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CN116555411A - LncRNA KCND1在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用 - Google Patents

LncRNA KCND1在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用 Download PDF

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CN116555411A
CN116555411A CN202211104016.8A CN202211104016A CN116555411A CN 116555411 A CN116555411 A CN 116555411A CN 202211104016 A CN202211104016 A CN 202211104016A CN 116555411 A CN116555411 A CN 116555411A
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CN
China
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kcnd1
lncrna
hypertrophy
pathological
cardiac hypertrophy
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CN202211104016.8A
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单宏丽
于桐
周宇宏
罗宇
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Shanghai University of Engineering Science
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Shanghai University of Engineering Science
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Publication date
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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及LncRNA KCND1在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用。本发明首先证明在实验性心肌肥厚小鼠及心肌肥大细胞中LncRNA KCND1表达显著下调，其次通过使用小干扰RNA技术特异性抑制心肌细胞中LncRNA KCND1的表达，结果发现心肌细胞明显肥大，最后发现通过使用腺相关病毒9携带LncRNA KCND1在横向主动脉缩窄术(TAC)诱导的小鼠心肌肥厚中过表达LncRNA KCND1，可以有效减轻实验性心肌肥大，改善TAC小鼠的心功能。本发明为心肌肥厚的发生阐释了一个新的病理生理学机制，并提供了一种可用于病理性心肌肥厚相关疾病的预防和治疗的新药物。

Description

LncRNA KCND1在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及LncRNA KCND1在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用。
背景技术
病理性心肌肥厚是心脏长期受到外界刺激后表现出的心室壁厚度增加，心肌收缩力下降以及心功能减弱等一系列变化，最终引发心力衰竭、恶性心律失常等。其临床表现为呼吸困难、胸痛、头晕昏厥、心悸，易发生心衰和猝死。病理性心肌肥厚的病人除了心脏肥大外还会出现左室舒张功能障碍、左室流出道拥堵、心肌细胞氧气供求失衡以及心律失常等现象。其病理改变以心肌细胞异常增大、成纤维细胞过度增殖、细胞外基质重构、活性氧超载以及血管新生为主要特征，进一步发展会出现线粒体功能损伤，心肌细胞代谢失衡，进而刺激心脏发生重构使得心肌收缩力降低，最终导致心室扩张，室壁变薄，心脏收缩功能障碍，进而发展为心力衰竭。然而，病理性心肌肥厚的发病机制尚不完全明晰，需要更全面更科学的阐明其分子机制，为寻求积极有效的治疗方法奠定理论基础。
近年来病理性心肌肥厚的发病率逐年增加，长期的心肌肥厚最终会导致心力衰竭。目前治疗心力衰竭的方法包括药物治疗，植入装置及心脏移植手术等。但是由于心脏来源的限制，排斥反应，经济能力等限制因素，绝大部分患者的健康和生命受到极大危害。关于心肌肥厚的预防、诊断和治疗工作，目前仍然存在大量的缺陷。
