[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN115697301A - 用于治疗急性呼吸窘迫综合征、哮喘或变应性鼻炎的制剂和方法 - Google Patents

用于治疗急性呼吸窘迫综合征、哮喘或变应性鼻炎的制剂和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115697301A
CN115697301A CN202180038692.7A CN202180038692A CN115697301A CN 115697301 A CN115697301 A CN 115697301A CN 202180038692 A CN202180038692 A CN 202180038692A CN 115697301 A CN115697301 A CN 115697301A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acids
free amino
present
pharmaceutical formulation
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180038692.7A
Other languages
English (en)
Inventor
S·维德亚瑟格
A·格罗舍
徐晓东
D·安戈利
S·J·加托
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Entelinco LLC
University of Florida Research Foundation Inc
Original Assignee
Entelinco LLC
University of Florida Research Foundation Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Entelinco LLC, University of Florida Research Foundation Inc filed Critical Entelinco LLC
Publication of CN115697301A publication Critical patent/CN115697301A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本文描述了可用于治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的包含游离氨基酸组合的制剂。本文还涵盖此类氨基酸制剂用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎；在用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎的方法中；和/或在制备用于治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的药剂的用途。

Description

用于治疗急性呼吸窘迫综合征、哮喘或变应性鼻炎的制剂和 方法
相关申请
本申请要求2020年5月29日提交的美国临时申请号63/032,185、2020年9月18日提交的美国临时申请号63/080,470、2020年10月7日提交的美国临时申请号63/088,813和2021年1月12日提交的美国临时申请号63/136,404的优先权，这些临时申请中的每一篇临时申请整体通过引用并入本文以用于所有目的。
技术领域
本文所述的氨基酸制剂、组合物、药剂和方法可用于治疗有此需要的受试者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘或变应性鼻炎。有此需要的受试者可表现出呼吸窘迫的体征，所述体征包括与过多肺泡液相关的症状。这些氨基酸制剂和组合物及其药剂赋予上皮钠通道(ENaC)活性的升高，从而减轻这些疾病的至少一种症状。ARDS是与多种疾病相关的症状，包括冠状病毒疾病2019(COVID-19)。本文涵盖本文所述的氨基酸制剂用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎的用途及在制备用于治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的药剂中的用途，以及用于治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的方法。
背景技术
SARS-CoV-2(其引起冠状病毒疾病2019(COVID-19))主要感染气道和肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞。SARS-CoV-2感染常常引起致命性炎性应答和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，这与COVID-19患者的高死亡率相关。表现出COVID-19肺炎的患者中有42％出现ARDS，并且其中的61％至81％被送进重症监护室(ICU)。在约20％的COVID-19患者中，该疾病很严重并且此类患者需要氧疗或机械通气。COVID-19ARDS患者在症状发作后使用通气机的中位时间为8.5天，并且通常，此类患者在这种支持性治疗后预后不良。ARDS导致肺部出现弥漫性肺泡损伤。有趣的是，COVID-19ARDS患者的结局比因其他原因所致的ARDS患者更糟糕。尽管在治疗方案方面取得了进步，ARDS患者仍旧具有高死亡率。
发明内容
所覆盖的实施方案由权利要求书限定，而不是由本发明内容限定。本发明内容是各个方面的高级概述，并且介绍了将在下面的具体实施方式部分中进一步描述的一些概念。本发明内容并不旨在识别要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在孤立地用于确定要求保护的主题的范围。应参考整篇说明书的适当部分、任何或所有附图以及每项权利要求来理解该主题。
ENaC和屏障功能在肺泡液清除中起着关键作用，并且它们被破坏会导致COVID-19中所见的ARDS。先天免疫机制对SARS-CoV-2识别不良会引起Th1和Th2应答的早期激活及Treg细胞应答的抑制。这种改变的免疫应答会引起经典的细胞因子风暴，最终导致ENaC活性和屏障功能被破坏。在本发明结果之前，人们对参与破坏ENaC活性和屏障功能的细胞因子的时间线和数量知之甚少。由于对此缺乏了解，应对ARDS的治疗选项也寥寥无几。
基于本文提供的电生理和免疫荧光技术，本发明人证实ENaC活性降低早于屏障破坏，并且与来自先天免疫应答(IFN-γ)、Th1免疫应答(TNF-α)和Treg免疫应答(TGF-β)的细胞因子相比，Th2细胞因子(IL-4和IL-13)对这些抑制效应的贡献更显著。
如本文所述，在剂量和时间依赖性评估中，使原代正常人支气管上皮细胞(HBEC)暴露于在COVID-19期间释放的代表性细胞因子及其组合。为了探究氨基酸制剂可用于通过增强ENaC功能来治疗ARDS的可能性，本发明人评价了多种氨基酸制剂(包括被指定为AA-EC01的氨基酸制剂)在暴露于COVID-19免疫应答特有的所选细胞因子的原代HBEC的模型系统中调节ENaC活性的能力。如本文所述，AA-EC01是在以表现出最大NaC抑制的剂量和温育时间暴露于IL-13时在HBEC中改善ENaC功能并降低MUC5AC表达的示例性氨基酸制剂。AA-EC01还在与细胞因子混合物一起温育的HBEC的纤周膜内增加了ENaC表达并减少IL-6分泌。因此，本文提供的结果证实了在ARDS相关炎性应答的体外模型系统中AA-EC01对ENaC功能的有益效应。AA-EC01由于能够恢复ENaC活性而具有成为第一治疗制剂的潜能，该第一治疗制剂被设计为改善在SARS-CoV-2或其他肺病毒感染后出现ARDS的患者的结局。AA-EC01可用作独立治疗剂或可与当前用于治疗ARDS患者的其他治疗剂一起用于联合治疗方法中。
AA-EC01还呈现为用于治疗哮喘的治疗剂。为了治疗哮喘，AA-EC01可用作独立治疗剂或可与当前用于治疗哮喘患者的其他治疗剂一起用于联合治疗方法中。
AA-EC01还呈现为用于治疗变应性鼻炎的治疗剂。为了治疗变应性鼻炎，AA-EC01可用作独立治疗剂或可与当前用于治疗变应性鼻炎患者的其他治疗剂一起用于联合治疗方法中。
在一些实施方案中，提供了用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎的药物制剂，其中该制剂包含游离氨基酸的治疗有效组合：游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸和赖氨酸的游离氨基酸；以及治疗有效量的谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或苏氨酸的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合，其中配制游离氨基酸的治疗有效组合以便递送到肺部来治疗ARDS或哮喘，并且游离氨基酸的治疗有效组合足以减少受试者肺部中的积液；或其中配制游离氨基酸的治疗有效组合以便递送到鼻道来治疗变应性鼻炎，并且游离氨基酸的治疗有效组合足以减少受试者鼻道中的积液；以及任选地，至少一种药学上可接受的载体、缓冲液、电解质、佐剂、赋形剂或水或它们的任何组合。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸和赖氨酸的游离氨基酸；以及治疗有效量的谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸；以及治疗有效量的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或苏氨酸的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸；以及治疗有效量的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。
在药物制剂的一些实施方案中，药物制剂是无菌的。
在药物制剂的一些实施方案中，存在于药物制剂中的游离氨基酸各自的浓度在0.1mM至30mM或0.5mM至30mM的范围内。在一些实施方案中，存在于药物制剂中的游离氨基酸各自的浓度在0.1mM至15mM或0.5mM至15mM的范围内。在一些实施方案中，存在于药物制剂中的游离氨基酸各自的浓度在0.1mM至10mM或0.5mM至10mM的范围内。
在药物制剂的一些实施方案中，药物制剂的pH在2.5至8.0、3.0至8.0、3.5至8.0、4.0至8.0、4.5至8.0、4.5至6.5、5.5至6.5、5.0至8.0、5.5至8.0、6.0至8.0、6.5至8.0、7.0至8.0或7.5至8.0的范围内。
在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸的浓度在4mM至10mM的范围内；精氨酸的浓度在6mM至10mM的范围内；精氨酸的浓度在7mM至9mM的范围内；精氨酸的浓度在7.2mM至8.8mM的范围内；或精氨酸的浓度为8mM；赖氨酸的浓度在4mM至10mM的范围内；赖氨酸的浓度在6mM至10mM的范围内；赖氨酸的浓度在7mM至9mM的范围内；赖氨酸的浓度在7.2mM至8.8mM的范围内；或赖氨酸的浓度为8mM；谷氨酰胺的浓度在4mM至10mM的范围内；谷氨酰胺的浓度在6mM至10mM的范围内；谷氨酰胺的浓度在7mM至9mM的范围内；谷氨酰胺的浓度在7.2mM至8.8mM的范围内；或赖氨酸的浓度为8mM；色氨酸的浓度在4mM至10mM的范围内；色氨酸的浓度在6mM至10mM的范围内；色氨酸的浓度在7mM至9mM的范围内；色氨酸的浓度在7.2mM至8.8mM的范围内；或色氨酸的浓度为8mM；酪氨酸的浓度在0.1mM至1.2mM的范围内；酪氨酸的浓度在0.4mM至1.2mM的范围内；酪氨酸的浓度在0.6mM至1.2mM的范围内；酪氨酸的浓度在0.8mM至1.2mM的范围内；或酪氨酸的浓度为1.2mM；半胱氨酸的浓度在4mM至10mM的范围内；半胱氨酸的浓度在6mM至10mM的范围内；半胱氨酸的浓度在7mM至9mM的范围内；半胱氨酸的浓度在7.2mM至8.8mM的范围内；或半胱氨酸的浓度为8mM；天冬酰胺的浓度在4mM至10mM的范围内；天冬酰胺的浓度在6mM至10mM的范围内；天冬酰胺的浓度在7mM至9mM的范围内；天冬酰胺的浓度在7.2mM至8.8mM的范围内；或天冬酰胺的浓度为8mM；苏氨酸的浓度在4mM至10mM的范围内；苏氨酸的浓度在6mM至10mM的范围内；苏氨酸的浓度在7mM至9mM的范围内；苏氨酸的浓度在7.2mM至8.8mM的范围内；或苏氨酸的浓度为8mM；或它们的任何组合。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺以及任选天冬酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，色氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，酪氨酸以0.1mM至1.2mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，色氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，酪氨酸以0.8mM至1.2mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，色氨酸以8mM的浓度存在，酪氨酸以1.2mM的浓度存在，并且谷氨酰胺以8mM的浓度存在。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸和谷氨酰胺以及任选天冬酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，色氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，色氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，色氨酸以8mM的浓度存在，并且谷氨酰胺以8mM的浓度存在。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺以及任选天冬酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，酪氨酸以0.1mM至1.2mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，酪氨酸以0.8mM至1.2mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，酪氨酸以1.2mM的浓度存在，并且谷氨酰胺以8mM的浓度存在。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，谷氨酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在，半胱氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，并且天冬酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，谷氨酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，半胱氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，并且天冬酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，谷氨酰胺以8mM的浓度存在，半胱氨酸以8mM的浓度存在，并且天冬酰胺以8mM的浓度存在。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸和色氨酸以及任选天冬酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸和色氨酸的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，并且色氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，并且色氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，并且色氨酸以8mM的浓度存在。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸和酪氨酸以及任选天冬酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸和酪氨酸的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，色氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，苏氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，并且酪氨酸以0.1mM至1.2mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，色氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，苏氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，并且酪氨酸以0.8mM至1.2mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，色氨酸以8mM的浓度存在，苏氨酸以8mM的浓度存在，并且酪氨酸以1.2mM的浓度存在。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺以及任选天冬酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，色氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，苏氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，色氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，苏氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，色氨酸以8mM的浓度存在，苏氨酸以8mM的浓度存在，并且谷氨酰胺以8mM的浓度存在。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸以及任选天冬酰胺的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸的游离氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，色氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，酪氨酸以0.1mM至1.2mM范围内的浓度存在，谷氨酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在，并且苏氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，色氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，酪氨酸以0.8mM至1.2mM范围内的浓度存在，谷氨酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，并且苏氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。在药物制剂的一些实施方案中，精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，色氨酸以8mM的浓度存在，酪氨酸以1.2mM的浓度存在，谷氨酰胺以8mM的浓度存在，并且苏氨酸以8mM的浓度存在。
在一些实施方案中，药物制剂还包含至少一种药学上可接受的载体、缓冲液、电解质、佐剂、赋形剂或水或它们的任何组合。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸中的至少一者或游离氨基酸中的每一者包含L-氨基酸。在药物制剂的一些实施方案中，所有氨基酸是L-氨基酸。
在药物制剂的一些实施方案中，配制药物制剂以便通过肺部、吸入或鼻内途径来施用。在药物制剂的一些实施方案中，配制药物制剂以便经由吸入或鼻腔施用来施用。
在药物制剂的一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在药物制剂的一些实施方案中，哺乳动物是人类、猫、狗、猪、马、奶牛、绵羊或山羊。在药物制剂的一些实施方案中，哺乳动物是人类。在药物制剂的一些实施方案中，人类是婴孩。
在药物制剂的一些实施方案中，受试者罹患冠状病毒疾病2019(COVID-19)。
在药物制剂的一些实施方案中，药物制剂减少罹患ARDS或哮喘的受试者的肺部中的过多积液，从而减轻与ARDS或哮喘相关的至少一种症状。在药物制剂的一些实施方案中，药物制剂减少罹患变应性鼻炎的受试者的鼻道中的过多积液，从而减轻与变应性鼻炎相关的至少一种症状。过多积液的减少部分地由于ENaC活性的增加。
在药物制剂的一些实施方案中，药物制剂用于治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎。在其一些实施方案中，药物制剂可经由肺部、吸入或鼻内途径中的至少一者来施用。在其一些实施方案中，药物制剂可经由吸入或鼻腔施用来施用。
在药物制剂的一些实施方案中，药物制剂用于制造治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的药剂。在其一些实施方案中，药剂可经由肺部、吸入或鼻内途径中的至少一者来施用。在其一些实施方案中，药剂可经由吸入或鼻腔施用来施用。
在药物制剂的一些实施方案中，药物制剂在用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎的方法中使用，该方法包括：向有此需要的受试者施用本文所述药物制剂中的至少一者，其中该施用减少肺部中的积液，从而在受试者中减轻与ARDS或哮喘相关的至少一种症状，或该施用减少受试者的鼻道中的积液，从而在受试者中减轻与变应性鼻炎相关的至少一种症状。
在该方法的一些实施方案中，药物制剂经由肺部、吸入或鼻内途径来施用。在该方法的一些实施方案中，药物制剂经由吸入或鼻腔施用来施用。
在药物制剂的一些实施方案中，提供了包含游离氨基酸的组合的药物制剂：游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸和赖氨酸的游离氨基酸；以及治疗有效量的谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或苏氨酸的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体、缓冲液、电解质、佐剂、赋形剂或水或它们的任何组合。
