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CN116096906A - 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途 - Google Patents

工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途 Download PDF

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CN116096906A
CN116096906A CN202180053084.3A CN202180053084A CN116096906A CN 116096906 A CN116096906 A CN 116096906A CN 202180053084 A CN202180053084 A CN 202180053084A CN 116096906 A CN116096906 A CN 116096906A
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CN
China
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virus
protein
cancer
saenox
polynucleotides
Prior art date
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Pending
Application number
CN202180053084.3A
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English (en)
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D·R·施密特
N·A·纳加拉詹
W·J·凯泽
P·J·高夫
S·达卡尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Flagship Entrepreneurship And Innovation Co 5
Original Assignee
Flagship Entrepreneurship And Innovation Co 5
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

在某些方面，本披露涉及一种被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒。萨诺传递是细胞之间的通讯，它是靶细胞中细胞周转通路激活的结果，该通路发信号通知应答细胞以进行生物应答。还披露了促进靶细胞的萨诺传递的方法、促进受试者中的免疫应答的方法和治疗受试者中的癌症的方法。

Description

工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途
相关申请
本申请要求2020年6月29日提交的美国临时申请号63/045,610和2021年3月31日提交的美国临时申请号63/169,166的优先权，其中每个的全部内容通过援引明确并入本文。
背景技术
在后生动物中，程序性细胞死亡是维持组织稳态和消除潜在有害细胞的重要的遗传程序性过程。
发明内容
萨诺传递(thanotransmission)是细胞之间(例如靶信号传导细胞与应答细胞之间)的通讯过程，它是靶细胞中细胞周转通路激活的结果，该通路发信号通知应答细胞以进行生物应答。可通过例如使靶细胞与本文所述的工程化病毒接触来调节细胞周转通路基因，从而在靶细胞中诱导萨诺传递。细胞周转通路已被激活的靶细胞可通过由靶细胞主动释放的因子，或通过在靶细胞周转(例如，细胞死亡)期间暴露于应答细胞的靶细胞的细胞内因子来发信号通知应答细胞。
在某些方面，本披露涉及一种被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒。在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸对该病毒是异源的。在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸对该靶细胞是异源的。在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸通过增加萨诺传递多肽在靶细胞中的表达或活性来促进该靶细胞的萨诺传递。在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码萨诺传递多肽。在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸通过降低抑制萨诺传递的多肽在该靶细胞中的表达或活性来促进该靶细胞的萨诺传递。在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码降低抑制萨诺传递的多肽在该靶细胞中的表达或活性的RNA分子。在一个实施例中，靶细胞中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸的表达改变靶细胞中的细胞周转通路。在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码野生型蛋白质。
在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码死亡折叠结构域(death fold domain)。在一个实施例中，该死亡折叠结构域选自由以下组成的组：死亡结构域、热蛋白结构域(pyrin domain)、死亡效应子结构域(DED)、C-末端半胱天冬酶募集结构域(CARD)以及它们的变体。在一个实施例中，该死亡结构域来自选自由以下组成的组的蛋白质：具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)、Fas、肿瘤坏死因子受体1型相关死亡结构域(TRADD)、肿瘤坏死因子受体1型(TNFR1)以及它们的变体。在一个实施例中，该热蛋白结构域来自选自由以下组成的组的蛋白质：NLR家族含热蛋白结构域蛋白3(NLRP3)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)。在一个实施例中，该死亡效应子结构域(DED)来自选自由以下组成的组的蛋白质：具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10。
在一个实施例中，该CARD来自选自由以下组成的组的蛋白质：RIP相关ICH1/CED3同源蛋白(RAIDD)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、线粒体抗病毒信号传导蛋白(MAVS)、半胱天冬酶-1以及它们的变体。在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码Toll/白介素-1受体(TIR)结构域。在一个实施例中，该TIR结构域来自选自由以下组成的组的蛋白质：髓样分化初级应答蛋白88(MyD88)、含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)、Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体4(TLR4)、含TIR结构域的衔接蛋白(TIRAP)和易位链相关膜蛋白(TRAM)
在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码包含TIR结构域的蛋白质。在一个实施例中，包含TIR结构域的蛋白质选自由以下组成的组的蛋白质：髓样分化初级应答蛋白88(MyD88)、含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)、Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体4(TLR4)、含TIR结构域的衔接蛋白(TIRAP)和易位链相关膜蛋白(TRAM)。
在一个实施例中，该一种或多种多核苷酸编码以下中的任一项或多项：受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)、Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)、混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)、含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)、仅包含TIR结构域和RHIM结构域的TRIF的N-末端截短物、干扰素调节因子3(IRF3)、具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)、截短的FADD、肿瘤坏死因子受体1型相关死亡结构域(TRADD)和细胞FLICE(FADD样IL-1β转化酶)抑制蛋白(c-FLIP)。
在一个实施例中，编码ZBP1的多核苷酸包含受体相互作用蛋白同型相互作用基序(RHIM)C的缺失、RHIM D的缺失和Zα1结构域的N-末端处的缺失。在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸抑制受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RIPK1)的表达或活性。
在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码促融合蛋白。在一个实施例中，该促融合蛋白是来自长臂猿白血病病毒(GALV)的糖蛋白，并且其R跨膜肽发生突变或被去除(GALV-R-)。在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码免疫刺激性蛋白。在一个实施例中，该免疫刺激性蛋白是转化生长因子β(TGF-β)的拮抗剂、集落刺激因子、细胞因子或免疫检查点调节剂。在一个实施例中，该集落刺激因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一个实施例中，将编码GM-CSF的该多核苷酸插入该病毒的ICP34.5基因座中。在一个实施例中，该细胞因子是白介素。在一个实施例中，该白介素选自由以下组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-24、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ。在一个实施例中，该细胞因子选自由以下组成的组：I型干扰素、干扰素γ、III型干扰素和TNFα。
在一个实施例中，该免疫检查点调节剂是抑制性免疫检查点蛋白的拮抗剂。在一个实施例中，该抑制性免疫检查点蛋白选自由以下组成的组：ADORA2A、B7-H3、B7-H4、IDO、KIR、VISTA、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、Tim3、BTLA和CTLA4。在一个实施例中，该免疫检查点调节剂是刺激性免疫检查点蛋白的激动剂。在一个实施例中，该刺激性免疫检查点蛋白选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS和4-1BB。在一个实施例中，该刺激性免疫检查点蛋白的该激动剂选自CD40配体(CD40L)、ICOS配体、GITR配体、4-1-BB配体、0X40配体以及它们中任一种的修饰形式。在一个实施例中，该刺激性免疫检查点蛋白的该激动剂是选自CD40、ICOS、GITR、4-1-BB和0X40的蛋白质的抗体激动剂。在一个实施例中，该免疫刺激性蛋白是flt3配体、或flt3的抗体激动剂。
在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸是自杀基因。在一个实施例中，该自杀基因编码选自由以下组成的组的多肽：FK506结合蛋白(FKBP)-FAS、FKBP-半胱天冬酶-8、FKBP-半胱天冬酶-9、具有胞嘧啶脱氨酶(CDase)活性的多肽、具有胸苷激酶活性的多肽、具有尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)活性的多肽和具有嘌呤核苷磷酸化酶活性的多肽。在一个实施例中，具有CDase活性的该多肽是FCY1、FCA1或CodA。在一个实施例中，具有UPRTase活性的该多肽是FUR1或其变体。在一个实施例中，FUR1的该变体是FUR1Δ105。在一个实施例中，该自杀基因编码具有CDase和UPRTase活性的嵌合蛋白。在一个实施例中，该嵌合蛋白选自由以下组成的组：codA::upp、FCY1::FUR1、FCYl::FUR1Δ105(FCU1)和FCU1-8多肽。
在一个实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码选自由以下组成的组的多肽：消皮素(gasdermin)-A(GSDM-A)、消皮素-B(GSDM-B)、消皮素-C(GSDM-C)、消皮素-D(GSDM-D)、消皮素-E(GSDM-E)、含有具有二聚化结构域的C-末端半胱天冬酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC-CARD)以及它们的突变体。
在一些实施例中，该一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸编码两种或更多种不同的萨诺传递多肽，其中该两种或更多种萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRADD、TRAF2、TRAF6、cIAP1、cIAP2、XIAP、NOD2、MyD88、TRAM、HOIL、HOIP、Sharpin、IKKg、IKKa、IKKb、RelA、MAVS、RIGI、MDA5、Tak1、TBK1、IKKe、IRF3、IRF7、IRF1、TRAF3、半胱天冬酶、FADD、TNFR1、TRAILR1、TRAILR2、FAS、Bax、Bak、Bim、Bid、Noxa、Puma、TRIF、ZBP1、RIPK1、RIPK3、MLKL、消皮素A、消皮素B、消皮素C、消皮素D、消皮素E、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFSF)蛋白、它们的变体以及它们的功能片段。在一些实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码包含这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽的嵌合蛋白。在一些实施例中，这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸被转录为编码两种或更多种不同萨诺传递多肽的单一转录物。
在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽激活NF-kB。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽促进外在凋亡。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽促进程序性坏死。在一些实施例中，由该一种或多种萨诺传递多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活NF-kB，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活NF-kB，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进外在凋亡。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活NF-kB，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进程序性坏死。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进外在凋亡。在一些实施例中，由该一种或多种萨诺传递多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进程序性坏死。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进外在凋亡，并且由该一种或多种萨诺传递多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进程序性坏死。在一些实施例中，程序性坏死包括坏死性凋亡。在一些实施例中，程序性坏死包括细胞焦亡。
在一些实施例中，激活NF-kB的萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、TRADD、TRAF2、TRAF6、cIAP1、cIAP2、XIAP、NOD2、MyD88、TRAM、HOIL、HOIP、Sharpin、IKKg、IKKa、IKKb、RelA、MAVS、RIGI、MDA5、Tak1、TNFSF蛋白以及它们的功能片段。在一些实施例中，激活IRF3和/或IRF7的萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、MyD88、MAVS、TBK1、IKKe、IRF3、IRF7、IRF1、TRAF3以及它们的功能片段。在一些实施例中，促进外在凋亡的萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、RIPK1、半胱天冬酶，FADD、TRADD、TNFR1、TRAILR1、TRAILR2、FAS、Bax、Bak、Bim、Bid、Noxa、Puma以及它们的功能片段。在一些实施例中，促进程序性坏死的萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、ZBP1、RIPK1、RIPK3、MLKL、消皮素以及它们的功能片段。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含TRIF或其功能片段。在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段。在一些实施例中，由该一种或多种萨诺传递多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含TRIF或其功能片段，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段。在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含MAVS或其功能片段，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段。
在一些实施例中，该一种或多种多核苷酸进一步编码抑制半胱天冬酶活性的多肽。在一些实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽选自由以下组成的组：FADD显性负性突变体(FADD-DN)、cFLIP、vICA、半胱天冬酶8显性负性突变体(Casp8-DN)、cIAP1、cIAP2、Tak1、IKK以及它们的功能片段。在一些实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽是FADD-DN。在一些实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽是cFLIP。在一些实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽是vICA。
在一些实施例中，病毒编码至少一种消皮素或其功能片段。在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含TRIF或其功能片段，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含消皮素或其功能片段。在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含MAVS或其功能片段，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含消皮素或其功能片段。在一些实施例中，消皮素是消皮素E或其功能片段。
在一些实施例中，病毒进一步包含至少一种编码二聚化结构域的多核苷酸。在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含在进一步包含二聚化结构域的融合蛋白内。在一些实施例中，二聚化结构域对萨诺传递多肽是异源的。
在某些方面，本披露涉及一种包含本文披露的病毒中的一种或多种和药学上可接受的载剂的药物组合物。在某些方面，本披露涉及一种向受试者递送一种或多种萨诺传递多核苷酸的方法，该方法包括向该受试者施用药物组合物。在某些方面，本披露涉及一种促进受试者中的萨诺传递的方法，该方法包括以足以促进萨诺传递的量和时间向受试者施用药物组合物。在某些方面，本披露涉及一种增加有需要的受试者中的免疫应答的方法，该方法包括以足以增加该受试者中的免疫应答的量和时间向该受试者施用药物组合物。在某些方面，本披露涉及一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括以足以治疗癌症的量和时间向该受试者施用药物组合物。
在一个实施例中，向该受试者施用药物组合物减少受试者中癌细胞的增殖。在一个实施例中，癌细胞的增殖是由施用于受试者的癌症疗法导致的癌细胞的过度增殖。在一个实施例中，向受试者施用药物组合物减少受试者中癌细胞的转移。在一个实施例中，向受试者施用药物组合物减少受试者中肿瘤的新血管形成。在一个实施例中，治疗癌症包括以下中的任一项或多项：肿瘤负荷的减少、肿瘤大小的减小、肿瘤生长的抑制、在治疗前患有进展性癌症的受试者中达到稳定的癌症、癌症进展时间的延后以及存活时间的增加。
在一个实施例中，将药物组合物静脉内施用于受试者。在一个实施例中，将药物组合物肿瘤内施用于受试者。在一个实施例中，该受试者先前用免疫疗法治疗。在一个实施例中，癌症对免疫疗法无应答。在一个实施例中，癌症是对免疫疗法有应答的癌症。在一个实施例中，相对于施用免疫疗法但不施用病毒的受试者，向受试者施用药物组合物改善癌症对免疫疗法的应答。在一个实施例中，免疫疗法是免疫检查点疗法。在一个实施例中，该免疫检查点疗法是免疫检查点抑制剂疗法。
在一个实施例中，癌症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤和白血病。在一个实施例中，癌症是实体瘤。在一个实施例中，癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肉瘤、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、胃食管癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、肝细胞癌、恶性间皮瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓发育不良综合征、多发性骨髓瘤、移行细胞癌、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、维尔姆斯瘤和肝细胞癌。在一个实施例中，癌症是结肠癌。
在一个实施例中，该方法进一步包括向受试者施用抗肿瘤剂。在一个实施例中，抗肿瘤剂是化学治疗剂。在一个实施例中，抗肿瘤剂是生物剂。在一个实施例中，生物剂是抗原结合蛋白。在一个实施例中，抗肿瘤剂是免疫治疗剂。在一个实施例中，免疫治疗剂选自由以下组成的组：Toll样受体(TLR)激动剂、基于细胞的疗法、细胞因子、癌症疫苗和免疫检查点分子的免疫检查点调节剂。在一个实施例中，TLR激动剂选自科利毒素(Coley’stoxin)和卡介苗(Bacille Calmette-Guérin)(BCG)。在一个实施例中，基于细胞的疗法是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)疗法。在一个实施例中，免疫检查点分子选自CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、4-1BB、ADORA2A、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA。在一个实施例中，免疫检查点分子是刺激性免疫检查点分子，并且免疫检查点调节剂是刺激性免疫检查点分子的激动剂。在一个实施例中，免疫检查点分子是抑制性免疫检查点分子，并且免疫检查点调节剂是抑制性免疫检查点分子的拮抗剂。在一个实施例中，免疫检查点调节剂选自小分子、抑制性RNA、反义分子和免疫检查点分子结合蛋白。在一个实施例中，免疫检查点分子是PD-1，并且免疫检查点调节剂是PD-1抑制剂。在一个实施例中，PD-1抑制剂选自派姆单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、SHR-1210、MEDI0680R01、BBg-A317、TSR-042、REGN2810和PF-06801591。在一个实施例中，免疫检查点分子是PD-L1，并且免疫检查点调节剂是PD-L1抑制剂。在一个实施例中，PD-L1抑制剂选自度伐鲁单抗、阿特利珠单抗、阿维鲁单抗、MDX-1105、AMP-224和LY3300054。在一个实施例中，免疫检查点分子是CTLA-4，并且免疫检查点调节剂是CTLA-4抑制剂。在一个实施例中，CTLA-4抑制剂选自艾匹利木单抗、曲美利木单抗、JMW-3B3和AGEN1884。
在一个实施例中，抗肿瘤剂是组蛋白脱乙酰酶抑制剂。在一个实施例中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂是异羟肟酸、苯甲酰胺、环四肽、缩酚酸肽、亲电酮或脂族化合物。在一个实施例中，异羟肟酸是伏立诺他(SAHA)、贝利司他(belinostat)(PXD101)、LAQ824、曲古抑菌素A或帕比司他(panobin ostat)(LBH589)。在一个实施例中，苯甲酰胺是恩替司他(entinostat)(MS-275)、01994或莫替司他(mocetinostat)(MGCD0103)。在一个实施例中，环四肽是曲普欣(trapoxin)B。在一个实施例中，脂肪酸是丁酸苯酯或丙戊酸。
在一些实施例中，病毒不是腺病毒或腺相关病毒(AAV)。在一些实施例中，病毒是溶细胞的。在一些实施例中，病毒优先感染分裂细胞。在一些实施例中，病毒能够再感染先前被感染的宿主。在一些实施例中，病毒不包含编码合成多聚化结构域的多核苷酸。在一些实施例中，病毒不是痘苗病毒。在一些实施例中，病毒不包含编码TRIF的多核苷酸。
在一个实施例中，在靶细胞中诱导免疫刺激性细胞周转通路。在一个实施例中，免疫刺激性细胞周转通路选自由以下组成的组：程序性坏死(例如坏死性凋亡或细胞焦亡)、外在凋亡、铁死亡以及它们的组合。在一个实施例中，靶细胞缺乏免疫刺激性细胞周转通路。在一个实施例中，靶细胞在编码受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK1)的基因、编码受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)的基因、编码Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)的基因、编码混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)的基因和编码含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)的基因中的一种或多种中具有失活突变。在一个实施例中，靶细胞具有降低的RIPK1、RIPK3、ZBP1、TRIF和MLKL中的一种或多种的表达或活性。在一个实施例中，靶细胞具有编码RIPK1的基因、编码RIPK3的基因、编码ZBP1的基因、编码TRIF的基因和编码MLKL的基因中的一种或多种的拷贝数损失。在一个实施例中，靶细胞选自由以下组成的组：癌细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞。在一个实施例中，靶细胞是癌细胞。在一个实施例中，癌症是转移性癌症。
在一个实施例中，病毒是溶瘤病毒。在一个实施例中，病毒是DNA复制型病毒。在一个实施例中，病毒是DNA复制型溶瘤病毒。在一个实施例中，病毒优先感染靶细胞。在一个实施例中，病毒在一个或多个内源性病毒基因中包含抑制癌细胞的萨诺传递的失活突变。在一个实施例中，病毒能够将至少4kb的异源多核苷酸转运到靶细胞中。
在一个实施例中，病毒是单纯疱疹病毒(HSV)。在一个实施例中，HSV是HSV1。在一个实施例中，HSV1选自由以下组成的组：Kos、F1、MacIntyre、McKrae和相关毒株。在一个实施例中，HSV在选自由以下组成的组的一个或多个基因中有缺陷：ICP34.5、ICP47、UL24、UL55、UL56。在一个实施例中，每个ICP34.5编码基因被包含可操作地连接到立即早期(IE)启动子的US 11编码基因的多核苷酸盒替代。在一个实施例中，HSV包含痘苗病毒E3L基因的ΔZα突变体形式。在一个实施例中，HSV在ICP6的一种或多种功能中有缺陷。在一个实施例中，ICP6具有受体相互作用蛋白同型相互作用基序(RHIM)结构域的突变。在一个实施例中，ICP6在C-末端具有一个或多个抑制半胱天冬酶-8结合的突变。在一个实施例中，HSV表达US11基因作为立即早期基因。在一个实施例中，缺失ICP47基因，使得US11基因处于ICP47立即早期启动子的控制下。
在一个实施例中，病毒属于痘病毒科。在一个实施例中，属于痘病毒科的病毒选自由以下组成的组：粘液瘤病毒、亚巴样病病毒、浣熊痘病毒、orf病毒和牛痘病毒。在一个实施例中，病毒属于痘病毒科的脊椎动物痘病毒亚科。在一个实施例中，病毒属于脊椎动物痘病毒亚科的正痘病毒属。在一个实施例中，病毒属于正痘病毒属的痘苗病毒种。在一个实施例中，痘苗病毒是选自由以下组成的组的毒株：Dairenl、IHD-J、L-IPV、LC16M8、LC16MO、李斯特(Lister)、LIVP、塔什干(Tashkent)、WR 65-16、惠氏(Wyeth)、安卡拉(Ankara)、哥本哈根(Copenhagen)、天坛(Tian Tan)和WR。在一个实施例中，痘苗病毒被工程化以缺乏胸苷激酶(TK)活性。在一个实施例中，痘苗病毒在J2R基因中具有降低或消除TK活性的失活突变或缺失。在一个实施例中，痘苗病毒被工程化以缺乏核糖核苷酸还原酶(RR)活性。在一个实施例中，痘苗病毒在选自I4L和F4L基因的基因中具有降低或消除RR活性的失活突变或缺失。在一个实施例中，痘苗病毒在E3L基因中有缺陷。在一个实施例中，E3L基因具有导致在癌细胞中诱导坏死性凋亡的突变。在一个实施例中，病毒是腺病毒。在一个实施例中，腺病毒是Ad5/F35。在一个实施例中，腺病毒包含腺病毒早期区域1A(E1A)中的缺失。在一个实施例中，腺病毒包含腺病毒早期区域1B(E1B)中的缺失。在一个实施例中，腺病毒具有工程化到纤维H环中的Arg-Gly-Asp(RGD)基序。
附图说明
图1A示出了重组HSV1的示意图。图1B示出了包含编码RIPK3、ZBP1、MLKL和TRIF的基因的示例性萨诺传递盒(thanotransmission cassette，TC)。
图2示出了包含将编码siRNA或gRNA/Cas9的基因插入HSV1的ICP34.5基因中的重组HSV1的示意图。
图3示出了包含将萨诺传递盒(TC)插入HSV1的ICP34.5基因中和将编码突变RHIM结构域的基因插入HSV1的ICP6基因中的重组HSV1的示意图。
图4A示出了诱导萨诺传递后CT-26小鼠结肠癌细胞的相对活力。图4B示出了单独或与RIPK3和/或消皮素E组合表达TRIF的CT-26小鼠结肠癌细胞的相对活力。
图5A示出了诱导萨诺传递多肽表达后由CT-26小鼠结肠癌细胞生成的细胞周转因子(CTF)对刺激巨噬细胞中IFN相关基因激活的影响。图5B示出了在单独或与RIPK3(cR3)和/或消皮素E(cGE)组合诱导TRIF后由CT-26小鼠结肠癌细胞生成的细胞周转因子(CTF)对刺激巨噬细胞中IFN相关基因激活的影响。在图5A中，Tet诱导型RIPK3被命名为“RIPK3”，并且含有组成型PGK启动子的RIPK3构建体被命名为“PGK_RIPK3”。
图6示出了在诱导TRIF、RIPK3或TRIF和RIPK3表达后由CT-26小鼠结肠癌细胞生成的细胞周转因子(CTF)对刺激骨髓来源树突状细胞(BMDC)中激活标志物的表达的影响。MFI是平均荧光强度。
图7A、图7B和图7C示出了萨诺传递多肽表达对植入有CT-26小鼠结肠癌细胞的小鼠存活的影响。图7B示出了植入有CT-26小鼠结肠癌细胞并用抗PD1抗体处理的小鼠的存活百分比。“CT26-TF”表示单独表达TRIF的CT-26细胞，并且“CT26-P_R3”表示单独表达RIPK3的细胞。
图8A示出了在用来自表达各种萨诺传递有效负荷的U937白血病细胞的细胞培养物处理并用半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-ph)单独地或与RIPK3抑制剂(GSK872)组合处理的THP-1双细胞中的相对NF-kB活性。图8B和图8C示出了在用来自表达各种萨诺传递有效负荷的U937白血病细胞的细胞培养物处理并用半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-ph)单独地或与RIPK3抑制剂(GSK872)组合处理的THP-1双细胞中的相对IRF活性。U937细胞也用多西环素处理以诱导萨诺传递多肽表达，单独地或与B/B同二聚体组合以诱导二聚化。在图8A至图8C中，+表示用多西环素处理的U937细胞，++表示用多西环素和B/B同二聚体处理的U937细胞。
图9A示出了单独或与半胱天冬酶抑制剂组合表达萨诺传递多肽的CT-26小鼠结肠癌细胞的相对活力。图9B示出了在单独或与半胱天冬酶抑制剂组合诱导萨诺传递多肽表达后由CT-26小鼠结肠癌细胞生成的细胞周转因子(CTF)对刺激巨噬细胞中IFN相关基因激活的影响。图9C示出了单独或与半胱天冬酶抑制剂组合的TRIF+RIPK3表达对植入有CT-26小鼠结肠癌细胞的小鼠存活的影响。
具体实施方式
本披露涉及一种被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒。萨诺传递是细胞之间(例如靶信号传导细胞与应答细胞之间)的通讯过程，它是靶细胞中细胞周转通路激活的结果，该通路发信号通知应答细胞以进行生物应答。可通过例如使靶细胞与本文所述的工程化病毒接触来调节细胞周转通路基因，从而在靶细胞中诱导萨诺传递。细胞周转通路已被激活的靶细胞可通过由靶细胞主动释放的因子，或通过在靶细胞周转(例如，细胞死亡)期间暴露于应答细胞的靶细胞的细胞内因子来发信号通知应答细胞。在本披露的各种实施例中，病毒包含的一种或多种多核苷酸通过增加促进萨诺传递的一种或多种多肽的表达或活性和/或通过降低抑制靶细胞中的萨诺传递的一种或多种多肽的表达或活性来促进靶细胞的萨诺传递。
在一些实施例中，病毒被工程化以包含编码仅一种促进萨诺传递的多肽的多核苷酸。在其他实施例中，病毒被工程化以包含一种或多种编码促进萨诺传递的两种或更多种不同的多肽的多核苷酸。在一些实施例中，促进萨诺传递的多肽(例如，该仅一种多肽或该两种或更多种不同的多肽)选自由以下组成的组：TRADD、TRAF2、TRAF6、cIAP1、cIAP2、XIAP、NOD2、MyD88、TRAM、HOIL、HOIP、Sharpin、IKKg、IKKa、IKKb、RelA、MAVS、RIGI、MDA5、Tak1、TBK1、IKKe、IRF3、IRF7、IRF1、TRAF3、半胱天冬酶、FADD、TRADD、TNFR1、TRAILR1、TRAILR2、FAS、Bax、Bak、Bim、Bid、Noxa、Puma、TRIF、ZBP1、RIPK1、RIPK3、MLKL、消皮素A、消皮素B、消皮素C、消皮素D、消皮素E、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFSF)蛋白、它们的变体以及它们的功能片段。
申请人已令人惊讶地发现，对萨诺传递的调节可调节癌细胞(例如，降低癌细胞的活性、生长或活力)。例如，一种或多种促进癌细胞中的萨诺传递的多肽(例如，TRIF和RIPK3，单独地或组合地)的表达降低癌细胞的体外活力。此外，申请人已令人惊讶地证实，携带被工程化以表达一种或多种促进萨诺传递的多肽(例如，单独的TRIF，或与RIPK3组合的TRIF)的癌细胞的受试者与携带未被工程化以表达促进萨诺传递的多肽的癌细胞的受试者相比表现出增加的存活率。特别地，发现促进萨诺传递的两种多肽(TRIF和RIPK3)的组合表达在增加存活方面比单独任一种多肽更有效。TRIF+RIPK3与半胱天冬酶抑制剂(例如FADD-DN或vICA)或消皮素E的组合被证明进一步增加存活。这些结果表明，通过施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒，可减少受试者中的癌细胞生长。例如，工程化病毒可转导癌细胞，导致一种或多种促进萨诺传递的多肽的表达，从而降低癌细胞的活力和/或通过释放免疫刺激性细胞周转因子来促进针对癌细胞的宿主免疫应答。
因此，本披露还涉及促进靶细胞(例如癌细胞)的萨诺传递的方法，该方法包括使靶细胞与被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒接触，其中该靶细胞以足以促进靶细胞萨诺传递的量和时间与病毒接触。还披露了包含工程化病毒的药物组合物。本披露还涉及促进受试者(例如，被诊断患有癌症的受试者)的萨诺传递的方法，该方法包括以足以促进萨诺传递的量和时间向该受试者施用药物组合物。还披露了增加有需要的受试者中的免疫应答的方法，以及治疗有需要的受试者中的癌症的方法。
I.定义
术语“施用(administer、administering或administration)”包括将药物组合物或药剂递送至受试者的系统或递送至受试者内或上的特定区域的任何方法。
如本文所用，“组合施用”、“共同施用”或“组合疗法”应理解为使用分开的配制品或单一药物配制品施用两种或更多种活性剂，或以任何顺序连续施用，使得存在两种(或全部)活性剂在发挥其生物学活性方面重叠的时间段。本文预期一种活性剂(例如被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒)可改善第二治疗剂(例如免疫治疗剂)的活性，例如可使靶细胞(例如癌细胞)对第二治疗剂的活性敏感或可与第二治疗剂具有协同作用。“组合施用”不要求同时、以相同的频率或通过相同的施用通路来施用药剂。如本文所用，“组合施用”、“共同施用”或“组合疗法”包括施用被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒与一种或多种附加的治疗剂(例如免疫治疗剂(例如免疫检查点调节剂))。本文提供了免疫治疗剂的实例。
如本文所用，术语“增加”和“减少”是指相对于参考，调节分别产生参数的更大或更小的量、功能或活性。例如，在施用本文所述的组合物之后，参数(例如，IRF的激活、NFkB的激活、巨噬细胞的激活、肿瘤的大小或生长)相对于施用前参数的量，可以在受试者中增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。通常，在施用已达到所述作用的时间，例如在开始治疗方案后至少一天、一周、一个月、3个月、6个月时，测量施用后的指标。类似地，临床前参数(通过本文所述的组合物，诸如体外细胞的NFkB或IRF激活和/或测试哺乳动物的肿瘤负荷的减少)相对于施用前参数的量，可增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多。
如本文所用，“抗肿瘤剂”是指用于治疗癌症的药物。抗肿瘤剂包括化学治疗剂(例如，烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂皮质类固醇和酶)、生物抗癌剂和免疫检查点调节剂。
“癌症治疗方案”或“抗肿瘤方案”是临床上可接受的用于治疗癌症的给药方案，其包括以特定的时间表以特定的量向受试者施用一种或多种抗肿瘤剂。
如本文关于多肽所用的术语“功能片段”是指保留多肽的至少一种生物活性(例如促进萨诺传递的能力)的多肽的一部分。在一些实施例中，功能片段是多肽的结构域，例如多肽的死亡折叠结构域、死亡结构域、热蛋白结构域、死亡效应子结构域(DED)或C-末端半胱天冬酶募集结构域(CARD)。在一些实施例中，多肽的功能片段是保留结构域的至少一种生物活性的该结构域的一部分。
术语“融合蛋白”和“嵌合蛋白”在本文中可互换使用，是指包含至少两种在自然界中不存在于同一蛋白质中的多肽的蛋白质。
如本文所用的“促融合蛋白”是指能够促进感染病毒的细胞与另一细胞融合的任何异源蛋白。促融合蛋白的实例包括VSV-G、合胞蛋白(syncitin)-1(来自人内源性逆转录病毒-W(HERV-W))或合胞蛋白-2(来自HERVFRDE1)、副粘病毒SV5-F、麻疹病毒-H、麻疹病毒-F、RSV-F、来自逆转录病毒或慢病毒诸如长臂猿白血病病毒(GALV)、鼠白血病病毒(MLV)、Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和马传染性贫血病毒(EIAV)的糖蛋白，其中R跨膜肽被去除(R-型)。
如本文所用的术语“异源”是指并非天然组合出现的元件的组合。例如，与病毒或靶细胞异源的多核苷酸是指不天然存在于病毒或靶细胞中的多核苷酸，或者存在于病毒或靶细胞中与其天然存在的位置不同的位置的多核苷酸。与靶细胞异源的多肽是指不天然存在于靶细胞中或由与靶细胞异源的多核苷酸表达的多肽。
如本文所用，“免疫检查点”或“免疫检查点分子”是免疫系统中调节信号的分子。免疫检查点分子可以是刺激性检查点分子，即，增加信号，或者是抑制性检查点分子，即，减少信号。如本文所用，“刺激性检查点分子”是免疫系统中增加信号或具有共刺激性的分子。如本文所用，“抑制性检查点分子”是免疫系统中减少信号或具有共抑制性的分子。
如本文所用，“免疫检查点调节剂”是能够改变受试者中免疫检查点的活性的药剂。在某些实施例中，免疫检查点调节剂改变一种或多种免疫检查点分子(其包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、4-1BB、ADORA2A、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA)的功能。免疫检查点调节剂可以是免疫检查点的激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是免疫检查点结合蛋白(例如，抗体、抗体Fab片段、二价抗体、抗体药物缀合物、scFv、融合蛋白、二价抗体或四价抗体)。在其他实施例中，免疫检查点调节剂是小分子。在特定的实施例中，免疫检查点调节剂是抗PD1、抗PD-L1或抗CTLA-4结合蛋白，例如抗体或抗体片段，例如抗原结合片段。
如本文所用，“免疫治疗”是指诱导或增强免疫应答的药学上可接受的化合物、组合物或疗法。免疫治疗剂包括但不限于免疫检查点调节剂、Toll样受体(TLR)激动剂、基于细胞的疗法、细胞因子和癌症疫苗。
如本文所用，“肿瘤障碍”或“癌症”或“赘生物”是指在人中发现的所有类型的癌症或赘生物，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、上皮癌和肉瘤。如本文所用，术语“肿瘤障碍”、“癌症”和“赘生物”可互换使用，并且以单数或复数形式指已经经历了恶性转化的细胞，该恶性转化使这些细胞对宿主生物而言是病理性的。通过成熟的技术，特别是组织学检查，可以容易地将原发癌细胞(即从恶性转化位点附近获得的细胞)与非癌性细胞区分开。如本文所用，癌细胞的定义不仅包括原发癌细胞，而且包括癌症干细胞，以及癌症祖细胞或任何源自癌细胞祖先的细胞。这包括转移的癌细胞，以及源自癌细胞的体外培养物和细胞系。
