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CN115417906B - 环二核苷酸金属化合物及其制备方法、应用 - Google Patents

环二核苷酸金属化合物及其制备方法、应用 Download PDF

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CN115417906B CN202211117378.0A CN202211117378A CN115417906B CN 115417906 B CN115417906 B CN 115417906B CN 202211117378 A CN202211117378 A CN 202211117378A CN 115417906 B CN115417906 B CN 115417906B
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Abstract

本发明公开了一种环二核苷酸金属化合物及其制备方法、应用，属于生物医药技术领域。该化合物的结构式为[M(环二核苷酸)]或[M'2(环二核苷酸)]，其中，M为Mg2+、Zn2+、Mn2+或Fe2+，所述M'为Li+，所述环二核苷酸为2’3’‑cGAMP、c‑di‑AMP、c‑di‑GMP、c‑di‑IMP、c‑GMP‑IMP以及其衍生物中的任意一种。环二核苷酸金属化合物具有更长的体内代谢周期、体内稳定性，并比环二核苷酸本身显示出更显著的抗疾病活性，具有结构简单、在制备抗疾病药物中应用前景广阔的优点。

Description

环二核苷酸金属化合物及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及环二核苷酸金属化合物及其制备方法、应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
在感染的哺乳动物细胞中，微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导内源强有力的免疫应答。内质网(ER)受体蛋白(STING)对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶(cGAS)在结合 DNA后的活化条件下，内源性地催环二核苷酸cGAMP的合成。cGAMP作为第二信使通过STING刺激干扰素INF-I的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动 I型干扰素INF-β基因的转录。先天免疫STING通路已经被广泛研究，STING作为靶点的免疫激活剂/激动剂通过刺激I型干扰素INF-β基因，具有抗肿瘤、抗AD等疾病的作用。但是，由于STING的激动剂环二核苷酸cGAMP是二级信号分子，其在体内代谢周期短、易被降解引起的不稳定性，限制了其在临床试验中药物的药效和成药性，至今尚没有获批上市的药物。
阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease,AD),俗称老年痴呆症，目前已成为世界最重大的疾病之一，世界现有AD病人近5000万人。全球抗阿尔茨海默病药物多数还处于临床前、临床阶段，主要作用于神经信号通路和Aβ淀粉样蛋白斑。但是，病人众多，药物需求量很大。65岁及以上的 AD患病率达到4.8％，年龄每增加5岁，患病率增长一倍，85岁以上老人AD患病率达到28.9％。
阿尔茨海默症是由德国学者Alosi Alzheimer于1907年首次报道。AD最典型的病理特征为：大脑皮层和海马组织内出现大量的淀粉样蛋白斑块－即老年斑(senileplaques,SP)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)、神经元数量减少和颗粒空泡变性。AD的发病机理十分复杂，可能是多种因素相互作用的结果。迄今为止，其确切的发病机理还是一个未解之谜，但在近三十年的研究证据表明，淀粉样多肽(amyloid-betapeptide,Aβ)、淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)、大脑内稳态调节蛋白及其相关的的金属离子内稳态平衡与AD的发生、发展有着密切的联系。最新研究报道，大脑慢性炎症是AD的显著特征之一。德国波恩大学的一项突破性研究发现：阿尔茨海默症是由脑部免疫细胞的炎症所引起。此前人类对于阿尔兹海默症的致病原因及发病机制一直未能完全确定，这一发现无疑是超级重磅。科学家预言，这项新发现为药物研发提供了新思路，人类或可能在未来五年内治愈甚至预防阿尔兹海默症。该研究结果已发表在世界顶级科学类杂志《自然》上。德国波恩大学MichaelHeneka 教授和他的同事认为，有炎症参与阿兹海默症过程中，β—淀粉样蛋白斑块是由炎症引起的。
