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CN116059370A - 敲低或抑制长链非编码rna jpx的物质的医药用途 - Google Patents

敲低或抑制长链非编码rna jpx的物质的医药用途 Download PDF

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CN116059370A
CN116059370A CN202211191187.9A CN202211191187A CN116059370A CN 116059370 A CN116059370 A CN 116059370A CN 202211191187 A CN202211191187 A CN 202211191187A CN 116059370 A CN116059370 A CN 116059370A
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lncrna
jpx
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preventing
substance
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CN202211191187.9A
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顾嘉铭
李雪松
董梦蝶
陈佳婧
陈明红
张韵佳
陈祥
印全文
郑龙彬
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Nanjing Medical University
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Nanjing Medical University
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Abstract

本申请提供了敲低或抑制长链非编码RNA JPX的物质的医药用途，具体来说是敲低或抑制lncRNA JPX的物质在制备防治衰老所致心血管疾病药物中的应用；在衰老所致的动脉粥样硬化患者及动脉粥样硬化相关的细胞和动物模型中，发现抑制lncRNA JPX，可以抑制衰老，延缓动脉粥样硬化的进程；本申请为衰老所致动脉粥样硬化相关血管疾病的诊断及治疗提供了新的靶点，开拓了防治药物制备的新方向。

Description

敲低或抑制长链非编码RNA JPX的物质的医药用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及敲低或抑制长链非编码RNA JPX的物质的医药用途，具体涉及敲低或抑制lncRNA JPX在制备衰老所致动脉粥样硬化相关血管疾病防治药物中的应用。
背景技术
随着社会发展，心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVDs)因其具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，正逐渐成为威胁人类健康的世界性问题，预计到2030年，CVDs仍将继续成为全球主要的死亡原因。其中，动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是中风、缺血性心脏病和周围血管疾病的共同病理生理基础，是由高血压、高血脂和遗传等多种危险因素所共同造成，并且一些不良的生活方式会加剧AS的发生和发展，例如高脂高胆固醇饮食、肥胖、吸烟、缺少运动和久坐等。AS的病变发展是一个典型的依赖年龄的过程。AS是一种慢性血管炎性疾病，其主要病变特征为血管内膜脂质沉积，同时还伴有平滑肌细胞和纤维基质增生，逐渐发展成为AS斑块。随着研究的深入，研究者发现血管中的多种衰老细胞与AS病理生理学变化密切相关，同时衰老细胞所分泌的SASP也会导致AS斑块的进展和失衡。在致病因素刺激下，衰老血管平滑肌细胞(Human vascular smooth muscle cells，HVSMCs)可形成多种SASP，促进单核细胞趋化，可以刺激和影响邻近的非衰老HVSMCs细胞和组织的稳态；衰老HVSMCs还可以通过分泌基质降解蛋白酶，导致细胞增殖减弱，促进纤维帽变薄，影响斑块的稳定性；同时衰老HVSMCs产生的胶原比正常HVSMCs少，会进一步影响斑块的稳定性。因此，细胞衰老逐渐被作为AS性心血管疾病的主要危险因素之一。
