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CN115029391A - 一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法 - Google Patents

一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法 Download PDF

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CN115029391A
CN115029391A CN202210725053.4A CN202210725053A CN115029391A CN 115029391 A CN115029391 A CN 115029391A CN 202210725053 A CN202210725053 A CN 202210725053A CN 115029391 A CN115029391 A CN 115029391A
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CN
China
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solution
sugar
fermentation
lactic acid
enzymolysis
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Application number
CN202210725053.4A
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许平
穆晓玲
宋家林
陈思弘
李维理
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Bbca Group Co ltd
Original Assignee
Anhui Bbca Group Co ltd
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Publication date
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Abstract

本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将芽孢杆菌接种到种子培养基中培养得到种液；步骤二：将一部分种液转移到以混合糖为碳源的发酵培养基中进行发酵培养得到乳酸；步骤三：向剩余种液中加入灭菌的种子培养基继续培养连续得到种液。本发明的有益效果是：本发明的种液是连续培养获得的，除首次接种外，连续培养的过程中不需额外经过甘油管、平板划线、斜面扩培及种子瓶培养，有效的减少了发酵及其辅助周期。利用本发明提供的发酵方法乳酸生产速率快，转化率高，最后得到的发酵液中产物浓度高。

Description

一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法。
背景技术
乳酸(Lactic Acid)，又名2-羟基丙酸，分子式是C3H6O3，它是一种含有羟基的羧酸，具有多种用途，乳酸及其盐应用于食品、医药、化工等领域。
以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物聚乳酸(polylactide,polylactic acid,PLA)是一种新型的生物降解材料。聚乳酸具有良好的机械物理性能、生物相容性、透气性、抗菌性、阻燃性及可降解性，因此可应用于汽车制造领域、纺织领域、一次性用品领域及生物医药领域等。
目前大规模乳酸发酵使用葡萄糖为碳源进行发酵，成本较高。现有研究报道使用木质纤维素酶解糖液作为碳源进行发酵生产乳酸。木质纤维素酶解糖液主要由葡萄糖、木糖及阿拉伯糖构成，部分乳酸生产菌株可以利用葡萄糖、木糖及阿拉伯糖，但存在发酵周期长、生产速率低的问题，同时木质纤维素酶解糖液存在糠醛等抑制物影响微生物生长及产物的积累。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，有效地缩短发酵及其辅助周期，提高生产速率，获得高浓度乳酸的同时降低发酵残余糖含量，发酵周期20-40h，乳酸生产速率3-6g/L*h，转化率88-96％，最后得到的发酵液中乳酸浓度可达120g/L，光学纯度≥99.6％。
本发明提供了如下的技术方案：
一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，包括以下步骤：
步骤一：将芽孢杆菌接种到种子培养基中培养得到种液；
步骤二：将一部分种液转移到以混合糖为碳源的发酵培养基中进行发酵培养得到乳酸；
步骤三：向剩余种液中加入灭菌的种子培养基继续培养连续得到种液。
优选的，所述芽孢杆菌为Bacillus sp.FYLR3，于2022年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2022920，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
优选的，所述混合糖为多种糖类以不同占比组成的混合糖水溶液，所述多种糖类的不同占比为葡萄糖：木糖：阿拉伯糖的质量比为(10-200)： (3-60)：1；所述混合糖为结晶糖配制获得糖液、酶解植物秸秆获得糖液或酶解淀粉获得糖液的任意一种或几种的组合。
优选的，所述酶解植物秸秆获得糖液的方法如下：
S1、对秸秆进行预处理；
S2、将预处理产物通过多级逆流装置处理，得到原始黑液和综合纤维素；
S3、将原始黑液通过多级膜系统处理，处理后产物，部分回收利用，部分制备黄腐酸；
S4、综合纤维素通过酶解系统进行酶解后，得到酶解糖液和酶解木质素，所述酶解木质素用于制备黄腐酸；
S5、将S4中的得到的酶解糖液通过精制系统进行精制，得到成品糖液；
所述酶解植物秸秆获得糖液为酶解糖液、成品糖液任意一种或两种。
优选的，所述S1中的预处理具体步骤包括：
将秸秆经过除杂、除尘后，切碎成0-20cm的碎秸秆；将碎秸秆与水混拌均匀后，保温，得到水抽提秸秆；将水抽提秸秆送入双螺杆挤压揉搓机中，得到挤压揉搓物料和第一挤压水；所述第一挤压水过滤后回用至水抽提步骤，所述挤压揉搓物料送入水热分解罐中进行水热分解，得到预处理产物，所述水热分解罐中加入碱性分解液，所述碱性分解液包含氢氧化钾或氢氧化钠，所述碱性分解液还包括水。
优选的，所述碱性分解液还包括2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲、乙内酰脲和4-乙酰氨基环己酮中的至少一种。
优选的，所述多级逆流装置包括洗涤装置、固液分离器和挤压装置，所述预处理产物送入洗涤装置进行洗涤，得到终点纤维和终点浓液，所述终点浓液送入固液分离器进行固液分离，固相的细小纤维回送至洗涤装置，液相的原始黑液送入多级膜系统处理，所述终点纤维先通过碱性淡水进行清洗，然后送入挤压装置进行挤压，得到第二挤压水和综合纤维素，所述第二挤压水回送至洗涤装置，所述综合纤维素送入酶解系统进行酶解。
优选的，所述多级膜系统包括预处理器、超滤膜、纳滤膜和电渗析膜，所述原始黑液送入预处理器处理，然后进行固液分离，得到固相的固形物和液相的预处理黑液，所述固形物用于制作黄腐酸，所述预处理黑液送入超滤膜进行过滤，超滤浓液经过碱析、酸析、保温处理后固液分离，得到固相的酸析木质素和液相的酸性稀糖液，所述酸析木质素用于制作黄腐酸，所述酸性稀糖液送入酶解系统，超滤透过液送入电渗析膜过滤，电渗析浓液为浓碱液、用于配制碱性分解液，电渗析透过液送入纳滤膜，纳滤浓液为碱性稀糖液、送入酶解系统，纳滤透过液为碱性淡水、用于降低终点纤维的pH。
优选的，所述预处理器中加入了预处理剂，所述预处理剂制备方法如下：将硅藻土、氧化锆在氮气氛围下煅烧活化，将活化后的硅藻土、氧化锆混匀后浸渍在醋酸钙溶液中，加热干燥，最后在氮气氛围下煅烧活化，得到预处理剂。
优选的，所述超滤膜的制备方法如下：将纳米二氧化钛与二甲基乙酰胺混合，超声分散，加入聚偏氟乙烯、聚乙烯吡络烷酮和N-苄氧羰基-L-天冬酰胺，搅拌加热至聚合物溶解，形成稳定、透明的铸膜液，脱泡后将铸膜液倾倒在玻璃板上，形成厚度均匀地薄层，然后将玻璃板浸没在蒸馏水中，等待薄层脱落，得到所述超滤膜。