基于肿瘤大小、组织学特征、肿瘤标志物和本领域技术人员已知的其他标准，用于癌症分期的特定标准取决于特定的癌症类型。通常，癌症的期可以描述如下：(i)0期，原位癌；(ii)I期，II期和III期，其中较高的数字表示疾病更加广泛，包括更大的肿瘤大小和/或癌症扩散超出其最初发展的器官到附近淋巴结和/或与原发肿瘤位置相邻的组织或器官；和(iii)IV期，其中癌症已经扩散到远处的组织或器官。
“实体瘤”是根据肿瘤团块例如通过诸如CAT扫描、MR成像、X射线、超声或触诊的程序可检测到的肿瘤，和/或由于可从患者获得的样品中一种或多种癌症特异性抗原的表达可检测到的肿瘤。肿瘤不需要具有可测量的尺寸。
通过本发明的方法治疗的“受试者”可以指人或非人动物，优选哺乳动物，更优选人。在某些实施例中，在使用本发明的方法开始治疗之前，受试者具有可检测的或经诊断的癌症。在某些实施例中，在使用本发明的方法开始治疗之前，受试者具有可检测的或经诊断的感染，例如慢性感染。如本文所用的“自杀基因”是指编码将药物的无毒前体转化成细胞毒性化合物的蛋白质(例如酶)的基因。
如本文所用，“细胞周转”是指重新排列和散布细胞内物质并可能最终导致细胞死亡的动态过程。细胞周转包括从细胞中产生和释放细胞周转因子。
如本文所用的“细胞周转因子”是由经历细胞周转的细胞产生的分子和细胞片段，其最终从细胞中释放并影响其他细胞的生物活性。细胞周转因子可包括蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、核酸、小分子和细胞片段(例如囊泡和细胞膜片段)。
如本文所用的“细胞周转通路基因”是指编码促进、诱导或以其他方式促成细胞周转通路的多肽的基因。
如本文所用，“萨诺传递”是细胞之间的通讯，它是靶信号传导细胞中细胞周转通路激活的结果，该通路发信号通知应答细胞以进行生物应答。可通过调节所述细胞中的细胞周转通路基因，通过例如病毒或其他基因治疗将促进此类通路的基因递送至靶信号传导细胞，在靶信号传导细胞中诱导萨诺传递。表2、表3、表4、表5和表6描述了能够促进各种细胞周转通路的示例性基因或蛋白质。因此，细胞周转通路已被激活的靶信号传导细胞可通过信号传导细胞主动释放的因子，或通过在信号传导细胞的细胞周转(例如，细胞死亡)期间暴露于应答细胞的信号传导细胞的胞内因子来发信号通知应答细胞。在某些实施例中，激活的信号传导细胞促进应答细胞(例如免疫细胞)中的免疫刺激性应答(例如促炎应答)。
术语“促进萨诺传递的多核苷酸”和“萨诺传递多核苷酸”在本文中可互换使用，是指其在靶细胞中的表达导致靶细胞的萨诺传递增加的多核苷酸。在一些实施例中，促进萨诺传递的多核苷酸编码促进萨诺传递的多肽；术语“促进萨诺传递的多肽”和“萨诺传递多肽”在本文中可互换使用，并且是指其在靶细胞中的表达增加靶细胞的萨诺传递的多肽。在一些实施例中，促进萨诺传递的多核苷酸降低抑制萨诺传递的多肽在靶细胞中的表达和/或活性。例如，促进萨诺传递的多核苷酸可编码降低靶细胞中抑制萨诺传递的多肽的表达和/或活性的RNA分子。
“治疗有效量”是指当施用于患者以治疗疾病时足以对该疾病实现这种治疗的化合物的量。当施用用于预防疾病时，该量足以避免或延迟疾病的发作。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗患者的年龄、体重等而变化。治疗有效量不需要是治愈性的。治疗有效量不需要预防疾病或病症永不发生。相反，治疗有效量是将至少延迟或减少疾病或病症的发作、严重程度或进展的量。
如本文所用，“治疗(treatment)”，“治疗(treating)”及其同源词是指旨在改善、改进、稳定、预防或治愈疾病、病理状况或障碍的受试者的医学管理。该术语包括活性治疗(旨在改善疾病、病理状况或障碍的治疗)、病因治疗(针对相关疾病、病理状况或障碍的原因的治疗)、姑息治疗(旨在缓解症状的治疗)、预防性治疗(旨在最大程度减少或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍发展的治疗)；以及支持治疗(用于补充另一疗法的治疗)。
如本文所用的关于多肽的术语“变体”是指与对应的野生型多肽相差至少一个氨基酸残基的多肽。在一些实施例中，变体多肽具有至少一种不同于对应的天然存在的多肽的活性。如本文所用的关于多核苷酸的术语“变体”是指与对应的野生型多核苷酸相差至少一个核苷酸的多核苷酸。在一些实施例中，变体多肽或变体多核苷酸与对应的野生型多肽或多核苷酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且该多肽或所编码的多肽相差至少一个氨基酸残基。
II.细胞周转通路
如本文所提供的，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒可用于调节靶细胞中的细胞周转通路。例如，在一些实施例中，用工程化病毒感染靶细胞诱导靶细胞中的免疫刺激性细胞周转通路。免疫刺激性细胞周转通路是当在细胞中被激活时促进应答细胞诸如免疫细胞中的免疫刺激性应答的细胞周转通路。免疫刺激性细胞周转通路包括但不限于程序性坏死(例如，细胞焦亡、坏死性凋亡)、凋亡(例如，外在和/或内在凋亡)、自噬、铁死亡以及它们的组合。
程序性坏死
如本文所用的“程序性坏死”是指具有形态学特征诸如细胞肿胀(胀亡)、膜破裂和细胞内容物释放的遗传控制的细胞死亡，与凋亡期间发生的膜完整性的保持相反。在一些实施例中，程序性坏死是细胞焦亡。在一些实施例中，程序性坏死是坏死性凋亡。
细胞焦亡
如本文所用的“细胞焦亡”是指半胱天冬酶1、半胱天冬酶4或半胱天冬酶5依赖性程序性细胞死亡的固有炎性过程。细胞焦亡的最显著的生物化学特征是早期诱导的邻近介导的半胱天冬酶-1的激活。半胱天冬酶-1、4或5的焦亡激活可在称为炎性体的多蛋白平台的背景下发生，炎性体涉及NOD样受体(NLR)或其他感受器，诸如胞质DNA感受器黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)，其募集促进半胱天冬酶-1激活的衔接蛋白ASC。半胱天冬酶-4/5可被LPS直接激活。在这两种情况下，活性半胱天冬酶-1催化热解白介素-1β(IL-1β)和IL-18的蛋白水解成熟和释放。此外，在一些(但不是全部)情况下，半胱天冬酶激活诱导成孔蛋白GSDM-D的裂解和激活以驱动膜破裂和细胞死亡。(参见Galluzzi等人,2018,Cell Death Differ.[细胞死亡与分化]3月；25(3):486–541。)在本披露的方法中，可通过与病毒接触或用病毒感染来在靶细胞中诱导细胞焦亡，该病毒被工程化以包含一种或多种编码在靶细胞中诱导细胞焦亡的多肽的多核苷酸。可在靶细胞中诱导细胞焦亡的多肽包括但不限于NLR、ASC、GSDM-D、AIM2和BIRC1。
几种方法在本领域中是已知的，并且可用于鉴定经历细胞焦亡的细胞，并通过检测特定标志物与其他类型的细胞拆解和/或细胞死亡区分开。细胞焦亡需要半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-4或半胱天冬酶-5活性，并且通常伴随前IL-1b和/或前IL-18的加工、这些成熟细胞因子的释放以及GSDM-D的半胱天冬酶-1/4/5切割片段的膜透化。
坏死性凋亡
如本文所用的术语“坏死性凋亡”是指受体相互作用蛋白激酶1和/或3(RIPK1-和/或RIPK3)/混合谱系激酶样(MLKL)依赖性坏死。几种触发因素可诱导坏死性凋亡，包括烷基化DNA损伤、兴奋毒素、和死亡受体的连接。例如，当半胱天冬酶(并且特别是半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-10)被遗传操作(例如，通过基因敲除或RNA干扰，RNAi)抑制或被药理剂(例如，化学半胱天冬酶抑制剂)阻断时，RIPK3磷酸化MLKL，导致MLKL装配到膜孔中，最终激活坏死细胞死亡的执行。参见Galluzzi等人,2018,Cell Death Differ.[细胞死亡与分化]3月；25(3):486–541，通过援引以其全文并入本文。
驱动免疫原性凋亡的相同通路可激活RIPK3，但通常半胱天冬酶8(和潜在的半胱天冬酶10)抑制RIPK3激活。RIPK3通常仅在半胱天冬酶8受损的情况下被激活。病毒蛋白诸如vICA或细胞突变体诸如FADD显性负性(DN)靶向半胱天冬酶8通路，并且如果存在RIPK3则释放RIPK3活性。如果RIPK3不存在，则vICA或FADD-DN简单地阻断凋亡。坏死性凋亡是免疫原性的，因为(a)膜破裂和(b)炎性转录程序(例如，NF-kB和IRF3)同时被激活。
在本披露的方法中，可通过与病毒接触或用病毒感染在靶细胞中诱导坏死性凋亡，该病毒被工程化以包含一种或多种编码在靶细胞中诱导坏死性凋亡的多肽的多核苷酸。可以在靶细胞中诱导坏死性凋亡的多肽包括但不限于Toll样受体3(TLR3)、TLR4、含TIR结构域的衔接蛋白(TIRAP)、含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接蛋白诱导干扰素-β(TRIF)、Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RIPK1)、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)、混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、FS-7相关表面抗原(FAS)、TNF相关凋亡诱导配体受体(TRAILR)和肿瘤坏死因子受体1型相关死亡结构域蛋白(TRADD)。
几种方法在本领域中是已知的，并且可用于鉴定经历坏死性凋亡的细胞，并通过检测特定标志物与其他类型的细胞拆解和/或细胞死亡区分开。这些标志物包括RIPK1、RIPK3和MLKL的磷酸化，这可通过检测这些翻译后修饰的抗体来检测，通常通过细胞的免疫印迹或免疫染色来检测。坏死性凋亡可通过不存在半胱天冬酶激活、快速膜透化、MLKL在膜上的再定位、RIPK3和MLKL累积成去污剂不溶部分、RIPK3/MLKL复合物形成和MLKL寡聚化来区别于凋亡和细胞焦亡。坏死性凋亡可通过对RIPK3和MLKL两者以及它们的激活的要求而在遗传和药理学上定义。
凋亡
如本文所用，凋亡是指一种类型的程序性细胞死亡，其特征在于垂死细胞的特定形态学和生物化学变化，包括细胞皱缩、核浓缩和断裂、动态膜起泡和丧失对邻居或对细胞外基质的粘附(Nishida K等人,(2008)Circ.Res.[循环研究]103,343–351)。存在两个基本的凋亡信号传导通路：外在和内在通路(Verbrugge I等人,(2010)Cell[细胞].143:1192-2)。内在凋亡通路被各种细胞内刺激所激活，这些刺激包括DNA损伤、生长因子剥夺和氧化应激。凋亡的外在通路由死亡配体与死亡受体的结合引发，随后是死亡诱导信号传导复合物的装配，其激活下游效应物半胱天冬酶以直接诱导细胞死亡或激活线粒体介导的内在凋亡通路(Verbrugge I等人,(2010)Cell[细胞].143:1192–2)。
外在凋亡
如本文所用的术语“外在凋亡”是指由特异性跨膜受体感知和传播的细胞外应激信号诱导的凋亡性细胞死亡的实例。外在凋亡可通过配体诸如FAS/CD95配体(FASL/CD95L)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和TNF(配体)超家族成员10(TNFSF10，最广为人知的是TNF相关凋亡诱导配体，TRAIL)与各种死亡受体(即，分别为FAS/CD95、TNFα受体1(TNFR1)和TRAIL受体(TRAILR)1-2)的结合来引发。替代性地，外在促凋亡信号可由所谓的“依赖性受体”，包括netrin受体(例如，UNC5A-D和在结直肠癌中缺失，DCC)发出，其仅在其特异性配体的浓度降到临界阈值水平以下时发挥致死功能。(参见Galluzzi等人,2018,Cell Death Differ.[细胞死亡与分化]3月；25(3):486–541，通过援引以其全文并入本文。)
在本披露的方法中，可通过与病毒接触或用病毒感染在靶细胞中诱导外在凋亡，该病毒被工程化以包含一种或多种编码在靶细胞中诱导外在凋亡的多肽的多核苷酸。可在靶细胞中诱导外在凋亡的多肽包括但不限于TNF、Fas配体(FasL)、TRAIL(及其同源受体)、TRADD、具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)、转化生长因子β-激活激酶1(Tak1)、半胱天冬酶-8、XIAP、BID、半胱天冬酶-9、APAF-1、CytoC、半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7。可抑制靶细胞中的外在凋亡的多肽包括凋亡蛋白细胞抑制剂1(cIAP1)、cIAP2、Ikka和Ikkb。几种方法在本领域中是已知的，并且可用于鉴定经历凋亡的细胞，并通过检测特定标志物与其他类型的细胞拆解和/或细胞死亡区分开。凋亡需要半胱天冬酶激活，并且可通过半胱天冬酶激活的抑制剂来抑制和/或通过缺少半胱天冬酶诸如半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9来预防死亡。半胱天冬酶激活通过切割特异性底物诸如PARP和DFF45以及超过600种附加蛋白质而系统地分解细胞。随着磷脂酰丝氨酸的外化和伴随的膜起泡，凋亡细胞膜最初保持完整。线粒体外膜通常被破坏而释放到细胞溶质蛋白诸如CytoC和HTRA2中。核DNA被切割成离散的片段，这些片段可通过本领域已知的测定来检测。
自噬
如本文所用，术语“自噬”是指进化上保守的分解代谢过程，始于自噬体即围绕细胞质大分子和细胞器的双膜结合结构的形成，预定用于再循环(Liu JJ等人.,(2011)Cancer Lett.[癌症通讯]300,105–114)。自噬在生理学上是在应激条件下存活的细胞策略和机制。当在某些情况下过度激活时，过度自噬导致细胞死亡(Boya P等人,(2013)NatCell Biol.15(7):713-20)。
在本披露的方法中，可通过编码在免疫细胞中诱导自噬的多肽的一种或多种异源多核苷酸的表达在免疫细胞中诱导自噬。
铁死亡
如本文所用，术语“铁死亡”是指经受调节的细胞死亡过程，该过程是铁依赖性的并且涉及活性氧物质的产生。在一些实施例中，铁死亡涉及脂质氢过氧化物的铁依赖性积聚至致死水平。对铁死亡的敏感性与许多生物过程紧密相关，包括氨基酸、铁和多不饱和脂肪酸代谢，以及谷胱甘肽、磷脂、NADPH和辅酶Q10的生物合成。铁死亡涉及代谢功能异常，其导致独立于线粒体，但在某些细胞环境中依赖NADPH氧化酶的细胞溶质ROS和脂质ROS两者的产生(参见例如Dixon等人,2012,Cell[细胞]149(5):1060-72，通过援引以其全文并入本文)。
在本披露的方法中，可通过与病毒接触或用病毒感染在靶细胞中诱导铁死亡，该病毒被工程化以包含一种或多种当在靶细胞中表达时降低抑制铁死亡的靶细胞内源性蛋白质的表达或活性的多核苷酸。抑制铁死亡的蛋白质包括但不限于FSP1、GPX4和谷氨酸/胱氨酸逆向转运体(System XC)。
几种方法在本领域中是已知的，并且可用于鉴定经历铁死亡的细胞，并通过检测特定标志物与其他类型的细胞拆解和/或细胞死亡区分开。(参见例如Stockwell等人,2017,Cell[细胞]171:273-285，通过援引以其全文并入本文)。例如，由于铁死亡可能是由致命的脂质过氧化引起的，因此测量脂质过氧化提供了一种鉴定经历铁依赖性细胞拆解的细胞的方法。C11-BODIPY和Liperfluo是亲脂性ROS传感器，可提供快速、间接的手段来检测脂质ROS(Dixon等人,2012,Cell[细胞]149:1060-1072)。液相色谱(LC)/串联质谱(MS)分析也可用于直接检测特定的氧化脂质(Friedmann Angeli等人,2014,Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]16:1180-1191；Kagan等人,2017,Nat.Chem.Biol.[自然化学生物学]13:81-90)。异前列腺素和丙二醛(MDA)也可用于测量脂质过氧化(Milne等人,2007,Nat.Protoc.[自然实验手册]2:221-226；Wang等人,2017,Hepatology[肝脏病学]66(2):449-465)。用于测量MDA的试剂盒是可商购的(碧云天公司(Beyotime)，海门市(Haimen)，中国)。
用于研究铁死亡的其他有用测定包括测量铁丰度和GPX4活性。可以使用电感耦合等离子体-MS或钙黄绿素AM淬灭法以及其他特定的铁探针来测量铁丰度(Hirayama和Nagasawa,2017,J.Clin.Biochem.Nutr.[临床生物化学与营养学杂志]60:39-48；Spangler等人,2016,Nat.Chem.Biol.[自然化学生物学]12:680-685)，而GPX4活性可以使用LC-MS使用细胞裂解液中的磷脂酰胆碱过氧化氢还原来检测(Yang等人,2014,Cell[细胞]156:317-331)。另外，可以通过测量谷胱甘肽(GSH)含量来评估铁死亡。GSH可以例如通过使用可商购的GSH-Glo谷胱甘肽测定法(普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)来测量。
铁死亡也可以通过测量一种或多种标志物蛋白的表达来评估。合适的标志物蛋白包括但不限于谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)和环氧合酶2(COX-2)。可以使用本领域已知的合适技术来确定标志物蛋白或编码标志物蛋白的核酸的表达水平，这些技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、定量实时PCR、单链构象多态性分析(SSCP)、错配切割检测、异双链体分析、RNA印迹分析、蛋白质印迹分析、原位杂交、阵列分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析及其组合或子组合。
III.病毒
在某些方面，本披露涉及一种被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒。可使用能够将促进萨诺传递的多核苷酸转移到靶细胞中的任何病毒。例如，在一些实施例中，病毒能够将至少4、5、6、7、8、9或10kb的异源多核苷酸转运到靶细胞中。在一些实施例中，病毒能够将4-12kb的异源多核苷酸转运到靶细胞中。在一些实施例中，病毒是溶细胞的，即能够裂解靶细胞。在一些实施例中，病毒是溶瘤的，即优先感染和/或裂解癌细胞的病毒。在一些实施例中，病毒优先感染靶细胞。在一些实施例中，病毒优先感染快速分裂的细胞(例如癌细胞)。在一些实施例中，病毒优先感染癌细胞。
病毒可以是DNA病毒或RNA病毒(例如逆转录病毒)。在一些实施例中，病毒是RNA病毒。在一些实施例中，病毒是DNA病毒。在一些实施例中，DNA病毒是DNA复制型病毒，例如DNA复制型溶瘤病毒。
在一些实施例中，病毒能够再感染先前被该病毒感染的宿主。该特征允许对受试者多次施用病毒。在一些实施例中，病毒天生触发Z-NA识别。
在一些实施例中，病毒在一个或多个内源性病毒基因中包含失活突变是有利的。在一些实施例中，失活突变位于有助于病毒毒力的内源性病毒基因(例如ICP34.5)中，使得失活突变降低毒力。在一些实施例中，失活突变位于限制受感染细胞周转的内源性病毒基因中(例如HSV中的ICP6；痘苗病毒中的E3L)，使得失活突变促进或增加感染后细胞的周转。在一些实施例中，病毒基因中的失活突变可与调节毒力或细胞周转的附加多核苷酸或多肽的表达组合。例如，痘苗病毒E3L的δ-Zα1突变体形式的表达可与ICP34.5的完全缺失组合以恢复复制能力。
可靶向灭活的合适病毒和内源性病毒基因的实例提供于下表中。
表1：示例性病毒和旨在突变的病毒基因。
Figure BDA0004097086860000271
在一些实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒是腺病毒。在一些实施例中，腺病毒是腺病毒血清型5(Ad5)。在一些实施例中，腺病毒是腺病毒血清型19A(Ad19A)。在一些实施例中，腺病毒是腺病毒血清型26(Ad26)。一种血清型的腺病毒可被工程化以包含来自不同腺病毒血清型的纤维蛋白。例如，在一些实施例中，Ad5被工程化以替代来自腺病毒血清型35(Ad35)的纤维蛋白。这种嵌合病毒称为Ad5/F35。(参见Yotnda等人,2001,Gene Therapy[基因疗法]8:930-937，其通过援引以其全文并入本文。)在一些实施例中，Ad5被工程化以替代来自腺病毒血清型3(Ad3)的纤维蛋白。这种嵌合病毒称为Ad5/F3。
在一些实施例中，腺病毒相对于对应的野生型腺病毒包含一个或多个突变(例如，一个或多个取代、添加或缺失)。例如，在一些实施例中，腺病毒(例如Ad5或Ad5/F35)包含腺病毒早期区域1A(E1A)中的缺失。在一些实施例中，腺病毒(例如Ad5或Ad5/F35)包含E1A中的24bp缺失。这种缺失使得病毒复制特异于Rb通路改变的细胞。在一些实施例中，腺病毒(例如Ad5或Ad5/F35)包含腺病毒早期区域1B(E1B)中的缺失。在一些实施例中，腺病毒(例如Ad5或Ad5/F35)包含E1B中的827bp缺失。这种缺失允许病毒在P53改变的细胞中复制。在特定的实施例中，腺病毒(例如Ad5或Ad5/F35)包含E1A中的24bp缺失和E1B中的827bp缺失。在一些实施例中，腺病毒(例如Ad5或Ad5/F35)具有工程化到纤维H环中的Arg-Gly-Asp(RGD)基序。这种修饰使得腺病毒利用αvβ3和αvβ5整联蛋白(其在癌细胞中表达)进入细胞。(参见Reynolds等人,1999,Gene Therapy[基因疗法]6:1336–1339，其通过援引以其全文并入本文。)
在一些实施例中，如本文所述的多核苷酸(例如，编码萨诺传递多肽的多核苷酸)可插入腺病毒的E1区，例如在E1A或E1B中。例如，在一些实施例中，E1区被去除并用多核苷酸替代。多核苷酸可以可操作地连接到如本文所述的启动子，例如与病毒异源的启动子。在一些实施例中，如本文所述的多核苷酸(例如，编码萨诺传递多肽的多核苷酸)可插入内源性病毒启动子的下游以驱动多核苷酸的表达。例如，在一些实施例中，将多核苷酸插入强病毒L5启动子下游的腺病毒中。L5启动子赋予伴随晚期病毒基因表达的表达。
在一些特定的实施例中，病毒不是腺病毒。在一些实施例中，病毒不是腺相关病毒(AAV)。在一些实施例中，病毒不是腺病毒或AAV。在另一个特定的实施例中，病毒不包含编码合成多聚化结构域的多核苷酸，该合成多聚化结构域即以足够的亲和力与其他此类结构域物理结合的非天然存在的结构域，使得这些结构域保持彼此接近。在一些实施例中，病毒不是包含编码合成多聚化结构域的多核苷酸的腺病毒或AAV，该合成多聚化结构域即以足够的亲和力与其他此类结构域物理结合的非天然存在的结构域，使得这些结构域保持彼此接近。
在一些实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒是单纯疱疹病毒(HSV)，例如HSV1。在一些实施例中，HSV1选自Kos、F1、MacIntyre、McKrae和相关毒株。HSV可能在选自ICP6、ICP34.5、ICP47、UL24、UL55和UL56的一个或多个基因中有缺陷。在特定的实施例中，ICP34.5编码基因被包含可操作地连接到立即早期(IE)启动子的US11编码基因的多核苷酸盒替代。在另一个特定的实施例中，HSV包含痘苗病毒E3L基因的ΔZα突变体形式。
在一个实施例中，HSV在ICP6的一种或多种功能中有缺陷。例如，ICP6基因的突变可能导致不同的功能丧失，这取决于突变。在一些实施例中，ICP6包含受体相互作用蛋白同型相互作用基序(RHIM)结构域的一个或多个突变。在一些实施例中，ICP6在C-末端包含一个或多个抑制半胱天冬酶-8结合的突变。在一些实施例中，ICP6包含一个或多个降低或消除核糖核苷酸还原酶(RR)活性的突变。
在一些实施例中，HSV将US11基因表达为立即早期基因。US11蛋白是病毒生命周期晚期蛋白质翻译调节所需的。US11的立即早期表达能够补偿ICP34.5中的功能丧失突变，并因此抵消具有ICP34.5缺失的突变体病毒中蛋白质合成的关闭，产生减毒较少的病毒。
在其他实施例中，病毒属于痘病毒科，例如选自粘液瘤病毒、雅巴样疾病病毒、浣熊痘病毒、orf病毒和牛痘病毒的病毒。在一些实施例中，病毒属于痘病毒科的脊椎动物痘病毒亚科。在一些实施例中，病毒属于脊椎动物痘病毒亚科的正痘病毒属。在一些实施例中，病毒属于正痘病毒属的痘苗病毒种。在一些实施例中，痘苗病毒是选自由以下组成的组的毒株：Dairenl、IHD-J、L-IPV、LC16M8、LC16MO、李斯特、LIVP、塔什干、WR 65-16、惠氏、安卡拉、哥本哈根、天坛和WR。
在一个实施例中，痘苗病毒被工程化以缺乏胸苷激酶(TK)活性。在一个实施例中，痘苗病毒在J2R基因中具有降低或消除TK活性的失活突变或缺失。J2R基因编码形成嘧啶脱氧核糖核苷酸合成的补救通路的一部分的TK。在一些实施例中，痘苗病毒被工程化以缺乏核糖核苷酸还原酶(RR)活性。在一些实施例中，痘苗病毒在选自I4L和F4L基因的基因中具有降低或消除RR活性的失活突变或缺失。TK活性或RR活性的降低增加了病毒在转化细胞(例如癌细胞)中的复制。
痘苗病毒编码多种干扰凋亡、坏死性凋亡和焦亡信号传导的蛋白质。例如，由E3L基因编码的E3是重要的干扰素拮抗剂，它也影响痘苗病毒宿主范围并有助于毒力。E3首先表征为25-kDa dsRNA结合蛋白，其拮抗干扰素诱导的dsRNA结合蛋白PKR的抗病毒活性并具有C-末端dsRNA结合结构域。E3的N-末端区域形成与Z-DNA结合蛋白具有相似性的独特结构域，并且N-和C-末端结构域都有助于病毒毒力。当用缺乏E3L基因的突变体痘苗病毒感染的HeLa细胞导致快速细胞死亡时，E3也被称为凋亡抑制剂。(参见Veyer等人,2017,Immunology Letters[免疫学快讯]186:68-80。)因此，在一些实施例中，痘苗病毒在E3L基因中有缺陷。在一些实施例中，E3L基因具有导致在感染癌细胞时诱导坏死性凋亡的突变。
在一些实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒不是痘苗病毒。在一些特定的实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒不是腺病毒。在一些实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒不是腺相关病毒(AAV)。在一些实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒不是腺病毒或AAV。在另一个特定的实施例中，病毒不包含编码合成多聚化结构域的多核苷酸，该合成多聚化结构域即以足够的亲和力与其他此类结构域物理结合的非天然存在的结构域，使得这些结构域保持彼此接近。在一些实施例中，病毒不是包含编码合成多聚化结构域的多核苷酸的腺病毒或AAV，该合成多聚化结构域即以足够的亲和力与其他此类结构域物理结合的非天然存在的结构域，使得这些结构域保持彼此接近。
在一些实施例中，病毒(例如HSV)包含微RNA(miR)靶序列。miR靶序列防止正常细胞中的病毒发病机理而不阻碍肿瘤细胞中的病毒复制。可将miR靶序列插入一个或多个病毒基因座中，例如病毒在正常(例如非癌性)细胞中复制所需的一个或多个病毒基因。包含在病毒中的示例性微RNA靶序列是miR-124，其特别适用于神经应用。其他微RNA靶序列可替代性地用于保护其他类型的组织，并且选择合适的微RNA靶序列来保护期望的组织或细胞类型在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，miR-122和miR-199在正常肝细胞而非原发性肝癌中表达；因此，miR-122和/或miR-199微RNA靶序列的一种或组合可用于治疗肝癌的病毒的实施例中。类似地，miR-128和/或miR-137微RNA的靶序列可用于病毒中以保护正常大脑。示例性微RNA靶序列可以是微RNA的反向互补序列。
在一些实施例中，微RNA靶序列包含在HSV基因的3'非翻译区(“UTR”)中，以在微RNA存在下沉默该基因。微RNA靶序列的多个拷贝(例如两个拷贝、三个拷贝、四个拷贝、五个拷贝、六个拷贝或更多)可串联插入。微RNA靶序列的多个拷贝可由四个或更多个核苷酸(例如八个或更多个核苷酸)的间隔区隔开。不希望受理论束缚，据信较大间隔(例如大于约8个核苷酸)提供增加的稳定性。
为了帮助保护非癌细胞免受HSV感染的裂解作用，将微RNA靶序列的多个拷贝插入对于在非癌细胞中复制至关重要的HSV基因的3'UTR中，这是本领域普通技术人员已知的。该位点可以是HSV基因组内正常(或天然)基因座中微RNA靶向基因的3'UTR。在特定的实施例中，病毒是HSV，其在具有ICP4基因的两个天然拷贝的病毒中包含插入ICP4基因的3'UTR中的微RNA靶序列的多个拷贝，例如ICP4基因的一个或两个拷贝。
在某些实施例中，病毒的基因组含有内部重复(接头)区的缺失，该内部重复(接头)区包含二倍体基因ICP0、ICP34.5、LAT和ICP4的每一者的一个拷贝以及ICP47基因的启动子。在其他实施例中，不是缺失接头，而是可通过缺失这些基因或以其他方式限制它们的诱变来沉默接头区域中基因、特别是ICP0和/或ICP47的表达。
在一些实施例中，病毒包含对靶细胞(例如癌细胞)表面上存在的分子(例如蛋白质、脂质或碳水化合物)特异的配体。可将配体结合到暴露于病毒表面的糖蛋白(例如HSV的gD或gC)中，以促进配体靶向期望的细胞。例如，配体可结合在gD的残基1和25之间。用于靶向GBM和其他癌细胞的示例性配体包括靶向EGFR和EGFRVIII、CD133、CXCR4、癌胚抗原(CEA)、ClC-3/膜联蛋白-2/MMP-2、人转铁蛋白受体和EpCAM的那些。配体可靶向此类受体或细胞表面分子，即配体能够特异性结合此类受体或细胞表面分子。EGFR-特异性配体和EGFRVIII-特异性配体，例如抗体(例如单链抗体)和VHH(单结构域抗体)，已描述于文献中(Kuan等人Int.J.Cancer[国际癌症杂志],88,962-69(2000)；Wickstrand等人,CancerRes.[癌症研究],55(14):3140-8(1995)；Omid far等人,Tumor Biology[肿瘤生物学],25:296-305(2004)；还参见Uchida等人Molecular Therapy[分子疗法],21:561-9(2013)；还参见Braidwood等人,Gene Then[基因疗法],15,1579-92(2008))。
病毒还或替代性地可通过将配体结合到不一定与癌症相关的其他细胞表面分子或受体中来靶向。例如，配体可包括来自天然配体(例如，生长因子(诸如可靶向EGFR的EGF、可靶向trkA的NGF等))、肽或非肽激素、选择用于结合靶分子的肽(例如，设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins))等的结合结构域。病毒还可包括促进载体通过非典型受体进入的gB和/或gD的突变体形式(并且还可在HSV基因组内的这些基因中的一者或两者中具有此类突变)。
IV.病毒有效负荷
本披露的病毒可被工程化以包含一种或多种在感染后促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸。例如，在一些实施例中，工程化病毒包含至少一种编码促进靶细胞中的萨诺传递的多肽的多核苷酸。在一些实施例中，工程化病毒包含至少2、3、4或5个多核苷酸序列，每个多核苷酸序列编码促进靶细胞中的萨诺传递的多肽。促进靶细胞中的萨诺传递的示例性多肽和多核苷酸提供于下表2A、表2B、表3、表4、表5和表6中。
在一些实施例中，病毒包含的多核苷酸编码野生型蛋白质。在一些实施例中，病毒包含的多核苷酸编码野生型蛋白质的生物活性片段，例如野生型蛋白质的N-末端或C-末端截短物或野生型蛋白质的另一功能片段或结构域。在一些实施例中，病毒包含的多核苷酸编码包含一个或多个突变的蛋白质或其功能片段或结构域。在一些实施例中，病毒包含的多核苷酸编码人蛋白质或其功能片段，例如人野生型蛋白质或其功能片段，或人蛋白质或其功能片段的变体。
表2A：促进靶细胞的萨诺传递的示例性多肽。
(提供了死亡折叠结构域(例如，死亡结构域(PF00531)和CARD(PF00619))和TIR结构域(PF01582)的Pfam条目的示例性登录号。其余的登录号是指编码多肽的多核苷酸序列。)
Figure BDA0004097086860000331
Figure BDA0004097086860000341
Figure BDA0004097086860000351
Figure BDA0004097086860000361
Figure BDA0004097086860000371
在一些实施例中，促进萨诺传递的一种或多种多核苷酸编码表2A或2B中所列的这些多肽中的任一种或多种(或与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％或99％相同的多肽)，或编码表3中所列的任何一种多肽结构域(或与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％或99％相同的结构域)。在一些实施例中，促进萨诺传递的一种或多种多核苷酸编码以下中的任一项或多项：受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)、Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)、混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)、含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)、仅包含TIR结构域和RHIM结构域的TRIF的N-末端截短物、干扰素调节因子3(IRF3)、具有死亡结构域的截短的Fas相关蛋白(FADD)和细胞FLICE(FADD样IL-1β转化酶)抑制蛋白(c-FLIP)。在一些实施例中，cFLIP是人cFLIP。在一些实施例中，cFLIP是半胱天冬酶-8和FADD样凋亡调节剂(cFLAR)。在一些实施例中，促进萨诺传递的一种或多种多核苷酸编码选自由以下组成的组的多肽：消皮素-A(GSDM-A)、消皮素-B(GSDM-B)、消皮素-C(GSDM-C)、消皮素-D(GSDM-D)、消皮素-E(GSDM-E)、含有具有二聚化结构域的C-末端半胱天冬酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC-CARD)以及它们的突变体。
在一些实施例中，促进萨诺传递的一种或多种多核苷酸编码选自cIAP1、cIAP2、IKKa、IKKb、XIAP和Nemo的多肽。尽管这些多肽可能抑制细胞死亡，但它们可能例如通过促进NF-kB激活来促进萨诺传递。因此，在一些实施例中，增加靶细胞中cIAP1、cIAP2、IKKa、IKKb、XIAP和/或Nemo的表达促进靶细胞的萨诺传递。在其他实施例中，减少靶细胞中cIAP1、cIAP2、IKKa、IKKb、XIAP和/或Nemo的表达促进靶细胞的萨诺传递，例如，通过减弱它们对细胞死亡的抑制，从而促进细胞周转。
在一些实施例中，促进萨诺传递的多核苷酸编码死亡折叠结构域。死亡折叠结构域的实例包括但不限于死亡结构域、热蛋白结构域、死亡效应子结构域(DED)、C-末端半胱天冬酶募集结构域(CARD)以及它们的变体。
在一些实施例中，死亡结构域选自具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)的死亡结构域、Fas受体的死亡结构域、肿瘤坏死因子受体1型相关死亡结构域蛋白(TRADD)的死亡结构域、肿瘤坏死因子受体1型(TNFR1)的死亡结构域以及它们的变体。FADD是23kDa的蛋白质，由208个氨基酸组成。它含有两个主要结构域：C末端死亡结构域(DD)和N末端死亡效应子结构域(DED)。这些结构域在结构上彼此相似，各自由6个α-螺旋组成。FADD的DD在质膜处经由它们的DD与受体诸如Fas受体结合。FADD的DED与细胞内分子诸如半胱天冬酶原8的DED结合。在一些实施例中，FADD-DD是FADD-DD的显性负性突变体，或豆蔻酰化FADD-DD(myr-FADD-DD)。
在一些实施例中，热蛋白结构域来自选自NLR家族含热蛋白结构域蛋白3(NLRP3)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的蛋白质。
在一些实施例中，死亡效应子结构域(DED)来自选自具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10的蛋白质。
在一些实施例中，CARD来自选自RIP相关ICH1/CED3同源蛋白(RAIDD)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、线粒体抗病毒信号传导蛋白(MAVS)、半胱天冬酶-1以及它们的变体的蛋白质。
在一些实施例中，促进萨诺传递的多核苷酸编码TIR结构域。在一些实施例中，促进萨诺传递的多核苷酸编码包含TIR结构域的蛋白质。TIR结构域可来自蛋白质，包括但不限于髓样分化初级应答蛋白88(MyD88)、含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)、Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体4(TLR4)、含TIR结构域的衔接蛋白(TIRAP)和易位链相关膜蛋白(TRAM)。
在一些实施例中，促进萨诺传递的多核苷酸是病毒基因。在一些实施例中，病毒基因编码选自卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的vFLIP(ORF71/K13)、来自传染性软疣病毒的MC159L、来自马疱疹病毒2的E8、来自人巨细胞病毒(HCMV)或鼠巨细胞病毒(MCMV)的vICA、来自牛痘病毒的CrmA和来自苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的P35的多肽。
如本文所述的促进靶细胞的萨诺传递的任何多肽可被突变以进一步增强它们促进萨诺传递的能力。例如，在一些实施例中，编码ZBP1的多核苷酸包含受体相互作用蛋白同型相互作用基序(RHIM)C的缺失、RHIM D的缺失、RHIM B的缺失和编码Zα1结构域的N-末端的区域中的缺失。
在一些实施例中，病毒包含的促进萨诺传递的一种或多种多核苷酸抑制受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RIPK1)的表达或活性。
促融合蛋白
在一个实施例中，病毒包含的促进萨诺传递的一种或多种多核苷酸编码促融合蛋白。促融合蛋白可以是能够促进被病毒感染的细胞与另一细胞融合的任何异源蛋白。促融合蛋白在本领域中是已知的，并且在例如WO 2017/118866中有所描述，其通过援引以其全文并入本文。相对于不表达促融合蛋白的病毒，表达促融合蛋白的病毒已显示增强肿瘤细胞杀伤。参见WO 2017/118866。促融合蛋白的实例包括VSV-G、合胞蛋白(syncitin)-1(来自人内源性逆转录病毒-W(HERV-W))或合胞蛋白-2(来自HERVFRDE1)、副粘病毒SV5-F、麻疹病毒-H、麻疹病毒-F、RSV-F、来自逆转录病毒或慢病毒诸如长臂猿白血病病毒(GALV)、鼠白血病病毒(MLV)、Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和马传染性贫血病毒(EIAV)的糖蛋白，其中R跨膜肽被去除(R-型)。在一个实施例中，该促融合蛋白是来自长臂猿白血病病毒(GALV)的糖蛋白，并且其R跨膜肽发生突变或被去除(GALV-R-)。示例性促融合蛋白提供于下表2B中。
表2B：促进靶细胞的萨诺传递的促融合蛋白。
Figure BDA0004097086860000401
促进萨诺传递的嵌合蛋白
在一些实施例中，促进萨诺传递的多核苷酸可编码嵌合蛋白。嵌合蛋白可包含下表3中所列的任何两个或更多个结构域，例如表3中所列的2、3、4或5个结构域。例如，在一些实施例中，促进萨诺传递的多核苷酸编码包含TRIF TIR结构域、TRIF RHIM结构域和ASC-CARD的嵌合蛋白。这种嵌合蛋白将募集半胱天冬酶-1并激活细胞焦亡。在一些实施例中，嵌合蛋白包含ZBP1 Za2结构域和ASC-CARD。预期这种嵌合蛋白激活细胞焦亡。在一些实施例中，嵌合蛋白包含RIPK3 RHIM结构域和半胱天冬酶大亚基/小亚基(L/S)结构域。这种嵌合蛋白将驱动半胱天冬酶的组成型激活，导致不同类型的细胞死亡，这取决于所选择的半胱天冬酶L/S结构域，如表3所示。在一些实施例中，嵌合蛋白包含TRIF TIR结构域、TRIF RHIM结构域和FADD死亡结构域(FADD-DD)。预期这种嵌合蛋白阻断凋亡但诱导坏死性凋亡。在一些实施例中，嵌合蛋白包含抑制剂kBα超阻遏物(IkBαSR)和半胱天冬酶-8DED结构域。预期这种嵌合蛋白抑制NF-kB并诱导凋亡。
表3：促进萨诺传递的多肽结构域。
(所示缩写为死亡结构域(DD)、死亡效应子结构域(DED)、半胱天冬酶募集结构域(CARD)和大亚基/小亚基(L/S)。指示了编码多肽结构域的多核苷酸的近似大小。)
Figure BDA0004097086860000411
在一些实施例中，病毒被工程化以包含仅一种促进萨诺传递的多核苷酸。在一些实施例中，这种促进萨诺传递的单一多核苷酸仅编码一种萨诺传递多肽或其结构域。在其他实施例中，病毒被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸，这些多核苷酸编码两种或更多种不同的萨诺传递多肽或其结构域。在一些实施例中，该两种或更多种萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRADD、TRAF2、TRAF6、cIAP1、cIAP2、XIAP、NOD2、MyD88、TRAM、HOIL、HOIP、Sharpin、IKKg、IKKa、IKKb、RelA、MAVS、RIGI、MDA5、Tak1、TBK1、IKKe、IRF3、IRF7、IRF1、TRAF3、半胱天冬酶、FADD、TNFR1、TRAILR1、TRAILR2、FAS、Bax、Bak、Bim、Bid、Noxa、Puma、TRIF、ZBP1、RIPK1、RIPK3、MLKL、消皮素A、消皮素B、消皮素C、消皮素D、消皮素E、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFSF)蛋白、它们的变体以及它们的功能片段。
合适的半胱天冬酶包括半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-11和半胱天冬酶-12。
示例性TNFSF蛋白提供于下表4中。
表4：示例性TNFSF蛋白。
(改编自Locksley等人,2001,Cell[细胞].104(4):487–501，其通过援引以其全文并入本文。)
Figure BDA0004097086860000421
Figure BDA0004097086860000431
Figure BDA0004097086860000441
编码本披露的萨诺传递多肽的示例性多核苷酸序列提供于下表5中。应当理解，编码本文披露的萨诺传递多肽的任何其他多核苷酸序列，包括表5中所列基因编码的多肽(或编码与其至少85％、87％、90％、95％、97％、98％或99％相同的多肽)可用于本文所述的方法和组合物中。
表5：编码萨诺传递多肽的示例性多核苷酸序列
Figure BDA0004097086860000442
Figure BDA0004097086860000451
Figure BDA0004097086860000461
该两种或更多种萨诺传递多肽可作为单独的多肽表达，或者它们可包含在嵌合蛋白中。在一些实施例中，促进萨诺传递的这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸被转录为编码两种或更多种萨诺传递多肽的单一转录物。
本文所述的萨诺传递多肽可通过各种机制促进萨诺传递，包括但不限于NF-kB的激活、IRF3和/或IRF7的激活、凋亡的促进和程序性坏死(例如坏死性凋亡或细胞焦亡)的促进。当使用两种或更多种萨诺传递多肽的组合时，该两种或更多种萨诺传递多肽中的每一种萨诺传递多肽可通过类似的机制或通过不同的机制促进萨诺传递。例如，在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽激活NF-kB。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽促进凋亡。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽促进程序性坏死(例如坏死性凋亡或细胞焦亡)。
当该两种或更多种萨诺传递多肽通过不同机制促进萨诺传递时，可使用各种机制的组合。例如，在一些实施例中，由该一种或多种萨诺传递多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活NF-kB，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活NF-kB，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进凋亡。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活NF-kB，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进程序性坏死(例如坏死性凋亡或细胞焦亡)。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进凋亡。在一些实施例中，由该一种或多种萨诺传递多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进程序性坏死(例如坏死性凋亡或细胞焦亡)。在一些实施例中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进凋亡，并且由该一种或多种萨诺传递多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进程序性坏死(例如坏死性凋亡或细胞焦亡)。
在一些实施例中，激活NF-kB的萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、TRADD、TRAF2、TRAF6、cIAP1、cIAP2、XIAP、NOD2、MyD88、TRAM、HOIL、HOIP、Sharpin、IKKg、IKKa、IKKb、RelA、MAVS、RIGI、MDA5、Tak1、TNFSF蛋白以及它们的功能片段和变体。在一些实施例中，激活IRF3和/或IRF7的萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、MyD88、MAVS、TBK1、IKKe、IRF3、IRF7、IRF1、TRAF3以及它们的功能片段和变体。在一些实施例中，促进凋亡的萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、RIPK1、半胱天冬酶，FADD、TRADD、TNFR1、TRAILR1、TRAILR2、FAS、Bax、Bak、Bim、Bid、Noxa、Puma以及它们的功能片段和变体。在一些实施例中，促进程序性坏死(例如，坏死性凋亡或细胞焦亡)的萨诺传递多肽选自由以下组成的组：ZBP1、RIPK1、RIPK3、MLKL、消皮素以及它们的功能片段和变体。
在一些实施例中，萨诺传递多肽的组合选自TRADD和TRAF2、TRADD和TRAF6、TRADD和cIAP1、TRADD和cIAP2、TRADD和XIAP、TRADD和NOD2、TRADD和MyD88、TRADD和TRAM、TRADD和HOIL、TRADD和HOIP、TRADD和Sharpin、TRADD和IKKg、TRADD和IKKa、TRADD和IKKb、TRADD和RelA、TRADD和MAVS、TRADD和RIGI、TRADD和MDA5、TRADD和Tak1、TRADD和TBK1、TRADD和IKKe、TRADD和IRF3、TRADD和IRF7、TRADD和IRF1、TRADD和TRAF3、TRADD和半胱天冬酶、TRADD和FADD、TRADD和TNFR1、TRADD和TRAILR1、TRADD和TRAILR2、TRADD和FAS、TRADD和Bax、TRADD和Bak、TRADD和Bim、TRADD和Bid、TRADD和Noxa、TRADD和Puma、TRADD和TRIF、TRADD和ZBP1、TRADD和RIPK1、TRADD和RIPK3、TRADD和MLKL、TRADD和消皮素A、TRADD和消皮素B、TRADD和消皮素C、TRADD和消皮素D、TRADD和消皮素E、TRAF2和TRAF6、TRAF2和cIAP1、TRAF2和cIAP2、TRAF2和XIAP、TRAF2和NOD2、TRAF2和MyD88、TRAF2和TRAM、TRAF2和HOIL、TRAF2和HOIP、TRAF2和Sharpin、TRAF2和IKKg、TRAF2和IKKa、TRAF2和IKKb、TRAF2和RelA、TRAF2和MAVS、TRAF2和RIGI、TRAF2和MDA5、TRAF2和Tak1、TRAF2和TBK1、TRAF2和IKKe、TRAF2和IRF3、TRAF2和IRF7、TRAF2和IRF1、TRAF2和TRAF3、TRAF2和半胱天冬酶、TRAF2和FADD、TRAF2和TNFR1、TRAF2和TRAILR1、TRAF2和TRAILR2、TRAF2和FAS、TRAF2和Bax、TRAF2和Bak、TRAF2和Bim、TRAF2和Bid、TRAF2和Noxa、TRAF2和Puma、TRAF2和TRIF、TRAF2和ZBP1、TRAF2和RIPK1、TRAF2和RIPK3、TRAF2和MLKL、TRAF2和消皮素A、TRAF2和消皮素B、TRAF2和消皮素C、TRAF2和消皮素D、TRAF2和消皮素E、TRAF6和cIAP1、TRAF6和cIAP2、TRAF6和XIAP、TRAF6和NOD2、TRAF6和MyD88、TRAF6和TRAM、TRAF6和HOIL、TRAF6和HOIP、TRAF6和Sharpin、TRAF6和IKKg、TRAF6和IKKa、TRAF6和IKKb、TRAF6和RelA、TRAF6和MAVS、TRAF6和RIGI、TRAF6和MDA5、TRAF6和Tak1、TRAF6和TBK1、TRAF6和IKKe、TRAF6和IRF3、TRAF6和IRF7、TRAF6和IRF1、TRAF6和TRAF3、TRAF6和半胱天冬酶、TRAF6和FADD、TRAF6和TNFR1、TRAF6和TRAILR1、TRAF6和TRAILR2、TRAF6和FAS、TRAF6和Bax、TRAF6和Bak、TRAF6和Bim、TRAF6和Bid、TRAF6和Noxa、TRAF6和Puma、TRAF6和TRIF、TRAF6和ZBP1、TRAF6和RIPK1、TRAF6和RIPK3、TRAF6和MLKL、TRAF6和消皮素A、TRAF6和消皮素B、TRAF6和消皮素C、TRAF6和消皮素D、TRAF6和消皮素E、cIAP1和cIAP2、cIAP1和XIAP、cIAP1和NOD2、cIAP1和MyD88、cIAP1和TRAM、cIAP1和HOIL、cIAP1和HOIP、cIAP1和Sharpin、cIAP1和IKKg、cIAP1和IKKa、cIAP1和IKKb、cIAP1和RelA、cIAP1和MAVS、cIAP1和RIGI、cIAP1和MDA5、cIAP1和Tak1、cIAP1和TBK1、cIAP1和IKKe、cIAP1和IRF3、cIAP1和IRF7、cIAP1和IRF1、cIAP1和TRAF3、cIAP1和半胱天冬酶、cIAP1和FADD、cIAP1和TNFR1、cIAP1和TRAILR1、cIAP1和TRAILR2、cIAP1和FAS、cIAP1和Bax、cIAP1和Bak、cIAP1和Bim、cIAP1和Bid、cIAP1和Noxa、cIAP1和Puma、cIAP1和TRIF、cIAP1和ZBP1、cIAP1和RIPK1、cIAP1和RIPK3、cIAP1和MLKL、cIAP1和消皮素A、cIAP1和消皮素B、cIAP1和消皮素C、cIAP1和消皮素D、cIAP1和消皮素E、cIAP2和XIAP、cIAP2和NOD2、cIAP2和MyD88、cIAP2和TRAM、cIAP2和HOIL、cIAP2和HOIP、cIAP2和Sharpin、cIAP2和IKKg、cIAP2和IKKa、cIAP2和IKKb、cIAP2和RelA、cIAP2和MAVS、cIAP2和RIGI、cIAP2和MDA5、cIAP2和Tak1、cIAP2和TBK1、cIAP2和IKKe、cIAP2和IRF3、cIAP2和IRF7、cIAP2和IRF1、cIAP2和TRAF3、cIAP2和半胱天冬酶、cIAP2和FADD、cIAP2和TNFR1、cIAP2和TRAILR1、cIAP2和TRAILR2、cIAP2和FAS、cIAP2和Bax、cIAP2和Bak、cIAP2和Bim、cIAP2和Bid、cIAP2和Noxa、cIAP2和Puma、cIAP2和TRIF、cIAP2和ZBP1、cIAP2和RIPK1、cIAP2和RIPK3、cIAP2和MLKL、cIAP2和消皮素A、cIAP2和消皮素B、cIAP2和消皮素C、cIAP2和消皮素D、cIAP2和消皮素E、XIAP和NOD2、XIAP和MyD88、XIAP和TRAM、XIAP和HOIL、XIAP和HOIP、XIAP和Sharpin、XIAP和IKKg、XIAP和IKKa、XIAP和IKKb、XIAP和RelA、XIAP和MAVS、XIAP和RIGI、XIAP和MDA5、XIAP和Tak1、XIAP和TBK1、XIAP和IKKe、XIAP和IRF3、XIAP和IRF7、XIAP和IRF1、XIAP和TRAF3、XIAP和半胱天冬酶、XIAP和FADD、XIAP和TNFR1、XIAP和TRAILR1、XIAP和TRAILR2、XIAP和FAS、XIAP和Bax、XIAP和Bak、XIAP和Bim、XIAP和Bid、XIAP和Noxa、XIAP和Puma、XIAP和TRIF、XIAP和ZBP1、XIAP和RIPK1、XIAP和RIPK3、XIAP和MLKL、XIAP和消皮素A、XIAP和消皮素B、XIAP和消皮素C、XIAP和消皮素D、XIAP和消皮素E、NOD2和MyD88、NOD2和TRAM、NOD2和HOIL、NOD2和HOIP、NOD2和Sharpin、NOD2和IKKg、NOD2和IKKa、NOD2和IKKb、NOD2和RelA、NOD2和MAVS、NOD2和RIGI、NOD2和MDA5、NOD2和Tak1、NOD2和TBK1、NOD2和IKKe、NOD2和IRF3、NOD2和IRF7、NOD2和IRF1、NOD2和TRAF3、NOD2和半胱天冬酶、NOD2和FADD、NOD2和TNFR1、NOD2和TRAILR1、NOD2和TRAILR2、NOD2和FAS、NOD2和Bax、NOD2和Bak、NOD2和Bim、NOD2和Bid、NOD2和Noxa、NOD2和Puma、NOD2和TRIF、NOD2和ZBP1、NOD2和RIPK1、NOD2和RIPK3、NOD2和MLKL、NOD2和消皮素A、NOD2和消皮素B、NOD2和消皮素C、NOD2和消皮素D、NOD2和消皮素E、MyD88和TRAM、MyD88和HOIL、MyD88和HOIP、MyD88和Sharpin、MyD88和IKKg、MyD88和IKKa、MyD88和IKKb、MyD88和RelA、MyD88和MAVS、MyD88和RIGI、MyD88和MDA5、MyD88和Tak1、MyD88和TBK1、MyD88和IKKe、MyD88和IRF3、MyD88和IRF7、MyD88和IRF1、MyD88和TRAF3、MyD88和半胱天冬酶、MyD88和FADD、MyD88和TNFR1、MyD88和TRAILR1、MyD88和TRAILR2、MyD88和FAS、MyD88和Bax、MyD88和Bak、MyD88和Bim、MyD88和Bid、MyD88和Noxa、MyD88和Puma、MyD88和TRIF、MyD88和ZBP1、MyD88和RIPK1、MyD88和RIPK3、MyD88和MLKL、MyD88和消皮素A、MyD88和消皮素B、MyD88和消皮素C、MyD88和消皮素D、MyD88和消皮素E、TRAM和HOIL、TRAM和HOIP、TRAM和Sharpin、TRAM和IKKg、TRAM和IKKa、TRAM和IKKb、TRAM和RelA、TRAM和MAVS、TRAM和RIGI、TRAM和MDA5、TRAM和Tak1、TRAM和TBK1、TRAM和IKKe、TRAM和IRF3、TRAM和IRF7、TRAM和IRF1、TRAM和TRAF3、TRAM和半胱天冬酶、TRAM和FADD、TRAM和TNFR1、TRAM和TRAILR1、TRAM和TRAILR2、TRAM和FAS、TRAM和Bax、TRAM和Bak、TRAM和Bim、TRAM和Bid、TRAM和Noxa、TRAM和Puma、TRAM和TRIF、TRAM和ZBP1、TRAM和RIPK1、TRAM和RIPK3、TRAM和MLKL、TRAM和消皮素A、TRAM和消皮素B、TRAM和消皮素C、TRAM和消皮素D、TRAM和消皮素E、HOIL和HOIP、HOIL和Sharpin、HOIL和IKKg、HOIL和IKKa、HOIL和IKKb、HOIL和RelA、HOIL和MAVS、HOIL和RIGI、HOIL和MDA5、HOIL和Tak1、HOIL和TBK1、HOIL和IKKe、HOIL和IRF3、HOIL和IRF7、HOIL和IRF1、HOIL和TRAF3、HOIL和半胱天冬酶、HOIL和FADD、HOIL和TNFR1、HOIL和TRAILR1、HOIL和TRAILR2、HOIL和FAS、HOIL和Bax、HOIL和Bak、HOIL和Bim、HOIL和Bid、HOIL和Noxa、HOIL和Puma、HOIL和TRIF、HOIL和ZBP1、HOIL和RIPK1、HOIL和RIPK3、HOIL和MLKL、HOIL和消皮素A、HOIL和消皮素B、HOIL和消皮素C、HOIL和消皮素D、HOIL和消皮素E、HOIP和Sharpin、HOIP和IKKg、HOIP和IKKa、HOIP和IKKb、HOIP和RelA、HOIP和MAVS、HOIP和RIGI、HOIP和MDA5、HOIP和Tak1、HOIP和TBK1、HOIP和IKKe、HOIP和IRF3、HOIP和IRF7、HOIP和IRF1、HOIP和TRAF3、HOIP和半胱天冬酶、HOIP和FADD、HOIP和TNFR1、HOIP和TRAILR1、HOIP和TRAILR2、HOIP和FAS、HOIP和Bax、HOIP和Bak、HOIP和Bim、HOIP和Bid、HOIP和Noxa、HOIP和Puma、HOIP和TRIF、HOIP和ZBP1、HOIP和RIPK1、HOIP和RIPK3、HOIP和MLKL、HOIP和消皮素A、HOIP和消皮素B、HOIP和消皮素C、HOIP和消皮素D、HOIP和消皮素E、Sharpin和IKKg、Sharpin和IKKa、Sharpin和IKKb、Sharpin和RelA、Sharpin和MAVS、Sharpin和RIGI、Sharpin和MDA5、Sharpin和Tak1、Sharpin和TBK1、Sharpin和IKKe、Sharpin和IRF3、Sharpin和IRF7、Sharpin和IRF1、Sharpin和TRAF3、Sharpin和半胱天冬酶、Sharpin和FADD、Sharpin和TNFR1、Sharpin和TRAILR1、Sharpin和TRAILR2、Sharpin和FAS、Sharpin和Bax、Sharpin和Bak、Sharpin和Bim、Sharpin和Bid、Sharpin和Noxa、Sharpin和Puma、Sharpin和TRIF、Sharpin和ZBP1、Sharpin和RIPK1、Sharpin和RIPK3、Sharpin和MLKL、Sharpin和消皮素A、Sharpin和消皮素B、Sharpin和消皮素C、Sharpin和消皮素D、Sharpin和消皮素E、IKKg和IKKa、IKKg和IKKb、IKKg和RelA、IKKg和MAVS、IKKg和RIGI、IKKg和MDA5、IKKg和Tak1、IKKg和TBK1、IKKg和IKKe、IKKg和IRF3、IKKg和IRF7、IKKg和IRF1、IKKg和TRAF3、IKKg和半胱天冬酶、IKKg和FADD、IKKg和TNFR1、IKKg和TRAILR1、IKKg和TRAILR2、IKKg和FAS、IKKg和Bax、IKKg和Bak、IKKg和Bim、IKKg和Bid、IKKg和Noxa、IKKg和Puma、IKKg和TRIF、IKKg和ZBP1、IKKg和RIPK1、IKKg和RIPK3、IKKg和MLKL、IKKg和消皮素A、IKKg和消皮素B、IKKg和消皮素C、IKKg和消皮素D、IKKg和消皮素E、IKKa和IKKb、IKKa和RelA、IKKa和MAVS、IKKa和RIGI、IKKa和MDA5、IKKa和Tak1、IKKa和TBK1、IKKa和IKKe、IKKa和IRF3、IKKa和IRF7、IKKa和IRF1、IKKa和TRAF3、IKKa和半胱天冬酶、IKKa和FADD、IKKa和TNFR1、IKKa和TRAILR1、IKKa和TRAILR2、IKKa和FAS、IKKa和Bax、IKKa和Bak、IKKa和Bim、IKKa和Bid、IKKa和Noxa、IKKa和Puma、IKKa和TRIF、IKKa和ZBP1、IKKa和RIPK1、IKKa和RIPK3、IKKa和MLKL、IKKa和消皮素A、IKKa和消皮素B、IKKa和消皮素C、IKKa和消皮素D、IKKa和消皮素E、IKKb和RelA、IKKb和MAVS、IKKb和RIGI、IKKb和MDA5、IKKb和Tak1、IKKb和TBK1、IKKb和IKKe、IKKb和IRF3、IKKb和IRF7、IKKb和IRF1、IKKb和TRAF3、IKKb和半胱天冬酶、IKKb和FADD、IKKb和TNFR1、IKKb和TRAILR1、IKKb和TRAILR2、IKKb和FAS、IKKb和Bax、IKKb和Bak、IKKb和Bim、IKKb和Bid、IKKb和Noxa、IKKb和Puma、IKKb和TRIF、IKKb和ZBP1、IKKb和RIPK1、IKKb和RIPK3、IKKb和MLKL、IKKb和消皮素A、IKKb和消皮素B、IKKb和消皮素C、IKKb和消皮素D、IKKb和消皮素E、IKKb和RelA、IKKb和MAVS、IKKb和RIGI、IKKb和MDA5、IKKb和Tak1、IKKb和TBK1、IKKb和IKKe、IKKb和IRF3、IKKb和IRF7、IKKb和IRF1、IKKb和TRAF3、IKKb和半胱天冬酶、IKKb和FADD、IKKb和TNFR1、IKKb和TRAILR1、IKKb和TRAILR2、IKKb和FAS、IKKb和Bax、IKKb和Bak、IKKb和Bim、IKKb和Bid、IKKb和Noxa、IKKb和Puma、IKKb和TRIF、IKKb和ZBP1、IKKb和RIPK1、IKKb和RIPK3、IKKb和MLKL、IKKb和消皮素A、IKKb和消皮素B、IKKb和消皮素C、IKKb和消皮素D、IKKb和消皮素E、RelA和MAVS、RelA和RIGI、RelA和MDA5、RelA和Tak1、RelA和TBK1、RelA和IKKe、RelA和IRF3、RelA和IRF7、RelA和IRF1、RelA和TRAF3、RelA和半胱天冬酶、RelA和FADD、RelA和TNFR1、RelA和TRAILR1、RelA和TRAILR2、RelA和FAS、RelA和Bax、RelA和Bak、RelA和Bim、RelA和Bid、RelA和Noxa、RelA和Puma、RelA和TRIF、RelA和ZBP1、RelA和RIPK1、RelA和RIPK3、RelA和MLKL、RelA和消皮素A、RelA和消皮素B、RelA和消皮素C、RelA和消皮素D、RelA和消皮素E、MAVS和RIGI、MAVS和MDA5、MAVS和Tak1、MAVS和TBK1、MAVS和IKKe、MAVS和IRF3、MAVS和IRF7、MAVS和IRF1、MAVS和TRAF3、MAVS和半胱天冬酶、MAVS和FADD、MAVS和TNFR1、MAVS和TRAILR1、MAVS和TRAILR2、MAVS和FAS、MAVS和Bax、MAVS和Bak、MAVS和Bim、MAVS和Bid、MAVS和Noxa、MAVS和Puma、MAVS和TRIF、MAVS和ZBP1、MAVS和RIPK1、MAVS和RIPK3、MAVS和MLKL、MAVS和消皮素A、MAVS和消皮素B、MAVS和消皮素C、MAVS和消皮素D、MAVS和消皮素E、RIGI和MDA5、RIGI和Tak1、RIGI和TBK1、RIGI和IKKe、RIGI和IRF3、RIGI和IRF7、RIGI和IRF1、RIGI和TRAF3、RIGI和半胱天冬酶、RIGI和FADD、RIGI和TNFR1、RIGI和TRAILR1、RIGI和TRAILR2、RIGI和FAS、RIGI和Bax、RIGI和Bak、RIGI和Bim、RIGI和Bid、RIGI和Noxa、RIGI和Puma、RIGI和TRIF、RIGI和ZBP1、RIGI和RIPK1、RIGI和RIPK3、RIGI和MLKL、RIGI和消皮素A、RIGI和消皮素B、RIGI和消皮素C、RIGI和消皮素D、RIGI和消皮素E、MDA5和Tak1、MDA5和TBK1、MDA5和IKKe、MDA5和IRF3、MDA5和IRF7、MDA5和IRF1、MDA5和TRAF3、MDA5和半胱天冬酶、MDA5和FADD、MDA5和TNFR1、MDA5和TRAILR1、MDA5和TRAILR2、MDA5和FAS、MDA5和Bax、MDA5和Bak、MDA5和Bim、MDA5和Bid、MDA5和Noxa、MDA5和Puma、MDA5和TRIF、MDA5和ZBP1、MDA5和RIPK1、MDA5和RIPK3、MDA5和MLKL、MDA5和消皮素A、MDA5和消皮素B、MDA5和消皮素C、MDA5和消皮素D、MDA5和消皮素E、Tak1和TBK1、Tak1和IKKe、Tak1和IRF3、Tak1和IRF7、Tak1和IRF1、Tak1和TRAF3、Tak1和半胱天冬酶、Tak1和FADD、Tak1和TNFR1、Tak1和TRAILR1、Tak1和TRAILR2、Tak1和FAS、Tak1和Bax、Tak1和Bak、Tak1和Bim、Tak1和Bid、Tak1和Noxa、Tak1和Puma、Tak1和TRIF、Tak1和ZBP1、Tak1和RIPK1、Tak1和RIPK3、Tak1和MLKL、Tak1和消皮素A、Tak1和消皮素B、Tak1和消皮素C、Tak1和消皮素D、Tak1和消皮素E、TBK1和IKKe、TBK1和IRF3、TBK1和IRF7、TBK1和IRF1、TBK1和TRAF3、TBK1和半胱天冬酶、TBK1和FADD、TBK1和TNFR1、TBK1和TRAILR1、TBK1和TRAILR2、TBK1和FAS、TBK1和Bax、TBK1和Bak、TBK1和Bim、TBK1和Bid、TBK1和Noxa、TBK1和Puma、TBK1和TRIF、TBK1和ZBP1、TBK1和RIPK1、TBK1和RIPK3、TBK1和MLKL、TBK1和消皮素A、TBK1和消皮素B、TBK1和消皮素C、TBK1和消皮素D、TBK1和消皮素E、IKKe和IRF3、IKKe和IRF7、IKKe和IRF1、IKKe和TRAF3、IKKe和半胱天冬酶、IKKe和FADD、IKKe和TNFR1、IKKe和TRAILR1、IKKe和TRAILR2、IKKe和FAS、IKKe和Bax、IKKe和Bak、IKKe和Bim、IKKe和Bid、IKKe和Noxa、IKKe和Puma、IKKe和TRIF、IKKe和ZBP1、IKKe和RIPK1、IKKe和RIPK3、IKKe和MLKL、IKKe和消皮素A、IKKe和消皮素B、IKKe和消皮素C、IKKe和消皮素D、IKKe和消皮素E、IRF3和IRF7、IRF3和IRF1、IRF3和TRAF3、IRF3和半胱天冬酶、IRF3和FADD、IRF3和TNFR1、IRF3和TRAILR1、IRF3和TRAILR2、IRF3和FAS、IRF3和Bax、IRF3和Bak、IRF3和Bim、IRF3和Bid、IRF3和Noxa、IRF3和Puma、IRF3和TRIF、IRF3和ZBP1、IRF3和RIPK1、IRF3和RIPK3、IRF3和MLKL、IRF3和消皮素A、IRF3和消皮素B、IRF3和消皮素C、IRF3和消皮素D、IRF3和消皮素E、IRF7和IRF1、IRF7和TRAF3、IRF7和半胱天冬酶、IRF7和FADD、IRF7和TNFR1、IRF7和TRAILR1、IRF7和TRAILR2、IRF7和FAS、IRF7和Bax、IRF7和Bak、IRF7和Bim、IRF7和Bid、IRF7和Noxa、IRF7和Puma、IRF7和TRIF、IRF7和ZBP1、IRF7和RIPK1、IRF7和RIPK3、IRF7和MLKL、IRF7和消皮素A、IRF7和消皮素B、IRF7和消皮素C、IRF7和消皮素D、IRF7和消皮素E、IRF1和TRAF3、IRF1和半胱天冬酶、IRF1和FADD、IRF1和TNFR1、IRF1和TRAILR1、IRF1和TRAILR2、IRF1和FAS、IRF1和Bax、IRF1和Bak、IRF1和Bim、IRF1和Bid、IRF1和Noxa、IRF1和Puma、IRF1和TRIF、IRF1和ZBP1、IRF1和RIPK1、IRF1和RIPK3、IRF1和MLKL、IRF1和消皮素A、IRF1和消皮素B、IRF1和消皮素C、IRF1和消皮素D、IRF1和消皮素E、TRAF3和半胱天冬酶、TRAF3和FADD、TRAF3和TNFR1、TRAF3和TRAILR1、TRAF3和TRAILR2、TRAF3和FAS、TRAF3和Bax、TRAF3和Bak、TRAF3和Bim、TRAF3和Bid、TRAF3和Noxa、TRAF3和Puma、TRAF3和TRIF、TRAF3和ZBP1、TRAF3和RIPK1、TRAF3和RIPK3、TRAF3和MLKL、TRAF3和消皮素A、TRAF3和消皮素B、TRAF3和消皮素C、TRAF3和消皮素D、TRAF3和消皮素E、半胱天冬酶和FADD、半胱天冬酶和TNFR1、半胱天冬酶和TRAILR1、半胱天冬酶和TRAILR2、半胱天冬酶和FAS、半胱天冬酶和Bax、半胱天冬酶和Bak、半胱天冬酶和Bim、半胱天冬酶和Bid、半胱天冬酶和Noxa、半胱天冬酶和Puma、半胱天冬酶和TRIF、半胱天冬酶和ZBP1、半胱天冬酶和RIPK1、半胱天冬酶和RIPK3、半胱天冬酶和MLKL、半胱天冬酶和消皮素A、半胱天冬酶和消皮素B、半胱天冬酶和消皮素C、半胱天冬酶和消皮素D、半胱天冬酶和消皮素E、FADD和TNFR1、FADD和TRAILR1、FADD和TRAILR2、FADD和FAS、FADD和Bax、FADD和Bak、FADD和Bim、FADD和Bid、FADD和Noxa、FADD和Puma、FADD和TRIF、FADD和ZBP1、FADD和RIPK1、FADD和RIPK3、FADD和MLKL、FADD和消皮素A、FADD和消皮素B、FADD和消皮素C、FADD和消皮素D、FADD和消皮素E、TNFR1和TRAILR1、TNFR1和TRAILR2、TNFR1和FAS、TNFR1和Bax、TNFR1和Bak、TNFR1和Bim、TNFR1和Bid、TNFR1和Noxa、TNFR1和Puma、TNFR1和TRIF、TNFR1和ZBP1、TNFR1和RIPK1、TNFR1和RIPK3、TNFR1和MLKL、TNFR1和消皮素A、TNFR1和消皮素B、TNFR1和消皮素C、TNFR1和消皮素D、TNFR1和消皮素E、TRAILR1和TRAILR2、TRAILR1和FAS、TRAILR1和Bax、TRAILR1和Bak、TRAILR1和Bim、TRAILR1和Bid、TRAILR1和Noxa、TRAILR1和Puma、TRAILR1和TRIF、TRAILR1和ZBP1、TRAILR1和RIPK1、TRAILR1和RIPK3、TRAILR1和MLKL、TRAILR1和消皮素A、TRAILR1和消皮素B、TRAILR1和消皮素C、TRAILR1和消皮素D、TRAILR1和消皮素E、TRAILR2和FAS、TRAILR2和Bax、TRAILR2和Bak、TRAILR2和Bim、TRAILR2和Bid、TRAILR2和Noxa、TRAILR2和Puma、TRAILR2和TRIF、TRAILR2和ZBP1、TRAILR2和RIPK1、TRAILR2和RIPK3、TRAILR2和MLKL、TRAILR2和消皮素A、TRAILR2和消皮素B、TRAILR2和消皮素C、TRAILR2和消皮素D、TRAILR2和消皮素E、FAS和Bax、FAS和Bak、FAS和Bim、FAS和Bid、FAS和Noxa、FAS和Puma、FAS和TRIF、FAS和ZBP1、FAS和RIPK1、FAS和RIPK3、FAS和MLKL、FAS和消皮素A、FAS和消皮素B、FAS和消皮素C、FAS和消皮素D、FAS和消皮素E、Bax和Bak、Bax和Bim、Bax和Bid、Bax和Noxa、Bax和Puma、Bax和TRIF、Bax和ZBP1、Bax和RIPK1、Bax和RIPK3、Bax和MLKL、Bax和消皮素A、Bax和消皮素B、Bax和消皮素C、Bax和消皮素D、Bax和消皮素E、Bak和Bim、Bak和Bid、Bak和Noxa、Bak和Puma、Bak和TRIF、Bak和ZBP1、Bak和RIPK1、Bak和RIPK3、Bak和MLKL、Bak和消皮素A、Bak和消皮素B、Bak和消皮素C、Bak和消皮素D、Bak和消皮素E、Bim和Bid、Bim和Noxa、Bim和Puma、Bim和TRIF、Bim和ZBP1、Bim和RIPK1、Bim和RIPK3、Bim和MLKL、Bim和消皮素A、Bim和消皮素B、Bim和消皮素C、Bim和消皮素D、Bim和消皮素E、Bid和Noxa、Bid和Puma、Bid和TRIF、Bid和ZBP1、Bid和RIPK1、Bid和RIPK3、Bid和MLKL、Bid和消皮素A、Bid和消皮素B、Bid和消皮素C、Bid和消皮素D、Bid和消皮素E、Noxa和Puma、Noxa和TRIF、Noxa和ZBP1、Noxa和RIPK1、Noxa和RIPK3、Noxa和MLKL、Noxa和消皮素A、Noxa和消皮素B、Noxa和消皮素C、Noxa和消皮素D、Noxa和消皮素E、Puma和TRIF、Puma和ZBP1、Puma和RIPK1、Puma和RIPK3、Puma和MLKL、Puma和消皮素A、Puma和消皮素B、Puma和消皮素C、Puma和消皮素D、Puma和消皮素E、TRIF和ZBP1、TRIF和RIPK1、TRIF和RIPK3、TRIF和MLKL、TRIF和消皮素A、TRIF和消皮素B、TRIF和消皮素C、TRIF和消皮素D、TRIF和消皮素E、ZBP1和RIPK1、ZBP1和RIPK3、ZBP1和MLKL、ZBP1和消皮素A、ZBP1和消皮素B、ZBP1和消皮素C、ZBP1和消皮素D、ZBP1和消皮素E、RIPK1和RIPK3、RIPK1和MLKL、RIPK1和消皮素A、RIPK1和消皮素B、RIPK1和消皮素C、RIPK1和消皮素D、RIPK1和消皮素E、RIPK3和MLKL、RIPK3和消皮素A、RIPK3和消皮素B、RIPK3和消皮素C、RIPK3和消皮素D、RIPK3和消皮素E、MLKL和消皮素A、MLKL和消皮素B、MLKL和消皮素C、MLKL和消皮素D、MLKL和消皮素E、消皮素A和消皮素B、消皮素A和消皮素C、消皮素A和消皮素D、消皮素A和消皮素E、消皮素B和消皮素C、消皮素B和消皮素D、消皮素B和消皮素E、消皮素C和消皮素D、消皮素C和消皮素E、消皮素D和消皮素E、TNFSF蛋白和TRADD、TNFSF蛋白和TRAF2、TNFSF蛋白和TRAF6、TNFSF蛋白和cIAP1、TNFSF蛋白和cIAP2、TNFSF蛋白和XIAP、TNFSF蛋白和NOD2、TNFSF蛋白和MyD88、TNFSF蛋白和TRAM、TNFSF蛋白和HOIL、TNFSF蛋白和HOIP、TNFSF蛋白和Sharpin、TNFSF蛋白和IKKg、TNFSF蛋白和IKKa、TNFSF蛋白和IKKb、TNFSF蛋白和RelA、TNFSF蛋白和MAVS、TNFSF蛋白和RIGI、TNFSF蛋白和MDA5、TNFSF蛋白和Tak1、TNFSF蛋白和TBK1、TNFSF蛋白和IKKe、TNFSF蛋白和IRF3、TNFSF蛋白和IRF7、TNFSF蛋白和IRF1、TNFSF蛋白和TRAF3、TNFSF蛋白和半胱天冬酶、TNFSF蛋白和FADD、TNFSF蛋白和TNFR1、TNFSF蛋白和TRAILR1、TNFSF蛋白和TRAILR2、TNFSF蛋白和FAS、TNFSF蛋白和Bax、TNFSF蛋白和Bak、TNFSF蛋白和Bim、TNFSF蛋白和Bid、TNFSF蛋白和Noxa、TNFSF蛋白和Puma、TNFSF蛋白和TRIF、TNFSF蛋白和ZBP1、TNFSF蛋白和RIPK1、TNFSF蛋白和RIPK3、TNFSF蛋白和MLKL、TNFSF蛋白和消皮素A、TNFSF蛋白和消皮素B、TNFSF蛋白和消皮素C、TNFSF蛋白和消皮素D、TNFSF蛋白和消皮素E以及它们的变体和它们的功能片段。
在特定的实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是TRIF或其功能片段或变体。
在特定的实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是RIPK3或其功能片段或变体。
在特定的实施例中，由该一种或多种萨诺传递多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含TRIF或其功能片段，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段。
在特定的实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是MAVS或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是RIPK3或其功能片段或变体。
在特定的实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是MAVS或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是MLKL或其功能片段或变体。
在一些实施例中，Bid的功能片段是截短的Bid(tBID)。TNFR1/Fas接合导致胞质Bid切割为截短的tBID，后者易位至线粒体。tBID多肽作为膜靶向死亡配体发挥作用。Bak缺陷型线粒体和阻断抗体揭示tBID结合其线粒体配偶体BAK以释放细胞色素c。激活的tBID导致BAK的变构激活，诱导其膜内寡聚化进入细胞色素c流出的拟议孔中，从而整合从死亡受体到细胞死亡的通路。参见Wei等人,2000,Genes&Dev.[基因与发育]14:2060-2071。
在特定的实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是MAVS或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是tBID或其功能片段或变体。
在一些实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒不包含编码TRIF的多核苷酸。
包含在工程化病毒中的附加多核苷酸描述如下。
半胱天冬酶抑制剂
工程化病毒可进一步包含一种或多种抑制靶细胞中半胱天冬酶活性的多核苷酸。在一些实施例中，抑制靶细胞中半胱天冬酶活性的多核苷酸降低一种或多种靶细胞内源性半胱天冬酶的表达或活性。降低半胱天冬酶表达的多核苷酸可包括但不限于反义DNA分子、反义RNA分子、双链RNA、siRNA或成簇的规则间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-cas)系统引导RNA。
在一些实施例中，抑制靶细胞中半胱天冬酶活性的多核苷酸编码抑制半胱天冬酶活性的多肽。在一些实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽是病毒蛋白或其变体或功能片段。示例性病毒蛋白半胱天冬酶抑制剂提供于下表6中。在一些实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽是人蛋白或其变体或功能片段。在一些实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽抑制一种或多种选自由以下组成的组的半胱天冬酶：半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9和半胱天冬酶10。在特定的实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽抑制半胱天冬酶8。在特定的实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽抑制半胱天冬酶10。在特定的实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽抑制半胱天冬酶8和半胱天冬酶10。
表6：示例性病毒蛋白半胱天冬酶抑制剂。
(改编自Mocarski等人,2011,Nat Rev Immunol[自然综述-免疫学]12月23日；12(2):79-88.doi:10.1038/nri3131，其通过援引以其全文并入本文。)
(所用缩写包括：BHV-4，牛疱疹病毒4；CMV，巨细胞病毒；DAI，干扰素调节因子的DNA依赖性激活剂；EHV-1，马疱疹病毒1；FADD，FAS相关死亡结构域蛋白；HPV-16，人乳头瘤病毒16；HSV，单纯疱疹病毒；KSHV，卡波西肉瘤相关疱疹病毒；MCMV，鼠巨细胞病毒；MCV，传染性软疣病毒；RHIM，RIP同型相互作用基序；RIP，受体相互作用蛋白；TRIF，诱导IFNβ的含TIR结构域的衔接蛋白；vICA，半胱天冬酶8激活病毒抑制剂；vIRA，RIP激活病毒抑制剂。)
Figure BDA0004097086860000611
Figure BDA0004097086860000621
在一些实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽选自由以下组成的组：Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)显性负性突变体(FADD-DN)、半胱天冬酶8激活病毒抑制剂(vICA)、细胞FLICE(FADD样IL-1β转化酶)抑制蛋白(cFLIP)、半胱天冬酶8显性负性突变体(Casp8-DN)、凋亡蛋白细胞抑制剂-1(cIAP1)、凋亡蛋白细胞抑制剂-1(cIAP2)、X-连锁凋亡抑制剂(XIAP)、TGFβ-激活激酶1(Tak1)、IκB激酶(IKK)以及它们的功能片段。
在特定的实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽是FADD-DN。死亡诱导信号传导复合物(DISC)募集包括FADD和起始半胱天冬酶诸如半胱天冬酶8的衔接蛋白。参见Morgan等人,2001,Cell Death&Differentiation[细胞死亡与分化]第8卷,第696–705页。DISC中半胱天冬酶8的聚集导致半胱天冬酶级联的激活和凋亡。FADD由两个蛋白质相互作用结构域组成：死亡结构域和死亡效应子结构域。因为FADD是DISC的必需组分，一种含有死亡结构域但没有死亡效应子结构域的显性负性突变体(FADD-DN)已被广泛用于死亡受体诱导的凋亡研究。FADD-DN作为显性负性抑制剂发挥作用，因为它与受体结合但不能募集半胱天冬酶8。
在特定的实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽是vICA。vICA蛋白是由UL36基因编码的人巨细胞病毒(CMV)蛋白。参见Skaletskaya等人,PNAS[美国国家科学院院刊]7月3日,2001 98(14)7829-7834，其通过援引以其全文并入本文。vICA蛋白通过与半胱天冬酶-8的前结构域结合并阻止其激活来抑制Fas介导的凋亡。
在特定的实施例中，抑制半胱天冬酶活性的多肽是cFLIP。cFLIP蛋白是抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Fas-L和TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的凋亡的主要抗凋亡调节剂和抗性因子。参见Safa,2012,Exp Oncol[实验肿瘤学]10月；34(3):176-84，其通过援引以其全文并入本文。cFLIP蛋白在人细胞中表达为长(cFLIP(L))、短(cFLIP(S))和cFLIP(R)剪接变体。cFLIP蛋白以配体依赖性和非依赖性方式结合FADD和/或半胱天冬酶-8或-10和TRAIL受体5(DR5)并形成凋亡抑制复合物(AIC)。这种相互作用继而防止死亡诱导信号传导复合物(DISC)的形成和随后半胱天冬酶级联的激活。还已知c-FLIP(L)和c-FLIP(S)在各种信号传导通路中具有多功能作用。在特定的实施例中，cFLIP是cFLIP(L)。在特定的实施例中，cFLIP是cFLIP(S)。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是TRIF或其功能片段或变体，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是RIPK3或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是FADD-DN或其功能片段或变体。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是TRIF或其功能片段或变体，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是RIPK3或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是vICA或其功能片段或变体。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是TRIF或其功能片段或变体，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是RIPK3或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是cFLIP或其功能片段或变体。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是MAVS或其功能片段或变体，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是RIPK3或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是FADD-DN或其功能片段或变体。
消皮素
消皮素是引起膜透化和细胞焦亡的成孔效应蛋白家族。消皮素蛋白包括消皮素A、消皮素B、消皮素C、消皮素D和消皮素E。消皮素含有通过柔性接头连接的细胞毒性N-末端结构域和C-末端阻遏物结构域。这两个结构域之间的蛋白水解切割释放对细胞毒性结构域的分子内抑制，允许其插入细胞膜并形成大的寡聚孔，这破坏离子稳态并诱导细胞死亡。参见Broz等人,2020,Nature Reviews Immunology[自然综述-免疫学]20:143–157，其通过援引以其全文并入本文。例如，消皮素E(GSDME，也称为DFNA5)可被半胱天冬酶3切割，从而在表达GSDME的细胞中将非炎性凋亡转化为细胞焦亡。类似地，半胱天冬酶1、4和5切割并激活消皮素D。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽编码消皮素或其功能片段或变体。在一些实施例中，消皮素的功能片段是消皮素A、消皮素B、消皮素C、消皮素D或消皮素E的N-末端结构域。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是TRIF或其功能片段或变体，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是RIPK3或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是消皮素或其功能片段或变体。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是TRIF或其功能片段或变体，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是RIPK3或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是消皮素E或其功能片段或变体。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是MAVS或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是消皮素D N-末端结构域或其功能片段或变体。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是MAVS或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是消皮素E N-末端结构域或其功能片段或变体。
在一些实施例中，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是MAVS或其功能片段或变体，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是tBID或其功能片段或变体，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽是消皮素E或其功能片段或变体。
除了一种或多种编码促进萨诺传递的多肽的多核苷酸之外，诸如上表2、表3、表4、表5和表6中提供的那些，工程化病毒可进一步包含一种或多种编码免疫刺激性蛋白的多核苷酸，诸如以下描述的那些。
免疫刺激性蛋白
除了一种或多种编码促进萨诺传递的多肽的多核苷酸之外，例如上表2、表3、表4和表5中提供的那些，本文披露的工程化病毒可进一步包含一种或多种编码免疫刺激性蛋白的多核苷酸。在一个实施例中，免疫刺激性蛋白是转化生长因子β(TGF-β)的拮抗剂、集落刺激因子、细胞因子、免疫检查点调节剂、flt3配体、或flt3的抗体激动剂。
集落刺激因子可以是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一个实施例中，将编码GM-CSF的多核苷酸插入ICP34.5基因座中。
细胞因子可以是白介素。在一个实施例中，该白介素选自由以下组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-24、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ。其他合适的细胞因子包括I型干扰素、γ干扰素、III型干扰素和TNFα。
在一些实施例中，免疫检查点调节剂是抑制性免疫检查点蛋白的拮抗剂。抑制性免疫检查点蛋白的实例包括但不限于ADORA2A、B7-H3、B7-H4、IDO、KIR、VISTA、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、Tim3、BTLA和CTLA4。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是刺激性免疫检查点蛋白的激动剂。刺激性免疫检查点蛋白的实例包括但不限于CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS和4-1BB。在一些实施例中，该刺激性免疫检查点蛋白的该激动剂选自CD40配体(CD40L)、ICOS配体、GITR配体、4-1-BB配体、0X40配体以及它们中任一种的修饰形式。在一些实施例中，该刺激性免疫检查点蛋白的该激动剂是选自CD40、ICOS、GITR、4-1-BB和0X40的蛋白质的抗体激动剂。
自杀基因
除了一种或多种编码促进萨诺传递的多肽的多核苷酸之外，诸如上表2A、表2B、表3、表4、表5或表6中提供的那些，本文披露的工程化病毒可进一步包含自杀基因。术语“自杀基因”是指编码将药物的无毒前体转化成细胞毒性化合物的蛋白质(例如酶)的基因。在一些实施例中，该自杀基因编码选自由以下组成的组的多肽：FK506结合蛋白(FKBP)-FAS、FKBP-半胱天冬酶-8、FKBP-半胱天冬酶-9、具有胞嘧啶脱氨酶(CDase)活性的多肽、具有胸苷激酶活性的多肽、具有尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)活性的多肽和具有嘌呤核苷磷酸化酶活性的多肽。
在一些实施例中，具有CDase活性的该多肽是FCY1、FCA1或CodA。
在一些实施例中，具有UPRTase活性的该多肽是FUR1或其变体，例如FUR1Δ105。FUR1Δ105是在编码区的5'区缺少前105个核苷酸的FUR1基因，允许UPRTase的合成，其中前35个氨基酸残基已在N-末端处缺失。FUR1Δ105以天然蛋白第36位的甲硫氨酸开始。
自杀基因可编码嵌合蛋白，例如具有CDase和UPRTase活性的嵌合蛋白。在一些实施例中，该嵌合蛋白选自codA::upp、FCY1::FUR1、FCYl::FUR1Δ105(FCU1)和FCU1-8多肽。
被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒可进一步包含编码基质金属蛋白酶的多核苷酸，例如基质金属蛋白酶9(“MMP9”)，其降解IV型胶原，IV型胶原是胶质母细胞瘤的细胞外基质(ECM)和基底膜的主要组分(Mammato等人,Am.J.Pathol.[美国病理学杂志],183(4):1293-1305(2013),doi:10.1016/j.ajpath.2013.06.026.2013年8月5日在线发表)。由于侧向传播和增强的肿瘤杀伤活性，工程化病毒对基质金属蛋白酶的表达增强了病毒对肿瘤细胞的感染。也可使用编码增强病毒侧向传播的其他基因的多核苷酸。
在一些实施例中，促进萨诺传递的多核苷酸是降低靶细胞中抑制萨诺传递的靶细胞内源性多肽的表达或活性的多核苷酸(例如编码siRNA的多核苷酸)。可抑制萨诺传递的示例性靶细胞内源性多肽提供于下表7中。
表7：抑制靶细胞中的萨诺传递的示例性多肽
多肽 登录号
FADD NP_003815
cIAP1 NP_001157.1
cIAP2 NP_001156.1
HOIL1 Q9BYM8.2
HOIP Q96EP0.1
Sharpin NP_112236.3
cFLIP BAB32551.1
A20 AAA51550.1
Tak1 NP_003179.1
IKKb NP_001547.1
IKKa NP_001269.3
IkBa NP_065390.1
P65 AAI10831.1
CYLD CAB93533.1
FSP1 AK127353
GPX4 AC004151
降低抑制萨诺传递的基因的表达的多核苷酸可包括但不限于反义DNA分子、反义RNA分子、双链RNA、siRNA或成簇的规则间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-cas)系统引导RNA。
在感染靶细胞时促进病毒萨诺传递的一种或多种多核苷酸或多肽的表达可改变靶细胞中的细胞周转通路。例如，在感染靶细胞病毒时一种或多种多核苷酸或多肽的表达可将靶细胞的正常细胞周转通路改变为促进萨诺传递的细胞周转通路，诸如例如程序性坏死(例如坏死性凋亡或细胞焦亡)、外在凋亡或铁死亡。
本文所述的病毒基因中的突变可与编码促进萨诺传递的蛋白质的多核苷酸和/或减少抑制萨诺传递的多肽表达的多核苷酸组合。在特定的实施例中，病毒是HSV1，其包含ICP34.5和ICP47基因中的失活突变(例如缺失)、ICP6的RHIM结构域中的失活突变以及编码ZBP1、RIPK3和MLKL的多核苷酸。在另一个特定的实施例中，病毒是HSV1，其包含ICP47的失活突变(例如缺失)、用痘苗病毒E3L基因的δ-Zα1突变体形式替代ICP34.5以及编码ZBP1、RIPK3和MLKL的多核苷酸。在另一个特定的实施例中，病毒是痘苗病毒，其包含E3L基因的Zα1结构域中的突变以及编码ZBP1、RIPK3和MLKL的多核苷酸。在另一个特定的实施例中，病毒是包含E1A中的24bp缺失和E1B中的827bp缺失的Ad5/F35腺病毒。
本文所述的工程化病毒可进一步包含可操作地连接到如本文所述的多核苷酸(例如，编码萨诺传递多肽的多核苷酸)以驱动多核苷酸表达的异源启动子。合适的启动子包括但不限于CMV启动子(例如，小型CMV启动子)、EF1α启动子(例如，小型EF1α启动子)、SV40启动子、PGK1启动子、多泛素C(UBC)基因启动子、人β肌动蛋白启动子和CMV增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白(CAG)杂合启动子。在一些实施例中，启动子是癌症特异性启动子，例如肿瘤特异性启动子。合适的肿瘤特异性启动子包括但不限于人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和E2F启动子。hTERT启动子驱动细胞(诸如癌细胞)中端粒酶表达增加的基因表达。E2F启动子驱动对Rb通路改变的细胞特异的基因表达。
V.病毒的靶细胞
被工程化以包含一种或多种促进本文所述萨诺传递的多核苷酸的病毒可感染一系列不同的靶细胞以促进靶细胞中的萨诺传递。靶细胞的类型包括但不限于癌细胞、免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞和被病原体感染的细胞。
本文所述的任何癌症的细胞可适合作为工程化病毒的靶细胞。在一些实施例中，靶细胞是转移性癌细胞。
在一些实施例中，靶细胞是选自肥大细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞(例如B细胞和T细胞)和本文所述的任何其他免疫细胞的免疫细胞。
在一些实施例中，靶细胞被病原体感染。示例性病原体包括细菌(例如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌)、真菌、寄生虫和病毒。示例性细菌病原体包括大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、链球菌属(Streptococcus spp.)或耐万古霉素肠球菌(Enterococcus)。真菌病原体可以是例如霉菌、酵母或高等真菌。寄生虫可以是例如单细胞或多细胞寄生虫，包括十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、卡耶塔环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)和弓形虫(Toxoplasma gondiz)。病毒可以是与AIDS、禽流感、水痘、唇疱疹、普通感冒、胃肠炎、腺热、流感、麻疹、腮腺炎、咽炎、肺炎、风疹、SARS和下呼吸道或上呼吸道感染相关的病毒(例如呼吸道合胞病毒)。在一些实施例中，病毒是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。
在一些实施例中，靶细胞(例如癌细胞)在细胞周转通路中是缺陷的。例如，靶细胞可具有编码有助于细胞周转通路的蛋白质的基因的失活突变或拷贝数损失。在一些实施例中，靶细胞缺乏免疫刺激性细胞周转通路，例如程序性坏死(例如坏死性凋亡或细胞焦亡)、外在凋亡、铁死亡或它们的组合。在一些实施例中，靶细胞具有编码受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK1)的基因、编码受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)的基因、编码Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)的基因、编码混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)的基因、编码消皮素(例如，消皮素D和/或消皮素E)的基因和编码含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)的基因中的一种或多种的失活突变。在一些实施例中，靶细胞具有降低的RIPK1、RIPK3、ZBP1、TRIF、消皮素(例如，消皮素D和/或消皮素E)和MLKL中的一种或多种的表达或活性。在一些实施例中，靶细胞不表达RIPK1、RIPK3、ZBP1、TRIF、消皮素(例如，消皮素D和/或消皮素E)和MLKL中的一种或多种。在一些实施例中，靶细胞具有编码RIPK1的基因、编码RIPK3的基因、编码ZBP1的基因、编码TRIF的基因、编码消皮素(例如消皮素D和/或消皮素E)的基因和编码MLKL的基因中的一种或多种的拷贝数损失。
在一些实施例中，在施用本文所述的组合物之前、期间和/或之后评价受试者的本文所述的靶细胞标准中的任一种或多种。
VI.促进萨诺传递的方法
本文所述的工程化病毒可用于促进靶细胞的萨诺传递。在某些方面，本披露涉及一种促进靶细胞的萨诺传递的方法，该方法包括使靶细胞与被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒接触，其中该靶细胞以足以促进靶细胞萨诺传递的量和时间与病毒接触。例如，用工程化病毒感染靶细胞和一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的表达诱导靶细胞产生由靶细胞主动释放或在靶细胞周转(例如死亡)期间暴露的因子。这些因子发信号通知应答细胞(例如免疫细胞)以进行生物应答(例如免疫活性增加)。
在一些实施例中，将工程化病毒施用于受试者以促进受试者中靶细胞的萨诺传递。例如，在某些方面，本披露涉及一种向受试者递送一种或多种萨诺传递多核苷酸的方法，该方法包括向该受试者施用包含如本文所述的工程化病毒的药物组合物。在某些方面，本披露涉及一种促进受试者中的萨诺传递的方法，该方法包括以足以促进萨诺传递的量和时间向该受试者施用包含如本文所述的工程化病毒的药物组合物。
A.增加免疫活性的方法
在一个方面，本文所述的工程化病毒可用于增加受试者(例如将受益于增加的免疫活性的受试者)的免疫活性。在某些方面，本披露涉及一种促进有需要的受试者中的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒，其中以足以促进萨诺传递的量和时间向该受试者施用该病毒，从而促进该受试者中的免疫应答。例如，靶细胞在表达一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸时产生的因子可在应答细胞(例如免疫细胞)中诱导免疫刺激性应答(例如促炎应答)。在一个实施例中，免疫应答是抗癌应答。
根据本披露的方法，免疫活性可通过靶细胞与广泛范围的免疫细胞的相互作用来调节，这些免疫细胞包括例如肥大细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞(例如B-淋巴细胞(B-细胞))和T-淋巴细胞(T-细胞))中的任一种或多种。
免疫细胞类型
肥大细胞是包含富含组胺和抗凝剂肝素的颗粒的粒细胞。激活时，肥大细胞将炎性化合物从颗粒释放到局部微环境中。肥大细胞在变态反应、过敏反应、伤口愈合、血管生成、免疫耐受、病原体防御和血脑屏障功能中发挥作用。
自然杀伤(NK)细胞是细胞毒性淋巴细胞，在无需任何事先刺激或免疫情况下裂解某些肿瘤细胞和病毒感染的细胞。NK细胞也是各种细胞因子的有效生产者，例如IFN-γ(IFNγ)、TNF-α(TNFα)、GM-CSF和IL-3。因此，也认为NK细胞在免疫系统中起调节性细胞的作用，影响其他细胞和应答。在人中，NK细胞被广泛定义为CD56+CD3-淋巴细胞。NK细胞的细胞毒性活性受到细胞表面受体激活信号和抑制信号之间平衡的严格控制。抑制NK细胞激活的主要受体组是抑制性杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)。在识别靶细胞上的自身MHC I类分子后，这些受体会递送停止激活信号传导级联的抑制信号，从而使具有正常MHC I类表达的细胞免受NK细胞裂解。激活受体包括天然细胞毒性受体(NCR)和NKG2D，它们通过与靶细胞表面上的不同配体接合而将平衡推向细胞溶解作用。因此，靶细胞的NK细胞识别受到涉及多个激活受体和抑制受体递送的信号整合的过程的严格控制。
单核细胞是骨髓来源的单核吞噬细胞，其在被募集到组织中之前在血液中循环数小时/天。参见Wacleche等人,2018,Viruses[病毒](10)2:65。各种趋化因子受体和细胞粘附分子在其表面上的表达使它们能够从骨髓中进入血液，并随后从血液募集到组织中。单核细胞属于免疫系统的先天武器，提供对病毒、细菌、真菌或寄生虫感染的应答。它们的功能包括通过吞噬作用、产生活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、髓过氧化物酶和炎性细胞因子杀死病原体。在特定条件下，单核细胞可在癌症以及感染性疾病和自身免疫性疾病中刺激或抑制T细胞应答。它们也参与组织修复和新血管形成。
巨噬细胞在称为吞噬作用的过程中吞噬并消化诸如细胞碎片、外来物质、微生物和癌细胞的物质。除吞噬作用外，巨噬细胞在非特异性防御(先天免疫)中起关键作用，并且还通过募集其他免疫细胞(例如淋巴细胞)来帮助启动特异性防御机制(适应性免疫)。例如，巨噬细胞作为针对T细胞的抗原呈递者是重要的。除了增加炎症和刺激免疫系统外，巨噬细胞还起重要的抗炎作用，并且可以通过释放细胞因子来降低免疫应答。促进炎症的巨噬细胞称为M1巨噬细胞，而减轻炎症并促进组织修复的巨噬细胞称为M2巨噬细胞。
树突状细胞(DC)在刺激针对病原体的免疫应答以及维持针对无害抗原的免疫稳态方面起关键作用。DC表示专化的抗原感测和抗原呈递细胞(APC)的异质组，它们对于诱导和调节免疫应答是必不可少的。在外周血中，人DC的特征是缺少T细胞标志物(CD3、CD4、CD8)、B细胞标志物(CD19、CD20)和单核细胞标志物(CD14、CD16)，但高表达HLA-DR和其他DC谱系标志物(例如CD1a、CD1c)。参见Murphy等人,Janeway’s Immunobiology.8th ed.[Janeway免疫生物学第8版]Garland Science；New York,NY,USA[加兰德科学出版社；美国纽约州纽约市]:2012.第868页。
术语“淋巴细胞”是指在全身淋巴组织中和正常成年人中形成的小白细胞，约占循环血液中白细胞总数的22％-28％，在保护机体抵抗疾病中起着重要作用。个体淋巴细胞是专化的，因为它们致力于通过其遗传物质的重组(例如产生T细胞受体和B细胞受体)对结构相关抗原的有限组作出应答。这种行为在免疫系统与给定抗原首次接触之前就存在，通过淋巴细胞表面膜上抗原上决定簇(表位)的特异性受体的存在来表达。每个淋巴细胞都具有独特的受体群，受体群的所有受体都具有相同的结合位点。淋巴细胞的一个组或克隆在其受体的结合区结构方面与另一克隆不同，并且因此在其可识别的表位方面也不同。淋巴细胞不仅在受体的特异性方面彼此不同，而且在其功能方面也彼此不同。(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999),第102页)。
淋巴细胞包括作为抗体分泌细胞的前体的B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。
B淋巴细胞(B细胞)
B淋巴细胞源自骨髓的造血细胞。成熟的B细胞可以用表达被其细胞表面识别的表位的抗原激活。激活过程可以是直接的(这依赖于抗原对膜Ig分子的交联(交联依赖性B细胞激活))，也可以是间接的(通过在称为同源辅助的过程中与辅助T细胞的相互作用)。在许多生理情况下，受体交联刺激和同源辅助协同产生更强烈的B细胞应答(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
交联依赖性B细胞激活需要抗原表达与细胞表面受体的结合位点互补的表位的多个拷贝，因为每个B细胞表达具有相同可变区的Ig分子。具有重复表位的其他抗原，例如微生物的荚膜多糖或病毒包膜蛋白，可以满足这种要求。交联依赖性B细胞激活是针对这些微生物的主要保护性免疫应答(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:anintroduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
同源辅助使B细胞针对无法交联受体的抗原进行应答，同时当B细胞受到弱交联事件刺激时，提供共刺激信号，拯救B细胞免于失活。同源辅助依赖于B-细胞膜免疫球蛋白(Ig)对抗原的结合、抗原的胞吞作用以及其在细胞的内体/溶酶体区室中断裂成肽。一些得到的肽被装载到称为II类主要组织相容性复合物(MHC)分子的专门的一组细胞表面蛋白的凹槽中。所得的II类/肽复合物在细胞表面表达，并充当一组T细胞(称为CD4+T细胞)的抗原特异性受体的配体。CD4+T细胞在其表面上具有针对B细胞的II类/肽复合物特异性的受体。B细胞激活不仅依赖于T细胞通过其T细胞受体(TCR)的结合，而且这种相互作用还允许T细胞上的激活配体(CD40配体)与其在B细胞上的受体(CD40)结合，从而信号传导B细胞激活。此外，T辅助细胞分泌几种细胞因子，这些细胞因子通过与B细胞上的细胞因子受体结合来调节受刺激的B细胞的生长和分化(Paul,W.E.,“Chapter1:The immune system:anintroduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
在针对抗体产生的同源辅助过程中，CD40配体在激活的CD4+T辅助细胞上瞬时表达，并它与抗原特异性B细胞上的CD40结合，从而转导第二共刺激信号。第二共刺激信号对于B细胞的生长和分化以及对于记忆B细胞的生成(通过防止已遇到抗原的生发中心B细胞的凋亡)是必要的。B和T细胞两者中CD40配体的超表达与人SLE患者的致病性自身抗体产生有关(Desai-Mehta,A.等人,“Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cells inhuman lupus and its role in pathogenic autoantibody production[在人狼疮中B和T细胞中CD40配体的超表达及其在致病性自身抗体产生中的作用],”J.Clin.Invest.[临床研究杂志]卷97(9),2063-2073,(1996))。
T淋巴细胞(T细胞)
源自造血组织前体的T淋巴细胞在胸腺中分化，然后接种到外周淋巴组织和淋巴细胞再循环池中。T淋巴细胞或T细胞介导范围广泛的免疫学功能。这些包括辅助B细胞发展为产生抗体的细胞的能力、增强单核细胞/巨噬细胞杀微生物作用的能力、抑制某些类型的免疫应答、直接杀伤靶细胞以及动员炎性应答。这些作用依赖于特异性细胞表面分子的T细胞表达和细胞因子的分泌(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
T细胞与B细胞的抗原识别机制不同。免疫球蛋白(B细胞的受体)与可溶性分子或颗粒表面的独特表位结合。B细胞受体针对在天然分子表面表达的表位。当抗体和B细胞受体进化为结合细胞外液中的微生物并针对细胞外液中的微生物保护时，T细胞识别其他细胞表面的抗原并介导它们的功能，这是通过与这些抗原呈递细胞(APC)相互作用和改变其行为。外周淋巴器官中有三种可以激活T细胞的主要APC类型：树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。其中最有效的是树突状细胞，其唯一功能是将外来抗原呈递给T细胞。未成熟的树突状细胞位于全身的组织中，包括皮肤、肠道和呼吸道。当它们在这些部位遇到入侵的微生物时，会吞噬病原体及其产物，并通过淋巴将其携带到局部淋巴结或肠道相关的淋巴器官。与病原体的遭遇会诱导树突状细胞从抗原捕获细胞成熟为可以激活T细胞的APC。APC在其表面显示三种类型的蛋白质分子，这些分子在激活T细胞成为效应细胞方面具有作用：(1)MHC蛋白，其向T细胞受体呈递外来抗原；(2)共刺激蛋白，其与T细胞表面互补受体结合；和(3)细胞-细胞粘附分子，其能够使T细胞与APC结合足够长的时间以变得激活(“Chapter 24:The adaptive immune system,”[第24章：适应性免疫系统]Molecular Biology of theCell[细胞分子生物学],Alberts,B.等人,Garland Science,NY[加兰德科学出版社，纽约市],(2002))。
T细胞根据其表达的细胞表面受体被分为两个不同的类别。大多数T细胞表达由α和β链组成的T细胞受体(TCR)。一小组T细胞表达由γ和δ链组成的受体。α/βT细胞中有两个亚谱系：那些表达共受体分子CD4的细胞(CD4+T细胞)；和那些表达CD8的细胞(CD8+T细胞)。这些细胞在它们识别抗原的方式以及其效应子功能和调节功能方面有所不同。
CD4+T细胞是免疫系统的主要调节性细胞。它们的调节功能依赖于它们的细胞表面分子的表达(例如CD40配体，当T细胞被激活时其表达被诱导)，以及它们在激活时分泌的多种细胞因子。
T细胞还介导重要的效应子功能，其中的某些由它们分泌的细胞因子的模式决定。细胞因子对靶细胞可以直接是毒性的并且可以动员有效的炎性机制。
此外，T细胞，特别是CD8+T细胞，可发育成细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其能够有效裂解表达由CTL识别的抗原的靶细胞(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:anintroduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
T细胞受体(TCR)识别由以下组成的组的复合物：与II类或I类MHC蛋白的专化凹槽结合的抗原的蛋白水解来源的肽。CD4+T细胞仅识别肽/II类复合物，而CD8+T细胞识别肽/I类复合物(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
在APC内产生TCR的配体(即肽/MHC蛋白复合物)。通常，II类MHC分子结合由APC通过内吞过程摄取的蛋白质来源的肽。这些载有肽的II类分子随后在细胞表面表达，在那里它们可被CD4+T细胞(其具有能够识别表达的细胞表面复合物的TCR)结合。因此，CD4+T细胞专门与源自细胞外来源的抗原反应(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:anintroduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
相比之下，I类MHC分子主要加载源自内部合成蛋白(例如病毒蛋白)的肽。这些肽是通过蛋白酶体的蛋白水解作用从细胞溶质蛋白产生，并被转运到粗糙内质网中。通常由长度为九个氨基酸构成的此类肽结合到I类MHC分子中，并被带到细胞表面，在这里它们可以被表达适当受体的CD8+T细胞识别。这使T细胞系统(尤其是CD8+T细胞)能够检测表达以下蛋白的细胞，这些蛋白与生物体其余部分的细胞的那些(例如，病毒抗原)或突变体抗原(例如活性癌基因产物)不同或比其以大得多的量产生，即使这些蛋白以其完整形式既不在细胞表面表达也不被分泌(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
T细胞也可以根据其作为辅助T细胞的功能进行分类；参与诱导细胞免疫的T细胞；阻抑性T细胞；和细胞毒性T细胞。
辅助T细胞
辅助T细胞是刺激B细胞对蛋白质和其他T细胞依赖性抗原产生抗体应答的T细胞。T细胞依赖性抗原是免疫原，其中独特表位仅出现一次或出现有限次数，因此它们无法交联B细胞的膜免疫球蛋白(Ig)或效率低下。B细胞通过其膜Ig结合抗原，并且复合物经历胞吞作用。在内体区室和溶酶体区室中，抗原通过蛋白水解酶被片段化为肽，并且产生的肽中的一种或多种被加载到II类MHC分子中，这些MHC分子运输通过该囊泡室。然后将所得的肽/II类MHC复合物输出至B细胞表面膜。具有肽/II类分子复合物特异性受体的T细胞可在B细胞表面识别该复合物。(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
B细胞激活依赖于以下两者：T细胞通过其TCR的结合以及T细胞CD40配体(CD40L)与B细胞上CD40的相互作用。T细胞不组成型表达CD40L。而是，与APC相互作用的结果是诱导CD40L表达，该APC表达被T细胞的TCR识别的同源抗原和CD80或CD86。CD80/CD86通常由激活的而不是由静息的B细胞表达，因此涉及激活的B细胞和T细胞的辅助相互作用可以导致有效的抗体产生。但是，在许多情况下，CD40L在T细胞上的初始诱导依赖于它们对组成型表达CD80/86的APC(例如树突状细胞)的表面抗原的识别。然后，这种激活的辅助T细胞可以有效地与B细胞相互作用并辅助B细胞。即使效率低下，B细胞上膜Ig的交联也可与CD40L/CD40相互作用协同以产生强烈的B细胞激活。B细胞应答中的后续事件(包括增殖，Ig分泌和所表达的Ig类别的类别转换)依赖于T细胞来源的细胞因子的作用或被其增强(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
CD4+T细胞倾向于分化为主要分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、和IL-10的细胞(TH2细胞)或分化为主要产生IL-2、IFN-γ和淋巴毒素(TH1细胞)的细胞。TH2细胞在辅助B细胞发展为产生抗体的细胞方面非常有效，而TH1细胞则是细胞免疫应答的有效诱导剂，涉及单核细胞和巨噬细胞的杀微生物活性的增强，并且因此增加了细胞内囊泡隔室中裂解微生物的效率。尽管具有TH2细胞表型的CD4+T细胞(即IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)是有效的辅助细胞，但TH1细胞也具有作为辅助细胞的能力(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:anintroduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
T细胞参与细胞免疫诱导
T细胞还可以起到增强单核细胞和巨噬细胞破坏细胞内微生物的能力的作用。特别是，辅助T细胞产生的干扰素-γ(IFN-γ)增强单核吞噬细胞破坏细胞内细菌和寄生虫的几种机制，包括一氧化氮的产生和肿瘤坏死因子(TNF)产生的诱导。TH1细胞有效增强杀微生物作用，因为它们产生IFN-γ。相反，由TH2细胞产生的两种主要细胞因子IL-4和IL-10阻断这些活性(Paul,W.E.,“Chapter 1:The immune system:an introduction[第1章：免疫系统：介绍],”Fundamental Immunology[基础免疫学],第4版,Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven出版社(Lippicott-Raven Publishers),费城(Philadelphia),(1999))。
调节性T(Treg)细胞
免疫稳态是通过免疫应答的启动和下调之间的受控平衡来维持。凋亡和T细胞无反应性的机制(一种耐受机制，其中T细胞在遇到抗原后固有地功能失活(Schwartz,R.H.,“T cell anergy[T细胞无反应性]”,Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度回顾],卷21:305-334(2003))有助于免疫应答的下调。第三种机制是通过阻抑性或调节性CD4+T(Treg)细胞主动阻抑激活的T细胞而提供(在Kronenberg,M.等人,“Regulation of immunity by self-reactive T cells[自身反应性T细胞对免疫力的调节]”,Nature[自然],卷435:598-604(2005)中综述)。组成型表达IL-2受体α(IL-2Rα)链的CD4+Treg(CD4+CD25+)是天然存在的T细胞亚群，其是无反应性的和阻抑性的(Taams,L.S.等人,“Human anergic/suppressiveCD4+CD25+T cells:a highly differentiated and apoptosis-prone population[人无反应性/阻抑性CD4+CD25+T细胞：高度分化且易发生凋亡的群体]”,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]卷31:1122-1131(2001))。人CD4+CD25+Treg，类似于它们的鼠对应物，在胸腺中产生，并且特征在于能够通过细胞-细胞接触依赖性机制阻抑应答性T细胞的增殖、不能产生IL-2、以及体外的无反应性表型。根据CD25的表达水平，人CD4+CD25+T细胞可分为阻抑性(CD25高)和非阻抑性(CD25低)细胞。叉形转录因子家族的成员FOXP3已显示在鼠和人CD4+CD25+Treg中表达，并且似乎是控制CD4+CD25+Treg发育的主要基因(Battaglia,M.等人,“Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+Foxp3+regulator T cellsof both healthy subjects and type 1diabetic patients[雷帕霉素促进健康受试者和1型糖尿病患者的功能性CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的扩增]”,J.Immunol.[免疫学杂志],卷177:8338-8347,(2006))。因此，在一些实施例中，免疫应答的增加可能与缺乏调节性T细胞的激活或增殖有关。
细胞毒性T淋巴细胞
识别来自靶细胞内产生的蛋白质的肽的CD8+T细胞具有细胞毒性，因为它们导致靶细胞裂解。CTL诱导的裂解机制涉及CTL产生穿孔素，穿孔素是可以插入靶细胞的膜中并促进该细胞裂解的分子。穿孔素介导的裂解被颗粒酶增强，颗粒酶是由激活的CTL产生的一系列酶。许多活性CTL还在其表面表达大量fas配体。CTL表面上的fas配体与靶细胞表面上的fas的相互作用启动靶细胞的凋亡，导致这些细胞死亡。CTL介导的裂解似乎是破坏病毒感染的细胞的主要机制。
淋巴细胞激活
术语“激活”或“淋巴细胞激活”是指特异性抗原、非特异性有丝分裂原或同种异体细胞刺激淋巴细胞，从而导致RNA、蛋白质和DNA的合成以及淋巴因子的产生；随后是各种效应细胞和记忆细胞的增殖和分化。T细胞激活依赖于TCR/CD3复合物与其同源配体的相互作用，同源配体是结合在I类或II类MHC分子的凹槽中的肽。通过受体接合而调动的分子事件是复杂的。最早的步骤之一似乎是酪氨酸激酶的激活，从而导致控制几个信号传导通路的一组底物的酪氨酸磷酸化。这些包括一组将TCR连接至ras通路的衔接蛋白，磷脂酶Cγ1，其酪氨酸磷酸化增加其催化活性并参与肌醇磷脂代谢通路，从而导致细胞内游离钙浓度升高和蛋白激酶C激活，以及控制细胞生长和分化的一系列其他酶激活。T细胞的完全应答性，除了受体接合外，还需要辅助细胞递送的共刺激活性，例如，T细胞上的CD28与APC上的和/或CD80和/或CD86接合。
T记忆细胞
在通过适应性免疫应答识别和根除病原体后，绝大多数(90％-95％)T细胞发生凋亡，其余细胞形成记忆T细胞池，称为中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和常驻记忆T细胞(TRM)(Clark,R.A.,“Resident memory T cells in human health and disease[人健康和疾病中的常驻记忆T细胞]”,Sci.Transl.Med.[科学转化医学],7,269rv1,(2015))。
与标准T细胞相比，这些记忆T细胞寿命长，具有不同的表型，例如特定的表面标志物的表达、不同细胞因子谱的快速产生、直接效应细胞功能的能力以及独特的归巢分布模式。记忆T细胞在重新暴露于其各自的抗原后表现出快速反应，从而消除冒犯者的再感染，并且从而迅速恢复免疫系统的平衡。越来越多的证据证实，自身免疫记忆T细胞阻碍了大多数治疗或治愈自身免疫性疾病的尝试(Clark,R.A.,“Resident memory T cells in humanhealth and disease[人健康和疾病中的常驻记忆T细胞]”,Sci.Transl.Med.[科学转化医学],卷7,269rv1,(2015))。
增加免疫活性
被工程化以包含一种或多种促进本文所述的萨诺传递的多核苷酸的病毒可通过增加组织或受试者中本文所述的免疫细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞和CD4+、CD8+或CD3+细胞(例如CD4+、CD8+或CD3+T细胞))中的任一种或多种的水平或活性来增加组织或受试者中的免疫活性。例如，在一个实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒以足以在组织或受试者中增加以下一种或多种的量施用：巨噬细胞的水平或活性、单核细胞的水平或活性、树突状细胞的水平或活性、T细胞的水平或活性、B细胞的水平或活性，以及CD4+、CD8+或CD3+细胞(例如CD4+、CD8+或CD3+T细胞)的水平或活性。
在一些方面，本披露涉及一种增加组织或受试者中巨噬细胞、单核细胞、B细胞、T细胞和/或树突状细胞的水平或活性的方法，该方法包括向该组织或受试者施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒，其中该病毒以足以相对于未用工程化病毒治疗的组织或受试者增加巨噬细胞、单核细胞、B细胞、T细胞和/或树突状细胞的水平或活性的量施用。
在一个实施例中，受试者需要增加的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、B细胞和/或T细胞的水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用工程化病毒治疗的组织或受试者，巨噬细胞、单核细胞、B-细胞、T-细胞或树突状细胞的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。
在一些方面，本披露涉及一种增加组织或受试者中CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性的方法，该方法包括按以下量向该受试者施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒，该量足以相对于未用工程化病毒治疗的组织或受试者增加CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性。
在一个实施例中，受试者需要增加的CD4+、CD8+、或CD3+细胞水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用工程化病毒治疗的组织或受试者，CD4+、CD8+或CD3+细胞的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。
被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒还可通过增加由免疫细胞产生的促免疫细胞因子的水平或活性来增加细胞、组织或受试者中的免疫活性。例如，在一些实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒以足以在细胞、组织或受试者中增加由免疫细胞产生的促免疫细胞因子的水平或活性的量施用。在一个实施例中，促免疫细胞因子选自IFN-α、IL-1、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17和GMCSF。
在一些方面，本披露涉及一种在本文所述的免疫细胞中诱导促炎性转录应答的方法，例如在组织或受试者的免疫细胞中诱导NFkB通路、干扰素IRF信号传导和/或STAT信号传导，该方法包括按以下量向该组织或受试者施用被工程化以包含一种或多种多促进萨诺传递的核苷酸的病毒，该量足以在免疫细胞中诱导促炎性转录应答即NFkB通路、干扰素IRF信号传导和/或STAT信号传导。
被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒还可通过调节经由核酸的细胞内感受器(例如干扰素基因刺激因子(STING))的信号传导来增加细胞、组织或受试者中的免疫活性。
在一些方面，本披露涉及一种通过调节经由核酸的细胞内感受器(例如干扰素基因刺激因子(STING))的信号传导来增加细胞、组织或受试者中的免疫活性的方法，该方法包括按以下量向该组织或受试者施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒，该量足以通过调节经由核酸的细胞内感受器(例如干扰素基因刺激因子(STING))的信号传导来增加细胞、组织或受试者中的免疫活性。
通过在本文所述的免疫细胞中诱导促炎性转录应答，例如诱导激活B细胞的核因子κ轻链增强子(NFkB)通路、干扰素调节因子(IRF)信号传导和/或STAT信号传导，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒也可增加细胞、组织或受试者中的免疫活性。例如，在一些实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒以足以在免疫细胞中诱导NFkB通路、干扰素IRF信号传导和/或STAT信号传导的量施用。
在一些方面，本披露涉及一种在本文所述的免疫细胞中诱导促炎转录应答的方法，例如在组织或受试者的免疫细胞中诱导NFkB通路、干扰素IRF信号传导和/或STAT信号传导，该方法包括向该组织或受试者施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒，其中该病毒以足以在免疫细胞中诱导促炎转录应答即NFkB通路、干扰素IRF信号传导和/或STAT信号传导的量施用。
被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒还可通过诱导或调节抗体应答来增加组织或受试者中的免疫活性。例如，在一些实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒以足以在组织或受试者中诱导或调节抗体应答的量施用。
在一些方面，本披露涉及一种通过诱导或调节组织或受试者中免疫细胞的抗体应答来增加组织或受试者中的免疫活性的方法，该方法包括向组织或受试者施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒，其中该病毒以足以相对于未用工程化病毒治疗的组织或受试者增加组织或受试者中免疫活性的量施用
在一些方面，本披露涉及一种增加细胞、组织或受试者中促免疫细胞因子的水平或活性的方法，该方法包括向该细胞、组织或受试者施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒，其中该病毒以足以相对于未用工程化病毒治疗的细胞、组织或受试者增加促免疫细胞因子的水平或活性的量施用。
在一个实施例中，受试者需要增加的促免疫细胞因子水平或活性。
在一个实施例中，相对于未用工程化病毒治疗的细胞、组织或受试者，促免疫细胞因子的水平或活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或至少2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。
在一个实施例中，促免疫细胞因子选自IFN-α、IL-1、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17和GMCSF。
在一些实施例中，本文披露的方法进一步包括，在施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒之前，评价组织或受试者的以下中的一项或多项：巨噬细胞的水平或活性；单核细胞的水平或活性；树突状细胞的水平或活性；CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞的水平或活性；T细胞的水平或活性；B细胞的水平或活性，以及促免疫细胞因子的水平或活性。
在一个实施例中，本发明的方法进一步包括在施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒之后，评价细胞、组织或受试者的以下中的一项或多项：NFkB、IRF或STING的水平或活性；巨噬细胞的水平或活性；单核细胞的水平或活性；树突状细胞的水平或活性；CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞的水平或活性；T细胞的水平或活性；以及促免疫细胞因子的水平或活性。
测量NFkB、IRF或STING的水平或活性；巨噬细胞的水平或活性；单核细胞的水平或活性；树突状细胞的水平或活性；CD4+细胞、CD8+细胞或CD3+细胞的水平或活性；T细胞的水平或活性；以及促免疫细胞因子的水平或活性的方法在本领域中是已知的。
例如，可以通过本领域已知的合适技术(包括ELISA、蛋白质印迹或原位杂交)来测量NFkB、IRF或STING的蛋白水平或活性。可以使用本领域已知的合适技术来测量编码NFkB、IRF或STING的核酸(例如mRNA)的水平，这些技术包括聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、定量实时PCR、单链构象多态性分析(SSCP)、错配切割检测、异双链体分析、RNA印迹分析、原位杂交、阵列分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析及其组合或子组合。
测量巨噬细胞水平和活性的方法描述于例如Chitu等人,2011,Curr ProtocImmunol[免疫学当前方案]14:1-33中。可以通过流式细胞术来测量单核细胞的水平和活性，如例如在Henning等人,2015,Journal of Immunological Methods[免疫学方法杂志]423:78-84中所述。树突状细胞的水平和活性可以通过流式细胞术来测量，如例如在Dixon等人,2001,Infect Immun.[感染与免疫]69(7):4351-4357中所述。这些参考文献中的每一者通过援引以其全文并入本文。
可以使用基于人CD4+T细胞的增殖测定法评估T细胞的水平或活性。例如，用荧光染料5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记细胞。那些增殖的细胞显示CFSE荧光强度降低，这可通过流式细胞术直接测量。替代性地，放射性胸腺嘧啶核苷掺入可用于评估T细胞的生长速率。
在一些实施例中，免疫应答的增加可能与调节性T细胞(Treg)的激活减少有关。可以使用体外Treg阻抑测定法评估功能活性T reg。此类测定法在Collinson和Vignali中进行了描述(Methods Mol Biol.[分子生物学方法]2011；707:21-37，通过援引以其全文并入本文)。
促免疫细胞因子的水平或活性可以例如在CD8+T细胞中定量。在实施例中，促免疫细胞因子选自干扰素α(IFN-α)、白介素-1(IL-1)、IL-12、IL-18、IL-2、IL-15、IL-4、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-17、和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。可以使用ELISPOT(酶联免疫斑点)技术进行定量，该技术可检测应答抗原性刺激而分泌给定细胞因子(例如IFN-α)的T细胞。在已用例如抗-IFN-α抗体包被的孔中将T细胞与抗原呈递细胞培养。分泌的IFN-α被包被的抗体捕获，并且然后用偶联到生色底物上的第二抗体显示。因此，局部分泌的细胞因子分子形成斑点，每个斑点对应于一个IFN-α分泌细胞。斑点的数量允许人们确定所分析样品中对给定抗原具有特异性的IFN-α分泌细胞的频率。还描述了ELISPOT测定法用于检测TNF-α、白介素-4(IL-4)、IL-6、IL-12和GMCSF。
VII.治疗癌症的方法
如本文所提供的，用包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒感染靶细胞可激活免疫细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞等)，并因此可增强免疫细胞功能，例如，涉及癌症治疗的免疫疗法的那些。因此，在某些方面，本披露涉及一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用被工程化以包含一种或多种促进癌细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒，其中以足以促进萨诺传递的量和时间向该受试者施用该病毒，从而治疗该受试者中的癌症。
癌细胞利用一系列复杂、重叠的机制阻止免疫系统将自身与非自身区分开的能力代表了癌症逃避免疫监视的基本机制。一种或多种机制包括破坏抗原呈递、破坏控制T细胞激活或抑制的调节通路(免疫检查点调节)、募集有助于免疫阻抑的细胞(Treg、MDSC)或释放影响免疫活性的因子(IDO、PGE2)。(参见Harris等人,2013,J Immunotherapy Cancer[癌症免疫疗法杂志]1:12；Chen等人,2013,Immunity[免疫]39:1；Pardoll,等人,2012,NatureReviews:Cancer[自然评论：癌症]12:252；和Sharma等人,2015,Cell[细胞]161:205，其每一者均通过援引以其全文并入本文。)
使用本文所述的方法进行治疗的癌症包括，例如，哺乳动物中发现的所有类型的癌症或赘生物或恶性肿瘤，包括但不限于：肉瘤、黑色素瘤、上皮癌、白血病和淋巴瘤。
术语“肉瘤”通常是指由诸如胚胎结缔组织的物质构成的肿瘤，并且通常由嵌入纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞构成。可以用本发明的方法治疗的肉瘤的实例包括，例如，软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、阿贝西米肉瘤(Abemethy's sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆斯瘤肉瘤(Wilms'tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、纤维母细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素性出血肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹恩逊氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波西肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病肉瘤、恶性间叶瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、鲁斯氏肉瘤(Roussarcoma)、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、子宫肉瘤、粘液性脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、梭形细胞肉瘤、促结缔组织增生肉瘤和毛细血管扩张肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。
术语“黑色素瘤”是指源自皮肤和其他器官的黑素细胞系统的肿瘤。可以用本发明的方法治疗的黑色素瘤包括，例如，肢端雀斑样痣黑色素瘤(acral-lentiginousmelanoma)、无黑素性黑色素瘤、良性青少年黑色素瘤、Cloudman黑色素瘤、S91黑色素瘤、Harding-Passey黑色素瘤、青少年黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、舌下黑色素瘤和浅表扩散性黑色素瘤。
术语“上皮癌”是指由上皮细胞构成的恶性新生长，趋于浸润周围组织并引起转移。如本文所述，可以用本发明的方法治疗的上皮癌包括，例如，腺泡癌、腺癌、腺囊癌、腺样囊性癌、腺瘤癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底上皮细胞癌、基底样癌、基底鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、支气管癌、支气管源性癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒膜上皮癌、胶样癌、结肠的结肠腺癌、粉刺性癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬脑膜癌、胚胎性癌、髓样癌、上皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性胃癌(carcinoma ex ulcere)、纤维瘤、胶样癌、胶状癌、巨细胞癌(giant cellcarcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌、血癌、肝细胞癌、许特耳氏细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明癌(hyaline carcinoma)，肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩切氏癌(Krompecher's carcinoma)，Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素鳞癌、软癌(carcinoma molle)、默克尔细胞癌(merkelcell carcinoma)、粘液性癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinomamyxomatode)、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌(carcinoma ossifican)、骨样癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、阴囊癌(carcinoma scroti)，印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、茄状癌(solanoid carcinoma)，球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌(carcinomaspongiosum)、鳞状细胞癌(squamous carcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cellcarcinoma)、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinomatuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌(verrucous carcinoma)、宫颈鳞状细胞癌、扁桃体鳞状细胞癌和绒毛状癌。在特定实施例中，该癌症是肾细胞癌。
术语“白血病”是指以未成熟白细胞(称为“母细胞”)异常增加为特征的血液或骨髓的癌症类型。白血病是涵盖广泛疾病的广义术语。反过来，它是影响血液、骨髓和淋巴系统的更广泛疾病组的一部分，这些疾病都被称为血液赘生物。白血病可分为四个主要类别：急性淋巴细胞(淋巴母细胞)白血病(ALL)、急性骨髓性(或髓系或非淋巴细胞)白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML)。白血病的其他类型包括毛细胞白血病(HCL)、T细胞淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病和成人T细胞白血病。在某些实施例中，白血病包括急性白血病。在某些实施例中，白血病包括慢性白血病。
术语“淋巴瘤”是指从淋巴细胞发展而来的一组血细胞肿瘤。淋巴瘤的两个主要类别是霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。淋巴瘤包括淋巴组织的任何赘生物。主要类别是淋巴细胞的癌症，淋巴细胞是一种既属于淋巴液又属于血液并遍及在两者中的白细胞。
在一些实施例中，这些组合物用于治疗各种类型的实体瘤，例如乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、膀胱癌、泌尿生殖道癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、肾(肾细胞)癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌(例如甲状腺乳头状癌)、皮肤癌、骨癌、脑癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、口癌和口腔癌、食道癌、腺样囊性癌、神经母细胞瘤、睾丸癌、子宫癌、甲状腺癌、头颈癌、肾癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌、子宫颈癌、髓母细胞瘤和外阴癌。在某些实施例中，皮肤癌包括黑色素瘤、鳞状细胞癌和皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。
在特定的实施例中，待治疗的癌症可以是“免疫冷”的癌症，例如含有少量浸润性T细胞的肿瘤，或不被免疫系统识别且不引起强烈应答的癌症，这使得难以用目前的免疫疗法治疗。例如，在一个实施例中，癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肉瘤、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、胃食管癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、恶性间皮瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓发育不良综合征、多发性骨髓瘤、移行细胞癌、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、维尔姆斯瘤和肝细胞癌(例如肝细胞性肝癌)。
在一些实施例中，待治疗的癌症对免疫疗法有应答，例如免疫检查点疗法诸如免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，对免疫疗法有应答的癌症选自由以下组成的组：鳞状细胞头颈癌、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、肝细胞癌、晚期肾细胞癌、转移性高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷型(dMMR)癌症(例如MSI-H或dMMR结直肠癌)、宫颈癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、胃和食管胃结合部(GEJ)癌、霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)和尿路上皮癌(例如局部晚期或转移性尿路上皮癌)。
在一些实施例中，本文所述的疗法可以施用于先前已经用另一种抗肿瘤(例如免疫治疗)方案治疗癌症失败的受试者。“抗肿瘤方案失败的受试者”是患有癌症的受试者，其根据RECIST 1.1标准对抗肿瘤方案的治疗无应答或停止应答，即未达到完全应答，部分应答或靶病变中的疾病稳定；或在抗肿瘤治疗方案(单独或与手术和/或放射疗法(可能的话通常在临床上指示与抗肿瘤疗法联合)联合使用)期间或完成后未实现非靶病变的完全应答或非CR/非PD。RECIST 1.1标准描述于例如Eisenhauer等人,2009,Eur.J.Cancer[欧洲癌症杂志]45:228-24(其通过援引以其全文并入本文)，并且在下文中更详细地讨论。抗肿瘤疗法的失败导致例如，肿瘤生长、增加的肿瘤负荷和/或肿瘤转移。如本文所用的失败的抗肿瘤方案包括由于剂量限制性毒性(例如不能解决以允许继续或恢复引起毒性的抗肿瘤剂或方案的治疗的III级或IV级毒性)而终止的治疗方案。在一个实施例中，受试者用抗肿瘤方案治疗失败，该抗肿瘤方案包括施用一种或多种抗血管生成剂。
失败的抗肿瘤方案包括如下治疗方案，该治疗方案针对所有靶病变和非靶病变不导致至少稳定的疾病持续延长的时间段，例如至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月或少于临床定义的治愈的任何时间段。失败的抗肿瘤方案包括如下治疗方案，该方案在用抗肿瘤剂治疗期间导致至少一个靶病变的进展性疾病，或在结束治疗方案后少于2周、少于1个月、少于两个月、少于3个月、少于4个月、少于5个月、少于6个月、少于12个月或少于18个月、或少于任何少于临床定义的治愈的时间段导致进展性疾病。
失败的抗肿瘤方案不包括如下治疗方案，其中治疗癌症的受试者在治疗方案结束后达到临床定义的治愈(例如，5年完全应答)，并且其中随后在治疗方案结束后，例如，超过5年、超过6年、超过7年、超过8年、超过9年、超过10年、超过11年、超过12年、超过13年、超过14年、或超过15年诊断出该受试者具有不同癌症。
RECIST标准是临床上接受的评估标准，用于提供实体瘤测量的标准方法，并提供用于临床试验中客观评估肿瘤大小变化的定义。这样的标准也可以用于监测进行实体瘤治疗的个体的应答。RECIST 1.1标准在Eisenhauer等人,2009,Eur.J.Cancer[欧洲癌症杂志]45:228-24中有详细讨论，其通过援引以其全文并入本文。靶病变的应答标准包括：
完全应答(CR)：所有靶病变消失。任何病理性淋巴结(无论是靶还是非靶)都必须将短轴减小至<10mm。
部分应答(PR)：以基线直径总和为参考，靶病变直径总和至少减少30％。
进展性疾病(PD)：靶病变的直径总和增加至少20％，以研究中的最小总和作为参考(如果研究中基线总和最小，则包括基线总和)。除了20％的相对增加之外，总和还必须显示出至少5mm的绝对增加。(注：一个或多个新病变的出现也被认为是进展。)
稳定性疾病(SD)：以研究时最小的直径总和作为参考，既没有足够的收缩率来满足PR，也没有足够的增加来满足PD。
RECIST 1.1标准还考虑了非靶病变，其定义为可测量但无需测量的病变，仅应在期望时间点进行定性评估。非靶病变的应答标准包括：
完全应答(CR)：所有非靶病变消失和肿瘤标志物水平正常化。所有淋巴结的大小均必须是非病理性的(短轴<10mm)。
非CR/非PD：一个或多个非靶病变的持续存在和/或肿瘤标志物水平维持在正常限度以上。
进展性疾病(PD)：现有非靶病变的明确进展。一个或多个新病变的出现也被视为进展。为了在非靶疾病的基础上实现“明确的进展”，非靶疾病的整体水平必须严重恶化，以使即使在靶疾病中存在SD或PR的情况下，总体肿瘤负荷也已增加足以值得中止疗法。一个或多个非靶病变的大小适度地“增加”通常不足以证明明确的进展状态。因此，仅基于面对靶疾病中的SD或PR的非靶疾病的变化来指定总体进展极为罕见。
在一些实施例中，本文所述的药物组合物和组合疗法可以施用于患有难治性癌症的受试者。“难治性癌症”是手术无效的恶性肿瘤，其最初对化学疗法或放射疗法无应答，或者随着时间的推移对化学疗法或放射疗法无应答。
本发明还提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，该方法包括施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒，使得肿瘤细胞生长被抑制。在某些实施例中，与对照(例如未用工程化病毒治疗的受试者)相比，治疗癌症包括延长存活或延长肿瘤进展时间。在某些实施例中，该受试者是人受试者。在一些实施例中，在施用第一剂量的被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒之前，受试者被鉴定为患有癌症(例如肿瘤)。在某些实施例中，受试者在第一次施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒时患有癌症(例如肿瘤)。
在一个实施例中，施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒导致以下中的一项或多项：减少癌细胞的增殖、减少癌细胞的转移、减少肿瘤的新血管形成、减少肿瘤负荷、减少肿瘤大小、重量或体积，抑制肿瘤生长、增加癌症进展的时间、和/或延长患有肿瘤障碍的受试者的存活时间。在某些实施例中，相对于未施用工程化病毒的对应对照受试者，施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒将癌细胞的增殖减少、将癌细胞的转移减少、将肿瘤的新血管形成减少、将肿瘤负荷减少、将肿瘤大小、重量或体积减少、将进展时间增加、将肿瘤生长抑制和/或将受试者的存活时间延长至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在某些实施例中，相对于未施用工程化病毒的患有肿瘤障碍的对照受试者的对应群体，施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒将癌细胞的增殖减少、将癌细胞的转移减少、将肿瘤的新血管形成减少、将肿瘤负荷减少、将肿瘤大小、重量或体积减少、将进展时间增加、将肿瘤生长抑制和/或将患有肿瘤障碍的受试者群体的存活时间延长至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在一些实施例中，癌细胞的增殖是由施用于受试者的癌症疗法导致的癌细胞的过度增殖。在一些实施例中，施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒在治疗之前稳定患有进行性肿瘤障碍的受试者中的肿瘤障碍。
工程化病毒和附加治疗剂的组合疗法
术语“组合施用”、“组合疗法”、“共同施用”或“共同施用”可指与一种或多种附加治疗剂组合施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的核苷酸的病毒。该一种或多种附加治疗剂可在施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒之前、同时或基本上同时、随后或间歇地施用。在某些实施例中，该一种或多种附加治疗剂在施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒之前施用。在某些实施例中，该一种或多种附加治疗剂与被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒同时施用。在某些实施例中，该一种或多种附加治疗剂在施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒之后施用。
该一种或多种附加治疗剂和被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒可相加地或协同地起作用。在一个实施例中，该一种或多种附加治疗剂和被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒协同地起作用。在一些实施例中，协同作用用于治疗肿瘤障碍或感染。例如，在一个实施例中，该一种或多种附加治疗剂和被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒的组合改善了针对癌症的免疫应答的持久性，即延长了持续时间。在一些实施例中，该一种或多种附加治疗剂和被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒相加地起作用。
1.免疫检查点调节剂
在一些实施例中，与被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒组合施用的附加治疗剂是免疫检查点分子的免疫检查点调节剂。免疫检查点分子的实例包括LAG-3(Triebel等人,1990,J.Exp.Med.[实验医学杂志]171:1393-1405)、TIM-3(Sakuishi等人,2010,J.Exp.Med.[实验医学杂志]207:2187-2194)、VISTA(Wang等人,2011,J.Exp.Med.[实验医学杂志]208:577-592)、ICOS(Fan等人,2014,J.Exp.Med.[实验医学杂志]211:715-725)、OX40(Curti等人,2013,Cancer Res.[癌症研究]73:7189-7198)和4-1BB(Melero等人,1997,Nat.Med.[自然医学]3:682-685)。
免疫检查点可以是刺激性免疫检查点(即刺激免疫应答的分子)或抑制性免疫检查点(即抑制免疫应答的分子)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是抑制性免疫检查点的拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是刺激性免疫检查点的激动剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是免疫检查点结合蛋白(例如，抗体、抗体Fab片段、二价抗体、抗体药物缀合物、scFv、融合蛋白、二价抗体或四价抗体)。在某些实施例中，免疫检查点调节剂能够结合或调节一个以上免疫检查点的活性。下面提供了可以在本发明的方法中使用的刺激性和抑制性免疫检查点的实例以及调节这些免疫检查点的分子。
i.刺激性免疫检查点分子
CD27支持原初T细胞的抗原特异性扩增，并且对于T细胞记忆的产生至关重要(参见例如Hendriks等人(2000)Nat.Immunol.[自然免疫学]171(5):433-40)。CD27也是B细胞的记忆标志物(参见例如Agematsu等人(2000)Histol.Histopathol.[组织学和病理组织学]15(2):573-6。CD27活性受其配体CD70在淋巴细胞和树突状细胞上的瞬时可利用性的支配(参见例如Borst等人(2005)Curr.Opin.Immunol.[免疫学最新观点]17(3):275-81)。已经开发了对CD27具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节CD27的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与CD27结合的药剂(例如，抗CD27抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是CD27激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是CD27拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是CD27结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是伐立鲁单抗(希尔德克施治疗学公司(Celldex Therapeutics)。另外的CD27结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,248,183、9,102,737、9,169,325、9,023,999、8,481,029；美国专利申请公开号2016/0185870、2015/0337047、2015/0299330、2014/0112942、2013/0336976、2013/0243795、2013/0183316、2012/0213771、2012/0093805、2011/0274685、2010/0173324；和PCT公开号WO 2015/016718、WO 2014/140374、WO2013/138586、WO 2012/004367、WO 2011/130434、WO 2010/001908和WO 2008/051424中披露，其每一者通过援引以其全文并入本文。
CD28.分化簇28(CD28)是在提供T细胞激活和存活所需要的共刺激信号的T细胞上表达的蛋白之一。除T细胞受体(TCR)外，还通过CD28刺激T细胞提供有效的信号产生各种白介素(特别是IL-6)。与在树突状细胞上表达的它的两个配体CD80和CD86的结合促使T细胞扩增(参见例如Prasad等人(1994)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91(7):2834-8)。已经开发了对CD28具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节CD28的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与CD28结合的药剂(例如，抗CD28抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是CD28激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是CD28拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是CD28结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂选自由以下组成的组：TAB08(TheraMab LLC)、鲁利珠单抗(也称为BMS-931699，百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))和FR104(OSE免疫治疗公司(OSEImmunotherapeutics))。另外的CD28结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,119,840、8,709,414、9,085,629、8,034,585、7,939,638、8,389,016、7,585,960、8,454,959、8,168,759、8,785,604、7,723,482；美国专利申请公开号2016/0017039、2015/0299321、2015/0150968、2015/0071916、2015/0376278、2013/0078257、2013/0230540、2013/0078236、2013/0109846、2013/0266577、2012/0201814、2012/0082683、2012/0219553、2011/0189735、2011/0097339、2010/0266605、2010/0168400、2009/0246204、2008/0038273；和PCT公开号WO 2015198147、WO 2016/05421、WO 2014/1209168、WO 2011/101791、WO 2010/007376、WO 2010/009391、WO 2004/004768、WO 2002/030459、WO 2002/051871和WO 2002/047721中披露，其每一者通过援引以其全文并入本文。
CD40.在多种免疫系统细胞(包括抗原呈递细胞)上发现了分化簇40(CD40，也称为TNFRSF5)。CD40L，也称为CD154，是CD40的配体，并且在激活的CD4+T细胞表面瞬时表达。已知CD40信号传导‘许可’树突状细胞成熟并由此触发T细胞激活和分化(参见例如O'Sullivan等人(2003)Crit.Rev.Immunol.[免疫学重要评论]23(1):83-107。已经开发了对CD40具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节CD40的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与CD40结合的药剂(例如，抗CD40抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是CD40激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是CD40拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是选自下组的CD40结合蛋白，该组由以下组成：达西珠单抗(基因泰克/西雅图遗传学公司(Genentech/Seattle Genetics))、CP-870,893(辉瑞公司(Pfizer))、布来鲁单抗(安斯泰来制药公司(Astellas Pharma))、鲁卡妥木单抗(诺华公司(Novartis))、CFZ533(诺华公司；参见例如Cordoba等人(2015)Am.J.Transplant.[美国移植杂志]15(11):2825-36)、RG7876(基因泰克公司(Genentech Inc.))、FFP104(泛遗传学公司(PanGenetics,B.V.))、APX005(艾派克基因公司(Apexigen))、BI 655064(勃林格殷格翰公司(BoehringerIngelheim))、Chi Lob 7/4(英国癌症研究(Cancer Research UK)；参见例如Johnson等人(2015)Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]21(6):1321-8)、ADC-1013(巴沃温特国际公司(BioInvent International))、SEA-CD40(西雅图遗传学公司)、XmAb 5485(Xencor)、PG120(泛遗传学公司)、替奈昔单抗(teneliximab)(百时美施贵宝公司；参见例如Thompson等人(2011)Am.J.Transplant.11(5):947-57)，和AKH3(渤健公司(Biogen)；参见例如国际公开号WO 2016/028810)。另外的CD40结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且披露于例如美国专利号9,234,044、9,266,956、9,109,011、9,090,696、9,023,360、9,023,361、9,221,913、8,945,564、8,926,979、8,828,396、8,637,032、8,277,810、8,088,383、7,820,170、7,790,166、7,445,780、7,361,345、8,961,991、8,669,352、8,957,193、8,778,345、8,591,900、8,551,485、8,492,531、8,362,210、8,388,971；美国专利申请公开号2016/0045597、2016/0152713、2016/0075792、2015/0299329、2015/0057437 2015/0315282、2015/0307616、2014/0099317、2014/0179907、2014/0349395、2014/0234344、2014/0348836、2014/0193405、2014/0120103、2014/0105907、2014/0248266、2014/0093497、2014/0010812、2013/0024956、2013/0023047、2013/0315900、2012/0087927、2012/0263732、2012/0301488、2011/0027276、2011/0104182、2010/0234578、2009/0304687、2009/0181015、2009/0130715、2009/0311254、2008/0199471、2008/0085531、2016/0152721、2015/0110783、2015/0086991、2015/0086559、2014/0341898、2014/0205602、2014/0004131、2013/0011405、2012/0121585、2011/0033456、2011/0002934、2010/0172912、2009/0081242、2009/0130095、2008/0254026、2008/0075727、2009/0304706、2009/0202531、2009/0117111、2009/0041773、2008/0274118、2008/0057070、2007/0098717、2007/0218060、2007/0098718、2007/0110754；和PCT公开号WO 2016/069919、WO 2016/023960、WO 2016/023875、WO 2016/028810、WO 2015/134988、WO 2015/091853、WO 2015/091655、WO 2014/065403、WO 2014/070934、WO 2014/065402、WO 2014/207064、WO 2013/034904、WO 2012/125569、WO 2012/149356、WO 2012/111762、WO 2012/145673、WO 2011/123489、WO 2010/123012、WO 2010/104761、WO 2009/094391、WO 2008/091954、WO 2007/129895、WO 2006/128103、WO 2005/063289、WO 2005/063981、WO 2003/040170、WO 2002/011763、WO 2000/075348、WO 2013/164789、WO 2012/075111、WO 2012/065950、WO 2009/062054、WO 2007/124299、WO 2007/053661、WO 2007/053767、WO 2005/044294、WO 2005/044304、WO 2005/044306、WO 2005/044855、WO 2005/044854、WO 2005/044305、WO 2003/045978、WO 2003/029296、WO 2002/028481、WO 2002/028480、WO 2002/028904、WO 2002/028905、WO 2002/088186、和WO 2001/024823中，其每一者通过援引并入本文。
CD122.CD122是白介素-2受体β亚基，并且已知会增加CD8+效应T细胞的增殖。参见例如Boyman等人(2012)Nat.Rev.Immunol.[自然综述免疫学]12(3):180-190。已经开发了对CD122具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节CD122的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与CD122结合的药剂(例如，抗CD122抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是CD122激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是CD22激动剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是人源化的MiK-β-1(Roche；参见例如Morris等人(2006)Proc Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]103(2):401-6，其通过援引并入)。另外的CD122结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,028,830中披露，其通过援引并入本文。
OX40.OX40受体(也称为CD134)促进效应T细胞和记忆T细胞的扩增。OX40还阻抑T调节细胞的分化和活性，并调节细胞因子的产生(参见例如Croft等人(2009)Immunol.Rev.[免疫学评论]229(1):173-91)。已经开发了对OX40具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节OX40的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与OX40结合的药剂(例如，抗OX40抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是OX40激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是OX40拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是选自由以下组成的组的OX40结合蛋白(例如，抗体)：MEDI6469(AgonOx公司/医学免疫公司(AgonOx/Medimmune))、泊加珠单抗(pogalizumab)(也称为MOXR0916和RG7888；基因技术公司(Genentech Inc.))、他佛利珠单抗(tavolixizumab)(也称为MEDI0562；医学免疫公司)、和GSK3174998(葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))。另外的OX-40结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,163,085、9,040,048、9,006,396、8,748,585、8,614,295、8,551,477、8,283,450、7,550,140；美国专利申请公开号2016/0068604、2016/0031974、2015/0315281、2015/0132288、2014/0308276、2014/0377284、2014/0044703、2014/0294824、2013/0330344、2013/0280275、2013/0243772、2013/0183315、2012/0269825、2012/0244076、2011/0008368、2011/0123552、2010/0254978、2010/0196359、2006/0281072；和PCT 公开号WO2014/148895、WO 2013/068563、WO 2013/038191、WO 2013/028231、WO 2010/096418、WO2007/062245和WO 2003/106498中披露，其每一者通过援引以其全文并入本文。
