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CN116158534B - 一种高负载且稳定的蛋白质脂质体 - Google Patents

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CN116158534B CN202310186564.8A CN202310186564A CN116158534B CN 116158534 B CN116158534 B CN 116158534B CN 202310186564 A CN202310186564 A CN 202310186564A CN 116158534 B CN116158534 B CN 116158534B
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Abstract

提供了一种高负载且稳定的蛋白质脂质体。本发明的脂质体组合物包含26～40重量份的蛋白质或多肽、5～10重量份的磷脂、3～8重量份的酸味调节剂和水，并且具有pH 3.5～4.6，其中蛋白质或多肽的重均分子量为3000Da以下，并且磷脂中磷脂酰胆碱含量为8～30％并且磷脂酰肌醇含量为15～35％。本发明的脂质体组合物具有高负载且稳定保存的优点。

Description

一种高负载且稳定的蛋白质脂质体
技术领域
本发明属于食品领域，具体涉及一种高负载且稳定的蛋白质脂质体。
背景技术
脂质体是一种有效提高功能性成分生物利用度及吸收的技术，其将活性成分包封于类脂质的双分子层内而形成的微型泡囊体，结构与细胞膜的磷脂双分子层结构类似，具有较好的生物相容性。脂质体可将水溶性功能因子包裹在内部水性囊泡中或将脂溶性的功能因子包裹在脂质双分子层中，可以胞吞形式改善活性成分的渗透、促进其吸收。
蛋白质作为机体的组成部分参与大部分重要生理过程，蛋白质在治疗疾病或保健应用中发挥着不可替代的作用。然而，蛋白质的理化性质容易受到外界环境的影响而导致变性，脂质体作为蛋白质的载体，具有保持蛋白活性、缓释等特点。
专利CN114099646A公开了一种可重复使用的具有缓释作用的胶原蛋白肽脂质体混悬液及其制备方法，所述混悬液包含粒度为70-1100nm和/或3000-5500nm的脂质体颗粒；所述混悬液由有机相和水相形成，有机相采用磷脂纳米纤维、甘油磷脂、胆固醇、吐温，所述有机相中含柔性碳链连接剂连接的磷脂纳米纤维的浓度为0.14～0.17g/mL，所述水相中胶原蛋白的浓度为1.5～3.5mg/mL。该发明提供的制备方法中，包封胶原蛋白的脂质体通过手臂链连接到纳米纤维上，定向附着于粘胶纤维无纺布上，使脂质体具有良好的空间灵活性，提高表面可及性和贴敷性能；由于手臂链的存在，使脂质体浮于无纺布表面，提高胶原蛋白的作用效果。
专利CN107441046A提供了一种复合蛋白质脂质体纳米制剂，所述纳米制剂为核壳结构，其中外壳由脂溶性的磷脂和维生素C衍生物组成，内核由蛋白质凝缩体组成。原始胶原蛋白的分子量为300kDa，浓度为0.5mg/mL，pH 7.4。该发明除了可以有效地对内含胶原蛋白进行包裹与保护，同时纳米结构表面具有高脂溶壳层，可以极大地促进大分子胶原蛋白通过小肠表皮细胞层进入血液循环，有效地解决了现有的胶原蛋白制剂难以吸收的问题。
专利CN103110935A提供了一种水解胶原蛋白肽脂质体溶液，主要用于各种因素引起的皮肤损伤修复。其中胶原蛋白肽的含量为10-50mg/g；其采用磷脂、神经酰胺、胆固醇制备水解胶原蛋白肽脂质体，促进水解胶原蛋白的透过皮肤角质层进入皮肤，并提高水解胶原蛋白在皮肤中的滞留量，能更有效地促进皮肤损伤的恢复。另外溶液中含有透明质酸提高脂质体的稳定性，延缓泄漏。
专利CN113559037A提供了一种以决明子复方胶原脂质体为主的制备方法及其应用。一种决明子复方胶原脂质体，由以下原料按质量百分比制成：复方卵磷脂2.00-5.00％、决明子提取液12.00-25.00％、薄荷提取液12.00-25.00％、石斛提取液12.00-25.00％、荸荠提取液12.00-25.00％、红枸杞提取液12.00-25.00％、甘草提取液12.00-25.00％、胶原蛋白溶液8.00-16.00％。该发明以决明子复方胶原脂质体为主的应用兼具明目、保湿、美白、抗皱和高渗透的作用，且质地温和清爽，能够有效缓解眼疲劳，对眼睛的明目作用最为明显。
专利CN103932897B提供一种用于面部保湿的组合物，它包括以下质量百分比的各组分：透明质酸0.01％-5％、水解胶原蛋白0.01％-5％、NFM0.01％-5％、角鲨烯0.1％-10％、甘油0.5％-5％、维生素E 0.01％-5％，余量为水，其中透明质酸、水解胶原蛋白、NFM、维生素E在混合前均单独用脂质体包埋或纳米微胶囊包裹。该组合物的活性有效成分被分别单独用转运载体包裹或包埋起来，通过转运载体的运输穿过角质层到达真皮层或浅真皮层，滋润皮肤并防止肌肤水分蒸发、改善微循环，增强肌肤湿润度。