在药物制剂的一些实施方案中，提供了包含游离氨基酸的治疗有效组合的药物制剂：游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸和赖氨酸的游离氨基酸；以及治疗有效量的谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。
在药物制剂的一些实施方案中，提供了包含游离氨基酸的组合的药物制剂：游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸；以及治疗有效量的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或苏氨酸的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺的游离氨基酸。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。
在药物制剂的一些实施方案中，游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。
在药物制剂的一些实施方案中，提供了一种装置，该装置包含本文所述的药物制剂或具有本文所述药物制剂的药剂，其中该装置被配置为将该药物制剂或该药剂递送到有此需要的受试者的肺部或鼻道。示例性的此类装置包括：吸入器、喷雾器、鼻用喷雾容器和滴鼻剂容器。
设想了单独描述的实施方案的所有组合。
附图说明
本文仅通过示例的方式参考附图描述本公开的一些实施方案。现在详细参考附图，应强调的是所示的实施方案采用示例的方式并且是为了本公开的实施方案的说明性讨论目的。在这方面，利用附图进行的描述使本领域的技术人员清楚地知道可如何实践本公开的实施方案。
图1：SARS-CoV-2通过肺泡和周围微毛细血管床来感染的发病机理的示意图，从而在该过程中抑制钠通道ENaC。
图2：在存在不同浓度IL-13的情况下人支气管上皮细胞中的ENaC电流。N＝6个组织。
图3：IL-12使ENaC电流最大减小所需的时间(N＝6个组织)。
图4：IL-13使ENaC电流最大减小所需的时间。N＝6个组织
图5A和图5B：生长于通透性膜嵌套(insert)上并用IL-13处理4天和14天的HBEC细胞。图5A.当与林格(Ringer)溶液相比时，在存在制剂AAF01(本文也称为AA-EC01)的情况下，HBEC显示出增加的ENaC电流。图5B.当与林格溶液中的HBEC相比时，在存在AAF01的情况下布美他尼敏感阴离子电流减小。N＝6个组织。
图6A和图6B：AAF01减少经IL-13处理的HBEC中的氯离子分泌。图6A.基础WT54和WT59的Jnet；图6B.布美他尼处理后WT54和WT59的Jnet。AAF01减少IL-13诱导的Cl分泌，使之恢复正常(第0天)。
图7A-D：在用20ng IL-13处理4天和14天的完全分化型原代HBEC中，精选氨基酸制剂对苯扎米尔敏感电流(ENaC活性)和布美他尼敏感电流(阴离子电流)的效应。平均值±平均标准误差(SEM)；方差分析(ANOVA)，与林格溶液相比*P<0.05(n＝3)。
图8A和图8B：当用20ng IL-13处理4天和14天时，精选氨基酸制剂对原代HBEC中的苯扎米尔敏感电流(ENaC活性)和布美他尼敏感电流(阴离子电流)的效应。平均值±平均标准误差；方差分析，P<0.05(n＝3)。
图9：在暴露于递增浓度的TNF-α达7天之后人支气管上皮细胞中的ENaC活性。用不同浓度的TNF-α(0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、5、50或500ng/mL培养基)处理人支气管上皮细胞(HBEC)7天。
图10：在暴露于递增浓度的IFN-γ达7天之后人支气管上皮细胞中的ENaC活性。用IFN-γ(0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、5、50或500ng/mL培养基)处理HBEC 7天。
图11：在暴露于递增浓度的TGF-β1达7天之后人支气管上皮细胞中的ENaC活性。用TGF-β1(0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、5、50或500ng/mL培养基)处理HBEC 7天。
图12：在暴露于TNF-α、IFN-γ和TGF-β1达7天之后精选氨基酸制剂对人支气管上皮细胞中的ENaC活性的效应。用TNF-α(1.2ng/mL培养基)、IFN-γ(0.875ng/mL培养基)和TGF-β1(2.6ng/mL)处理HBEC 7天。初始细胞：时相匹配的正常健康细胞。精选“5AA制剂”(8mM精氨酸、8mM赖氨酸、8mM半胱氨酸、8mM天冬酰胺、8mM谷氨酰胺)；NC(8mM天冬氨酸、8mM苏氨酸、8mM亮氨酸)。
图13A-13D：IFN-γ对HBEC中的苯扎米尔敏感Isc和TEER的剂量和时间依赖性效应。(13A)在将HBEC与递增浓度的IFN-γ(5x10-5至500ng/mL)一起温育7天之后分析IFN-γ对苯扎米尔敏感Isc的剂量依赖性效应。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯(Ussing)室中的林格溶液之前和15分钟后的Isc计算Delta Isc。(13B)在将HBEC与递增浓度的IFN-γ(5x10-5至500ng/mL)一起温育7天之后分析IFN-γ对TEER的剂量依赖性效应。在浸没于尤斯室中的林格溶液中的同时在30分钟后记录TEER。(13C)在将HBEC与1ng/mL IFN-γ一起温育16天之后分析IFN-γ对苯扎米尔敏感Isc的时间依赖性效应，并且在第2、4、6、8、10、12、14和16天分析数据。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯室中的林格溶液之前和15分钟后的Isc计算Delta Isc。(13D)在将HBEC与1ng/mL IFN-γ一起温育16天之后分析IFN-γ对TEER的时间依赖性效应，并且在第2、4、6、8、10、12、14和16天分析数据。在浸没于尤斯室中的林格溶液中的同时在30分钟后记录TEER。将所有值归一化到对照(0ng/mL细胞因子/第0天)，并且数据呈现为平均值±平均标准误差(n＝2个供体且N＝每组2个独立实验)。使用用于与对照成对比较的曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验来检验统计显著性(*P<0.05)。
图14A-14D：TNF-α对HBEC中的苯扎米尔敏感Isc和TEER的剂量和时间依赖性效应。(14A)在将HBEC与递增浓度的IFN-α(5x10-5至500ng/mL)一起温育7天之后分析TNF-α对苯扎米尔敏感Isc的剂量依赖性效应。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯室中的林格溶液之前和15分钟后的Isc计算Delta Isc。(14B)在将HBEC与递增浓度的TNF-α(5x10-5至500ng/mL)一起温育7天之后分析TNF-α对TEER的剂量依赖性效应。在浸没于尤斯室中的林格溶液中的同时在30分钟后记录TEER。(14C)在将HBEC与1ng/mL TNF-α一起温育16天之后分析TNF-α对苯扎米尔敏感Isc的时间依赖性效应，并且在第2、4、6、8、10、12、14和16天分析数据。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯室中的林格溶液之前和15分钟后的Isc计算Delta Isc。(14D)在将HBEC与1ng/mL TNF-α一起温育16天之后分析TNF-α对TEER的时间依赖性效应，并且在第2、4、6、8、10、12、14和16天分析数据。在浸没于尤斯室中的林格溶液中的同时在30分钟后记录TEER。将所有值归一化到对照(0ng/mL细胞因子/第0天)，并且数据呈现为平均值±平均标准误差(n＝2个供体且N＝每组2个独立实验)。使用用于与对照成对比较的曼-惠特尼检验来检验统计显著性(*P<0.05)。
图15A-15D：IFN-γ和TNF-α混合物对HBEC中的苯扎米尔敏感Isc和TEER的剂量依赖性效应，以及IL-4对HBEC中的苯扎米尔敏感Isc和TEER的时间依赖性效应。(15A)在将HBEC与各0.05、0.5、2.5、5或10ng/mL的IFN-γ和TNF-α一起温育7天之后分析IFN-γ和TNF-α混合物对苯扎米尔敏感Isc的剂量依赖性效应。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯室中的林格溶液之前和15分钟后的Isc计算Delta Isc。(15B)在将HBEC与各0.05、0.5、2.5、5或10ng/mL的IFN-γ和TNF-α一起温育7天之后分析IFN-γ和TNF-α混合物对TEER的剂量依赖性效应。在浸没于尤斯室中的林格溶液中的同时在30分钟后记录TEER。(15C)在将HBEC与2ng/mLIL-4一起温育14天之后分析IL-4对苯扎米尔敏感Isc的时间依赖性效应，并且在第2、4、6、8、10、12和14天分析数据。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯室中的林格溶液之前和15分钟后的Isc计算Delta Isc。(15D)在将HBEC与2ng/mL IL-4一起温育14天之后分析IL-4对TEER的时间依赖性效应，并且在第2、4、6、8、10、12和14天分析数据。在浸没于尤斯室中的林格溶液中的同时在30分钟后记录TEER。将所有值归一化到对照(0ng/mL细胞因子/第0天)，并且数据呈现为平均值±平均标准误差(n＝2个供体且N＝每组2个独立实验)。使用用于与对照成对比较的曼-惠特尼检验来检验统计显著性(*P<0.05)。
图16A-16D：IL-13对HBEC中的苯扎米尔敏感Isc和TEER的剂量和时间依赖性效应。(16A)在将HBEC与递增浓度的IL-13(0.1至64ng/mL)一起温育14天之后分析IL-13对苯扎米尔敏感Isc的剂量依赖性效应。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯室中的林格溶液之前和15分钟后的Isc计算Delta Isc。(16B)在将HBEC与递增浓度的IL-13(0.1至64ng/mL)一起温育14天之后分析IL-13对TEER的剂量依赖性效应。在浸没于尤斯室中的林格溶液中的同时在30分钟后记录TEER。(16C)在将HBEC与20ng/mL IL-13一起温育16天之后分析IL-13对苯扎米尔敏感Isc的时间依赖性效应，并且在第2、4、6、8、10、12、14和16天分析数据。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯室中的林格溶液之前和15分钟后的Isc计算Delta Isc。(16D)在将HBEC与20ng/mL IL-13一起温育16天之后分析IL-13对TEER的时间依赖性效应，并且在第2、4、6、8、10、12、14和16天分析数据。在浸没于尤斯室中的林格溶液中的同时在30分钟后记录TEER。将所有值归一化到对照(0ng/mL细胞因子/第0天)，并且数据呈现为平均值±平均标准误差(n＝2个供体且N＝每组2个独立实验)。使用用于与对照成对比较的曼-惠特尼检验来检验统计显著性(*P<0.05)。
图17A-17D：TGF-β1对HBEC中的苯扎米尔敏感Isc和TEER的剂量和时间依赖性效应。(17A)在将HBEC与递增浓度的TGF-β1(5x10-5至50ng/mL)一起温育7天之后分析TGF-β1对苯扎米尔敏感Isc的剂量依赖性效应。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯室中的林格溶液之前和15分钟后的Isc计算Delta Isc。(17B)在将HBEC与递增浓度的TGF-β1(5x10-5至50ng/mL)一起温育7天之后分析TGF-β1对TEER的剂量依赖性效应。在浸没于尤斯室中的林格溶液中的同时在30分钟后记录TEER。(17C)在将HBEC与1ng/mL TGF-β1一起温育16天之后分析TGF-β1对苯扎米尔敏感Isc的时间依赖性效应，并且在第2、4、6、8、10、12、14和16天分析数据。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯室中的林格溶液之前和15分钟后的Isc计算DeltaIsc。(17D)在将HBEC与1ng/mL TGF-β1一起温育16天之后分析TGF-β1对TEER的时间依赖性效应，并且在第2、4、6、8、10、12、14和16天分析数据。在浸没于尤斯室中的林格溶液中的同时在30分钟后记录TEER。将所有值归一化到对照(0ng/mL细胞因子/第0天)，并且数据呈现为平均值±平均标准误差(n＝2个供体且N＝每组2个独立实验)。使用用于与对照成对比较的曼-惠特尼检验来检验统计显著性(*P<0.05)。
图18A-18B：AA-EC01对HBEC中的苯扎米尔敏感Isc和TEER的效应，以及AA-EC01影响COVID-19相关ARDS中的ENaC和免疫应答的示意图。(18A)在将HBEC与20ng/mL IL-13一起温育14天之后分析AA-EC01对苯扎米尔敏感Isc的效应。由将6μM苯扎米尔朝向顶部添加到尤斯室中的林格溶液、AA-EC01或AANC(阴性对照)之前和15分钟后的Isc计算Delta Isc。(18B)在将HBEC与20ng/mL IL-13一起温育14天之后分析AA-EC01对TEER的效应。在浸没于尤斯室中的林格溶液、AA-EC01或AANC(阴性对照)中的同时在30分钟后记录TEER。将所有值归一化到对照(0ng/mL IL-13)，并且数据呈现为平均值±平均标准误差(n＝2个供体且N＝每组2个独立实验)。在使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis)确认各组之间的显著性之后，使用曼-惠特尼检验进行成对比较(*P<0.05)。
具体实施方式
在已经公开的那些益处和改进当中，根据结合附图进行的以下描述，本公开的其它目的和优点将变得显而易见。本文公开了本公开的详细实施方案；然而，应理解，所公开的实施方案仅是可以各种形式体现的本公开的示意。另外，关于本公开的各种实施方案给出的每一个实例均旨在示意而非限制。
ARDS与COVID-19的高死亡率相关。ARDS的特征在于细胞因子风暴并伴有受损的肺泡液体清除(ALC)、肺泡-毛细血管通透性及血管和上皮渗漏，引起富含蛋白质的流体从肺毛细血管渗漏到间质和肺泡空间中，从而造成肺水肿。在正常条件下，气道促进跨越肺泡腔和包埋于肺泡间隔膜中的毛细血管网络的气体交换。ENaC介导生电性钠吸收，之后是被动吸水，并且保持用于粘膜纤毛清除的最佳含水量。然而，ENaC在COVID-19发病的多个阶段受到抑制，从而引起肺泡中积液。补氧和通气机支持会加重炎症，从而触发过氧化物、过氧亚硝酸根形成和一氧化氮合酶(NOS)解偶联，并且破坏屏障和转运蛋白，包括ENaC。
图1中示意性地描绘了上述事件级联。SARS-CoV-2抑制ENaC活性发生于以下阶段：1)跨膜蛋白酶丝氨酸S1成员2(TMPRSS2)(即，对病毒的蛋白水解激活是必需的并因此对COVID-19传播和发病是必需的宿主细胞因子)；2)上调血管紧张素转化酶(ACE)和肾素-血管紧张素系统(RAS)的血管紧张素转化酶2(ACE2)；3)继发于ACE和RAS激活的细胞因子风暴引起TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6、IL-10、IP-10、IL-13、MCP-1、IL-2、IL-4、GCSF IP-10和MIP-1A的水平升高；4)上皮和内皮屏障破坏，引起流体渗漏到肺泡中，从而减少气体交换；以及5)继发于炎症和肺泡内局部氧增加的NOS解偶联。
ARDS的唯一可用治疗是补氧及使用通气机帮助在充满水肿液的肺泡空间中溶解更多氧并增加血气屏障处的可用氧。然而，补氧和通气机支持会加重炎症并且有利于eNOS解偶联、过氧化物形成、过氧亚硝酸根(ONOO-)增加以及各种细胞蛋白(包括膜相关蛋白如上皮和周围血管中的ENaC)的半胱氨酸残基的不可逆硝化。构成基本细胞功能(例如转运及细胞内和细胞间结构完整性)的ENaC和其他细胞蛋白受损造成了不利地影响肺组织完整性的进一步损伤。
接受补氧治疗和机械通气的COVID-19患者的高死亡率可能与上述损伤级联相关。实际上，这些患者的死亡率在65％至94％的范围内，所述统计数据已引发关于为SARS-CoV-2患者使用通气机的价值的争论。此外，值得注意的是，患上COVID-19介导的ARDS的受试者的结局比因其他原因罹患ARDS的受试者糟糕得多。
本发明人已开发了研究用于应对ARDS的潜在治疗方案的测定法，并且已开发了应对治疗ARDS(特别是COVID-19患者/受试者的ARDS)的挑战的模型系统。因此，本文所述的模型系统被设计为解决与ARDS相关的重大临床问题，而不论与COVID-19相关还是与COVID-19无关，并且通过提供氨基酸制剂(诸如本文所述的那些)来提出此类临床问题的解决方案。首先转到用于解决这些临床问题的体外模型系统，本发明人使用暴露于各种促炎剂的分化型原代人支气管上皮细胞(HBEC)来重现ARDS的特征。
在模型系统的一些实施方案中，本发明人示出了分化型HBEC暴露于IL-13导致ENaC受抑制并且屏障功能受损。因此，本发明人基于这一发现而开发了实验系统，其中重现ARDS的这些特征，达到与患病受试者/患者的肺部中观察到的情形相当的程度。
包含暴露于本文所述IL-13的分化型HBEC的所开发的实验系统用作评价各种氨基酸制剂对增加ENaC活性和改善屏障功能的效应的模型系统。使用该模型系统，基于其增加ENaC转运蛋白活性的能力(如通过其增加ENaC电流和改善屏障功能的能力来测量)来鉴定和表征多种氨基酸制剂。参见下表1和2。示例性的此类制剂是五氨基酸制剂(AAF01)。如本文所示，在用IL-13处理14天的HBEC中，AAF01增加了ENaC电流，减小了阴离子电流，并且改善了屏障功能。选择AAF01的至少部分原因是其能够减少氯离子分泌并改善屏障功能。
这些发现提供证据证明AAF01和本文所述的其他示例性氨基酸制剂可用于治疗罹患COVID-19的受试者，特别是表现出ARDS的至少一种症状的那些受试者。AAF01和本文所述的其他示例性氨基酸制剂还可用于治疗罹患哮喘或变应性鼻炎、Th2细胞因子(例如，IL-4和IL-13)起到重要作用的病症的受试者。基于本文提供的结果，AAF01和本文所述的其他示例性氨基酸制剂可至少部分地经由其增加ENaC活性和改善肺泡液清除的能力来发挥作用。
本文提供的结果证实AAF01：
·增加了阿米洛利/苯扎米尔敏感ENaC电流
·增加了ENaC蛋白水平
·增加了NHE3蛋白水平(不依赖ENaC的钠吸收)
·增加了紧密连接蛋白水平和功能
·AAF01可用于治疗与COVID和其他形式的肺炎相关的ARDS以及哮喘和变应性鼻炎。
·AAF01可经由多种方式递送，包括但不限于：采用雾化形式，诸如由喷雾器、吸入器或鼻用雾化器递送的形式。
·AAF01可与用于治疗SARS-CoV-2、哮喘和/或变应性鼻炎的其他药剂联用。
基于本文提供的结果，AAF01、AAF03和AAF07被选择为用于治疗ARDS的示例性制剂，至少部分原因是这些制剂中的每一者在本文所述的重现呼吸窘迫特征的模型系统中赋予ENaC活性的增加。AAF01、AAF03和AAF07被选择为示例性制剂，因为它们能够在本文所述的重现呼吸窘迫特征(诸如ARDS或哮喘中观察到的那些特征，所述特征包括过多肺泡积液)的模型系统中减少氯离子分泌和/或降低屏障通透性。减少氯离子分泌和/或降低屏障通透性的能力还通过减少有此需要的受试者的鼻道中的过多积液而向AAF01、AAF03和AAF07中的每一者赋予了用作治疗变应性鼻炎的治疗制剂的能力。
表1
Figure BDA0003968165340000141
*AAF01(本文也称为AA-EC01)
表2
Figure BDA0003968165340000142
本文所述的示例性氨基酸制剂[例如，AAF01、AAF03、AAF07以及精选5AA制剂(精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)]可用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎。ARDS或哮喘可能与肺泡积液相关，因此可通过改善肺泡液清除来赋予症状缓解。本文所述的示例性氨基酸制剂至少部分地通过上调ENaC功能(如增加的钠和流体吸收所反映)来改善肺泡液清除。因此，提供本文所述的氨基酸制剂以用于治疗ARDS或哮喘，其中改善肺泡液清除是期望的。本文所述的用于治疗ARDS或哮喘的氨基酸制剂可单独使用或与用于治疗这些障碍中的每种障碍的至少一种其他活性药物成分(API)联用。能够改善肺泡液清除的特性还强调了本文所述的示例性氨基酸制剂在制备用于治疗ARDS或哮喘的药剂方面的实用性，其中此类药剂改善肺泡液清除并因此向罹患这些障碍的受试者赋予症状缓解。本文所述的氨基酸制剂可能是该药剂中的唯一API或可能与用于治疗ARDS或哮喘的至少一种其他API共存。本文所述的示例性氨基酸制剂还可在用于治疗有此需要的受试者的方法中使用，所述有此需要的受试者患有与肺泡积液相关的ARDS或哮喘。用于治疗ARDS或哮喘的方法可能要求将本文所述的氨基酸制剂单独施用或与用于治疗ARDS或哮喘的至少一种其他API联合施用。
本文所述的示例性氨基酸制剂(例如，AAF01、AAF03、AAF07和精选5AA制剂)可用于治疗有此需要的受试者的变应性鼻炎。变应性鼻炎与鼻道中的过多流体相关，因此可通过改善鼻道的流体清除来赋予症状缓解。本文所述的示例性氨基酸制剂至少部分地通过上调ENaC功能(如增加的钠和流体吸收所反映)来改善鼻窦和/或鼻道的流体清除。因此，提供了本文所述的氨基酸制剂以用于治疗变应性鼻炎。本文所述的用于治疗变应性鼻炎的氨基酸制剂可单独使用或与用于治疗变应性鼻炎的至少一种其他API联用。能够改善鼻道的流体清除的特性还强调了本文所述的示例性氨基酸制剂在制备用于治疗变应性鼻炎的药剂方面的实用性，其中减少过多鼻分泌物是期望的。本文所述的氨基酸制剂可能是该药剂中的唯一API或可能与用于治疗变应性鼻炎的至少一种其他API共存。本文所述的示例性氨基酸制剂还可在用于治疗患有变应性鼻炎的有此需要的受试者的方法中使用。用于治疗变应性鼻炎的方法可能要求将本文所述的氨基酸制剂单独施用或与用于治疗变应性鼻炎的至少一种其他API联合施用。
在一些实施方案中，存在于制剂中的游离氨基酸各自的浓度在0.1mM至30mM或0.5mM至30mM的范围内。在一些实施方案中，存在于制剂中的游离氨基酸各自的浓度在0.1mM至15mM或0.5mM至15mM的范围内。在一些实施方案中，存在于制剂中的游离氨基酸各自的浓度在0.1mM至10mM或0.5mM至10mM的范围内。在一些实施方案中，存在于制剂中的游离氨基酸各自的浓度在4mM至12mM、5mM至12mM、6mM至12mM、4mM至10mM、5mM至10mM、6mM至10mM、4mM至9mM、5mM至9mM或6mM至9mM的范围内，但酪氨酸除外，酪氨酸的浓度在0.1mM至1.2mM、0.5mM至1.2mM、0.6mM至1.2mM或0.8mM至1.2mM的范围内(例如，约1.2mM)。在一些实施方案中，存在于制剂中的游离氨基酸各自的浓度在7mM至9mM的范围内(例如，约8mM)，但酪氨酸除外，酪氨酸的浓度在0.8mM至1.2mM的范围内(例如，约1.2mM)。在一些实施方案中，制剂是如下AAF01(本文也称为AA-EC01)：8mM赖氨酸、8mM色氨酸、8mM精氨酸、8mM谷氨酰胺和1.2mM酪氨酸。