非编码RNA在心脏疾病病理过程中的作用逐渐被揭示。长链非编码RNA(lncRNAs)由大于200个核苷酸组成，其通过招募转录因子来调节各种生理和病理过程，这些转录因子扮演着微小RNA海绵的角色，调节各种mRNA的翻译，沉默转录，并重新编码表观遗传过程。随着对lncRNAs研究的逐步深入，其在心血管疾病中发挥重要作用，是包括心肌肥大在内的各种心血管疾病的可靠诊断指标和治疗目标。因此发现不同病理生理情况下起关键调节作用的lncRNAs亚型变化，并阐明其功能，将会提供新的治疗病理性心肌肥厚的干预策略。尽管越来越多的lncRNAs作为人类疾病的生物标志物、决定因素和治疗靶点被发现，但调节病理性心肌肥厚的关键lncRNAs亚型仍没有确定，其在心肌肥大的治疗和诊断中的作用仍然不清楚，需要进一步的研究。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供LncRNA KCND1在制备防治病理性心肌肥厚药物中的应用。本发明首先证明在实验性心肌肥厚小鼠及心肌肥大细胞中LncRNA KCND1(LncKCND1)表达显著下调，其次通过使用小干扰RNA技术特异性抑制LncKCND1结果发现心肌细胞肥大，最后发现通过使用腺相关病毒9(AAV9)携带LncKCND1在横向主动脉缩窄术(TAC)诱导的小鼠心肌肥厚中过表达LncKCND1，可以有效减轻实验性心肌肥大，改善TAC小鼠的心功能。本发明为心肌肥厚的发生阐释了一个新的病理生理学机制，并提供了一种可用于病理性心肌肥厚相关疾病的预防和治疗的新药物。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个目的是提供LncRNA KCND1在作为病理性心肌肥厚诊断的标志物中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在本发明的一个实施方式中，LncRNA KCND1在病理性心肌肥厚中表达降低；抑制LncRNA KCND1的表达可诱导病理性心肌肥厚。
在本发明的一个实施方式中，离体过表达LncRNA KCND1可明显抑制病理性心肌肥厚；在体过表达LncRNA KCND1可明显抑制病理性心肌肥厚。
本发明的第二个目的是提供一种病理性心肌肥厚的诊断试剂盒，包括上述LncRNAKCND1，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第三个目的是提供LncRNA KCND1在筛选病理性心肌肥厚的诊断药物中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第四个目的是提供LncRNA KCND1在筛选病理性心肌肥厚的诊断试剂盒中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第五个目的是提供LncRNA KCND1在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第六个目的是提供LncRNA KCND1在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第七个目的是提供LncRNA KCND1激活剂在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第八个目的是提供LncRNA KCND1激活剂在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，所述LncRNAKCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在本发明的一个实施方式中，通过使用小干扰RNA技术特异性抑制LncRNA KCND1结果发现可导致心肌细胞肥大。
在本发明的一个实施方式中，通过使用腺相关病毒9(AAV9)携带LncRNA KCND1在横向主动脉缩窄术(TAC)诱导的小鼠心肌肥厚中过表达LncRNA KCND1，可以有效减轻实验性心肌病理性肥大，改善TAC小鼠的心功能。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明为病理性心肌肥厚的发生提供了一个新的病理生理学机制，并可用于心肌肥厚相关疾病的预防与治疗。
附图说明