本领域中需要更多的蛋白质或肽脂质体。
发明内容
本发明人在长期的工作中发现目前国内外虽然采用了脂质体技术将蛋白质诸如胶原蛋白肽应用于普通食品和营养补充剂产品，但因肽脂质体产品存在酸不稳定、热不稳定、负载率低等问题，影响产品的质量，限制了蛋白质或肽在脂质体产品中的应用。此外，常见的脂质体制备工艺，如薄膜分散法、乙醇注入法等存在使用大量有机溶剂，其安全隐患大、难以实现规模化生产等问题。
例如，发明人发现专利CN114099646A制备的胶原蛋白肽脂质体采用了有机溶剂，存在安全隐患，且所制备出来的胶原蛋白肽脂质体负载量较低，仅有0.15～0.35％，而且还采用非食品可用的胆固醇以及化学性的乳化剂吐温等材料。专利CN107441046A所制备的胶原蛋白肽脂质体制剂中，胶原蛋白的含量仅为0.05％，负载量较低；pH为偏中性，不利于保存。专利CN103110935A提供了一种外用的胶原蛋白肽脂质体制剂，胶原蛋白的含量为1～5％，负载量也较低。专利CN113559037A提供了一种胶原蛋白肽含量在4％以下的脂质体制剂，用于外用缓解眼疲劳，其负载量偏低。专利CN103932897B提供了一种胶原蛋白肽含量为0.01～5％的脂质体产品，通过外用起到美容护肤的作用，其负载量较低。
针对现有技术的这些缺陷，发明人提供了本发明的脂质体以及制备该脂质体的脂质体组合物，以解决这些缺陷。
在一方面，本发明提供了脂质体组合物，其包含26～40重量份的蛋白质或多肽、5～10重量份的磷脂、3～8重量份的酸味调节剂和水，并且具有pH3.5～4.6，其中蛋白质或多肽的重均分子量为3000Da以下，并且磷脂中磷脂酰胆碱含量为8～30％并且磷脂酰肌醇含量为15～35％。
在一个实施方案中，脂质体组合物包含41-53重量份的水。
在一个实施方案中，多肽是胶原蛋白肽、海参肽、玉米多肽和核桃多肽中的一种或多种。
在一个实施方案中，磷脂中磷脂酰胆碱含量为15～30％并且磷脂酰肌醇含量为18～35％。
在一个实施方案中，磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的总量可以不超过45％、46％、47％、48％、49％或50％。
在一个实施方案中，磷脂选自包含15％磷脂酰胆碱和30％磷脂酰肌醇的磷脂和包含30％磷脂酰胆碱和18％磷脂酰肌醇的磷脂。
在一个实施方案中，蛋白质或多肽的重均分子量为200-2900Da、300-2800Da、300-2700Da、300-2500Da、300-2000Da、300-1500Da或300-1000Da。
在一个实施方案中，蛋白质或多肽为26-35重量份、26-34重量份或26-33重量份。
在一个实施方案中，酸味调节剂为4～8重量份。
在一个实施方案中，脂质体组合物具有pH 3.5～4.5、3.5～4、3.5～3.95或3.5～3.9。
在一个实施方案中，胶原蛋白肽具有500-3000Da、800-2500、900-2100或1000-2000的重均分子量。
在一个实施方案中，海参肽具有200-3000Da、300-2000Da、350-1000Da或400-800Da的重均分子量。
在一个实施方案中，玉米多肽具有200-3000Da、250-2000Da、300-1000Da或350-800Da的重均分子量。
在一个实施方案中，核桃多肽200-3000Da、300-2000Da、350-1000Da、400-800Da或500-700Da的重均分子量。
在一个实施方案中，脂质体组合物包含41-53、45-52或48-51重量份的水。
在一个实施方案中，脂质体组合物包含赋形剂、抗氧化剂、水溶性成分中的一种或多种。在一个实施方案中，脂质体组合物不包含以下一种或多种成分：胆固醇、乙醇和吐温。在一个实施方案中，酸味调节剂包括食用磷酸、乳酸、柠檬酸和苹果酸的一种或几种。
在一个实施方案中，脂质体组合物包含20～70重量份、30-60重量份、或40-55重量份的赋形剂。
在一个实施方案中，赋形剂是胶体、麦芽糊精、环糊精、淀粉、糖醇、糖浆和乳清蛋白的一种或多种。在一个实施方案中，水溶性成分是水溶性维生素。在一个实施方案中，糖醇为赤藓糖醇。在一个实施方案中，赋形剂是麦芽糊精、乳清蛋白和赤藓糖醇。在一个实施方案中，胶体是植物胶或动物胶，优选黄原胶、阿拉伯胶、魔芋胶、瓜尔胶、卡拉胶、刺槐豆胶、果胶、明胶的一种或多种。
在一方面，本发明提供了制备本文所述的脂质体组合物的方法，其包括将脂质体组合物的各组分混合并且均质形成脂质体液。在一个实施方案中，通过剪切、胶体磨、高压进行均质。在一个实施方案中，在400～800bar的条件下进行均质。