GITR.糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族(其在Treg、CD4和CD8 T细胞上组成型或条件型表达)的成员。在TCR连接和激活后，GITR在效应T细胞上迅速上调。人GITR配体(GITRL)在次级淋巴器官和一些非淋巴组织中的APC上组成型表达。GITR的下游效应：GITRL相互作用诱导Treg活性减弱并增强CD4+T细胞活性，从而导致Treg介导的免疫阻抑作用逆转并增强免疫刺激。已经开发了对GITR具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节GITR的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与GITR结合的药剂(例如，抗GITR抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是GITR激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是GITR拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是选自由以下组成的组的GITR结合蛋白(例如，抗体)：TRX518(飞跃疗法公司(Leap Therapeutics))、MK-4166(默克公司(Merck&Co.))、MEDI-1873(医学免疫公司(MedImmune))、INCAGN1876(安帝君斯公司/英赛德公司(Agenus/Incyte))、和FPA154(五主疗法公司(Five PrimeTherapeutics))。另外的GITR结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,309,321、9,255,152、9,255,151、9,228,016、9,028,823、8,709,424、8,388,967；美国专利申请公开号2016/0145342、2015/0353637、2015/0064204、2014/0348841、2014/0065152、2014/0072566、2014/0072565、2013/0183321、2013/0108641、2012/0189639；和PCT公开号WO 2016/054638、WO 2016/057841、WO 2016/057846、WO 2015/187835、WO 2015/184099、WO 2015/031667、WO 2011/028683、和WO 2004/107618中披露，其每一者通过援引并入本文。
ICOS.诱导型T细胞共刺激物(ICOS，也称为CD278)在激活的T细胞上表达。它的配体是主要在B细胞和树突状细胞上表达的ICOSL。ICOS在T细胞效应子功能中很重要。T细胞激活后，ICOS表达上调(参见例如Fan等人(2014)J.Exp.Med.[实验医学杂志]211(4):715-25)。已经开发了对ICOS具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节ICOS的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与ICOS结合的药剂(例如，抗ICOS抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是ICOS激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是ICOS拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是选自由以下组成的组的ICOS结合蛋白(例如，抗体)：MEDI-570(也称为JMab-136，医学免疫公司)、GSK3359609(葛兰素史克公司/INSERM)和JTX-2011(弹跳疗法公司(Jounce Therapeutics))。另外的ICOS结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,376,493、7,998,478、7,465,445、7,465,444；美国专利申请公开号2015/0239978、2012/0039874、2008/0199466、2008/0279851；和PCT公开号WO 2001/087981中披露，其每一者通过援引并入本文。
4-1BB.4-1BB(也称为CD137)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员。4-1BB(CD137)是II型跨膜糖蛋白，可在引发的CD4+和CD8+T细胞、激活的NK细胞、DC和嗜中性粒细胞上诱导表达，并与在与激活的巨噬细胞、B细胞和DC上发现的4-1BB配体(4-1BBL)结合时起T细胞共刺激分子的作用。4-1BB受体的连接导致NF-κB、c-Jun和p38信号传导通路的激活，并且已被证明可通过上调抗凋亡基因BcL-x(L)和Bfl-1的表达来促进CD8+T细胞的存活。以这种方式，4-1BB起到增强甚至挽救次优免疫应答的作用。已经开发了对4-1BB具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节4-1BB的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与4-1BB结合的药剂(例如，抗4-1BB抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是4-1BB激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是4-1BB拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是4-1BB结合蛋白，其是乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513；百时美施贵宝公司)或乌托鲁单抗(辉瑞公司)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是4-1BB结合蛋白(例如，抗体)。4-1BB结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,382,328、8,716,452、8,475,790、8,137,667、7,829,088、7,659,384；美国专利申请公开号2016/0083474、2016/0152722、2014/0193422、2014/0178368、2013/0149301、2012/0237498、2012/0141494、2012/0076722、2011/0177104、2011/0189189、2010/0183621、2009/0068192、2009/0041763、2008/0305113、2008/0008716；和PCT公开号WO 2016/029073、WO 2015/188047、WO2015/179236、WO 2015/119923、WO 2012/032433、WO 2012/145183、WO 2011/031063、WO2010/132389、WO 2010/042433、WO 2006/126835、WO 2005/035584、WO 2004/010947；以及Martinez-Forero等人(2013)J.Immunol.[免疫学杂志]190(12):6694-706，和Dubrot等人(2010)Cancer Immunol.Immunother.[癌免疫学和免疫疗法]59(8):1223-33，其每一者通过援引以其全文并入本文。
ii.抑制性免疫检查点分子
ADORA2A.腺苷A2A受体(A2A4)是G蛋白偶联受体(GPCR)家族的成员，该家族拥有七个跨膜α螺旋并且被认为是癌症疗法中的重要检查点。A2A受体可以负调节过度反应的免疫细胞(参见例如Ohta等人(2001)Nature[自然]414(6866):916-20)。已经开发了对ADORA2A具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节ADORA2A的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与ADORA2A结合的药剂(例如，抗ADORA2A抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是ADORA2A结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是ADORA2A激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是ADORA2A拮抗剂。ADORA2A结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利申请公开号2014/0322236中披露，其通过援引并入本文。
B7-H3.B7-H3(也称为CD276)属于B7超家族，这是一组共刺激或下调T细胞应答的分子。B7-H3有效且持续地下调人T细胞应答(参见例如Leitner等人(2009)Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]39(7):1754-64)。已经开发了对B7-H3具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节B7-H3的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与B7-H3结合的药剂(例如，抗B7-H3抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是B7-H3激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是B7-H3拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是选自由以下组成的组的抗B7-H3结合蛋白：DS-5573(第一三共株式会社(Daiichi Sankyo,Inc.))、依诺妥珠单抗(宏基因公司(MacroGenics,Inc.)和8H9(斯隆凯特琳癌症研究所(Sloan KetteringInstitute for Cancer Research)；参见例如Ahmed等人(2015)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]290(50):30018-29)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是B7-H3结合蛋白(例如，抗体)。B7-H3-结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,371,395、9,150,656、9,062,110、8,802,091、8,501,471、8,414,892；美国专利申请公开号2015/0352224、2015/0297748、2015/0259434、2015/0274838、2014/032875、2014/0161814、2013/0287798、2013/0078234、2013/0149236、2012/02947960、2010/0143245、2002/0102264；PCT公开号WO 2016/106004、WO 2016/033225、WO 2015/181267、WO 2014/057687、WO 2012/147713、WO 2011/109400、WO 2008/116219、WO 2003/075846、WO 2002/032375；和Shi等人(2016)Mol.Med.Rep.[分子医学报告]14(1):943-8中披露，其每一者通过援引并入本文。
B7-H4.B7-H4(也称为O8E、OV064和含V-set结构域的T细胞激活抑制剂(VTCN1))属于B7超家族。通过阻止细胞周期，T细胞的B7-H4连接对细胞生长、细胞因子分泌和细胞毒性的发展具有深远的抑制作用。向小鼠中施用B7-H4Ig会损害抗原特异性T细胞应答，而特异性单克隆抗体对内源性B7-H4的阻断则会促进T细胞应答(参见例如Sica等人(2003)Immunity[免疫]18(6):849-61)。已经开发了对B7-H4具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节B7-H4的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与B7-H4结合的药剂(例如，抗B7-H4抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是B7-H4结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是B7-H4激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是B7-H4拮抗剂。B7-H4结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,296,822、8,609,816、8,759,490、8,323,645；美国专利申请公开号2016/0159910、2016/0017040、2016/0168249、2015/0315275、2014/0134180、2014/0322129、2014/0356364、2014/0328751、2014/0294861、2014/0308259、2013/0058864、2011/0085970、2009/0074660、2009/0208489；和PCT公开号WO 2016/040724、WO 2016/070001、WO 2014/159835、WO 2014/100483、WO 2014/100439、WO 2013/067492、WO 2013/025779、WO 2009/073533、WO 2007/067991、和WO 2006/104677中披露，其每一者通过援引并入本文。
BTLA.B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，也称为CD272，以HVEM(疱疹病毒入侵介质)作为其配体。在人CD8+T细胞从原初到效应细胞表型分化过程中，BTLA的表面表达逐渐下调，但是肿瘤特异性的人CD8+T细胞表达高水平的BTLA(参见例如Derre等人(2010)J.Clin.Invest.[临床研究杂志]120(1):157-67)。已经开发了对BTLA具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节BTLA的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与BTLA结合的药剂(例如，抗BTLA抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是BTLA结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是BTLA激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是BTLA拮抗剂。BTLA结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,346,882、8,580,259、8,563,694、8,247,537；美国专利申请公开号2014/0017255、2012/0288500、2012/0183565、2010/0172900；和PCT公开号WO 2011/014438和WO 2008/076560中披露；其每一者通过援引并入本文。
CTLA-4.细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)是免疫调节性CD28-B7免疫球蛋白超家族的成员，并且作用于原初和静息的T淋巴细胞，以通过B7依赖性和非B7依赖性通路促进免疫阻抑(参见例如Kim等人(2016)J.Immunol.Res.[免疫学研究杂志],文章ID4683607,第14页)。CTLA-4也被称为CD152。CTLA-4调节T细胞激活的阈值。参见例如Gajewski等人(2001)J.Immunol.[免疫学杂志]166(6):3900-7。已经开发了对CTLA-4具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节CTLA-4的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与CTLA-4结合的药剂(例如，抗CTLA-4抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是CTLA-4激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是CTLA-4拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是选自由以下组成的组的CTLA-4结合蛋白(例如，抗体)：艾匹利木单抗(Yervoy；美达瑞公司/百时美施贵宝公司(Medarex/Bristol-Myers Squibb))、曲美利木单抗(以前的ticilimumab；辉瑞公司/阿斯利康公司(Pfizer/AstraZeneca))、JMW-3B3(阿伯丁大学(University ofAberdeen))和AGEN1884(安帝君斯公司(Agenus))。另外的CTLA-4结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并在例如美国专利号8,697,845；美国专利申请公开号2014/0105914、2013/0267688、2012/0107320、2009/0123477；和PCT 公开号WO 2014/207064、WO 2012/120125、WO 2016/015675、WO 2010/097597、WO 2006/066568、和WO 2001/054732中披露，其每一者通过援引并入本文。
IDO.吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是一种具有免疫抑制特性的色氨酸分解代谢酶。另一个重要的分子是TDO，色氨酸2,3-双加氧酶。已知IDO阻抑T和NK细胞，产生并激活Treg和源自髓系的阻抑细胞，并促进肿瘤血管生成。Prendergast等人,2014,Cancer ImmunolImmunother.[癌症免疫学与免疫疗法]63(7):721–35，该文献通过援引并入本文。
已经开发了对IDO具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节IDO的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与IDO(例如，IDO结合蛋白，例如抗IDO抗体)结合的药剂。在一些实施例中，检查点调节剂是IDO激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是IDO拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂选自由以下组成的组：去甲哈尔满、迷迭香酸、COX-2抑制剂、α-甲基色氨酸和依多司他。在一个实施例中，调节剂是依多司他。
KIR.杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)包含MHCI结合分子的多样性库，其负调节自然杀伤(NK)细胞功能，以保护细胞免受NK介导的细胞裂解。KIR通常在NK细胞上表达，但也已在肿瘤特异性CTL上检测到。已经开发了对KIR具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节KIR的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与KIR结合的药剂(例如，抗KIR抗体)。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是KIR结合蛋白(例如，抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是KIR激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是KIR拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是利瑞鲁单抗(也称为BMS-986015；百时美施贵宝公司)。另外的KIR结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号8,981,065、9,018,366、9,067,997、8,709,411、8,637,258、8,614,307、8,551,483、8,388,970、8,119,775；美国专利申请公开号2015/0344576、2015/0376275、2016/0046712、2015/0191547、2015/0290316、2015/0283234、2015/0197569、2014/0193430、2013/0143269、2013/0287770、2012/0208237、2011/0293627、2009/0081240、2010/0189723；和PCT公开号WO 2016/069589、WO2015/069785、WO 2014/066532、WO 2014/055648、WO 2012/160448、WO 2012/071411、WO2010/065939、WO 2008/084106、WO 2006/072625、WO 2006/072626、和WO 2006/003179中披露，其每一者通过援引并入本文。
LAG-3，淋巴细胞激活基因3(LAG-3，也称为CD223)是与CD4相关的跨膜蛋白，其竞争性结合MHC II，并作为T细胞激活的共抑制性检查点(参见例如Goldberg和Drake(2011)Curr.Top.Microbiol.Immunol.[微生物学和免疫学最新话题]344:269-78)。已经开发了对LAG-3具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节LAG-3的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与LAG-3结合的药剂(例如，抗PD-1抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是LAG-3激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是LAG-3拮抗剂。在一些实施例中，该免疫检查点调节剂是选自由以下组成的组的LAG-3-结合蛋白(例如，抗体)：派姆单抗(Keytruda；先前为兰罗利珠单抗(lambrolizumab)；默克公司)、纳武单抗(Opdivo；百时美施贵宝公司)、匹地利珠单抗(CT-011，克睿基因公司(CureTech))、SHR-1210(英赛德/江苏恒瑞医药有限公司)、MEDI0680(还称为AMP-514；应用免疫公司/医学免疫公司)、PDR001(诺华公司)、BGB-A317(百济神州公司(BeiGene Ltd.))、TSR-042(也称为ANB011；安珀特生物公司-特沙若公司)、REGN2810(再生元制药公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)/赛诺菲-安万特公司(Sanofi-Aventis))和PF-06801591(辉瑞公司)。另外的PD-1-结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,181,342、8,927,697、7,488,802、7,029,674；美国专利申请公开号2015/0152180、2011/0171215、2011/0171220；和PCT公开号WO 2004/056875、WO 2015/036394、WO 2010/029435、WO 2010/029434、WO 2014/194302中披露，其每一者通过援引并入本文。
PD-1.程序性细胞死亡蛋白1(PD-1，也称为CD279和PDCD1)是抑制性受体，其负调节免疫系统。与主要影响原初T细胞的CTLA-4相反，PD-1在免疫细胞上更广泛地表达，并调节周围组织和肿瘤微环境中成熟T细胞活性。PD-1通过干扰T细胞受体信号传导来抑制T细胞应答。PD-1具有两个配体，PD-L1和PD-L2。已经开发了对PD-1具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节PD-1的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与PD-1结合的药剂(例如，抗PD-1抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-1激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-1拮抗剂。在一些实施例中，该免疫检查点调节剂是选自由以下组成的组的PD-1-结合蛋白(例如，抗体)：派姆单抗(Keytruda；先前为兰罗利珠单抗；默克公司)、纳武单抗(Opdivo；百时美施贵宝公司)、匹地利珠单抗(CT-011，克睿基因公司)、SHR-1210(英赛德/江苏恒瑞医药有限公司)、MEDI0680(还称为AMP-514；应用免疫公司/医学免疫公司)、PDR001(诺华公司)、BGB-A317(百济神州公司)、TSR-042(也称为ANB011；安珀特生物公司-特沙若公司)、REGN2810(再生元制药公司/赛诺菲-安万特公司)和PF-06801591(辉瑞公司)。另外的PD-1-结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利号9,181,342、8,927,697、7,488,802、7,029,674；美国专利申请公开号2015/0152180、2011/0171215、2011/0171220；和PCT公开号WO 2004/056875、WO 2015/036394、WO 2010/029435、WO 2010/029434、WO 2014/194302中披露，其每一者通过援引并入本文。
PD-L1/PD-L2.PD配体1(PD-L1，也称为B7-H1)和PD配体2(PD-L2，也称为PDCD1LG2、CD273和B7-DC)与PD-1受体结合。这两个配体都属于与CD28和CTLA-4相互作用的B7-1和B7-2蛋白相同的B7家族。PD-L1可以在许多细胞类型上表达，包括例如上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞。PDL-1的连接减少IFNγ、TNFα和IL-2的产生，并刺激IL10的产生，IL10是一种与T细胞反应性和增殖降低以及抗原特异性T细胞无反应性相关的抗炎细胞因子。PDL-2主要在抗原呈递细胞(APC)上表达。PDL2连接也导致T细胞阻抑，但在PDL-1-PD-1相互作用通过在G1/G2期的细胞周期阻滞来抑制增殖的情况下，PDL2-PD-1接合已经显示出通过在低抗原浓度下阻断B7:CD28信号并在高抗原浓度下降低细胞因子产生来抑制TCR介导的信号传导。已经开发了对PD-L1和PD-L2具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。
在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节PD-L1的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与PD-L1结合的药剂(例如，抗PD-L1抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-L1激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-L1拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是选自由以下组成的组的PD-L1-结合蛋白(例如，抗体或Fc融合蛋白)：度伐鲁单抗(也称为MEDI-4736；阿斯利康公司/新基生物制药公司(AstraZeneca/Celgene Corp.))、阿特利珠单抗(Tecentriq；也称为MPDL3280A和RG7446；基因技术公司(Genetech Inc.))、阿维鲁单抗(也称为MSB0010718C；默克雪兰诺公司/阿斯利康公司(Merck Serono/AstraZeneca))；MDX-1105(美达瑞公司/百时美施贵宝公司)、AMP-224(应用免疫公司，葛兰素史克公司)、LY3300054(礼来公司(Eli Lilly and Co.))。另外的PD-L1结合蛋白是本领域已知的，并且在例如美国专利申请公开号2016/0084839、2015/0355184、2016/0175397、和PCT公开号WO 2014/100079、WO 2016/030350、WO 2013181634中披露，其每一者通过援引并入本文。
在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节PD-L2的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与PD-L2结合的药剂(例如，抗PD-L2抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-L2激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是PD-L2拮抗剂。PD-L2结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并且在例如美国专利号9,255,147、8,188,238；美国专利申请公开号2016/0122431、2013/0243752、2010/0278816、2016/0137731、2015/0197571、2013/0291136、2011/0271358；和PCT公开号WO 2014/022758和WO 2010/036959中披露；其每一者通过援引并入本文。
TIM-3.T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3，也称为甲型肝炎病毒细胞受体(HAVCR2))是I型糖蛋白受体，其与S型凝集素半乳凝素9(Gal-9)结合。TIM-3是在淋巴细胞、肝脏、小肠、胸腺、肾脏、脾脏、肺、肌肉、网状细胞和脑组织上广泛表达的配体。Tim-3最初被鉴定为在分泌IFN-γ的Th1和Tc1细胞上选择性表达(Monney等人(2002)Nature[自然]415:536-41)。TIM-3受体与Gal-9结合触发下游信号传导，从而负调节T细胞存活和功能。已经开发了对TIM-3具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节TIM-3的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与TIM-3结合的药剂(例如，抗TIM-3抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是TIM-3激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是TIM-3拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是选自由以下组成的组的抗TIM-3抗体：TSR-022(安珀特生物公司-特沙若公司)和MGB453(诺华公司)。另外的TIM-3结合蛋白(例如，抗体)在本领域中是已知的，并在例如美国专利号9,103,832、8,552,156、8,647,623、8,841,418；美国专利申请公开号2016/0200815、2015/0284468、2014/0134639、2014/0044728、2012/0189617、2015/0086574、2013/0022623；和PCT 公开号WO 2016/068802、WO 2016/068803、WO 2016/071448、WO2011/155607和WO 2013/006490中披露，其每一者通过援引并入本文。
VISTA.T细胞激活的V结构域Ig阻抑物(VISTA，也称为血小板受体Gi24)是负调控T细胞应答的Ig超家族配体。参见例如Wang等人,2011,J.Exp.Med.[实验医学杂志]208:577-92。在APC上表达的VISTA直接阻抑CD4+和CD8+T细胞增殖和细胞因子产生(Wang等人(2010)JExp Med.[实验医学杂志]208(3):577-92)。已经开发了对VISTA具有特异性的多种免疫检查点调节剂，并且可以如本文披露的那样使用。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是调节VISTA的活性和/或表达的药剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是与VISTA结合的药剂(例如，抗VISTA抗体)。在一些实施例中，检查点调节剂是VISTA激动剂。在一些实施例中，检查点调节剂是VISTA拮抗剂。在一些实施例中，免疫检查点调节剂是选自由以下组成的组的VISTA结合蛋白(例如，抗体)：TSR-022(安珀特生物公司-特沙若公司)和MGB453(诺华公司)。VISTA结合蛋白(例如，抗体)是本领域已知的，并且在例如美国专利申请公开号2016/0096891、2016/0096891；和PCT公开号WO 2014/190356、WO 2014/197849、WO 2014/190356和WO 2016/094837中披露，其每一者通过援引并入本文。
提供了通过向受试者施用被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒与至少一种免疫检查点调节剂的组合来治疗肿瘤障碍的方法。在某些实施例中，免疫检查点调节剂刺激受试者的免疫应答。例如，在一些实施例中，免疫检查点调节剂刺激或增加刺激性免疫检查点(例如CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、或4-1BB)的表达或活性。在一些实施例中，免疫检查点调节剂抑制或降低抑制性免疫检查点(例如A2A4、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3或VISTA)的表达或活性。
在某些实施例中，免疫检查点调节剂靶向选自下组的免疫检查点分子，该组由以下组成：CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、4-1BB、A2A4、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA。在某些实施例中，免疫检查点调节剂靶向选自下组的免疫检查点分子，该组由以下组成：CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、4-1BB、A2A4、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA。在特定的实施例中，免疫检查点调节剂靶向选自下组的免疫检查点分子，该组由以下组成：CTLA-4、PD-L1和PD-1。在另一个特定的实施例中，免疫检查点调节剂靶向选自下组的免疫检查点分子，该组由以下组成：PD-L1和PD-1。
在一些实施例中，向受试者施用一种以上(例如2、3、4、5种或更多)免疫检查点调节剂。当施用一种以上的免疫检查点调节剂时，调节剂可各自靶向刺激性免疫检查点分子，或各自靶向抑制性免疫检查点分子。在其他实施例中，免疫检查点调节剂包括至少一种靶向刺激性免疫检查点的调节剂和至少一种靶向抑制性免疫检查点分子的免疫检查点调节剂。在某些实施例中，免疫检查点调节剂是结合蛋白，例如抗体。如本文所用，术语“结合蛋白”是指可以特异性结合靶分子(例如免疫检查点分子)的蛋白或多肽。在一些实施例中，结合蛋白是抗体或其抗原结合部分，并且靶分子是免疫检查点分子。在一些实施例中，结合蛋白是与靶分子(例如免疫检查点分子)特异性结合的蛋白或多肽。在一些实施例中，结合蛋白是配体。在一些实施例中，结合蛋白是融合蛋白。在一些实施例中，结合蛋白是受体。可用于本发明方法的结合蛋白的实例包括但不限于人源化抗体、抗体Fab片段、二价抗体、抗体药物缀合物、scFv、融合蛋白、二价抗体、以及四价抗体。
如本文所用，术语“抗体”是指由四个多肽链—两个重(H)链和两个轻(L)链或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物构成的任何免疫球蛋白(Ig)分子。这样的突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。在全长抗体中，每个重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间插着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，任何类别(例如IgG 1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类别。在一些实施例中，抗体是全长抗体。在一些实施例中，抗体是鼠抗体。在一些实施例中，抗体是人抗体。在一些实施例中，抗体是人源化抗体。在其他实施例中，抗体是嵌合抗体。嵌合和人源化抗体可通过本领域技术人员公知的方法制备，包括CDR移植方法(参见例如美国专利号5,843,708、6,180,370、5,693,762、5,585,089和5,530,101)、链改组策略(参见例如美国专利号5,565,332；Rader等人(1998)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA[美国国家科学院院刊]95:8910-8915)、分子建模策略(美国专利号5,639,641)等。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指抗体的保留特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。这样的抗体实施例也可以是双特异性，二重特异性或多特异性形式；例如，多特异性形式；与两种或更多种不同抗原特异性结合。涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人(1989)NATURE[自然]341:544-546；和WO 90/05144A1，其内容通过援引并入本文)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过使它们能够形成为单一蛋白链的合成接头来相连，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)SCIENCE[科学]242:423-426；和Huston等人(1988)PROC.NAT’L.ACAD.SCI.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。这样的单链抗体也旨在涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。也涵盖其他形式的单链抗体，例如双抗体。抗原结合部分也可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv中(参见例如Hollinger和Hudson,NatureBiotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，分别称为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用，术语“CDR组”是指能够结合抗原的单可变区中存在的三个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同的系统进行了不同的定义。Kabat(Kabat等人,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST[免疫学感兴趣的蛋白质序列](National Institutes of Health,Bethesda,Md.[马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院](1987)和(1991))描述的系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，而且提供了限定三个CDR的精确的残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia及其同事发现，Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性(Chothia等人(1987)J.MOL.BIOL.[分子生物学杂志]196:901-917，和Chothia等人(1989)NATURE[自然]342:877-883)。这些子部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区域。这些区域可以称为Chothia CDR，其边界与Kabat CDR重叠。定义与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界描述于Padlan等人(1995)FASEB J.[美国实验生物学会联合会杂志]9:133-139，和MacCallum等人(1996)J.MOL.BIOL.[分子生物学杂志]262(5):732-45。还有其他CDR边界定义可能并不严格遵循上述系统之一，但仍会与Kabat CDR重叠，尽管根据以下预测或实验发现，它们可以被缩短或延长：特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合。尽管优选的实施例使用Kabat或Chothia定义的CDR，但是本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一个定义的CDR。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指非人(例如鼠)抗体，其是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(接受体抗体或抗体片段)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所希望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可包含既不在接受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含至少一个(典型地两个)可变结构域中的基本上全部，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且FR区的全部或很大部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。有关更多详细信息，参见Jones等人(1986)NATURE[自然]321:522-525；Reichmann等人(1988)NATURE[自然]332:323-329；和Presta(1992)CURR.OP.STRUCT.BIOL.[当代结构生物学观点]2:593-596，其每一者均通过援引以其全文并入本文。
如本文所用，术语“免疫缀合物”或“抗体药物缀合物”是指抗体或其抗原结合片段与另一种药剂例如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等的连接。连接可以是共价键，也可以是非共价相互作用，例如通过静电力。为了形成免疫缀合物，可以使用本领域已知的各种接头。另外，可以以融合蛋白的形式提供免疫缀合物，该融合蛋白可从编码免疫缀合物的多核苷酸表达的。融合基因的翻译产生具有源自每个本来蛋白的功能特性的单蛋白。
“二价抗体”是指包含两个抗原结合位点的抗体或其抗原结合片段。两个抗原结合位点可以结合相同的抗原，或者它们可以各自结合不同的抗原，在这种情况下，抗体或抗原结合片段被表征为“双特异性”。“四价抗体”是指包含四个抗原结合位点的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，四价抗体是双特异性的。在某些实施例中，四价抗体是多特异性的，即与两种以上不同抗原结合。
Fab(片段抗原结合)抗体片段是包含抗体的单价抗原结合结构域的免疫反应性多肽，其包括由重链可变区(VH)和重链恒定区1(CH1)部分组成的多肽以及由轻链可变(VL)和轻链恒定(CL)部分组成的多肽，其中CL和CH1部分优选地通过Cys残基之间的二硫键结合在一起。
