体应用于生物制剂中时，该生物制剂包含有由上述核酸序列或氨基酸序列构建的表达盒(如，基因表达框)、重组载体(如，质粒)、重组蛋白(如，融合蛋白、抗体蛋白等)、重组微生物(如，大肠杆菌，噬菌体等)或重组细胞系(如，免疫细胞，CHO细胞等)，且这些核酸序列或氨基酸序列来源于上述单克隆抗体；其中，重组载体包括基因重组表达载体和嵌合抗原受体。
单克隆抗体应用于生物制剂中时，是作为生物制剂配置组份存在的，且该述生物制剂组份中还包含有检测人GUCY2C蛋白浓度的试剂、检测人GUCY2C蛋白在肿瘤细胞表面表达程度的试剂、抗体偶联毒素对人GUCY2C阳性细胞进行杀伤、抗体偶联其他抗体制成靶向人GUCY2C及其他抗原多抗、抗体偶联其他蛋白制成靶向人GUCY2C的功能重组蛋白。
总之，相对于现有技术而言，本发明提供的单克隆抗体具有如下优点：
1、具有特异性识别靶向人GUCY2C蛋白，部分组合具有人鼠双种属特异性；
2、具有良好的组织特异性，仅识别表达GUCY2C组织，对其他组织器官不识别，说明本发明中抗体具有良好的检测用途前景；
3、抗体制备的CAR-T对GUCY2C阳性靶细胞具有特异性杀伤功能，具有良好的细胞免疫疗法应用前景；
4、本抗体在天然构型状态及重组构型状态均具有良好的靶向性，具有良好的抗体药(ADC)、多抗药及重组抗体蛋白应用前景。
下面以CAR-T细胞为例，代表性地对本发明的单克隆抗体拓展应用进行详细说明。
本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。其中，胞外结构域包括抗原结合结构域，细胞内结构域包括共刺激信号传导区、细胞因子受体胞内区和CD3ζ链部分，共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分，共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。
在一个较佳的实施方案中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向GUCY2C的鼠单抗轻重链可变区抗原结合结构域。本发明的CAR在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性或者蛋白受体结合进行抗原识别。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和CD3ζ链的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域分别与CD28、4-1BB、ICOS信号传导结构域及CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
本发明的CAR中，胞内结构域包括CD28、4-1BB、ICOS的信号传导结构域及CD3ζ的信号传导结构域。
表达框的载体选自：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统中的一种或两种以上。优选地，载体为病毒载体。
载体编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了插入表达框的载体，源于逆转录病毒，诸如慢病毒的载体，其特点是长期、稳定的整合目的基因至细胞中；可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞；低免疫原性；安全性高。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列，另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为脂质体转染法。核酸可与脂质相关联，与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
本发明提供了含有如上所述的靶向GUCY2C抗体的CAR-T细胞以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一个实施方案中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103～1×108个/ml，更优地，CAR-T细胞的浓度为1×104～1×107个/ml。在一个实施方案中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
本发明包括用编码本发明抗体的核酸构建物的慢病毒载体转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞，且CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。且本发明的CAR-T细胞膜可以表达本发明靶向GUCY2C的鼠单抗scFv结构抗原嵌合受体，特异性杀伤GUCY2C阳性靶细胞并且无脱靶风险。
在一个实施方案中，本发明的免疫细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，GUCY2C CAR-T细胞引起抗表达GUCY2C的细胞的特异性免疫应答。
可治疗的症状包括GUCY2C阳性表达的肿瘤细胞。肿瘤细胞可能造成的症状包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤等。
使用本发明抗体的CAR免疫细胞，修饰T细胞的离体程序，以下中的至少一项在将细胞施用进入人体前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸和编码细胞膜上表达的与细胞因子受体融合的免疫检查点抗体蛋白的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，人外周血中分离的细胞用于表达本文公开的CAR和细胞膜上表达的与细胞因子受体融合的免疫检查点抗体蛋白。修饰T的细胞可被施用给接受者，以提供治疗益处。其次免疫细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
