CN115015457B - 高效液相色谱分析司来帕格中溴乙酸杂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出高效液相色谱分析司来帕格中溴乙酸的方法，其采用反相高效液相色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，pH值2.1‑2.3的磷酸‑磷酸钠缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱。本发明的方法能以紫外检测器检测溴乙酸，实现用普通仪器便捷地监控司来帕格中该基因毒性杂质的含量，具有较好的专属性、稳定性和精确度。

Description

高效液相色谱分析司来帕格中溴乙酸杂质的方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种用高效液相色谱评价药物质量的方法。

背景技术

司来帕格，英文名Selexipag，化学名2-{4-[(5,6-二苯基吡嗪-2-基)(丙烷-2-基)氨基]丁氧基}-N-(甲磺酰)乙酰胺，是一种优良的PGI2受体激动，具有出血小板凝集抑制作用、血管扩张作用、支气管肌扩张作用、脂质沉淀抑制作用、白血球活化抑制作用等多种功效，在治疗肺动脉高压方面具有很好的效果，2018年在中国上市，需求量大。

现行国家标准HJ758-2015采用气相色谱法测水质中溴乙酸，该方法先用硫酸酸化的甲醇溶液对溴乙酸进行衍生，然后再进行气相色谱分析，该衍生的步骤比较费时，便利性较差。

CN 108828081 A以液相色谱质谱联用为基础，采用阴离子交换色谱进行分离，采用负离子模式的多反应监测(MRM)对溴乙酸进行检测。该方法对仪器要求高，检测成本高，且操作过程麻烦。

发明内容

本发明提出一种高效液相色谱分析方法，用来监测司来帕格中的基因毒性杂质溴乙酸的含量，本方法使用普通的紫外检测器来检测，方法简单准确、高效易操作，且不受司来帕格中其它多种有机杂质及残留溶剂组分的干扰。

根据本发明，其采用如下检测条件：

色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；

流动相：以磷酸-磷酸钠缓冲液(pH值2.1-2.3)为流动相A，以乙腈为流动相 B；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：

表1

在一个优选实施方式中，供试品溶液的制备为：取司来帕格200mg，置10ml 量瓶中，加入2ml乙腈，不超过65℃、优选60℃的水浴加热至溶解，再加入流动相A，边加边振摇并稀释至刻度，摇匀后静置，离心，取上清液再次离心，取上清液即得。

在一个优选实施方式中，对照品溶液的制备包括：取溴乙酸对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每lml中含9-10μg的溶液，所述溶剂为乙腈与流动相A按体积比20︰80的混合液。

在一个优选的实施方式中，采用紫外检测器检测，检测波长为190-250nm，优选地为205nm。流速范围为0.9～1.1ml/min，优选1.0ml/min。

本发明中，色谱柱柱温为38～42℃，优选40℃。

用于本发明的检测器可以采用紫外检测器，检测波长为190-400nm。

附图说明

图1为本发明条件下专属性试验叠加图。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。表2列出实施例中所使用材料的详细信息。

表2实验用对照品及样品信息

供试品与对照品溶液的制备

发明人通过将不同样品配制方式做了对比，从结果看出方法3回收率良好，即供试品采用60℃水浴加热至溶解，再加入流动相A，边加边振摇并稀释至刻度，摇匀后静置2h，将溶液转移至离心管中，每分钟5000转离心10分钟，取上清液同法再次离心，取上清液得供试品溶液。

表3：不同配样方式回收率对比

除非特别说明，下文展示分析效果所使用的供试品溶液制备方法皆采用此处所述方法获得。

供试品溶液：取本品200mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入2ml乙腈，60℃水浴加热至溶解，再加入流动相A，边加边振摇并稀释至刻度，摇匀后静置2h，将溶液转移至离心管中，每分钟5000转离心10分钟，取上清液同法再次离心，取上清液。

对照品溶液：取溴乙酸对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每lml 中约含9.4μg的溶液。

色谱条件

在本发明的典型实施例中，色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱Kromasil 100-5C18，4.6×250mm，5μm；

流动相A：0.0025mol/L磷酸钠缓冲液(磷酸调节pH至2.2)为流动相A；

流动相B：乙腈；

流速：1.0ml/min；

波长：205nm；

柱温：40℃；

进样量：80μl，以及

梯度程序：表1

专属性试验

SLPZ31定位溶液：取SLPZ31对照品1.175mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀后从该量瓶中精密移取0.8ml置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

SLPZ32定位溶液：取SLPZ32对照品1.175mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀后从该量瓶中精密移取0.8ml置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

中间体1定位溶液：取中间体1对照品1.25mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀后从该量瓶中精密移取1.6ml置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