免疫检查点调节剂抗体包括但不限于至少4个主要类别：i)直接在T细胞或自然杀伤(NK)细胞上阻断抑制性通路的抗体(例如靶向PD-1的抗体如纳武单抗和派姆单抗，靶向TIM-3的抗体以及靶向LAG-3、2B4、CD160、A2aR、BTLA、CGEN-15049和KIR的抗体)，ii)直接在T细胞或NK细胞上激活刺激性通路的抗体(例如靶向OX40、GITR和4-1BB的抗体)，iii)在免疫细胞上阻断抑制性通路或依靠抗体依赖性细胞毒性以消耗抑制性免疫细胞群的抗体(例如靶向CTLA-4的抗体如伊匹木单抗，靶向VISTA的抗体，以及靶向PD-L2、Gr1和Ly6G的抗体)，和iv)直接在癌细胞上阻断抑制性通路或依靠抗体依赖性细胞毒性以增强对癌细胞的细胞毒性的抗体(例如利妥昔单抗，靶向PD-L1的抗体，以及靶向B7-H3、B7-H4、Gal-9和MUC1的抗体)。检查点抑制剂的实例包括例如CTLA-4的抑制剂，例如艾匹利木单抗或曲美利木单抗；PD-1通路的抑制剂，例如抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2抗体。示例性的抗PD-1抗体描述于WO 2006/121168、WO 2008/156712、WO 2012/145493、WO 2009/014708和WO 2009/114335中。示例性的抗PD-L1抗体描述于WO 2007/005874、WO 2010/077634和WO 2011/066389中，并且示例性的抗PD-L2抗体描述于WO 2004/007679中。
在特定的实施例中，免疫检查点调节剂是融合蛋白，例如，调节免疫检查点调节剂的活性的融合蛋白。
在一个实施例中，免疫检查点调节剂是治疗性核酸分子，例如调节免疫检查点蛋白或mRNA的表达的核酸。核酸治疗剂是本领域众所周知的。核酸治疗剂包括与细胞中靶序列互补的单链和双链(即，具有长度至少为15个核苷酸的互补区的核酸治疗剂)核酸。在某些实施例中，核酸治疗剂靶向编码免疫检查点蛋白的核酸序列。
反义核酸治疗剂是单链核酸治疗剂，通常长约16至30个核苷酸，并且与培养物或生物体中靶细胞中的靶核酸序列互补。
在另一方面，药剂是单链反义RNA分子。反义RNA分子与靶mRNA内的序列互补。反义RNA可以通过与mRNA碱基配对并物理性地阻碍翻译机制以化学计量的方式抑制翻译，参见Dias,N.等人,(2002)Mol Cancer Ther[分子癌症疗法]1:347-355。反义RNA分子可具有与靶mRNA互补的约15-30个核苷酸。涉及反义核酸、化学修饰和治疗用途的专利包括，例如：美国专利号5,898,031涉及经化学修饰的含RNA的治疗化合物；美国专利号6,107,094涉及使用这些化合物作为治疗剂的方法；美国专利号7,432,250涉及通过施用单链化学修饰的RNA样化合物来治疗患者的方法；并且美国专利号7,432,249涉及含有单链化学修饰的RNA样化合物的药物组合物。美国专利号7,629,321涉及使用具有多个RNA核苷和至少一个化学修饰的单链寡核苷酸切割靶mRNA的方法。本段中列出的每个专利的全部内容通过援引并入本文。
用于本发明方法的核酸治疗剂还包括双链核酸治疗剂。在本文中可互换使用的“RNAi药剂”，“双链RNAi药剂”，双链RNA(dsRNA)分子，也称为“dsRNA药剂”，“dsRNA”，“siRNA”，“iRNA药剂”指具有双链结构的核糖核酸分子的复合物，该双链结构包含两个反平行且基本互补(如下文所定义)的核酸链。如本文所用，RNAi药剂还可以包括dsiRNA(参见例如美国专利公开20070104688，其通过援引并入本文)。通常，每个链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但是如本文所述，每个链或两个链也可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。此外，如本说明书中所使用的，“RNAi药剂”可包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi药剂可包括在多个核苷酸处的实质性修饰。这样的修饰可以包括本文披露的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书及权利要求书的目的，任何此类修饰，如在siRNA类型分子中所使用的，是由“RNAi药剂”涵盖。在本发明的方法中使用的RNAi药剂包括具有化学修饰的药剂，如例如在WO/2012/037254和WO 2009/073809中披露的，其每一者的整体内容通过援引并入本文。
可以以适当剂量施用免疫检查点调节剂以治疗肿瘤障碍，例如通过使用标准剂量。本领域技术人员将能够通过常规实验确定用于治疗肿瘤障碍的目的的免疫检查点调节剂的有效无毒量。免疫检查点调节剂的标准剂量是本领域技术人员已知的，并且可以例如从免疫检查点调节剂的制造商提供的产品说明书中获得。下表8中提供了免疫检查点调节剂的标准剂量的实例。在其他实施例中，免疫检查点调节剂以与用于在针对特定肿瘤障碍的标准护理下治疗肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量不同(例如更低)的剂量施用。
表8.免疫检查点调节剂的示例性标准剂量
Figure BDA0004097086860001191
在某些实施例中，免疫检查点调节剂的施用剂量比针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量低5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。在某些实施例中，免疫检查点调节剂的施用剂量是针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一个实施例中，在施用免疫检查点调节剂的组合的情况下，免疫检查点调节剂中的至少一种以低于针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。在一个实施例中，在施用免疫检查点调节剂的组合的情况下，免疫检查点调节剂中的至少两种以低于针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。在一个实施例中，在施用免疫检查点调节剂的组合的情况下，免疫检查点调节剂中的至少三种以低于针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。在一个实施例中，在施用免疫检查点调节剂的组合的情况下，免疫检查点调节剂中的所有以低于针对特定肿瘤障碍的免疫检查点调节剂的标准剂量的剂量施用。
可与被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸的病毒组合施用的附加免疫治疗剂包括但不限于Toll样受体(TLR)激动剂、基于细胞的疗法、细胞因子和癌症疫苗。
2.TLR激动剂
TLR是单跨膜的非催化受体，其识别源自微生物的结构保守分子。TLR与白介素-1受体共同形成受体超家族，称为“白介素-1受体/Toll样受体超家族”。该家族的成员在结构上的特征是胞外富亮氨酸重复(LRR)结构域、近膜半胱氨酸残基的保守模式和胞质内信号传导结构域，该胞质内信号传导结构域通过募集含TIR结构域的衔接子(包括MyD88)、含TIR结构域的接合子(TRAP)和含TIR结构域的接合子(诱导IFNβ)(TRIF)形成用于下游信号传导的平台(O'Neill等人,2007,Nat Rev Immunol[自然评论免疫学]7,353)。
TLR包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、和TLR10。TLR2介导细胞对多种微生物产物的应答，这些微生物产物包括肽聚糖、细菌脂肽、脂磷壁酸、分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖和酵母细胞壁成分。TLR4是跨膜蛋白，其属于模式识别受体(PRR)家族。它的激活导致细胞内信号传导通路NF-κB和炎性细胞因子产生，这负责激活先天免疫系统。已知TLR5从入侵的移动细菌识别细菌鞭毛蛋白，并且已显示在许多疾病(包括炎性肠病)的发作中涉及。
TLR激动剂是本领域已知的，并且描述于例如US 2014/0030294中，其通过援引以其全文并入本文。示例性的TLR2激动剂包括分枝杆菌细胞壁糖脂、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和甘露糖基化磷脂酰肌醇(PIIM)、MALP-2和Pam3Cys及其合成变体。示例性TLR4激动剂包括脂多糖或其合成的变体(例如，MPL和RC529)和脂质A或其合成的变体(例如，氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸酯)。参见例如Cluff等人,2005,Infection and Immunity[感染与免疫],第3044-3052页:73；Lembo等人,2008,The Journal of Immunology[免疫学杂志]180,7574-7581；和Evans等人,2003,Expert Rev Vaccines[疫苗专家评论]2:219-29。示例性的TLR5激动剂包括鞭毛蛋白或其合成的变体(例如，通过缺失对于TLR5激活不是必需的鞭毛蛋白部分而制成的具有降低的免疫原性的药理学优化的TLR5激动剂(例如CBLB502))。
其他TLR激动剂包括科利毒素和卡介苗(BCG)。科利毒素是由物种化脓性链球菌和粘质沙雷氏菌的被杀死的细菌组成的混合物。参见Taniguchi等人,2006,Anticancer Res.[抗癌研究]26(6A)：3997-4002。BCG由减毒的活牛结核杆菌，牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)制备。参见Venkataswamy等人,2012,Vaccine.[疫苗]30(6):1038-1049。
3.基于细胞的疗法
用于治疗癌症的基于细胞的疗法包括对受试者施用免疫细胞(例如T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤细胞和树突状细胞)。在基于自体细胞的疗法中，免疫细胞源自对其施用的相同受试者。在基于同种异体细胞的疗法中，免疫细胞源自一个受试者，并施用于不同的受试者。在施用于受试者之前，可以例如通过用细胞因子处理来激活免疫细胞。在一些实施例中，例如在嵌合抗原受体(CAR)T细胞免疫疗法中，免疫细胞在施用于受试者之前经基因修饰。
在一些实施例中，基于细胞的疗法包括过继细胞转移(ACT)。ACT通常由三个部分组成：淋巴细胞耗竭、细胞施用和高剂量的IL-2疗法。可以在ACT中施用的细胞类型包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞受体(TCR)转导的T细胞和嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
肿瘤浸润淋巴细胞是在包括乳腺癌在内的许多实体瘤中观察到的免疫细胞。它们是包含细胞毒性T细胞和辅助T细胞以及B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的混合物的细胞群体。自体TIL疗法的一般程序如下：(1)将切除的肿瘤消化成片段；(2)每个片段在IL-2中生长，并且淋巴细胞增殖破坏肿瘤；(3)在存在纯淋巴细胞群体之后，扩增这些淋巴细胞；和(4)扩增至1011个细胞后，将淋巴细胞注入患者体内。参见Rosenberg等人，2015,Science[科学]348(6230):62-68，其通过援引以其全文并入本文。
TCR转导的T细胞是通过肿瘤特异性TCR的遗传诱导产生。这通常是通过将特定的抗原特异性TCR克隆到逆转录病毒骨架中来完成。从患者抽血，并提取外周血单核细胞(PBMC)。在IL-2存在下，用CD3刺激PBMC，然后用编码抗原特异性TCR的逆转录病毒进行转导。这些转导的PBMC在体外进一步扩增并输注回患者体内。参见Robbins等人,2015,Clinical Cancer Research[临床癌症研究]21(5):1019-1027，其通过援引以其全文并入本文。
嵌合抗原受体(CAR)是包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(例如CD3δ、CD28和4-1BB)的重组受体。CAR同时具有抗原结合和T细胞激活功能。因此，表达CAR的T细胞可以识别多种细胞表面抗原，包括糖脂、碳水化合物和蛋白质，并且可以通过激活细胞质共刺激来攻击表达这些抗原的恶性细胞。参见Pang等人,2018,MolCancer[分子癌症]17:91，其通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，基于细胞的疗法是基于自然杀伤(NK)细胞的疗法。NK细胞是大的粒状淋巴细胞，其具有杀伤肿瘤细胞的能力，而无需主要组织相容性复合物(MHC)分子表达的任何事先敏化或限制。参见Uppendahl等人,2017,Frontiers in Immunology[免疫学前言]8:1825。在人临床试验中已评估了大剂量IL-2疗法情况下的自体淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞的过继转移。与LAK免疫疗法相似，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞在抗CD3mAb、IFN-γ和IL-2的刺激作用情况下产生自外周血单核细胞培养物。CIK细胞的特征在于混合的T-NK表型(CD3+CD56+)，并且与LAK细胞相比，其显示增强的针对卵巢癌和宫颈癌的细胞毒活性。还进行了人临床试验，研究初次瘤体减灭术和佐剂卡铂/紫杉醇化学疗法后自体CIK细胞的过继转移。参见Liu等人,2014,J Immunother[免疫疗法杂志]37(2):116-122。
在一些实施例中，基于细胞的疗法是基于树突状细胞的免疫疗法。已经显示用肿瘤裂解物处理的树突状细胞(DC)的疫苗接种在体外和体内增加治疗性抗肿瘤免疫应答。参见Jung等人,2018,Translational Oncology[转化肿瘤学]11(3):686-690。DC捕获并处理抗原、迁移到淋巴器官中、表达淋巴细胞共刺激分子、并分泌引发免疫应答的细胞因子。它们还刺激表达肿瘤相关抗原特异性受体的免疫效应细胞(T细胞)，并减少免疫抑制因子(例如CD4+CD25+Foxp3+调节性T(Treg)细胞)的数量。例如，基于肿瘤细胞裂解物-DC混杂物的肾细胞癌(RCC)DC疫苗接种策略在临床前和临床试验中显示出治疗潜力。参见Lim等人,2007,Cancer Immunol Immunother[癌症免疫学与免疫疗法]56:1817-1829。
4.细胞因子
包括IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21在内的几种细胞因子已用于治疗癌症，以激活免疫细胞，例如NK细胞和T细胞。IL-2是临床上首先使用的细胞因子之一，希望能够诱导抗肿瘤免疫力。作为高剂量的单一药剂，IL-2在某些肾细胞癌(RCC)和转移的黑色素瘤患者中诱导缓解。还研究了低剂量的IL-2，并且目的是选择性地连接IL-2αβγ受体(IL-2Rαβγ)，以降低毒性，同时保持生物学活性。参见Romee等人,2014,Scientifica[科学],第2014卷,文章ID 205796,第18页，其通过援引以其全文并入本文。
白介素15(IL-15)是与白介素2(IL-2)结构相似的细胞因子。如同IL-2，IL-15结合并通过由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同的γ链(γ-C，CD132)组成的复合物来发出信号。已对重组IL-15用于在癌症患者中过继转移后治疗实体瘤(例如黑色素瘤、肾细胞癌)并支持NK细胞进行了评估。参见上面引用的Romee等人。
IL-12是由p35和p40亚基(IL-12α和β链)构成的异二聚体细胞因子，基于其增强NK细胞毒性的能力，最初被鉴定为“NK细胞刺激因子(NKSF)”。遇到病原体后，IL-12被激活的树突状细胞和巨噬细胞释放，并与其主要在激活的T和NK细胞上表达的同源受体结合。许多临床前研究表明，IL-12具有抗肿瘤潜力。参见上面引用的Romee等人。
IL-18是促炎性IL-1家族的成员，并且如同IL-12，由激活的吞噬细胞分泌。IL-18在临床前动物模型中已显示出显著的抗肿瘤活性，并已在人临床试验中进行了评估。参见Robertson等人,2006,Clinical Cancer Research[临床癌症研究]12:4265-4273。
IL-21由于其刺激NK细胞和CD8+T细胞的能力，已被用于抗肿瘤免疫疗法。对于离体NK细胞扩增，已在K562刺激细胞中表达了膜结合的IL-21，具有有效的结果。参见Denman等人,2012,PLoS One[公共科学图书馆·综合]7(1)e30264。重组人IL-21也显示增加可溶性CD25并诱导穿孔素和颗粒酶B在CD8+细胞上的表达。IL-21已在几项治疗实体瘤的临床试验中进行了评估。参见上面引用的Romee等人。
5.癌症疫苗
治疗性癌症疫苗通过在适当佐剂的辅助下增强患者自身对癌症的免疫应答，特别是CD8+T细胞介导的应答，来消除癌细胞。癌症疫苗的治疗功效依赖于肿瘤细胞相对于正常细胞的肿瘤相关抗原(TAA)差异表达。TAA衍生自细胞蛋白，并且应主要或选择性地在癌细胞上表达，以避免免疫耐受或自身免疫作用。参见Circelli等人,2015,Vaccines[疫苗]3(3):544-555。癌症疫苗包括例如基于树突状细胞(DC)的疫苗、肽/蛋白质疫苗、基因疫苗和肿瘤细胞疫苗。参见Ye等人,2018,J Cancer[癌症杂志]9(2):263-268。
本发明的组合疗法可以用于治疗肿瘤障碍。在一些实施例中，被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒和附加治疗剂的组合疗法抑制肿瘤细胞生长。因此，本发明还提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，该方法包括向该受试者施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸和至少一种附加治疗剂的病毒，使得肿瘤细胞生长被抑制。在某些实施例中，与对照相比，治疗癌症包括延长存活或延长肿瘤进展时间。在一些实施例中，对照是用附加治疗剂治疗但未用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒治疗的受试者。在一些实施例中，对照是用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒治疗但未用附加治疗剂治疗的受试者。在一些实施例中，对照是未用附加治疗剂或被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒治疗的受试者。在某些实施例中，该受试者是人受试者。在一些实施例中，在施用第一剂量的被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒或第一剂量的附加治疗剂之前，受试者被鉴定为患有肿瘤。在某些实施例中，受试者在第一次施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒时或在第一次施用附加治疗剂时患有肿瘤。
在某些实施例中，向受试者施用至少1、2、3、4或5个周期的组合疗法，该组合疗法包括被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒和一种或多种附加治疗剂。在每个周期结束时针对应答标准评估受试者。还在每个周期的整个过程中监测受试者的不良事件(例如凝血、贫血、肝和肾功能等)，以确保治疗方案被充分耐受。
应当注意，多于一种的附加治疗剂(例如2、3、4、5种或更多种附加治疗剂)可与被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒组合施用。
在一个实施例中，施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒和如本文所述的附加治疗剂导致以下中的一项或多项：减小肿瘤大小、重量或体积，增加进展时间，抑制肿瘤生长和/或延长患有肿瘤障碍的受试者的存活时间。在某些实施例中，相对于施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒但未施用附加治疗剂的对应对照受试者，施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒和附加治疗剂将肿瘤大小、重量或体积减小、将进展时间增加、将肿瘤生长抑制和/或将受试者的存活时间延长至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在某些实施例中，相对于施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒但未施用附加治疗剂的患有肿瘤障碍的对照受试者的对应群体，施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒和附加治疗剂将肿瘤大小、重量或体积减小、将进展时间增加、将肿瘤生长抑制和/或将患有肿瘤障碍的受试者群体的存活时间延长至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。在其他实施例中，施用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒和附加治疗剂在治疗之前稳定患有进行性肿瘤障碍的受试者中的肿瘤障碍。
在某些实施例中，用被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸的病毒和附加治疗剂(例如免疫治疗剂)的治疗与另外的抗肿瘤剂(诸如用于治疗待治疗的特定癌症的标准护理，例如通过施用标准剂量的一种或多种抗肿瘤剂(例如化学治疗剂))组合。特定癌症类型的标准护理可以由本领域技术人员根据例如癌症的类型和严重程度，受试者的年龄、体重、性别和/或病史，和先前治疗的成功或失败确定。在本发明的某些实施例中，标准护理包括手术、放射、激素疗法、抗体疗法、生长因子疗法、细胞因子和化学疗法中的任何一种或组合。在一个实施例中，该附加抗肿瘤剂不是诱导铁依赖性细胞拆解试剂和/或免疫检查点调节剂。
适用于本文披露的方法的附加抗肿瘤剂包括但不限于化学治疗剂(例如，烷化剂，诸如六甲蜜胺、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、洛莫司汀、美法仑、奥沙利铂、替莫唑胺、噻替派；抗代谢物，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)；卡培他滨
Figure BDA0004097086860001261
阿糖胞苷
Figure BDA0004097086860001262
氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨
Figure BDA0004097086860001263
羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞
Figure BDA0004097086860001264
抗肿瘤抗生素，例如蒽环类(例如柔红霉素、多柔比星
Figure BDA0004097086860001265
表柔比星、依达比星)、放线菌素-D、博来霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌(还用作拓扑异构酶II抑制剂)；拓扑异构酶抑制剂，例如托泊替康、伊立替康(CPT-11)、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、米托蒽醌(还用作抗肿瘤抗生素)；有丝分裂抑制剂，例如多西他赛、雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春瑞滨；皮质类固醇，例强的松、甲基强的松龙
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地塞米松
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酶，例如L-天冬酰胺酶和硼替佐米
Figure BDA0004097086860001273
抗肿瘤剂还包括生物抗癌剂，例如抗TNF抗体，例如阿达木单抗或英夫利昔单抗；抗CD20抗体，例如利妥昔单抗，抗VEGF抗体(例如贝伐单抗)；抗HER2抗体，例如曲妥珠单抗；抗RSV，例如帕利珠单抗。
VIII.药物组合物和施用方式
在某些方面，本披露涉及一种包含病毒的药物组合物，该病毒被工程化以包含一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸。本文所述的药物组合物可以任何合适的配制品形式施用于受试者。这些包括例如液体、半固体和固体剂型。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。
在某些实施例中，药物组合物适于口服施用。在某些实施例中，药物组合物适于肠胃外施用，包括局部施用和静脉内、腹膜内、肌内和皮下注射。在特定的实施例中，药物组合物适于静脉内施用。在另一个特定的实施例中，药物组合物适于肿瘤内施用。
肠胃外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。对于静脉内施用，配制品可以是水溶液。水溶液可以包括汉克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水缓冲液或其他合适的盐或组合，以实现用于肠胃外递送配制品的合适的pH和渗透压。水溶液可用于稀释配制品至期望浓度用以施用。水溶液可以包含增加溶液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。在一些实施例中，配制品包括磷酸盐缓冲盐溶液，其包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠和注射用水。
适用于局部施用的配制品包括适合于穿透皮肤的液体或半液体制剂，例如擦剂、洗剂、乳膏、软膏或糊剂，以及适合于眼、耳或鼻施用的滴剂。适用于口服施用的配制品包括含有惰性稀释剂或可吸收的可食用载剂的制剂。用于口服施用的配制品可以被封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可以被压制成片剂，或者可以与饮食中的食物直接合并。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料之外，它还可以包含液体载剂。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式修饰剂量单位的物理形式。适用于本发明的药物组合物包括其中包含有效量的活性成分以实现其预期目的的组合物。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细披露内容。除了活性成分之外，这些药物组合物还可包含合适的药学上可接受的载剂，包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可药用的制剂。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，待施用的有用的体内剂量和特定的施用方式将根据年龄、体重、患病的严重程度和所治疗的哺乳动物物种、所使用的具体化合物、以及使用这些化合物的具体用途而变化。本领域技术人员可以使用常规方法，例如人临床试验、动物模型和体外研究来确定有效剂量水平，即达到期望结果所需的剂量水平。
在某些实施例中，药物组合物经口服递送。在某些实施例中，组合物经肠胃外施用。在某些实施例中，组合物通过注射或输注递送。在某些实施例中，组合物局部地(包括经粘膜)递送。在某些实施例中，组合物通过吸入递送。在一个实施例中，本文提供的组合物可通过直接注射至肿瘤来施用。在一些实施例中，组合物可通过静脉内注射或静脉内输注来施用。在某些实施例中，施用是全身性的。在某些实施例中，施用是局部的。
实例
本发明通过以下实例进一步说明，这些实例不应被解释为限制性的。在整个申请中引用的所有参考文献、GenBank登录号和基因号、以及公开的专利和专利申请的内容据此通过援引并入。本领域技术人员将认识到，本发明可在所披露的结构、材料、组合物和方法上进行变化来实施，并且此类变化被认为在本发明的范围内。
实例1.制备含有一种或多种异源多核苷酸的病毒，这些异源多核苷酸各自编码促进萨诺传递的多肽(例如RIPK3、ZBP1、MLKL和/或TRIF)。
图1A所示的是萨诺传递盒(TC)的架构和插入病毒基因组的基因座。TC的实例包括编码通过P2A切割位点连接的RIPK3、ZBP1、MLKL和/或TRIF并由病毒启动子或细胞启动子(例如ICP34.5、CMV IE1或EF1a)驱动表达的基因(图1B)。其他实例包括包含编码TRIF、RIPK3、TRIF+RIPK3、TRIF+RIPK3+半胱天冬酶抑制剂(例如FADD-DN、vICA或cFLIP)、或TRIF+RIPK3+消皮素(例如消皮素E)的多核苷酸的TC。可插入病毒基因组中的TC的具体实例提供于下文实例9至14中。TC可插入一个或两个ICP34.5基因中，或替代性地插入中性基因座中。重组病毒通过同源重组生成，然后在Vero细胞中繁殖。病毒原种以10-0.1的感染复数(MOI)范围感染靶细胞，并且通过评价病毒标志物的表达来确认感染。免疫印迹或荧光标签分析证实萨诺传递盒的表达。病毒可以是例如HSV、痘苗病毒或腺病毒。
实例2.表达多核苷酸(例如siRNA或gRNA)的病毒的制备，该多核苷酸降低调节萨诺传递的多肽的表达。
图2示出了表达多核苷酸的重组病毒的架构和病毒基因组插入的基因座的细节。插入的基因座可在病毒的一个或两个ICP34.5基因中，或替代性地在中性基因座处。重组病毒通过同源重组生成，然后在Vero细胞中繁殖。病毒原种以一定范围的MOI感染靶细胞，并且通过评价病毒标志物的表达来确认感染。免疫印迹或荧光标签分析证实病毒编码的多核苷酸所靶向的细胞蛋白的表达水平。
实例3.在病毒基因中含有防止细胞周转通路坏死性凋亡的功能丧失突变的病毒的制备。
本实例描述了HSV1中ICP6基因的突变和痘苗病毒中E3L基因的突变。图3示出了在HSV1-ICP6的RHIM结构域和/或痘苗病毒-E3L的Za结构域中携带突变的突变体病毒的架构。在此，插入痘苗病毒的突变体E3L(ΔZα)以恢复PKR抑制，但在CNS内的复制仍然是减毒的。突变体病毒通过同源重组生成并在Vero细胞中繁殖。病毒原种以一定范围的MOI感染靶细胞，并且通过评价病毒标志物的表达来确认感染。免疫印迹分析证实突变体ICP6和E3L的表达。对于痘苗病毒，TC将被插入中性基因座中并且E3L的ZBP1抑制性Zα结构域被突变。
实例4.包含病毒基因中的突变和编码促进萨诺传递的蛋白质的多核苷酸的溶瘤病毒的制备。
本实例描述了HSV中ICP6的突变或痘苗病毒中E3L的突变与含有编码RIPK3、ZBP1、MLKL和TRIF的多核苷酸的一个附加物的萨诺传递盒的组合。组合实例1-3中描述的突变。突变体病毒通过同源重组生成并在Vero细胞中繁殖。将如图1或实例1所述的TC克隆到具有ICP6突变的突变体病毒骨架中，如图3所述。在其他实验中，将图2所述的多核苷酸盒克隆到如图3所述的突变体病毒背景中。克隆通过同源重组完成，并且病毒在Vero细胞中繁殖。病毒用于感染人细胞系(例如HEK 293)，并且通过免疫印迹验证TC的表达。通过病毒基因组的扩增和测序来验证突变体病毒蛋白的表达。当多核苷酸导致细胞基因的敲除时，评价siRNA/gRNA所靶向的细胞基因的表达水平。
实例5.用表达促进癌细胞的萨诺传递并影响细胞周转和增殖的蛋白质的工程化病毒感染癌细胞。
用来自实例1-4的病毒以不同的MOI感染多种肿瘤细胞系(例如B16、CT26)。通过定量IE病毒抗原证实生产性感染。肿瘤细胞在低(0.1)和高(10)MOI下的生长曲线用于评价病毒的复制能力。受感染肿瘤细胞的活力通过标准细胞活力测定(例如细胞ATP含量、LDH释放或细胞成像)来测量，以确定肿瘤细胞对病毒诱导的细胞死亡的易感性。用细胞渗透性染料诸如CFSE标记的肿瘤细胞被病毒感染，并评价感染对细胞增殖的影响。
实例6.用表达促进萨诺传递的蛋白质的工程化病毒感染的癌细胞的评价。
多种肿瘤细胞系(例如B16、CT26)被实例1-4中所述的亲本病毒和重组病毒感染。评价从受感染癌细胞释放的细胞周转因子(CTF)在确定的应答细胞测定中促进萨诺传递的能力。CTF的作用通过报告基因测定(例如NF-kB和/或IRF活性)和免疫学测定诸如T细胞增殖、树突状细胞激活或巨噬细胞分化来测量。从受感染癌细胞释放的CTF的质谱分析鉴定从溶瘤病毒感染的细胞释放的因子。
实例7.向小鼠癌症模型施用表达促进萨诺传递的蛋白质的工程化病毒。
将WT BALB/c或C57Bl6/J小鼠皮下植入4T1、CT26、B16或MC38肿瘤。以每只小鼠1×105至1×106的剂量植入肿瘤细胞。在一些实验中，将小鼠植入原位位点，例如乳房脂肪垫。当肿瘤变得可触知时，通过肿瘤内施用如本文所述的工程化病毒，例如实例1-4中所述的工程化病毒来治疗小鼠。病毒以不同的给药频率施用，范围为每周一次、每周两次或每2天一次。病毒剂量范围从每只小鼠1×106pfu到每只小鼠1×108pfu。
每周测量肿瘤的生长三次。当肿瘤达到约1000mm3时，收获肿瘤和引流淋巴结(DLN)。肿瘤免疫应答的特征在于通过流式细胞术定量肿瘤和DLN中免疫细胞的水平，以及通过四聚体染色评估肿瘤特异性T细胞应答的发展。通过评估激活的细胞毒性T细胞与辅助T细胞的比率以及血浆中免疫调节细胞因子的水平来测量全身免疫应答。在一些研究中，收获肿瘤，并通过免疫印迹、免疫荧光和/或流式细胞术测量萨诺传递模块的组分(例如由促进萨诺传递的多核苷酸编码的多肽)的表达或siRNA/gRNA细胞靶的降低的表达。在一些实验中，针对病毒中和抗体的出现通过ELISA来监测HSV-1+免疫应答的发展，并与抗肿瘤免疫应答的发展进行比较。
在一些实验中，小鼠将被接种同基因双侧皮下肿瘤，并且只有一只小鼠用病毒治疗。在治疗和未治疗的肿瘤中监测病毒水平和肿瘤特异性T细胞应答。在这些实验中，测量未治疗肿瘤的肿瘤大小以确定远隔效应。
在一些实验中，用如上所述的重组病毒的肿瘤内施用与检查点抑制剂的全身施用的组合来治疗植入有肿瘤的小鼠。抗PD-1或抗CTLA-4抗体以1-10mg/kg的剂量腹膜内施用。如上所述测量肿瘤生长动力学和免疫应答。
实例8.研究工程化病毒治疗癌症的功效的人类临床试验。
使用本文披露的组合物和方法治疗患有胰腺癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、乳腺癌或头颈癌或结肠癌的患者。基于实例1-4中所述的病毒，生成基于HSV-1的突变体和重组病毒颗粒。噬斑纯化后，将病毒原种进一步纯化，进行缓冲液交换，并在Vero细胞上滴定。对于向患有胰腺癌、肺癌或结肠癌的患者的体内施用，HSV颗粒在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中与药学上可接受的稳定剂一起制备。在治疗当天，经由肿瘤内输注在1.0mL具有药学上可接受的载剂的体积中施用107、108、109或1010个载体基因组。基于患者的特定预后，使用标准护理程序以适当的时间间隔监测患者的肿瘤消退。
实例9.在表达一种或多种萨诺传递多肽的CT-26小鼠结肠癌细胞中诱导细胞死亡。
用源自pLVX-Tet3G载体(宝生物公司(Takara)；631358)的慢病毒转导CT-26小鼠结肠癌细胞(ATCC；CRL-2638)，以通过人PGK启动子建立稳定的Tet-On反式激活因子表达。在Tet-On系统中，基因表达可由多西环素诱导。所有慢病毒转导均使用标准生产方案利用293T细胞(ATCC；CRL-3216)和慢病毒包装混合物(博塞塔公司(Biosettia)；pLV-PACK)进行。然后用在pLVX-TRE3G(宝生物公司；631193)中表达人TRIF ORF(登录号：NM_182919)的慢病毒转导CT-26-Tet3G细胞。替代性地或作为补充，用表达小鼠RIPK3ORF(登录号：NM_019955.2)的载体转导CT-26-Tet3G细胞；RIPK3表达由pLV-EF1a-MCS-IRES-Hyg(博塞塔公司；cDNA-pLV02)的组成型PGK启动子衍生物驱动。通过添加两个串联的在结合B-B配体后寡聚化的DmrB结构域(宝生物公司；635059)来修饰两个ORF，以允许使用B/B同二聚体(1μM)进行蛋白质激活以促进寡聚化。在初始测试后，使用B/B的二聚化对TRIF构建体的活性没有实质性影响，但确实促进了表达RIPK3的构建体的活性。因此，在所有随后的实验中，B/B诱导的二聚化不用于激活包括TRIF的任何构建体，而是仅用于激活表达RIPK3的单一构建体。因此，B/B二聚体被包括在实验设置中，以确保所有组的实验条件具有可比性，尽管它对TRIF诱导的活性没有影响。例如，如图5B所示和实例10所述，添加二聚体对用来自上述工程化CT-26细胞的细胞培养物处理的巨噬细胞中的IRF活性几乎没有影响。
接种表达指定萨诺传递模块的CT26小鼠结肠癌细胞，随后用多西环素(1mg/mL；西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，0219895525)和B/B同二聚体(1μM)处理24小时，以经由寡聚化促进表达和蛋白质激活。使用RealTime-Glo MT细胞活力测定试剂盒(普洛麦格公司，目录号G9712)根据制造商的说明书在处理后24小时测定相对细胞活力，并且绘图显示通过相对发光单位(RLU)测量的相对活力。
如图4A所示，相对于CT-26-Tet3G(Tet3G)亲本细胞系，TRIF、RIPK3或TRIF+RIPK3的诱导表达和寡聚化诱导细胞活力降低。这些结果证明癌细胞中一种或多种萨诺传递多肽的表达降低癌细胞的活力。
在单独的实验中，检测了消皮素E(GSDME)在表达TRIF、RIPK3或TRIF和RIPK3的癌细胞中的表达效果。用克隆到pLV-EF1a-MCS-IRES-Puro载体(博塞塔公司)中的人GSDME(NM_004403.3)转导CT-26-Tet3G细胞。GSDME还被转导到上述CT-26-Tet3G-TRIF和CT26-Tet3G-TRIF-RIPK3细胞中。接种这些细胞，随后用多西环素(1mg/mL；西格玛奥德里奇公司，0219895525)处理24小时以促进表达。使用RealTime-Glo MT细胞活力测定试剂盒(普洛麦格公司，目录号G9712)根据制造商的说明书在处理后24小时测定相对细胞活力，并且绘图显示通过相对发光单位(RLU)测量的相对活力。B/B二聚体不用于这些实验。
如图4B所示，TRIF和TRIF+RIPK3的表达相对于CT-26-Tet3G亲本细胞系降低了细胞活力，证实了图4A中呈现的结果。另外，与CT-26-Tet3G亲本细胞相比，在GSDME表达细胞中诱导TRIF或TRIF+RIPK3蛋白表达也降低细胞活力。总之，这些结果证明在癌细胞中一种或多种萨诺传递多肽(包括TRIF、RIPK3和GSDME)的表达降低癌细胞的活力。
实例10.来自表达一种或多种萨诺传递多肽的CT-26小鼠结肠癌细胞的细胞周转因子(CTF)对巨噬细胞中干扰素刺激基因(ISG)报告基因的影响
将J774-DualTM细胞(英杰公司(Invivogen)，J774-NFIS)以100,000个细胞/孔接种在96孔培养板中。J774-DualTM细胞通过稳定整合两个可诱导的报告基因构建体而源自小鼠J774.1巨噬细胞样细胞系。这些细胞在与五个拷贝的NF-κB转录应答元件和三个拷贝的c-Rel结合位点融合的IFN-β最小启动子的控制下表达分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。J774-DualTM细胞也表达Lucia萤光素酶基因，该基因在ISG54最小启动子连同五种干扰素刺激的应答元件(ISRE)的控制下编码分泌型萤光素酶。结果，J774-DualTM细胞允许通过评估SEAP的活性研究NF-κB通路，并且同时通过监测Lucia萤光素酶的活性研究干扰素调节因子(IRF)通路。
如以上实例9中所述，由CT-26小鼠结肠癌细胞生成含有细胞周转因子(CTF)的培养基。除了实例9中描述的萨诺传递模块之外，还评价了含有完全Tet诱导型启动子的附加RIPK3构建体。该Tet诱导型RIPK3在图5A中被命名为“RIPK3”,并且含有PGK启动子的RIPK3构建体(描述于实例9)在图5A中被命名为“PGK_RIPK3”。
还包括对照，预测其将诱导细胞死亡，而没有免疫刺激性萨诺传递。这些对照构建体表达i)人Bid的C-末端半胱天冬酶截短物(NM_197966.3)，ii)人GSDMD的N-末端半胱天冬酶截短物(NM_001166237.1)，iii)人半胱天冬酶-8的合成可二聚化形式(DmrB-半胱天冬酶-8)，或iv)DmrB-半胱天冬酶-8和人GSDME(NM_004403.3)两者。然后用指定的CTF刺激J774-DualTM细胞24小时。收集细胞培养基，并使用QUANTI-luc(英杰公司；rep-qlc1)测定测量萤光素酶活性。将干扰素刺激的应答元件(ISRE)启动子激活相对于对照细胞系CT-26-Tet3G作图。
如图5A所示，在所检查的CT-26细胞系中，仅从表达TRIF(单独或与RIPK3组合)的细胞收集的培养基在J774-DualTM细胞中诱导ISRE/IRF报告基因激活。
在单独的实验中，检查了消皮素E(GSDME)与TRIF或TRIF+RIPK3的组合表达的效果。由如实例9所述的表达TRIF或TRIF+RIPK3的CT-26细胞以及另外由表达TRIF+消皮素-E或TRIF+RIPK3+消皮素-E的CT-26细胞生成含有CTF的培养基。如图5B所示，来自表达TRIF(iTRIF)、TRIF+RIPK3(iTRIF_cR3)、TRIF+消皮素-E(iTRIF_cGE)或TRIF+RIPK3+消皮素-E(iTRIF_cR3_cGE)的CT-26细胞的培养基各自在J774-DualTM细胞中诱导ISRE/IRF报告基因激活。如实例9中所讨论的，添加二聚体对ISRE/IRF报告基因激活几乎没有影响。
总之，这些结果证明由表达一种或多种萨诺传递多肽的癌细胞产生的CTF激活免疫细胞中的免疫刺激性通路(即IRF通路)。
实例11.来自表达一种或多种萨诺传递多肽的CT-26小鼠结肠癌细胞的细胞周转因子(CTF)对骨髓来源树突状细胞(BMDC)的影响
使用GM-CSF充足的RPMI培养基将骨髓细胞分化为树突状细胞持续8天。将每2mL400,000个细胞/接种在6孔板中。在第8天，收获骨髓来源树突状细胞(BMDC)并将100,000个细胞/孔接种在96孔板中。然后用含有源自实例9所述的工程化CT-26细胞的CTF的培养基刺激BMDC。在24小时时，收获刺激的细胞，并通过流式细胞术测量细胞表面标志物CD86、CD40和PD-L1的表达，并相对于Tet3G对照绘制平均荧光强度(MFI)图。抗体来源如下：CD86(百进生技公司(Biolegend)，目录号105042)；CD40(百进生技公司，目录号102910)；PD-L1(百进生技公司，目录号124312)。细胞表面标志物CD86、CD40和PD-L1的表达是树突状细胞成熟的指示。
如图6所示，在所检查的CT-26细胞系中，仅从工程化以表达TRIF(单独或与RIPK3组合)的细胞收集的培养基提高CD86、CD40或PD-L1的细胞表面表达。这些结果表明来自工程化以表达TRIF或TRIF和RIPK3两者的CT-26细胞的CTF诱导树突状细胞的成熟。树突状细胞中CD86和CD40的上调表明激活T细胞的能力增加。因此，结果表明来自工程化以表达TRIF或TRIF和RIPK3的癌细胞的CTF将诱导树突状细胞的成熟并增加它们激活T细胞的能力。
实例12.单独或与抗PD1抗体组合的萨诺传递多肽表达对结肠癌小鼠模型中肿瘤生长和存活的影响。
