CN115976053A

CN115976053A - 一种干旱胁迫相关的鸭茅基因及其应用

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Publication number: CN115976053A
Application number: CN202211537042.XA
Authority: CN
Inventors: 张新全; 王苗利; 杨翔宇; 冯光燕; 刘�文; 黄琳凯; 聂刚; 余国辉; 李丹丹; 汪霞; 韩佳婷; 杨鹏
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2042-12-02
Also published as: CN115976053B

Abstract

本发明公开了一种干旱胁迫相关的鸭茅基因及其应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。经研究，在给与鸭茅干旱胁迫后，该基因的表达量降低。在酵母和拟南芥中过表达该基因，发现酵母和拟南芥对干旱胁迫的耐受性均降低，表明该基因的表达量与干旱胁迫负相关，这种负相关的特性可用于制备高干旱胁迫抗性的鸭茅，能够促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用，对传统牧草的改良有显著的贡献。

Description

一种干旱胁迫相关的鸭茅基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种干旱胁迫相关的鸭茅基因及其应用。

背景技术

鸭茅属于禾本科(Poaceae)早熟禾亚科(Festucoideae)鸭茅属(Dactylis)，是世界范围内广泛栽培的多年生冷季型丛生牧草。鸭茅具有叶多高产、耐阴、适应性强、适口性好、营养价值高等优点，可用于青饲、调制干草或青贮，是世界四大分布广泛的禾本科牧草之一，全球每年约生产14000t鸭茅种子，占世界温带牧草种子的3.3％。目前，全球有约40％的土地遭受干旱胁迫。鸭茅生长过程中表现出不耐旱的生物学特征，且关于鸭茅对干旱胁迫耐受性相关的研究较少，而传统牧草改良技术见效慢、周期长，严重限制了其在生产上的运用，因此迫切需要提供一种有效的方法，可以制备筛选出干旱胁迫抗性高的鸭茅株系，以达到缩短育种时间，提高育种效率的目的，从而进一步促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种与干旱胁迫相关的鸭茅基因，该基因的表达量与干旱胁迫负相关，通过这种负相关的特性可用于制备高干旱胁迫抗性的鸭茅，能够解决鸭茅对干旱耐受性差的问题，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用，对传统牧草的改良有显著的贡献，具备显著的应用价值。

为了达到上述目的，本发明提供了一种干旱胁迫相关的鸭茅基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种上述干旱胁迫相关的鸭茅基因所编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种包含上述鸭茅基因核苷酸序列的重组载体。

本发明还提供了一种含有上述重组载体的重组工程菌。

本发明提供的干旱胁迫相关的鸭茅基因可被用于酵母干旱胁迫耐受性中，尤其可用于提高酵母的干旱胁迫耐受性，制备干旱胁迫耐受性强的酵母。

本发明提供的干旱胁迫相关的鸭茅基因可被用于拟南芥干旱胁迫抗性中，尤其可用于提高拟南芥的干旱胁迫耐受性，制备干旱胁迫耐受性强的拟南芥。

本发明提供的干旱胁迫相关的鸭茅基因可被用于鸭茅干旱胁迫抗性中，尤其可用于制备干旱胁迫耐受性增强的鸭茅株系。

本发明的干旱胁迫相关的鸭茅基因及其应用，解决了鸭茅对干旱耐受性差的问题，并具有以下优点：

本发明提供的基因在抗旱性上表现出负调控，提示可利用基因敲除技术降低该基因在鸭茅中的表达量以提高鸭茅的抗旱能力。对于传统牧草改良技术见效慢、周期长的缺点，该方法可缩短育种时间，提高育种效率，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用，具备显著的应用价值。

附图说明

图1为本发明中基因DG7C04019.1的扩增电泳图。

图2为本发明中基因DG7C04019.1在干旱胁迫下的表达结果。

图3为本发明中过表达DG7C04019.1的酵母对干旱胁迫耐受性结果。

图4为本发明中过表达DG7C04019.1的拟南芥鉴定结果。

图5为本发明中过表达DG7C04019.1的拟南芥在干旱胁迫下萌发情况。

图6为本发明中过表达DG7C04019.1的拟南芥的萌发率统计结果。

图7为本发明中过表达DG7C04019.1的拟南芥在干旱胁迫下根长变化。

图8为本发明中过表达DG7C04019.1的拟南芥在干旱胁迫下根长的统计定量结果。

图9为本发明过表达DG7C04019.1和野生型拟南芥的失水实验对比和相关指标检测结果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

