CN116041370A - 一种星形孢菌素类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
发明公开了一种星形孢菌素类化合物及其制备方法和用途，特点是该化合物的结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括将保藏号为CCTCC No:M2020953的放线菌通过发酵培养来获取星形孢菌素化合物的发酵物，然后将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取得粗浸膏，在此基础上将该粗浸膏经正相硅胶柱层析，反向中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该化合物在制备耐药乳腺癌细胞株抑制剂方面的用途，优点是该星形孢菌素类具有抗耐药乳腺癌细胞株的活性，可以用于开发抗耐药乳腺癌方面的药物。
Description
技术领域
本发明涉及星形孢菌素类化合物，尤其是涉及一种从海洋放线菌中提取的星形孢菌素类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
星形孢菌素类抗生素，是一组由吲哚咔唑为核心的六元链胺类化合物组成的一类天然产物。它最初是由日本大村智和他的同事于1977从土壤链霉菌中分离出来的，与其高度的结构特异性一致，星状孢子素具有广谱的生物活性，包括抗肿瘤、抗病毒、杀虫、抗菌和抗癌。星形孢菌素类化合物因其显著的活性和多样的结构，引起了化学或生物合成研究人员的关注。
本发明人在对海洋放线菌
Steptomyces sp. 4-7在A培养基发酵下的乙酸乙酯提取物的化学调查中，发现了一个星形孢菌素类型新天然产物。目前尚未见该化合物的化学结构及抗耐药乳腺癌细胞株活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对耐药乳腺癌细胞株具有抑制作用的具有抑制作用的新的星形孢菌素类化合物及其制备方法和用途。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种星形孢菌素类化合物，该星形孢菌素类化合物的结构式如（I）所示：
（I）。
2、一种星形孢菌素类化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2020953的海洋放线菌（
Steptomyces sp. 4-7）在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28 ℃培养箱中培养活化7 天后，挑取单菌落接种于高氏1号液体培养基中，于温度28 ℃、180 rpm/min的转速下置于摇床上培养增菌，培养3 天后收集种子液，然后将种子液按体积比10%的接种量接种到A培养基中，于温度28 ℃培养11天，获得发酵物；
（2）浸膏提取
在步骤（1）得到的发酵物中加入等量乙酸乙酯，反复萃取3次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后获得粗浸膏；
（3）化合物的分离制备
将步骤（2）得到的粗浸膏用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为（100:1）~（0:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到11个组分；将收集的第10个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为30-100%的乙腈-水为洗脱剂，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到10个组分；将得到的第7个组分进行半制备反相高效液相色谱分离纯化，采用乙腈与水按体积比43:57的比例混合的溶液为流动相，获得化合物，其结构如（I）所示
（I）。
进一步，步骤（1）中所述的A培养基的配制方法如下：称取 20 g 可溶性淀粉，6 g蛋白胨，2 g 酵母提取物，30 g 海盐，100 mg KBr，40 mg Fe2(SO4)3·4H2O和1 g CaCO3 加入 1000 mL 蒸馏水中，121 ℃高压灭菌 20 min。
进一步，步骤（3）所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和0:1。
进一步，步骤（3）中所述的反相中压柱层析梯度洗脱中乙腈体积比从30~100%，洗脱时间150 min。
进一步，步骤（3）中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为2.0 mL/min。
3、上述星形孢菌素化合物在制备耐药乳腺癌细胞株抑制剂方面的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种星形孢菌素类化合物及其制备方法和用途，通过微生物发酵培养来获取星形孢菌素类的发酵物，然后通过将发酵物用乙酸乙酯浸泡提取，得粗浸膏，然后将该粗浸膏经中压正向硅胶柱层析，中压反向柱层析，及反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该化合物具有显著的抗耐药乳腺癌细胞株MCF/ADR活性，可用于开发具有抗耐药乳腺癌活性的药物。生物活性评价表明，化合物1对耐药耐药乳腺癌细胞株具有有效的抑制作用，IC50值为4.47
μM。
上述海洋放线菌（
Steptomyces sp
. 4-7），保藏编号为CCTCC NO：M2020953，于2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为本发明化合物的核磁共振氢谱；
图2为本发明化合物的核磁共振碳谱
图3为本发明化合物的核磁共振DEPT-135谱；
图4为本发明化合物的核磁共振COSY谱；
图5为本发明化合物的核磁共振HSQC谱；
图6为本发明化合物的核磁共振HMBC谱；
图7为本发明化合物的核磁共振NOESY谱；
图8为本发明化合物的质谱；
图9为本发明化合物的CD谱；
图10为已知化合物星形孢菌素M1的CD谱。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种星形孢菌素类化合物的结构式如（I）所示：
（I）。
实施例2
一种星形孢菌素类化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2020953的海洋放线菌（
Steptomyces sp
. 4-7）在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28 ℃培养箱中培养活化7 天后，挑取单菌落接种于高氏1号液体培养基中，于温度28 ℃、180 rpm/min的转速下置于摇床上培养增菌，培养3 天后收集种子液，然后将种子液按体积比10%的接种量接种到A培养基中，于温度28 ℃培养11天，获得发酵物；其中A培养基的配制方法如下：称取 20 g 可溶性淀粉，6 g蛋白胨，2 g 酵母提取物，30 g 海盐，100 mg KBr，40 mg Fe2(SO4)3·4H2O和1 g CaCO3 加入 1000 mL 蒸馏水中，121 ℃高压灭菌 20 min；
（2）浸膏提取
在步骤（1）得到的发酵物中加入等量乙酸乙酯，反复萃取3次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后获得粗浸膏；
（3）化合物的分离制备
