CN118079075A - 一种促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶及其制备方法和应用。本发明以锌基金属有机框架化合物Zn‑MOF为载体负载精氨酸Arg和葡萄糖氧化酶GOx，通过与硫酸软骨素和泊洛沙姆F127物理交联制备得到了一种可注射水凝胶AZG‑Gel。经实验证实，本发明所述水凝胶可响应糖尿病伤口环境的高血糖触发级联反应，降低血糖和降低pH值从而改善伤口微环境，并生成具有调节炎症和促血管生成作用的一氧化氮NO。本发明所述水凝胶具备良好的生物相容性、抗细菌增殖和生物膜形成、以及促糖尿病伤口愈合能力。与商业伤口敷料相比，不仅具有明显的抗菌和促伤口愈合作用，而且可以改善不利于伤口愈合的高糖和高pH微环境，从“攘外”（抗菌和抗炎）和“安内”（降低血糖和降低pH值）两方面发挥标本兼治的作用。本发明所述水凝胶制备工艺绿色环保、操作简便，在促糖尿病伤口愈合方面具有良好的应用前景。另外，本发明所述水凝胶应用于伤口时降低pH的特性，还可用于糖尿病伤口愈合过程的可视化监测。
Description
技术领域
本发明属于医用水凝胶敷料技术领域，具体涉及一种促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病慢性伤口是临床最难治愈的伤口之一。高血糖、高pH值（7.0~8.9），细菌感染及持续炎症的微环境，是糖尿病伤口显著的特征。高血糖是阻碍慢性伤口愈合的重要因素。异常的葡萄糖代谢会促进氧化应激，上调肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素（IL）-1、IL-6等促炎因子的表达，造成炎症聚集。另一方面，高血糖会诱导内皮细胞凋亡，抑制成纤维细胞和角质细胞的迁移，阻碍血管生成和组织重构。此外，高糖和高pH微环境是细菌定植和生物膜形成的温床，易造成持续的微生物感染并加剧炎症，甚至造成截肢率升高，给患者造成了巨大的心理和生理负担。
为突破糖尿病伤口难以愈合的问题，近些年国内外学者在重塑糖尿病伤口高血糖和炎症微环境，以及抑制细菌感染等敷料方面进行了大量的研究。如利用葡萄糖氧化酶（GOx）可催化葡萄糖生成葡萄糖醛酸并产生过氧化氢（H2O2）的特性，可以改善糖尿病伤口局部的高葡萄糖浓度和高pH微环境。但单独应用GOx时，易造成H2O2过度积累阻碍伤口愈合，这限制了GOx在促伤口愈合中的实际应用。局部应用抗生素是治疗皮肤感染的常用策略，但抗生素滥用会导致多重耐药细菌的产生。
近些年，锌基有机框架化合物（Zn-MOF）作为新型多孔纳米材料，可负载药物和实现酸响应性药物释放，在抗菌和药物递送等方面引起了学者们的广泛关注。另外，一氧化氮（NO）气体疗法在伤口愈合领域显示出了良好的应用前景。研究表明，在炎症阶段NO可调节炎症相关细胞因子，如IL-8、转化生长因子（TGF-β1）等；在增殖阶段NO可驱动血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血小板-内皮细胞粘附分子（CD31）的表达，进而刺激血管生成和促进伤口愈合；在重塑阶段，NO还可增加肌成纤维细胞和胶原蛋白的产生和沉积，促进伤口的快速愈合。然而，糖尿病伤口的高血糖环境会阻碍内源性NO的合成，难以满足伤口愈合不同阶段的需要。
综合来看，改善糖尿病伤口中的高血糖和高pH微环境、补充NO调节炎症、抑制细菌感染对加速糖尿病伤口愈合具有重要意义。此外，控制GOx催化速率和减少H2O2积累是GOx有效安全应用的关键。多糖水凝胶具有类天然细胞外基质（ECM）的多孔结构，并具有良好的亲水性和生物相容性，已成为较为理想的伤口敷料材料之一。
发明内容
针对糖尿病伤口因存在高血糖、高pH、持续炎症和细菌感染等影响因素而难以愈合的问题，本发明的目的在于提供了一种能有效促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶。该水凝胶通过响应糖尿病伤口固有的高糖环境，启动级联催化反应降低伤口局部的葡萄糖浓度和高pH值，改善伤口微环境，并释放NO利用气体疗法调节炎症。该水凝胶从“攘外（抗菌和抗炎）”和“安内（降低血糖和降低pH值）”两方面发挥标本兼治的作用，具有重要的实际应用价值。