在一些实施方案中，本文所述的制剂的pH在2.5至8.0、3.0至8.0、3.5至8.0、4.0至8.0、4.5至8.0、4.5至6.5、5.5至6.5、5.0至8.0、5.5至8.0、6.0至8.0、6.5至8.0、7.0至8.0或7.5至8.0的范围内。
在其中经由喷雾器(吸入或溶液混悬剂)递送制剂的一些实施方案中，制剂的pH可在4.5至6.5的pH之间的范围内，这减少受试者对施用作出反应而打喷嚏的倾向。
在其中经由鼻用喷雾器或鼻用雾化器递送制剂的一些实施方案中，制剂的pH可在4.5至6.5的pH之间的范围内。在一些实施方案中，制剂的pH可在5.5至6.5的pH之间的范围内。可商购获得的鼻用喷雾产品通常具有3.5至7.0范围内的pH。鼻上皮的pH通常在5.5至6.5的范围内。平均基线人鼻pH为约6.3。
在一些实施方案中，每掀喷雾的剂量(左右鼻孔)：效价<5mg/剂；体积最多为100μl/每掀喷雾：溶解度>50mg/ml；溶液型药物：pH大约5.5，渗透压290-500mosm/kg。
在一些实施方案中，经由例如合适的盐水溶液中的鼻腔冲洗来递送本文所述的制剂。合适的盐水溶液可商购获得，或另选地，可在家中制备。合适的盐水溶液可包含1至2杯温水(例如，蒸馏、无菌或煮沸的)，其中溶解了1/4至1/2茶匙的非碘盐和少许小苏打。
施加装置：旨在用于鼻腔施用的制剂的预期用途和药物剂型(例如，灌洗、滴剂、喷射系统、喷雾)决定了可使用的施加装置。剂量(每掀的体积通常仅100μl)、给药选项(单次与多次)、受试者(消费者、医疗保健专业人士、患者、儿童、老年个体)和受试者的健康状态也影响施加装置的选择。透粘膜鼻腔递送和吸收因避免了胃肠道破坏和肝首过代谢而受益。
在一些实施方案中，本文所述的制剂相继用于应对对病原体(例如，SARS-CoV-2)的免疫应答的阶段。因此，随着疾病从早期进展到晚期，适用于治疗早期疾病的氨基酸制剂被替换为适用于治疗晚期疾病的氨基酸制剂。在一些实施方案中，在对病原体或病症(例如，慢性或急性)的免疫应答的早期，施用抵消先天免疫(例如，IFN-γ)和/或Th1细胞应答(例如，TNF-α)特有的细胞因子的病理结果的制剂。用于抵消先天免疫和/或Th1细胞应答特有的细胞因子的病理结果的示例性制剂包括第一制剂：其中此类第一制剂包含基本上由以下项组成的游离氨基酸的治疗有效组合：治疗有效量的精氨酸和赖氨酸；以及治疗有效量的半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。在对病原体引起的呼吸系统病症的早期免疫应答(诸如对SARS-CoV-2作出反应而引发的那些早期免疫应答)中观察到此类免疫应答。当对例如SARS-CoV-2的免疫应答随时间进展时，细胞因子表达组合可改变为Th2细胞应答特有的细胞因子表达组合(例如，IL-4和IL-13)。一旦免疫应答已开始进展到Th2细胞应答，就可使用包含示例性氨基酸制剂例如AAF01、AAF03或AAF07的第二制剂替换第一制剂。本文提供的证据证实，例如AAF01(本文也称为AA-EC01)通过至少部分地恢复ENaC活性而在治疗上适用于应对Th2型细胞因子的病理结果。
基于本文提供的结果，治疗方案可包括至少部分地通过恢复ENaC活性来抵消先天免疫和/或Th1细胞特有的细胞因子的病理作用的第一氨基酸制剂，之后是至少部分地通过恢复ENaC活性来抵消Th2细胞特有的细胞因子的病理作用的第二氨基酸制剂。第一氨基酸制剂和第二氨基酸制剂是以相继且单独的方式或相继且给药重叠的方式可施用的或可能施用的，并且随着添加递增量的第二氨基酸制剂，第一氨基酸制剂的量逐渐减少，直到仅施用第二氨基酸制剂。可由主治医生基于临床体征和症状表现来确定第一氨基酸制剂和第二氨基酸制剂的施用时间。
在一些实施方案中，可评估受试者以确定受试者是表现出其中主要免疫应答包括产生先天免疫和/或Th1细胞特有的细胞因子或产生Th2细胞特有的细胞因子的免疫应答，还是表现出这样的免疫应答，其中初始免疫应答包括产生先天免疫和/或Th1细胞特有的细胞因子，随后接着是包括产生Th2细胞特有的细胞因子的免疫应答。这种评估可用于针对受试者的遗传学、状况、环境和生活方式来定制氨基酸制剂，从而有利于精准医疗。
根据上文，探究了细胞因子诱导的炎症对ENaC活性和屏障功能的效应，如本文提供的实施例和附图中详述。如本文所述，ENaC对于上皮流体层的维持很关键。高浓度的一些细胞因子诸如TNF-α、TGF-β、IFN-γ和IL-6与肺损伤和ARDS密切相关，并且如本文所示，降低了ENaC活性和功能，因此防止了COVID-19患者气道的流体清除。为了探究这些细胞因子在疾病病因和进展中的效应，本发明人将正常人支气管上皮细胞暴露于三种细胞因子(TNF-α、TGF-β1、IFN-γ)的混合物7天以分析其对ENaC活性的效应，随后选择了使增加的细胞因子水平对ENaC功能的不良反应发生逆转的氨基酸制剂。参见图9-12。图9例如示出了ENaC电流随着TNF-α的浓度增加而减小。图10例如示出了当用更低浓度的IFN-γ(0.00005至0.05ng/mL培养基)处理细胞时，ENaC电流增加。ENaC电流在暴露于更高水平的IFN-γ时返回到基线(未处理)水平，但随后在用更高浓度的IFN-γ(>0.05ng/mL培养基)处理细胞时相对于基线减小。图11例如示出了ENaC电流随着TGF-β1的浓度增加而减小。
图12例如示出了与未暴露于细胞因子混合物的HBEC(初始)相比，HBEC暴露于TNF-α、IFN-γ和TGF-β1(细胞因子混合物)7天显著降低了ENaC活性(媒介物)。如图12中所用的术语“媒介物”是指向其中引入AA而生成5AA制剂和NC制剂并因此用作AA制剂的阴性对照的溶液。如图12所示，与初始细胞相比，精选5AA制剂(AA：精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)在暴露于TNF-α、IFN-γ和TGF-β1的HBEC中赋予ENaC活性的显著恢复。在一些实施方案中，精选5AA制剂包含8mM精氨酸、8mM赖氨酸、8mM半胱氨酸、8mM天冬酰胺和8mM谷氨酰胺，与初始细胞相比，其在暴露于TNF-α、IFN-γ和TGF-β1的HBEC中赋予ENaC活性的显著恢复。NC制剂(天冬氨酸、苏氨酸和亮氨酸)未改善细胞因子诱导的ENaC活性降低。实际上，相对于暴露于细胞因子混合物和媒介物的HBEC而言，NC制剂在暴露于细胞因子混合物的HBEC中进一步降低了ENaC活性。
如上文所详述，ARDS是冠状病毒疾病-19(COVID-19)和其他病毒性肺感染的常见呼吸系统表现。ARDS由受损的肺泡液清除(AFC)引起，由此导致肺水肿、通气不良和氧饱和度降低。在正常情况下，由纤周流体薄层(约7μm)和粘液构成的气道表面液体(ASL)促成了跨越约75m2表面积的600mL流体并且有利于粘膜纤毛功能从气道清除尘埃和其他外来颗粒。顶端阴离子通道活性和ENaC的重吸收的复杂相互作用形成了使水被动运动的渗透梯度并维持AFC。如例如流感病毒感染中所见的ENaC功能降低引起持续时间超过活跃病毒复制的AFC降低。屏障破坏触发富含蛋白质的流体从肺微血管毛细血管渗出到肺泡中，从而导致非心源性肺水肿和透明膜形成，这严重损害了AFC。
ENaC和屏障功能在COVID-19发病的多个阶段受到影响。促使SARS-CoV-2能够结合血管紧张素转化酶2(ACE2)并进入宿主细胞的II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)、解整合素和金属肽酶结构域17(ADAM17)也会抑制ENaC功能。参见图1。SARS-CoV-2结合ACE2导致ACE2水平降低，从而引起肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)与组织激肽释放酶-激肽系统(KKS)之间失衡并且血管紧张素II(Ang II)和激肽升高。Ang II和激肽既直接抑制ENaC功能，又通过释放促炎性细胞因子(包括TNF-α和IL-6)来抑制ENaC功能。在SARS-CoV-2感染中，模式识别受体(PRR)对病毒相关分子模式的识别能力较差，导致I型干扰素(IFN)产量和病毒清除降低。I型IFN对巨噬细胞功能和IFN-γ激活的抑制子效应受到抑制，导致提早和持续的低水平IFN-γ释放。这一改变的IFN-γ应答促进了过早M1极化，并且揭示了对M2激活的抑制子效应，从而引发Th1和Th2型免疫应答的高级且持续的刺激。患者的临床并发症由持续的先天和适应性免疫应答引起，这些免疫应答随时间推移而放大，从而造成COVID-19特有的细胞因子风暴。
HBEC中的苯扎米尔敏感电流和TEER的高个体变异性。在基于尤斯室的实验设计中，在取自两个肺供体的分化型HBEC中记录基础短路电流(Isc)和跨上皮电阻(TEER)，这些分化型HBEC在snapwell上的气液界面处生长28至35天。使用苯扎米尔(一种强效ENaC阻滞剂)通过以下方式确定ENaC活性：根据在将6μM苯扎米尔添加到细胞顶端侧之后15分钟发生的Isc变化来计算苯扎米尔敏感Isc。时相匹配HBEC的苯扎米尔敏感Isc(38±2.6μA.cm-2、25.7±2.2μA.cm-2；P<0.01，n＝10)和基础TEER(130.5±6.8Ω.cm2，177.7±16Ω.cm2；P<0.03，n＝10)在这两个供体之间存在显著差异。因此，归一化数据用于与图13-18相关的统计分析的所有后续实验。
IFN-γ以剂量和时间依赖性方式改变ENaC活性和上皮屏障。IFN在先天免疫应答期间起到核心作用并且是抵御病毒感染的第一道防线。作为II型IFN家族的一员，IFN-γ具有强效抗病毒活性并且用于确定其对ENaC活性和屏障功能的效应。通过将HBEC与不同浓度的IFN-γ一起温育7天的时间段来测量IFN-γ对苯扎米尔敏感Isc和TEER的剂量依赖性效应。有趣的是，暴露于极低浓度(5x10-4 ng/mL)的IFN-γ将苯扎米尔敏感Isc增加到了基线值的161.62％±9.7％(P<0.04)，但IFN-γ>20ng/mL对苯扎米尔敏感Isc具有负面效应(图13A)。IFN-γ在较低浓度下不影响TEER，但是上皮电阻在0.5ng/mL的浓度下显著增加(图13B)。这些研究表明，在先天免疫应答的早期，IFN-γ促进了ENaC活性和屏障功能以便维持ASL和粘膜免疫的适当内稳态。基于0.5ng/mL(与疾病状况期间观察到的血浆水平类似的浓度)的IFN-γ对TEER的效应，按1ng/mL执行所有后续实验以确保充分的IFN-γ应答。
在16天的时间段内按1ng/mL IFN-γ研究IFN-γ对ENaC活性和屏障功能的时间依赖性效应。苯扎米尔敏感Isc在暴露的最初12天内不变，但在第14天开始减小，并在第16天见到最低ENaC活性(43.7％±7.0％，P<0.04；图13C)。相比之下，IFN-γ在早期改善了上皮电阻，并且在整个研究时间段中随时间推移而逐渐增加TEER(第16天：142.5％±12.3％，P<0.04；图13D)。这些结果表明，IFN-γ在ARDS的早期保持并支持ENaC活性和上皮屏障，但可能随时间推移而变得有害。
低浓度的TNF-α破坏ENaC功能。TNF-α是与COVID-19相关ARDS严重性有关的SARS-CoV-2感染期间释放的早期、强效促炎性细胞因子之一。本文提供的结果表明，TNF-α在与COVID-19患者中所见的血浆水平类似的浓度0.05ng/mL(图14A)下减小了苯扎米尔敏感Isc。苯扎米尔敏感Isc的减小稳定于约10ng/mL处(17.4％±3.6％，P<0.01)。在5x10-5至5x10- 3ng/mL的TNF-α之间观察到屏障功能随TNF-α浓度增加而降低(图14B)。令人惊讶的是，在10与40ng/mL之间，TNF-α引起上皮电阻的显著增加。由于在浓度>0.5ng/mL下苯扎米尔敏感Isc明显减小，因此为所有后续实验使用1ng/mL的TNF-α以确保完全抑制。当将HBEC与1ng/mLTNF-α一起温育16天的时间段时，苯扎米尔敏感Isc从早在第4天开始随时间逐渐减小(81.2％±5.4％，P<0.04)，并且在第16天引起最大减小(39.2％±2.4％，P<0.04；图14C)。在暴露于TNF-α的最初8天内未观察到TEER的显著变化，但上皮电阻随时间增加，其中在第16天测得峰值变化(132.6％±9.0％，P<0.04)(图14D)。这些研究证实，TNF-α在与疾病状况相关的浓度下对ENaC活性和屏障功能的破坏有着显著贡献，这表明TNF-α在ARDS的发病中发挥着关键作用。
高浓度的IFN-γ和TNF-α组合降低了ENaC和屏障功能。HBEC暴露于递增浓度的该组合7天(即，被设计为模拟SARS-CoV-2感染早期的实验条件)使得与对照细胞相比在每种细胞因子均为10ng/mL时苯扎米尔敏感Isc显著减小(48.0％±3.7％，P<0.01)。在存在5和10ng/mL的该组合的情况下TEER降低(图15A、B)。这些结果表明，TNF-α对ENaC功能的抑制效应通过较低浓度的IFN-γ的保护特性来补偿。然而，IFN-γ的补偿效应有可能在较高浓度下减弱，导致增加的ENaC和屏障功能障碍，这进而主要由TNF-α驱动。
IL-4和IL-13引起ENaC和屏障功能的稳健降低。IL-4和IL-13是功能上相关的细胞因子并且在抑制Th1/Th17应答时引发Th2免疫应答。如本文所示，Th2细胞因子与受损的ENaC功能和AFC相关。HBEC与2ng/mL IL-4一起温育14天在早在第4天时就显著减小了苯扎米尔敏感Isc(59.9％±9.4％，P<0.04)。在第10天见到苯扎米尔敏感Isc的最大减小(8.6％±5％，P<0.04)，并且在剩余研究时间段仍然受到抑制(图15C)。类似地，屏障功能在早在第2天时就降低，并且在第10天出现最大抑制(37.5％±2％，P<0.04)(图15D)。对HBEC中的ENaC和上皮屏障功能的早期、重大抑制效应揭示了IL-4在ARDS的病理生理演变中起到关键作用。
IL-4通过正反馈机制来调节并且刺激IL-4和其他Th2细胞因子(诸如IL-13)的进一步释放。因此，使用IL-13(其缺乏此类特性)研究其对疾病发展的贡献。当以剂量依赖性方式将IL-13添加到培养基时，苯扎米尔敏感Isc从0.1ng/mL开始逐渐减小(50.9％±9.6％，P<0.03)并且苯扎米尔敏感Isc在8ng/mL下被完全破坏(图16A)。TEER在2ng/mL IL-13下降低至59.9％±7.6％(P<0.03)，并且在4ng/mL下观察到屏障功能的最大降低(41.3％±6.9％，P<0.03；图16B)。HBEC与20ng/mL IL-13一起温育16天的时间段在第2天将苯扎米尔敏感Isc减小至其基线值的四分之一(25.0％±5％，P<0.03)并且到第8天苯扎米尔敏感Isc受到完全抑制(图16C)。上皮电阻随时间逐渐降低，并在第10天观察到TEER的最大降低(48.7％±3.6％，P<0.03)(图16D)。这些研究一起表明Th2型细胞因子对ENaC和屏障功能的早期、强抑制效应，这可能是ASL清除的早期、渐进失调的原因。由于已在患有COVID-19相关ARDS的患者中检测到高浓度的这两种细胞因子(IL-4和IL-13)，因此AFC的渐进受损可引起肺水肿和ARDS的发作。
TGF-β1降低了ENaC活性，但不影响屏障功能。多功能细胞因子TGF-β1(其通常参与生长、增殖和分化)也是抑制促炎性细胞因子(诸如IFN-γ、TNF-α和白介素)的分泌和激活的抗炎Treg免疫应答的一部分。TGF-β1尽管具有免疫抑制性质，但也可充当趋化因子并引发炎症。如本文所示，TGF-β1使ENaC转运失调并且与参与COVID-19相关ARDS的发病的促炎性细胞因子同步工作。
HBEC与递增浓度的TGF-β1一起温育7天，显示出在0.5ng/mL下，TGF-β1将苯扎米尔敏感Isc减小至70.4％±2.5％(P<0.04)，并且在50ng/mL下减小至1.5％±0.3％(P<0.04)(图17A)。相比之下，TEER在低浓度的TGF-β1下不受影响，但从5ng/mL TGF-β1开始逐渐增加(图17B)。为了确保抑制苯扎米尔敏感Isc，在后续时间依赖性实验中使用1ng/mL的TGF-β1达16天的最长时间段。TGF-β1从第4天开始减小苯扎米尔敏感Isc(64.4％±8.3％，P<0.04)，并且到第16天苯扎米尔敏感Isc减小至对照值的20.3％±5.8％(图17C)。TEER在研究的时间段内保持不受影响(图17D)。这些结果表明TGF-β1对ENaC活性具有剂量依赖性效应，但对上皮屏障功能没有效应。因此，TGF-β1被鉴定为影响AFC和向ARDS进展的细胞因子。
AA-EC01改善了高浓度IL-13所破坏的ENaC活性。.如本文所述，本发明人开发了包含增加苯扎米尔敏感Isc的五种氨基酸的制剂(AA-EC01)并且在与20ng/mL的IL-13一起温育14天(即，完全破坏ENaC功能的浓度和暴露时间)的HBEC中测试了该制剂改善ENaC表达和功能的能力。IL-13激发的HBEC暴露于尤斯室中的AA-EC01引起苯扎米尔敏感Isc增加至33.9％±3.6％(P<0.02)，相比之下，在浸没于林格溶液中的IL-13激发的HBEC中为4.0％±1.7％in(图18A)。当IL-13激发的细胞暴露于基于其对苯扎米尔敏感Isc的抑制效应来选择的一组氨基酸(阴性对照；AANC)时，ENaC活性仍然较低(3.4％±2.5％，P＝NS；图18A)。ENaC功能在与AA-EC01接触之后的30分钟内改善，但在研究期间未完全恢复。相比之下，IL-13诱导的屏障破坏在AA-EC01作用下保持不变(图18B)。
AA-EC01在存在IL-13的情况下恢复了顶端ENaC表达。本文提供的结果证实，Th2细胞因子IL-4和IL-13是造成HBEC中的ENaC活性失调的主要细胞因子，并且AA-EC01在细胞因子温育后改善了ENaC功能(图18A)。HBEC的免疫荧光成像显示出沿着纤周膜和顶端膜的ENaC-α亚基表达。HBEC暴露于IL-13达14天显示出ENaC蛋白从有纤毛和无纤毛细胞的纤周膜和顶端膜完全易位至近顶端隔室和细胞质。用AA-EC01处理一小时增加了沿着顶端膜和纤周膜的ENaC-α的免疫荧光。这些观察结果表明，AA-EC01至少通过恢复顶端膜和纤周膜处的ENaC的表达来改善ENaC功能。
AA-EC01减少COVID-19细胞因子组合所触发的IL-6分泌。IL-6是多种细胞类型(包括上皮细胞、组织巨噬细胞和单核细胞)对感染和组织损伤作出反应而产生的多效促炎性细胞因子。最初，IL-6是将中性粒细胞和其他炎性细胞吸引至炎症部位的急性期蛋白的关键刺激因子。随后，IL-6不仅促进Th2细胞分化而表达IL-4，而且激活Th17型应答，同时破坏Th17/Treg平衡(这是慢性炎症和自体免疫的先决条件)。在SARS-CoV-2感染期间，支气管上皮细胞对升高的Ang II作出反应而一起产生IL-6和其他促炎性细胞因子诸如IL-1β和TNF-α。使用免疫荧光显微术，本发明人证实在暴露于由IFN-γ、TNF-α和TGF-β1组成的细胞因子组合达7天时间段之后IL-6表达沿着HBEC的纤周膜增加。当用AA-EC01处理细胞因子温育的细胞一小时时，IL-6相关免疫荧光信号在顶端膜处显著减少。基于这些研究，AA-EC01的有益效应不限于增强ENaC功能，而是还包括对在COVID-19疾病演变中起到关键作用的细胞因子的免疫调节特性。
AA-EC01减少IL-13诱导的MUC5AC分泌。MUC5AC是通常由上皮表面的杯状细胞产生的胶凝性、粘性的粘蛋白。MUC5AC表达在肺损伤和炎症期间大幅增加，导致进行性气道阻塞、粘膜防御减弱和肺功能下降。MUC5AC是哮喘和囊性纤维化发病的重要促成因子并且也会由与炎症相关的许多病原体和内源性因子上调。在呼吸系统病毒感染期间，TNF-α和Th2型细胞因子的产量增加尤其会触发MUC5AC的过表达。本发明人使用免疫荧光成像揭示了杯状细胞增生以及在IL-13温育后MUC5AC表达和分泌增加。用AA-EC01处理一小时减少受影响的细胞中的细胞内和细胞外MUC5AC，这表明AA-EC01具有调节支气管上皮细胞中的粘液产生的潜能。由于COVID-19危重患者表现出与其痰液中的高水平MUC5AC相关的气道阻塞，因此MUC5AC也可用作AA-EC01的靶标。
概括地说，PRR识别SARS-CoV-2相关分子模式的方式的极端差异引起了先天和适应性免疫应答的不可预测且高度可变的激活以及相关细胞因子(IFN、Th1、Th2、Th17和Treg)的释放。在免疫应答递增的情况下，患者表现出肺水肿或ARDS，这是细胞因子风暴综合征的表现形式(图1)。本文提供的结果证实，这些细胞因子损害气道上皮中的ENaC和屏障功能。ENaC功能对ASL调节至关重要，并且肺泡上皮表面上的流体薄层的精确维持对于有效气体交换很关键。屏障缺陷导致肺泡毛细血管通透性过高以及富含蛋白质的流体从肺毛细血管渗漏到间质和肺泡空间中，从而引起氧饱和度降低。目前，ARDS的治疗大多是支持性的并且由补氧和通气机支持组成。通气机递送的氧部分地因肺泡内过多流体的氧合而耗尽，从而减少可供跨血气屏障交换的氧并且解偶联与过氧化物和过氧亚硝酸根的形成相关的内皮一氧化氮合酶(eNOS)。随着病症进展，过氧亚硝酸根引起各种细胞蛋白(包括ENaC和屏障蛋白)中的酪氨酸残基的不可逆硝化，导致胶原沉积、纤维化和组织重塑。机械通气对肺实质造成附加伤害，导致通气机所致肺损伤，这可解释受影响的患者的高死亡率(65％至88％)。此外，在插管中存活下来的患者表现出肺功能降低并形成明显瘢痕。因此，支持性治疗会使肺损伤恶化并且使患者脱离通气机支持会随着时间推移而变得越来越困难。肺泡积液是与SARS-CoV-2和其他感染相关的ARDS的发病和死亡的重要原因，但对于有效靶向ENaC和屏障功能的治疗剂而言，只有很少选项可供使用。
如本文所示，AA-EC01增强了HBEC中的ENaC功能，因此是在临床干预中用于改善AFC并治疗肺水肿和ARDS的有前景的治疗制剂。在暴露于细胞因子风暴综合征特有的病理上高浓度的细胞因子达足以破坏ENaC功能的时间段的HBEC中，AA-EC01显示出增强了ENaC功能。另外，AA-EC01减少IL-6和MUC5AC的产生和分泌。
TNF-α是一种强效促炎性细胞因子，它具有存在多种内稳态和发病机制的多效性效应并且其水平在ARDS期间升高。TNF-α降低了肺泡上皮细胞中的α-β-和γ-ENaC mRNA、蛋白水平和阿米洛利敏感性Isc。TNF-α下调紧密连接蛋白的表达，同时增加肺泡通透性。在本发明研究中，较低浓度的TNF-α对苯扎米尔敏感Isc没有效应，而较高浓度引起ENaC活性的显著降低。相比之下，在较低浓度下见到TEER的降低，而较高浓度增加了上皮电阻。
ENaC功能的失调从切割并激活SARS-CoV-2的TMPRSS2开始，因为ENaC具有与SARS-CoV-2刺突蛋白的切割位点类似的切割位点。升高的Ang II和激肽进一步降低了ENaC功能。SARS-CoV-2感染期间释放的各种细胞因子对ENaC和屏障功能的抑制是ARDS的主要原因并且在病毒停止其复制很久以后持续存在。在本发明研究中，HBEC与较低浓度的IFN-γ一起长期温育抑制了ENaC功能。在与IFN-γ一起温育≥14天时HBEC中苯扎米尔敏感Isc的逐渐减小可有助于解释SARS-CoV-2中观察到的疾病进展。与患有轻微疾病的那些患者相比，重症COVID-19患者中已报告了升高的血浆IFN-γ和IL-6水平。IFN-γ很少单独起作用，并且与TNF-α一起显示出上调巨噬细胞中的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。这点特别重要，因为eNOS解偶联触发了过氧化物和过氧亚硝酸根形成，这会破坏蛋白质，导致ENaC和屏障功能降低。这些效应在补氧和通气支持(其中过氧化物形成增加)时加重。