在一方面，本发明提供了制备脂质体剂型的方法，其中所述方法包括本文所述的制备本文所述的脂质体组合物的方法，并且还包括以下步骤中的一个或多个：
对脂质体液进行高温灭菌，制得经灭菌的液态脂质体；
对脂质体液添加胶体赋形剂，并且充分分散，高温灭菌后得到脂质体凝胶；或者
对脂质体液添加赋形剂，混合后高温灭菌，然后干燥，得到脂质体粉末；其中赋形剂是麦芽糊精、环糊精、淀粉、糖醇、糖浆和乳清蛋白中的一种或多种。
在一个实施方案中，高温灭菌是80～100℃、85-95℃或90-95℃处理10～40分钟或10-30分钟。
在一方面，本发明提供了脂质体液，其通过本文所述的方法制备。
在一方面，本发明提供了脂质体剂型，其由本文所述的脂质体液制备。在一个实施方案中，脂质体剂型是溶液剂、凝胶剂、粉末、片剂、软胶囊或软糖。
在另一方面，本发明提供了脂质体剂型，其是通过本文所述的方法制备的液态脂质体、脂质体凝胶或脂质体粉末。
在又一方面，本发明提供了脂质体剂型在化妆品、食品或保健品中的用途或者在制备药物或药品中的用途。
本发明的优点包括：
(1)本发明的脂质体的蛋白质(例如胶原蛋白)的负载量高；
(2)本发明的脂质体的稳定性好，能够耐酸性和高温；
(3)本发明的脂质体的可应用于多种剂型；
(4)本发明的脂质体的采用普通食品和保健食品的辅料，不含有机溶剂和化学性乳化剂。
附图说明
图1显示了胶原蛋白肽脂质体结构图。
图2显示了胶原蛋白肽脂质体外观。外观稳定性评价：将胶原蛋白肽脂质体样品在90℃下灭菌30min后，观察其析出或分层的严重程度，从右到左析出或分层的程度依次递增。评价指标如下(从左到右)：++：灭菌后液面有明显分层或析出，溶液变浑浊；+：灭菌后液面有较明显的析出或分层，溶液略微浑浊；-：灭菌后液面无析出或分层，溶液澄清透亮。
图3显示了胶原蛋白肽脂质体溶液。
图4显示了胶原蛋白肽脂质体凝胶。
图5显示了胶原蛋白肽脂质体粉剂。
图6显示了胶原蛋白肽脂质体粉剂溶于水的状态。
图7显示了液体胶原蛋白肽脂质体电镜扫描图。
图8显示了液体胶原蛋白肽脂质体电镜扫描图。
图9显示了胶原蛋白肽凝胶电镜扫描图。
图10显示了胶原蛋白肽凝胶电镜扫描图。
图11显示了胶原蛋白肽粉剂电镜扫描图。
具体实施方式
现有的蛋白或肽脂质体(例如胶原蛋白肽脂质体)产品负载量低且多为中性体系，本发明的脂质体主要是解决了脂质体酸性不稳定问题，以及高浓度蛋白肽和磷脂兼容性问题。磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)为两性分子，具有接受或给予电荷的能力，是磷脂的重要组成成分，其含量的变化会改变脂质体的电位，影响磷脂与蛋白或肽(例如胶原蛋白肽)的结合。磷脂在酸性pH下易水解，加热易发生析出沉淀，而当在较高含量的多肽存在下：一部分多肽与脂质体磷脂结合，即有部分多肽是作为脂质体结构的壁材，另数量增多的两性多肽分子也使暴露出来的氨基数量也增多，增大了与酸性介质的反应，提高了多肽脂质体体系在低pH体系中的稳定性，对脂质体起到保护作用，避免酸性下磷脂的聚集与不稳定；一部分多肽以功能性物料形式包埋于脂质体水性核心，提高多肽的吸收。
图1以胶原蛋白肽脂质体为例，显示了微观结构模型图，胶原蛋白肽脂质体结构为由磷脂双分子层组成的外壳将一部分胶原蛋白肽包裹起来，形成球形脂质体，外层有另一部分的胶原蛋白肽与磷脂结合，形成稳定的胶原蛋白肽脂质体结构，该结构可以抵御酸性条件下氢离子的进攻，显现出耐酸性的技术效果。
本发明提供了脂质体组合物，其在本文中指制备脂质体的原料组合物。本文的脂质体可以从脂质体组合物制备。脂质体组合物可以包含蛋白质或多肽、磷脂、酸味调节剂和水。脂质体可以包含蛋白质或多肽、磷脂、酸味调节剂，并且根据需要可以包含水或不包含水。
蛋白质或多肽的种类没有特别限制，可以为任何合适的蛋白质或多肽。蛋白质或多肽的重均分子量可以为3000Da以下，例如200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900Da或它们之间的任何范围。蛋白质或多肽的优选实例为胶原蛋白肽，例如3000Da以下，例如500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000Da或它们之间的任何范围。在本文中，脂质体组合物或脂质体可以包含一定量的蛋白质或多肽，例如26～40重量份的蛋白质或多肽，例如27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39重量份的蛋白质或多肽。蛋白质或多肽也可以选自海参肽、玉米多肽和核桃多肽。
脂质体组合物或脂质体可以包含一定量的磷脂，例如5～10重量份磷脂，例如6、7、8、9重量份。磷脂可以包含磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇。磷脂酰胆碱含量可以为8～30％，例如9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％或29％。磷脂酰肌醇含量可以为15～35％，例如16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％或34％。磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的总量可以不超过45％、46％、47％、48％、49％或50％。磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇可以是以上各个数值或数值范围的任意组合。
脂质体组合物或脂质体可以包含酸味调节剂，例如3～8重量份的酸味调节剂，例如4、5、6、7重量份的酸味调节剂。酸味调节剂的种类没有特别限制，可以是任何可用的食用酸味调节剂。酸味调节剂可以将脂质体组合物的pH调节为pH 3.5～4.6，例如3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5。作为非限制性实例，酸味调节剂可以是食用磷酸、乳酸、柠檬酸和苹果酸的一种或几种。
脂质体组合物或脂质体还可以根据需要包含赋形剂、抗氧化剂、水溶性成分中的一种或多种。赋形剂、抗氧化剂、水溶性成分的种类没有特别限制，可以是任何可用的赋形剂、抗氧化剂、水溶性成分。例如，赋形剂可以是胶体、麦芽糊精、环糊精、淀粉、糖醇、糖浆和乳清蛋白的一种或多种。水溶性成分可以是水溶性维生素。胶体可以是植物胶或动物胶，优选黄原胶、阿拉伯胶、魔芋胶、瓜尔胶、卡拉胶、刺槐豆胶、果胶、明胶的一种或多种。
本发明的脂质体组合物或脂质体可以不包含现有技术中通常添加非食用成分，诸如以下一种或多种成分：胆固醇、乙醇和吐温。
本发明的脂质体组合物或脂质体可以包含41-53重量份的水，例如42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52重量份的水。
可以将本发明的脂质体组合物的各组分混合并且进行均质处理(例如通过剪切、胶体磨、高压进行均质处理)以得到脂质体液。均质处理可以在合适的条件下进行，例如400～800bar的条件下进行。在没有无菌需要的情况下，这种脂质体液含有形成的脂质体，可以直接进行使用。在通常情况下，例如在食品应用或需要长期保持的情况下，通常需要对脂质体液进行进一步的加工处理，例如对脂质体液进行高温灭菌。高温灭菌可以在高温(例如80～100℃)处理一定时间(例如10～40min)。经过高温灭菌后得到的经灭菌的液态脂质体可以直接进行应用或者商业出售。或者，可以对脂质体液添加胶体赋形剂，并且充分分散，高温灭菌后得到脂质体凝胶。也可以对脂质体液添加赋形剂，混合后高温灭菌，然后干燥，得到脂质体粉末。赋形剂可以是任何种类的食用赋形剂，例如麦芽糊精、环糊精、淀粉、糖醇、糖浆和乳清蛋白中的一种或多种。因此，本发明的脂质体产品可以包含未灭菌的脂质体液、经灭菌的液体脂质体、胶体脂质体或粉末脂质体，但是脂质体产品的形态不限于此。这些脂质体可以制备为各种剂型，包括溶液剂、凝胶剂、粉末、片剂、软胶囊或软糖。
胶原蛋白肽
本发明的脂质体中采用的蛋白质或多肽的种类没有特别限制，但是为了阐释本发明。本文利用胶原蛋白肽作为实例进行验证。蛋白质或多肽在本文中的脂质体可以充当包埋物质并且也可以充当脂质体结构的组成成分。
胶原蛋白肽是以富含胶原蛋白的动物(包括牛、猪、鱼等)组织(包括皮、骨、筋、鳞等)为原料，经过提取、水解、精制等工艺生产得到的相对分子量小于一万道尔顿的一类产品。现有科学研究证据表明，胶原蛋白肽在改善皮肤水分及弹性、减少皮肤皱纹、缓解皮肤老化、促进烧伤伤口的愈合等方面具有显著的效果，还能增强骨骼健康，有益于骨质疏松、肌少症、骨关节炎的治疗，是目前在国内外营养保健品及化妆品行业中经久不衰的一种功能性成分。
商业化的胶原蛋白肽平均分子量多在1000～3000道尔顿，研究表明其吸收率并不是很高，且在酸性条件下胶原蛋白肽容易发生变性、析出及沉淀，这影响了胶原蛋白肽产品的稳定性及充分发挥胶原蛋白肽功效、吸收的作用。胶原蛋白每日摄入量大概是5g～10g，但目前市售的胶原蛋白肽产品普遍负载量较低，难以满足人群的日常所需。因此需要进一步开发能提高胶原蛋白肽产品的稳定性、吸收率及负载量的技术。在本文中，使用的胶原蛋白肽是商购的胶原蛋白肽，其规格以重均分子量表征，例如实施例中采用的1000、2000、3000或3500道尔顿。
例如，在胶原蛋白肽脂质体中加入20～70份的赋形剂后，可以通过冻干、喷雾干燥等形式制备出胶原蛋白的脂质体粉剂，粉剂中胶原蛋白肽脂质体的含量在25～57％范围内，其应用的范围也较广，可直接作为冲调粉剂，也可应用于片剂、颗粒剂、软胶囊、软糖等保健食品。
制备方法
本发明的脂质体的制备方法可以包括如下步骤：
(1)将磷脂充分溶解溶于水中，记为组分A；
(2)将胶原蛋白溶解于水中，记为组分B；
(3)将A倒入B中进行充分搅拌、混合形成均一体系，之后调节pH为3.5～4.6且均质(例如在400～800bar条件下)两次，制得液体脂质体；
(4)将(3)液体脂质体直接经高温灭菌(例如80～100℃下，10～40min)。
本发明的方法也可以进一步包括以下步骤的一个或多个：
(1)可在液体脂质体中加入赋形剂(例如20～70份)；赋形剂包括胶体，再通过例如高剪切、胶体磨、高压均质等方式充分分散后，获得胶原蛋白肽脂质体凝胶；
(2)可在液体脂质体中加入赋形剂(例如20～70份)，赋形剂包括麦芽糊精、环糊精、淀粉、糖醇、糖浆、乳清蛋白等，充分混合均匀后，通过冷冻干燥、喷雾干燥等方式去除水分，即获得胶原蛋白肽脂质体粉剂。
实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。若无特殊标明，所列出的量均基于总重并以重量份数描述。本申请不应解释为受限于所述的具体实施例。
1.材料与设备
物料：胶原蛋白肽，磷脂，酸味剂，赋形剂
设备：均质机，高效液相色谱，喷雾干燥仪，粒径仪，pH计，水浴锅2.制备方法
制备方法，包括如下步骤：
(1)将磷脂充分溶解溶于水中，记为组分A；
(2)将胶原蛋白溶解于水中，记为组分B；
(3)将A倒入B中进行搅拌、混合形成均一体系，之后调节pH为3.5～4.6且在400～800bar条件下均质两次，制得液体脂质体；
(4)将液体脂质体高温灭菌(80～100℃下，10～40min)
可在液体型胶原蛋白肽脂质体中加入20～70份胶体(黄原胶)，再通过例如高剪切、胶体磨、高压均质等方式充分分散后，获得胶原蛋白肽脂质体凝胶。或者，可在液体型胶原蛋白肽脂质体中加入20～70份麦芽糊精、环糊精、淀粉、糖醇、糖浆、乳清蛋白等，充分混合均匀后，通过冷冻干燥、喷雾干燥等方式去除水分，即获得胶原蛋白肽脂质体粉剂。
3.测试方法
3.1外观稳定性评价
将胶原蛋白肽脂质体样品在90℃下灭菌30min后，观察其析出或分层的严重程度，如图2所示，从右到左析出或分层的程度依次递增。
评价指标如下(从左到右)：
++：灭菌后液面有明显分层或析出，溶液变浑浊；
+：灭菌后液面有较明显的析出或分层，溶液略微浑浊；
-：灭菌后液面无析出或分层，溶液澄清透亮。
3.2粒径及电位
取制备的胶原蛋白肽脂质体样品在90℃下灭菌30min后测定粒径和电位。
粒径测定采用马尔文纳米粒度仪，具体操作为：先将样品加热至60℃，沿边缘将样品注入比色皿2-3mL，确保粒径比色皿内的样品无空气，每个样品测试三次，取平均值，即为胶原蛋白肽脂质体的粒径。
电位的测定采用马尔文纳米粒度仪，具体操作为：清洗干净电位皿，再装载样品测定样品电位值。
3.3稳定性测试
取灭菌后胶原蛋白肽脂质体样品，采用不稳定系数测定仪，具体操作为：系统设置为转速为4000rpm，时间2h，放入样品后运行系统。根据不稳定性系数大小判断样品的稳定性，不稳定性系数越小时，稳定性越好。胶原蛋白肽脂质体样品在不稳定性系数大于0.2时即出现分层析出的现象。
3.4形态表征
采用扫描电镜进行液体、凝胶及粉末胶原蛋白肽脂质体的形态表征，显示样品的电镜扫描图。
3.5包封率检测
取等同于50mg胶原蛋白肽的样品(灭菌后)于超速离心机中13万rpm离心1小时，其上层即为包封胶原蛋白肽的脂质体层。取上层及样品于自动凯式定氮仪测定蛋白含量，并计算结果。
包封率＝(X1*M1)/(X2*M2)
X1：上层脂质体层蛋白含量，单位为mg/g
X2：样品蛋白含量，单位为mg/g
M1：上层脂质体层，质量单位为g
M2：取样的质量，单位为g
3.6磷脂成分的检测方法
磷脂中磷脂酰胆碱(Phosphatidyl cholines，PC)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositols，PI)依据高效液相色谱法(通则0512)测定。
色谱条件：用硅胶为填充剂(色谱柱Alltima Sillica，250mm×4.6mm×5μm)，柱温为40℃；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85：15：0.45：0.05，V/V)为流动相A，以正己烷-异丙醇-流动相A(20：48：32，V/V)为流动相B；流速为每分钟1ml；按下表进行梯度洗脱，流动相色谱条件如表1所示；检测器为蒸发光散射检测器(参考条件：漂移管温度为72℃；载气流量为每分钟2.0ml)。