说明：本实验中为具体说明的试剂耗材均为常规试剂耗材，未具体说明的方法均为本领域常规操作方法。

实施例1

1.基因克隆

1.1基因提取

本发明选择的材料为鸭茅品种“2006-1”，种植于四川农业大学温江校区。取其幼嫩叶片为材料提取总RNA。选用天根(北京)生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒进行RNA提取，操作参考内附说明书进行。RNA提取后利用1％琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测，使用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。反转录选用TaKaRa公司的PrimeScript II1st Strand cDNA Synthesis Kit，操作流程参考内附说明书。

1.2目的片段的扩增

以1.1中经反转所得的基因组cDNA为模板，通过如下所示的引物对进行扩增，扩增选用vazyme公司的2×Phanta Max MasterMix(Dye Plus)试剂盒进行，操作流程参考内附说明书：

所用的引物如下所示(5’→3’)：

F(SEQ ID NO.3)：ATGGCGCCGCCACAGGAA；

R(SEQ ID NO.4)：CTATTTCTGATTCTTGCTCTTCTCGG。

扩增体系为50μL，包含25μL的2×PhantaMax MasterMix(Dye Plus)、2μL的上、下游引物(10μM)、4μL的cDNA模板、17μL的ddH₂O。

扩增程序为如下所示：

95℃预变性3min；

95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min(35个循环)；

72℃延伸5min。

1.3目的基因的回收及测序

对上述扩增所得的产物进行电泳并回收，每个反应管中加入适量10×上样buffer，在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳。在0.5×TBE缓冲液中以5～10V/cm进行电泳，结束电泳，在凝胶成像系统中拍照，结果如图1所示，其中，泳道M为DNAladder。泳道1～5分别为五个PCR重复的电泳样，条带结果显示该基因的大小在750bp左右。

采用GK2042(捷瑞生物)琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对图1中的目的条带进行回收，具体步骤如下：

1)将DNA目标条带小心割下,放入1.5mLEP管中；

2)向管中加入400μL的banding B，放入70℃水浴中，直到凝胶完全溶解；

3)向管中加入100μL的异丙醇，室温放1分钟，5000rpm离心1分钟过柱；

4)重复步骤3一次；

5)加500μLwashbuffer 12000rmp洗两次，10000rmp离心1分钟。

6)向柱中加入40μL双蒸水，37℃放置2分钟，12000rmp离心1min收集。

将回收所得的基因送测序，通过测序可知，该基因的核苷酸序列如下所示，其氨基酸序列如下所示，将该基因命名为DG7C04019.1。

核苷酸序列记为SEQ ID NO.1(5’→3’)：

ATGGCGCCGCCACAGGAACGGGACTACATCGGGCTGTCGCCGGCGGCGGCGGCAGCCACGGAGTTGCGCTTGGGGCTACCTGGCACGGAGGCTGCTGAGGTGGAGGGCGGTGGAGCGGCGGCGCCGTTGACGCTGGAGCTTCTTTCAAAGGGCGGAGCCAAACGCGGGTTTGCCGGCGCAGCGGGAGGCAAGGCGGTGGCGGAGGAGCAGGAGGACGACGAGAAGAAGAAGGCGCAAGCGCCGGCCGCAAAGGCACAGGTGGTAGGATGGCCACCAATCCGCAGTTACAGGAAGAACACCATGGCAACGAACCTATCTGCTCCGAGAAGCAAAGACGAGGTCGAGGCAAAGCAGGCGCCAGTGCAAGGGTGCCTTTATGTCAAGGTTAGTATGGATGGTGCGCCTTACCTCAGGAAGGTGGATCTTAAGATGTACAAGAACTACAAGGACCTCTCTCTGGAGCTGGAGAAGAAGTTCAGCTGCTTTACTGTTGGTCATGGTGAATCAAATGGTAAATCAGGAAGAGATGGCTTATCTGATTGCCGACTGATGGATCTTAAAAGCGGAGCTGAACTTGTGCTCACTTATGAGGACAAGGATGGCGATTGGATGCTTGTTGGTGATGTTCCATGGCGAATGTTCACAGACAGCTGTAGGAGGATGAGGATCATGAAGGGGTCAGATGCAGTGGGCCTTGCTCCGAGAGCCACCGAGAAGAGCAAGAATCAGAAATAG。