本发明人研究了HBEC上的IFN-γ和TNF-α的组合对苯扎米尔敏感Isc和TEER的效应。本文提供的结果证实，10ng/mL的这两种细胞因子的组合协同工作。TNF-α在单独时降低了ENaC活性，但在与IFN-γ组合时，TNF-α和IFN-γ的组合还影响屏障功能。这些研究表明，TNF-α在COVID-19的早期，特别是在存在IFN-γ的情况下对ENaC和屏障功能造成重大损伤。
Treg细胞激活TGF-β和IL-10的释放，通过在炎性状态期间抑制CD8+、CD4+T细胞、单核细胞、NK细胞和B细胞来保持免疫内稳态，并且在防止自体免疫中起到关键作用。Treg细胞的抑制效应在COVID-19期间减弱。TGF-β1已知能降低α-亚基的阿米洛利敏感性ENaC活性、ENaC mRNA和蛋白质表达。然而，TGF-β1具有多效性效应并且其功能取决于有关联的细胞因子和炎性状态。在COVID-19的发病期间，细胞因子的复杂组合使得更难确定TGF-β1对ENaC和屏障功能的具体效应。在本发明研究中，独立于其他细胞因子测试的TGF-β1引起在早在第4天时在浓度≥0.5ng/mL下苯扎米尔敏感Isc减小，并且对TEER没有抑制效应。这些效应与对IFN-γ和TNF-α作出反应而观察到的那些效应类似。
SARS-CoV-2感染可引起受损的先天免疫应答，其特征在于早期Th1型激活外加对Th2应答的抑制子效应降低，从而在Th2应答占优势的情况下造成Th1/Th2失衡。因IFN-γ产生减弱引起的早期Th2激活使M2巨噬细胞激活，释放Th2细胞因子并且增加精氨酸酶活性。精氨酸酶途径的激活通过减少精氨酸对NOS的可用性而降低了NO介导的细胞毒性，并且增强了胶原合成、增殖、纤维化和组织重塑。IL-4是主要Th2细胞因子，其具有进一步增强IL-4应答和其他Th2细胞因子(IL-5和IL-13)的应答的正反馈应答。IL-4引发从嗜碱性粒细胞分泌IgE，以此作为变应性应答的一部分，IL-5招募肥大细胞和嗜酸性粒细胞，并且IL-13主要通过激活MUC5AC来增加上皮细胞的粘液产生。IL-4还降低ENaC的β-和γ-亚基的表达，并且IL-4和IL-13抑制阿米洛利敏感性Isc。本文提供的结果证实，在研究的所有细胞因子中，Th2细胞因子在COVID-19疾病进展的早期对苯扎米尔敏感Isc和TEER具有特别重大的负面效应，而IFN-γ和TNF-α对TEER没有效应。因此，在COVID-19发病期间，一些个体中提早转变成Th2免疫应答可以解释更严重的肺部事件，包括ARDS。
本文提供的结果表明，IL-13抑制了ENaC和屏障功能，而AA-EC01增加了ENaC活性和表达，从而抵消了IL-13介导的不良反应。本发明研究进一步证实，AA-EC01促进了ENaC从细胞质易位至顶端膜，其在此具有功能活性。本文所述的免疫组织化学研究揭示，AA-EC01还可通过增加ENaC转录和/或ENaC蛋白质合成来增加ENaC活性。
Th2型细胞因子(特别是IL-13)的激活也是粘蛋白产生和分泌增加的主要诱因，并且MUC5AC在阻塞性呼吸系统症状(诸如重症COVID-19患者中观察到的那些症状)的发病中具有关键作用。在IL-13暴露后的HBEC中AA-EC01对细胞内MUC5AC表达和分泌的抑制效应表明AA-EC01对粘液产生具有调节效应。
IL-6(一种由肺内居留细胞分泌的促炎性细胞因子)在细胞因子风暴期间也起到核心作用并且代表COVID-19患者的预后指标。AA-EC01减少HBEC中细胞因子诱导的IL-6分泌的能力表明该制剂具有超出其对ENaC活性的增强的更广泛特性。
由于还没有可减少过多肺泡积液的已批准药物，AA-EC01为未满足且迫切的临床需求提供了解决方案。本文提供的结果支持使用AA-EC01作为用于治疗ARDS和/或用于降低与ARDS相关的肺部并发症的可能性和/或严重性的治疗剂。由于AA-EC01由具有治疗特性的氨基酸的功能组合组成，因此制剂可用作独立API或用作与其他治疗选项联用的补充API。AA-EC01具有优异的安全特性，因为包括在其中的每种氨基酸是“公认安全的”(GRAS)并且预期不会表现出任何副作用或对于其他API是禁忌的。因此，AA-EC01与护理标准API联用可使标准护理治疗的效果最大化，从而降低补氧和通气支持的持续时间，使长期肺部并发症最小化，并且增加受影响的患者的存活率。相同的推理适用于本文所述的其他相关氨基酸制剂[诸如AAF03、AAF07和精选5AA制剂(精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)]，所述制剂至少部分通过增加ENaC活性来减少过多肺泡积液。
用于治疗ARDS的API包括：肺保护性通气(低潮气量：6ml/kg；ARDS网络指南规定的适度呼气末正压；小于30cm水柱的平台压)；俯卧位；高频振荡通气；保守流体策略；ARDS早期给予低剂量皮质类固醇；体外膜氧合；外源性表面活性物质(显示出对儿科人群特别有益；四种类型：非离子、阴离子、阳离子、两性)；免疫调节剂(例如，白介素-1受体拮抗剂、干扰素γ和TNF-α抑制剂)；法匹拉韦(广谱RNA聚合酶抑制剂)；洛匹那韦/利托那韦(HIV蛋白酶抑制剂)；乌米诺韦(阿比朵尔；抑制病毒性相互作用并经由ACE2与宿主细胞结合)；氯喹/羟基氯喹(抗疟药)；神经肌肉剂(NMA)可用于改善患者-通气机同步性并辅助严重低氧血症患者的机械通气；吸入性一氧化氮(NO；内源性血管扩张剂)；前列腺素类：包括前列腺环素类(引起肺血管舒张的花生四烯酸衍生物)；中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(例如，地来司他)；抗氧化剂(例如，谷胱甘肽及其前体N-乙酰半胱氨酸)；β2激动剂；雾化沙丁胺醇；抗凝血剂(雾化肝素或静脉肝素)；采用间充质基质细胞的基于细胞的治疗；他汀类；胰岛素；以及干扰素β。在联合治疗用途、方法和药剂中，本文所述的氨基酸制剂可与当前用于治疗罹患ARDS的受试者的上列治疗性干预中的至少一者联用。
支气管哮喘是由支气管气道阵发性狭窄引起的呼吸困难、胸闷和喘息的阵发性发作。哮喘的特征在于气道炎症、阻塞和高反应性。支气管哮喘的病理特征包括支气管收缩和炎症。因此用于治疗哮喘的API以预防或逆转支气管收缩和/或减轻气道炎症为目标。
下文将详述用于治疗哮喘的API。支气管树的平滑肌主要含有β2受体，所述β2受体的刺激引起支气管扩张。拟交感(引起β2肾上腺素受体的刺激)的API可用于治疗支气管哮喘，尤其是主要作用于β2受体的那些。此类API包括：肾上腺素、麻黄碱、异丙肾上腺素、沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇、比托特罗、奥西那林、特布他林、利托君、丙卡特罗、异他林、福莫特罗、吡布特罗和沙美特罗。可经由注射或吸入器来施用肾上腺素。可皮下施用肾上腺素(0.3至0.5mL的1:1000溶液)治疗哮喘，所述施用可在15至20分钟后重复。其对于老年受试者以及患有缺血性心脏病、心律失常或高血压的那些受试者是禁忌的。可通过口服、注射或吸入来施用沙丁胺醇。当通过口服施用时，其被胃肠道很好地吸收并且支气管扩张在约1小时后发生并维持6至8小时。当通过吸入施用时，其在约15分钟后起作用并保持效力3至4小时。通过皮下注射，其药效在5分钟后显现并持续3至4小时。甲基黄嘌呤药物包括：茶碱、氨茶碱、可可碱、咖啡因、胆茶碱、二羟丙茶碱、己酮可可碱和茶碱乙酸。氨茶碱是治疗出现矛盾性腹肌和隔肌疲劳的患者的处方药。氨茶碱输注可有效改善膈肌收缩性。肥大细胞稳定剂包括：色甘酸钠、奈多罗米钠和酮替芬。此类抗炎药防止炎性细胞，特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和上皮细胞的激活，但没有直接支气管扩张剂活性。它们可有效治疗轻度持续性哮喘，特别是在运动为诱发因素的时候。色甘酸钠来源于称为凯林(khellin)的埃及植物。其抑制从肥大细胞释放化学物质并因此预防哮喘发作的所有阶段。其可每天施用3至4次。粉末形式的该药物可为吸入性的并且已被开发为1％Intel溶液，该溶液在喷雾装置中使用并且现已可供在Intel袖珍吸入器中使用。皮质类固醇包括：曲安西龙、强的松、莫米松、甲基强的松龙、氢化可的松、氟替卡松、氟尼缩松、地塞米松、布地奈德和倍氯米松。皮质类固醇是有效抗炎药。皮质类固醇减轻炎症，从而控制哮喘表现并防止哮喘恶化。可的松吸入剂可使哮喘局部缓解且副作用最小。可的松可有效治疗哮喘和持续性异常呼吸。5-脂氧合酶抑制剂(例如，齐留通)和白三烯D4(LTD4)受体拮抗剂(例如，扎鲁司特和孟鲁司特)也常规用于治疗哮喘。白三烯通过收缩平滑肌细胞、吸引炎性细胞并增强粘液分泌和血管通透性来诱发哮喘表现和气道阻塞。在联合治疗用途、方法和药剂中，本文所述的氨基酸制剂可与当前用于治疗罹患哮喘的受试者的上列治疗性干预中的至少一者联用。
变应性鼻炎特有的症状包括：鼻塞、鼻痒、鼻液溢(鼻中流出过多粘液)和打喷嚏。第二代口服抗组胺药和鼻内皮质类固醇是主要治疗手段。一般来讲，变应性鼻炎的治疗选项以症状减轻为目标。此类治疗选项包括规避措施(如果症状与暴露于变应原相关，则避开变应原)；API诸如口服抗组胺药、鼻内皮质类固醇、减充血药、白三烯受体拮抗剂和鼻内cromones；以及变应原免疫治疗。一些受试者中可能有用的其他治疗包括减充血药和口服皮质类固醇。还使用间歇全身性皮质类固醇和减充血药(口服和外用)。非处方鼻腔盐水喷雾剂或自制盐水溶液也可用于从鼻道冲洗刺激物并且有助于使粘液变稀薄并舒缓鼻道膜。在联合治疗用途、方法和药剂中，本文所述的氨基酸制剂可与当前用于治疗罹患变应性鼻炎的受试者的上列治疗性干预中的至少一者联用。
粘液溶解剂是使粘液变稀薄并由此使粘液更易排出体外的API。粘液溶解剂用于治疗以过多或浓稠粘液为特征的呼吸系统病症或鼻道病症。粘液溶解剂可按片剂或糖浆制剂的形式口服施用或通过喷雾器吸入。一些更常见类型的粘液溶解剂包括：美清痰(愈创甘油醚)、羧甲司坦、百慕时(阿法链道酶)、厄多司坦、半胱甲酯、溴己新高渗盐水和甘露醇粉末。在联合治疗用途、方法和药剂中，本文所述的氨基酸制剂可与至少一种粘液溶解剂(诸如上列的那些)联用。
如本文所用，短语“增加ENaC活性”可用于指ENaC活性增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％或500％。
如本文所用，短语“增加ENaC活性”可用于指ENaC活性增加一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍、十五倍、二十倍、三十倍、四十倍或五十倍。
如本文所用，短语“增加ENaC活性”可用于指ENaC活性增加而使ENaC活性至少部分地恢复到特定细胞或组织中的正常水平，使得ENaC活性恢复到正常ENaC活性的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
如本文所述，可通过例如在尤斯室中测量苯扎米尔/阿米洛利敏感电流来确定ENaC活性的增加或降低。基于本文提供的结果，AAF01、AAF03、AAF07、精选5AA制剂(精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)被选择为示例性制剂，在本文所述的重现呼吸窘迫特征的模型系统中，所述示例性制剂相对于阴性对照溶液(被确立为对ENaC活性没有效应)增加了ENaC活性。
在说明书和权利要求自始至终，下述术语采取本文明确关联的含义，除非上下文另有明确说明。如本文所用，表述“在一个实施方案中”，“在实施方案中”和“在一些实施方案中”不一定是指相同的一个或一些实施方案，虽然可以是指相同的一个或一些实施方案。此外，如本文所用，表述“在另一个实施方案中”和“在一些其它实施方案中”不一定是指不同的实施方案，虽然可以是指不同的实施方案。本公开的所有实施方案旨在可组合而不偏离本公开的范围或精神。
如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则术语“基于”不具有排他性并允许基于未描述的额外因素。另外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述”的含义包含复数指代。“在……中”的含义包含“在……中”和“在……上”。
药剂(或包含此类药剂的组合物)的“有效量”或“有效剂量”是指例如在根据所选择的施用剂型、途径和/或时间表递送到细胞或生物体时足以实现期望的生物和/或药理效应的量。短语“有效量”和“治疗有效量”可互换使用。如本领域的普通技术人员将理解的那样，有效的特定试剂或组合物的绝对量可根据诸如所需的生物学或药理学终点、待递送的试剂、靶组织等因素而变化。本领域的普通技术人员将进一步理解，在各种实施方式中，“有效量”可以单个剂量或通过使用多个剂量与细胞接触或施用于受试者。在一些实施方案中，有效量是至少部分地通过增加至少一个细胞中的ENaC活性来减少过多积液的量。在一些实施方案中，有效量是至少部分地通过增加有此需要的受试者中的ENaC活性来减少有此需要的受试者中的过多积液的量。在其一些实施方案中，有效量是减少有此需要的受试者的肺部或鼻道中的过多积液的量。在一些实施方案中，有效量是减轻ARDS、哮喘或变应性鼻炎的至少一种症状的量。
如本文在治疗受试者的上下文中所用的“治疗(Treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和类似术语是指提供受试者的医疗和/或外科管理。治疗可包括但不限于向受试者施用药剂或制剂(例如，药物制剂)。如本文所用，术语“治疗(treatment)”或其任何语法变体(例如，治疗(treat)、治疗(treating)和治疗(treatment)等)包括但不限于减轻疾病或病症的症状；和/或减少、压制、抑制、减轻或影响疾病或病症的进展、严重性和/或范围。
治疗效果还可包括降低疾病或疾病的至少一种症状或表现的发生或复发的可能性。可向患有疾病或相对于普通人群的一员而言患病风险增加的受试者施用治疗剂或其制剂。在一些实施方案中，可出于维持目的而向受试者施用治疗剂或其制剂以减轻或消除疾病的至少一种症状。在一些实施方案中，可向已患疾病但不再表现出疾病迹象的受试者施用治疗剂或其制剂。可施用药剂或其制剂，例如以降低疾病复发的可能性。可预防性地(即，在出现疾病的任何症状或表现之前)施用治疗剂或其制剂。
“预防性治疗”是指向未患疾病或未表现出疾病迹象的受试者提供医疗和/或外科管理，例如以降低发生疾病的可能性或在发生疾病时减轻疾病的严重性。受试者可能已被鉴定为处于患疾病的风险之中(例如，相对于普通人群而言风险增加或被鉴定为具有增加患疾病的可能性的风险因素)。
如本文所用，术语“改善(amelioration)”或其任何语法变化(例如，改善(ameliorate)、改善(ameliorating)和改善(amelioration)等)包括但不限于延迟疾病或病症的发作或减轻其严重性。如本文所用，改善不需要完全没有症状。
术语“病症”、“疾病”和“障碍”可互换使用。
在各种实施方案中，“受试者”可能是任何脊椎动物生物体。受试者可能是例如出于实验、诊断和/或治疗目的而向其施用药剂的个体，或者从其获得样品的个体，或对其执行程序的个体。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人类；非人灵长类(例如，猿、黑猩猩、猩猩、猴)；或驯养动物，诸如狗、猫、兔、牛、公牛、马(包括例如马驹)、猪、绵羊、山羊、美洲驼、小鼠和大鼠。在一些实施方案中，受试者是人类。人类或其他哺乳动物可为任一性别并且处于任何发育阶段。在一些实施方案中，人类或其他哺乳动物是婴孩(包括早产儿)。在一些实施方案中，受试者已被确诊为患有ARDS、哮喘或变应性鼻炎。
根据上文，ENaC在分娩期间起到重要作用。胎儿中充满流体的肺泡在分娩时通过ENaC表达和功能的激增而转化为充满空气的肺泡。因此，本文所述的示例性制剂对早产儿(在预产期前过早出生的婴儿)或天生就患有以呼吸系统的发育障碍为特征的疾病或障碍的婴儿具有直接益处。相同的推理适用于早产幼小动物和天生就患有以呼吸系统的发育障碍为特征的疾病或障碍的幼小动物。
如本文所用，术语“婴儿”是指年龄范围从出生到一周岁的人类小孩。如本文所用，术语“婴孩”是指年龄范围从出生到四周岁的人类小孩，因此涵盖新生儿、婴儿和幼儿。
所谓“可忽略的量”意指存在的氨基酸不会减少肺部或鼻道中的积液。或在一些实施方案中，即使氨基酸存在于制剂中，其也不会以将影响有此需要的受试者的肺部或鼻道中的积液的量存在。在一些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于100mg/l、50mg/l、10mg/l、5mg/l、1mg/l、0.5mg/l、0.1mg/l或0.01mg/l的量。在一些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于100mg/l的量。在一些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于50mg/l的量。在一些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于10mg/l的量。在一些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于5mg/l的量。在一些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于1mg/l的量。在一些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于0.5mg/l的量。在一些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于0.1mg/l的量。在一些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于0.01mg/l的量。
术语“氨基酸”涵盖含有胺(-NH2)官能团、羧基(-COOH)官能团和特定于每个氨基酸的侧链(“R”)基团的所有已知氨基酸。“氨基酸”涵盖由人类基因组编码的21个氨基酸(即，蛋白原性氨基酸)、由细菌或单细胞生物编码或产生的氨基酸以及天然衍生的氨基酸。出于本公开的目的，除非另有说明，否则具有碱性侧链的氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)的共轭酸形式或具有酸性侧链的氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)的共轭碱形式基本上相同。“氨基酸”还涵盖在例如尤斯室测定法中在增加ENaC活性方面保持基本上相同的活性的其衍生物和类似物。所述衍生物和类似物可以是例如对映异构体，并且包括氨基酸的D形式和L形式。所述衍生物和类似物可以是“天然”或“非天然”氨基酸的衍生物(例如，β-氨基酸、高氨基酸、脯氨酸衍生物、丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的半胱氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸衍生物、线性核心氨基酸和N-甲基氨基酸)，例如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、碘化半胱氨酸、正亮氨酸或正缬氨酸。所述衍生物和类似物可包含保护基团(α-氨基、α-羧酸基团或合适的R基团，其中R含有NH2、OH、SH、COOH或其他反应性官能团)。其他氨基酸衍生物包括但不限于通过例如氨基酸的酰化、甲基化、糖基化和/或卤化合成的那些。这些包括例如β-甲基氨基酸、C-甲基氨基酸和N-甲基氨基酸。本文所述的氨基酸可以游离氨基酸形式存在。术语“游离氨基酸”是指不属于肽或多肽的一部分(例如，不通过肽键连接至另一个氨基酸)的氨基酸。游离氨基酸在溶液中呈游离形式(而不是经由例如二肽键连接到至少一种其他氨基酸)，但可与溶液中的盐或其他组分缔合。
如本文所用，术语“盐”是指任何和所有盐，并且涵盖药学上可接受的盐。
术语“载体”可以指与本文所述的制剂一起施用的任何稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。合适的药物载体的示例在Remington’s Essentials of Pharmaceuticals，第21版，Felton编，2012年中有所描述，该文献以引用方式并入本文。
要加入到本文所述的制剂中的示例性盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁或柠檬酸三钠、碳酸氢钠、使用磷酸一钠、二钠或三钠的葡萄糖酸钠磷酸盐缓冲液或它们的任何组合。
示例性稀释剂包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠以及它们的混合物。
用于制造本文所述药物制剂的药学上可接受的赋形剂包括惰性稀释剂、分散剂和/或粒化剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘结剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。所述组合物中还可以存在赋形剂诸如可可脂和栓剂蜡、着色剂，包衣剂和香味剂。
达到有效量所需的氨基酸制剂或组合物的确切量将在受试者之间变化，具体取决于例如受试者的物种、年龄和一般状况、施用方式等。有效量可以包含在单剂量(例如，单个口服剂量)或多剂量(例如，多个口服剂量)中。在一些实施方案中，当向受试者施用多个剂量或将多个剂量施用于组织或细胞时，多个剂量中的任意两个剂量包含不同量或基本上相同量的本文所述的氨基酸组合物。在一些实施方案中，当向受试者施用多个剂量或将多个剂量施用于组织或细胞时，向受试者施用多个剂量或将多个剂量施用于组织或细胞的频率根据需要为每天三剂、每天两剂、每天一剂、每隔一天一剂、每三天一剂、每周一剂、每两周一剂、每三周一剂或每四周一剂。在一些实施方案中，向受试者施用多个剂量或将多个剂量施用于组织或细胞的频率是每天一剂。在一些实施方案中，向受试者施用多个剂量或将多个剂量施用于组织或细胞的频率是每天两剂。在一些实施方案中，向受试者施用多个剂量或将多个剂量施用于组织或细胞的频率是每天三剂。在一些实施方案中，当向受试者施用多个剂量或将多个剂量施用于组织或细胞时，所述多个剂量的第一剂量与最后剂量之间的持续时间是三分之一天、二分之一天、一天、两天、四天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、六个月、九个月、一年、两年、三年、四年、五年、七年、十年、十五年、二十年或者受试者、组织或细胞的整个生命期。在一些实施方案中，所述多个剂量的第一剂量与最后剂量之间的持续时间是三个月、六个月或一年。在一些实施方案中，所述多个剂量的第一剂量与最后剂量之间的持续时间是受试者、组织或细胞的整个生命期。
在一些实施方案中，本文所述的剂量(例如，单个剂量或多个剂量中的任何剂量)独立地包括0.1μg至1μg之间、0.001mg至0.01mg之间、0.01mg至0.1mg之间、0.1mg至1mg之间、1mg至3mg之间、3mg至10mg之间、10mg至30mg之间、30mg至100mg之间、100mg至300mg之间、300mg至1,000mg之间、1g至10g之间、1g至15g之间或1g至20g之间(包括端值在内)的本文所述氨基酸制剂。在一些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括1mg至3mg之间(包括端值在内)的本文所述氨基酸制剂。在一些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括3mg至10mg之间(包括端值在内)的本文所述氨基酸制剂。在一些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括10mg至30mg之间(包括端值在内)的本文所述氨基酸制剂。在一些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括30mg至100mg之间(包括端值在内)的本文所述氨基酸制剂。