优选的，所述酶解系统包括预调装置、一次酶解罐、二次酶解罐和复滤膜，所述综合纤维素送入预调装置中，所述预调装置中还加入了酸性稀糖液、碱性稀糖液、碱性淡水、硫酸，搅拌均匀后得到预调浆纤维，所述预调浆纤维送入一次酶解罐，所述一次酶解罐中还加入了复合酶、复滤稀糖液、酸性淡水，进行一次酶解后得到固相的一次酶解固形物和液相的一次酶解糖液，所述一次酶解固形物送入二次酶解罐中，所述二次酶解罐中还加入了复合酶，进行二次酶解，得到固相的酶解木质素和液相糖液，所述酶解木质素用于制作黄腐酸，所述液相糖液送入复滤膜过滤，复滤透过液为复滤稀糖液、回送至一次酶解罐，复滤浓液为二次酶解糖液，所述一次酶解糖液、二次酶解糖液一起称为酶解糖液、送入精制系统进行精制。
优选的，所述精制系统包括活性炭层、反渗透膜、电渗析膜和热力浓缩器，所述酶解糖液送入活性炭脱色，得到固相的脱色固形物和液相的脱色糖液，所述脱色固形物用于制作黄腐酸，所述脱色糖液送入反渗透膜过滤，反渗透透过液为酸性淡水、送入预调装置和/或一次酶解罐，反渗透浓液为浓糖液、送入电渗析膜过滤，电渗析透过液为浓盐水，所述浓盐水用于制作黄腐酸，电渗析浓液为去离子糖液、送入热力浓缩器浓缩，浓缩后的蒸发液为酸性淡水、送入预调装置和/或一次酶解罐，浓缩后产物即为成品糖液。
优选的，水抽提步骤的条件：碎秸秆与水的质量比为1:(1-5)，保温温度50-99℃，保温时间10-90min。
优选的，所述第一挤压水的过滤方式为板框压滤机、布袋过滤器、连续式离心机分离中的任意一种。
优选的，所述碱性分解液中，氢氧化钾、2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲、乙内酰脲、4-乙酰氨基环己酮和水的质量比为(5-10):(0-1):(0-1):(0-1):100，所述2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲、乙内酰脲、4-乙酰氨基环己酮的质量不同时为0。
优选的，所述水热分解的条件：挤压揉搓物料与碱性分解液的质量比为 1：(1-6)，保温温度50-99℃，保温时间30-240min。
优选的，所述洗涤装置中，预处理产物与水的质量比为1：(2-6)。
优选的，所述固液分离器为板框压滤机或连续式离心机。
优选的，所述终点纤维进行酸洗时，终点纤维与酸性洗涤水的质量比为1：(2-6)，酸性洗涤水的pH为3-6。
优选的，所述超滤浓液酸析的pH值为1-4，保温温度40-90℃，保温时间0-90min，固液分离形式为板框压滤机、真空转鼓机、连续式离心机分离中的任意一种。
优选的，所述一次酶解罐中的浆料固含量为8-35％，pH为4.5-7。
优选的，所述一次酶解罐中的复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶和纤维二糖酶，所述纤维素酶添加量为0-40FPA/g干物质、半纤维素酶添加量为 0-3000U/g干物质、纤维二糖酶添加量为2-20U/g干物质，温度47-53℃，pH 范围4.5-5.5，搅拌速率1.5-5rpm，酶解时间24-96h，固液分离形式为板框压滤机或连续式离心机分离；
优选的，所述二次酶解罐中的复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶和纤维二糖酶，所述二次酶解罐中的浆料固含量为2-10％，纤维素酶添加量为 0-40FPA/g干物质、半纤维素酶添加量为0-3000U/g干物质、纤维二糖酶添加量为0-20U/g干物质，温度47～53℃，pH范围4.5-5.5，搅拌速率10-30rpm，酶解时间24-96h，固液分离形式为板框压滤机或连续式离心机分离；
优选的，所述活性炭为粉末活性炭、椰壳活性炭、热碳炉活性炭中的任意一种。
优选的，所述热力浓缩器为多效蒸发器、真空浓缩器、塔式浓缩器中的任意一种。
优选的，所述黄腐酸的制备方法如下：将酸析木质素、固形物、酶解木质素按比例混合，先加入混合酶酶解，酶解完成后在加入活化剂活化，所述混合酶为漆酶、过氧化物酶、锰过氧化物酶中的一种或多种，混合酶添加量为2-30U/g干物质，反应温度25-60℃，pH值3-8，反应时间8-48h；所述活化剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠，反应温度70-99℃，反应时间1-5h，反应结束，烘干，装袋得黄腐酸。
优选的，在所述种子培养基、发酵培养基中，有机氮源牛肉膏、酵母膏、酵母浸粉、豆粕粉、花生粉、玉米浆或棉籽蛋白中的任意一种或几种的组合；
无机氮源选自尿素、硝酸盐或铵盐中的任意一种或几种的组合。
优选的，所述有机氮源的浓度为0.2-200g/L，无机氮源的浓度为2-30 g/L。
优选的，当种子培养基中碳源残余量为20-80g/L时，优选为25-40g/L，取出60-80vol％的种液接种到以混合糖为碳源发酵培养基中进行发酵，剩余 20-40vol％的种液中加入灭菌的种子培养基继续培养连续得到种液。
优选的，在发酵培养基发酵培养过程中pH值控制在5.0-7.8，优选为 5.9-6.4。
优选的，用于控制pH值的中和剂为酸、酸式盐、碱或碱式盐中的任意一种或几种的组合，进一步优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钙、碳酸氢钠、醋酸钠、焦磷酸钠、碳酸钠、氨水、盐酸、磷酸、甲酸、醋酸、二氧化碳、硫酸、乳酸、AMP-95、二乙醇胺、三乙醇胺或氨基乙酸中的任意一种或几种的组合，再进一步优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钙、氨水、盐酸、硫酸或乳酸中的任意一种或几种的组合，最优选20-25％氢氧化钠溶液、20-25％氢氧化钾溶液、15-20％氢氧化钙溶液、10-15％碳酸钙溶液、15-20％氨水、20-25％盐酸、40-50％硫酸或80-90％乳酸溶液中的任意一种或几种的组合。
本发明的有益效果是：
1、本发明的种液是连续培养获得的，除首次接种外，连续培养的过程中不需额外经过甘油管、平板划线、斜面扩培及种子瓶培养，有效的减少了发酵及其辅助周期。
2、利用本发明提供的发酵方法乳酸生产速率快，转化率高，最后得到的发酵液中产物浓度高。
3、本发明采用混合糖为碳源，混合糖可以来源于酶解秸秆，秸秆通过预处理和多级逆流装置处理后，得到原始黑液和综合纤维素，其中综合纤维素中的发酵抑制物(有机酸)含量极低，小于100ppm，提高后续酶解系统中糖液的产率。
4、本发明预处理步骤中的水热分解罐中加入碱性分解液，碱性分解液的主要成分包括氢氧化钾、水，此外发明人还发现在碱性分解液添加少量2,5- 二氧代-4-咪唑烷基脲、乙内酰脲和4-乙酰氨基环己酮，可以提高糖液产率，可能是因为在水热条件下，会发生部分分解，放出少量的气体(主要是氨气)，氨气溶解后形成的氨水与氢氧化钾一起能够去除木质素，并且氨分子还会渗入木质纤维素里面去，能够促进木质素含量显著降低，而大部分纤维素、半纤维素被保留，纤维素和半纤维素的结晶度也显著降低了，提高了比表面积，提高后续酶解系统酶解效率，增加糖液的产率。
5、聚偏氟乙烯具有优异的机械强度和良好的膜加工性能，但其本身具有极强的疏水性，在使用的过程中容易受到污染，会大大降低超滤膜的使用寿命，本发明中通过引入纳米二氧化钛、N-苄氧羰基-L-天冬酰胺，很好的解决了上述问题，同时也提高了膜的渗透性能，这是因为a纳米二氧化钛表面有大量的羟基、N-苄氧羰基-L-天冬酰胺中含有羧基和氨基，这些亲水性基团的引入可以极大的增加膜表面的亲水性，氮原子、氧原子上存在孤电子对，会产生一些协同作用，进而提高膜的抗污染能力，延长了超滤膜的使用寿命，b在膜制备过程中，二甲基乙酰胺与蒸馏水发生交换，聚乙烯吡络烷酮起到致孔剂的作用，由于纳米二氧化钛表面有大量的羟基、N-苄氧羰基-L- 天冬酰胺中含有羧基和氨基，在膜制备过程中能够诱导水快速进入铸膜液体系，从而加速相交换过程。由此在膜表面形成较多的膜孔，形成了发达的空隙结构，从而提高了膜的渗透性能。
6、原始黑液送入预处理器处理，原始黑液中还含有少量的细小纤维和偏硅酸盐，预处理器中加入了预处理剂，预处理剂的主要成分包括硅藻土、氧化锆和氧化钙，经过高温煅烧活化后，可以有效的吸附细小纤维和偏硅酸盐，提高后续酶解系统中糖液的产率。
附图说明
图1是芽孢杆菌生产L-乳酸流程图；
图2是秸秆制糖联产黄腐酸有机肥的流程图；
图3是多级逆流装置的流程图。。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做具体说明。
性能测试方法：
利用下述测试方法对下述实施例提供的发酵液进行性能测试，方法如下：
(1)L-乳酸含量(g/L)和D-乳酸含量(g/L)的测定：采用Agilent 1200 液相色谱仪，采用手性分离柱；分别利用L-乳酸标准品和D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中乳酸的含量；
(2)光学纯度：按以下公式计算样品中L-乳酸的光学纯度：
Figure RE-GDA0003794796610000081
公式中，AL为L-乳酸峰含量(g/L)，AD为D-乳酸含量(g/L)；
(3)糖酸转化率(％)：乳酸产量(g)÷碳源总量(g)×100％；
(5)乳酸发酵生产能力(g/L/h)：乳酸产量(g/L)÷发酵时间(h)；
其中，作为标准品的D-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为L0625-25mg；作为标准品的L-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为46937-500mg。
本发明中所述芽孢杆菌为Bacillus sp.FYLR3，于2022年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2022920，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
实施例1
种子培养基：葡萄糖100g/L(来源于结晶糖)，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，酵母浸粉20g/L，硫酸铵6.48g/L，磷酸氢二铵4.14 g/L，115℃灭菌20min。
实施例2
种子培养基：葡萄糖100g/L+木糖30g/L(来源于结晶糖)，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，酵母浸粉15g/L，硫酸铵12.96g/L，磷酸氢二铵8.28g/L，115℃灭菌20min。
实施例3
发酵培养基：葡萄糖93.3g/L+木糖39.4g/L+阿拉伯糖2.5g/L(来源于结晶糖)，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，酵母浸粉15g/L，硫酸铵12.96g/L，磷酸氢二铵8.28g/L，115℃灭菌20min。
实施例4
发酵培养基：葡萄糖83.2g/L+木糖36.7g/L+阿拉伯糖4.7g/L(来源于酶解植物秸秆获取的酶解糖液)，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，酵母浸粉10g/L，硫酸铵12.96g/L，磷酸氢二铵8.28g/L，115℃灭菌20 min。
实施例5
发酵培养基：葡萄糖91.6g/L+木糖40g/L+阿拉伯糖2.4g/L(来源于结晶糖)，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸铵12.96g/L，磷酸氢二铵8.28g/L，酵母浸粉1g/L，蛋白胨1g/L，玉米浆15g/L，糖蜜15g/L，115℃灭菌20min。。
实施例6
发酵培养基：葡萄糖92.7g/L+木糖37.9g/L+阿拉伯糖4.5g/L(来源于酶解植物秸秆获取的成品糖液)，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，酵母浸粉10g/L，硫酸铵12.96g/L，磷酸氢二铵8.28g/L，115℃灭菌20 min。
实施例7
本实施例提供了一种于5L发酵罐中连续培养获得种液的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
首次种子培养基：实施例1提供的种子培养基；
种子培养基：实施例2提供的种子培养基；
制备方法如下：
(1)首次种子培养：将保存的菌种通过甘油管、平板划线、斜面扩培及种子瓶培养后接种到装有2.4L首次种子培养基的5L发酵罐中进行培养，使用30％碳酸钙溶液自动控制pH值为6.5，得到OD610值为11.4的种液，当残糖到达40g/L时，移出70vol％；
(2)连续种子培养：向剩余30vol％中加入70vol％无菌的种子培养基，使用20％氢氧化钙溶液自动控制pH值为6.2，得到OD610约为20的种液，当残糖到达40g/L时，移出70vol％进行发酵培养，向剩余30vol％中加入70 vol％无菌的种子培养基，重复步骤(2)连续培养获得种液。
实施例8
本实施例提供了一种于50L发酵罐中利用凝结芽孢杆菌制备乳酸的发酵方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
发酵培养基：实施例3提供的发酵培养基；
制备方法如下：