氨基酸序列记为SEQ ID NO.2：

MAPPQERDYIGLSPAAAAATELRLGLPGTEAAEVEGGGAAAPLTLELLSKGGAKRGFAGAAGGKAVAEEQEDDEKKKAQAPAAKAQVVGWPPIRSYRKNTMATNLSAPRSKDEVEAKQAPVQGCLYVKVSMDGAPYLRKVDLKMYKNYKDLSLELEKKFSCFTVGHGESNGKSGRDGLSDCRLMDLKSGAELVLTYEDKDGDWMLVGDVPWRMFTDSCRRMRIMKGSDAVGLAPRATEKSKNQK。

2.功能分析

2.1鸭茅胁迫处理

为验证基因DG7C04019.1在干旱条件下的表达趋势，选取鸭茅品种“2006-1”在16h(23℃)白天/8h(18℃)黑暗进行砂培。鸭茅幼苗长至3～4叶期时进行20％聚乙二醇处理(PEG6000)，分别在0h、2h、4h和8h取叶片样品，并迅速放入液氮中冷冻，每个样品取3个重复。

对处理后的样品进行RNA提取和反转录，RNA和反转录的实验方法如上。荧光定量采用美国Bio-RAD公司的Bio-RAD CFX Connet进行，定量试剂盒选择普迈精医科技(北京)的MonAmpTMGreen qPCR Mix(None ROX)。荧光定量引物为如下所示(5’→3’)：

DG7C04019.1-F(SEQ ID NO.5)：GCTCCGAGAAGCAAAGACGA；

DG7C04019.1-R(SEQ ID NO.6)：GCTCCAGAGAGAGGTCCTTG。

以β-Actin为内参基因，内参引物如下所示，以2^-ΔΔCT法计算基因的表达水平。定量结果如图2所示，结果表明，DG7C04019.1在20％PEG6000模拟的干旱胁迫有较低的表达水平。

Actin-F(SEQ ID NO.7)：TCACGAAGCGACATACAACT；

Actin-R(SEQ ID NO.8)：TCCACTGAGAACAACATTACC。

2.2酵母表达验证

为初步鉴定DG7C04019.1的功能，选择前期克隆的DG7C04019.1片段，连接pYES2酵母载体，选取Hind III和Xba I为酶切位点，进行PCR反应连接含有酶切位点的同源臂，含有同源臂的扩增引物如下所示(5’→3’)：

pYES2-DG7C04019.1-F(SEQ ID NO.9)：

ctatagggaatattaagcttATGGCGCCGCCACAGGAA；

pYES2-DG7C04019.1-R(SEQ ID NO.10)：

acatgatgcggccctctagaTTTCTGATTCTTGCTCTTCTCGG。

采用vazyme生物(南京)的ClonExpress Ultra One Step Cloning kit试剂盒将连接好同源臂的DG7C04019.1基因与线性化(双酶切)后的pYES2酵母载体进行连接构建过表达重组载体质粒pYES2-DG7C04019.1。将重组载体质粒通过CarrierDNA(Coolaber，中国)转入酿酒酵母株系(INVScI,MATa his3Δ1leu2 trp1-289 ura3-52/MATαhis3Δ1leu2trp1-289 ura3-52)，以空白pYES2载体质粒为对照。转化后的酵母涂在SD-Ura培养基上28℃培养48～72h，选取单克隆进行PCR，引物使用载体通用引物，序列如下所示(5’→3’)：

pYES2-F(SEQ ID NO.11)：AATATACCTCTATACTTTAACGTC；

pYES2-R(SEQ ID NO.12)：GCGTGAATGTAAGCGTGAC。

将扩增的产物送测序进行验证，选取鉴定正确的阳性菌落转化酵母于含2％半乳糖的液体SD-Ura培养基培养后，150rpm离心后以10的倍数进行稀释。稀释后的酵母悬浮液分别涂布于含有0M、1.5M和2.5M山梨醇(Sorbitol)的YPG培养基上28℃培养。结果如图3所示，表明，DG7C04019.1基因过表达可以降低酵母对干旱胁迫的耐受性。