随着表观遗传学的深入研究,人们越来越认识到长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)显示出高度的细胞和组织特异性,以及其作为细胞中调节因子的作用。许多研究表明，lncRNAs与胚胎发育、细胞凋亡、组织生长等关系密切，是一种在人体组织中表达非常广泛的调控因子。近年来，lncRNA在AS发病机制中的修饰作用也引起了广泛关注。研究证实lncRNA H19、lncRNA MALAT1、lncRNA P21、lncRNA ANRIL等都能够通过p53/p21和p16/Rb两个主要调节途径参与影响细胞增殖、凋亡等过程，从而参与细胞衰老以及AS的发生发展。许多lncRNAs已被报道可调节核因子κB(NF-κB)的活化及其下游靶基因，这些发现提出了这样的假设：在衰老过程中，lncRNAs可能在SASP诱导的AS中发挥关键作用。lncRNA JPX基因定位于X染色体长臂上的12位点，是XIST基因的激活剂，也是X染色体失活的分子开关。它可以正向调节XIST的表达，从而参与X染色体失活。JPX作为一种lncRNA，已被证明可以靶向数百个常染色体基因，相对于它在基因组中的表现，它更喜欢结合启动子、转录起始或转录终止位点的近端区域、外显子和内含子。JPX可以通过驱逐转录因子或与许多重要的转录因子协同调节基因表达。相关文献报道，lncRNA JPX能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭、参与肺癌、胃癌和宫颈癌等多种癌症的发生发展过程，但lncRNA JPX是否能够通过调控SASP基因，参与细胞衰老，从而影响AS的关系还未见报道。
发明内容
针对上述问题，本申请提供一种敲低lncRNA JPX物质的医药用途。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
敲低或抑制lncRNA JPX的物质在制备防治衰老所致心血管疾病药物中的应用。作为本发明的一种优选，所述敲低或抑制lncRNA JPX的物质包括敲低lncRNA JPX的小干扰RNA或敲除lncRNA JPX的基因编辑系统，比如CRISP/Cas9基因编辑系统等目前已知的能够敲除或抑制目的基因的基因编辑系统。
作为本发明的进一步优选，所述的敲低lncRNA JPX的siRNA序列如CCAGUUAAUAGUAUUGUGUTT(SEQ ID NO.1)和ACACAAUACUAUUAACUGGTT(SEQ ID NO.2)所示。作为本发明的一种优选，所述防治衰老所致的心血管疾病药物包括防治动脉粥样硬化的药物。
lncRNA JPX作为靶点在筛选防治衰老所致心血管疾病药物中的应用。
一种筛选防治衰老所致心血管疾病药物的方法，向Ras诱导的衰老HVSMCs给予候选药物，检测lncRNA JPX表达量，如果lncRNA JPX得到抑制，这说明该候选药物具有防治衰老所致心血管疾病的体外活性；或者对衰老所致心血管疾病动物模型给予候选药物，检测lncRNA JPX表达量，如果lncRNA JPX得到抑制，这说明该候选药物具有防治衰老所致心血管疾病的体内活性。
lncRNA JPX作为检测靶点在制备衰老所致动脉粥样硬化的辅助检测试剂中的应用。
检测lncRNA JPX的物质在制备衰老所致动脉粥样硬化的辅助检测试剂中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的检测lncRNA JPX的物质为定量检测lncRNA JPX的物质。
作为本发明的进一步优选，所述的定量检测lncRNA JPX的物质为lncRNA JPX的特异性引物对。
有益效果：
本申请通过Western Blot、细胞免疫荧光等方法研究衰老所致Apoe-/-小鼠主动脉组织以及人血管平滑肌中lncRNA JPX的表达。构建并合成特异性干扰lncRNA JPX的敲除小鼠；选取8周龄的Apoe-/-小鼠，并随机分为对照组和lncRNA JPX敲除组，对照组和lncRNAJPX敲除组小鼠每周两次静脉注射非特异性对照或lncRNA JPX gapmeRs(每只小鼠10mg/kg)，持续注射并高脂饮食喂养16周，构建AS小鼠模型。本发明首次明确lncRNA JPX对HVSMCs的调节机制，有效防止HVSMCs的衰老，及其导致的AS发生，为AS的诊断及治疗提供新的防治药物研发途径和药物作用靶点，具有十分重要的药用价值。
附图说明
图1为正常HVSMCs(图中Con表示)和Ras诱导的衰老HVSMCs(图中Ras表示)中lncRNA JPX的表达水平示意图；
检测方法为通过实时定量PCR(RT-qPCR)检测它们在正常和Ras诱导的衰老的HVSMCs中lncRNA JPX表达水平。