发酵培养：使用实施例7连续培养获得的2.4L种液，加入灭菌的9.6L 发酵培养基，温度50℃、转速80rpm，30％氢氧化钙溶液自动控制pH值为 6.0，每2h取样测OD610值、残糖，发酵培养至残糖≤0.3％时，停止发酵；
发酵结果：周期22h；乳酸含量121.87g/L；转化率96.56％；光学纯 99.8％；产酸速率5.54g/L*h。
实施例9
本实施例提供了一种于50L发酵罐中利用凝结芽孢杆菌制备乳酸的发酵方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
发酵培养基：实施例4提供的发酵培养基；
制备方法如下：
发酵培养：使用实施例7连续培养获得的2.4L种液，加入灭菌的9.6L 发酵培养基，温度52℃、转速80rpm，30％氢氧化钙溶液自动控制pH值为 6.3，每2h取样测OD610值、残糖，发酵培养至残糖≤0.3％时，停止发酵；
发酵结果：周期36h；乳酸含量118.14g/L；转化率97.95％；光学纯 99.7％；产酸速率3.28g/L*h。
实施例10
本实施例提供了一种于50L发酵罐中利用凝结芽孢杆菌制备乳酸的发酵方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
发酵培养基：实施例5提供的发酵培养基；
制备方法如下：
发酵培养：使用实施例7连续培养获得的2.4L种液，加入灭菌的9.6L 发酵培养基，温度51℃、转速100rpm，30％氢氧化钙溶液自动控制pH值为6.1，每2h取样测OD610值、残糖，发酵培养至残糖≤0.3％时，停止发酵；
发酵结果：周期40h；乳酸含量120.94g/L；转化率94.99％；光学纯 99.6％；产酸速率3.02g/L*h。
实施例11
本实施例提供了一种于50L发酵罐中利用凝结芽孢杆菌制备乳酸的发酵方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
发酵培养基：实施例6提供的发酵培养基；
制备方法如下：
发酵培养：使用实施例7连续培养获得的2.4L种液，加入灭菌的9.6L 发酵培养基，温度50℃、转速120rpm，30％氢氧化钙溶液自动控制pH值为6.2，每2h取样测OD610值、残糖，发酵培养至残糖≤0.3％时，停止发酵；
发酵结果：周期38h；乳酸含量127.8g/L；转化率90.22％；光学纯 99.7％；产酸速率3.36g/L*h。
实施例12
本实施例提供了酶解植物秸秆获得糖液方法，包括如下步骤：
S1、对秸秆进行预处理；
将秸秆经过除杂、除尘后，切碎成0-10cm的碎秸秆；将碎秸秆与水按照质量比为1:1混拌均匀后，50℃保温90min，得到水抽提秸秆；将水抽提秸秆送入双螺杆挤压揉搓机中，得到挤压揉搓物料和第一挤压水；所述第一挤压水通过板框压滤机压滤后回用至水抽提步骤，所述挤压揉搓物料送入水热分解罐中进行水热分解，所述水热分解罐中加入碱性分解液，挤压揉搓物料与碱性分解液的质量比为1：1，所述碱性分解液中，氢氧化钾、2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲、乙内酰脲、4-乙酰氨基环己酮和水的质量比为10:0:1:1:100， 50℃保温时间120min，得到预处理产物；
S2、将预处理产物通过多级逆流装置处理，得到原始黑液和综合纤维素；
所述多级逆流装置包括洗涤装置、固液分离器和挤压装置，所述预处理产物送入洗涤装置进行洗涤，得到终点纤维和终点浓液，所述洗涤装置中，预处理产物与水的质量比为1：2，所述终点浓液送入固液分离器进行固液分离，固液分离器为板框压滤机，固相的细小纤维回送至洗涤装置，液相的原始黑液送入多级膜系统处理，所述终点纤维先通过碱性淡水进行清洗，然后送入挤压装置进行挤压，得到第二挤压水和综合纤维素，终点纤维与酸性洗涤水的质量比为1：2，酸性洗涤水的pH为4-5，所述第二挤压水回送至洗涤装置，所述综合纤维素(pH为5-8)送入酶解系统进行酶解。
S3、将原始黑液通过多级膜系统处理，处理后产物，部分回收利用，部分制备黄腐酸；
所述多级膜系统包括预处理器、超滤膜、纳滤膜和电渗析膜，所述原始黑液送入预处理器处理，然后进行固液分离，得到固相的固形物和液相的预处理黑液，所述预处理器中加入了预处理剂，所述预处理剂制备方法如下：将硅藻土、氧化锆在氮气氛围下700℃煅烧活化2h，将活化后的硅藻土、氧化锆按照质量比5:1的比例混匀后，取1kg混匀后的粉体浸渍在3L质量浓度20％为醋酸钙溶液中，110℃加热干燥，最后在氮气氛围下800℃煅烧活化24h，得到预处理剂，所述固形物用于制作黄腐酸，所述预处理黑液送入超滤膜进行过滤，超滤浓液经过碱析、酸析(pH为1-2)、40℃保温时间90min 后通过板框压滤机固液分离，得到固相的酸析木质素和液相的酸性稀糖液，所述酸析木质素用于制作黄腐酸，所述酸性稀糖液送入酶解系统，超滤透过液送入电渗析膜过滤，电渗析浓液为浓碱液、用于配制碱性分解液，电渗析透过液(pH为7-10)送入纳滤膜，纳滤浓液为碱性稀糖液(质量浓度0-25％)、送入酶解系统，纳滤透过液为碱性淡水、用于降低终点纤维的pH。
S4、综合纤维素通过酶解系统进行酶解后，得到酶解糖液和酶解木质素，所述酶解木质素用于制备黄腐酸；
所述酶解系统包括预调装置、一次酶解罐、二次酶解罐和板框过滤机，所述综合纤维素送入预调装置中，所述预调装置中还加入了酸性稀糖液、碱性稀糖液、碱性淡水、硫酸，搅拌均匀后得到预调浆纤维，所述预调浆纤维送入一次酶解罐，所述一次酶解罐中还加入了复合酶、复滤稀糖液、酸性淡水，所述一次酶解罐中的浆料固含量为10-15％，pH为4-5，进行一次酶解后得到固相的一次酶解固形物和液相的一次酶解糖液，所述一次酶解罐中的复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶和纤维二糖酶，所述纤维素酶添加量为20FPA/g干物质、半纤维素酶添加量为2000U/g干物质、纤维二糖酶添加量为10U/g干物质，温度50℃，pH范围4.5-5.5，搅拌速率2rpm，酶解时间 48h，固液分离形式为板框压滤机，所述一次酶解固形物送入二次酶解罐中，所述二次酶解罐中还加入了复合酶，进行二次酶解，所述二次酶解罐中的复合酶包括纤维素酶、半纤维素酶和纤维二糖酶，所述二次酶解罐中的浆料固含量为5-10％，纤维素酶添加量为30FPA/g干物质、半纤维素酶添加量为 3000U/g干物质、纤维二糖酶添加量为20U/g干物质，温度50℃，pH范围 4.5-5.5，搅拌速率30rpm，酶解时间96h，二次酶解结束，经过固液分离(板框压滤机过滤)，得到滤饼和二次酶解糖液，滤饼使用酸性淡水复滤(冲洗滤饼，把滤饼里面的糖洗出来)，得到酶解木质素和复滤稀糖液，所述酶解木质素用于制作黄腐酸，复滤稀糖液回送至一次酶解罐，所述一次酶解糖液、二次酶解糖液一起称为酶解糖液、送入精制系统进行精制。
S5、将S4中的得到的酶解糖液通过精制系统进行精制，得到成品糖液；
所述精制系统包括活性炭层、反渗透膜、电渗析膜和热力浓缩器，所述酶解糖液送入活性炭脱色，得到固相的脱色固形物和液相的脱色糖液，所述脱色固形物用于制作黄腐酸，所述脱色糖液送入反渗透膜过滤，反渗透透过液为酸性淡水、送入预调装置和/或一次酶解罐，反渗透浓液为浓糖液、送入电渗析膜过滤，电渗析透过液为浓盐水，所述浓盐水用于制作黄腐酸，电渗析浓液为去离子糖液、送入热力浓缩器(多效蒸发器)浓缩，浓缩后的蒸发液为酸性淡水、送入预调装置和/或一次酶解罐，浓缩后产物即为成品糖液。
黄腐酸的制备方法如下：将酸析木质素、固形物、酶解木质素、脱色固形物、浓盐水按比例混合，先加入混合酶酶解，酶解完成后在加入活化剂活化，所述混合酶为漆酶、过氧化物酶、锰过氧化物酶中的一种或多种，混合酶添加量为10U/g干物质，反应温度40℃，pH值3-5，反应时间12h；所述活化剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠，反应温度80℃，反应时间3h，反应结束，烘干，装袋得黄腐酸。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将芽孢杆菌接种到种子培养基中培养得到种液；
步骤二：将一部分种液转移到以混合糖为碳源的发酵培养基中进行发酵培养得到乳酸；
步骤三：向剩余种液中加入灭菌的种子培养基继续培养连续得到种液。
2.根据权利要求1所述一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为Bacillus sp.FYLR3，于2022年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M2022920，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
3.根据权利要求1所述的一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，所述混合糖为多种糖类以不同占比组成的混合糖水溶液，所述多种糖类的不同占比为葡萄糖：木糖：阿拉伯糖的质量比为（10-200）：（3-60）：1；所述混合糖为结晶糖配制获得糖液、酶解植物秸秆获得糖液或酶解淀粉获得糖液的任意一种或几种的组合。
4.根据权利要求3所述的一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，所述酶解植物秸秆获得糖液的方法如下：
S1、对秸秆进行预处理；
S2、将预处理产物通过多级逆流装置处理，得到原始黑液和综合纤维素；
S3、将原始黑液通过多级膜系统处理，处理后产物，部分回收利用，部分制备黄腐酸；
S4、综合纤维素通过酶解系统进行酶解后，得到酶解糖液和酶解木质素，所述酶解木质素用于制备黄腐酸；
S5、将S4中的得到的酶解糖液通过精制系统进行精制，得到成品糖液；
所述酶解植物秸秆获得糖液为酶解糖液、成品糖液任意一种或两种。
5.根据权利要求4所述的一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，所述S1中的预处理具体步骤包括：
将秸秆经过除杂、除尘后，切碎成0-20cm的碎秸秆；将碎秸秆与水混拌均匀后，保温，得到水抽提秸秆；将水抽提秸秆送入双螺杆挤压揉搓机中，得到挤压揉搓物料和第一挤压水；所述第一挤压水过滤后回用至水抽提步骤，所述挤压揉搓物料送入水热分解罐中进行水热分解，得到预处理产物，所述水热分解罐中加入碱性分解液，所述碱性分解液包含氢氧化钾或氢氧化钠，所述碱性分解液还包括水。
6.根据权利要求5所述的一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，所述碱性分解液还包括2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲、乙内酰脲和4-乙酰氨基环己酮中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，在所述种子培养基、发酵培养基中，有机氮源牛肉膏、酵母膏、酵母浸粉、豆粕粉、花生粉、玉米浆或棉籽蛋白中的任意一种或几种的组合；
无机氮源选自尿素、硝酸盐或铵盐中的任意一种或几种的组合。
8.根据权利要求7所述的一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，所述有机氮源的浓度为0.2-200 g/L，无机氮源的浓度为2-30 g/L。
9.根据权利要求1所述的一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，当种子培养基中碳源残余量为20-80 g/L时，优选为25-40 g/L，取出60-80 vol%的种液接种到以混合糖为碳源发酵培养基中进行发酵，剩余20-40 vol%的种液中加入灭菌的种子培养基继续培养连续得到种液。
10.根据权利要求1所述的一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，在发酵培养基发酵培养过程中pH值控制在5.0-7.8，优选为5.9-6.4。
11.根据权利要求10所述的一种利用混合糖为碳源生产乳酸的发酵方法，其特征在于，用于控制pH值的中和剂为酸、酸式盐、碱或碱式盐中的任意一种或几种的组合，进一步优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钙、碳酸氢钠、醋酸钠、焦磷酸钠、碳酸钠、氨水、盐酸、磷酸、甲酸、醋酸、二氧化碳、硫酸、乳酸、AMP-95、二乙醇胺、三乙醇胺或氨基乙酸中的任意一种或几种的组合，再进一步优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钙、氨水、盐酸、硫酸或乳酸中的任意一种或几种的组合，最优选20-25%氢氧化钠溶液、20-25%氢氧化钾溶液、15-20%氢氧化钙溶液、10-15%碳酸钙溶液、15-20%氨水、20-25%盐酸、40-50%硫酸或80-90%乳酸溶液中的任意一种或几种的组合。
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