2.3拟南芥中的功能验证

2.3.1过表达载体构建

根据载体pCAMBIA1300-35S的图谱设计以Kpn I/Xba I为插入位点并合成扩增引物，具体序列如下所示(5’→3’)：

DG7C04019.1-pCAMBIA1300-35S-F(SEQ ID NO.13)：

acgggggacgagctcggtaccATGGCGCCGCCACAGGAA；

DG7C04019.1-pCAMBIA1300-35S-R(SEQ ID NO.14)：

acgtaacatgtcgactctagaTTTCTGATTCTTGCTCTTCTCGG。

以上述1.3中的DG7C04019.1目的片段为模板，进行PCR反应，获得含pCAMBIA1300-35S酶切位点的同源臂基因，对正确的PCR片段进行回收，方法同上。

同时，对载体pCAMBIA1300-35S质粒以Kpn I/Xba I进行双酶切：

40μL酶切体系：30μL质粒、4μL 10×酶切缓冲液、4μL10×BSA、两个限制性内切酶各1μL，在37℃水浴处理1h左右。

将上述的PCR扩增片段经琼脂糖凝胶回收后，与双酶切回收的空载体混合，加入EasyGenoDNA重组体系连接(#VI201-02，天根生物)，10μL重组体系为：5μL的2×EasyGenoAssemblyMix、2.5μL的酶切载体DNA、2.5μL的DNA片段。

将反应体系加入250μL EP管中，放50℃水浴30分钟后转化大肠杆菌涂板，放37℃培养箱16h后，挑菌，送测序，测序正确的提重组载体质粒放在-20℃长期保存。

2.3.2拟南芥转化

(1)农杆菌转化：-80℃冰箱取出感受态GV3101，冰上解冻3min后加入2.3.1中测序正确的重组质粒4μL，冰上放置5min。将EP管置于液氮中速冻1min，37℃水浴5min，冰浴2min，加入800μL无抗液体LB培养基，28℃摇床150rpm/min培养3h。8000rpm/min离心1min，弃上清600μL后，悬浮，涂于固体LB培养基上(含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平)，28℃培养箱倒置培养48h。挑取单克隆，使用载体通用引物PCR鉴定，其中，通用引物序列如下所示(5’→3’)：

pCAMBIA1300-F(SEQ ID NO.15)：CTATCCTTCGCAAGACCCTTC；

pCAMBIA1300-R(SEQ ID NO.16)：CGCGATCCAGACTGAATGC。

(2)拟南芥种植：将野生型拟南芥(Col-0)用70％乙醇和3％的次氯酸钠进行灭菌，灭菌后的拟南芥平铺于1/2MS的培养基上。

(3)移栽：待野生拟南芥幼苗长至四叶期开始移栽至土壤中，选择直径9cm的花盆，每盆2-3棵。转移的拟南芥置于拟南芥生长室中培养，生长室的光照强度为2000-3000lx，光照时间为14h/day，湿度为40-60％。

(4)去顶：定时用霍格兰营养液浇灌植株，在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉等待侵染，侵染前一天浇水使拟南芥充分吸水。

(5)配制浸染液：在含5％的蔗糖1/2MS溶液中重悬农杆菌使最终OD₆₀₀为0.8，并加入表面活性剂silwet-77(0.05％)，选取生长良好的拟南芥进行侵染。

(6)浸染：将拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中约15s，轻轻晃动侵染液。

(7)暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养16-24h。

(8)浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。

(9)种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。

(10)转基因种子筛选：在含有潮霉素(25μg/mL)的平板上培养浸染后所得种子。约1周后观察拟南芥的生长状况，阳性苗不受潮霉素的影响会正常生长。所以根据拟南芥生长状况判断是否为转基因阳性种子。

(11)转基因植株的栽培：平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。

(12)T3代纯合株系表达量的验证：待T3代转基因植物生长至3周后进行RNA的提取，验证了3个纯合株系阳性苗(OE1、OE2、OE3)的DG7C04019.1基因表达量，结果如图4所示，结果显示过表达阳性苗的表达量比野生型高出很多，表明这三株阳性苗为基因过表达的植株苗。

2.3.3拟南芥抗旱验证

(1)萌发试验：将2.3.2中所得的3个T3转基因拟南芥株系和野生型拟南芥的无菌种子分别播种在含0mM、200mM、300mM、400mM甘露醇(Mannitol)的1/2MS培养基上。使用甘露醇可以模拟植物抗旱试验。种子播种后10天计算萌发率，每个浓度处理试验设3个重复。幼苗的萌发情况如图5所示，其中，图中的a、b、c、d分别为植株在0mM、200mM、300mM、400mM甘露醇下的萌发情况，萌发率结果如图6所示，其中，相同的两个小写字母表明两个数据间没有显著的变化。不同的两个字母表明数据有显著性的差异。结果表明DG7C04019.1基因过表达植株的萌发率均低于野生型，尤其当在400mM甘露醇的干旱胁迫下，植株的萌发率显著降低。

(2)根长实验：将T3转基因株系和野生型拟南芥在1/2MS培养基上播种7天，然后转到含0mM、200mM、300mM、400mM甘露醇的1/2MS培养基上播种7天测量根长。每个浓度处理试验设3个重复。幼苗的根长情况如图7所示，其中，图中a、b、c、d分别为植株在0mM、200mM、300mM、400mM甘露醇下的根长情况，根长的统计定量结果如图8所示。结果表明DG7C04019.1基因过表达植株的根长低于野生型。

(3)失水试验：对3周的过表达和野生型拟南芥失水14天后复水4天，观察表型。表型记录结果如图9中的A所示。

同时，在失水处理前和失水10天时测量叶片失水率、相对含水量、电导率、MDA含量、叶绿素荧光和叶绿素含量。

失水率：取6～10片叶子，置于称量纸上称重，每隔0.5h称量一次，至3h称量结束，记录每次称量的重量。其中，失水率＝(失水前重量-失水后重量)/失水前重量*100％。野生型拟南芥(Col-0)和转基因拟南芥(OE1、OE2、OE3)的失水率结果如图9中的B所示，可知，除OE3外其他两个株系的失水率高于野生型株系。

相对含水量：称取鲜重(freshweight，FM)约0.2g，将叶片放入水中浸泡5～6h，使叶片充分吸水达到饱和，取出擦干表面水分再称重(saturation weight，TM)。再将叶片放入烘箱中，105度30分钟杀青，再调70度烘干至恒重(dry weight，DM)，其中，相对含水量＝(FM-DM)/(TM-DM)*100％。相对含水量的统计结果如图9中的C所示，可知，在干旱胁迫下，过表达基因的拟南芥的相对含水量显著低于野生型。

电导率：取鲜重约0.1g，擦干净后用纸包好放入试管中，加入20mL的去离子水使样品充分浸入水中，室温下放置光照培养箱24h后测定初始电导率S1。然后沸水浴15min，冷却至室温测量最终电导率S2，其中，电导率＝S1/S2*100％。测定结果如图9中的D所示，可知，在干旱胁迫下，过表达基因的拟南芥的电导率显著高于野生型。

MDA含量：MDA含量用碧云天公司的MDA检测试剂盒测量，实验方法参照内置说明书进行，测定结果如图9中的E所示，可知，在干旱胁迫下，过表达基因的拟南芥的MDA含量高于野生型。

叶绿素荧光：使用PocketPEA Chlorophyll fluorimeter仪器测量植物叶片的叶绿素荧光，测定结果如图9中的F所示，其中，图中Fv/Fm的比值代表植物潜在最大光和能力，可知，在干旱胁迫下，过表达基因的拟南芥的潜在最大光和能力低于野生型。

叶绿素含量：使用索莱宝公司的植物叶绿素(chlorophyll)含量检测试剂盒，实验方法参照内置说明书进行。测定结果如图9中的G所示，可知，无论是在正常还是在干旱情况下，过表达基因的拟南芥的叶绿素总含量低于野生型。

说明：图中相同的两个小写字母表明两个数据间没有显著的变化。不同的两个字母表明数据有显著性的差异。

通过上述的失水表型结果和多个指标的检测结果可知，DG7C04019.1基因在干旱胁迫下表现出负调控作用，为敲除该基因提高鸭茅的抗旱性提供了理论基础，促进优质禾本科牧草鸭茅的开发与利用。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一种干旱胁迫相关的鸭茅基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1中所述的干旱胁迫相关的鸭茅基因所编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.包含如权利要求1中所述鸭茅基因的核苷酸序列的重组载体。

4.含有如权利要求3所述重组载体的重组工程菌。

5.如权利要求1所述的干旱胁迫相关的鸭茅基因在酵母干旱胁迫耐受性中的应用，所述的应用包含制备干旱胁迫耐受性强的酵母。

6.如权利要求1所述的干旱胁迫相关的鸭茅基因在拟南芥干旱胁迫抗性中的应用，所述的应用包含制备干旱胁迫耐受性强的拟南芥。

7.如权利要求1所述的干旱胁迫相关的鸭茅基因在鸭茅干旱胁迫抗性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用包含制备干旱胁迫耐受性增强的鸭茅株系。