图1为横向主动脉缩窄术(TAC)后诱导小鼠心肌肥厚过程中LncKCND1的一部分表达变化结果图；图1A为心肌肥厚模型建立成功后小鼠超声心动图；图1B为心功能超声检查评价心肌肥厚小鼠左心室射血分数结果图；图1C为心功能超声检查评价心肌肥厚小鼠左心室缩短率结果图；图1D为实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析心肌肥厚小鼠心脏组织中心肌肥大标志物：心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)以及β-肌球蛋白重链(β-MHC)的mRNA表达差异；图1E为Western blot检测心肌组织中β-MHC的表达水平；图1F为qRT-PCR评价心肌肥厚小鼠心脏组织中LncKCND1的表达变化；图1G为血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)诱导心肌细胞肥大模型的免疫荧光染色结果图。
图2血管紧张素II(Ang II)诱导小鼠心肌肥厚过程中LncKCND1的另一部分表达变化结果图；图2A为qRT-PCR评价心肌肥大细胞中ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达变化；图2B为Western blot检测肥大心肌细胞中β-MHC的蛋白表达水平；图2C为qRT-PCR评价心肌细胞中LncKCND1的表达差异结果图；图2D为qRT-PCR评价心肌细胞(CM)和心肌成纤维细胞(CF)中LncKCND1的表达差异。
图3为特异性敲减LncKCND1的表达对病理性心肌细胞肥大的影响图；图3A为qRT-PCR评价si-LncKCND1抑制效率；图3B为免疫荧光染色检测心肌细胞面积；图3C为心肌肥大细胞中ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达变化；图3D为Western blot检测si-LncKCND1对心肌细胞中β-MHC蛋白含量的影响。
图4为过表达LncKCND1对Ang II所诱导的心肌细胞肥大的抑制情况图；图4A为qRT-PCR评价LncKCND1过表达效率；图4B为免疫荧光染色检测心肌细胞面积；图4C为心肌细胞中ANP的mRNA表达变化；图4D为心肌细胞中BNP的mRNA表达变化；图4E为心肌细胞中β-MHC的mRNA表达变化；图4F为Western blot检测LncKCND1对心肌细胞中β-MHC蛋白含量的影响。
图5为TAC术后构建小鼠病理性心肌肥厚模型，并注射过表达LncKCND1腺相关病毒后对病理性心肌肥厚小鼠心脏影响的一部分结果图；图5A为qRT-PCR评价小鼠体内过表达LncKCND1的效率；图5B、C、D为超声心动图测定小鼠心功能，尾静脉注射携带LncKCND1载体的腺相关病毒9(AAV9)4周后，诱导小鼠体内过表达LncKCND1，然后行假手术(sham)或TAC手术4周，AAV9-Vector或AAV9-LncKCND1感染的小鼠左心室射血分数和左心室缩短率的评价。图5E、F为感染AAV9-Vector或AAV9-LncKCND1的假手术组和TAC模型组小鼠的心脏重量(HW)/体重(BW)和心脏重量/胫骨长度(TL)分析比较结果图。
图6为TAC术后构建小鼠病理性心肌肥厚模型，并注射过表达LncKCND1腺相关病毒后对病理性心肌肥厚小鼠心脏影响的另一部分结果图；图6A、B为心脏切片病理组织染色苏木精-伊红(H&E)、麦胚凝集素(WGA)和Masson染色分析评估Sham-Vector组、Sham-LncKCND1组、TAC-Vector组和TAC-LncKCND1组小鼠心脏肥厚水平。图6C、D、E为评估心脏组织中ANP、BNP和β-MHC的mRNA表达变化的结果图。
具体实施方式
本发明提供LncRNA KCND1在作为病理性心肌肥厚诊断的标志物中的应用，所述LncRNAKCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在本发明的一个实施方式中，LncRNA KCND1在病理性心肌肥厚中表达降低；抑制LncRNA KCND1的表达可诱导病理性心肌肥厚。
在本发明的一个实施方式中，离体过表达LncRNA KCND1可明显抑制病理性心肌肥厚；在体过表达LncRNA KCND1可明显抑制病理性心肌肥厚。
本发明提供一种病理性心肌肥厚的诊断试剂盒，包括上述LncRNA KCND1，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA KCND1在筛选病理性心肌肥厚的诊断药物中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA KCND1在筛选病理性心肌肥厚的诊断试剂盒中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA KCND1在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA KCND1在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，所述LncRNAKCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA KCND1激活剂在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供LncRNA KCND1激活剂在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在本发明的一个实施方式中，通过使用小干扰RNA技术特异性抑制LncRNA KCND1结果发现可导致心肌细胞肥大。