本文所述的剂量范围为将本文所述药物制剂或组合物施用于成人提供了指导。施用于例如婴孩、儿童或青少年的量可以由医师或本领域技术人员确定，并且可以小于或等于施用于成人的量。
本文引用的所有在先专利、出版物和测试方法均通过引用整体并入。
一些实施方案的详细说明
本文所述的每种氨基酸制剂(例如，药物制剂)可用于治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的方法中，可用于治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎，和/或可用于制备治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的药剂。ARDS的特征在于阻碍肺部发挥功能的过多肺泡积液。哮喘也可表现出阻碍肺部发挥功能的过多积液的特征。变应性鼻炎的特征在于鼻道中的过多积液。本文所述的每种氨基酸制剂可用于在这些病症中减少积液，所述能力至少部分地由增加肺部或鼻道中的ENaC活性的能力来赋予。
在其一些实施方案中，对于本文所述的每种氨基酸制剂(例如，药物制剂)而言，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸的游离氨基酸。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸中的至少一者或它们的任何组合的游离氨基酸。
在一些实施方案中，该制剂包含游离氨基酸，基本上由游离氨基酸组成或由游离氨基酸组成，其中所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)和精氨酸(R)，以及谷氨酰胺(Q)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)或天冬酰胺(N)中的至少一者或它们的任何组合的游离氨基酸。其示例性游离氨基酸制剂包括AAF01[赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)]、AAF07[K、R、Q、Y]、AAF03[K、R、Q、W]、AAF02[K、R、W]和精选5AA制剂[K、R、Q、C、N]。在一些实施方案中，其此类游离氨基酸制剂包括AAF01[赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)]、AAF07[K、R、Q、Y]、AAF03[K、R、Q、W]和精选5AA制剂[K、R、Q、C、N]。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸的游离氨基酸。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸中的至少一者或它们的任何组合的游离氨基酸。
在一些实施方案中，该制剂包含游离氨基酸，基本上由游离氨基酸组成或由游离氨基酸组成，其中所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q)，以及色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)或天冬酰胺(N)中的至少一者或它们的任何组合的游离氨基酸。其示例性游离氨基酸制剂包括AAF01[赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)]、AAF07[K、R、Q、Y]、AAF03[K、R、Q、W]、AAF02[K、R、W]和精选5AA制剂[K、R、Q、C、N]。在一些实施方案中，其此类游离氨基酸制剂包括AAF01[赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)]、AAF07[K、R、Q、Y]、AAF03[K、R、Q、W]和精选5AA制剂[K、R、Q、C、N]。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸的游离氨基酸。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸中的至少一者或它们的任何组合的游离氨基酸。
在一些实施方案中，该制剂包含游离氨基酸，基本上由游离氨基酸组成或由游离氨基酸组成，其中所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q)，以及色氨酸(W)或酪氨酸(Y)中的至少一者或它们的组合的游离氨基酸；或半胱氨酸(C)或天冬酰胺(N)中的至少一者或它们的组合的游离氨基酸。其示例性游离氨基酸制剂包括AAF01[赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)]、AAF07[K、R、Q、Y]、AAF03[K、R、Q、W]、AAF02[K、R、W]和精选5AA制剂[K、R、Q、C、N]。在一些实施方案中，其此类游离氨基酸制剂包括AAF01[赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)]、AAF07[K、R、Q、Y]、AAF03[K、R、Q、W]和精选5AA制剂[K、R、Q、C、N]。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸的游离氨基酸。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸中的至少一者或它们的任何组合的游离氨基酸。
在一些实施方案中，该制剂包含游离氨基酸，基本上由游离氨基酸组成或由游离氨基酸组成，其中所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q)，以及色氨酸(W)或酪氨酸(Y)中的至少一者或它们的组合的游离氨基酸。其示例性游离氨基酸制剂包括AAF01[赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)]、AAF07[K、R、Q、Y]和AAF03[K、R、Q、W]。在其一些实施方案中，氨基制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)或丝氨酸(S)的游离氨基酸。在其一些实施方案中，氨基制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)或丝氨酸(S)中的至少一者或它们的任何组合。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸的游离氨基酸。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸中的至少一者或它们的任何组合的游离氨基酸。
在一些实施方案中，该制剂包含游离氨基酸，基本上由游离氨基酸组成或由游离氨基酸组成，其中所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q)，以及半胱氨酸(C)或天冬酰胺(N)中的至少一者或它们的组合的游离氨基酸。其示例性游离氨基酸制剂包括精选5AA制剂[K、R、Q、C、N]。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸的游离氨基酸。在其一些实施方案中，氨基酸制剂不包含苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)或N-乙酰半胱氨酸中的至少一者或它们的任何组合的游离氨基酸。
AAF01是本文所述的示例性氨基酸制剂。用于确定由此涵盖的不同组合的数量的公式为2n-1，其中n等于精选氨基酸列表中的不同氨基酸的数量(例如，5种氨基酸)。因此赖氨酸、色氨酸、精氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺(AAF01的游离氨基酸)的不同组合的总数为31种不同组合(25-1)。为了简单起见，每种精选氨基酸用如下氨基酸的标准单个大写字母来指代：赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)。如下在列表2中呈现了不同组合：五AA组：K、W、R、Y、Q(AAF01)。四AA子组：K、W、R、Y；K、W、R、Q(AAF03)；K、W、Y、Q；K、R、Y、Q(AAF07)；以及W、R、Y、Q。三AA子组：K、W、R(AAF02)；K、W、Y；K、W、Q；K、R、Y；K、R、Q；K、Y、Q；W、R、Y；W、R、Q；W、Y、Q；以及R、Y、Q。二AA子组：K、W；K、R；K、Y；K、Q；W、R；W、Y；W、Q；R、Y；R、Q；以及Y、Q。
该公式适用于包含AAF01中的精选五种氨基酸(K W R Y Q)及包括精选五种氨基酸中的二、三或四氨基酸子组在内的其子组的制剂(例如，药物制剂)以及其用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎和/或用于制备治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的药剂的用途。
以上公式和推理同样适用于本文所述精选五种氨基酸(K W R Y Q)中的二、三或四氨基酸子组的任何组合。
在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)中的任何两种游离氨基酸。AAF01的5氨基酸制剂[赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)]的示例性二游离氨基酸子组如下：K、W；K、R；K、Y；K、Q；W、R；W、Y；W、Q；R、Y；R、Q；以及Y、Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K和W。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K和R。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K和Y。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：W和R。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：W和Y。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：W和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：R和Y。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：R和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：Y和Q。
在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)中的任何三种游离氨基酸。AAF01的5氨基酸制剂[赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)]的示例性三游离氨基酸子组如下：K、W、R；K、W、Y；K、W、Q；K、R、Y；K、R、Q；K、Y、Q；W、R、Y；W、R、Q；W、Y、Q；以及R、Y、Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、W和R。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、W和Y。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、W和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、R和Y。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、R和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、Y和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：W、R和Y。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：W、R和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：W、Y和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：R、Y和Q。
在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)中的任何四种游离氨基酸。AAF01的5氨基酸制剂[赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)]的示例性四游离氨基酸子组如下：K、W、R、Y；K、W、R、Q；K、W、Y、Q；K、R、Y、Q；以及W、R、Y、Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、W、R和Y。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、W、R和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、W、Y和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、R、Y和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：W、R、Y和Q。
在一些实施方案中，该组合物包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)和谷氨酰胺(Q)的游离氨基酸。
精选5AA制剂[K、R、Q、C、N]是本文所述的示例性氨基酸制剂。用于确定由此涵盖的不同组合的数量的公式为2n-1，其中n等于精选氨基酸列表中的不同氨基酸的数量(例如，5种氨基酸)。因此赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸和谷氨酰胺的不同组合的总数为31种不同组合(25-1)。为了简单起见，每种精选氨基酸用如下氨基酸的标准单个大写字母来指代：赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)和谷氨酰胺(Q)。如下在列表1中呈现了不同组合：五AA组：K、N、R、C、Q。在其一些实施方案中，可任选地将苏氨酸(T)添加到K、N、R、C、Q的五AA组中。在其一些实施方案中，在K、N、R、C、Q的五AA组中精氨酸(R)可被替换为瓜氨酸或精氨酸与瓜氨酸的组合。四AA子组：K、N、R、C；K、N、R、Q；K、N、C、Q；K、R、C、Q；以及N、R、C、Q。在其一些实施方案中，可任选地将苏氨酸(T)添加到任何一个四AA子组中。在其一些实施方案中，在任何一个四AA子组中精氨酸(R)(存在时)可被替换为瓜氨酸或精氨酸与瓜氨酸的组合。
三AA子组：K、N、R；K、N、C；K、N、Q；K、R、C；K、R、Q；K、C、Q；N、R、C；N、R、Q；N、C、Q；以及R、C、Q。在其一些实施方案中，可任选地将苏氨酸(T)添加到任何一个三AA子组中。在其一些实施方案中，在任何一个三AA子组中精氨酸(R)(存在时)可被替换为瓜氨酸或精氨酸与瓜氨酸的组合。二AA子组：C、N；K、R；K、C；K、Q；N、R；N、C；N、Q；R、Q；以及C、Q。在其一些实施方案中，可任选地将苏氨酸(T)添加到任何一个二AA子组中。在其一些实施方案中，在任何一个二AA子组中精氨酸(R)(存在时)可被替换为瓜氨酸或精氨酸与瓜氨酸的组合。
该公式适用于包含精选五种氨基酸(K N R C Q)及包括精选五种氨基酸中的二、三或四氨基酸子组在内的其子组的制剂(例如，药物制剂)以及其治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎及用于制备治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的药剂的用途。包含精选五种氨基酸(K N RC Q)及包括精选五种氨基酸中的二、三或四氨基酸子组在内的其子组的此类制剂(例如，药物制剂)包括其中精氨酸(R)(存在时)可被替换为瓜氨酸或精氨酸与瓜氨酸的组合的实施方案。
以上公式和推理同样适用于本文所述精选五种氨基酸(K N R C Q)中的二、三或四氨基酸子组中的任何一者。
在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)和谷氨酰胺(Q)中的任何两种游离氨基酸。赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)和谷氨酰胺(Q)的5氨基酸制剂的示例性二游离氨基酸子组包括：K、N；K、R；K、C；K、Q；N、R；N、C；N、Q；R、Q；以及C、Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K和N。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K和R。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K和C。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：N和R。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：N和C。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：N和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：R和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：C和Q。
在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)和谷氨酰胺(Q)中的任何三种游离氨基酸。赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)和谷氨酰胺(Q)的5氨基酸制剂的示例性三游离氨基酸子组如下：K、N、R；K、N、C；K、N、Q；K、R、C；K、R、Q；K、C、Q；N、R、C；N、R、Q；N、C、Q；以及R、C、Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、N和R。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、N和C。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、N和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、R和C。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、R和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、C和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：N、R和C。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：N、R和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：N、C和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：R、C和Q。
在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)和谷氨酰胺(Q)中的任何四种游离氨基酸。赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)和谷氨酰胺(Q)的5氨基酸制剂的示例性四游离氨基酸子组如下：K、N、R、C；K、N、R、Q；K、N、C、Q；K、R、C、Q；以及N、R、C、Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、N、R和C。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、N、R和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、N、C和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：K、R、C和Q。在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：N、R、C和Q。
在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)和谷氨酰胺(Q)的游离氨基酸。
在一些实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：精氨酸(R)和赖氨酸(K)的游离氨基酸，以及色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或天冬酰胺(N)中的至少一者的游离氨基酸。如下在列表3中呈现了该实施方案的不同组合：七AA组：R、K、W、Y、Q、T、N。在其一个实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：R、K、W、Y、Q、T和N的游离氨基酸。六AA子组：R、K、W、Y、Q、T[AAF06]；R、K、W、Y、Q、N；R、K、W、Y、T、N；R、K、W、Q、T、N；以及R、K、Y、Q、T、N。在其实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：R、K、W、Y、Q和T[AAF06]；R、K、W、Y、Q和N；R、K、W、Y、T和N；R、K、W、Q、T和N；或R、K、Y、Q、T和N的游离氨基酸。五AA子组：R、K、W、Y、Q；R、K、W、Y、T[AAF04]；R、K、W、Y、N；R、K、W、Q、T[AAF05]；R、K、W、Q、N；R、K、W、T、N；R、K、Y、Q、T；R、K、Y、Q、N；R、K、Y、T、N；以及R、K、Q、T、N。在其实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：R、K、W、Y和Q；R、K、W、Y和T[AAF04]；R、K、W、Y和N；R、K、W、Q和T[AAF05]；R、K、W、Q和N；R、K、W、T和N；R、K、Y、Q和T；R、K、Y、Q和N；R、K、Y、T和N；或R、K、Q、T和N的游离氨基酸。四AA子组：R、K、W、Y；R、K、W、Q[AAF03]；R、K、W、T；R、K、W、N；R、K、Y、Q[AAF07]；R、K、Y、T；R、K、Y、N；R、K、Q、T；R、K、Q、N；以及R、K、T、N。在其实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：R、K、W和Y；R、K、W和Q[AAF03]；R、K、W和T；R、K、W和N；R、K、Y和Q[AAF07]；R、K、Y和T；R、K、Y和N；R、K、Q和T；R、K、Q和N；或R、K、T和N的游离氨基酸。三AA子组：R、K、W[AAF02]；R、K、Y；R、K、Q；R、K、T；以及R、K、N。在其实施方案中，该制剂包含以下项、基本上由以下项组成或由以下项组成：R、K和W[AAF02]；R、K和Y；R、K和Q；R、K和T；或R、K和N的游离氨基酸。