图2为敲除HVSMCs中lncRNA JPX，给予Ras刺激，Western Blot检测P16、P21、P53蛋白表达水平示意图；
检测方法为：给予HVSMCs silncRNA JPX刺激24h敲低lncRNA JPX，再给予Ras刺激24h，通过Western Blot检测P16、P21、P53蛋白表达水平。
图3为敲除HVSMCs中lncRNA JPX，给予Ras刺激，β-半乳糖甘酶染色检测HVSMCs衰老示意图；
检测方法为:给予HVSMCs silncRNA JPX刺激24h敲低lncRNA JPX，再给予Ras刺激24h，用β-半乳糖甘酶染色实验检测HVSMCs衰老情况。
图4为敲除HVSMCs中lncRNA JPX，给予Ras刺激，实时定量PCR(RT-qPCR)检测IL-6、IL-8、IL-1β、CCL2、ICAM-1、TNF-α等SASP基因表达水平示意图；检测方法为:给予HVSMCssilncRNA JPX刺激24h敲低lncRNA JPX，再给予Ras刺激24h，提取细胞RNA，用qRT-PCR检测IL-6、IL-8、IL-1β、CCL2、ICAM-1、TNF-α等SASP基因表达水平。
图5为正常(NC)和高脂(HFD)喂养的Apoe-/-小鼠血管组织中lncRNA JPX的表达水平示意图。
检测方法：选取8周龄的Apoe-/-小鼠，并随机分为对照组和高脂喂养组，高脂饮食喂养16周，构建AS小鼠模型。随后收取小鼠血管组织，提取RNA进行qRT-PCR实验检测正常饮食和高脂喂养血管中lncRNA JPX的表达水平。
图6为小鼠模型油红O染色检测结果图片；
检测方法为：选取8周龄的Apoe-/-小鼠，并随机分为对照组和lncRNA JPX敲除组，将对照组和lncRNA JPX敲除组小鼠每周两次静脉注射非特异性对照或lncRNA JPXgapmeRs(每只小鼠10mg/kg)，持续注射并高脂饮食喂养16周，构建AS小鼠模型。随后收取其主动脉血管，通过油红O染色检测斑块的大小。
图7为小鼠血管组织通过Western Blot检测P16、P21、P53蛋白表达水平示意图；
检测方法为：选取8周龄的Apoe-/-雄性小鼠，并随机分为对照组和lncRNA JPX敲除组，将对照组和lncRNA JPX敲除组小鼠每周两次静脉注射非特异性对照或lncRNA JPXgapmeRs(每只小鼠10mg/kg)，持续注射并高脂饮食喂养16周，构建AS小鼠模型。随后收取小鼠血管组织，提取小鼠血管组织蛋白，通过Western Blot检测p-STING、STING、p-TBK1、TBK1、p-IRF3、IRF3、P16、P21、P53蛋白表达水平。
图8为小鼠模型免疫荧光检测结果图片；
检测方法为：选取8周龄的Apoe-/-雄性小鼠，并随机分为对照组和lncRNA JPX敲除组，将对照组和lncRNA JPX敲除组小鼠每周两次静脉注射非特异性对照或lncRNA JPXgapmeRs(每只小鼠10mg/kg)，持续注射并高脂饮食喂养16周，构建AS小鼠模型。测量P21和α-SMA在小鼠主动脉组织切片中的表达水平：提取小鼠主动脉组织后进行OCT包埋，冰冻切片后，用免疫荧光检测P21和α-SMA的表达，红色(A)代表P21，绿色(C)代表α-SMA，蓝色(B)代表细胞核,白色箭头所示为红色和绿色的共定位黄色区域。
图9为小鼠血管组织通过实时定量PCR(RT-qPCR)检测IL-6、IL-8、IL-1β、CCL2、ICAM-1、TNF-α等SASP基因表达水平示意图；
检测方法为：选取8周龄的Apoe-/-雄性小鼠，并随机分为对照组和lncRNA JPX敲除组，将对照组和lncRNA JPX敲除组小鼠每周两次静脉注射非特异性对照或lncRNA JPXgapmeRs(每只小鼠10mg/kg)，持续注射并高脂饮食喂养16周，构建AS小鼠模型。提取小鼠主动脉组织RNA，用qRT-PCR检测IL-6、IL-8、IL-1β、CCL2、ICAM-1、TNF-α等SASP基因表达水平。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
以下实施例涉及的细胞、试剂来源：
人血管平滑肌细胞(HVSMCs)：购于ScienCell公司。
Apoe-/-小鼠：购于维通利华实验动物技术有限公司，8周龄雄性小鼠。
以下实施例所涉及的细胞实验均经过南京医科大学伦理委员会的批准。
siJPX：由上海吉玛基因公司合成。正义链核苷酸序列为:5‘-CCAGUUAAUAGUAUUGUGUTT-3’(SEQ ID NO.1)，反义链核苷酸序列为:5‘-ACACAAUACUAUUAACUGGTT-3’(SEQ ID NO.2)。
实施例1 lncRNA JPX与衰老所致AS相关性检测试验