环二核苷酸cGAMP，作为STING的天然免疫激动剂已被报道显示了治疗 AD的药效，改善AD模型鼠的学习记忆能力，减少脑内淀粉样斑块，减少大脑慢性炎症等。但是，该免疫激动剂cGAMP是二级信号分子，在体内代谢特别快，严重影响其药效作用时间。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种环二核苷酸金属化合物，该类环二核苷酸金属化合物由环二核苷酸与金属离子(包括锂、镁、锌、锰、铁)形成的金属化合物。这些环二核苷酸金属化合物克服了其在体内代谢过快的缺点，显著延长其在体内代谢周期、体内稳定性明显增加，其在小鼠疾病模型试验中比环二核苷酸本身显示出更显著的抗疾病活性，包括抗阿尔茨海默症、缺血性脑损伤、肿瘤等疾病。因此，这类创新环二核苷酸金属化合物在制备抗疾病药物中具有广阔的应用前景。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：环二核苷酸金属化合物，所述化合物的结构式为[M(环二核苷酸)]或[M'2(环二核苷酸)]，其中，M为Mg2+、 Zn2+、Mn2+或Fe2+，所述M'为Li+，所述环二核苷酸为2’3’-cGAMP、c-di-AMP、 c-di-GMP、c-di-IMP、c-GMP-IMP以及其衍生物中的任意一种。
作为一种优选的实施方式，所述化合物中的M为Mg2+。
本发明的第二个目的是提供环二核苷酸金属化合物的制备方法，包括以下步骤：将环二核苷酸阴离子结合到离子交换柱上，采用目标金属离子的盐溶液梯度洗脱离子交换柱，收集洗脱出来的环二核苷酸金属化合物溶液，浓缩脱盐后，经冷冻干燥或冷却结晶析出目标产物。
本发明另外提供环二核苷酸金属化合物在制备防治神经退行性疾病药物中的应用，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默症、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症、亨丁顿舞蹈症。
作为一种优选的实施方式，所述的环二核苷酸金属化合物为环二核苷酸锂。
本发明另外提供环二核苷酸金属化合物在制备防治缺血性脑血管损伤或颅脑损伤药物药物中的应用。
作为一种优选的实施方式，所述的环二核苷酸金属化合物为环二核苷酸镁。
本发明另外提供环二核苷酸金属化合物在制备抗肿瘤药物及防治抗肿瘤药物导致的毒副作用药物中的应用。
本发明另外提供环二核苷酸金属化合物在制备抗冠状病毒及其病毒性炎症药物、抗病毒疫苗中的应用。
作为应用的一种优选的实施方式，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、肠溶性微粒、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂。
本发明的有益效果是：
1)本发明的环二核苷酸金属化合物由环二核苷酸中两个带负电荷的磷酸根与金属离子之间通过离子键形成稳定的金属化合物结构，以延长其在体内的代谢周期，增加其作为药物时的药效浓度，具有结构简单、在制备抗疾病药物中应用前景广阔的优点。
2)本发明的环二核苷酸金属化合物通过离子交换柱制备，制备方法简单、易于操作，制备得到的环二核苷酸金属化合物纯度高、杂质含量少，方便应用于相关药物的制备。
3)本发明的环二核苷酸金属化合物不仅在制备防治神经退行性疾病、防治缺血性脑血管损伤或颅脑损伤药物、抗肿瘤药物及抗病毒药物等方面具备显著的抗疾病活性，而且其中的环二核苷酸锂在制备防治神经退行性疾病方面、环二核苷酸镁在制备防治缺血性脑血管损伤或颅脑损伤药物方面均具有尤为突出的效果。
附图说明
图1为本发明环二核苷酸金属化合物的结构式。
图2为本发明实施例一、二和五的制备产物的NMR。
图3为本发明实施例三和四的制备产物的NMR。
图4为本发明环二核苷酸化合物的MS图。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种环二核苷酸金属化合物，该化合物的结构式为[M(环二核苷酸)]或[M'2(环二核苷酸)]，其中，结构式中的M可以为Mg2+、Zn2+、Mn2+或Fe2+等正二价金属离子，特别是M为Mg2+形成的环二核苷酸镁；结构式中的M'可以为 Li+等正一价金属离子。环二核苷酸为2’3’-cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、c-di-IMP、 c-GMP-IMP以及其衍生物中的任意一种。在下述实施例中，如不加特殊说明，采用的环二核苷酸均为2’3’-cGAMP(C20H22N10O13P2Na2)。
在环二核苷酸金属化合物用于制备相应药物的应用中，药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、肠溶性微粒、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂，注射静脉注射、静脉滴珠、皮下注射、肌肉注射或脑室直接给药注射。
环二核苷酸2’3’-cGAMP的制备
按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶(cGAS)催化合成，纯度在98％以上。(Li P.W，et al.,Immunity,2013,39(6), 1019-1031.)
实施例一