使用本发明抗体的免疫细胞CAR修饰T细胞可被单独施用或与其他药物、药物组合物、稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
采用本发明抗体的免疫细胞制成的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度，并由临床方案确定。当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以1×104～1×109个/kg体重的剂量，优选1×105～1×106个/kg体重的剂量施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员确定。
本发明的制剂的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
以下通过具体实施例进行详细说明。
实施例1单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备步骤如下：
S10：小鼠免疫及鼠单抗序列获取
使用自产人GUCY2C蛋白免疫Balbc小鼠，按照20ug/只/次进行小鼠皮下多点注射免疫，每周一次。经过4周免疫后，对血液抗体效价达到1k以上小鼠处死，取脾脏细胞与SP2.0细胞融合。对融合细胞进行效价检测，筛选阳性融合细胞使用有限稀释法挑取单克隆后，进行抗体发酵及功能评价，对最终筛选到的鼠单抗提取基因并构建抗体轻重链表达质粒发酵纯化抗体及构建CAR质粒。
S20：鼠单抗发酵纯化
将构建好的抗体轻重链表达质粒配对，使用PEI试剂作为转染试剂，同时将一对轻重链表达质粒瞬时转染293T细胞进行抗体蛋白发酵，抗体轻重链在发酵过程中天然配对，并收集培养液。使用0.22μm无菌滤膜过滤培养液，得培养上清后进行亲和色谱纯化。
纯化方法为：(1)20mM PB，pH7.0平衡1ml-Protein A亲和柱，1.0ml/min；(2)上样培养液50ml，1ml/min，使用平衡液平衡；(3)0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7洗脱，1ml/min，收集280nm吸收峰；(4)20-50mM PB，150mM NaCl，pH6.7平衡Superdex 200Increase 10/300GL柱，1ml/min；(5)上样，收集280nm吸收峰2ml。
对纯化样品进行HPLC分析，对接收峰进行检测，检测纯化接出峰浓度，并计算蛋白量。
实施例2细胞系培养
不表达GUCY2C的细胞系：HGC27(人胃癌细胞)，K562(人慢性髓原白血病细胞)，购自ATCC。
表达人GUCY2C的细胞系：HGC27-hGUCY2C，自产慢病毒侵染构建。
表达鼠GUCY2C的细胞：K562-mGUCY2C，自产慢病毒侵染构建。
包装用细胞：293T(人胚肾细胞系)，购自ATCC。
过表达人GUCY2C及鼠GUCY2C的细胞系的建立：将表达hGUCY2C及mGUCY2C的碱基序列克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中，置于EF1α(EF-1α)的启动子下,形成PHBLV-EF1α-hGUCY2C及PHBLV-EF1α-mGUCY2C，将PHBLV-EF1α-hGUCY2C及PHBLV-EF1α-mGUCY2C、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T中制备慢病毒完整表达载体；在48h和72h收集病毒上清，超离进行浓缩(Merck Millipore)；浓缩后的病毒即可用于感染HGC27和K562细胞，最终得到过表达hGUCY2C的HGC27单克隆细胞系和过表达mGUCY2C的K562混合细胞系，命名为HGC27-hGUCY2C和K562-mGUCY2C。
上述所有细胞培养基培养：贴壁细胞使用DMEM培养基培养，悬浮细胞使用1640培养基培养。所有培养基均添加10％(v/v)胎牛血清。
如图1a、1b、1c和1d中分别为HGC27、HGC27-hGUCY2C和K562、K562-mGUCY2C细胞表达人或鼠GUCY2C的检测图；其中：
图1a中为HGC27细胞使用抗人GUCY2C抗体检测结果，图中峰型位置在竖线左侧，表示检测结果为GUCY2C阴性；
图1b中为HGC27-hGUCY2C细胞使用抗人GUCY2C抗体检测结果，图中峰型位置在竖线右侧，表示检测结果为hGUCY2C阳性；
图1c中为K562细胞使用抗鼠GUCY2C抗体检测结果，图中峰型位置在竖线左侧，表示检测结果为mGUCY2C阴性；
图1d中为K562-mGUCY2C细胞使用抗鼠GUCY2C抗体检测结果。
K562-mGUCY2C细胞构建后未挑选单克隆，其表达并非完全阳性，图中峰型位置在竖线右侧为mGUCY2C阳性，在竖线左侧为mGUCY2C阴性，检测结果表明为K562-mGUCY2C细胞阳性率为68.5％。
实施例3鼠单抗亲和力、种属特异性评价
该实施例中，使用实施例2中的细胞对实施例1中的单克隆抗体亲和力及种属特异性评价。
采用实施例2中的HGC27-hGUCY2C细胞作为阳性细胞，081抗体作为阳性对照，检测GUCY2C鼠单抗1H8、3F7、4D9、4E5的EC50亲和力，检测结果见图2。结果显示1H8、3F7、4D9、4E5的EC50亲和力均接近或高于对照抗体081。
使用实施例2中的HGC27、HGC27-hGUCY2C、K562、K562-mGUCY2C细胞作为靶细胞，检测GUCY2C鼠单抗1H8、3F7、4D9、4E5的种属特异性，结果见图3a、3b、3c、3d。