为了探索正常和Ras诱导的衰老HVSMCs中lncRNA JPX的水平，验证lncRNA JPX是否参与了AS，本实施例采用qRT-PCR的方法检测正常和Ras诱导的衰老HVSMCs中lncRNA JPX表达水平。
参考Oncogenic ras Provokes Premature Cell Senescence Associated withAccumulation of p53 and p16INK4a，构建衰老HVSMCs实验步骤如下：
(1)在10cm大皿中种5x106个Phoenix细胞培养；
(2)第二天换液，加6mL新鲜培养基继续培养；
(3)取20μg目的质粒(pBabe-H-RasV12)+0.4μgVSV-G质粒溶于1mL Opti-MEM，轻轻混匀；
(4)取12μL lipo2000溶于1mL Opti-MEM，轻轻混匀；
(5)两者室温静止5min；
(6)质粒与lipo2000两者合并混匀，静止20min；
(7)将上述混合液滴加到种了细胞的培养皿培养中，轻轻晃动混匀；
(8)37℃培养15h后换液，弃掉培养基，每碟细胞加入6mL新鲜培养基；
(9)培养48h后收取细胞第一上清液，0.45μm的滤膜过滤，4℃保存；
(10)再添加6mL新鲜培养基继续培养细胞8h后再收集第二上清液，0.45μm的滤膜过滤，4℃保存：
(11)将HVSMCs在六孔板中进行培养；
(12)感染时，将适量的第一上清液与培养基混合，在37℃下培养12h；
(13)用第二上清液重复感染过程，并用2μg/mL嘌呤霉素进行筛选，持续3天。
总RNA的提取实验步骤如下：
(1)收集处理后的样品，按Trizol试剂盒所述，提取总RNA。用去RNA酶枪头、DEPC水、戴口罩(避RNA酶，防止RNA降解)；
(2)用PBS洗涤细胞，每孔中加入1mL Trizol；
(3)10s后，将细胞裂解液转移至EP中，冰上静置10min；
(4)加200μL氯仿，震荡混匀，置于冰上裂解10min；
(5)4℃，12000rpm，离心15min；
(6)小心吸取上清液至新EP管，加入异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min；
(7)12000rpm，4℃，离心15min，弃去上清液；
(8)倒置于纸上吸干余液，加入DEPC水稀释的75％乙醇，用枪轻轻吹散，可见白色羽毛状沉淀；
(9)离心：4℃，12000rpm，15min；
(10)弃去上清乙醇，纸吸干，置于细胞房超净台通风孔处风干(5-10min)
(11)加入DEPC水溶解RNA；
(12)NanoDrop测RNA浓度，测完后置于-80℃冰箱储存备用。
逆转录实验步骤如下：
(1)使用
Figure BDA0003869475810000071
II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，反应总体积为20μL，具体组成如下所示：
RNase free ddH2O To 20μL
Total RNA 1μg
Figure BDA0003869475810000072
II Buffer plus 4μL
(2)混合均匀后用PCR仪进行逆转录：
25℃ 5min
42℃ 30min
85℃ 5min
(3)逆转录结束后，将cDNA用DEPC水按1：3或1：4比例稀释，-80℃储存备用。
Real-time PCR实验步骤如下：
(1)本实验采
Figure BDA0003869475810000073
qPCR SYBR Green Master Mix对目的基因进行相对定量检测，PCR反应体系如下：
cDNA模板 1μL
Figure BDA0003869475810000074
qPCR SYBR Green Master Mix 5μL
上游引物：TGCAGTCAGAAGGGAGCAAT，1μM 1μL
下游引物：CACCGTCATCAGGCTGTCTT，1μM 1μL
超纯水2μL
(2)进行分组，计算体系(最后加cDNA)；
(3)封膜，384孔板离心后放入荧光定量PCR仪中；
(4)反应在Bio-Rad 480 Ι Ι型定量PCR仪上进行。
检测结果如图1所示，与正常组相比，Ras诱导的衰老HVSMCs中lncRNA JPX表达水平显著升高。
为了进一步明确lncRNA JPX是否参与HVSMCs衰老，从而导致AS，我们构建了lncRNA JPX的小干扰RNA(siRNA)。在HVSMCs中转染siRNA敲除lncRNA JPX后，给予Ras刺激，提取细胞蛋白，通过Western Blot检测P16、P21、P53等衰老标志物的表达。
Western Blot检测试验步骤如下：