在本发明的一个实施方式中，通过使用腺相关病毒9(AAV9)携带LncRNA KCND1在横向主动脉缩窄术(TAC)诱导的小鼠心肌肥厚中过表达LncRNA KCND1，可以有效减轻实验性心肌病理性肥大，改善TAC小鼠的心功能。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
在下述实施例中，所述试剂若无特殊说明均为市售试剂，所述技术手段和方法若无特殊说明均为本领域常规技术手段和方法。
实施例1
本实施例提供LncRNA KCND1(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)作为病理性心肌肥厚诊断的标志物的实验方法。
(1)横向主动脉缩窄术(TAC)构建心肌肥厚模型
将20g-25g的雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham)和心肌肥厚模型组(TAC)。称取小鼠体重，采用腹腔注射的方式麻醉小鼠(麻醉药剂量：1％阿弗丁0.1mL/10g)。胸部脱毛后仰卧位固定于鼠台后用碘伏消毒皮肤。钝性分离气管周围组织暴露出气管后于胸部正中切口，将第一肋剪断，寻找主动脉弓；用7-0无创伤灭菌缝合线将主动脉弓与针头一起结扎，待缝合线系好后立即抽出针头。观察右侧颈总动脉搏动是否明显增强，初步判断模型构建是否成功。随后，逐层缝合胸腔及胸部皮肤，待小鼠意识恢复。手术结束后，将模型组及对照组小鼠在同等条件下饲养约4周，经超声检测主动脉弓血流速度及心功能验证心肌肥厚模型建立成功。
(2)原代乳鼠心肌细胞培养
取1-3天新生C57BL/6乳鼠，在超净台中用75％酒精浸泡乳鼠，对其体表进行消毒后采用断头开胸法取出心脏，放置在装有预冷PBS的小皿中清洗心脏中残留血液；用剪子剪去心耳等结缔组织及大动脉后放置提前高压灭菌过的50ml离心管内，用PBS吹洗2-3遍；按照1:1.5的比例，加入预冷的胰酶消化液(含EDTA)和PBS(25只鼠用量为2ml胰酶+3ml PBS)；4℃摇床摇8～12小时后加入同等体积含有血清的完全培养基，混匀吸出弃掉。随后加入37℃提前预热二型胶原酶消化液7ml，放置37℃恒温摇床，10分钟后吸上清于另外离心管中，上述步骤重复3-4次直到心脏组织被完全消化；将装有上清的离心管1000rpm离心5分钟，保留沉淀并加入适量完全培养基吹匀后将细胞悬浮液铺在细胞培养瓶中，放入含有5％的CO2恒温培养箱内培养。心脏成纤维贴壁速度较心肌细胞快，因此可采用差速贴壁原理将二者分离，在培养箱内孵育90分钟后心肌成纤维细胞贴于细胞培养瓶底部而心肌细胞仍然悬浮于培养液中。移出细胞悬液至新的培养瓶中，添加完全培养基至所需体积继续培养48小时，观察心肌细胞状态，贴壁状态良好且搏动明显有节律后进行后续实验。
(3)小动物心动超声检测
取经过手术处理的C57BL/6小鼠，称重后麻醉，用脱毛膏脱去胸部的毛发，胸前涂抹耦合剂后，将超声探头放置于动物心脏位置上。采用高分辨率成像系统的传感器得到小动物二维心动超声图，调整探头方向获得相应M型检测曲线，进行测量。测量在心动超声仪上根据超声图像计算射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室缩短分数(left ventricular fractional shortening,LVFS)。
(4)实时定量PCR(qRT-PCR)
1)提取细胞或组织RNA。按照Trizol试剂盒说明书提取细胞或组织RNA，将原来细胞培养孔板中的培养基吸出后，加入预冷的PBS清洗3遍后，加入1mL RNA提取试剂Trizol，用无酶枪头底部刮取细胞后将其收集放入EP管中(无酶，1.5mL)；对于心脏组织，将组织块从液氮中取出后，置于EP管中，先加入0.5mL Trizol进行研磨(防止液体溅出)后再补齐至1ml冰上静置。接下来的步骤细胞和组织完全一致：在EP管中加入200μL氯仿后，剧烈震荡30s，室温静置15min后，将EP管置于4℃离心机中，13500rpm/min离心15min。离心后，取出EP管，可见管中液体分为三相：最上层的水相(RNA相)，中间乳白色的裙带样的蛋白相，以及最下层DNA相。小心吸取最上层上清液约400μL并转移至新的1.5mL EP管中。注意在吸取最上层上清液时不要吸到蛋白层，以避免蛋白或DNA污染。在EP管中加入等体积(500μL)异丙醇，轻柔地颠倒EP管15-20次混匀沉淀，4℃静置30min。将EP管置于4℃离心机中，13500rpm/min离心10min。从离心机中取出后倒掉上层液体，加入1mL DEPC水配制的75％乙醇轻轻晃动洗涤RNA。将EP管置于4℃离心机中，10600rpm/min离心5min。移除75％乙醇，注意勿将沉淀弃去，将EP管倒置于干净的虑纸上，室温风干。用10-20μL DEPC水溶解RNA，测量RNA浓度及纯度。