本发明的另一目的在于提供了一种促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶的制备方法。
本发明的另一目的在于提供了一种促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶，按质量百分比计，所述水凝胶包括以下组分：多糖0.1~1%，泊洛沙姆20~22%，精氨酸Arg为0.01~0.1%，锌基金属有机框架化合物Zn-MOF为0.01~0.1%，葡萄糖氧化酶GOx为0.01~0.1%，余量为溶剂。
进一步的，所述溶剂为纯水或磷酸盐缓冲溶液。
进一步的，所述多糖为硫酸软骨素、褐藻胶、岩藻聚糖、卡拉胶中的任意一种或多种。
进一步的，所述多糖的分子量优选0.5 kDa~100 kDa。
本发明还提供了一种促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1：负载Arg的Zn-MOF制备：将六水合硝酸锌分散在甲醇和纯水的混合溶液中，加入二甲基咪唑和Arg，搅拌均匀，离心清洗，得到Arg@Zn-MOF纳米材料即AZ-NPs，重悬；
S2：负载GOx和Arg的Zn-MOF制备：将GOx加入制备的AZ-NPs纯水溶液中，搅拌得到Arg@Zn-MOF-GOx纳米材料即AZG-NPs；
S3：负载GOx和Arg的Zn-MOF水凝胶制备：室温下向AZG-NPs水溶液中溶解多糖，然后冷却至4℃溶解泊洛沙姆，待充分溶解后，置入37℃~40℃的环境中凝胶化，即得到水凝胶AZG-Gel。
进一步的，所述步骤S1中室温150~250 r/min搅拌30-60分钟，然后8000~1000 r/min离心，用纯水反复清洗3次。
本发明还提供了所述的纳米反应器水凝胶在制备用于促进伤口愈合的抑菌敷料中的应用。
进一步的，所述伤口包括糖尿病伤口和/或细菌感染的全层伤口、烧伤、放射性损伤。
进一步的，所述水凝胶AZG-Gel在高糖环境下对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有明显抑菌作用。
进一步的，所述水凝胶具有良好的生物相容性和抗菌能力，不仅可以抑制细菌增殖，还可以抑制细菌生物膜的形成和清除细菌已经建立的生物膜。
进一步的，所述水凝胶AZG-Gel具有一氧化氮产生能力，且具有葡萄糖浓度依赖性，具有炎症调节功能，能促进血管生成和/或胶原沉积。
进一步的，所述水凝胶AZG-Gel对葡萄糖表现出良好的响应性，能降低糖尿病伤口环境的血糖和pH值，改善糖尿病伤口微环境。
进一步的，所述水凝胶AZG-Gel能利用伤口局部环境的pH值变化来可视化监测糖尿病伤口愈合的过程。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
（1）传统促糖尿病伤口愈合的水凝胶通常是针对伤口的止血、炎症、增殖和重塑阶段而设计，忽略了导致慢性伤口愈合的高血糖和高pH微环境这一根本原因。本发明所述的水凝胶不仅兼具抗菌和抗炎（“攘外”）的作用，还可降低局部血糖和pH（“安内”）改善糖尿病伤口的微环境，从“攘外安内”两个方面发挥标本兼治的作用。
（2）针对糖尿病的高糖环境，以往报道的利用硼酸酯键与葡萄糖特异性结合制备的水凝胶，虽然可以响应伤口的高糖环境，但不能消耗葡萄糖和降低pH微环境。本发明所述的水凝胶可兼具重塑高血糖和高pH微环境并释放NO调节炎症的作用。
（3）本发明所述的水凝胶应用可通过伤口局部环境的pH值变化，用于糖尿病伤口愈合过程的可视化监测。如向其中添加溴百里香酚蓝、酚红等pH指示剂或异硫氰酸荧光素、碳量子点等pH敏感荧光染料，可实现对糖尿病伤口治疗及预后的可视化预测，拓展水凝胶的生物医学应用。