(1)配置SDS聚丙烯胺凝胶：根据蛋白分子量配制分离胶，将各种试剂按照不同配比加入到50mL离心管中配置分离胶，涡旋震荡30s混匀，倒入垂直夹层玻璃板中至玻璃板中上部，再缓慢加入ddH2O进行液封，室温凝固45min。浓缩胶：根据配方将试剂混合均匀倒入分离胶上方至玻璃板顶端，插入梳子(避免混入气泡)，可用移液器将剩余液体从梳子两侧补加进去，待胶体凝固后备用。
(2)样品上样并进行电泳分离：上样电泳，上样前蛋白样品瞬时离心，然后轻微摇匀。一般按照总质量为30μg蛋白的溶液体积即为上样量。将凝胶板固定于电泳装置的电泳槽内，两个凝胶板之间加满1x电泳缓冲液后拔出梳子上样，上样结束后补满液体开始电泳。80V恒压电泳跑至溴酚蓝抵达浓缩胶与分离胶交界处并且每条泳道的蛋白样品基本在同一水平线上，调成120V，等到溴酚蓝接近底部时终止电泳。
(3)转膜：玻璃板拆下，切胶。将PVDF膜根据凝胶大小裁剪好，提前用甲醇激活1min，再与海绵、滤纸、凝胶一起放入1x转膜缓冲液浸泡5-10min，之后按照顺序依次排列好，放置过程中注意排出气泡。将转膜槽放入盒子中，恒压120V，根据蛋白分子量选择转膜时间(转膜过程中产热，周围放入冰袋和水模拟4℃低温环境)。
(4)封闭：转完后将膜取出，放在5％脱脂牛奶(TBS-T配制)中，室温脱色摇床上摇动封闭1h。
(5)一抗孵育：封闭结束后用TBS-T洗净牛奶，将膜密封于塑封膜内，加入相应的一抗，4℃冰箱摇床过夜。
(6)二抗结合：将膜用TBS-T分别10min、10min、5min、5min洗四次，与相应的二抗室温于脱色摇床上摇动孵育1h，再用TBS-T依次洗膜10min、10min、5min、5min。
(7)ECL显色：显色前将ECL显色液A、B液等体积混合均匀(避光)，在荧光化学发光凝胶成像系统中显像，拍照并保存记录。
检测结果如图2所示，与正常HVSMCs相比，干扰lncRNA JPX后，Ras诱导的HVSMCs中P16、P21、P53蛋白表达水平下降。意味着lncRNA JPX参与HVSMCs衰老的调节，干扰lncRNAJPX可以减少Ras诱导的衰老，从而抑制AS的发生发展。
同时进行β-半乳糖甘酶染色实验(β-Gal染色实验)，检测结果如图3所示，干扰lncRNA JPX后，衰老的HVSMCs(蓝色)明显减少。
β-半乳糖甘酶染色实验步骤如下：
(1)吸除培养基，用PBS洗涤3次，每次5min。
(2)加入适当体积的β-半乳糖苷酶染色固定液，以充分盖住细胞为宜，室温固定不少于15min。
(3)吸除固定液，用PBS洗涤3次，每次5min。
(4)加入适当量的染色工作液(染色工作液的配制以1mL为例)
Figure BDA0003869475810000091
(5)37℃孵育过夜，最好把细胞浸泡在染色工作液中。注：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。
(6)吸除染色工作液，用PBS洗涤3次，每次5min。
(7)加入检测液，在普通光学显微镜下观察。光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达-半乳糖苷酶的细胞。
同时，也可以通过验证SASP基因水平来进一步证明细胞衰老。结果如图4所示，干扰lncRNA JPX能够降低由Ras诱导的IL-6、IL-8、IL-1β、ICAM-1、CCL2、TNF-α等SASP基因水平的升高。本实施例中使用的IL-6上游引物序列为：5’-CTCCAGAACAGATTTGAGAG-3’,下游引物序列为：5‘-GGGTCAGGGGTGGTTATTGC-3’；IL-8上游引物序序列为5’-CTGAGGTGCCAGTGCATTAG-3’,下游引物序列为：5‘-AGCACACCTCTCTTCCATCC-3’；IL-1β上游引物序序列为5’-TTGCCAGCCAGTGACACAAT-3’,下游引物序列为：5‘-GAGAAGGTGGTTGTCTGGGAAT-3’；ICAM-1上游引物序列为5’-AGGTTGAACCCCACAGTCAC-3’,下游引物序列为：5‘-TCTGAGACCTCTGGCTTCGT-3’；CCL2上游引物序序列为5’-GATCTCAGTGCAGAGGCTCG-3’,下游引物序列为：5‘-TCTGGGGAAAGCTAGGGGAA-3’；TNF-α上游引物序列为5’-TAACAAGCCGGTAGCCCACG-3’,下游引物序列为：5‘-TCTTGATGGCAGACAGGATG-3’。
实施例2小鼠模型试验