表1：磷脂PC、PI检测流动相
取PC、PI对照品各适量，用三氯甲烷-甲醇(2：1)溶解，制成每1mL含上述对照品分别为50μg、100μg、200μg的混合溶液，取上述溶液20μL注入液相色谱仪，各成分按上述顺序依次洗脱，各成分分离度应符合规定，理论板数按PC、PI计算应不低于1500。
测定法：分别称取PC、PI对照品适量，精密称定，用三氯甲烷-甲醇(2：1)溶解，绘制标准曲线。精密量取上述对照品溶液各20μL注入液相色谱仪中，记录色谱图，以对照品溶液浓度的对数值与相应的峰面积对数值计算回归方程，另精密称取本品约15mg，置50mL量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(2：1)溶解并稀释至刻度。取供试溶液20μL注入液相色谱仪中，记录色谱图，由回归方程计算PC、PI的含量。
实施例1：磷脂的筛选
根据表2的配方制备样品(以重量份数计)，其中磷脂采用不同的PC、PI含量，不同PC含量规格的磷脂检测PC、PI含量检测方法如上文3.6所示，结果如表2所示，评估胶原蛋白肽脂质体样品的粒径、Zeta电位、不稳定系数、外观稳定性、包封率。
结果显示，低PC含量、高PI含量的磷脂(PC15％，PI30％的磷脂；PC30％，PI18％的磷脂)所制备的胶原蛋白肽脂质体的稳定性更好，表现为粒径、电位绝对值和不稳定性指数较小，包封率较高；当PC含量提高、PI减小时，制备出来的胶原蛋白肽脂质体的粒径、电位绝对值和不稳定性指数增大，包封率降低。图3、4、5为组合物1的胶原蛋白脂质体的液体、凝胶、粉剂，液体呈透明淡黄色，凝胶为黄色半固状，粉剂为白色粉末。图6为组合物1制备的粉剂溶于水后的状态。图7、8为液体胶原蛋白肽脂质体的电镜扫描图，呈规则球形，其粒径大小与检测结果相吻合。图9、10为胶原蛋白脂质体凝胶的电镜扫描图，视野可观察到规则球形的脂质体颗粒。图11为胶原蛋白脂质体粉剂的电镜扫描图，可观察到壁材包裹住圆形规则的脂质体颗粒，可见较大囊状球形颗粒包裹多个小型颗粒的双层保护结构，圆形颗粒的粒径大小与脂质体相吻合。
表2：磷脂的筛选
注：表格中“/”表示对应实施例不含该成分。
实施例2：考察胶原蛋白分子量对脂质体的影响
根据表3的配方制备样品(以重量份数计)，其中胶原蛋白采用不同分子量，结果如表3所示，评估胶原蛋白肽脂质体样品的粒径、Zeta电位、不稳定系数、外观稳定性、包封率。
结果显示，当胶原蛋白肽的分子量减少时，同等质量下的胶原蛋白肽分子数增多，外层结构中与磷脂结合的胶原蛋白肽分子数增多，增大了胶原蛋白肽脂质体结构的稳定性，表现为粒径、电位绝对值和不稳定系数小，外观透明均匀，包封率提高；当分子量增大时，同等质量下的胶原蛋白肽分子数减小，外层结构中与磷脂结合的胶原蛋白肽分子数降低，胶原蛋白肽脂质体结构的稳定性降低，在低pH体系中其结构易被破坏，表现为粒径、电位绝对值和不稳定系数增大，外观上分层析出，包封率降低。
表3：胶原蛋白的筛选
注：表格中“/”表示对应实施例不含该成分。
实施例3：考察胶原蛋白肽添加量对脂质体的影响
根据表4的配方制备样品(以重量份数计)，其中采用不同的胶原蛋白肽添加量，评估胶原蛋白肽脂质体样品的粒径、Zeta电位、不稳定系数、外观稳定性、包封率。
结果显示，在一定程度上，胶原蛋白肽的添加量提高后，外层与磷脂结合的胶原蛋白肽量会增多，其包封率会下降，但稳定性会提高，表现为粒径、电位绝对值和不稳定系数减小，外观状态稳定升高；当胶原蛋白肽的量太少时，包封率提高，但外层与磷脂结合的量少了，稳定性变差，在低pH体系中容易分层析出，表现为粒径、电位绝对值和不稳定系数增大；而胶原蛋白肽在水中具有一定溶解限度，超过该限度后，制备出来的胶原蛋白肽脂质体结构稳定性变差，包封率降低，粒径、电位绝对值和不稳定性系数增大，包封率降低。
表4：胶原蛋白不同添加量对脂质体的影响
实施例4：考察磷脂添加量对脂质体的影响
根据表5的配方制备样品(以重量份数计)，其中采用不同的磷脂添加量，评估胶原蛋白肽脂质体样品的粒径、Zeta电位、不稳定系数、外观稳定性、包封率。
结果显示，磷脂配比在5-10％的比例范围内时，胶原蛋白肽的比例较高，与外层与磷脂结合的胶原蛋白肽的量增多，稳定性提高，胶原蛋白肽脂质体的包封率在50％左右，粒径、电位绝对值和不稳定系数较小，外观透明均匀；当磷脂的量减少时，达不到形成脂质体结构所需的量，包封率低，稳定性差，表现为粒径、电位绝对值和不稳定系数增大，出现分层析出的现象；而当磷脂含量较高时，相应胶原蛋白肽的比例降低，稳定性减小，同样表现为粒径、电位绝对值和不稳定系数增大，出现分层析出的现象。
表5：磷脂的不同添加量对脂质体的影响
