CN115322963A

CN115322963A - 一种原代临床级脂肪干细胞分离制备的方法

Info

Publication number: CN115322963A
Application number: CN202110508050.0A
Authority: CN
Inventors: 王丽莎; 刘冬羽; 李治寰
Original assignee: Dongguan Xuanguan Stem Cell Regenerative Medicine Co ltd
Current assignee: Dongguan Xuanguan Stem Cell Regenerative Medicine Co ltd
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2021-05-10
Publication date: 2022-11-11

Abstract

本发明涉及一种原代临床级脂肪干细胞的分离方法。主要步骤为将5～10mL抽脂脂肪组织及膨胀液转移至50mL离心管中，加入45mL生理盐水颠倒混匀后，400g，离心7min，此时离心管内分为四层，从上到下依次为油脂层、脂肪组织层、生理盐水层和细胞沉淀层。用巴氏吸管将脂肪组织转移至新的离心管中，保留最下面一层细胞沉淀，用完全培养基重悬细胞沉淀并接种至培养瓶培养。向脂肪组织中加入人源I型胶原蛋白酶，37℃，180～200rpm消化20～30min后，加入完全培养基终止消化，收集离心管底部细胞沉淀，加入完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至培养瓶培养；每3天更换一次培养液，待细胞融合度达90～95％时进行消化传代，对P3细胞进行细胞表面抗原检测和三系分化能力检测。

Description

一种原代临床级脂肪干细胞分离制备的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种原代临床级脂肪干细胞的分离制备方法。

背景技术

脂肪干细胞(Adipose-derived Stem Cells，ADSCs)是一类来源于脂肪组织的具有多向分化潜能的干细胞。脂肪干细胞能够向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞等分化，另外脂肪干细胞分泌的生长因子对于促进血管再生和组织损伤修复有重要作用。这使得脂肪干细胞在临床应用中具有巨大的潜力。

原代脂肪干细胞的分离方法有两种，一种是组织贴壁法，一种是酶消化法。虽然组织贴壁法与酶消化法相比具有不引入外源物质，对细胞损伤小的优势，但是由于其所需时间长，操作步骤繁琐，因此目前较为普遍的分离方法还是酶消化法。传统的酶消化法存在以下问题：(1)传统的酶消化方法需要大量的脂肪组织才可以得到足够的脂肪干细胞，脂肪组织利用率不高；(2)分离大量脂肪组织增加分离成本；(3)大面积抽脂易引起供者不适及易引起后期炎症反应；(4)所用消化酶存在动物来源成分。

要获得临床级的脂肪干细胞，后续的细胞培养也很重要，但是目前市面上大部分机构在干细胞培养过程中使用胎牛血清等动物源性成分，这在临床应用中存在一定的风险。

发明内容

为了解决上述问题，我们发明了一种原代临床级脂肪干细胞的分离制备方法，其分离方法包括以下步骤：

1.采用肿胀抽脂方法对经过病毒(乙型肝炎病毒、丙肝病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、梅毒等传染性疾病)检测结果为阴性，无家族性病史(血液系统疾病、代谢性疾病、染色体异常、免疫缺陷病等)的供者采集脂肪组织5～10mL。

2.将5～10mL抽脂脂肪组织及膨胀液转移至50mL离心管中，加入生理盐水至45mL，盖上盖子，上下颠倒离心管以洗涤脂肪组织。将离心管放入离心机中，400g，离心7min后，离心管内物体分为四层，从上到下依次为油脂层、脂肪组织层、生理盐水层和细胞沉淀层。用巴氏吸管将最上面一层油脂层吸走，将脂肪组织转移至新的离心管中，保留最下面一层细胞沉淀，将细胞沉淀用生理盐水洗涤一次后，加入完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至培养瓶培养。

3.将脂肪组织用生理盐水再清洗2～3次后，加入I型胶原蛋白酶，放置于摇床中，37℃，180～200rpm 消化20～30min后加入完全培养基终止消化，400g，离心7min后保留离心管底部细胞沉淀，用生理盐水洗涤细胞沉淀后，加入完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至培养瓶培养。

4.培养3天后更换完全培养基，待细胞融合度达90～95％时，采用TrypLE酶对细胞消化传代。细胞传代至P3进行细胞表面抗原检测和三系分化能力检测。

具体的步骤3中脂肪组织消化操作步骤为将脂肪组织以2～3mL每个50mL离心管的量分配至离心管中，向离心管中加入脂肪组织体积1～1.5倍的浓度为0.1～0.2％的I型胶原蛋白酶进行消化，酶体积优选为脂肪组织的1倍，加入的胶原蛋白酶浓度优选为0.15％。

上述步骤中所用完全培养基由补充成分和基础培养基组成，补充成分优选为不含动物来源的血清替代物，优选为人血小板裂解液；基础培养基优选为低糖培养基，优选为α-MEM。其中补充培养基所占体积比优选3～10％，优选为5％。

本发明的优点：通常采用抽脂方法得到的脂肪样本中的液体部分会被当做废弃物丢弃，采用本方法分离脂肪干细胞使采集的样本各成分得到充分利用，从肿胀液和脂肪组织分别分离出原代脂肪干细胞，只需少量脂肪组织即可获得足够的可供临床使用的脂肪干细胞，减少供者的不适，提高组织利用率，同时能够节约生产成本；在培养5～6天后，原代细胞融合度即可达到90％左右，避免了培养过程中细胞多次分裂导致的活性降低；只需一种人源的胶原蛋白酶即可使组织在短时间内充分消化，整个操作过程简单方便，也避免了酶消化过久对细胞的损伤，另外采用人源的酶对组织进行消化降低了临床应用的风险；采用血小板裂解液作为血清替代物，在保证细胞质量的同时避免了动物源性物质带来的风险。

附图

图1(7mL抽脂脂肪中)肿胀液和脂肪组织中分离的原代脂肪干细胞数量(左图)和活率(右图)。

图2 P3代脂肪干细胞表面抗原检测结果。

图3 P3代脂肪干细胞成脂(50×)、成骨(50×)、成软骨分化染色结果(20×)。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明做进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

1.组织采集：采用抽脂方法对经过病毒(乙型肝炎病毒、丙肝病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、梅毒等传染性疾病)检测结果为阴性，无家族性病史(血液系统疾病、代谢性疾病、染色体异常、免疫缺陷病等)的供者采集脂肪组织7mL。

2.脂肪组织预处理：将抽脂脂肪组织及肿胀液转移至50mL离心管中，加入生理盐水至45mL，盖上盖子，上下颠倒离心管以洗涤脂肪组织。将离心管放入离心机中，400g，离心7min后，离心管内分为四层，从上到下依次为油脂层、脂肪组织层、生理盐水层和细胞沉淀层。用巴氏吸管将最上面一层油脂层吸走，将脂肪组织转移至新的离心管中，同时收集最下面一层细胞沉淀备用；将最下面一层细胞沉淀用生理盐水洗涤1次后加入含5％血小板裂解液的完全培养基后转移至培养瓶进行培养，该部分细胞即为肿胀液中分离得到的细胞。

3.脂肪干细胞分离：将收集的脂肪组织用生理盐水清洗2～3次后，按照脂肪组织与酶体积比1∶1～1∶1.5 加入终浓度为0.1～0.15％胶原蛋白酶，放置于摇床中，37℃，180～200rpm消化20～30min后加入等体积完全培养基终止消化，400g，离心7min后保留离心管底部细胞沉淀，然后用生理盐水重悬沉淀，细胞悬液经100μm细胞筛网过滤后，补加生理盐水至45mL，400g，离心7min后，弃上清，加入等体积的含5％血小板裂解液的完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至培养瓶培养；

4.脂肪间充质干细胞纯化培养：细胞在37℃，5％CO₂培养箱中培养3天后观察细胞贴壁情况，并更换新鲜的完全培养基，继续培养3～4天，细胞即可进行传代操作。倒掉培养瓶中培养液，加入5mL生理盐水洗涤细胞后，加入TrypLE酶，消化2min后，立即加入等体积的含5％血小板裂解液的完全培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打瓶底，使细胞脱落，收集细胞悬液，400g，离心5min后向细胞沉淀中加入适量完全培养基重悬细胞，取20μL细胞悬液，使用细胞计数仪进行计数，按照6000个细胞/cm²密度接种至 T175的培养瓶中。传代至P3进行细胞表面抗原检测和分化能力检测。

5.细胞表面抗原检测：将含1.8×10⁶个P3脂肪干细胞的细胞悬液以110μL每管的体积均分到9个EP 管中，平均每管放入2.0×10⁵个细胞，并做如下标记：PE-ISO/CD13/CD29/CD31/CD44/CD45/CD73/CD90/ CD105，3000rpm，离心6min，小心去上清。加入25μL的PBS重悬，各加入5μL流式单抗 PE-ISO/CD13/CD29/CD31/CD44/CD45/CD73/CD90/CD105，轻柔吹打混匀，放入4℃冰箱避光孵育30min。孵育终止后，每管加入500μL PBS洗一遍样品，3000rpm离心6min，小心弃上清；重复洗涤一次后，加入200μL PBS重悬，转移到流式管中，用流式细胞仪进行流式检测。