为了进一步验证lncRNA JPX在衰老所致AS中的作用，本实施例构建特异性干扰lncRNA JPX的敲除小鼠。Antisense LNA GapmeRs，是一类能高效抑制mRNA和lncRNA功能的反义寡核苷酸，一般长14-16个核苷酸，并且全部被硫代磷酸化，可通过细胞膜表面受体介导进入细胞中发挥功能，特异性干扰lncRNA。选取8周龄的Apoe-/-雄性小鼠，并随机分为对照组和lncRNA JPX敲除组(构建方法参考文献：A Smooth Muscle Cell-Enriched LongNoncoding RNA Regulates Cell Plasticity and Atherosclerosis by InteractingWith Serum Response Factor)，将对照组和lncRNA JPX敲除组小鼠每周两次静脉注射对照(序列为5‘-CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC-3’)或lncRNA JPX gapmeRs(序列为5‘-TTCTTGTCATTGCTCCCTTC-3’)每只小鼠10mg/kg，高脂饮食喂养16周，构建AS小鼠模型。随后，收取小鼠血管组织，通过以上构建小鼠AS相关血管疾病模型。
同时，收取小鼠血管组织，进行RT-qPCR检测，检测结果如图5所示，可见，小鼠给予高脂饮食(High fat diet，HFD)后，lncRNA JPX被显著活化。
小鼠组织提取RNA实验步骤：
(1)从液氮中取出组织后，快速的拿到超净台上，放入小皿中，加入trizol试剂，(100mg的组织放入1.2mL的Trizol试剂)，用注射器进行研磨，注意要熟练，快速研磨。
(2)4℃，12000转，离心5min,弃沉淀。(超净台准备好EP管，离心后，吸取上清至准备好的EP管中)
(3)按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，剧烈振荡15s,(用手震荡即可)15-30℃，孵育2-3min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。(氯仿又叫三氯甲烷chloroform，一般储存在4℃冰箱中)。
(4)4℃，12000转,离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。注：吸取水相要小心，千万不要吸取中间界面，可采用小枪头少量多次吸取。若同时提取DNA和蛋白质，则保存下层有机相，存于4℃冰箱内备用，否则弃下层有机相。
(5)按500μL异丙醇/mL Trizol的比例加入异丙醇，用手震荡一下，15-30℃(室温即可)孵育10min。
(6)2-8℃，12000g，离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
(7)按1mL 75％乙醇/mL Trizol加入75％乙醇，漩涡混匀，悬浮沉淀。(注：75％乙醇用DEPC水配制)
(8)4℃，7500转离心5min，尽量弃尽上清(注：用完离心机关电源后，将离心机盖打开30min降温，再盖上)室温晾干或真空干燥5-10min。(注：不能用离心的方法使RNA干燥，RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。)
(9)加入DEPC水溶解RNA；
(10)NanoDrop测RNA浓度，测完后置于-80℃冰箱储存备用。
逆转录实验步骤如下：
(1)使用
Figure BDA0003869475810000111
II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，反应总体积为20μL，具体组成如下所示：
RNase free ddH2O To 20μL
Total RNA 1μg
Figure BDA0003869475810000112
II Buffer plus 4μL
(2)混合均匀后用PCR仪进行逆转录：
25℃ 5min
42℃ 30min
85℃ 5min
(3)逆转录结束后，将cDNA用DEPC水按1：3或1：4比例稀释，-80℃储存备用。
Real-time PCR实验步骤如下：
(1)本实验采
Figure BDA0003869475810000113
qPCR SYBR Green Master Mix对目的基因进行相对定量检测，PCR反应体系如下：
cDNA模板 1μL
Figure BDA0003869475810000121
qPCR SYBR Green Master Mix 5μL
上游引物，1μM 1μL
下游引物，1μM 1μL
超纯水 2μL
(2)进行分组，计算体系(最后加cDNA)；
(3)封膜，384孔板离心后放入荧光定量PCR仪中；
(4)反应在Bio-Rad 480 Ι Ι型定量PCR仪上进行。
并且收取小鼠主动脉血管，通过油红O染色检测斑块的大小，检测图片如图6所示。Apoe-/-给予HFD后血管红色斑块显著增多，而敲除lncRNA JPX则能显著降低斑块面积。