本实施例提供环二核苷酸锂的制备方法：取环二核苷酸(10毫摩尔)溶于 1L纯净水中，运用AKTA Pure蛋白质纯化仪器，环二核苷酸水溶液通过阴离子交换柱(SOURCE Q，GEHealthcare)，使环二核苷酸结合在SOURCE Q阴离子交换柱上。用3倍柱体积的20mM氯化锂溶液洗该SOURCE Q柱，然后用氯化锂水溶液梯度洗脱(摩尔梯度浓度为50mM～300mM)，本实施例采用的分析出氯化锂购自Sigma公司，收集洗脱下来的环二核苷酸金属化合物[Li2(cGAMP)]溶液。洗脱得到的环二核苷酸锂，用纳滤膜浓缩，纳滤膜滤出溶液中多余的氯化锂，加超纯水后再浓缩，反复5次以上，最后浓缩到1/5(原洗脱液总体积)以下，用冷冻干燥机干燥，所得环二核苷酸锂的产率为78％。环二核苷酸锂的结构如图1所示，对环二核苷酸锂进行金属含量分析和元素分析以及NMR、MS表征，分析结果见表1，其核磁数据见图2，为1HNMR(400MHz,D2O)δ8.22(s,1H),8.03(s,1H),7.69 (s,1H),5.92(s,1H),5.79(d,J＝7.7Hz,1H),5.59(s,1H),4.82(s,2H),4.44(d,J＝21.7Hz,2H),4.22(d,J＝49.6Hz,5H),3.87(s,1H)。环二核苷酸锂的MS图见图3，其 ESI-MS结果显示，目标产物峰为673.0906，为环二核苷酸阴离子的离子峰，即本实施例制备的环二核苷酸锂为金属盐形式，在溶液中以金属盐离子和环二核苷酸根离子分别存在。
实施例二
本实施例与实施例一的区别主要在于：本实施例制备的是环二核苷酸镁，洗脱液采用氯化镁溶液，对收集的的环二核苷酸镁溶液进行浓缩后，在4℃下冷却结晶析出环二核苷酸镁化合物，经恒温箱干燥后得到，所得环二核苷酸镁的产率为81％。环二核苷酸镁的结构如图1所示，对环二核苷酸镁进行金属含量分析和元素分析以及NMR、MS表征，分析结果见表1，其核磁数据与环二核苷酸锂的基本一致，MS图也与环二核苷酸锂的一致。
实施例三
本实施例与实施例一的区别主要在于：本实施例制备的是环二核苷酸锰，洗脱液采用氯化锰，所得环二核苷酸锰的产率为78％。环二核苷酸锰的结构如图1所示，对环二核苷酸锰进行金属含量分析和元素分析以及NMR、MS表征，分析结果见表1。由于锰离子的3d轨道有单电子，具有顺磁性，在进行核磁分析时要加入一定量的EDTA清除Mn2+顺磁离子干扰，其NMR如图2所示，核磁数据为1H NMR(400MHz,D2O)δ8.27(s,1H),7.93(s,1H),7.82(s,1H),5.85(s,1H), 5.71(s,1H),5.51(s,1H),4.31(d,J＝21.3Hz,3H),4.17(s,3H),3.96(s,1H)，其MS图与环二核苷酸锂的一致。
实施例四
本实施例与实施例一的区别主要在于：本实施例制备的是环二核苷酸铁，洗脱液采用硫酸亚铁(含有连二亚硫酸钠还原剂)，所得环二核苷酸铁的产率为 75％。环二核苷酸铁的结构如图1所示，对环二核苷酸铁进行金属含量分析和元素分析以及NMR、MS表征，由于铁离子的3d轨道有单电子，具有顺磁性，在进行核磁分析时要加入一定量的EDTA清除Fe2+顺磁离子干扰，分析结果见表1，其核磁数据与环二核苷酸锰的基本一致，其MS图也与环二核苷酸锂的一致。
实施例五
本实施例与实施例一的区别主要在于：本实施例制备的是环二核苷酸锌，洗脱液采用氯化锌溶液(pH值调到弱酸性～6)，所得环二核苷酸锌的产率为 72％。环二核苷酸锌的结构如图1所示，对环二核苷酸镁进行金属含量分析和元素分析以及NMR、MS表征，分析结果见表1，其核磁数据与环二核苷酸锂的基本一致，MS图也与环二核苷酸锂的一致。
表1实施一至五制备的环二核苷酸金属化合物的金属和C、H、N元素分析结果
实施例六
本实施例提供实施例一至五所制备的环二核苷酸金属化合物在制备防治神经退行性疾病药物的应用，主要验证环二核苷酸金属化合物对AD小鼠认知能力的影响。
实验材料为购自南方模式生物技术股份有限公司的APP/PSI转基因AD模型小鼠，4月龄，体重24-26g。将AD鼠随机分为7组，每组10只，7组分别为：A： AD模型组，作为阴性对照组(给药：生理盐水)；B：cGAMP组，作为阳性对照组(给药：环二核苷酸)；C：[Li2(cGAMP)]组(给药：实施例一制备的环二核苷酸锂)；D：[Mg(cGAMP)]组(给药：实施例二制备的环二核苷酸镁)；E：[Zn(cGAMP)] 组(给药：实施例五制备的环二核苷酸锌)；F：[Mn(cGAMP)]组(给药：实施例三制备的环二核苷酸锰)；G：[Fe(cGAMP)]组(给药：实施例四制备的环二核苷酸铁)。其中，C-G组所给药物的配制方法为：采用生理盐水将相应实施例制备得到的粉末配制成所需浓度的溶液，各组的给药剂量均为10mg/kg，给药方式为腹腔注射，给药次数为：每2天给药1次，连续60天。
Morris水迷宫实验装置及方法：
圆形水池，直径1m，高50cm，水深30cm，池底白色，水温保持在23±2℃；池壁上标记四个等距离点N、E、S、W作为试验的起始点，分水池为四个象限，在第三象限中央放置平台(平台与池壁圆心距离相等)；没于水下1cm，使平台不可见。水池周围贴有丰富的参照线索(不同颜色三角形、四方形、圆、菱形置于各个象限)且保持不变，供小鼠用来定位平台。定位航行试验：试验供历时6天，每天定于固定时间段训练4次。训练开始时，将平台置于第一象限，从池壁四个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水中。自由录像记录系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径，4次训练即将小鼠分别从四个不同的起始点 (不同象限)放入水中。小鼠找到平台后或90秒内找不到平台(潜伏期记为90 秒)，则由实验者将其引导到平台，在平台上休息10秒，再进行下一次试验。
空间探索试验：