6.细胞三系分化能力检测：取P3脂肪干细胞，以1.0×10⁴个细胞/孔的密度接种到12孔板，加入1ml 完全培养基，将细胞于37℃，5％CO₂培养箱中培养至细胞达到60％融合。12孔细胞分成三组，培养基分别更换成脂诱导、成骨诱导和成软骨诱导培养基。每隔一段时间用同样的培养基换一次液。诱导14天后，对成脂诱导的细胞进行油红O染色观察红色油滴；诱导21天后，对成骨诱导的细胞进行茜素红染色，观察钙结节；培养19天以后，对成软骨诱导的细胞用阿利新蓝染液进行染色，并记录实验结果。

7.实验结果：通过对脂肪组织和肿胀液中分离得到的脂肪干细胞数量进行统计，结果显示肿胀液中得到的原代脂肪干细胞数量为1.10×10⁶个，脂肪组织消化所得原代脂肪干细胞数量为1.98×10⁶个，两种方式所得细胞活率无明显差异(附图1)。抽脂7mL，共收获3.08×10⁶个原代脂肪干细胞，肿胀液中所得的原代脂肪干细胞数量占总产量的35.7％。传代至P5后获得的细胞数量为100～200亿，可以满足临床多次应用的需求。且后续通过对脂肪干细胞的表面抗原检测，表明通过该方法获得的脂肪干细胞能够正常表达干细胞相关的细胞表面标志物，不表达或低表达免疫原性相关标志物(附图2)；通过油红O染色、茜素红染色和阿利新蓝染液染色，表明脂肪干细胞能够诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞，具有良好的分化潜能(附图3)。

Claims

1.本发明为一种原代临床级脂肪干细胞分离制备方法，其分离方法包括以下步骤：

A.组织采集：采用抽脂方法对经过病毒(乙型肝炎病毒、丙肝病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、梅毒等传染性疾病)检测结果为阴性，无家族性病史(血液系统疾病、代谢性疾病、染色体异常、免疫缺陷病等)的供者采集脂肪组织5～10mL。

B.脂肪组织预处理：将5～10mL抽脂脂肪组织及肿胀液转移至50mL离心管中，加入生理盐水至45mL，盖上盖子，上下颠倒离心管以洗涤脂肪组织。将离心管放入离心机中，400g，离心7min后，离心管内分为四层，从上到下依次为油脂层、脂肪组织层、生理盐水层和细胞沉淀层。用巴氏吸管将最上面一层油脂层吸走，将脂肪组织转移至新的离心管中，同时收集最下面一层细胞沉淀，将细胞沉淀用生理盐水洗涤1次后，加入完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至培养瓶培养。

C.脂肪干细胞分离：将收集的脂肪组织用生理盐水再清洗2～3次后，将脂肪组织平均分配至多个离心管中，按照一定体积比加入胶原蛋白酶，放置于摇床中，37℃，180～200rpm消化20～30min后加入等体积完全培养基终止消化，400g，离心7min后保留离心管底部细胞沉淀，然后用生理盐水重悬沉淀，细胞悬液经100μm细胞筛网过滤后，补加生理盐水至45mL，400g，离心7min后，弃上清，加入完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至培养瓶培养；

D.脂肪间充质干细胞纯化培养：细胞在37℃，5％CO₂培养箱中培养3天后观察细胞贴壁情况，并更换新鲜的完全培养基，继续培养2～3天，细胞即可进行传代操作。

2.根据权利要求1所述步骤C中将脂肪组织平均分配至多个离心管中，每个离心管分配脂肪组织体积为2～3mL。

3.根据权利要求1所述步骤C中脂肪组织消化采用的胶原蛋白酶为人胎盘来源I型胶原蛋白酶。

4.根据权利要求1所述步骤C中按照一定体积比指的是脂肪组织体积与胶原蛋白酶体积比为1∶1～1∶1.5。

5.根据权利要求1所述步骤C中胶原蛋白酶浓度为0.1～0.2％。

6.根据权利要求1中所述完全培养基为血小板裂解液和基础培养基的混合物，其中血小板裂解液占比为3～10％；基础培养基为低糖培养基。

7.该方法不只局限于用肿胀抽脂法获得的脂肪样本，对其它方式采集的脂肪样本同样适用。