因此，本文涵盖包含精选七种氨基酸(R、K、W、Y、Q、T、N)及包括精选七种氨基酸中的二(R、K)、三、四、五和六氨基酸子组在内的其子组的制剂(例如，药物制剂)以及其用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎及用于制备治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的药剂的用途。以上推理同样适用于本文所述精选七种氨基酸(R、K、W、Y、Q、T、N)中的二(R、K)、三、四、五或六氨基酸子组的任何组合。
在一些实施方案中，提供了用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎的制剂，其中该制剂包含游离氨基酸的治疗有效组合，基本上由游离氨基酸的治疗有效组合组成或由游离氨基酸的治疗有效组合组成，其中游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸和赖氨酸；以及治疗有效量的半胱氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合，其中游离氨基酸的治疗有效组合足以减少与ARDS或哮喘相关的肺部中的积液或足以减少与受试者的变应性鼻炎相关的鼻道中的积液；以及任选地，药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，提供了用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎的制剂，其中该制剂包含游离氨基酸的治疗有效组合，基本上由游离氨基酸的治疗有效组合组成或由游离氨基酸的治疗有效组合组成，其中游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺；以及治疗有效量的半胱氨酸或天冬酰胺的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合，其中游离氨基酸的治疗有效组合足以减少与ARDS或哮喘相关的肺部中的积液或足以减少与变应性鼻炎相关的鼻道中的积液；以及任选地，药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本文所述的制剂可任选地包含单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合，其中单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合的总浓度等于或小于90mM。在其实施方案中，单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于85mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于80mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于75mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于70mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于65mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于60mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于55mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于50mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于45mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于40mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于35mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于30mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于25mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于20mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于15mM；单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于10mM；或单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合等于或小于5mM。
在其实施方案中，单糖葡萄糖、至少一种含葡萄糖的二糖或它们的任何组合在10-90mM的范围内；在10-85mM的范围内；在10-80mM的范围内；在10-75mM的范围内；在10-70mM的范围内；在10-65mM的范围内；在10-60mM的范围内；在10-55mM的范围内；在10-50mM的范围内；在10-45mM的范围内；在10-40mM的范围内；在10-35mM的范围内；在10-30mM的范围内；在10-25mM的范围内；在10-20mM的范围内；在5-90mM的范围内；在5-85mM的范围内；在5-80mM的范围内；在5-75mM的范围内；在5-70mM的范围内；在5-65mM的范围内；在5-60mM的范围内；在5-55mM的范围内；在5-50mM的范围内；在5-45mM的范围内；在5-40mM的范围内；在5-35mM的范围内；在5-30mM的范围内；在5-25mM的范围内；在5-20mM的范围内；在1-90mM的范围内；在1-85mM的范围内；在1-80mM的范围内；在1-75mM的范围内；在1-70mM的范围内；在1-65mM的范围内；在1-60mM的范围内；在1-55mM的范围内；在1-50mM的范围内；在1-45mM的范围内；在1-40mM的范围内；在1-35mM的范围内；在1-30mM的范围内；在1-25mM的范围内；或在1-20mM的范围内。
在一些实施方案中，治疗组合物不含有任何糖类，包括任何单糖、二糖、寡糖、多糖和碳水化合物。在一些实施方案中，治疗组合物不含有葡萄糖和/或任何可水解成葡萄糖的二糖、寡糖、多糖和碳水化合物。在一些实施方案中，该组合物不含有乳糖。在一些实施方案中，治疗组合物不含有果糖和/或半乳糖和/或任何可水解成果糖和/或半乳糖的二糖、寡糖、多糖和碳水化合物。
如本文所用，术语“基本上由……组成”将成分和步骤的范围限制为指定的材料或步骤、以及不会实质性地影响本发明(例如，制剂及其用于治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的用途以及用于治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的方法)的基本和新颖特征的那些。例如，通过使用“基本上由……组成”，治疗制剂不含有权利要求书中未明确列举的任何成分，包括但不限于对治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎具有治疗效果的游离氨基酸、二肽、寡肽或多肽或蛋白质；以及单糖、二糖、寡糖、多糖和碳水化合物。在“基本上由……组成”的上下文内，可基于ENaC活性的变化来确定治疗有效量，而ENaC活性的变化通过在尤斯室测定法中检查的分化型HBEC中测量苯扎米尔敏感电流来评估，其中赋予多达1％、2％、3％、4％或5％的增加或减小的成分可落在术语“基本上由……组成”以内。
可通过药理学领域内已知的任何方法来制备本文所述的制剂。一般来讲，此类制备方法包括使本文所述制剂的化合物(即，游离氨基酸)与载体或赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，然后如果有必要和/或期望的话，成形和/或将产品包装成期望的单剂量或多剂量单位。
本文所述药物制剂的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何附加成分的相对量将根据接受治疗的受试者的身份、体格和/或状况并且还根据将施用该制剂的途径而变化。该制剂可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，将活性成分与如下物质混合：至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂或载体，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙；和/或填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；粘结剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；保湿剂，诸如甘油；崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；溶液阻滞剂，诸如石蜡；吸收促进剂，诸如季铵化合物；润湿剂，例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；吸附剂，诸如高岭土和膨润土；以及润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。就胶囊剂、片剂和丸剂而言，该剂型可包含缓冲剂。
在某些实施方案中，包含本文所述氨基酸的制剂可以以粉末形式提供并且在复原后施用给受试者。可按适用于通过颊腔进行肺部施用的制剂的形式制备、包装和/或销售本文所述的药物制剂。这种制剂可包含干燥颗粒，所述干燥颗粒包含活性成分并且具有在约0.5纳米至约7纳米或约1纳米至约6纳米的范围内的直径。此类制剂便利地为干粉形式，以便使用包括干粉储器的装置(推进剂的气流可被引导至该干粉储器，从而分散粉末)来施用和/或使用自推进溶剂/粉末分散容器(诸如包含溶解和/或悬浮在密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的装置)来施用。此类粉末包含颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒的直径大于0.5纳米并且按数量计至少95％的颗粒的直径小于7纳米。另选地，按重量计至少95％的颗粒的直径大于1纳米并且按数量计至少90％的颗粒的直径小于6纳米。干粉制剂可包含固体细粉稀释剂(诸如糖)并且便利地以单位剂量形式提供。
用于口服或肠胃外施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性成分以外，液体剂型还可包含通常用于本领域的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(例如，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖脂肪酸酯以及它们的混合物。除了惰性稀释剂之外，口服制剂还可包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在用于肠胃外施用的某些实施方案中，本文所述的缀合物可与增溶剂诸如
Figure BDA0003968165340000401
醇类、油类、改性油类、二元醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或它们的混合物混合。
本文所述的被配制用于肺部递送的药物制剂可提供溶液和/或混悬液的液滴形式的活性成分。此类制剂可按包含活性成分、任选无菌的水溶液和/或稀释醇溶液和/或悬液形式制备、包装和/或销售，并且可使用任何喷雾和/或雾化装置便利地施用。此类制剂还可包含一种或多种附加成分，包括但不限于调味剂诸如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂诸如对羟基苯甲酸甲酯。通过这种施用途径提供的液滴的平均直径可在约0.1纳米至约200纳米的范围内。常用吸入装置包括：加压计量吸入器(pMDI)、喷雾器(例如，压缩空气/射流和超声喷雾器)和干粉吸入器(DPI)。相对于超声喷雾器而言，射流喷雾器递送更小粒度并且需要延长的治疗时间。通过吸入施用的药物经由受试者吸入其气道中的气溶胶喷雾、薄雾或粉末来分散。
本文所述可用于肺部递送的制剂也可以用于本文所述药物制剂的鼻内递送。另一种适用于鼻内施用的制剂是包含活性成分且平均颗粒为约0.2微米至500微米的粗粉。这种制剂通过鼻道从保持在鼻孔附近的粉末容器快速吸入来施用。
用于鼻腔施用的制剂可例如包含约少至0.1％(w/w)到多至100％(w/w)的活性成分，并且可包含一种或多种本文所述的附加成分。此类制剂可例如呈现使用常规方法制备的片剂和/或锭剂的形式，并且可含有例如0.1％至20％(w/w)的活性成分，余量包含口服可溶的和/或可降解的组合物以及任选一种或多种本文所述的附加成分。另选地，用于颊面施用的制剂可包含含有活性成分的粉末和/或气雾化和/或雾化的溶液和/或悬液。在被分散时，此类粉末化、气雾化和/或雾化的制剂的平均粒度和/或液滴大小可在约0.1纳米至约200纳米的范围内，并且还可包含一种或多种本文所述的附加成分。
以上描述的本公开的实施方案的变型、修改和更改对于本领域技术人员将是显而易见的。所有这样的变型、修改和更改等旨在落入仅由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内。
虽然已经描述了本公开的若干实施方案，但是应当理解，这些实施方案仅是说明性的，而不是限制性的，并且许多修改对于本领域普通技术人员都可能是显而易见的。例如，本文讨论的所有尺寸仅作为实例提供，并且旨在是说明性的而不是限制性的。
在本说明书中明确指出的任何特征或元素也可以被特别地排除在如权利要求中所限定的本发明的实施方案的特征或元素之外。
可以在没有任何一个元素或多个元素、一种限制或多种限制(即，本文未具体公开)的情况下实践本文所述的公开内容。已经采用的术语和表达用作描述性的术语而不是限制性的术语，并且在使用这些术语和表达时，并不意图排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在本公开的范围内各种修改是可能的。
实施例
实施例1：重现ARDS的肺病理学模型系统：IL-13介导的肺组织炎症
材料和方法
IL-13：abcam(#ab9577)；储备溶液：10μg/mL水；20ng＝2μL储备液/mL培养基
每隔一天更换含IL-13的培养基
实验设计：采用20ng/mL培养基进行4天和14天的IL-13处理。碱性林格溶液(基底外侧中的5mM葡萄糖)中的尤斯室实验。
在一些实施方案中，实验研究要求确定：
·基线值(30min)
·6μM苯扎米尔(顶端侧上)的存在或不存在(15min)
·20μM CFTRinh 172(顶端侧和基底外侧上)的存在或不存在(15min)
·10μM CaCCinh AO1(顶端侧和基底外侧上)的存在或不存在(10min)
·20μM布美他尼(基底外侧上)的存在或不存在(15min)
对于第0天分析：
·IL-13处理：0ng/mL培养基
·碱性林格溶液或氨基酸(AA)制剂中的尤斯室实验。
·另外，S侧添加5mM葡萄糖
处理4天或14天的分析：
·IL-13处理：20ng/mL培养基
·碱性林格溶液或AA制剂中的尤斯室实验。
·另外，S侧添加5mM葡萄糖
在一些实施方案中，第4天和第14天实验研究要求确定：
·基线值(30min)
·6μM苯扎米尔(粘膜侧上)的存在或不存在(15min)
·20μM布美他尼(浆膜侧上)的存在或不存在(15min)
·20μM CFTRinh 172(粘膜侧和浆膜侧上)的存在或不存在(15min)
结果
为了研究炎症期间ENaC的重要性并探讨在ARDS的演变期间如何调节其活性，本发明人使用从正常人肺收获的人支气管上皮细胞(HBEC)的原代培养物，这些细胞已在空气-培养基界面(顶端侧上的空气和基底外侧上的培养基)中体外分化30天。分化型HBEC用于电生理学实验以评价IL-13对这些细胞的效应。这些实验得出的结果揭示了ENaC电流的IL-13剂量依赖性减小(图2)。结果还表明，在IL-13暴露的第8天出现了ENaC电流的最大减小(图3)。类似地，IL-13(20ng/mL)在暴露的第8天引起了屏障功能的最大降低。这些研究证实，IL-13暴露导致分化型HBEC中ENaC活性和屏障功能降低。上述结果确认了暴露于IL-13的HBEC表现出呼吸窘迫条件下的肺组织特有的特征，因此提供了评价制剂治疗ARDS和哮喘的功效的体外模型系统。
实施例2：使用在IL-13介导的肺组织炎症背景下重现ARDS的肺病理学模型系统来测试氨基酸制剂
包含精选氨基酸组合的各种制剂基于其在暴露于IL-13(20ng/mL)达4天或14天的分化型HBEC中改善屏障功能、经由ENaC增加生电性钠吸收(图4)以及经由囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)和anoctamin 1(ANO1)通道减少阴离子分泌的能力来筛选和评级。基于这些定量测定法来鉴定示例性5氨基酸制剂(AAF01)。使用钠同位素(22Na)通量研究来验证由AAF01赋予的净钠吸收功能。AAF01还经由钠-氢交换异构体3(NHE3)增加电中性钠吸收。蛋白质印迹分析表明，与在存在对照溶液的情况下温育的分化型HBEC相比，在存在AAF01的情况下分化型HBEC中ENaC和NHE3的蛋白水平增加，CFTR减少，ANO1(钙激活氯通道)减少，并且紧密连接蛋白闭合蛋白1和E-钙粘蛋白的水平增加。
将AAF01对暴露于IL-13达四(4)天或14天的分化型HBEC的效应(图5A和图5B)与林格溶液(阴性对照制剂/溶液)的效应进行比较。HBEC显示出在第4天或第14天，与林格氏溶液相比，在存在AAF01制剂的情况下ENaC电流增加。参见图5A。AAF01介导的ENaC电流增加在IL-13暴露的第14天更加明显，模型系统的所述后期时间状态与ARDS的后期在发病机理方面相关，这包括生物化学物质、参与的信号转导途径、组织和/或细胞的完整性以及结构蛋白及细胞表面转运和通道蛋白的状态。
进行附加实验以评估在存在布美他尼(其是一种NKCC1强效抑制剂，防止氯离子在可供顶端出口利用之前进入细胞)的情况下AAF01的效应。
图6A呈现了使用36Cl的同位素通量研究得出的结果，示出了在所指示的温育天在存在林格溶液(不含IL-13)、林格溶液(含IL-13)或AAF01(含IL-13)的情况下的净氯离子分泌。即使在存在IL-13的情况下，AAF01也减少氯离子分泌。图6B呈现了使用36Cl的同位素通量研究得出的结果，示出了添加布美他尼后的净氯离子分泌。IL-13增加了净氯离子分泌。在存在AAF01的情况下，布美他尼敏感阴离子电流减小。在存在林格溶液的情况下未观察到该减小。因此，相对于这些研究中使用的阴性对照制剂/溶液而言，AAF01减少氯离子分泌。添加布美他尼并未完全逆转净氯离子分泌。然而，AAF01的存在引起了净氯离子吸收。这些研究证实了AAF01经由增强的ENaC活性和减少的氯离子分泌来增加流体摄取的效力，即帮助清除如ARDS或哮喘中所观察到的肺泡液并帮助清除变应性鼻炎中所观察到的过多鼻分泌物的效应。
结果表明与在存在林格溶液的情况下温育的分化型HBEC相比在存在AAF01的情况下分化型HBEC中紧密连接蛋白闭合蛋白1和E-钙粘蛋白的水平增加，这揭示AAF01也改善了屏障功能。
图7A至图7D呈现了结果，其表明在存在所指示的氨基酸制剂的情况下显著改善了IL-13诱导的ENaC活性降低，并在IL-13处理后第4天暴露于AAF03以及第14天暴露于AAF01的细胞中见到最大值。IL-13诱导的阴离子电流增加在存在所指示的示例性氨基酸制剂的情况下显著减小，并在IL-13处理后第4天浸没于AAF04中以及在第14天浸没于AAF03中的细胞中观察到最低值。
图8A和图8B呈现了结果，其表明在IL-13处理后第4天在存在AAF01或AAF07的情况下以及第14天在存在AAF01、AAF03或AAF07的情况下显著改善了IL-13诱导的ENaC活性降低。IL-13诱导的阴离子电流增加在暴露于所指示的示例性氨基酸制剂的HBEC中显著减小，并在IL-13处理后第4天和第14天浸没于AAF07中的细胞中观察到最低值。
实施例3：重现ARDS的肺病理学模型系统：使用人支气管上皮细胞模型系统的TNF-α介导的肺组织炎症
方法：由于TNF-α已被鉴定为参与细胞因子风暴的主要促炎性介质之一，本发明人使用分化型HBEC模型系统来探讨在暴露于TNF-α(作为重现ARDS肺病理学特征的炎性状态的诱导因子)的背景下氨基酸制剂的效应。如以上实施例1-2中所述，可在存在各种浓度的TNF-α的情况下温育不同持续时间的分化型HBEC中，评估氨基酸制剂对ENaC活性、阴离子通道活性和屏障功能的效应。
方法和材料
尤斯室研究可用于确定：
·苯扎米尔敏感电流(ENaC介导的生电性钠电流)
·使用22Na确定净Na吸收的尤斯室通量研究
·TEER作为屏障通透性的量度(欧姆)
·使用FITC葡聚糖的通透性测定法
·通过qRT-PCR测定ENaC(α、β和γ)、闭合蛋白1、2、5、7和8、咬合蛋白和E-钙粘蛋白、酸敏感离子通道(ASIC1a)以及水通道蛋白1和5的mRNA表达
通过蛋白质印迹分析和免疫组织化学来确定ENaC(α、β和γ)、紧密连接蛋白(闭合蛋白1、2、5、7和8、咬合蛋白和E-钙粘蛋白)、酸敏感离子通道(ASIC1a)以及水通道蛋白1和5的蛋白水平和表达
·使用ELISA检测IL-6、IL-1β和/或IL13，由此确定培养基中的细胞因子表达。
通过将例如0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20或40ng/L的不同浓度TNF-α添加到培养基来确定ENaC活性和屏障功能最大降低所需的TNF-α最小量。
在其在例如0、1、3、7或14天添加后每天评价并确定TNF-α降低ENaC活性和屏障功能所需的时间。
在一些实施方案中，用0.00005ng/mL至500ng/mL TNF-α范围内的不同浓度TNF-α(例如，培养基中的0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5、5、50或500ng/mL TNF-α)处理HBEC 7天。参见图9，该图示出了ENaC电流随着TNF-α的浓度增加而减小。
评价并确定了诱导ENaC活性和屏障功能的最大增加所需的AAF01剂量和时间。在TNF-α处理之前、同时和之后使用AAF01。在上文相对于本文所述TNF-α介导的肺组织炎症模型系统确定TNF-α量和TNF-α暴露持续时间的同时评估AAF01施用的剂量和时间。
目标：为了界定AAF01在TNF-α处理的分化型HBEC中诱导ENaC活性和屏障功能的最大增加所需的最小浓度和暴露时间。为实现这一点，使HBEC生长于购自Costar的孔尺寸为0.4μm的通透性snap well膜嵌套上并且让其在空气-培养基界面中分化30天的时间段。可按如下概述的那样评价TNF-α在降低ENaC活性、增加CFTR和ANO1活性及降低屏障功能方面的效应。