定位航行试验结束24h后，撤除站台。然后将鼠由第三象限放入水中，记录鼠在180s内的游泳路径，记录鼠在目标象限(第三象限)的停留时间和穿越原站台所在位置的次数，观察受试鼠的空间定位能力。利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验比较各组差异的显著性。实验结果如表2所示。
表2环二核苷酸金属化合物对AD小鼠认知能力的改善作用
组别 AD鼠穿过第三象限平台的时间百分比(％)
A：AD模型组 0.38±0.21
B：cGAMP组 0.62±0.17
C：[Li2(cGAMP)]组 0.91±0.18
D：[Mg(cGAMP)]组 0.78±0.10
E：[Zn(cGAMP)]组 0.86±0.16
F：[Mn(cGAMP)]组 0.83±0.21
G：[Fe(cGAMP)]组 0.81±0.23
由表2可见，B组采用环二核苷酸的阳性对照组和采用环二核苷酸金属化合物的C-G组在给药60天后均能明显改善阿尔茨海默症小鼠的认知能力。C-G组 (环二核苷酸金属化合物给药组)对AD小鼠认知能力的改善作用比B组(环二核苷酸阳性对照组)都有明显的提高，其中，C组(环二核苷酸锂给药组)的改善效果要明显优于其他环二核苷酸金属化合物的改善效果，应用环二核苷酸锂制备防治神经退行性疾病药物的药效尤为突出，显示出更优的药效提升。
实施例七
本实施例提供实施例一至五所制备的环二核苷酸金属化合物在制备防治神经退行性疾病药物的应用，主要验证环二核苷酸金属化合物对AD小鼠脑淀粉样蛋白斑块的影响。
本实施例与实施例六的区别主要在于：在7组AD模型小鼠给药60天后，检测AD鼠大脑淀粉样蛋白斑块削减情况。本实施例进行的实验为硫黄素S染色实验，实验流程为：给药60天后，取小鼠脑组织，固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，TBS洗三次，0.3％硫黄素S(溶于50％乙醇)滴于组织上，室温孵育10min，50％乙醇洗三次，TBS清晰，阴干，封片，激光共聚焦显微镜(Leica,Germany)检测AD鼠脑淀粉样斑块沉积量的变化。实验结果如表 3所示。
表3环二核苷酸金属化合物抑制AD小鼠脑淀粉样蛋白斑块效果
组别 AD鼠脑组织淀粉样斑块荧光强度平均计数点(视野区域)
A：AD模型组 2870±189
B：cGAMP组 1790±180
C：[Li2(cGAMP)]组 165±75
D：[Mg(cGAMP)]组 480±80
E：[Zn(cGAMP)]组 360±75
F：[Mn(cGAMP)]组 390±87
G：[Fe(cGAMP)]组 410±91
由表3可见，B组采用环二核苷酸的阳性对照组和采用环二核苷酸金属化合物的C-G组在给药60天后均能明显减少阿尔茨海默症小鼠脑组织淀粉样蛋白斑块量，与其他环二核苷酸金属化合物的给药组相比，环二核苷酸锂(C组)的改善效果尤为突出，应用环二核苷酸锂制备防治神经退行性疾病药物的药效显示出更优的药效提升。
实施例八
本实施例提供实施例一至五所制备的环二核苷酸金属化合物在制备防治缺血性脑血管损伤药物的应用，主要验证环二核苷酸金属化合物对缺血性脑血管损伤小鼠的影响。
实验动物：健康雄性ICR小鼠，体重18-20克，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格证号(SCXK(沪)2007-0005)，饲养于清洁剂动物房。
小鼠模型：小鼠线栓法制作局部脑缺血模型，验证环二核苷酸金属化合物对试验性动物脑缺血性脑疾病的治疗作用。
实验方法：实验小鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离并结扎右侧颈总动脉近心段、颈动脉及其分支血管。分离右侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分支。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，扎入尼龙线，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤去动脉夹，扎进备线，缝合皮肤，术后回笼饲养。缺血2小时后腹腔注射给药，拔出尼龙线进行再灌注，再灌注8 小时后再给药。术后进行行为学评分，评分采用单盲法，评分参考Zea Longa 5 分制评分标准，评分法如下：0分，小鼠正常，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，相对测倾倒；4分，不能自发行走，意识伤失。
实验中将小鼠分为7组，每组10只，7组分别为：A：AD模型组，作为阴性对照组(给药：生理盐水)；B：cGAMP组，作为阳性对照组(给药：环二核苷酸)；C：[Li2(cGAMP)]组(给药：实施例一制备的环二核苷酸锂)；D：[Mg(cGAMP)]组(给药：实施例二制备的环二核苷酸镁)；E：[Zn(cGAMP)]组(给药：实施例五制备的环二核苷酸锌)；F：[Mn(cGAMP)]组(给药：实施例三制备的环二核苷酸锰)；G：[Fe(cGAMP)]组(给药：实施例四制备的环二核苷酸铁)。其中，C-G 组所给药物的配制方法为：采用生理盐水将相应实施例制备得到的粉末配制成所需浓度的溶液，各组的给药剂量均为10mg/kg，给药方式为腹腔注射，缺血2 小时后给药1次，拔出尼龙线进行再灌注，再灌注8小时后再给药1次。24小时后每天给药1次，给药7天。各组的实验结果如表4所示。
表4环二核苷酸金属化合物治疗缺血性脑血管损伤对其行为学评分结果