主动脉根部血管油红O染色步骤如下：
(1)主动脉树分离出来后，置于干净的六孔板中，用4％的多聚甲醛固定。
(2)用显微镊取经过多聚甲醛固定好的主动脉于新的六孔板中，用三蒸水漂洗10min左右。
(3)用移液枪吸掉六孔板中的三蒸水，加入60％异丙醇溶液，处理2min。
(4)用移液枪吸掉六孔板中的异丙醇，加入提前滤好的油红O染液，置于水平摇床上染色1h。
(5)用移液枪吸掉六孔板中油红O染液，加入60％异丙醇溶液溶液漂洗1min，如此重复3次，直至血管背景不在是红色。
(6)在显微镜下用显微剪小心去除残余的血管外壁脂肪。
(7)最后将染色好的主动脉树平铺在黑色解剖蜡板上，拍照。
同时收取小鼠血管组织蛋白，用Western Blot检测P16、P21、P53等衰老标志物。检测结果如图7所示，可见，对照组小鼠给予HFD后，P16、P21、P53等衰老标志物被显著活化；而与其相比，JPX gapmeRs小鼠给予HFD后，P16、P21、P53蛋白表达水平显著降低。
进一步进行血管免疫荧光检测，高脂喂养16周提取不同分组小鼠主动脉组织后进行冰冻切片包埋剂(optimal cutting temperature compound，OCT)包埋，冰冻切片后，免疫荧光检测P21和α-SMA的表达，如图8所示，其中红色代表P21，绿色代表α-SMA，蓝色代表细胞核，白色箭头所示为红色和绿色的共定位黄色区域。可见，Apoe-/-给予HFD后，血管内皮P21表达显著增加，P21与α-SMA的共定位呈黄色；而JPX gapmeRs小鼠给予HFD后，血管平滑肌P21表达下降，同时P21与α-SMA的共定位黄色显著下降。
提取不同分组小鼠主动脉组织，进行RT-qPCR实验，检测SASP基因水平来进一步证明lncRNA JPX对衰老以及AS的作用。图9发现，对照组小鼠给予HFD后，IL-6、IL-8、IL-1β、ICAM-1、CCL2、TNF-α等SASP基因水平明显升高；而与其相比，JPX gapmeRs小鼠给予HFD后，可以逆转IL-6、IL-8、IL-1β、ICAM-1、CCL2、TNF-α等SASP基因水平的升高。
由以上实施例可见：在衰老所致的动脉粥样硬化患者及动脉粥样硬化相关的细胞和动物模型中，抑制或敲除lncRNA JPX，可以抑制衰老，延缓动脉粥样硬化的进程。因此，抑制或敲除lncRNA JPX的物质能够被用于制备治疗衰老所致心血管疾病的药物，尤其是用于制备治疗衰老所致动脉粥样硬化的药物，lncRNA JPX也可以作为靶点用于筛选治疗衰老所致心血管疾病的药物，尤其是用于筛选治疗衰老所致动脉粥样硬化的药物。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.敲低或抑制lncRNA JPX的物质在制备防治衰老所致心血管疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述敲低或抑制lncRNA JPX的物质包括但不限于敲低lncRNA JPX的小干扰RNA或敲除lncRNA JPX的基因编辑系统。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的敲低lncRNA JPX的小干扰RNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述防治衰老所致的心血管疾病药物包括但不限于防治动脉粥样硬化的药物。
5.lncRNA JPX作为靶点在筛选防治衰老所致心血管疾病药物中的应用。
6.一种筛选防治衰老所致心血管疾病药物的方法，其特征在于向Ras诱导的衰老HVSMCs给予候选药物，检测lncRNA JPX表达量，如果lncRNA JPX得到抑制，这说明该候选药物具有防治衰老所致心血管疾病的体外活性；或者对衰老所致心血管疾病动物模型给予候选药物，检测lncRNA JPX表达量，如果lncRNA JPX得到抑制，这说明该候选药物具有防治衰老所致心血管疾病的体内活性。
7.lncRNA JPX作为检测靶点在制备衰老所致动脉粥样硬化的辅助检测试剂中的应用。
8.检测lncRNA JPX的物质在制备衰老所致动脉粥样硬化的辅助检测试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的检测lncRNA JPX的物质为定量检测lncRNA JPX的物质。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的定量检测lncRNA JPX的物质为lncRNA JPX的特异性引物对。
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