（4）与绝大多数基于单独应用GOx的水凝胶相比，本发明所述的水凝胶可通过葡萄糖氧化酶-过氧化氢-精氨酸（GOx-H2O2-Arg）级联反应消耗H2O2，降低H2O2过度积累造成的毒副作用，提高水凝胶的生物相容性。
（5）本发明设计的水凝胶释放的Arg，仅在高糖环境的病灶部位被H2O2氧化释放NO，保证了NO的可控释放。
（6）本发明所述水凝胶以多糖为基质，还具有良好的生物相容性、强大的抗菌和抗细菌生物膜能力、以及明显促进伤口愈合的作用，应用前景广阔。特别是糖尿病慢性伤口愈合方面将具有明显的优势和广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1的水凝胶AZG-Gel的溶胶-凝胶转变和可注射性图像。
图2是实施例1的水凝胶AZG-Gel的温度、频率和应力应变扫描结果。
图3是pH变化结果及其应用；图3a是实施例1、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4的水凝胶分别与20 mmol/L葡萄糖共孵育时的pH变化结果；图3b是实施例1响应不同浓度葡萄糖（0，5，20 mmol/L）时的pH变化结果；图3c是溴麝香草酚蓝指示剂的颜色变化：左图是pH为4、6.86、7.4和9.18的标准磷酸盐缓冲溶液（PBS），在pH指示剂溴麝香草酚蓝中的颜色变化；右图是1- pH 7.4 PBS、2-葡萄糖、3-Zn-MOF-NPs、4-葡萄糖 + Zn-MOF-NPs、5-AZ-NPs、6-葡萄糖 + AZ-NPs、7-GOx、8-葡萄糖 + GOx、9-AZG-NPs和10-葡萄糖（20 mmol/L）+AZG-NPs在溴麝香草酚蓝中的颜色变化；图3d是对比例1的水凝胶通过局部伤口环境pH变化对糖尿病伤口愈合过程进行可视化监测的示意图。
图4是实施例1水凝胶的级联反应表征。其中，图4a是实施例1水凝胶的级联反应流程图；图4b是H2O2产生测定结果，图4c是NO产生测定结果。
图5实施例1、对比例2、对比例3、对比例4水凝胶的细胞相容性评价结果。其中，图5a和5b是对小鼠成纤维细胞（L929细胞）24小时和48小时活力检测结果；图5c是溶血实验结果；图5d是活死细胞的染色结果。
图6是实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4水凝胶的抗菌性能评价结果。其中，图6a和图6d分别是细菌平板计数图像及定量结果；图6b和6e分别是水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜形成的抑制作用图像及定量结果；图6c和6f分别是清除已建立的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生物膜图像及定量结果；图6g是实施例1、对比例1处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态变化。
图7是实施例1、对比例1、对比例2、对比例3与商业水凝胶促糖尿病大鼠伤口愈合效果。其中，图7a是在金黄色葡萄球菌感染的糖尿病大鼠伤口模型中的促进伤口愈合效果。图7b是金黄色葡萄球菌感染的糖尿病大鼠伤口在水凝胶处理前和处理30分钟后的pH变化。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法；所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1
一种促进糖尿病伤口愈合纳米反应器水凝胶（记作AZG-Gel）的制备：
1、在10 mL纯水和20 mL甲醇的混合溶剂中，加入0.47g六水合硝酸锌，搅拌至完全溶解。继续添加1g二甲基咪唑和80 mg精氨酸，室温150~250 r/min搅拌30分钟，制备Arg@Zn-MOF纳米材料（记作AZ-NPs）。然后8000~1000 r/min离心，用纯水反复清洗3次，得到60 μg/mLAZ-NPs纯水溶液。
2、将25 μg/mL GOx加入上述AZ-NPs纯水溶液中，搅拌30分钟即得Arg@Zn-MOF-GOx-NPs（记作AZG-NPs），，放入4℃保存。