组别 行为学评分(术后24h) 行为学评分(术后7d)
A：AD模型组 3.50±0.28 2.96±0.24
B：cGAMP组 2.15±0.32 1.67±0.41
C：[Li2(cGAMP)]组 1.82±0.19 1.49±0.26
D：[Mg(cGAMP)]组 1.18±0.24 1.09±0.18
E：[Zn(cGAMP)]组 1.57±0.38 1.31±0.15
F：[Mn(cGAMP)]组 1.62±0.39 1.38±0.27
G：[Fe(cGAMP)]组 1.67±0.35 1.41±0.29
如表4所示，B-G组的腹腔注射给药均能改善局部性脑缺血小鼠行为学评分，与环二核苷酸给药组(B组)相比，环二核苷酸金属化合物给药组(C-G组)对缺血性脑血管损伤具有更明显药效，其中，环二核苷酸镁(D组)的改善效果尤为突出，其所制备的防治缺血性脑血管损伤药物明显具备得到显著提高的药效。
实施例九
本实施例提供实施例一至五所制备的环二核苷酸金属化合物在制备防治缺血再灌注损伤药物的应用，主要验证环二核苷酸金属化合物对缺血再灌注损伤小鼠的影响。
实验动物：健康雄性大鼠，体重280-300克，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格证号(SCXK(沪)2007-0005)，饲养于清洁剂动物房。
大鼠脑缺血模型建立和实验方法：选取280-300克雄性SD大鼠进行实验，术前12h禁食不禁水，称重编号并进行随机分组。以0.3mL/100g剂量腹腔注射 10％水合氯醛进行麻醉，待大鼠无疼痛反射后颈部备皮，将其仰卧固定在鼠板上，消毒棉球给颈部皮肤消毒后，沿颈正中剪开约1cm皮肤，暴露皮下组织，用弯镊钝性拨开皮下脂肪及筋膜，暴露颈部肌群。找到二腹肌将其掀开便能看到颈总动脉及其向上的颈内和颈外分支，仔细剥离颈外动脉、颈内动脉和颈总动脉，并在三根动脉下方各穿一根细线，用自制的塑料垫片垫在颈总动脉下方。结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，用动脉夹夹闭颈内动脉后将自制的弯钩扎进颈总动脉，挑起血管后将线栓引入颈总动脉，取下垫片轻推线栓使其进入颈内动脉，继续轻推至颅内，待线栓黑色标记处(18mm左右)超过颈内与颈外交叉处时，可感受到明显的阻力，说明线栓头部已经超过大脑中动脉与前动脉交叉处进入前动脉，此时已经阻断大脑中动脉来自前动脉的血液供应。将颈内动脉下方的细线结扎来固定线栓防止线栓回退，把多余的细线剪短在伤口上涂抹青霉素防止感染并进行缝合，缝合后将大鼠放暖灯下保暖。从线栓开始阻断大脑中动脉血流开始计时，2h后轻轻拉出线栓看到黑色标记即可实现再灌注。
TTC染色：在实现大鼠脑缺血2h再灌注24h损伤后，以0.3mL/100g剂量腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹主动脉放血减少大脑中血液对染色的影响，立即断头取出完整大脑，用生理盐水浸洗后迅速放入-20℃冰箱冷冻20min。取出冷冻后的大脑用刀片进行冠状面切片，每片约为2mm。在2％TTC溶液中避光染色20min，在4％多聚甲醛溶液中固定6h后进行拍照，之后用Photoshop软件进行面积圈定和计算，脑缺血面积百分比＝白色区域面积总和/缺血侧半脑面积总和×100％。
药物配制及实验分组：阳性对照药采用依达拉奉，依达拉奉注射液规格为 30mg/20mL，大鼠单次给药剂量为0.4mL/100g，即单次给药剂量为6mg/kg。实施例一至五制备的环二核苷酸金属配合物分别用生理盐水配置成0.75mg/mL浓度的注射药物，每只大鼠尾静脉给与0.4mL/100g剂量药物，即单次给药剂量为 5mg/kg。将大鼠分为8组，每组10只大鼠，8组分别为：模型组：生理盐水，按4mg/kg尾静脉注射；阳性对照组：依达拉奉，按6mg/kg尾静脉注射；组Ⅰ：环二核苷酸，按5mg/kg尾静脉注射；组Ⅱ：[Li2(cGAMP)]，按5mg/kg尾静脉注射；组Ⅲ：[Mg(cGAMP)]，按5mg/kg尾静脉注射；组Ⅳ：[Zn(cGAMP)]，按5mg/kg 尾静脉注射；组Ⅴ：[Mn(cGAMP)]，按5mg/kg尾静脉注射；组Ⅵ：[Fe(cGAMP)]，按5mg/kg尾静脉注射。给药组每只大鼠在缺血30min后尾静脉注射给药。通过对各组大鼠脑组织TTC染色结果统计，统计结果如表5所示。
表5环二核苷酸金属化合物对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗作用效果
组别 大鼠脑缺血面积百分比均值(％)
模型组 46.89
阳性对照组 28.97
组ⅠcGAMP 26.86
组Ⅱ[Li2(cGAMP)] 25.25
组Ⅲ[Mg(cGAMP)] 18.16
组Ⅳ[Zn(cGAMP)] 23.52
组Ⅴ[Mn(cGAMP)] 25.56
组Ⅵ[Fe(cGAMP)] 26.78
由表5可见，阳性对照组和各实验组的大鼠脑缺血面积百分比均较模型组明显减少，环二核苷酸金属化合物对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。同时，在各实验组中，环二核苷酸镁(组Ⅲ)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用最好，显著优于阳性对照组，也明显优于其他环二核苷酸金属化合物。
实施例十
