CN115137872B - 兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽dna水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医用敷料技术领域，具体涉及一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法。首先DNA单元的5’端修饰巯基与兼具抗菌和募集间充质干细胞能力的多肽E7(MKLQLPE)右端修饰马来酸酐进行迈克加成反应，制备兼具抗菌和募集间充质干细胞的E7‑DNA链段。E7‑DNA链段C与DNA链段A、DNA链段B通过动态交联形成致密氢键，并掺杂肝细胞生长因子(HGF)，方便地获得具有多肽DNA水凝胶/HGF。获得的多肽DNA水凝胶能够高效率的募集内源性间充质干细胞并供给内源性干细胞最佳生长发育场所。另外，在多肽DNA水凝胶和HGF相互辅佐促进内源性干细胞有效的发挥旁分泌效果。
Description
技术领域
本发明属于医用敷料技术领域，具体涉及一种兼具抗菌、募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法。
背景技术
糖尿病伤口是糖尿病患者的严重并发症之一，由于糖尿病患者高血糖导致伤口延缓愈合或伤口反复不愈合形成溃疡性伤口。溃疡性糖尿病伤口的微环境具有高血糖、氧分压降低和营养不良等可共同引发组织水肿、酸积聚、高渗和低效无氧代谢，此类环境适合细菌生长，并且阻碍了白细胞的功能。此外，因远端神经异常病变和不同程度的血管病变导致局部进一步感染、溃疡或深层组织的破坏。全球溃疡性糖尿病伤口的发病率大约从910万到2610万，其中84％的糖尿病患者接受了截肢手术，但累计死亡率超过50％。目前，临床依旧缺乏治疗溃疡性糖尿病伤口的敷料。
临床治疗溃疡性糖尿病伤口主要方式进行植皮手术，但会产生非同源免疫性。干细胞治疗是代替植皮手术的一种安全有效的方法，由于干细胞具有自我复制和多向分化能力，能够恢复失去正常功能的细胞和组织，使之再生从而改善病状。虽然干细胞获取相对容易，但长期的体外培养过程，干细胞逐渐失去定向、自发分化的能力和干性减弱。募集内源性干细胞是一种新兴方式，直接避免了干细胞体外培养的苛刻条件、免疫原问题、和干性降低等等问题。但是募集内源性干细胞集体迁移到目标部位，难以确保募集干细胞的有效数量。此外，考虑到溃疡性糖尿病伤口微环境严重缺氧，干细胞集体迁移到目标位置后能否继续存活和是否有效的发挥旁分泌效应仍旧是棘手问题。
作为免疫系统的第一道防线，皮肤是最大且最脆弱的组织。溃疡性糖尿病伤口由于炎症期延长导致易受到细菌侵袭。临床治疗感染性伤口的主要方式是全身输送抗生素由于溃疡型伤口的血管病变可能造成抗生素运输受限，进一步造成细菌的清除效率下降，导致局部组织进一步感染。开发一种本身固有抗菌性的敷料不仅解决了全身用药的毒性还能够减少抗生素的依赖性。
因此，兼具抗菌、募集内源性间充质干细胞、保证内源性干细胞存活的功能性敷料将为有效治疗溃疡性糖尿病伤口恢复再生特性开辟了新征程。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种兼具抗菌和募集内源性间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，该方法制备获得的多肽DNA水凝胶通过缺氧环境模拟内源性干细胞的存活率和检测干细胞发挥旁分泌作用，从而高效治疗溃疡性糖尿病伤口的临床问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将马来酸酐修改的多肽E7和5’端修饰巯基的DNA链段C进行迈克加成反应，制备得到E7-DNA链段C；其中，DNA链段C的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；多肽E7的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
(2)在氮气的保护下，将所述E7-DNA链段C与DNA链段A和DNA链段B均匀混合，通过动态交联形成致密的氢键进而获得兼具抗菌和募集内源性充间质干细胞能力的多肽DNA水凝胶；其中，DNA链段A的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；DNA链段B的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。
进一步地，步骤(2)中，将所述E7-DNA链段C与DNA链段A和DNA链段B均匀混合后，原位掺杂加入一定量的肝细胞包生长因子HGF，得到负载HGF、兼具抗菌和募集内源性干细胞能力的多肽DNA水凝胶/HGF。
进一步地，步骤(1)具体为：
将马来酸酐修改的多肽E7水溶液与5’端修饰巯基的DNA链段C水溶液分别溶解后，加入到饱和NaHCO3溶液中在室温条件下反应10-18h；通过高效液相提纯产物，得到E7-DNA链段C，即MKLQLPE-Mal-SH-5'-DNA-3'。
进一步地，步骤(1)中，反应体系溶液中多肽E7水溶液、DNA链段C水溶液、饱和NaHCO3溶液的体积比为(1～4)：(0.5～2)：(1～4)；其中，多肽E7水溶液浓度为0.1～6.0mM、DNA链段C水溶液的浓度为0.2～12mM。
进一步地，步骤(2)中，以物质的量计，E7-DNA链段C、DNA链段A和DNA链段B的比例为：(1～1.8)：(1～2)：(1～2.4)；所述HEPES缓冲液的pH＝7.0。
进一步地，HGF的添加浓度为10-100ng mL-1。
进一步地，将5mM E7-DNA链段C，5mM DNA链段A和5mM DNA链段B均匀充分混合，HGF的添加浓度为95ng mL-1，当HGF负载率为95ng mL-1时，募集内源性干细胞的能力最佳，即使在缺氧环境下内源性干细胞有较为优异的生存能力。
一种采用所述方法制备的多肽DNA水凝胶的应用，将所述多肽DNA水凝胶应用于治疗皮肤伤口修复以及用于治疗神经系统疾病、骨科系统疾病、免疫系统疾病和循环系统疾病。
本发明提供兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法制备获得的多肽DNA水凝胶兼具抗菌、募集间充质干细胞、和缺氧环境下也能促进干细胞处于最佳生长发育状态，使敷料无免疫性和引导组织再生的功能特性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述方法利用兼具抗菌和募集内源性间充质干细胞能力的多肽与不同的DNA链段制备了具有多肽DNA水凝胶，使敷料具有高效的集体极化干细胞迁移的能力和固有优异的抗菌性。
(2)本发明所述方法有效的直接解决了体外培养干细胞的繁琐步骤、干细胞干性减弱、和非同源免疫性等重大问题。
(3)本发明所述方法为避免溃疡性糖尿病伤口缺氧环境导致募集的内源性间充质干细胞凋亡，掺杂了具有多效性的生长因子HGF抑制干细胞凋亡和参与调节内源性间充质干细胞存活、增殖、迁移、和分化等，进而高效的发挥旁分泌效应。
附图说明
图1是本发明实施例中一种兼具抗菌和募集内源性间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法流程图；
图2是本发明实施例中E7-DNA链段C相对分子质量示意图；
图3是本发明实施例子中制备的兼具抗菌和募集内源性间充质干细胞的多肽DNA水凝胶微观形貌示意图；
图4是本发明实施例中多肽DNA水凝胶/HGF的抗菌性能；
图5是本发明实施例中多肽DNA水凝胶/HGF体外模拟募集内源性间充质干细胞的能力示意图；
图6是本发明实施例中多肽DNA水凝胶/HGF体外模拟缺氧性微环境内源性间充质干细胞增殖的能力示意图；
图7是本发明实施例中多肽DNA水凝胶/HGF外模拟缺氧性微环境内源性间充质干细胞的干性示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
实施例1
一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将马来酸酐修改的多肽E7和5’端修饰巯基的DNA链段C进行迈克加成反应，制备得到E7-DNA链段C；其中，DNA链段C：5’-SH-TTCTTTTCTTTTCTTTTCTT-3’，碱基序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；多肽E7的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
步骤(1)具体为：将马来酸酐修改的多肽E7(MKLQLPE-Mal)水溶液与5’端修饰巯基的DNA链段C水溶液分别溶解后，加入到饱和NaHCO3溶液中进行反应；通过高效液相提纯产物，得到E7-DNA链段C，即MKLQLPE-Mal-SH-5'-DNA-3'，其相对分子量如图2所示。
(2)在氮气的保护下，将所述E7-DNA链段C与DNA链段A和DNA链段B均匀混合，通过动态交联形成致密的氢键进而获得兼具抗菌和募集内源性充间质干细胞能力的多肽DNA水凝胶；具有很好的可注射性和可书写性，微观形貌如图3所示。
其中，DNA链段A:
5’-acrydite-GGAGGGGAGGGGAGGTTTACCTCCCCTCCCCTCCCTTTGCCTCCCCTCCCCTCCGTACTC-3’，碱基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；
DNA链段B：5’-acrydite-GAGTACGGAGGG-3’，碱基序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。
具体地，步骤(1)中，反应体系溶液中多肽E7水溶液、DNA链段C水溶液、饱和NaHCO3溶液的体积比为2：1：2；
在本实施例中，步骤(2)中，以物质的量计，E7-DNA链段C、DNA链段A和DNA链段B的比例为：1：1.4：1.8
实施例2
一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤：
(1)将马来酸酐修改的多肽E7(MKLQLPE-Mal)水溶液与5’端修饰巯基的DNA链段C进行迈克加成反应，制备得到E7-DNA链段C；其中，DNA链段C的碱基序列如序列表中SEQ IDNO:1所示；多肽E7的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
具体为：将马来酸酐修改的多肽E7(MKLQLPE-Mal)水溶液与5’端修饰巯基的DNA链段C水溶液分别溶解后，加入到饱和NaHCO3溶液中进行反应；通过高效液相提纯产物，得到纯净的产品MKLQLPE-Mal-SH-5'-DNA-3'的效率高且杂质少(简称E7-DNA链段C)。
(2)将所述E7-DNA链段C与DNA链段A和DNA链段B均匀混合后，原位掺杂加入一定量的肝细胞包生长因子HGF，加适当的HEPES缓冲液，通过动态交联形成致密的氢键进而获得负载HGF、兼具抗菌、和募集内源性干细胞能力的多肽DNA水凝胶/HGF。
其中，DNA链段A的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；DNA链段B的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。
以物质的量计，E7-DNA链段C、DNA链段A和DNA链段B的比例为1：2：2.2；HGF的添加浓度为10-100ng mL-1。
实施例3
一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将多肽E7修饰马来酸酐(MKLQLPE-Mal)水溶液与5端修饰巯基的DNA链段C(SH-5'-DNA-3')水溶液分别溶解后，加入到饱和NaHCO3溶液进行反应，其中反应体系溶液比例为2：1：2。通过高效液相提纯产物，得到纯净的产品MKLQLPE-Mal-SH-5'-DNA-3'的效率高且杂质少(简称E7-DNA链段C)。
(2)在氮气的保护下，将适量的E7-DNA链段C(5mM)与一定量的量DNA链段A(5mM)和DNA链段B(5mM)均匀充分混合，原位掺杂不同浓度的HGF(0，15，35，55，75，和95ng mL-1)，加到适当的HEPES缓冲液，通过动态交联形成致密的氢键进而获得负载HGF、兼具抗菌、和募集内源性干细胞能力的多肽DNA水凝胶。进一步研究了多肽DNA水凝胶/HGF对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抗菌效果，如图4所示多肽DNA水凝胶/HGF对三种致病菌均具有优异的抗菌效果。
当HGF负载率为95ng mL-1时，募集内源性干细胞的能力最佳，即使在缺氧环境下内源性干细胞有较为优异的生存能力，如图5所示，多肽DNA水凝胶/HGF体外模拟募集内源性间充质干细胞的能力。多肽DNA水凝胶/HGF的Transwell的上层小室内的干细胞与对照组相比较少，但是招募到下层孔板的干细胞数量远远高于对照组的数量。
如图6所示多肽DNA水凝胶/HGF体外模拟缺氧性微环境内源性间充质干细胞增殖的能。为了进一步研究多肽DNA水凝胶/HGF外模拟缺氧性微环境内源性间充质干细胞的干性，如图7所示通过相对mRNA表达检测了干细胞的干性。多肽DNA水凝胶/HGF的mRNA相对表达比对照组高出5～6倍左右。
一种采用所述方法制备的多肽DNA水凝胶的应用，将所述多肽DNA水凝胶应用于治疗皮肤伤口修复以及用于治疗神经系统疾病、骨科系统疾病、免疫系统疾病和循环系统疾病。
本发明公开了一种兼具抗菌和募集内源性间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备及模拟缺氧环境下的存活率应用，属于医用敷料技术领域。首先DNA单元的5端修饰巯基与兼具抗菌和募集间充质干细胞能力的多肽E7(MKLQLPE)右端修饰马来酸酐进行迈克加成反应，制备兼具抗菌和募集间充质干细胞的E7-DNA链段。E7-DNA链段C与DNA链段A、DNA链段B通过动态交联形成致密氢键，并掺杂肝细胞生长因子(HGF)，方便地获得具有多肽DNA水凝胶/HGF。获得的多肽DNA水凝胶能够高效率的募集内源性间充质干细胞并供给内源性干细胞最佳生长发育场所。另外，在多肽DNA水凝胶和HGF相互辅佐促进内源性干细胞有效的发挥旁分泌效果。最重要地，多功能性的多肽DNA水凝胶/HGF可以促进M2a型快速向M2c型转化，进而发挥免疫抑制功能和促进新血管的形成，有利于组织再生。本发明敷料结构设计合理、制作工艺成熟，可广泛用于缺氧型慢性复杂性伤口的治疗，具有良好的应用前景。
序列表
<110> 北京科技大学
<120> 兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法
<141> 2022-06-13
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
ttcttttctt ttcttttctt 20
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
Met Lys Leu Gln Leu Pro Glu
1 5
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
ggaggggagg ggaggtttac ctcccctccc ctccctttgc ctcccctccc ctccgtactc 60
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
gagtacggag gg 12
Claims (7)
1.一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将马来酸酐修改的多肽E7和5’端修饰巯基的DNA链段C进行迈克加成反应，制备得到E7-DNA链段C；其中，DNA链段C的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；多肽E7的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
（2）在氮气的保护下，将所述E7-DNA链段C与DNA链段A和DNA链段B均匀混合，原位掺杂加入一定量的肝细胞生长因子HGF，通过动态交联形成致密的氢键进而获得负载HGF、兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶；其中，DNA链段A的碱基序列如序列表中SEQ IDNO:3所示；DNA链段B的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）具体为：
将马来酸酐修改的多肽E7水溶液与5’端修饰巯基的DNA链段C水溶液分别溶解后，加入到饱和NaHCO3溶液中在室温条件下反应10-18h；通过高效液相提纯产物，得到E7-DNA链段C。
3.根据权利要求2所述一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反应体系溶液中多肽E7水溶液、DNA链段C水溶液、饱和NaHCO3溶液的体积比为（1~4）：（0.5~2）：（1~4）；其中，多肽E7水溶液浓度为0.1~6.0 mM、DNA链段C水溶液的浓度为0.2~12 mM。
4.根据权利要求1所述一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，以物质的量计，E7-DNA链段C、DNA链段A和DNA链段B的比例为：（1~1.8）：（1~2）：（1~2.4）。
5.根据权利要求1所述一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，HGF的添加浓度为10-100ng mL-1。
6.根据权利要求1所述一种兼具抗菌和募集间充质干细胞的多肽DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，将5 mM E7-DNA链段C，5 mM DNA链段A和5 mM DNA链段B均匀充分混合，HGF的添加浓度为95 ng mL-1。
7.一种采用权利要求1-6任一项所述方法制备的多肽DNA水凝胶的应用，其特征在于，将所述多肽DNA水凝胶应用于制备皮肤伤口修复材料以及用于制备神经系统疾病、骨科系统疾病、免疫系统疾病和循环系统疾病治疗材料。
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