3、按质量百分比计，室温下向AZG-NPs水溶液中充分溶解0.5%的硫酸软骨素。然后加入20%的泊洛沙姆，在4℃充分溶解24小时得到混合溶胶体系，置于40℃水浴中发生溶胶-凝胶转变得到AZG-Gel。
对比例1
一种不含Zn-MOF、Arg且不含GOx的空白水凝胶（记作PBS-Gel）制备：按质量百分比计，室温下向PBS溶液中充分溶解0.5%的硫酸软骨素，然后加入20%的泊洛沙姆。在4℃充分溶解24小时得到混合溶胶体系，置于40℃水浴中发生溶胶-凝胶转变得到PBS-Gel。
对比例2
一种只含Zn-MOF，但不涉及Arg和GOx的水凝胶（记作Zn-MOF-Gel）的制备：在10 mL纯水和20 mL甲醇的混合溶剂中加入0.47g六水合硝酸锌，室温搅拌至完全溶解。继续添加1g二甲基咪唑搅拌30分钟，制备Zn-MOF纳米材料（记作Zn-MOF-NPs）。用纯水反复清洗3次，得到60 μg/mL Zn-MOF-NPs纯水溶液。
按质量百分比计，室温下向MOF-NPs水溶液中充分溶解0.5%硫酸软骨素。然后加入20%的泊洛沙姆，在4℃充分溶解24小时得到混合溶胶体系，置于40℃水浴中发生溶胶-凝胶转变得到Zn-MOF-Gel。
对比例3
一种只含有Zn-MOF和Arg，但不涉及GOx的水凝胶（记作AZ-Gel）的制备：在10 mL纯水和20 mL甲醇的混合溶剂中加入0.47g六水合硝酸锌，室温搅拌至完全溶解。继续添加1g二甲基咪唑和80 mg精氨酸搅拌30分钟，制备Arg@Zn-MOF纳米材料，（记作AZ-NPs）。用纯水反复清洗3次，得到60 μg/mL AZ-NPs水溶液。
按质量百分比计，室温下向AZ-NPs纯水溶液中充分溶解0.5%硫酸软骨素。然后加入20%的泊洛沙姆，在4℃充分溶解24小时得到混合溶胶体系，置于40℃水浴中发生溶胶-凝胶转变得到AZ-Gel。
对比例4
一种只含有GOx，但不涉及Arg和Zn-MOF的水凝胶（记作GOx-Gel）的制备：将GOx溶解制备25 μg/mL GOx纯水溶液。
按质量百分比计，室温下向上述溶液中充分溶解0.5%硫酸软骨素。然后加入20%的泊洛沙姆，在4℃充分溶解24小时得到混合溶胶体系，置于40℃水浴中发生溶胶-凝胶转变得到GOx-Gel。
实施例2：AZG-Gel凝胶的性能
1、AZG-Gel的溶胶凝胶转变表征
通过台盼蓝对实施例1的水凝胶AZG-Gel进行表征。如图1a所示：AZG-Gel可在20℃和37℃下可由溶胶变为凝胶状态，并可通过注射器在培养皿和水中进行液体书写（图1b）。说明实施例1的AZG-Gel具有良好的温度响应性和可注射性，这有利于在体温触发快速成胶并适应各种不规则的伤口。
2、AZG-Gel的机械性能表征
使用流变仪对实施例1的水凝胶AZG-Gel的粘弹性能进行表征。如图2a温度扫描所示，对比例1制备的PBS-Gel和实施例1制备的AZG-Gel的成胶温度分别为28.2℃和29℃。此外，动态频率扫描显示频率为0.1至15 Hz，AZG-Gel的储能模量（G'）大于损耗模量（G''），表明其具有弹性行为（图2b）。从振幅扫描可见，实施例1的AZG-Gel的G'和G''高于对比例1的PBS-Gel的G'和G''（图2c），这表明AZG-NPs的引入有利于提高水凝胶的机械强度。
3、水凝胶响应葡萄糖的pH变化考察
通过pH指示剂考察实施例1制备的AZG-Gel，在不同浓度葡萄糖环境下pH的变化情况。结果显示，仅有对比例4制备的GOx-Gel和实施例1制备的AZG-Gel组可产生 pH变化。GOx-Gel或AZG-Gel与20 mmol/L葡萄糖反应300 min后，其pH可从6.9或7.0分别降至3.2或3.3（图3a）。随着AZG-Gel中葡萄糖浓度增加，溶液pH值的变化更加明显（图3b）。
此外，添加溴百里酚蓝作为酸碱指示剂证实葡萄糖酸的产生和监测pH值的颜色变化。溴百里酚蓝在不同pH体系中的颜色分别为pH 4时的黄色，pH 6.86时的绿色，pH 7.4以上时的蓝色（图3c左）。图3c右为1- pH 7.4 PBS、2-葡萄糖、3-Zn-MOF-NPs、4-葡萄糖 + Zn-MOF-NPs、5-AZ-NPs、6-葡萄糖 + AZ-NPs、7-GOx、8-葡萄糖 + GOx、9-AZG-NPs和10-葡萄糖（20 mmol/L）+ AZG-NPs的pH值颜色变化。结果显示，只有GOx和AZG-NPs组与葡萄糖共孵育后颜色由浅绿色变为黄色，这表明实施例1制备的AZG-Gel可催化葡萄糖为葡萄糖酸降低体系的pH。通过局部环境的pH水平可通过制备可视化比色创可贴，用于对糖尿病伤口治疗及预后的监测和指导（图3d）。
4、水凝胶产生H2O2和NO考察
对实施例1水凝胶级联反应产生的H2O2和NO进行表征。如图4a显示了水凝胶的级联反应示意图。如图4b所示：相较于对比例4的GOx-Gel，实施例1制备的AZG-Gel在20 mmol/L葡萄糖中产生的H2O2变低，这可减少GOx快速催化葡萄糖带来H2O2大量积累的毒副作用。如图4c所示：实施例1制备的水凝胶AZG-Gel在无葡萄糖时不产生NO，在与5或20 mmol/L葡萄糖共孵育可明显产生NO，这表明AZG-Gel具有良好的NO产生能力，且具有葡萄糖浓度依赖性。这进一步表明，AZG-Gel通过GOx级联催化可控制H2O2的积累，并同时利用H2O2和Arg产生NO。
5、水凝胶生物相容性表征
通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验，评价实施例1、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4的水凝胶的细胞相容性。小鼠成纤维细胞L929贴壁生长后，加入水凝胶孵育24小时和48小时，然后加入适量MTT溶液，用酶标仪检测570 nm下的吸光度并计算细胞存活率。选用L929细胞进行活/死染色，用100 µL吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）染料染色15分钟后，在倒置荧光显微镜下观察细胞的绿色（492 nm）和红色（545 nm）荧光，并拍照记录。如图5a和5b所示：除GOx -Gel组细胞活力降低至78.3% ± 3.9%（24 h）和70.1% ± 3.3%（48 h）外，其余制剂均无明显毒性。
更重要的是，当GOx浓度为0.0063 μg/mL时，AZG-Gel组的细胞存活率为90%以上，这是由于Arg有效消耗了由GOx产生的H2O2，从而降低了GOx的毒副作用（p < 0.01）。这与体外H2O2的检测（图4b）结果相一致。如图5d所示：仅对比例4制备的GOx-Gel组出现了显著的红色荧光（死细胞），而PBS-Gel、Zn-MOF-Gel、AZ-Gel和AZG-Gel中L929细胞呈绿色荧光（活细胞）。表明AZG-Gel通过级联反应控制GOx的催化速率，可以提高其生物安全性；实施例1、对比例1、对比例2和对比例3的水凝胶均具有良好的细胞相容性。
通过溶血实验评价实施例1、对比例1、对比例2和对比例3水凝胶的血液相容性。将大鼠全血3000 rpm离心4分钟，获得红细胞，PBS（pH = 7.4）洗涤并稀释至最终浓度为5%（v/v）。将此红细胞与水凝胶以1/1（v/v）在37℃孵育1小时，以PBS作为阴性对照，0.1%（v/v）聚乙二醇辛基苯基醚（Trion X-100）作为阳性对照。离心后在540 nm处，测定上清液的光密度值计算溶血率。溶血实验结果显示（图5c）：PBS-Gel、MOF-Gel、AZ-Gel、AZG-Gel几乎没有产生溶血（溶血率均低于2%），表明它们具有良好的血液相容性，可安全应用于生物医学领域。
6、水凝胶的抗菌和抗生物膜性能表征
选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S.aureus）和革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）作为模型，通过测定平板计数评价实施例1、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4水凝胶的抗菌性能。其中，1为PBS-Gel、2为20 mmol/L葡萄糖、3为Zn-MOF-Gel + 20 mmol/L葡萄糖、4为AZ-Gel + 20 mmol/L葡萄糖、5为GOx-Gel + 20 mmol/L葡萄糖、6为AZG-Gel、7为AZG-Gel + 20 mmol/L葡萄糖、8为阳性药物：氨苄青霉素钠。将 100 μL细菌悬浮液（107CFU/mL），与菌液按比例混合（样品与菌悬液的体积比为3：1）并进行共孵育（150 rpm ，37℃，2小时）。将共孵育的细菌悬浮液，取100 μL按照十倍比梯度稀释并在溶菌肉汤（LB）固体培养基上进行涂布，计算细菌单菌落数并统计细菌存活率。
采用结晶紫染色实验表征细菌生物膜的形成及破坏，考察水凝胶对生物膜形成的抑制作用。在无菌孔板中，每孔分别加入各组水凝胶样品和菌悬液（样品与菌悬液的体积比为3：1），葡萄糖的终浓度为20 mmol/L（模拟糖尿病伤口高糖微环境中细菌的生长），以无菌纯水作为阴性对照。充分混匀后，在37℃培养箱中，静置培养48 小时得到细菌生物膜。然后，将培养基吸走，用无菌纯水洗涤3次，去除浮游细菌和水凝胶样品。加入1%（w/v）的结晶紫溶液染色20分钟。然后，吸走结晶紫溶液，用无菌纯水洗至上清无色。每孔加入95%的乙醇，脱色30分钟。用相机对结晶紫染色后的孔板进行成像，并用紫外分光光度计在630 nm波长下检测各个样品的吸光值。
考察水凝胶对已经建立的生物膜的清除作用：建立生物膜的方法同上操作，37℃培养箱中静置培养48小时即得。然后，将培养基吸走，用无菌纯水清洗2次以去除游离的细菌，分别加入无菌纯水、水凝胶样品和葡萄糖溶液，以无菌纯水作为阴性对照。混匀后置于37℃培养箱培养12小时，用紫外分光光度计在630 nm波长下检测各个样品的吸光值。
结果显示，具有NO释放和微环境调节作用的实施例1的水凝胶AZG-Gel，在葡糖糖存在下与细菌孵育后，呈现出显著的细菌生长（图6a、6d）。结晶紫染色法结果显示，与PBS-Gel相比，20 mmol/L葡萄糖处理组细菌形成了更致密的生物膜（图6b、6e），这表明高糖环境可促进细菌增殖和生物膜的形成。AZG-Gel + 20 mmol/L葡萄糖处理组生物膜的破坏和解离最显著（图6c、6f），残留量最低。这些结果表明，采用具有NO释放和微环境调节策略制备的Zn-MOFs同时负载Arg和GOx的实施例1水凝胶AZG-Gel，在高糖环境下不仅对S.aureus 和E.coli的生长具有明显的抑制作用，并且可以抑制细菌生物膜的形成，甚至破坏和清除已建立的细菌生物膜，可降低伤口感染的风险。
通过透射电子显微镜，考察实例1制备的AZG-Gel和对比例1制备的PBS-Gel附近细菌的形态变化。如图6g所示，对比例1处理的S.aureus和E.coli保持典型的球状和杆状，表面光滑，有完整的细胞膜和细胞壁。而AZG-Gel + 20 mmol/L处理组S.aureus和E.coli的菌体，出现了明显的菌体膨胀破裂、表面坍塌和不完整。这表明，实施例1制备的AZG-Gel可改变细菌内外的渗透压，破坏细菌的细胞壁和细胞膜产生良好的抗菌效果。
7、水凝胶促细菌感染的糖尿病伤口愈合的能力
通过建立S.aureus感染的糖尿病大鼠全层伤口模型，在不同时间点监测伤口愈合情况。如图7a所示：实施例1制备的具有NO释放和微环境调节的水凝胶纳米反应器AZG-Gel，对S.aureus感染的糖尿病大鼠全层伤口具有明显的促愈合作用，优于商业水凝胶。通过pH试纸考察了糖尿病大鼠伤口pH微环境的变化（图7b），结果显示实施例1制备的AZG-Gel处理组，伤口渗出液pH由碱性（pH 8~9）降低至适宜伤口愈合的偏酸环境（pH 6~7）；而对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和商业水凝胶应用后伤口pH值无明显改变。