2)cDNA的制备。取1000ng的总RNA按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为相应cDNA，内参采用GAPDH进行相对标准化。将样本置于PCR仪中按照如下反应程序进行特异性的PCR扩增。反应温度程序为42℃15min、85℃5s、4℃5min、-20℃hold。扩增得到的cDNA冻存于-20℃冰箱中待用。
3)qRT-PCR。本实验采用SYBR GreenⅠ染料法进行荧光定量PCR实验，根据试剂盒说明书具体反应体系如下：95℃10min、95℃5sec、60℃30sec、72℃30sec、42℃15min，40个循环，溶解曲线：95℃30sec、60℃1min、95℃30sec、60℃1min。应用循环值(Ct值)法计算目标基因的相对量2-ΔΔCT。ΔΔCt＝(Ct目标基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目标基因-Ct管家基因)对照组。实验中用到的具体引物序列如下：LncKCND1上游引物为5’-CAGGCTCTTTGTGTCAGGA-3’(SEQ ID NO.1)，LncKCND1下游引物为5’-GAACTCATGGCACGTTGTC-3’(SEQ ID NO.2)。ANP上游引物为5’-ACCTGCTAGACCACCTGGAG-3’(SEQ ID NO.3)，ANP下游引物为5’-CCTTGGCTGTTATCTTCGGTACCGG-3’(SEQ ID NO.4)。BNP上游引物为5’-GAGGTCACTCCTATCCTCTGG-3’(SEQ ID NO.5)，BNP下游引物为5’-GCCATTTCCTCCGACTTTTCTC-3’(SEQ ID NO.6)。β-MHC上游引物为5’-CCGAGTCCCAGGTCAACAA-3’(SEQ ID NO.7)，β-MHC下游引物为5’-CTTCACGGGCACCCTTGGA-3’(SEQ ID NO.8)。GAPDH上游引物为5’-TCTACATGTTCCAGTATGACTC-3’(SEQ ID NO.9)，GAPDH下游引物为5’-ACTCCACGACATACTCAGCACC-3’(SEQ ID NO.10)。
(5)蛋白免疫印迹实验Western blot
细胞或组织蛋白提取，将处理好的细胞用PBS清洗三次后置于冰上，加入配置好的细胞裂解液(RIPA：protease inhibitor＝100：1)，以每孔(6孔板)30μL刮取细胞并将蛋白裂解液转移至1.5mL EP管中待用。组织蛋白的提取：在组织块中以每10mg/100μL体积的量加入组织裂解液(RIPA：10％SDS：protease inhibitor＝100：50：1)并研磨直至组织块消失。蛋白样本进行超声破碎，每次超声10s，共超声3次，每次间隔7min。充分裂解后4℃离心机中13500rpm/min离心20min，吸取上清液至新的1.5mL EP管中，冻存于-80℃冰箱中待用。配制8％的SDS-PAGE分离胶和5％的积层胶，每孔加入60ug蛋白样品，置电泳缓冲液中，70V电泳约30min，待样品进入分离胶后，110V电泳至所需时间。将蛋白转印至NC膜上，用5％脱脂奶粉于室温封闭2h，加相应的一抗。4℃过夜孵育，次日TBST洗膜3次，每次5min，再加相应二抗室温孵育50min，再用TBST洗膜3次，每次5min，将NC膜正面朝下倒置于Odessey红外扫描成像仪上，结果用Image J软件分析蛋白条带的相对灰度值。
(6)免疫荧光染色法观察心肌细胞面积。
心肌细胞接种于铺有盖玻片的24孔板中进行培养48h贴壁后，进行转染和加药处理后收获细胞进行荧光染色处理。每孔中加入500μL 4％多聚甲醛，室温固定30min。之后用PBS洗涤3次，使用含1％BSA，0.4％Triton x-100的PBS缓冲液在室温下穿透1h。1h后采用PBS洗涤3次，每孔中加入1mL山羊血清于37℃培养箱中封闭30min。而后再用PBS洗涤3次，吸干净PBS后向细胞中加入荧光一抗(α-actinin，1:200)4℃孵育过夜。次日，PBS洗3次后，加入二抗(Dylight594，1：200)，在37℃培养箱中避光孵育1h，而后PBS洗涤3次，向细胞中加入DAPI(1:200)室温孵育5min，最后PBS洗涤3次，将未结合染料彻底清洗去除。荧光显微镜下随机挑选视野拍照并保存，采用Image-Pro Plus 6.0软件勾画出心肌细胞表面积，同时使用任意单位读取心肌细胞相对面积，进而作为评估心肌细胞肥大程度的依据。
(7)HE染色
准备切好的石蜡片子，61℃烘箱30min，1)脱蜡：纯二甲苯I，10min；纯二甲苯II，10min；纯二甲苯III，10min；纯二甲苯IV，10min；2)水化：纯乙醇I，10min；纯乙醇II，10min；95％乙醇I，10min；95％乙醇II，10min；85％乙醇，10min；75％乙醇，10min；50％乙醇，10min；自来水洗一次，2min；3)染色：苏木素，滴到组织上覆盖，2-3min；自来水冲洗，3-4次，每次上下提拉3次，1％盐酸乙醇溶液，2-3s；自来水洗15min；伊红染色剂，滴到组织上覆盖30s；水盆里晃一下，再从50％乙醇逆行回到纯二甲苯II；最后中性树脂封片。
(8)Masson染色
根据公司Masson染色试剂盒说明书操作。染色前先用蒸馏水润湿玻片30s～60s后进行下述操作：R1核染液染色60s左右，倒掉，冲洗液冲洗30s左右。R2染浆液染色30s～60s左右，倒掉，冲洗液冲洗30s左右。R3黄色分色液分色6min～8min左右弃去分色液。直接用R4蓝色复染液染色5min左右，倒掉，用无水乙醇冲洗干净。吹干后，直接用无毒环保固封剂封片，镜检。染色结果：胶原纤维，粘液，软骨呈蓝色；胞浆，肌肉，纤维素，神经胶质呈红色；细胞核蓝紫色。
(9)WGA染色
准备切好的石蜡片子，61℃烘箱30min(从放上开始计时)，脱蜡:纯二甲苯I，15min；纯二甲苯II，10min；100％乙醇，10min；96％乙醇，3min；70％乙醇，3min；ddH2O，3min；用PBS清洗玻片2次；孵育用PBS配制的WGA-FITC抗体，孵育时间为2h；孵育结束后用PBS清洗2遍以去除没有结合的WGA-FITC抗体；孵育DAPI；用防淬灭封片剂封片；荧光显微镜拍照。
(10)统计分析
实验所有数据采用Graphpad Prism 5.0软件分析，所有数据均采用平均值±标准误(Mean±SEM)的形式，并以单因素方差分析检验差异的显著性，两组数据之间的显著性差异采用Bonferroni法比较，双尾概率以P<0.05作为具有显著差异标准。
实施例2
本实施例提供LncRNA KCND1(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)作为病理性心肌肥厚诊断的标志物的实验结果分析。
(1)构建小鼠心肌肥厚实验模型，检测在心肌肥厚时LncKCND1表达降低
本实验采用实施例1中步骤，利用横向主动脉缩窄术(TAC)诱导小鼠心肌肥厚实验模型。4周后经超声检测主动脉弓血流速度及心功能验证小鼠心肌肥厚模型建立成功，结果发现，TAC组小鼠心功能明显下降(图1A)，左心室射血分数(LVEF)和缩短分数(LVFS)降低(图1B-C)。采用实施例1中步骤常规提取小鼠心脏组织RNA和蛋白，qRT-PCR以及Westernblot结果显示TAC小鼠的心房利钠肽(ANP)、脑利纳肽(BNP)和β-肌球蛋白重链(β-MHC)的RNA和蛋白水平均上调(图1D-E)。并且发现在TAC小鼠中LncKCND1表达显著降低(图1F)。
采用实施例1中步骤体外分离培养原代乳鼠心肌细胞，采用浓度为1μmol/L的血管紧张素II(Ang II)处理48小时，构建心肌细胞肥大模型。心肌细胞孵育荧光一抗α-actinin后通过免疫荧光检测心肌细胞面积，DAPI用于细胞核染色，结果显示与对照组相比Ang II组细胞面积明显增加(图1G)。提取心肌细胞总RNA，利用实时荧光定量PCR技术检测发现，Ang II组细胞心肌肥厚标志物ANP、BNP以及β-MHC的RNA水平也较对照组细胞明显升高(图2A)。同时，Western blot结果显示在Ang II组细胞中β-MHC蛋白表达水平也较对照组细胞明显升高(图2B)。与体内实验结果一致，在Ang II诱导的心肌细胞肥大模型中LncKCND1表达也显著降低(图2C)。并且LncKCND1在心肌细胞中的表达水平高于心肌成纤维细胞(CFs)(图2D)，表明LncKCND1可能在心肌肥厚的调控中起重要作用。
(2)抑制LncKCND1的表达可诱导心肌细胞肥大
利用小干扰RNA(siRNA)敲减原代乳鼠心肌细胞内源性LncKCND1的表达并评估这三种siRNAs的敲减效率，首先利用Lipofectamine 2000转染试剂将siRNA转染到心肌细胞中，充分孵育48小时后提取总RNA，利用实施例1中步骤进行qRT-PCR技术检测LncKCND1的含量，结果显示三条siRNAs均能抑制LncKCND1的表达，尤其是siRNA-3敲减效率最高，并在随后的实验中使用了最有效的siRNA-3(图3A)。α-actinin的免疫荧光染色显示敲减LncKCND1显著增加心肌细胞的面积(图3B)，并且肥厚标志物ANP、BNP以及β-MHC的RNA水平也较对照组细胞明显升高(图3C)。同时，Western blot结果显示敲减LncKCND1组心肌细胞中β-MHC蛋白表达明显升高(图3D)。
(3)外源性表达LncKCND1可显著抑制心肌肥厚
构建LncKCND1过表达质粒，利用Lipofectamine 2000将LncKCND1过表达质粒转染到心肌细胞中，充分孵育48小时后提取总RNA，利用qRT-PCR技术检测LncKCND1的含量验证其过表达效率(图4A)。在对Ang II诱导乳鼠原代心肌细胞肥大模型后转染LncKCND1过表达质粒，α-actinin的免疫荧光染色显示过表达LncKCND1显著减小心肌细胞面积(图4B)，并且肥厚标志物ANP、BNP以及β-MHC的RNA水平也较Ang II处理组细胞显著降低(图4C-E)。同时，Western blot结果显示LncKCND1组心肌细胞中β-MHC蛋白表达明显降低(图4F)。
(4)LncKCND1有效减轻小鼠病理性心肌肥厚
为了进一步探究LncKCND1对病理性心肌肥大的预防和治疗作用，在TAC术前连续4周经小鼠尾静脉注射携带LncKCND1的腺相关病毒9(AAV9)病毒或空载体作为对照。结果显示LncKCND1组的表达水平明显高于空载体组(图5A)。经超声检测主动脉弓血流速度及心功能结果发现，与TAC组相比，TAC手术4周后过表达LncKCND1明显改善了小鼠心功能(图5B)，显著升高了左心室射血分数和缩短分数(图5C-D)，并且，TAC手术4周后明显升高心脏重量(HW)/体重(BW)和胫骨长度(TL)，而LncKCND1过表达部分逆转了这些效应(图5E-F)。应用H&E和WGA染色对心脏进行组织学形态分析，结果显示，在TAC手术后小鼠心脏和心肌细胞明显增大说明心肌肥厚模型成功，而LncKCND1过表达后显著抑制TAC组小鼠心脏和心肌细胞增大(图6A)。Masson染色结果分析显示LncKCND1的过度表达也降低了心肌纤维化水平(图6B)。同样，与空载体组相比，过表达LncKCND1的小鼠BNP、ANP和β-MHC的mRNA水平也下降(图6C-E)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.LncRNA KCND1在作为病理性心肌肥厚诊断的标志物中的应用，其特征在于，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的LncRNA KCND1在作为病理性心肌肥厚诊断的标志物中的应用，其特征在于，LncRNA KCND1在病理性心肌肥厚中表达降低；抑制LncRNA KCND1的表达可诱导病理性心肌肥厚。
3.根据权利要求1所述的LncRNA KCND1在作为病理性心肌肥厚诊断的标志物中的应用，其特征在于，离体过表达LncRNA KCND1可明显抑制病理性心肌肥厚；在体过表达LncRNAKCND1可明显抑制病理性心肌肥厚。
4.一种病理性心肌肥厚的诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的LncRNAKCND1，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
5.LncRNA KCND1在筛选病理性心肌肥厚的诊断药物中的应用，其特征在于，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
6.LncRNA KCND1在筛选病理性心肌肥厚的诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
7.LncRNA KCND1在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，其特征在于，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
8.LncRNA KCND1在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，其特征在于，所述LncRNAKCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
9.LncRNA KCND1激活剂在制备预防或治疗病理性心肌肥厚药物中的应用，其特征在于，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
10.LncRNA KCND1激活剂在制备病理性心肌肥厚试剂盒中的应用，其特征在于，所述LncRNA KCND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
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