将步骤（2）得到的粗浸膏用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为（100:1）~（0:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到11个组分；将收集的第10个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为30-100%的乙腈-水为洗脱剂，洗脱时间150 min，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到10个组分；将得到的第7个组分进行半制备反相高效液相色谱分离纯化，采用乙腈与水按体积比43:57的比例混合的溶液为流动相，流速为 2.0 mL/min，获得化合物，其结构如（I）所示，上述石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和0:1，
（I）。
实施例3
化合物的结构鉴定及核磁信号归属
该化合物为黄色粉末，正离子模式下的高分辨质谱(HR-ESI-MS)给出其准分子离子峰m/z 525.2139 [M + H]+，结合13C NMR谱确定其分子式为C30H29N4O5。该化合物的1H和13CNMR数据见图1-7和表1所示。
表1. 化合物1的1D NMR 数据 (DMSO-
d 6)
注1：s—单重峰、d—二重峰、t—三重峰、q—四重峰、 m—多重峰；
注2：1H 在600 MHz NMR获得；13C 在150 MHz NMR获得。
图3-7为本发明化合物的主要二维相关，由图3可知该化合物含有30个碳，其中季碳13个，甲基碳4个，亚甲基碳2个，次甲基碳11个，由图4可知化合物H-8/H-9/H-10/H-11,H-1/H-2/H-3/H-4存在COSY相关，由图5可知化合物碳氢直接相关，由图6可知化合物碳氢远程相关，可将碳连接在一起；图7为本发明化合物的NOE相关，H3-2′和H-4′之间存在NOESY相关，这表明它们位于糖基的同一面上。耦合常数(3
J H-3′，H-4′=4.27 Hz)表明H-3′和H-4′位于同一取向。图8为本发明化合物质谱，说明本发明化合物的分子量是525.2139，分子式为C30H29N4O5图9和10分别为本发明化合物的CD谱和已知化合物星形孢菌素M1的CD谱；由此可知化合物1的CD谱与星形孢菌素M1的CD谱几乎相同。表明，化合物1的绝对构型和星形孢菌素M1一致，归属为2′S，3′R，4′R，6′R。
实施例4
星形孢菌素类化合物的活性
实施例1所述星形孢菌素类化合物活性及应用
（1） 实验样品
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物1纯品，精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液供测试抗肿瘤活性。该实验使用的肿瘤细胞为耐药乳腺癌细胞株；
（2） 实验方法
将耐药乳腺癌细胞接种于96孔板中，贴壁过夜，用指定浓度的化合物1处理72h。，用细胞计数试剂盒测定细胞存活率。随后在微型平板阅读器上，在450 nm波长下测量吸光度；
（3）实验结果
抗肿瘤测试中，化合物1在4.47
μM时对耐药乳腺癌细胞株具有显著的细胞毒性。相比于在4‘位的酰亚胺基团上没有甲基，它在耐药及其亲本细胞中表现出更强的抗癌活性，化合物1的IC50 = 4.47 μM。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种星形孢菌素类化合物，其特征在于该星形孢菌素类化合物的结构式如（I）所示：
（I）。
2.一种权利要求1所述的星形孢菌素类化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）发酵生产
将保藏号为CCTCC NO：M2020953的海洋放线菌（Steptomycessp. 4-7）在高氏1号固体培养基的平板上划线，于28 ℃培养箱中培养活化7 天后，挑取单菌落接种于高氏1号液体培养基中，于温度28 ℃、180 rpm/min的转速下置于摇床上培养增菌，培养3 天后收集种子液，然后将种子液按体积比10%的接种量接种到A培养基中，于温度28 ℃培养11天，获得发酵物；
（2）浸膏提取
在步骤（1）得到的发酵物中加入等量乙酸乙酯，反复萃取3次，随后对乙酸乙酯浸提液减压蒸干后获得粗浸膏；
（3）化合物的分离制备
将步骤（2）得到的粗浸膏用体积比为1：1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，进行正相中压柱层析，采用体积比为（100:1）~（0:1）的石油醚-乙酸乙酯溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱流分，按流分极性由小到大排列，合并得到11个组分；将收集的第10个组分进行反相中压柱层析梯度洗脱，采用体积比为30-100%的乙腈-水为洗脱剂，收集洗脱流分，按流分极性由大到小排列，合并得到10个组分；将得到的第7个组分进行半制备反相高效液相色谱分离纯化，采用乙腈与水按体积比43:57的比例混合的溶液为流动相，获得化合物，其结构如（I）所示
（I）。
3.根据权利要求2所述的一种星形孢菌素类化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的A培养基的配制方法如下：称取 20 g 可溶性淀粉，6 g蛋白胨，2 g 酵母提取物，30g 海盐，100 mg KBr，40 mg Fe2(SO4)3·4H2O和1 g CaCO3 加入 1000 mL 蒸馏水中，121 ℃高压灭菌 20 min。
4.根据权利要求2所述的一种星形孢菌素类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和0:1。
5.根据权利要求2所述的一种星形孢菌素类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的反相中压柱层析梯度洗脱中乙腈体积比从30~100%，洗脱时间150 min。
6.根据权利要求2所述的一种星形孢菌素类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的半制备反相高效液相色谱的化合物分离制备的流速为 2.0 mL/min。
7.一种权利要求1所述的星形孢菌素化合物在制备耐药乳腺癌细胞株抑制剂方面的用途。
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| WO2020261293A1 (en) * | 2019-06-24 | 2020-12-30 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Process for preparation of midostaurin |
| CN114437109A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-05-06 | 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室(贵州医科大学天然产物化学重点实验室) | 一种十字孢碱卤代衍生物及其制备方法与应用 |
-
2023
- 2023-01-06 CN CN202310019142.1A patent/CN116041370A/zh active Pending
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