本发明水凝胶可响应糖尿病伤口的葡萄糖，通过级联催化反应降低血糖和降低pH值从而改善伤口微环境，并生成具有调节炎症和促血管生成作用的一氧化氮（NO）。从“攘外安内”两方面发挥标本兼治的作用，在制备抑菌敷料、糖尿病伤口和/或细菌感染的全层伤口、烧伤、放射性损伤等伤口护理等领域，具有广阔的应用前景。
以上实施例仅用于说明而并非限制本发明所描述的技术方案。尽管本说明书参照上述的实施例，对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的技术人员应当理解，所属技术领域人员仍然可以对本发明进行修改或者等同替换，而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶，其特征在于，按质量百分比计，所述水凝胶包括以下组分：多糖0.1~1%，泊洛沙姆20~22%，精氨酸Arg为0.01~0.1%，锌基金属有机框架化合物Zn-MOF为0.01~0.1%，葡萄糖氧化酶GOx为0.01~0.1%，余量为溶剂。
2.根据权利要求1所述的纳米反应器水凝胶，其特征在于，所述多糖为硫酸软骨素、褐藻胶、岩藻聚糖、卡拉胶中的任意一种或多种。
3.权利要求1所述的促进糖尿病伤口愈合的纳米反应器水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：负载Arg的Zn-MOF制备：将六水合硝酸锌分散在甲醇和纯水的混合溶液中，加入二甲基咪唑和Arg，搅拌均匀，离心清洗，得到Arg@Zn-MOF纳米材料即AZ-NPs，重悬；
S2：负载GOx和Arg的Zn-MOF制备：将GOx加入制备的AZ-NPs纯水溶液中，搅拌得到Arg@Zn-MOF-GOx纳米材料即AZG-NPs；
S3：负载GOx和Arg的Zn-MOF水凝胶制备：室温下向AZG-NPs水溶液中溶解多糖，然后冷却溶解泊洛沙姆，待充分溶解后，置入37℃~40℃的环境中凝胶化，即得到水凝胶AZG-Gel。
4.权利要求1-2任一项所述的纳米反应器水凝胶在制备用于促进伤口愈合的抑菌敷料中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述伤口包括糖尿病伤口和/或细菌感染的全层伤口、烧伤、放射性损伤。
6.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述水凝胶AZG-Gel在高糖环境下对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有明显抑菌作用。
7.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述抑菌包括抑制细菌增殖、抑制细菌生物膜的形成及清除已经建立的细菌生物膜。
8.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述水凝胶AZG-Gel具有一氧化氮产生能力，且具有葡萄糖浓度依赖性，具有炎症调节功能，能促进血管生成和/或胶原沉积。
9.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述水凝胶AZG-Gel对葡萄糖表现出良好的响应性，能降低糖尿病伤口环境的血糖和pH值，改善糖尿病伤口微环境。
10.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述水凝胶AZG-Gel能利用伤口局部环境的pH值变化来可视化监测糖尿病伤口愈合的过程。
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|---|---|---|---|---|
| CN119303155A (zh) * | 2024-12-19 | 2025-01-14 | 浙江大学 | 一种促进创面愈合的抗菌水凝胶及其制备方法 |
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