实施例5：胶原蛋白肽脂质体的应用
按照表6的各组分配方量，各添加30份麦芽糊精、20份分离乳清蛋白和10份赤藓糖醇溶解完全后，控制进风温度120℃及出风温度60℃进行喷雾干燥去除水分制备得到粉剂，并测试各粉剂的复溶性，结果如表6。
结果显示，在限定的配方比例范围内，使用PC含量在30以下的磷脂和分子量在3000Da以下的胶原蛋白肽所制备的脂质体粉剂复溶性更好。
表6：胶原蛋白肽脂质体粉剂复溶性实验
注：表格中“/”表示对应实施例不含该成分。
实施例6：多肽脂质体的应用
根据表7的配方制备样品(以重量份数计)，其中采用不同种类的多肽，评估多肽脂质体样品的粒径、Zeta电位、不稳定系数、外观稳定性、包封率。
结果显示，在限定的配方比例范围内，不同种类多肽制备的脂质体均具有较好稳定性。
表7：不同多肽脂质体的制备
实施例7：pH对多肽脂质体的影响。
根据表8的配方制备样品(以重量份数计)，其中采用不同柠檬酸添加量，评估pH值对多肽脂质体样品的粒径、Zeta电位、不稳定系数、外观稳定性、包封率。
结果显示，在限定的配方比例范围内，pH在3.5～4.6的多肽脂质体具有较好的稳定性。
表8：不同pH对多肽脂质体的影响
组合物28 组合物29 组合物30 组合物31
胶原蛋白肽(1000Da) 33 33 33 33
磷脂(PC15％，PI30％) 5 5 5 5
柠檬酸 3 5 8 10
水 50 50 50 50
pH 4.6 3.90 3.50 3.0
粒径Dx(50)/μm 0.341 0.424 0.524 2.264
电位/mV 1.21 1.57 1.89 4.43
不稳定性系数 0.035 0.025 0.031 0.242
外观稳定性 - - - +
包封率(％) 50.24 52.56 51.56 30.83
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。

Claims (54)

1.脂质体组合物，其包含26~40重量份的多肽、5~10重量份的磷脂、3~8重量份的酸味调节剂和水，并且具有pH 3.5~4.6，其中多肽的重均分子量为3000Da以下，并且磷脂中磷脂酰胆碱含量为15~30%并且磷脂酰肌醇含量为18~35%；其中所述多肽是胶原蛋白肽、海参肽、玉米多肽和核桃多肽中的一种或多种。
2.根据权利要求1的脂质体组合物，其中磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的总量不超过45%。
3.根据权利要求1的脂质体组合物，其中磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的总量不超过46%。
4.根据权利要求1的脂质体组合物，其中磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的总量不超过47%。
5.根据权利要求1的脂质体组合物，其中磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的总量不超过48%。
6.根据权利要求1的脂质体组合物，其中磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的总量不超过49%。
7.根据权利要求1的脂质体组合物，其中磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的总量不超过50%。
8.根据权利要求1-7中任一项的脂质体组合物，其中磷脂选自包含15%磷脂酰胆碱和30%磷脂酰肌醇的磷脂或包含30%磷脂酰胆碱和18%磷脂酰肌醇的磷脂。
9.根据权利要求1-7中任一项的脂质体组合物，其中多肽的重均分子量为200-2900Da,。
10.根据权利要求9的脂质体组合物，其中多肽的重均分子量为300-2800Da。
11.根据权利要求10的脂质体组合物，其中多肽的重均分子量为300-2700Da。
12.根据权利要求11的脂质体组合物，其中多肽的重均分子量为300-2500Da。
13.根据权利要求12的脂质体组合物，其中多肽的重均分子量为300-2000Da。
14.根据权利要求13的脂质体组合物，其中多肽的重均分子量为300-1500Da。
15.根据权利要求14的脂质体组合物，其中多肽的重均分子量为300-1000Da。
16.根据权利要求1-7中任一项的脂质体组合物，其中多肽为26-35重量份。
17.根据权利要求16的脂质体组合物，其中多肽为26-34重量份。
18.根据权利要求17的脂质体组合物，其中多肽为26-33重量份。
19.根据权利要求1-7中任一项的脂质体组合物，其中酸味调节剂为4~8重量份。
20.根据权利要求1-7中任一项的脂质体组合物，其中脂质体组合物具有pH 3.5~4.5。
21.根据权利要求20的脂质体组合物，其中脂质体组合物具有pH 3.5~4。
22.根据权利要求21的脂质体组合物，其中脂质体组合物具有pH 3.5~3.95。
23.根据权利要求22的脂质体组合物，其中脂质体组合物具有pH 3.5~3.9。
24.根据权利要求1-7中任一项的脂质体组合物，其中脂质体组合物包含41-53重量份的水。
25.根据权利要求24的脂质体组合物，其中脂质体组合物包含45-52重量份的水。
26.根据权利要求25的脂质体组合物，其中脂质体组合物包含48-51重量份的水。
27.根据权利要求1-7中任一项的脂质体组合物，其中胶原蛋白肽具有500-3000Da的重均分子量；
海参肽具有200-3000Da的重均分子量；
玉米多肽具有200-3000Da的重均分子量；
核桃多肽具有200-3000Da的重均分子量。
28.根据权利要求27的脂质体组合物，其中胶原蛋白肽具有800-2500的重均分子量；
海参肽具有300-2000Da的重均分子量；
玉米多肽具有250-2000Da的重均分子量；或
核桃多肽具有300-2000Da的重均分子量。
29.根据权利要求28的脂质体组合物，其中胶原蛋白肽具有900-2100的重均分子量；
海参肽具有350-1000Da的重均分子量；
玉米多肽具有300-1000Da的重均分子量；或
核桃多肽具有350-1000Da的重均分子量。
30.根据权利要求29的脂质体组合物，其中胶原蛋白肽具有1000-2000的重均分子量；
海参肽具有400-800Da的重均分子量；
玉米多肽具有350-800Da的重均分子量；或
核桃多肽具有500-700Da的重均分子量。
31.根据权利要求1-7中任一项所述的脂质体组合物，其包含赋形剂、抗氧化剂、水溶性成分中的一种或多种。
32.根据权利要求1-7中任一项的脂质体组合物，其不包含以下一种或多种成分：胆固醇、乙醇和吐温。
33.根据权利要求1-7中任一项的脂质体组合物，其中酸味调节剂包括食用磷酸、乳酸、柠檬酸和苹果酸的一种或几种。
34.根据权利要求1-7中任一项的脂质体组合物，所述脂质体组合物包含20~70重量份的赋形剂。
35.根据权利要求34的脂质体组合物，所述脂质体组合物包含30-60重量份的赋形剂。
36.根据权利要求34的脂质体组合物，所述脂质体组合物包含40-55重量份的赋形剂。
37.根据权利要求31所述的脂质体组合物，其中赋形剂是胶体、麦芽糊精、环糊精、淀粉、糖醇、糖浆和乳清蛋白的一种或多种，和/或水溶性成分是水溶性维生素。
38.根据权利要求37所述的脂质体组合物，其中糖醇为赤藓糖醇。
39.根据权利要求37所述的脂质体组合物，其中赋形剂是麦芽糊精、乳清蛋白和赤藓糖醇。
40.根据权利要求37所述的脂质体组合物，其中胶体是植物胶或动物胶。
41.根据权利要求37所述的脂质体组合物，其中胶体是黄原胶、阿拉伯胶、魔芋胶、瓜尔胶、卡拉胶、刺槐豆胶、果胶、明胶的一种或多种。
42.制备权利要求1-41中任一项所述的脂质体组合物的方法，其包括将脂质体组合物的各组分混合并且均质形成脂质体液。
43.根据权利要求42的方法，其中通过剪切、胶体磨、高压进行均质。
44.根据权利要求43的方法，其中在400~800 bar的条件下进行均质。
45.制备脂质体剂型的方法，其中所述方法包括根据权利要求42-44中任一项所述的方法，并且还包括以下步骤中的一个或多个：
对脂质体液进行高温灭菌，制得经灭菌的液态脂质体；或者
对脂质体液添加胶体赋形剂，并且充分分散，高温灭菌后得到脂质体凝胶；或者
对脂质体液添加赋形剂，混合后高温灭菌，然后干燥，得到脂质体粉末；其中赋形剂是麦芽糊精、环糊精、淀粉、糖醇、糖浆和乳清蛋白中的一种或多种。
46.根据权利要求45的方法，其中高温灭菌是80~100℃处理10~40分钟。
47.根据权利要求46的方法，其中高温灭菌是85-95℃处理。
48.根据权利要求46的方法，其中高温灭菌是90-95℃处理。
49.根据权利要求46的方法，其中高温灭菌处理10-30分钟。
50.脂质体液，其通过根据权利要求42-44中任一项所述的方法制备。
51.脂质体剂型，其由根据权利要求50所述的脂质体液制备，其中所述脂质体剂型是溶液剂、凝胶剂、粉末、片剂、软胶囊或软糖。
52.脂质体剂型，其是通过权利要求45-49中任一项所述的方法制备的液态脂质体、脂质体凝胶或脂质体粉末。
53.根据权利要求51或52所述的脂质体剂型在制备食品或化妆品中的用途或者在制备药品中的用途。
54.根据权利要求53的用途，其中食品是保健品。
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