确定诱导炎性效应(如ENaC活性降低、CFTR和ANO1活性增加及屏障功能降低所证实)所需的TNF-α最小量。为实现这一点，可将不同浓度的TNF-α添加到培养基，例如：0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20或40ng/L。在后续研究中使用引起ENaC电流最大减小的TNF-α浓度。如上文相对于实施例1和2所述的那样进行这些实验。
确定TNF-α发挥其效应(如ENaC活性降低、CFTR和ANO1活性增加及屏障功能降低所证实)所需的时间。为实现这一点，将TNF-α添加到培养基并且在其添加后0、1、3、7或14天进行研究。这些研究有助于鉴定对TNF-α的早期和晚期应答并且更好地界定在SARS-CoV-2感染和ARDS形成后肺组织生理变化的进展。
评价包含氨基酸的不同制剂，诸如本文所述的那些制剂(例如，AAF01)，以表征具有明显治疗活性的那些制剂。如上文所述的那样确定TNF-α发挥其最大效应所需的剂量和时间。在与ARDS进展中观察到的不同肺病理学阶段相关的不同TNF-α介导的炎症状态下并行评估不同制剂。
在存在单独干扰素-γ(IFN-γ)的情况下温育或在存在各种浓度的TNF-α与IFN-γ的组合的情况下温育不同持续时间的分化型HBEC中，评估氨基酸制剂对ENaC活性、阴离子通道活性和屏障功能的效应。图10例如示出了当用更低浓度的IFN-γ(0.00005至0.05ng/mL培养基)处理细胞时，ENaC电流增加。ENaC电流在暴露于更高水平的IFN-γ时返回到基线(未处理)水平，但随后在用更高浓度的IFN-γ(>0.05ng/mL培养基)处理细胞时相对于基线减小。这些研究有助于鉴定对单独TNF-、单独IFN-γ或TNF-α与IFN-γ的组合的早期和晚期应答并且更好地界定在SARS-CoV-2感染和ARDS形成后肺组织生理变化的进展。可在与ARDS进展中观察到的不同肺病理学阶段相关的不同TNF-α介导的炎症状态、IFN-γ介导的炎症状态和TNF-/IFN-γ介导的炎症状态下并行评估不同制剂。
本文还研究了TGF-β对分化型HBEC中的ENaC活性的效应。图11例如示出了ENaC电流随着TGF-β1的浓度增加而减小。
概括地说，基于本文提供的结果，增加TNF-α的浓度揭示了ENaC活性的浓度依赖性降低。参见图9。增加IFN-γ的浓度揭示了在较低IFN-γ浓度下活性增加以及在较高浓度(>5ng)下ENaC活性显著降低。参见图10。增加TGF-β1浓度揭示了ENaC活性的浓度依赖性降低。参见图11。
本发明人还在存在TNF-α、IFN-γ和TGF-β1的细胞因子混合物的情况下温育7天的分化型HBEC中评价了ENaC活性。参见图12。相对于在不含细胞因子混合物的培养基中温育的未处理HBEC(初始)而言，在暴露于细胞因子混合物7天的HBEC(媒介物)中ENaC电流显著减小。如图12中所用的术语“媒介物”是指向其中引入AA而生成5AA制剂和NC制剂并因此用作AA制剂的阴性对照的溶液。与初始HBEC相比，精选5AA制剂(AA：精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)在暴露于TNF-α、IFN-γ和TGF-β1的HBEC中赋予ENaC活性的显著恢复。相比之下，NC制剂(天冬氨酸、苏氨酸和亮氨酸)未改善细胞因子诱导的ENaC活性降低。实际上，相对于暴露于细胞因子混合物和媒介物的HBEC而言，NC制剂在暴露于细胞因子混合物的HBEC中进一步降低了ENaC活性。因此，在一些实施方案中，在受损ENaC活性(诸如在存在包含TNF-α、IFN-γ和TGF-β1的细胞因子混合物的情况下温育7天的分化型HBEC中观察到的情形)的背景下，评估氨基酸制剂改善ENaC活性的能力。图12中呈现的结果证实了“5AA制剂”(即，本文所述的示例性制剂)的治疗特性。
附加材料和方法
在暴露于代表性细胞因子的HBEC中与AA-EC01一起温育之后通过免疫荧光来使ENaC、IL-6和MUC5AC表达模式可视化。在初始对照和暴露于20ng/mL IL-13达14天的时相匹配的HBEC(它们用林格溶液或AA-EC01处理一小时)中评估ENaC表达。在初始对照和暴露于IFN-γ、TNF-α和TGF-β1(各1ng/mL)的细胞因子混合物达7天的时相匹配的HBEC(它们用林格溶液或AA-EC01处理一小时)中评估IL-6表达。在初始对照和暴露于20ng/mL IL-13达14天的时相匹配的HBEC(它们用林格溶液或AA-EC01处理一小时)中评估MUC5AC表达。在N＝2个不同切片上的n＝2个供体中进行所有实验。如本文所详述，AA-EC01在存在IL-13的情况下恢复了顶端ENaC表达，减少COVID-19细胞因子组合(IFN-γ、TNF-α和TGF-β1)所触发的IL-6分泌，并且减少IL-13诱导的MUC5AC分泌。
实施例4：重现ARDS的肺病理学模型系统：使用人肺泡内皮细胞模型系统的TNF-α介导的肺组织炎症
方法：为了探讨TNF-α对人肺泡内皮细胞的效应，本发明人还将使用人肺泡内皮细胞模型系统探讨在暴露于TNF-α(作为重现ARDS肺病理学特征的炎性状态的诱导因子)的背景下氨基酸制剂的效应。如以上实施例1-3中所述，可在存在各种浓度的TNF-α的情况下温育不同持续时间的人肺泡内皮细胞中，评估氨基酸制剂对ENaC活性、阴离子通道活性和屏障功能的效应。
方法和材料
尤斯室研究将用于确定：
·苯扎米尔敏感电流(ENaC介导的生电性钠电流)
·使用22Na确定净Na吸收的尤斯室通量研究
·TEER作为屏障通透性的量度(欧姆)
·使用FITC葡聚糖的通透性测定法
·通过qRT-PCR测定ENaC(α、β和γ)、闭合蛋白1、2、5、7和8、咬合蛋白和E-钙粘蛋白、酸敏感离子通道(ASIC1a)以及水通道蛋白1和5的mRNA表达
·通过蛋白质印迹分析和免疫组织化学来确定ENaC(α、β和γ)、紧密连接蛋白(闭合蛋白1、2、5、7和8、咬合蛋白和E-钙粘蛋白)、酸敏感离子通道(ASIC1a)以及水通道蛋白1和5的蛋白水平和表达
·使用ELISA检测例如IL-6、IL-1β和/或IL13，由此确定培养基中的细胞因子表达。
将确定ENaC活性和屏障功能最大降低所需的TNF-α最小量。将0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20或40ng/L的不同浓度TNF-α添加到培养基。将评价并确定TNF-α降低ENaC活性和屏障功能所需的时间。将在其在例如0、1、3、7或14天添加后每天研究TNF-α的效应。
将评价并确定诱导ENaC活性和屏障功能的最大增加所需的AAF01剂量和时间。将在TNF-α处理之前、同时和之后使用AAF01。将在上文相对于本文所述TNF-α介导的肺组织炎症模型系统确定TNF-α量和TNF-α暴露持续时间的同时评估AAF01施用的剂量和时间。
目标：为了界定AAF01在TNF-α处理的人肺泡内皮细胞中诱导ENaC活性和屏障功能的最大增加所需的最小浓度和暴露时间。为实现这一点，可使人肺微血管内皮(HPMVE)细胞生长于购自Costar的孔尺寸为0.4μm的通透性snap well膜嵌套上并且让其在培养基中(培养基位于顶端侧和基底外侧上)分化7天的时间段。可按如下概述的那样评价TNF-α在降低ENaC活性、增加CFTR和ANO1活性及降低屏障功能方面的效应。
确定诱导炎性效应(如ENaC活性降低、CFTR和ANO1活性增加及屏障功能降低所证实)所需的TNF-α最小量。为实现这一点，将不同浓度的TNF-α添加到培养基，例如：0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20或40ng/L。将在后续研究中使用引起ENaC电流最大减小的TNF-α浓度。将如上文相对于实施例1和2所述的那样进行这些实验。
确定TNF-α发挥其效应(如ENaC活性降低、CFTR和ANO1活性增加及屏障功能降低所证实)所需的时间。为实现这一点，TNF-α将被添加到培养基并且在其添加后0、1、3、7或14天进行研究。这些研究将有助于鉴定对TNF-α的早期和晚期应答并且更好地界定在SARS-CoV-2感染和ARDS形成后肺组织生理变化的进展。
评价包含氨基酸的不同制剂，诸如本文所述的那些制剂(例如，AAF01)，以表征具有明显治疗活性的那些制剂。将如上文所述的那样确定TNF-α发挥其最大效应所需的剂量和时间。可在与ARDS进展中观察到的不同肺病理学阶段相关的不同TNF-α介导的炎症状态下并行评估不同制剂。
还将在存在单独干扰素-γ(IFN-γ)的情况下温育或在存在各种浓度的TNF-α与IFN-γ的组合的情况下温育不同持续时间的人肺泡内皮细胞中，评估氨基酸制剂对ENaC活性、阴离子通道活性和屏障功能的效应。这些研究将有助于鉴定对单独TNF-、单独IFN-γ或TNF-α与IFN-γ的组合的早期和晚期应答并且更好地界定在SARS-CoV-2感染和ARDS形成后肺组织生理变化的进展。可在与ARDS进展中观察到的不同肺病理学阶段相关的不同TNF-α介导的炎症状态、IFN-γ介导的炎症状态和TNF-/IFN-γ介导的炎症状态下并行评估不同制剂。
还将根据实施例1和2测试人肺泡内皮细胞以评价IL-13对例如ENaC活性的效应。将如上文相对于HBEC所指示的那样评价示例性氨基酸制剂相对于人肺泡内皮细胞的治疗活性。
实施例5：实施例1-4中使用的示例性方法：
电生理学技术：a)在尤斯室中测量苯扎米尔敏感电流(ENaC介导的生电性钠电流)、布美他尼敏感电流和跨上皮电阻；b)使用22Na确定净Na吸收并使用36Cl确定氯离子分泌的尤斯室通量研究；以及c)使用直接添加到室中的异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖(4KD)的通透性测定法。
尤斯室-钠通量(通用)
将取自8周龄雄性Swiss小鼠的小肠粘膜组织(回肠和空肠)安装在含有等渗林格溶液的尤斯室中，用95％O2和5％CO2对等渗林格溶液进行鼓泡并将等渗林格溶液在整个实验中保持在37℃。在让组织稳定之后，记录电导率(G；表示为mS/cm2)，并且基于类似电导率来使肠组织配对。将钠放射性同位素(22Na)添加到每个组织对的基底外侧或顶端侧(热)。每15分钟从对侧(冷)取出林格溶液样品。使用γ计数器分析样品22Na活性，并且计算单向净钠通量(Jnet；μeq·cm2·h-1)。
Jnet＝(冷CPM2-空白)-[(冷CPM1-空白)x9/10]x5x4x140
(热CPM-空白)x 10x 0.3
[CPM＝每分钟计数，CPM1＝前一样品，CPM2＝后一样品；空白＝未添加22Na；9/10＝每个样品的稀释因子(0.5mL至5mL)；5＝室体积(5mL)；4＝时间因子(15min至60min)；140＝钠浓度；热CPM＝“热”样品活性；冷CPM＝“冷”样品活性；10＝热样品的体积因子(0.1mL至1mL)；0.3＝肠表面积(cm2)]
分子生物学技术：通过qRT-PCR测定ENaC(α、β和γ)mRNA表达、闭合蛋白1、2、5、7和8、咬合蛋白和E-钙粘蛋白、酸敏感离子通道(ASIC1a)以及水通道蛋白1和5。
蛋白质印迹分析和免疫组织化学：通过蛋白质印迹分析和/或免疫组织化学来确定ENaC(α、β和γ)、紧密连接蛋白(闭合蛋白1、2、5、7和8、咬合蛋白和E-钙粘蛋白)、酸敏感离子通道(ASIC1a)以及水通道蛋白1和5的蛋白水平和表达。
实施例6：使用AAF01改善急性呼吸窘迫综合征(ARDS)小鼠模型的肺功能和放射学清除
可通过例如喷雾来递送本文所述的不同浓度的示例性制剂(例如，AAF01)并且评价所述制剂的治疗效果。
ARDS诱导型ARDS模型
确定TNF-α降低ENaC活性和屏障所需的时间。
·可在其添加后的以下天(0、1、3、7或14天)研究TNF-α的效应。
ARDS诱导型肺炎球菌ARDS模型
ARDS的动物模型是本领域已知的并且在例如以下文献中有所描述：Aeffner等人(Toxicologic Pathology,43:1074-1092,2015)；Gotts等人(Am J Physiol Lung CellMol Physiol 317:L717–L736,2019)；以及Hong等人[Signal Transduction and TargetedTherapy(2021)6:1]，这些文献各自的内容整体并入本文。确定诱导ENaC活性和屏障功能的最大增加所需的AAF01剂量和时间。将在TNF-α处理之前、同时和之后使用AAF01。基于上述内毒素屏障功能测定法和ARDS诱导型ARDS模型中获取的信息来确定TNF-α的最佳剂量和时间。
方法
·体质测量
体重、日常活动、呼吸率、氧饱和度、肺湿/干重比
·生理测量
肺功能测试、使用FITC葡聚糖的通透性测定法(4KD和10KD FITC葡聚糖通透研究)
·分子生物学
·通过qRT-PCR测定ENaC(α、β和γ)、闭合蛋白1、2、5、7和8、咬合蛋白和E-钙粘蛋白、酸敏感离子通道(ASIC 1a)以及水通道蛋白1和5的mRNA表达
·通过蛋白质印迹和免疫组织化学分析来确定ENaC(α、β和γ)、紧密连接蛋白(闭合蛋白1、2、5、7和8、咬合蛋白和E-钙粘蛋白)、酸敏感离子通道(ASIC1a)以及水通道蛋白1和5的蛋白水平和表达
·通过ELISA确定例如IL-6、IL-1β和/或IL13的细胞因子水平。
实施例7：相对于图13-18使用的示例性方法
材料和方法
研究设计。分析了来自COVID-19免疫应答不同阶段(先天、Th1、Th2和Treg)的单独细胞因子及其组合对HBEC中的ENaC和屏障功能的效应以便确定它们在AFC中的相应作用。人们推测AFC降低是如COVID-19期间所见的肺水肿或ARDS的主要诱因。使用取自两个单独肺供体的正常原代HBEC(P2)，并且所有实验均根据赫尔辛基宣言(Declaration ofHelsinki)及关于人类研究伦理学的Huriet-Serusclat和Jardet法律描述的指南和规定进行，并且获取、培养、储存和研究HBEC的方案得到了佛罗里达大学(University ofFlorida)的机构审查委员会(Institutional Review Board)的批准。将时相匹配的分化型HBEC随机分组以用单独细胞因子和细胞因子组合进行剂量和时间依赖性温育实验，并且这些研究重复两次或三次。当用AA-EC01处理细胞时，使用类似的随机化。合并所有样品以进行统计分析。未排除数据异常值。
HBEC培养。通过MTA从阿拉巴马大学(University of Alabama)和迈阿密大学(University of Miami)获得HBEC。从供体肺分离这些细胞，如先前所述(M.L.Fulcher,S.H.Randell，载于Epithelial Cell Culture Protocols:Second Edition,S.H.Randell,M.L.Fulcher编(Humana Press,Totowa,NJ,2013)，第109-121页)。将细胞(P0和P1)以1x106个细胞的浓度接种于10cm鼠尾胶原I包被的细胞培养皿(ThermoFisher)上，并且在37℃和5％CO2/95％O2下在含有100U/mL青霉素/链霉素和0.25ug/mL两性霉素B(ThermoFisher)的PneumaCult Ex Plus培养基(StemCell)中扩增4-8天，如先前所述(71)。每两天更换一次培养基，直到细胞变为80％至90％汇合度。
为进行传代培养，除去培养基，用PBS洗涤细胞，用TrypLE Select Enzyme(ThermoFisher)对细胞进行胰蛋白酶处理，并且将细胞接种于胶原I包被的细胞培养皿上以进一步扩增(P1)或以80,000个细胞/cm2的浓度接种于胶原IV包被的(Sigma)通透性snapwell膜嵌套(0.4μM孔径聚碳酸酯膜，Corning)上(P2)。在snapwell上含青霉素/链霉素的PneumaCult Ex Plus中扩增至90％汇合度(细胞浸入培养基中)之后，细胞在含青霉素/链霉素的PneumaCult ALI培养基(StemCell)中的气液界面处分化。每两天更换一次ALI培养基，直到细胞完全分化(14至21天)。分化型HBEC的特征在于纤毛运动性。
早在分化后第14天就开始用稀释于ALI培养基中的细胞因子[IL-13(Abcam)、IL-4(PeproTech)、TNF-α、IFN-γ和TGF-β1(R&DSystems)]进行基础处理。将单独细胞因子或细胞因子混合物以期望的浓度添加到培养基，并且将细胞与这些细胞因子一起温育最长16天。每两天更换一次含有细胞因子的ALI培养基。将时相匹配的HBEC分配给以下处理组：
I剂量依赖性研究：对于7天处理，IFN-γ或TNF-α以5x10-5、5x10-4、5x10-3、5x10-2、0.5、5、10、20、40、50和500ng/mL使用，而TGF-β1以5x10-5、5x10-4、5x10-3、5x10-2、0.5、5和50ng/mL使用。对于14天处理，IL-13以0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、16、20、64ng/mL使用。
II时间依赖性研究：使用确保苯扎米尔敏感Isc和TEER的最大抑制的浓度来进行这些研究。用相应细胞因子处理HBEC 2、4、6、8、10、12、14或16天。使用1ng/mL的IFN-γ、TNF-α或TGF-β1，20ng/mL的IL-13，以及2ng/mL的IL-4。
III细胞因子混合物：使用0.05、0.5、2.5、5和10ng/mL的IFN-γ和TNF-α制备细胞因子混合物，同时将各1ng/mL的细胞因子TNF-α、IFN-γ和TGF-β1添加到培养基并持续7天。
IV用氨基酸处理后分析免疫荧光：将AA-EC01、AANC(阴性对照)或林格溶液的等渗溶液添加到细胞培养物(200μL)的顶端侧，所述细胞培养物先前分别与20ng/mL IL-13或1ng/mL IFN-γ、TNF-α和TGF-β1一起温育14天或7天。在处理以进行免疫荧光成像之前，在37℃和5％CO2/95％O2下用氨基酸或林格溶液处理细胞培养物一小时。
尤斯室实验：将含有与细胞因子一起温育的分化型HBEC或无细胞因子暴露的时相匹配HBEC的snapwell安装在尤斯室(Physiologic Instruments)中，并且将细胞浸没于含有113.8mM Na+、93.6mM Cl-、25mM HCO3 -、5.2mM K+、2.4mM HPO4 -、0.4mM H2PO4 -、1.2mM Mg2+、1.2mM Ca2+和75mM甘露醇的等渗林格溶液中或AA-EC01中。将葡萄糖(5mM)添加到基底侧，并且在37C下用95％O2和5％CO2对室进行鼓泡。AA-EC01含有8mM赖氨酸、8mM色氨酸、8mM精氨酸、8mM谷氨酰胺和1.2mM酪氨酸，并且AANC含有8mM亮氨酸、8mM半胱氨酸、8mM异亮氨酸、8mM天冬氨酸和8mM谷氨酸盐(Ajinomoto)，两者均在pH 7.4和300mOsm下稀释于含有113.8mMNa+、93.6mM Cl-、25mM HCO3 -、5.2mM K+、2.4mM HPO4 -、0.4mM H2PO4 -、1.2mM Mg2+、1.2mM Ca2+和40mM甘露醇的电解质溶液。让细胞培养物在尤斯室中平衡30分钟，同时连续电压钳制至0mV。以30秒间隔记录基础短路电流(Isc)和跨上皮电阻(TEER)，并且根据在将6μM苯扎米尔(ThermoFisher)添加到顶端侧30分钟后记录的基础Isc与15分钟后测得的Isc的差值来计算苯扎米尔敏感Isc。
免疫荧光成像：在用AA-EC01或林格溶液处理之后，将细胞用4％多聚甲醛固定并且包埋于石蜡中。按照标准方案，将横切片(4μm)封固在经硅烷涂覆的载玻片(FisherScientific)上，脱蜡，再水化并且在pH 6.0的修复缓冲液(Biocare Medical)中热预处理。在用1％BSA和10％正常山羊血清封闭之后，将切片与稀释于封闭缓冲液(1:100)中的小鼠抗人IL-6单克隆抗体(Abcam)、兔抗人ENaC-α多克隆抗体(Abcepta)或小鼠抗人MUC5AC单克隆抗体(Abcam)一起在4℃下温育过夜。与AlexaFluor488缀合的山羊抗小鼠superclonal重组二抗(ThermoFisher)用于IL-6和MUC5AC检测/显色，并且与AlexaFluor647缀合的山羊抗兔superclonal重组二抗(ThermoFisher)用于在温育一小时的1μg/mL浓度下进行ENaC-α检测/显色。用DAPI对细胞核进行10分钟染色，并且在分析之前在水性封固介质(Abcam)中封固细胞。使用Olympus Fluoview FV1000激光扫描共聚焦显微镜在400X放大倍率下分析信号。
统计分析：结果呈现为平均值±平均标准误差(SEM)。使用OriginPro2018软件包进行分析。对于每个处理组，使用夏皮洛-威尔克(Shapiro-Wilk)正态性检验来检验值的正态分布。由于供体肺的供应量有限(导致样本大小较小)并且由于供体之间的变异较高，因此数据不呈正态分布，并且使用非参数检验对归一化的值进行统计分析。将这些值归一化到该组内的对照，并且合并数据以便在各组之间比较。克鲁斯卡尔-沃利斯检验用于比较林格溶液、AA-EC01和AANC对苯扎米尔敏感Isc和TEER的总体效应，并且曼-惠特尼U检验用于该组内的成对比较并用于在每种细胞因子为0ng/mL或第0天采用所研究的每种浓度和时间段时的基础值之间的比较。P<0.05被视为显著的，并且NS指示不显著。
与图13至图18相关的结果
图13示出了HBEC与较低浓度的IFN-γ一起长期温育抑制了ENaC功能。ENaC抑制反映于在与IFN-γ一起温育≥14天时HBEC中苯扎米尔敏感Isc的逐渐减小。
图14示出了TNF-α抑制ENaC活性，但未损害屏障功能，如TEER所反映。相比之下，图17A和图17B示出了IFN-γ和TNF-α(各10ng/mL)的组合协同工作来降低ENaC活性并且损害了HBEC的屏障功能。
图15C和图15D示出了与2ng/mL IL-4一起温育14天的HBEC表现出在早在第4天就显著减小了苯扎米尔敏感Isc。在第10天见到苯扎米尔敏感Isc的最大减小，并且苯扎米尔敏感Isc在剩余研究时间段仍然受到抑制(图15C)。类似地，屏障功能在早在第2天时就降低，并且在第10天出现最大抑制(图15D)。
图16示出了将IL-13添加到培养基以剂量依赖性方式减小了苯扎米尔敏感Isc。苯扎米尔敏感Isc从0.1ng/mL IL-13开始逐渐减小并且在8ng/mL下被完全破坏(图16A)。TEER在2ng/mL IL-13下显著降低，并且在4ng/mL下观察到屏障功能的最大降低(图16B)。HBEC与20ng/mL IL-13一起温育16天的时间段在第2天将苯扎米尔敏感Isc减小至其基线值的四分之一并且到第8天苯扎米尔敏感Isc受到完全抑制(图16C)。上皮电阻随时间逐渐降低，并在第10天观察到TEER的最大降低(图16D)。
如图17所示，独立于其他细胞因子测试的TGF-β1引起在早在第4天时在浓度≥0.5ng/mL下苯扎米尔敏感Isc减小，并且对TEER没有抑制效应。
图18示出了IL-13抑制了ENaC和屏障功能，而AA-EC01增加了ENaC活性和表达，从而抵消了IL-13介导的不良反应诸如肺泡积液。本发明研究还证实，AA-EC01促进了ENaC从细胞质易位至顶端膜，其在此具有功能活性。本文所述的免疫组织化学研究揭示，AA-EC01还可通过增加ENaC转录和/或ENaC蛋白质合成来增加ENaC活性。
如免疫组织化学研究示出，AA-EC01在很大程度上在IL-13暴露后的HBEC中减少细胞内MUC5AC表达和分泌，这表明AA-EC01可用于减少粘液产生。AA-EC01减少HBEC中细胞因子诱导的IL-6分泌(由于暴露于由IFN-γ、TNF-α和TGF-β1组成的细胞因子组合)的能力进一步强调了AA-EC01具有应对与ARDS相关的肺部并发症的多种治疗特性。AA-EC01在IL-13暴露后的HBEC中增加了ENaC活性，在IL-13暴露后的HBEC中显著减少MUC5AC表达和分泌，并且在细胞因子温育的细胞的顶端膜处显著减少IL-6相关免疫荧光信号。