将携带如实例9中所述的TRIF或TRIF+RIPK3萨诺传递模块的CT-26小鼠结肠癌细胞用胰蛋白酶消化，并以1×106个细胞/mL重悬于无血清培养基中。将细胞(100mL)注射到BALB/c小鼠的右侧皮下胁腹。从CT-26细胞注射后的第11天至第18天，向常规饮用水中补充2mg/ml多西环素(西格玛奥德里奇公司，目录号D9891)以诱导萨诺传递多肽表达，并且从第11天至第18天，通过每日IP注射施用2mg/kg B/B同型二聚体(宝生物公司，目录号632622)。在第14天、第17天和第21天施用抗PD1抗体(百西尔公司(BioXcell)，目录号BP0273)和同种型对照。当根据IACUC指南肿瘤达到2000mm3或在实验终点时，将小鼠安乐死。
如图7A所示，与CT-26-Tet3G对照(Tet3G-同种型对照)和CT26-RIPK3细胞(CT26-P_R3)相比，单独的TRIF(CT26-TF)的表达增加了存活率，并且用TRIF和RIPK3的组合(Trif_RIPK3-同种型对照)观察到甚至更大的益处。如图7B所示，注射了携带TRIF的CT-26细胞(CT26-TF)或携带TRIF+RIPK3的CT-26细胞(TRIF_RIPK3)的小鼠的存活率通过用抗PD-1抗体治疗而提高，这两个处理组都表现出100％的存活率(线重叠)。
在单独的实验中，将携带实例10中所述的TRIF+GSDME和TRIF+RIPK3+GSDME萨诺传递模块的CT-26小鼠结肠癌细胞用胰蛋白酶消化，并以1×106个细胞/mL重悬于无血清培养基中。本实验不使用B/B同二聚体。将细胞(100mL)注射到BALB/c小鼠的右侧皮下胁腹。从CT-26细胞注射后的第15天至第21天，给小鼠喂食补充有625mg/kg盐酸多西环素(恩维戈公司(Envigo)TD.01306)的Teklad基础饮食。当根据IACUC指南肿瘤达到2000mm3或在实验终点时，将小鼠安乐死。
如图7C中所示，GSDME与TRIF或TRIF+RIPK3组合的表达相对于植入有单独表达TRIF或单独表达TRIF-RIPK3的肿瘤的小鼠进一步增强存活。
实例13.化学半胱天冬酶抑制剂对U937人髓样白血病细胞表达萨诺传递多肽的影响
U937人髓样白血病细胞和THP1-Dual细胞分别从ATCC和英杰公司获得。U937是髓样白血病细胞系。使用实例9和10中描述的方法和实例9中描述的多西环素诱导型表达系统生成表达人萨诺传递多肽(tBid、半胱天冬酶8、RIPK3或TRIF)的U937细胞。
THP1-Dual细胞是在NF-kB或IRF通路激活时诱导报告蛋白的人单核细胞系。它表达由与五个拷贝的NF-κB共有转录应答元件和三个拷贝的c-Rel结合位点融合的IFN-β最小启动子驱动的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。THP1-Dual细胞的特征还在于Lucia基因，一种在ISG54最小启动子连同五种IFN刺激的应答元件控制下的分泌型萤光素酶报告基因。结果，THP1-Dual细胞允许通过监测SEAP的活性研究NF-kB通路，并且同时通过评估分泌型萤光素酶(Lucia)的活性研究IRF通路。
为了生成条件培养基，将5百万个U937-tet3G、U937-tBid、U937-半胱天冬酶8、U937-RIPK3或U937-TRIF细胞接种在10cm培养皿中的RPMI中，随后用多西环素(1μg/mL)处理24小时以诱导表达。将B/B同二聚体(100nM)添加到U937-半胱天冬酶8、U937-RIPK3和U937-TRIF细胞培养物中以通过寡聚化促进表达和蛋白质激活。此外，将U937-TRIF细胞另外用4μM Q-VD-ph(泛半胱天冬酶抑制剂)、10μM GSK872(RIPK3抑制剂)或两者的组合处理。将细胞孵育24小时后，收获条件培养基并无菌过滤。
为了测量萨诺传递多肽对NF-kB或IRF报告基因表达的影响，将100,000个THP1-Dual细胞/孔以100μl体积接种在96孔平底板中。向每个孔中添加100μl由表达萨诺传递模块的U937细胞生成的条件培养基。在24小时孵育期后，将20μl THP1-Dual细胞培养上清液转移到平底96孔白色(不透明)测定板中，并将50μl QUANTI-Luc测定溶液添加到每个孔中，然后立即通过读板器读取发光。为了测量NF-kB活性，将20μl THP1-Dual培养上清液转移到平底96孔透明测定板中，并将180μl重悬的QUANTI-Blue溶液添加到每个孔中。将板在37℃下孵育1小时，然后使用读板器在655nm下测量SEAP水平。
如图8A和图8B所示，用来自单独用半胱天冬酶抑制剂(Q-VD-ph)或与RIPK3抑制剂(Q-VD-Oph+GSK872)组合处理的U937-TRIF细胞的细胞培养物处理THP-1Dual细胞极大地增加了NF-kB激活和IRF活性。(在图8A-图8C中，+表示用多西环素处理的U937细胞，++表示用多西环素和B/B同二聚体处理的U937细胞)。来自单独用RIPK3抑制剂处理的U937-TRIF细胞的细胞培养基对THP-1Dual细胞的NF-kB激活几乎没有影响，表明增加的NF-kB激活是由于半胱天冬酶抑制。如图8B和图8C所示，用来自未用半胱天冬酶抑制剂处理的U937-TRIF细胞的细胞培养基处理THP-1Dual细胞也增加了IRF活性，尽管其程度低于用半胱天冬酶抑制剂处理的U937-TRIF细胞。
总之，这些结果证明由表达TRIF的人癌细胞产生的CTF激活免疫细胞中的免疫刺激性通路(即NF-kB和IRF通路)，并且半胱天冬酶抑制增强该作用。
实例14.通过表达包括半胱天冬酶抑制剂蛋白的组合的萨诺传递多肽调节CT-26小鼠结肠癌细胞中的萨诺传递。
本实例中描述的实验测试了半胱天冬酶抑制剂蛋白的表达对表达TRIF和RIPK3的癌细胞中萨诺传递的影响。
如实例9所述，用编码以下的基因转导表达萨诺传递多肽TRIF和RIPK3的CT26小鼠结肠癌细胞：(i)具有死亡结构域的人Fas相关蛋白的显性负性形式(FADD；登录号NM_003824)；(ii)人细胞FLICE样抑制蛋白的短形式(cFLIPs；登录号NM_001127184.4)；或(iii)半胱天冬酶的病毒抑制剂(vICA，HCMV基因UL36；登录号NC_006273.2)，以便通过抑制半胱天冬酶活性来调节萨诺传递。将FADD-DN、cFLIP和vICA各自克隆到pLV-EF1a-MCS-IRES-Puro载体(博塞塔公司)中，并用于转导表达CT26-TRIF-RIPK3的细胞。
接种这些细胞，随后用多西环素(1mg/mL；西格玛奥德里奇公司，0219895525)处理24小时以促进表达。B/B同二聚体不用于本实验。使用RealTime-Glo MT细胞活力测定试剂盒(普洛麦格公司，目录号G9712)根据制造商的说明书在处理后24小时测定相对细胞活力，并且绘图显示通过相对发光单位(RLU)测量的相对活力。
如图9A所示，CT26-TRIF+RIPK3细胞中FADD-DN、cFLIP或vICA中任一种的表达减弱了由TRIF+RIPK3表达诱导的癌细胞活力的降低。然而，相对于亲本系CT26-Tet3G细胞系，cFLIP+TRIF+RIPK3或vICA+TRIF+RIPK3在CT26细胞中的表达仍然降低癌细胞活力，只是程度比单独的TRIF-RIPK3更小。参见图9A。
接下来，如上所述由CT-26小鼠结肠癌细胞生成含有CTF的培养基。然后用指定的CTF刺激J774-DualTM细胞24小时。收集细胞培养基，并使用QUANTI-luc(英杰公司；rep-qlc1)测定测量萤光素酶活性。将干扰素刺激的应答元件(ISRE)启动子激活相对于对照细胞系即Tet3G作图。如图9B所示，从表达TRIF或TRIF+RIPK3的CT26细胞系收集的培养基在J774-Dual细胞中诱导IRF报告基因表达。此外，来自除了TRIF+RIPK3还表达FADD-DN、cFLIPs或vICA的CT26细胞的培养基也在J774-Dual细胞中诱导了IRF报告基因激活。
将携带上述FADD-DN、cFLIPs或vICA萨诺传递模块的CT-26-TRIF+RIPK3小鼠结肠癌细胞用胰蛋白酶消化并以1×106个细胞/mL重悬于无血清培养基中。本实验中没有使用B/B同二聚体。将细胞(100μL)注射到免疫活性BALB/c小鼠的右侧皮下胁腹。从CT-26细胞注射后的第15天至第21天，给小鼠喂食补充有625mg/kg盐酸多西环素(恩维戈公司TD.01306)的Teklad基础饮食。当根据IACUC指南肿瘤达到2000mm3或在实验终点时，将小鼠安乐死。
如图9C所示，相对于对照CT26-Tet3G细胞，所有表达萨诺传递模块(即TRIF+RIPK3、TRIF+RIPK3+FADD-DN、TRIF+RIPK3+cFLIPS或TRIF+RIPK3+vICA)的肿瘤的生长均减少。特别地，与亲本CT26-TRIF+RIPK3细胞相比，FADD-DN或vICA与TRIF+RIPK3组合的表达进一步减少了肿瘤生长。有趣的是，尽管除了TRIF+RIPK3之外还包含FADD-DN或vICA的萨诺传递模块在减少体内肿瘤生长方面最有效，但是FADD-DN+TRIF+RIPK3相对于TRIF+RIPK3细胞对CT26癌细胞体外活力几乎没有影响，而vICA+TRIF+RIPK3共表达相对于TRIF+RIPK3增强了体外细胞杀伤。这些结果表明，除了通过萨诺传递模块杀伤癌细胞的量级之外，癌细胞由于这些模块的表达而产生的精确的细胞周转因子(CTF)谱也可有助于体内对肿瘤细胞的免疫应答。

Claims (175)

1.一种病毒，该病毒被工程化以包含一种或多种促进靶细胞的萨诺传递的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸对该病毒是异源的。
3.如权利要求1或2所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸对该靶细胞是异源的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸通过增加萨诺传递多肽在该靶细胞中的表达或活性来促进该靶细胞的萨诺传递。
5.如权利要求1至4中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码萨诺传递多肽。
6.如权利要求1至5中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸通过降低抑制萨诺传递的多肽在该靶细胞中的表达或活性来促进该靶细胞的萨诺传递。
7.如权利要求1至6中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码降低抑制萨诺传递的多肽在该靶细胞中的表达或活性的RNA分子。
8.如权利要求1至7中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸在该靶细胞中的表达改变该靶细胞中的细胞周转通路。
9.如权利要求1至8中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码野生型蛋白或其功能片段。
10.如权利要求1至9中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码死亡折叠结构域。
11.如权利要求10所述的病毒，其中该死亡折叠结构域选自由以下组成的组：死亡结构域、热蛋白结构域、死亡效应子结构域(DED)、C-末端半胱天冬酶募集结构域(CARD)以及它们的变体。
12.如权利要求11所述的病毒，其中该死亡结构域来自选自由以下组成的组的蛋白质：具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)、Fas、肿瘤坏死因子受体1型相关死亡结构域(TRADD)、肿瘤坏死因子受体1型(TNFR1)以及它们的变体。
13.如权利要求11所述的病毒，其中该热蛋白结构域来自选自由以下组成的组的蛋白质：NLR家族含热蛋白结构域蛋白3(NLRP3)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)。
14.如权利要求11所述的病毒，其中该死亡效应子结构域(DED)来自选自由以下组成的组的蛋白质：具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10。
15.如权利要求11所述的病毒，其中该CARD来自选自由以下组成的组的蛋白质：RIP相关ICH1/CED3同源蛋白(RAIDD)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、线粒体抗病毒信号传导蛋白(MAVS)、半胱天冬酶-1以及它们的变体。
16.如权利要求1至15中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码Toll/白介素-1受体(TIR)结构域。
17.如权利要求16所述的病毒，其中该TIR结构域来自选自由以下组成的组的蛋白质：髓样分化初级应答蛋白88(MyD88)、含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)、Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体4(TLR4)、含TIR结构域的衔接蛋白(TIRAP)和易位链相关膜蛋白(TRAM)。
18.如权利要求1至17中任一项所述的病毒，其中该一种或多种多核苷酸编码以下中的任一项或多项：受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)、Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)、混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)、含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)、仅包含TIR结构域和RHIM结构域的TRIF的N-末端截短物、干扰素调节因子3(IRF3)、具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)、截短的FADD、肿瘤坏死因子受体1型相关死亡结构域(TRADD)和细胞FLICE(FADD样IL-1β转化酶)抑制蛋白(c-FLIP)。
19.如权利要求18所述的病毒，其中编码ZBP1的该多核苷酸包含受体相互作用蛋白同型相互作用基序(RHIM)C的缺失、RHIM D的缺失和Zα1结构域的N-末端处的缺失。
20.如权利要求1至19中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸抑制受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RIPK1)的表达或活性。
21.如权利要求1至20中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码促融合蛋白。
22.如权利要求21所述的病毒，其中该促融合蛋白是来自长臂猿白血病病毒(GALV)的糖蛋白，并且其R跨膜肽发生突变或被去除(GALV-R-)。
23.如权利要求1至22中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码免疫刺激性蛋白。
24.如权利要求23所述的病毒，其中该免疫刺激性蛋白是转化生长因子β(TGF-β)的拮抗剂、集落刺激因子、细胞因子或免疫检查点调节剂。
25.如权利要求24所述的病毒，其中该集落刺激因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
26.如权利要求25所述的病毒，其中将编码GM-CSF的该多核苷酸插入该病毒的ICP34.5基因座中。
27.如权利要求24所述的病毒，其中该细胞因子是白介素。
28.如权利要求27所述的病毒，其中该白介素选自由以下组成的组：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-24、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ。
29.如权利要求24所述的病毒，其中该细胞因子选自由以下组成的组：I型干扰素、干扰素γ、III型干扰素和TNFα。
30.如权利要求24所述的病毒，其中该免疫检查点调节剂是抑制性免疫检查点蛋白的拮抗剂。
31.如权利要求30所述的病毒，其中该抑制性免疫检查点蛋白选自由以下组成的组：ADORA2A、B7-H3、B7-H4、IDO、KIR、VISTA、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、Tim3、BTLA和CTLA4。
32.如权利要求24所述的病毒，其中该免疫检查点调节剂是刺激性免疫检查点蛋白的激动剂。
33.如权利要求32所述的病毒，其中该刺激性免疫检查点蛋白选自由以下组成的组：CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS和4-1BB。
34.如权利要求32所述的病毒，其中该刺激性免疫检查点蛋白的该激动剂选自CD40配体(CD40L)、ICOS配体、GITR配体、4-1-BB配体、0X40配体以及它们中任一种的修饰形式。
35.如权利要求32所述的病毒，其中该刺激性免疫检查点蛋白的该激动剂是选自CD40、ICOS、GITR、4-1-BB和0X40的蛋白质的抗体激动剂。
36.如权利要求23所述的病毒，其中该免疫刺激性蛋白是flt3配体、或flt3的抗体激动剂。
37.如权利要求1至36中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸是自杀基因。
38.如权利要求37所述的病毒，其中该自杀基因编码选自由以下组成的组的多肽：FK506结合蛋白(FKBP)-FAS、FKBP-半胱天冬酶-8、FKBP-半胱天冬酶-9、具有胞嘧啶脱氨酶(CDase)活性的多肽、具有胸苷激酶活性的多肽、具有尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)活性的多肽和具有嘌呤核苷磷酸化酶活性的多肽。
39.如权利要求38所述的病毒，其中具有CDase活性的该多肽是FCY1、FCA1或CodA。
40.如权利要求38所述的病毒，其中具有UPRTase活性的该多肽是FUR1或其变体。
41.如权利要求40所述的病毒，其中FUR1的该变体是FUR1Δ105。
42.如权利要求37所述的病毒，其中该自杀基因编码具有CDase和UPRTase活性的嵌合蛋白。
43.如权利要求42所述的病毒，其中该嵌合蛋白选自由以下组成的组：codA::upp、FCY1::FUR1、FCYl::FUR1Δ105(FCU1)和FCU1-8多肽。
44.如权利要求1至43中任一项所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码选自由以下组成的组的多肽：消皮素-A(GSDM-A)、消皮素-B(GSDM-B)、消皮素-C(GSDM-C)、消皮素-D(GSDM-D)、消皮素-E(GSDM-E)、含有具有二聚化结构域的C-末端半胱天冬酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC-CARD)以及它们的突变体。
45.如权利要求1至44中任一项所述的病毒，其中该一种或多种促进萨诺传递的多核苷酸编码两种或更多种不同的萨诺传递多肽，其中该两种或更多种萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRADD、TRAF2、TRAF6、cIAP1、cIAP2、XIAP、NOD2、MyD88、TRAM、HOIL、HOIP、Sharpin、IKKg、IKKa、IKKb、RelA、MAVS、RIGI、MDA5、Tak1、TBK1、IKKe、IRF3、IRF7、IRF1、TRAF3、半胱天冬酶、FADD、TNFR1、TRAILR1、TRAILR2、FAS、Bax、Bak、Bim、Bid、Noxa、Puma、TRIF、ZBP1、RIPK1、RIPK3、MLKL、消皮素A、消皮素B、消皮素C、消皮素D、消皮素E、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFSF)蛋白、它们的变体以及它们的功能片段。
46.如权利要求45所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码包含这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽的嵌合蛋白。
47.如权利要求45所述的病毒，其中这些多核苷酸中的至少一种多核苷酸被转录为编码两种或更多种不同萨诺传递多肽的单一转录物。
48.如权利要求45至47中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽激活NF-kB。
49.如权利要求45至47中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7。
50.如权利要求45至47中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽促进外在凋亡。
51.如权利要求45至47中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少两种萨诺传递多肽促进程序性坏死。
52.如权利要求45至47中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种萨诺传递多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活NF-kB，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7。
53.如权利要求45至47中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活NF-kB，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进外在凋亡。
54.如权利要求45至47中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活NF-kB，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进程序性坏死。
55.如权利要求45至47中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进外在凋亡。
56.如权利要求45至47中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽激活IRF3和/或IRF7，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进程序性坏死。
57.如权利要求45至47中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进外在凋亡，并且由该一种或多种萨诺传递多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽促进程序性坏死。
58.如权利要求51、54、56和57中任一项所述的病毒，其中该程序性坏死包括坏死性凋亡。
59.如权利要求51、54、56和57中任一项所述的病毒，其中该程序性坏死包括细胞焦亡。
60.如权利要求48和52至54中任一项所述的病毒，其中激活NF-kB的该萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、TRADD、TRAF2、TRAF6、cIAP1、cIAP2、XIAP、NOD2、MyD88、TRAM、HOIL、HOIP、Sharpin、IKKg、IKKa、IKKb、RelA、MAVS、RIGI、MDA5、Tak1、TNFSF蛋白以及它们的功能片段。
61.如权利要求49、52、55和56中任一项所述的病毒，其中激活IRF3和/或IRF7的该萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、MyD88、MAVS、TBK1、IKKe、IRF3、IRF7、IRF1、TRAF3以及它们的功能片段。
62.如权利要求50、53、55和57中任一项所述的病毒，其中促进外在凋亡的该萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、RIPK1、半胱天冬酶，FADD、TRADD、TNFR1、TRAILR1、TRAILR2、FAS、Bax、Bak、Bim、Bid、Noxa、Puma以及它们的功能片段。
63.如权利要求51、54、56和57中任一项所述的病毒，其中促进程序性坏死的该萨诺传递多肽选自由以下组成的组：TRIF、ZBP1、RIPK1、RIPK3、MLKL、消皮素以及它们的功能片段。
64.如权利要求1至63中任一项所述的病毒，其中，由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含TRIF或其功能片段。
65.如权利要求1至63中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段。
66.如权利要求1至63中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含TRIF或其功能片段，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段。
67.如权利要求1至63中任一项所述的病毒，其中由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含MAVS或其功能片段，并且由该一种或多种多核苷酸编码的这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段。
68.如权利要求1至67中任一项所述的病毒，其中该一种或多种多核苷酸进一步编码抑制半胱天冬酶活性的多肽。
69.如权利要求68所述的病毒，其中抑制半胱天冬酶活性的该多肽选自由以下组成的组：FADD显性负性突变体(FADD-DN)、cFLIP、vICA、半胱天冬酶8显性负性突变体(Casp8-DN)、cIAP1、cIAP2、Tak1、IKK以及它们的功能片段。
70.如权利要求68所述的病毒，其中抑制半胱天冬酶活性的该多肽是FADD-DN。
71.如权利要求68所述的病毒，其中抑制半胱天冬酶活性的该多肽是cFLIP。
72.如权利要求68所述的病毒，其中抑制半胱天冬酶活性的该多肽是vICA。
73.如权利要求1至72中任一项所述的病毒，其中该一种或多种多核苷酸编码至少一种消皮素或其功能片段。
74.如权利要求73所述的病毒，其中这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含TRIF或其功能片段，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含消皮素或其功能片段。
75.如权利要求73所述的病毒，其中这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含MAVS或其功能片段，这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含RIPK3或其功能片段，并且这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含消皮素或其功能片段。
76.如权利要求74或75所述的病毒，其中该消皮素是消皮素E或其功能片段。
77.如权利要求1至76中任一项所述的病毒，其中该一种或多种多核苷酸进一步包含编码二聚化结构域的多核苷酸。
78.如权利要求1至77中任一项所述的病毒，其中这些萨诺传递多肽中的至少一种萨诺传递多肽包含在进一步包含二聚化结构域的融合蛋白内。
79.如权利要求77或78所述的病毒，其中该二聚化结构域对该萨诺传递多肽是异源的。
80.一种药物组合物，该药物组合物包含如权利要求1-79中任一项所述的病毒和药学上可接受的载剂。
81.一种向受试者递送一种或多种萨诺传递多核苷酸的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求80所述的药物组合物。
82.一种促进受试者中的萨诺传递的方法，该方法包括以足以促进萨诺传递的量和时间向该受试者施用如权利要求80所述的药物组合物。
83.一种增加有需要的受试者中的免疫应答的方法，该方法包括以足以增加该受试者中的免疫应答的量和时间向该受试者施用如权利要求80所述的药物组合物。
84.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，该方法包括以足以治疗该癌症的量和时间向该受试者施用如权利要求80所述的药物组合物。
85.如权利要求84所述的方法，其中向该受试者施用该药物组合物减少该受试者中癌细胞的增殖。
86.如权利要求85所述的方法，其中这些癌细胞的该增殖是由施用于该受试者的癌症疗法导致的这些癌细胞的过度增殖。
87.如权利要求84至86中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该药物组合物减少该受试者中癌细胞的转移。
88.如权利要求84至87中任一项所述的方法，其中向该受试者施用该药物组合物减少该受试者中肿瘤的新血管形成。
89.如权利要求84至88中任一项所述的方法，其中治疗癌症包括以下中的任一项或多项：肿瘤负荷的减少、肿瘤大小的减小、肿瘤生长的抑制、在治疗前患有进展性癌症的受试者中达到稳定的癌症、癌症进展时间的延后以及存活时间的增加。
90.如权利要求81至89中任一项所述的方法，其中将该药物组合物静脉内施用于该受试者。
91.如权利要求81至89中任一项所述的方法，其中将该药物组合物肿瘤内施用于该受试者。
92.如权利要求81至91中任一项所述的方法，其中该受试者先前用免疫疗法治疗。
93.如权利要求84至92中任一项所述的方法，其中该癌症对免疫疗法无应答。
94.如权利要求84至92中任一项所述的方法，其中该癌症是对免疫疗法有应答的癌症。
95.如权利要求84至94中任一项所述的方法，其中相对于施用免疫疗法但不施用该病毒的受试者，向该受试者施用该药物组合物改善该癌症对该免疫疗法的应答。
96.如权利要求95所述的方法，其中该免疫疗法是免疫检查点疗法。
97.如权利要求96所述的方法，其中该免疫检查点疗法是免疫检查点抑制剂疗法。
98.如权利要求84至97中任一项所述的方法，其中该癌症选自上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤和白血病。
99.如权利要求84至97中任一项所述的方法，其中该癌症是实体瘤。
100.如权利要求84至97中任一项所述的方法，其中该癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肉瘤、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤、胃食管癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、肝细胞癌、恶性间皮瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓发育不良综合征、多发性骨髓瘤、移行细胞癌、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、维尔姆斯瘤和肝细胞癌。
101.如权利要求84至97中任一项所述的方法，其中该癌症是结肠癌。
102.如权利要求84至101中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括向该受试者施用抗肿瘤剂。
103.如权利要求102所述的方法，其中该抗肿瘤剂是化学治疗剂。
104.如权利要求102所述的方法，其中该抗肿瘤剂是生物剂。
105.如权利要求104所述的方法，其中该生物剂是抗原结合蛋白。
106.如权利要求102所述的方法，其中该抗肿瘤剂是免疫治疗剂。
107.如权利要求106所述的方法，其中该免疫治疗剂选自由以下组成的组：Toll样受体(TLR)激动剂、基于细胞的疗法、细胞因子、癌症疫苗和免疫检查点分子的免疫检查点调节剂。
108.如权利要求107所述的方法，其中该TLR激动剂选自科利毒素和卡介苗(BCG)。
109.如权利要求107所述的方法，其中该基于细胞的疗法是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)疗法。
110.如权利要求107所述的方法，其中该免疫检查点分子选自CD27、CD28、CD40、CD122、OX40、GITR、ICOS、4-1BB、ADORA2A、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3和VISTA。
111.如权利要求107所述的方法，其中该免疫检查点分子是刺激性免疫检查点分子，并且该免疫检查点调节剂是该刺激性免疫检查点分子的激动剂。
112.如权利要求107所述的方法，其中该免疫检查点分子是抑制性免疫检查点分子，并且该免疫检查点调节剂是该抑制性免疫检查点分子的拮抗剂。
113.如权利要求107所述的方法，其中该免疫检查点调节剂选自小分子、抑制性RNA、反义分子和免疫检查点分子结合蛋白。
114.如权利要求107所述的方法，其中该免疫检查点分子是PD-1，并且该免疫检查点调节剂是PD-1抑制剂。
115.如权利要求114所述的方法，其中该PD-1抑制剂选自派姆单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、SHR-1210、MEDI0680R01、BBg-A317、TSR-042、REGN2810和PF-06801591。
116.如权利要求107所述的方法，其中该免疫检查点分子是PD-L1，并且该免疫检查点调节剂是PD-L1抑制剂。
117.如权利要求116所述的方法，其中该PD-L1抑制剂选自度伐鲁单抗、阿特利珠单抗、阿维鲁单抗、MDX-1105、AMP-224和LY3300054。
118.如权利要求107所述的方法，其中该免疫检查点分子是CTLA-4，并且该免疫检查点调节剂是CTLA-4抑制剂。
119.如权利要求118所述的方法，其中该CTLA-4抑制剂选自艾匹利木单抗、曲美利木单抗、JMW-3B3和AGEN1884。
120.如权利要求102所述的方法，其中该抗肿瘤剂是组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
121.如权利要求120所述的方法，其中该组蛋白脱乙酰酶抑制剂是异羟肟酸、苯甲酰胺、环四肽、缩酚酸肽、亲电酮或脂族化合物。
122.如权利要求121所述的方法，其中该异羟肟酸是伏立诺他(SAHA)、贝利司他(PXD101)、LAQ824、曲古抑菌素A或帕比司他(LBH589)。
123.如权利要求121所述的方法，其中该苯甲酰胺是恩替司他(MS-275)、01994或莫替司他(MGCD0103)。
124.如权利要求121所述的方法，其中该环四肽是曲普欣B。
125.如权利要求121所述的方法，其中该脂肪酸是丁酸苯酯或丙戊酸。
126.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125中任一项所述的方法，其中该病毒不是腺病毒或腺相关病毒(AAV)。
127.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125中任一项所述的方法，其中该病毒是溶细胞的。
128.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125中任一项所述的方法，其中该病毒优先感染分裂细胞。
129.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125中任一项所述的方法，其中该病毒能够再感染先前被感染的宿主。
130.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125中任一项所述的方法，其中该病毒不包含编码合成多聚化结构域的多核苷酸。
131.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125中任一项所述的方法，其中该病毒不是痘苗病毒。
132.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125中任一项所述的方法，其中该病毒不包含编码TRIF的多核苷酸。
133.如权利要求81至125中任一项所述的方法，其中在该靶细胞中诱导免疫刺激性细胞周转通路。
134.如权利要求133所述的方法，其中该免疫刺激性细胞周转通路选自由以下组成的组：坏死性凋亡、外在凋亡、铁死亡、细胞焦亡以及它们的组合。
135.如权利要求133或134所述的方法，其中该靶细胞缺乏该免疫刺激性细胞周转通路。
136.如权利要求135所述的方法，其中该靶细胞在编码受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK1)的基因、编码受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)的基因、编码Z-DNA结合蛋白1(ZBP1)的基因、编码混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)的基因和编码含Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)的基因中的一种或多种中具有失活突变。
137.如权利要求135所述的方法，其中该靶细胞具有降低的RIPK1、RIPK3、ZBP1、TRIF和MLKL中的一种或多种的表达或活性。
138.如权利要求135所述的方法，其中该靶细胞具有编码RIPK1的基因、编码RIPK3的基因、编码ZBP1的基因、编码TRIF的基因和编码MLKL的基因中的一种或多种的拷贝数损失。
139.如权利要求133至138中任一项所述的方法，其中该靶细胞选自由以下组成的组：癌细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞。
140.如权利要求139所述的方法，其中该靶细胞是癌细胞。
141.如权利要求140所述的方法，其中该癌症是转移性癌症。
142.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125和133至141中任一项所述的方法，其中该病毒是溶瘤病毒。
143.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125和133至141中任一项所述的方法，其中该病毒是DNA复制型病毒。
144.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125和133至141中任一项所述的方法，其中该病毒是DNA复制型溶瘤病毒。
145.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125和133至141中任一项所述的方法，其中该病毒优先感染靶细胞。
146.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125和133至141中任一项所述的方法，其中该病毒在一个或多个内源性病毒基因中包含抑制癌细胞的萨诺传递的失活突变。
147.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125和133至141中任一项所述的方法，其中该病毒能够将至少4kb的异源多核苷酸转运到靶细胞中。
148.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125和133至141中任一项所述的方法，其中该病毒是单纯疱疹病毒(HSV)。
149.如权利要求148所述的病毒、药物组合物或方法，其中该HSV是HSV1。
150.如权利要求149所述的病毒、药物组合物或方法，其中该HSV1选自由以下组成的组：Kos、F1、MacIntyre、McKrae和相关毒株。
151.如权利要求148至150中任一项所述的病毒、药物组合物或方法，其中该HSV在选自由以下组成的组的一个或多个基因中有缺陷：ICP34.5、ICP47、UL24、UL55、UL56。
152.如权利要求151所述的病毒、药物组合物或方法，其中每个ICP34.5编码基因被包含可操作地连接到立即早期(IE)启动子的US 11编码基因的多核苷酸盒替代。
153.如权利要求148至152中任一项所述的病毒、药物组合物或方法，其中该HSV包含痘苗病毒E3L基因的ΔZα突变体形式。
154.如权利要求148至153中任一项所述的病毒、药物组合物或方法，其中该HSV在ICP6的一种或多种功能中有缺陷。
155.如权利要求154所述的病毒、药物组合物或方法，其中该ICP6具有受体相互作用蛋白同型相互作用基序(RHIM)结构域的突变。
156.如权利要求154或155所述的病毒、药物组合物或方法，其中该ICP6在C-末端具有一个或多个抑制半胱天冬酶-8结合的突变。
157.如权利要求154至156中任一项所述的病毒、药物组合物或方法，其中该HSV将该US11基因表达为立即早期基因。
158.如权利要求154至156中任一项所述的病毒、药物组合物或方法，其中缺失该ICP47基因，使得该US11基因处于ICP47立即早期启动子的控制下。
159.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125和133至141中任一项所述的方法，其中该病毒属于痘病毒科。
160.如权利要求159所述的病毒、药物组合物或方法，其中属于该痘病毒科的该病毒选自由以下组成的组：粘液瘤病毒、亚巴样病病毒、浣熊痘病毒、orf病毒和牛痘病毒。
161.如权利要求159所述的病毒、药物组合物或方法，其中该病毒属于痘病毒科的脊椎动物痘病毒亚科。
162.如权利要求161所述的病毒、药物组合物或方法，其中该病毒属于脊椎动物痘病毒亚科的正痘病毒属。
163.如权利要求162所述的病毒、药物组合物或方法，其中该病毒属于正痘病毒属的痘苗病毒种。
164.如权利要求163所述的病毒、药物组合物或方法，其中该痘苗病毒是选自由以下组成的组的毒株：Dairenl、IHD-J、L-IPV、LC16M8、LC16MO、李斯特、LIVP、塔什干、WR 65-16、惠氏、安卡拉、哥本哈根、天坛和WR。
165.如权利要求163或164所述的病毒、药物组合物或方法，其中该痘苗病毒被工程化以缺乏胸苷激酶(TK)活性。
166.如权利要求163至165中任一项所述的病毒、药物组合物或方法，其中该痘苗病毒在该J2R基因中具有降低或消除TK活性的失活突变或缺失。
167.如权利要求163至166中任一项所述的病毒、药物组合物或方法，其中该痘苗病毒被工程化以缺乏核糖核苷酸还原酶(RR)活性。
168.如权利要求167所述的病毒、药物组合物或方法，其中该痘苗病毒在选自I4L和F4L基因的基因中具有降低或消除RR活性的失活突变或缺失。
169.如权利要求163至168中任一项所述的病毒、药物组合物或方法，其中该痘苗病毒在E3L基因中有缺陷。
170.如权利要求169所述的病毒、药物组合物或方法，其中该E3L基因具有导致在癌细胞中诱导坏死性凋亡的突变。
171.如权利要求1至79中任一项所述的病毒、如权利要求80所述的药物组合物或如权利要求81至125和133至141中任一项所述的方法，其中该病毒是腺病毒。
172.如权利要求171所述的病毒、药物组合物或方法，其中该腺病毒是Ad5/F35。
173.如权利要求171或172所述的病毒、药物组合物或方法，其中该腺病毒包含腺病毒早期区域1A(E1A)中的缺失。
174.如权利要求171至173中任一项所述的病毒、药物组合物或方法，其中该腺病毒包含腺病毒早期区域1B(E1B)中的缺失。
175.如权利要求171至174中任一项所述的病毒、药物组合物或方法，其中该腺病毒具有工程化到纤维H环中的Arg-Gly-Asp(RGD)基序。
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