图3a中，鼠单抗1H8、3F7、4D9、4E5分别与HGC27细胞结合峰型均在竖线左侧，表明其结合为阴性；图3b中1H8、3F7、4D9、4E5与HGC27-hGUCY2C细胞结合峰型均在竖线右侧，表明其结合为阳性；图3c中1H8、3F7、4D9、4E5与K562细胞结合峰型在竖线左侧，表明其结合为阴性；图3d中1H8、3F7、4D9、4E5与K562-mGUCY2C细胞结合峰型部分在竖线左侧表示结合阴性，部分在竖线右侧表示结合阳性，其阳性率与K562-mGUCY2C细胞阳性率相符，且经检测3F7抗体结合细胞确为K562-mGUCY2C细胞阳性细胞，表明3F7抗体可与mGUCY2C结合。
以上结果表明，鼠单抗1H8、3F7、4D9、4E5抗体可特异性结合人GUCY2C，并且部分抗体可结合鼠GUCY2C。抗体具有人鼠两种种属特异性，可在后续实验中在小鼠动物实验中初步评价病理毒理特性。
实施例4鼠单抗组织特异性检测评价
使用人正常组织芯片对实施例1中鼠单抗的组织特异性进行免疫组化评价，组织芯片包括37个正常组织类型：食道组织，胃组织，小肠组织，结肠组织，肝组织，胰腺组织，阑尾组织，舌组织，涎腺组织，咽粘膜，肺组织，睾丸组织，前列腺组织，乳腺组织，卵巢组织，子宫内膜组织，宫颈管组织，宫颈组织，肾皮质组织，肾髓质组织，膀胱组织，扁桃体组织，淋巴结组织，胸腺组织，脾脏组织，皮肤组织，骨骼肌组织，动脉组织，胸膜间皮组织，间皮组织，外周神经组织，小脑组织，大脑白质，大脑灰质，肾上腺组织，甲状腺组织，心肌组织。共102个组织点。检测结果见图4，结果表明仅在食道及胃组织(GUCY2C阳性表达)细胞膜表面具有染色效果，在其余正常组织均无细胞膜表面染色，证明其组织特异性良好。
实施例5外周血PBMC的分离和T细胞的培养
从人供体外周血中分离单核细胞，使用ficol进行密度梯度离心，并用T细胞分选试剂盒富集T细胞(CD3 MicroBeads,human-lyophilized，130-097-043)，使用偶联anti-CD3/anti-CD28的磁珠激活培养和扩增T细胞；培养基使用TexMACS GMP Medium(MiltenyiBiotec，170-076-309)，含10％FBS，2mM L-glutamine，100IU/ml rhIL2，所有细胞均置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养，获得T细胞。
实施例6CAR结构设计与慢病毒包装
GUCY2C-CAR结构，即靶向GUCY2C的CAR结构：
本实施例中，将命名为1H8、3F7、4D9、4E5四对靶向GUCY2C鼠单抗轻重链可变区scFv序列分别构建到第二代CAR的一个表达框上。CAR的核心结构包括分泌信号肽序列；CD8跨膜区；胞内段刺激信号4-1BB-CD3ζ，分别命名为CAR-1H8、CAR-3F7、CAR-4D9、CAR-4E5，以对照靶向GUCY2C抗体的轻重链可变区scFv构建CAR的表达框作为对照，命名为CAR-081，如图5所示，标识号1#、2#、3#、4#、5#分别表示5种GUCY2C-CAR结构示意图。
如图5所示，GUCY2C scFv/TM/4-1BB/CD3ζ表示免疫细胞的细胞膜上表达的嵌合抗原受体。
将表达框克隆至PHBLV慢病毒载体骨架中，置于EF1α(EF-1α)的启动子下，形成PHBLV-EF1α-CAR-1H8、PHBLV-EF1α-CAR-3F7、PHBLV-EF1α-CAR-4D9、PHBLV-EF1α-CAR-4E5和PHBLV-EF1α-CAR-081，将PHBLV-EF1α-CAR-1H8、PHBLV-EF1α-CAR-3F7、PHBLV-EF1α-CAR-4D9、PHBLV-EF1α-CAR-4E5和PHBLV-EF1α-CAR-081、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，Plasmid#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene Plasmid#12260)三个质粒使用Lipofectamine3000转入293T中制备慢病毒完整表达载体；在细胞培养到48h和72h后，转入离心管中离心处理，离心停止后收集病毒上清液，对上清液进行超速离心浓缩(MerckMillipore)；浓缩后的病毒即可用于感染T细胞。
实施例7CAR-T细胞制备
1、慢病毒感染
将实施例5中分离纯化的原代T细胞再激活1天后，利用实施例6中包装的5种慢病毒，分别是Lv-CAR-1H8、Lv-CAR-3F7、Lv-CAR-4D9、Lv-CAR-4E5、Lv-CAR-081。按MOI(1-10)进行慢病毒载体感染，并将感染病毒的T细胞转移至细胞培养瓶，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。
2、细胞增殖及CAR阳性率检测
T细胞感染后第6、9、11、13天，每天取样检测细胞数量，第6天分别检测T细胞的CAR阳性率，每隔1-2天传代补加培养基。
利用实施例6中的5种慢病毒载体，成功构建了5种CAR-T细胞，分别命名为CAR-T-1H8、CAR-T-3F7、CAR-T-4D9、CAR-T-4E5、CAR-T-081，以不感染慢病毒的T细胞为对照(NT)。
如图6所示，5种细胞的增殖速率，由图可知在相同培养条件的情况下5种细胞的增殖速率无明显差异。
如图7a、7b、7c、7d、7e、7f所示，分别表示NT细胞、CAR-T-081、CAR-T-1H8、CAR-T-3F7、CAR-T-4D9、CAR-T-4E5第6天测试的CAR的表达情况，如图7a、7b、7c、7d、7e、7f中所示竖线右侧为CAR阳性比例，由图可见不同scFv对CAR阳性率无显著影响。
实施例8CAR-T对HGC27-hGUCY2C细胞杀伤检测实验