由于还没有可减少肺泡积液的已批准药物，AA-EC01为未满足且迫切的临床需求提供了解决方案。本文提供的结果支持使用AA-EC01作为用于治疗ARDS和/或用于降低与ARDS相关的肺部并发症的可能性和/或严重性的治疗剂。由于AA-EC01由具有治疗特性的功能氨基酸组成，因此制剂可用作独立API或用作与其他治疗选项联用的补充API。AA-EC01具有优异的安全特性，因为包括在其中的每种氨基酸是“公认安全的”(GRAS)并且预期不会在与其他API联用时表现出任何副作用。因此，AA-EC01与护理标准API联用可使标准护理治疗的效果最大化，从而降低补氧和通气支持的持续时间，使长期肺部并发症最小化，并且增加受影响的患者的存活率。

Claims (48)

1.一种用于治疗有此需要的受试者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘或变应性鼻炎的药物制剂，其中所述制剂包含游离氨基酸的治疗有效组合：
所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸和赖氨酸的游离氨基酸；以及
治疗有效量的谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或苏氨酸的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合，
其中配制所述游离氨基酸的治疗有效组合以便递送到肺部来治疗ARDS或哮喘，并且所述游离氨基酸的治疗有效组合足以减少所述受试者的肺部中的积液；或
其中配制所述游离氨基酸的治疗有效组合以便递送到鼻道来治疗变应性鼻炎，并且所述游离氨基酸的治疗有效组合足以减少所述受试者的鼻道中的积液；以及
任选地，至少一种药学上可接受的载体、缓冲液、电解质、佐剂、赋形剂或水或它们的任何组合。
2.根据权利要求1所述的药物制剂，所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸和赖氨酸的游离氨基酸；以及
治疗有效量的谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。
3.根据权利要求1所述的药物制剂，所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸；以及
治疗有效量的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或苏氨酸的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。
4.根据权利要求2所述的药物制剂，所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸；以及
治疗有效量的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物制剂，其中精氨酸的浓度在4mM至10mM的范围内；其中精氨酸的浓度在6mM至10mM的范围内；其中精氨酸的浓度在7mM至9mM的范围内；其中精氨酸的浓度在7.2mM至8.8mM的范围内；或其中精氨酸的浓度为8mM。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。
7.根据权利要求6所述的药物制剂，其中精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，色氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，酪氨酸以0.1mM至1.2mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在。
8.根据权利要求6所述的药物制剂，其中精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，色氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，酪氨酸以0.8mM至1.2mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。
9.根据权利要求6所述的药物制剂，其中精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，色氨酸以8mM的浓度存在，酪氨酸以1.2mM的浓度存在，并且谷氨酰胺以8mM的浓度存在。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。
11.根据权利要求10所述的药物制剂，其中精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，色氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在。
12.根据权利要求10所述的药物制剂，其中精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，色氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。
13.根据权利要求10所述的药物制剂，其中精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，色氨酸以8mM的浓度存在，并且谷氨酰胺以8mM的浓度存在。
14.根据权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。
15.根据权利要求14所述的药物制剂，其中精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，酪氨酸以0.1mM至1.2mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在。
16.根据权利要求14所述的药物制剂，其中精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，酪氨酸以0.8mM至1.2mM范围内的浓度存在，并且谷氨酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。
17.根据权利要求14所述的药物制剂，其中精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，酪氨酸以1.2mM的浓度存在，并且谷氨酰胺以8mM的浓度存在。
18.根据权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺的游离氨基酸。
19.根据权利要求18所述的药物制剂，其中精氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，赖氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，谷氨酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在，半胱氨酸以6mM至10mM范围内的浓度存在，并且天冬酰胺以6mM至10mM范围内的浓度存在。
20.根据权利要求18所述的药物制剂，其中精氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，赖氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，谷氨酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，半胱氨酸以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在，并且天冬酰胺以7.2mM至8.8mM范围内的浓度存在。
21.根据权利要求18所述的药物制剂，其中精氨酸以8mM的浓度存在，赖氨酸以8mM的浓度存在，谷氨酰胺以8mM的浓度存在，半胱氨酸以8mM的浓度存在，并且天冬酰胺以8mM的浓度存在。
22.根据权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸和色氨酸的游离氨基酸。
23.根据权利要求1、3或5中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸和酪氨酸的游离氨基酸。
24.根据权利要求1、3或5中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。
25.根据权利要求1、3或5中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的治疗有效组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸的游离氨基酸。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的药物制剂，还包含至少一种药学上可接受的载体、缓冲液、电解质、佐剂、赋形剂或水或它们的任何组合。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸中的至少一者或所述游离氨基酸中的每一者包含L-氨基酸。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的药物制剂，其中配制所述药物制剂以便通过肺部、吸入或鼻内途径来施用。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的药物制剂，其中配制所述药物制剂以便经由吸入或鼻腔施用来施用。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的药物制剂，其中所述受试者是哺乳动物。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的药物制剂，其中所述哺乳动物是人类、猫、狗、猪、马、奶牛、绵羊或山羊。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的药物制剂，其中所述哺乳动物是人类。
33.根据权利要求32所述的药物制剂，其中所述人类是婴孩。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的药物制剂，其中所述受试者罹患冠状病毒疾病2019(COVID-19)。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的药物制剂，其中减少肺部中的积液减轻与ARDS或哮喘相关的至少一种症状并且其中减少鼻道中的积液减轻与变应性鼻炎相关的至少一种症状。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的药物制剂，所述药物制剂用于治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎。
37.根据权利要求1至35中任一项所述的药物制剂用于制造治疗ARDS、哮喘或变应性鼻炎的药剂的用途。
38.一种用于治疗有此需要的受试者的ARDS、哮喘或变应性鼻炎的方法，所述方法包括：
向有此需要的所述受试者施用根据权利要求1至35中任一项所述的药物制剂，
其中所述施用减少肺部中的积液，从而减轻与所述受试者的ARDS或哮喘相关的至少一种症状，或
所述施用减少所述受试者的鼻道中的积液，从而减轻与所述受试者的变应性鼻炎相关的至少一种症状。
39.根据权利要求36所述的用途、根据权利要求37所述的药剂或根据权利要求38所述的方法，其中所述药物制剂或所述药剂可经由肺部、吸入或鼻内途径中的至少一者或它们的任何组合来施用。
40.根据权利要求36所述的用途、根据权利要求37所述的药剂或根据权利要求38所述的方法，其中所述药物制剂或所述药剂可经由吸入或鼻腔施用来施用。
41.一种包含游离氨基酸的治疗有效组合的药物制剂，其中配制所述药物制剂以便进行肺部施用或鼻内施用：
所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸和赖氨酸的游离氨基酸；以及
治疗有效量的谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或苏氨酸的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合，以及
任选地，至少一种载体、缓冲液、电解质、佐剂、赋形剂或水或它们的任何组合。
42.根据权利要求41所述的药物制剂，所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸和赖氨酸的游离氨基酸；以及
治疗有效量的谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。
43.根据权利要求41所述的药物制剂，所述游离氨基酸基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸；以及
治疗有效量的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺或苏氨酸的游离氨基酸中的至少一者或它们的任何组合。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。
45.根据权利要求41至43中任一项所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺的游离氨基酸。
46.根据权利要求41至43所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、色氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。
47.根据权利要求41至43所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸的组合基本上由以下项组成或由以下项组成：治疗有效量的精氨酸、赖氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺的游离氨基酸。
48.一种装置，包含根据权利要求1至35或41至47中任一项所述的药物制剂或根据权利要求37所述的药剂，其中所述装置被配置为将所述药物制剂或所述药剂递送到有此需要的所述受试者的肺部或鼻道。
CN202180038692.7A 2020-05-29 2021-05-28 用于治疗急性呼吸窘迫综合征、哮喘或变应性鼻炎的制剂和方法 Pending CN115697301A (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063032185P 2020-05-29 2020-05-29
US63/032,185 2020-05-29
US202063080470P 2020-09-18 2020-09-18
US63/080,470 2020-09-18
US202063088813P 2020-10-07 2020-10-07
US63/088,813 2020-10-07
US202163136404P 2021-01-12 2021-01-12
US63/136,404 2021-01-12
PCT/US2021/034807 WO2021243183A1 (en) 2020-05-29 2021-05-28 Formulations and methods for treating acute respiratory distress syndrome, asthma, or allergic rhinitis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115697301A true CN115697301A (zh) 2023-02-03

Family

ID=78722883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180038692.7A Pending CN115697301A (zh) 2020-05-29 2021-05-28 用于治疗急性呼吸窘迫综合征、哮喘或变应性鼻炎的制剂和方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230201151A1 (zh)
EP (1) EP4157218A4 (zh)
JP (1) JP2023531872A (zh)
KR (1) KR20230018474A (zh)
CN (1) CN115697301A (zh)
AU (1) AU2021280328A1 (zh)
BR (1) BR112022024033A2 (zh)
CA (1) CA3177780A1 (zh)
MX (1) MX2022015044A (zh)
WO (1) WO2021243183A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116036277B (zh) * 2022-07-19 2023-10-31 广州国家实验室 氯离子在预防、治疗冠状病毒所致疾病中的应用
US11878073B1 (en) 2022-09-20 2024-01-23 Entrinsic, LLC Generation of hydration-targeted formulations and methods of use therein

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104207146A (zh) * 2014-07-26 2014-12-17 胡安然 呼吸系统疾病全营养配方食品
WO2019070759A1 (en) * 2017-10-02 2019-04-11 University Of Florida Research Foundation Incorporated AMINO ACID COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CYSTIC FIBROSIS
JP7352901B2 (ja) * 2017-10-02 2023-09-29 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファンデーション インコーポレーティッド 腫瘍成長を阻害するための材料および方法
CN113164425A (zh) * 2018-10-30 2021-07-23 佛罗里达大学研究基金会公司 用于治疗囊性纤维化的氨基酸组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021280328A1 (en) 2022-11-17
US20230201151A1 (en) 2023-06-29
BR112022024033A2 (pt) 2022-12-20
EP4157218A1 (en) 2023-04-05
MX2022015044A (es) 2023-01-04
JP2023531872A (ja) 2023-07-26
WO2021243183A1 (en) 2021-12-02
WO2021243183A8 (en) 2022-01-13
CA3177780A1 (en) 2021-12-02
EP4157218A4 (en) 2024-06-26
KR20230018474A (ko) 2023-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2524304C2 (ru) Применение соли ацетилсалициловой кислоты для лечения вирусных инфекций
US8709496B2 (en) Use of deuterium oxide for the treatment of virus-based diseases of the respiratory tract
JP5970465B2 (ja) ペプチドおよびウイルス・ノイラミニダーゼ阻害剤を含んでなる組成物
CA3165957A1 (en) Methods, compositions, and vaccines for treating a virus infection
JP2023134592A (ja) ライノウイルス感染症の予防又は治療のための薬物
CN115697301A (zh) 用于治疗急性呼吸窘迫综合征、哮喘或变应性鼻炎的制剂和方法
AU2016287580A1 (en) Compositions and methods for the treatment of viral infection
US20040242700A1 (en) Anti-influenzal agent
JP2023524693A (ja) ラクトフェリンの投与によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス侵入の阻害およびその使用
US11197912B2 (en) Prevention and treatment of viral infection and viral infection-induced organ failure
Betts et al. Inhibitory influence of the hexapeptidic sequence SLIGRL on influenza A virus infection in mice
US20230149429A1 (en) Use of a nitrogen-containing bisphosphonate in combination with a glucocorticoid in preventing or treating viral pneumonia
EP4135685A1 (en) Cysteine protease inhibitors for use in the prevention and/or treatment of coronavirus
JP7527288B2 (ja) 急性増悪をポリクローナル免疫グロブリンで予防または治療するための方法および組成物
US20220016160A1 (en) Method for preventing or treating infection of respiratory virus utilizing gold nanoparticles
JP2003155230A (ja) 抗インフルエンザ薬
Saravanabavan et al. An Overview of COVID-19: Focus on Pharmacological Aspect
JP2023525522A (ja) Ｃｏｖｉｄ－１９の治療または予防用ペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20230203

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication