CN102643874A

CN102643874A - 芽孢杆菌利用玉米秸秆水解液生产聚合级l-乳酸的方法

Info

Publication number: CN102643874A
Application number: CN2012101227121A
Authority: CN
Inventors: 马延和; 于波; 王丽敏; 薛张伟
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2012-04-24
Filing date: 2012-04-24
Publication date: 2012-08-22

Abstract

本发明公开了一种发酵生产L-乳酸的方法。本发明所提供的发酵生产L-乳酸的方法包括如下步骤：将芽孢杆菌(Bacillus sp.)接种到以玉米秸秆水解液作为唯一碳源的发酵培养基中进行发酵培养，得到L-乳酸；所述玉米秸秆水解液中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的质量比为(27-29)∶(8-10)∶1；所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)具体为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4DSM No.23183。在本发明所述方法中，该菌不但可以高效利用所述玉米秸秆水解液中的葡萄糖，而且也可以利用其中的木糖；其L-乳酸产量高达80克/升(每升发酵液生产80克L-乳酸)；糖酸转化率达到94-98％；且发酵液中检测不到D-乳酸的存在，光学纯度达到100％；另外，本发明还降低了发酵原料成本，有利于工业化生产。

Description

芽孢杆菌利用玉米秸秆水解液生产聚合级L-乳酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种发酵生产L-乳酸的方法，特别涉及一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)利用玉米秸秆水解液生产L-乳酸的方法。

背景技术

乳酸(Lactic acid：CH₃CHOHCOOH/C₃H₆O₃)广泛应用于食品、纺织、化妆与医药等行业，有可能替代目前的石化产品，如丙烯酸，或能形成新的生物制品，如聚乳酸。乳酸的需求量随着运用范围的增大而日益增加。可以通过合成和发酵两个途径形成乳酸。合成法是用乙醛和剧毒物氢氰酸作为底物，因此不能广泛应用于食品中，并且合成法最终产生一种消旋混合物，还需进行光学拆分，稍显复杂。相比，发酵法比较常用，它可以产生手性纯度接近100％的D型或L型乳酸，这两种异构体都能够聚合，但是立体纯度的聚合特性不同。发酵法还可分为同型发酵和异型发酵，但是商业化生产却是通过同型分批发酵模式生产的。有人曾尝试用根霉菌通过异型发酵或嗜热条件产乳酸，事实证明这并不经济。

现有研究已经证明许多微生物有生产乳酸的能力，包括乳酸菌、真菌和各种基因改造的菌株。其中嗜热芽孢杆菌是一种新型的生产乳酸的菌种。目前普遍把精制糖作为原料生产乳酸，但是价格比较昂贵，不利于降低乳酸生产成本。由于制备L-乳酸近70％的成本是其生产原料，因此急需找到经济上有吸引力的农业废料作为碳源和廉价的氮源，以满足对营养物质要求比较苛刻的微生物生长及产乳酸。玉米秸秆是玉米收获后在玉米地里的农业残留，在中国大量存在。玉米秸秆主要含木质纤维素，由纤维素和半纤维素组成，分别彻底水解为葡萄糖和木糖。许多生产乳酸的微生物可以利用葡萄糖，但是又能同时利用木糖的微生物几乎很少。如果能以玉米秸秆水解液作为发酵生产L-乳酸的底物，将具有广阔的市场前景。从工业长远发展的角度看，经济节约发酵成本的关键性步骤就是选择廉价的农副产品为碳氮原，并优化选择其生产乳酸的最适廉价碳氮原浓度。如果能以可再生性农业废料作为原料来发酵，高效利用廉价底物生产光学纯的L-乳酸，将具有较高的经济价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵生产L-乳酸的方法。

本发明所提供的发酵生产L-乳酸的方法包括如下步骤：将芽孢杆菌(Bacillussp.)接种到以玉米秸秆水解液作为唯一碳源的发酵培养基中进行发酵培养，得到L-乳酸。

所述玉米秸秆水解液可为玉米秸秆的酸水解液，也可为酶水解液，还可为酸酶联合水解液；在本发明中，所述玉米秸秆水解液为玉米秸秆的酸水解液，其中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的质量比可为(27-29)∶(8-10)∶1，具体如28∶9∶1。

所述玉米秸秆水解液中总还原糖在所述发酵培养基中的终浓度可为82-134g/L，如82.53g/L。

在本发明中，所述玉米秸秆水解液中所述总还原糖为葡萄糖、木糖和阿拉伯糖；所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度具体为69.4g/L，所述木糖在所述发酵培养基中的终浓度具体为21.7g/L，所述阿拉伯糖在所述发酵培养基中的终浓度具体为2.5g/L。

所述发酵培养基中含有碳源，氮源和控制发酵液pH的中和剂。在本发明的实施例中，所述碳源即为上述玉米秸秆水解液；所述氮源为终浓度为9.8-13.2g/L，如9.87g/L的花生粕，所述花生粕中需加入终浓度为60000U/L的中性蛋白酶；其中，中性蛋白酶的酶活定义为：在测定条件(30±0.2℃；pH值7.5)下，每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长的吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位(即1U)，用U/g表示。所述中性蛋白酶用于处理花生粕，释放氮元素。在本发明的一个实施例中，所述中性蛋白酶具体为诺维信(中国)生物技术有限公司产品，CAS号为9068-59-1。所述中和剂为碳酸钙；所述碳酸钙在所述发酵培养基中的含量可为所述总还原糖质量的60％。所述发酵培养基的pH可为5.1-6.5，如6.5。

所述发酵培养的温度可为45-55℃，具体如50℃；所述发酵培养的培养方式可为静止培养；所述发酵培养的时间可为72-96h，具体如96h。

本发明所提供的发酵生产L-乳酸的方法中，接种到所述发酵培养基中进行培养的所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)是经过活化的所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)；在本发明的具体实施例中，其活化方法为：将所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)接入种子培养基，在50℃静止培养24h后，将培养物按照1∶10的体积比转接到新的种子培养基中，继续在50℃静止培养24h，得到所述活化的芽孢杆菌(Bacillus sp.)。

所述种子培养基中含有终浓度为10g/L的葡萄糖，终浓度为10g/L的酵母粉，以及终浓度为6g/L的碳酸钙，余量为水；所述种子培养基的pH为5.1-6.5。

在本发明中，进行所述发酵培养的所述发酵培养基需经高压灭菌，具体为115℃高压灭菌10min。

芽孢杆菌(Bacillus sp.)在以玉米秸秆水解液作为唯一碳源，发酵生产L-乳酸中的应用也属于本发明的保护范围。

所述玉米秸秆水解液可为玉米秸秆的酸水解液，也可为酶水解液，还可为酸酶联合水解液；在本发明中，所述玉米秸秆水解液为玉米秸秆的酸水解液，含有如下三种还原糖：葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，这三种还原糖的质量比为葡萄糖∶木糖∶阿拉伯糖＝(27-29)∶(8-10)∶1，具体如28∶9∶1。

在本发明中，上述所有所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)均为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)XZL4 DSM No.23183。该菌株已经于2009年12月4日保藏于布达佩斯条约指定的微生物国际保藏单位：德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，地址：德国布伦瑞克英豪丰大街7B，邮编D-38124(Inhoffenstr.7B，Braunschweig，D-38124)，保藏编号为DSM No.23183。该菌株已经于2010年5月20日申请中国发明专利，申请号201010176868.9，申请公布号CN 101914465A。

本发明所提供的发酵生产L-乳酸的方法中，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4 DSM No.23183以玉米秸秆水解液为唯一碳源，不但可以高效利用水解液中的葡萄糖，而且也可以利用水解液中的木糖。其生产L-乳酸的能力强，L-乳酸产量高达80克/升(每升发酵液生产80克L-乳酸)；糖酸转化率达到94-98％；且发酵液中检测不到D-乳酸的存在，光学纯度达到100％。另外，本发明采用高温发酵工艺，避免杂菌污染；同时使用花生粕作为氮源，一定程度上降低了发酵原料成本，有利于工业化生产。

附图说明

图1为随着玉米秸秆水解液浓度的提高，发酵液中相应总还原糖、葡萄糖、木糖、L-乳酸浓度和细胞生长情况的变化。其中，A为总还原糖浓度；B为葡萄糖浓度；C为L-乳酸浓度；D为木糖浓度；E为发酵液OD620，反应细胞生长情况。

图2为不同氮源，发酵液中相应总还原糖、葡萄糖、木糖、L-乳酸浓度和细胞生长情况的变化。其中，A为总还原糖浓度；B为葡萄糖浓度；C为L-乳酸浓度；D为木糖浓度；E为发酵液OD620，反应细胞生长情况。

图3为廉价氮源花生粕不同浓度下，发酵液中相应总还原糖、葡萄糖、木糖、L-乳酸浓度和细胞生长情况的变化。其中，A为总还原糖浓度；B为葡萄糖浓度；C为L-乳酸浓度；D为木糖浓度；E为发酵液OD620，反应细胞生长情况。

图4为分批发酵模式放大实验高效生产L-乳酸，发酵液中相应总还原糖、葡萄糖、木糖、L-乳酸浓度和细胞生长情况的变化。其中，乳酸即为L-乳酸。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的玉米秸秆水解液，均按照如下方法制备得到：

将干燥的玉米秸秆与质量百分含量为1％的稀硫酸按1∶5的质量比混合，在120-130℃保温2-3小时进行水解，之后通过中和脱酸、活性炭脱色、减压蒸发浓缩、经离子交换脱离子后得到玉米秸秆水解液。所得玉米秸秆水解液含葡萄糖555.3g/L、木糖174.2g/L和阿拉伯糖19.9g/L，其中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的质量比为28∶9∶1。

下述实施例中所涉及的各参数测定方法均如下：

(1)总还原糖浓度采用DNS法(3，5-二硝基水杨酸比色法)测定，使用山东省科学院生物研究所的总还原糖测定仪测定，仪器型号为SGD-IV；葡萄糖浓度采用SBA-80C生物传感分析仪测定；木糖浓度采用木糖测定试剂盒(南京建成科技有限公司)测定。

其中DNS法的原理是：在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸(DNS)共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，而还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。

(2)L-乳酸和D-乳酸浓度的测定采用Agilent 1200液相色谱仪，配备手性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10W，4.6mm ID×50mm，光学异构体分离用)。具体操作条件为：2mM的硫酸铜作为流动相，流量0.5ml/min，进样量10μl，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。利用L-乳酸和D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。

(3)糖酸转化率定义为：L-乳酸产量(克/升)÷总还原糖的消耗量(克/升)×100％。

(4)光学纯度(optical purity)是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值(enantiomeric excess)表示。本发明中L-乳酸的光学纯度按以下公式计算：(L-乳酸含量-D-乳酸含量)÷(L-乳酸含量+D-乳酸含量)×100％。

芽孢杆菌均为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4，该菌株已经于2009年12月4日保藏于布达佩斯条约指定的微生物国际保藏单位：德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，地址：德国布伦瑞克英豪丰大街7B，邮编D-38124(Inhoffenstr.7B，Braunschweig，D-38124)，保藏编号为DSM No.23183。该菌株已经于2010年5月20日申请中国发明专利，申请号201010176868.9，申请公布号CN 101914465A。

种子培养基：终浓度为10g/L的葡萄糖，终浓度为10g/L的酵母粉，以及终浓度为6g/L的碳酸钙，余量为水；pH为6.5。

实施例1、高效生产L-乳酸的最佳玉米秸秆水解液浓度的确定

本实施例所用发酵培养基依据玉米秸秆水解液浓度的不同，共四种，其配方如下：81.25g/L、108.3g/L、162.5g/L和260g/L四个浓度梯度的玉米秸秆水解液中的任一份，分别含有总还原糖(总还原糖为葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的总和)的终浓度为41.0g/L、52.9g/L、82.53g/L和133.7g/L(上述四个浓度是指玉米秸秆水解液在所述发酵培养基中的加量，例如81.25g/L是指在每升发酵培养基中加入了81.25g玉米水解液，在此条件下，总还原糖在发酵培养基中的终浓度为41.0g/L)；终浓度为10g/L的酵母粉；含量为发酵培养基中总还原糖质量60％的碳酸钙；余量为水；pH6.5。所用酵母粉为商品化试剂，可以从安琪酵母股份有限公司购买获得。

确定用于生产L-乳酸的最佳玉米秸秆水解液浓度的具体步骤如下：

1)种子菌培养：在无菌条件下，将保存在LB斜面里的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)XZL4DSM No.23183用接种环接一环到30ml种子培养基中，50℃静止培养24h后，从中取出3ml培养液转接到30ml新鲜种子培养基中，继续50℃静止培养24h，得到种子液(活化的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4DSM No.23183)。

2)将步骤1)的种子液按体积比1∶10的接种量接到上述四种含有不同浓度玉米秸秆水解液的发酵培养基(30mL)中，50℃静止发酵培养96小时。从0h(将种子液接种到发酵培养基中的一刻)开始，每隔6h，取发酵液，12000rpm离心10分钟，取上清液测定如下参数：总还原糖浓度、葡萄糖浓度、木糖浓度、L-乳酸浓度；计算糖酸转化率。实验设3个重复，结果取平均值。

结果如图1所示，葡萄糖与木糖被同时利用，当在162.5g/L的玉米秸秆水解液(总还原糖在发酵培养基中的终浓度为82.53g/L，其中葡萄糖为69.4g/L，木糖为21.7g/L，阿拉伯糖为2.5g/L)浓度水平时，发酵48小时可产较高水平的L-乳酸浓度(81.5g/L)，糖酸转换率最高(98％)，发酵72h时总还原糖几乎全部消耗。当继续提高玉米秸秆水解液的浓度时，还原糖不能有效的利用，对发酵产生抑制，使糖酸转换率降低。以上实验结果表明，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4DSM No.23183具有良好的发酵性能，玉米秸秆水解液为162.5g/L(总还原糖在发酵培养基中的终浓度为82.53g/L，其中葡萄糖为69.4g/L，木糖为21.7g/L，阿拉伯糖为2.5g/L)浓度时能被凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4DSM No.23183有效的利用，生产较高水平的L-乳酸。

实施例2、高效生产L-乳酸的廉价氮源的确定

本实施例所用发酵培养基依据氮源种类的不同，共七种，其配方如下：玉米秸秆水解液浓度为162.5g/L(每升发酵培养基中加入了162.5g玉米秸秆水解液，在此条件下，总还原糖在发酵培养基中的终浓度为82.53g/L，其中葡萄糖为69.4g/L，木糖为21.7g/L，阿拉伯糖为2.5g/L)；氮源分别为酵母提取物、花生粕、胰蛋白胨、玉米浆干粉、豆饼粉、硫酸铵和磷酸氢二铵，相应各氮源的含氮量(即氮元素在各相应氮源中的质量百分含量)为9.8％、7.6％、13.5％、4.02％、8％、21％和21％，相对应加入发酵培养基中各氮源的终浓度为5g/L、6.45g/L、3.63g/L、12.19g/L、6.13g/L、2.33g/L和2.33g/L，发酵液中统一含氮量(即氮元素在发酵培养基中的质量百分含量)为0.45％，花生粕和豆饼粉两种氮源中需加入终浓度为0.3g/L(60000U/L；酶活定义为：在30±0.2℃、pH 7.5的测定条件下，每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长的吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位(即1U)，用U/g表示。)的中性蛋白酶(用于处理花生粕和豆饼粉，释放氮元素，所述中性蛋白酶为诺维信(中国)生物技术有限公司产品，CAS号为9068-59-1)；碳酸钙的终浓度为50g/L；余量为水；pH6.5。

确定用于生产L-乳酸的最佳廉价氮源的具体步骤如下：

2)将步骤1)的种子液按体积比10％的接种量接到上述七种发酵培养基(30mL)中，50℃静止发酵96小时。从0h(将种子液接种到发酵培养基中的一刻)开始，每隔6h，取发酵液，12000rpm离心10分钟，取上清液测定如下参数：总还原糖浓度、葡萄糖浓度、木糖浓度、L-乳酸浓度。实验设3个重复，结果取平均值。

结果如图2所示，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4DSM No.23183利用玉米秸秆水解液，其中两种无机氮源(硫酸铵和磷酸氢二铵)的乳酸转换率非常低，12.19g/L的玉米浆干粉96小时发酵产乳酸浓度为77g/L，6.13g/L豆饼粉96小时发酵产乳酸浓度为77.7g/L，花生粕产乳酸浓度为83g/L，虽然利用酵母粉作为氮源产乳酸浓度达93g/L，但是考虑到成本问题，花生粕是比较理想的氮源选择。

实施例3、高效生产L-乳酸的廉价氮源花生粕浓度的确定

本实施例所用发酵培养基依据廉价氮源花生粕浓度的不同，共四种，其配方如下：玉米秸秆水解液浓度为162.5g/L(总还原糖在发酵培养基中的终浓度为82.53g/L，其中葡萄糖为69.4g/L，木糖为21.7g/L，阿拉伯糖为2.5g/L)；氮源为花生粕，终浓度分别为3.29g/L、6.58g/L、9.87g/L和13.16g/L，中性蛋白酶终浓度为0.3g/L(60000U/L)；碳酸钙的终浓度为50g/L；余量为水；pH6.5。

确定用于生产L-乳酸的廉价氮源花生粕的最佳浓度的具体步骤如下：

2)将步骤1)的种子液按体积比10％的接种量接到上述四种发酵培养基(30mL)中，50℃静止发酵96小时。从0h(将种子液接种到发酵培养基中的一刻)开始，每隔6h，取发酵液，12000rpm离心10分钟，取上清液测定如下参数：总还原糖浓度、葡萄糖浓度、木糖浓度、L-乳酸浓度。实验设3个重复，结果取平均值。

结果如图3所示，花生粕在发酵培养基中的终浓度在9.87g/L以上时，产L-乳酸浓度没有氮源抑制现象，最高产L-乳酸浓度为83.2g/L；当花生粕在发酵培养基中的终浓度在9.87g/L以下时，发酵受到氮限制，导致较低水平L-乳酸浓度的产生和较多的还原糖残留。

实施例4、分批发酵模式放大实验高效生产L-乳酸

本实施例所用发酵培养基的配方如下：玉米秸秆水解液浓度为162.5g/L(总还原糖在发酵培养基中的终浓度为82.53g/L，其中葡萄糖为69.4g/L，木糖为21.7g/L，阿拉伯糖为2.5g/L)；氮源为终浓度9.87g/L的花生粕，中性蛋白酶终浓度为0.3g/L(60000U/L)；碳酸钙的终浓度为50g/L；余量为水；pH6.5。

分批发酵模式放大实验高效生产L-乳酸的具体步骤如下：

1)种子菌培养：在无菌条件下，将保存在LB斜面里的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)XZL4DSM No.23183用接种环接一环到30ml种子培养基中，50℃静止培养24h后，从中取出3ml(培养液转接到30ml新鲜种子培养基中，继续50℃静止培养24h后，得到种子液(活化的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4DSM No.23183)。

2)将步骤1)的种子液按体积比1∶10的接种量接到1L的上述发酵培养基中，50℃静止发酵96小时。从0h(将种子液接种到发酵培养基中的一刻)开始，每隔6h，取发酵液，12000rpm离心10分钟，取上清液测定如下参数：总还原糖浓度、葡萄糖浓度、木糖浓度、L-乳酸浓度；计算糖酸转化率和L-乳酸光学纯度。实验设3次重复，结果取平均值。

结果如图4和表1所示，L-乳酸产量最高可高达80g/L(每升发酵液生产80克L-乳酸)，糖酸转化率为96.9％，且发酵生产的L-乳酸光学纯度达到了100％。这一结果表明，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4DSM No.23183在以玉米秸秆水解液为唯一碳源发酵生产L-乳酸中，显示出了非常好的工业应用前景。

表1分批发酵模式放大实验高效生产L-乳酸3次重复实验的结果

重复	L-乳酸产量(g/L)	糖酸转化率(％)	L-乳酸光学纯度(％)
				1	78	97.5	100
2	79	96.1	100

3	83	97.1	100
				平均值	80	96.9	100

Claims

1.一种发酵生产L-乳酸的方法，包括如下步骤：将芽孢杆菌(Bacillus sp.)接种到以玉米秸秆水解液作为唯一碳源的发酵培养基中进行发酵培养，得到L-乳酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述玉米秸秆水解液中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的质量比为(27-29)∶(8-10)∶1。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述玉米秸秆水解液中总还原糖在所述发酵培养基中的终浓度为82-134g/L。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度为69.4g/L，所述木糖在所述发酵培养基中的终浓度为21.7g/L，所述阿拉伯糖在所述发酵培养基中的终浓度为2.5g/L。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中的氮源为终浓度为9.8-13.2g/L的花生粕。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基还含有中和剂，所述中和剂为碳酸钙；所述碳酸钙在所述发酵培养基中的含量为所述总还原糖质量的60％；所述发酵培养基的pH为5.1-6.5。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为45-55℃；所述发酵培养的培养方式为静止培养；所述发酵培养的时间为72-96h。

8.芽孢杆菌(Bacillus sp.)在以玉米秸秆水解液作为唯一碳源，发酵生产L-乳酸中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述玉米秸秆水解液中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的质量比为(27-29)∶(8-10)∶1。

10.根据权利要求1-7中任一所述的方法，或权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZL4DSM No.23183。