对实施例7中获得的5种CAR-T细胞进行体外杀伤实验，采用RTCA设备检测CAR-T细胞的杀伤效应，靶细胞与效应细胞共孵育24h，杀伤效率明显，结果如图8a和8b所示。图8a中显示CAR-T-081、CAR-T-1H8、CAR-T-3F7、CAR-T-4D9、CAR-T-4E5均对HGC27细胞无杀伤效果，表示其对非靶向细胞无杀伤活性；图8b中显示，与对照CAR-T-081相比，CAR-T-1H8、CAR-T-3F7、CAR-T-4D9、CAR-T-4E5均具有对HGC27-hGUCY2C细胞基本相当的杀伤效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种靶向人GUCY2C蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；其中，所述重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别选自如下任意一组：
第1组：所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列为GFTFSTYA，所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列为ISSGGST，所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列为TRGADY；所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列为QSLLYSSNQMNY，所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列为WAS，所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列为QQYSSYPLT；或
第2组：所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列为GYRFTSSW，所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列为IHPDRGII，所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列为ARWGQLGLRYAMDY；所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列为ESVDKYGISF，所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列为DAS，所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列为QQSKEVPLT；或
第3组：所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列为GFSLTSFG，所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列为IWSGGRK，所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列为VRHGTRPYWYFEV；所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列为QDISNY，所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列为YTS，所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列为QQGNSLPWT；或
第4组：所述重链可变区HCDR1的氨基酸序列为GYTFTSYW，所述重链可变区HCDR2的氨基酸序列为IYPGDGDT，所述重链可变区HCDR3的氨基酸序列为AREDGYYDY；所述轻链可变区LCDR1的氨基酸序列为QSLLDSDGKTY，所述轻链可变区LCDR2的氨基酸序列为LVS，所述轻链可变区LCDR3的氨基酸序列为WQGTHFPQT。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，第1组中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或
第2组中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；或
第3组中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或
第4组中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码为权利要求1或2所述的单克隆抗体。
4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒含有权利要求3所述的核酸分子。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权要求3所述的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括基因重组表达载体。
7.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物含有权利要求3所述的核酸分子。
8.一种重组细胞系，其特征在于，所述重组细胞系含有权利要求3所述的核酸分子。
9.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂含有权利要求1或2所述的单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂为检测人GUCY2C蛋白浓度的试剂、或检测人GUCY2C蛋白在肿瘤细胞表面表达程度的试剂、或对人GUCY2C阳性细胞进行抗体介导的补体依赖或细胞依赖细胞毒反应试剂。
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