本实施例提供实施例一至五所制备的环二核苷酸金属化合物在制备抗肿瘤药物的应用，主要验证环二核苷酸金属化合物对小鼠移植肿瘤生长的抑制作用。
实验动物：BALB/C普通小鼠，C57BL/6普通小鼠，雄性，体重20-22克，7-8 周龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
饲养条件：所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23±2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。
肿瘤细胞株：小鼠结直肠癌细胞株CT26，小鼠乳腺癌细胞株4T1，均购自中国科学院细胞库。
肿瘤模型鼠的建立与干预：细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0×107)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2ml细胞悬液(细胞数目为2.0×106个/只)，7天左右植瘤成功。将植瘤成功的小鼠随机均分为7 组，每组10只，7组分别为：A：阴性对照组(注射生理盐水)、B：阳性对照cGAMP 组(10mg/kg)、C：[Li2(cGAMP)]组(10mg/kg)、D：[Mg(cGAMP)]组(10mg/kg)、E： [Zn(cGAMP)]组(10mg/kg)、F:[Mn(cGAMP)]组(10mg/kg)、G：[Fe(cGAMP)]组 (10mg/kg)。给药方式为腹腔注射给药，给药体积为200微升/只，每2天给药1 次，连续给药20天。20天后，处死小鼠并称瘤体重量，抑瘤率＝[1-实验组平均瘤重/A阴性对照组平均瘤重]×100％。
按照上述模型建立方法分别培养小鼠结直肠癌细胞株CT26，移植到BAlB/C 普通小鼠，小鼠乳腺癌细胞株4T1，移植到BAlB/C普通小鼠，观察不同药物抗肿瘤效果。
统计分析：数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验比较各组瘤重差异的显著性，数据统计结果如表 6和表7所示。
表6环二核苷酸金属化合物对BAlB/C小鼠结直肠癌细胞CT26皮下移植瘤的抑制作用
注：*P<0.05vs阴性对照组；**P<0.01vs阴性对照组
表7环二核苷酸金属化合物对BAlB/C鼠乳腺癌4T1皮下移植瘤的抑制作用
组别 平均瘤重(g) 平均抑瘤率(％)
阴性对照组 1.846±0.165 /
阳性对照cGAMP组 0.761±0.157** 58.8
C：[Li2(cGAMP)]组 0.712±0.146** 61.5
D：[Mg(cGAMP)]组 0.679±0.183** 63.2
E：[Zn(cGAMP)]组 0.212±0.135** 89.1
F：[Mn(cGAMP)]组 0.287±0.116** 84.9
G：[Fe(cGAMP)]组 0.301±0.116** 83.6
注：*P<0.05vs阴性对照组；**P<0.01vs阴性对照组
由表6和表7可见，由小鼠皮下接种肿瘤细胞后制备成功的移植瘤模型，环二核苷酸金属化合物均可明显抑制肿瘤生长，给药21天后的瘤重均显著低于阴性对照组(P<0.05，P<0.01)，表明环二核苷酸金属化合物均优于cGAMP给药组，其中[Zn(cGAMP)]组和[Mn(cGAMP)]组具有突出提高的抗肿瘤作用。
实施例十一
本实施例提供实施例三和五所制备的环二核苷酸金属化合物在制备防治抗肿瘤药物导致的毒副作用药物中的应用，主要验证环二核苷酸金属化合物对抗癌化药的毒副作用的降低效果。
实验动物：BALB/C普通小鼠，雄性，体重20-22克，7-8周龄，SPF级，购于南方模式生物科技有限公司。
饲养条件：所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23±2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。
肿瘤细胞株为小鼠结直肠癌细胞株CT26，均购自中国科学院细胞库。
肿瘤模型鼠的建立与干预：细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0×107)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2ml细胞悬液(细胞数目为2.0×106个/只)，7天左右植瘤成功。将小鼠随机分为5组，每组10只， 5组分别为：A：阴性对照组(注射生理盐水)、B：阳性对照奥沙利铂组(5mg/kg)、 C：奥沙利铂(5mg/kg)+cGAMP(10mg/kg)、D：奥沙利铂(5mg/kg)+ [Mn(cGAMP)](10mg/kg)、E：奥沙利铂(5mg/kg)+[Zn(cGAMP)](10mg/kg)。给药方式为腹腔注射给药，给药体积为200微升/只，每2天给药1次，连续给药20 天。20天后，称量小鼠体重，取血，然后处死小鼠并称瘤体重量，抑瘤率＝[1- 实验组平均瘤重/A阴性对照组平均瘤重]×100％。
结果分析：
1.环二核苷酸金属化合物对小鼠体重和生存率的影响：统计小鼠给药20天后体重下降百分数、生存率和平均抑瘤率，统计结果如表8所示。
表8小鼠体重下降百分数、生存率和平均抑瘤率
组别 体重下降(％) 生存率(％) 抑瘤率(％)
A：阴性对照组 / 100 /
B：阳性对照奥沙利铂组 40 50 78
C：奥沙利铂+cGAMP 10 90 84
D：奥沙利铂+[Mn(cGAMP)] 8 100 92
E:奥沙利铂+[Zn(cGAMP)] 6 100 95
由表8可见，环二核苷酸及其金属化合物[Mn(cGAMP)]、[Zn(cGAMP)]显著降低了铂金属配合物的毒副作用。阳性对照奥沙利铂组体重下降了40％；奥沙利铂与环二核苷酸金属化合物联合用药后比奥沙利铂单用毒性小很多，生存率和抑瘤率显著提高了，环二核苷酸锰和环二核苷酸锌对抗癌化药的毒副作用改善效果显著，达到了增效减毒的作用。
2.环二核苷酸金属化合物降低抗肿瘤化药的血液毒性：对实验中各组小鼠进行外周血的采集，对比其血常规检测结果，检测结果如表9所示。
表9各组小鼠外周血的血常规检验结果
由表9可见，阳性对照奥沙利铂组的红细胞数目和血红蛋白含量均明显低于阴性对照组的正常值。环二核苷酸及其金属化合物与奥沙利铂联合用药后，其血液检测指标明显优于阳性对照奥沙利铂组，血常规指标均在正常范围，与阴性对照组的正常数据一致。可见，[Mn(cGAMP)]、[Zn(cGAMP)]均能显著降低抗肿瘤化药奥沙利铂的血液毒性。
3.环二核苷酸金属化合物降低抗肿瘤化药对小鼠肝肾的毒性：对各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和肌酐(Creatinine)的含量进行了统计，统计结果如表10所示。
表10各组小鼠血清中ALT和Creatinine含量统计
组别 ALT(U/L) Creatinine(μmol/L)
正常鼠(参考值) 81.45±9.16 36.56±3.02
A：阴性对照组 86.78±3.86 38.26±0.25
B：阳性对照奥沙利铂组 118.25±7.84 80.33±4.65
C：奥沙利铂+cGAMP 88.05±0.56 39.28±4.36
D：奥沙利铂+[Mn(cGAMP)] 81.25±6.85 34.46±3.89
E:奥沙利铂+[Zn(cGAMP)] 82.46±7.35 35.46±4.16
由表10可见，与正常组相比，在肝功能指标上，阳性对照奥沙利铂组的ALT 和Creatinine含量均明显超出了正常值，环二核苷酸及其金属化合物与奥沙利铂联合用药后，其指标与正常组含量疾病一致，没有呈现明显的变化。奥沙利铂对小鼠的肝脏和肾脏产生了损伤，环二核苷酸锰和环二核苷酸锌均能显著降低抗肿瘤铂药对肝肾的毒副作用。
实施例十二
本实施例提供实施例一至五所制备的环二核苷酸金属化合物作为免疫佐剂在制备抗病毒疫苗中的应用，主要验证环二核苷酸金属化合物的免疫佐剂功能。
实验动物：BALB/C普通小鼠，雄性，体重20-22克，7-8周龄，SPF级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
饲养条件：所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23±2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。
小鼠免疫：将小鼠随机分为8组，每组10只，8组分别为：A：阴性对照组； B：OVA+铝佐剂；C：OVA+环二核苷酸；D：OVA+[Li2(cGAMP)]；E：OVA+[Mg(cGAMP)]；F：OVA+[Zn(cGAMP)]；G：OVA+[Mn(cGAMP)]；H：OVA+[Fe(cGAMP)]。B-H组每只小鼠皮下注射10微克OVA和100微克的铝佐剂或环二核苷酸或其金属化合物，阴性对照组注射生理盐水。分别在第1，7，14天各免疫一次，在第21天获得肺灌洗液和取血样。用ELISA法测定环二核苷酸金属化合物作为佐剂诱导产生抗体的效价，实验结果见表11。
表11环二核苷酸金属化合物的免疫佐剂药效
由表11可见，作为免疫佐剂，环二核苷酸及其金属化合物均能显著诱导免疫抗体，而且效果明显优于铝佐剂。其中，[Mn(cGAMP)]和[Zn(cGAMP)]具有突出的免疫佐剂药效作用，比环二核苷酸及其他金属配合物具有更显著的提高。
实施例十三
本实施例提供实施例一至五所制备的环二核苷酸金属化合物在制备抗病毒性炎症药物的应用，主要验证环二核苷酸金属化合物诱发激活获得性免疫的作用。
实验动物：BALB/C普通小鼠，C57BL/6普通小鼠，雄性，体重20-22克，7-8 周龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
饲养条件：所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23±2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。
将小鼠随机均分为8组，每组10只，8组分别为：A：阴性对照组(同型对照抗体组)、B：空白组、C：环二核苷酸组、D：[Li2(cGAMP)]组、E：[Mg(cGAMP)]组、F:[Zn(cGAMP)]组、G：[Mn(cGAMP)]组(10mg/kg)、H：[Fe(cGAMP)]组。同型对照流式抗体购自eBiosciences,抗体磁株购于Militeny Biotech,流式细胞仪购于 BD公司，免疫14天(免疫过程同实施例十二)后取小鼠脾脏、肺组织，分别研磨捣碎，过40微米孔脱过滤细胞，1000rpm离心10分钟，分离未被裂解的免疫细胞，用抗体磁株分离DC(CD40\CD80\CD86\MHCII)、T(CD8+)细胞，加入对应的FAC抗体(用FACS缓冲液稀释)，同型对照抗体作为阴性对照，抗体加入后孵育1小时后离心，用PBS清洗，用流式细胞仪分析样品，分选合适的细胞，测定选定细胞的荧光强度(MFI)，流式结果见表12。
表12环二核苷酸金属化合物诱发免疫细胞活化效果
由表12可见，环二核苷酸金属化合物均能显著活化树突状细胞DC和T细胞，其中，[Mn(cGAMP)]和[Zn(cGAMP)]具有突出的诱导获得性免疫药效作用，比环二核苷酸及其他金属配合物具有更显著的提高。
环二核苷酸金属化合物急性毒性研究：
实验材料：ICR小鼠20只(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，雌雄各半，体重20～22g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。
实验方法：ICR小鼠按体重分别腹腔注射1g/kg的环二核苷酸金属化合物药物(注射用生理盐水配制)，观察给药后小鼠14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠腹腔注射给药后，小鼠活动正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。
实验结果：上述急性毒性实验结果表明，腹腔注射给药最大耐受量MTD不低于1g/Kg，说明环二核苷酸金属化合物药物的急性毒性低。
环二核苷酸金属化合物在血液中的稳定性检测：
实验动物：选用SD大鼠，体重200-220g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
饲养条件：所有大鼠均自由觅食和饮水，在室温(25±2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为SPF级。
试验主要步骤：选用体重为200-220g SD大鼠，随机分为7组，每组10只；分别为空白对照组(注射用生理盐水)、cGAMP组、[Li2(cGAMP)]组、[Mg(cGAMP)]组、[Mn(cGAMP)]组、[Zn(cGAMP)]组、[Fe(cGAMP)]组。通过尾静脉注射进大鼠体内，每只鼠注射药物剂量为10mg/kg。在固定时间点(0h，1h，2h，4h，6h， 8h，10h，12h，14h，16h，20h，24h)利用毛细血管通过眼静脉取血1ml，置于1.5ml离心管内，血样离心30分钟，取上层血清存入-80℃待用。利用大鼠ELISA 试剂盒测定血清中cGAMP和IFN-β的浓度。基于cGAMP或环二核苷酸金属化合物激活天然免疫通路诱导产生IFN-β，通过检测血液中IFN-β的含量，评估cGAMP 和环二核苷酸金属化合物在血液中的稳定性和激活免疫通路的活性。用试剂盒分别检测每组小鼠按时间点所取血样中的浓度值(包括cGAMP和IFN-β)，计算每个时间点的浓度值及其平均值，绘出浓度随时间变化曲线，得到浓度曲线峰值，结果如表13所示。
表13环二核苷酸金属化合物在血液中的稳定性及其诱导产生IFN-β含量
组别 cGAMP血样平均浓度峰值(小时) IFN-β血样平均浓度峰值(小时)
空白对照组 / /
cGAMP对照组 2.0 4.0
[Li2(cGAMP)]组 4.1 5.6
[Mg(cGAMP)]组 4.3 5.9
[Mn(cGAMP)]组 4.7 6.0
[Zn(cGAMP)]组 4.8 6.2
[Fe(cGAMP)]组 4.5 5.6
由表13可见，在大鼠血液中cGAMP的浓度和由其诱导产生的IFN-β的生物效应平均浓度峰值时间有明显变化，环二核苷酸金属化合物均比cGAMP对照组有显著代谢周期增长作用。可见环二核苷酸金属化合物比环二核苷酸本身更稳定，在血液中代谢周期更长，药效浓度显著增加，显著增强了其药效作用， [Zn(cGAMP)]和[Mn(cGAMP)]药物稳定性及其药效有效浓度尤为突出。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种环二核苷酸金属化合物在制备防治神经退行性疾病药物中的应用，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默症、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症、亨丁顿舞蹈症；
所述的环二核苷酸金属化合物为环二核苷酸锂，所述环二核苷酸为2’3’-cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、c-di-IMP、c-GMP-IMP以及其衍生物中的任意一种。
2.一种环二核苷酸金属化合物在制备防治缺血性脑血管损伤或颅脑损伤药物药物中的应用；
所述的环二核苷酸金属化合物为环二核苷酸镁，所述环二核苷酸为2’3’-cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、c-di-IMP、c-GMP-IMP以及其衍生物中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、肠溶性微粒、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂。
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