中间体3定位溶液：取中间体3对照品1.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀后从该量瓶中精密移取2ml置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

5-氯-2,3-二苯基吡嗪定位溶液：取5-氯-2,3-二苯基吡嗪对照品1.25mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀后从该量瓶中精密移取1.6ml 置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

咪唑定位溶液：取咪唑对照品1.25mg，精密称定，置10ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀后从该量瓶中精密移取1.6ml置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)定位溶液：取1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)对照品50mg，精密称定，置50ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀后从该量瓶中精密移取0.5ml置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。

供试品加标溶液：取司来帕格约200mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入2ml 乙腈，60℃水浴加热至溶解，精密加入对照品储备液1.0ml，再加入流动相A，边加边振摇并稀释至刻度，摇匀后静置2h，将溶液转移至离心管中，每分钟5000转离心10分钟，取上清液同法再次离心，取上清液。

精密量取各定位溶液、对照品溶液、供试品溶液、供试品加标溶液各进样1 针，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1和表4。

表4：专属性考察结果

结果表明空白溶液无干扰，各已知杂质不干扰溴乙酸的测定。供试品加标溶液色谱图中，溴乙酸的保留时间与对照品溶液中溴乙酸的保留时间一致，溴乙酸峰与相邻峰最小分离度为8.035，不小于1.5，专属性符合要求。

耐用性试验

分别取上述对照品溶液和供试品加标溶液各80μl，按下表所述条件进行测定，记录色谱图。按外标法计算溴乙酸加标回收率。考察色谱条件有微小的变动时，对测定结果的影响。

表5：司来帕格中溴乙酸含量方法耐用性条件

考察结果如下：

表6：耐用性试验(微调柱温、流速、流动相pH)结果

表7：测定方法耐用性RSD结果

通过微调方法中的柱温、流速、流动相pH考察方法的耐用性，不同耐用性试验条件下的供试品加标溶液中，溴乙酸与相邻峰最小分离度为12.278，不小于1.5，溴乙酸加标回收率的RSD最大为2.7％，不大于30.0％；通过更换色谱柱考察方法的耐用性，溴乙酸与相邻峰最小分离度为12.667，不小于1.5，使用不同色谱柱测得供试品加标溶液中溴乙酸加标回收率的比值为106％。以上结果表明方法耐用性良好。

线性关系试验

在相当于定量限浓度～溴乙酸限度浓度的200％范围内取5个浓度点进行溴乙酸的线性和范围研究。

精密量取各线性溶液80μl分别进样1针，注入液相色谱仪，以测得的各峰面积对进样浓度(μg/ml)进行线性回归。结果表明，溴乙酸峰面积在0.3828μg/ml～ 19.1400μg/ml范围内呈良好的线性关系。相关系数r＝1.0000，不小于0.999；截距偏差＝1％，不大于20％。

定量限试验

将已知浓度的对照品储备液稀释至低浓度的溶液，依上述测定方法检测，取 80μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以各峰响应信号为噪声10倍作为定量的信号 (S/N≈10)，计算定量限，结果见下表。

表8：定量限试验测定结果

精密度考察

(1)重复性试验

因供试品中无溴乙酸检出，因此采用向供试品溶液中加入已知溴乙酸的方法考察方法重复性。取本品约200mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入2ml乙腈， 60℃水浴加热至溶解，精密加入对照品储备液1.0ml，再加入流动相A，边加边振摇并稀释至刻度，摇匀后静置2h，将溶液转移至离心管中，每分钟5000转离心 10分钟，取上清液同法再次离心，取上清液。分别精密量取80μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法考察溴乙酸的回收率，结果见下表。

表9：重复性考察结果

结果表明，该方法重复性好。

(2)中间精密度试验

考察随机变动因素对精密度的影响，由另一名分析员在不同日期使用不同仪器进行测定，重新配制6份供试品加标溶液，配制方法同重复性试验，结果见下表。

表10：中间精密度考察结果

结论：综合重复性试验与中间精密度试验共12次测定结果，结果表明该方法精密度良好。

准确度试验

取溴乙酸对照品约23.5mg，精密称定，置250ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀即得对照品储备液。精密移取对照品储备液1.0ml置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得对照品溶液。取本品约200mg，精密称定，共9份，分别置10ml量瓶中，加入2ml乙腈，60℃水浴加热至溶解，按低(80％)、中(100％)、高(120％)三种浓度分别精密加入对照品储备液0.8ml、1ml和1.2ml，再加入流动相A，边加边振摇并稀释至刻度，摇匀后静置2h，将溶液转移至离心管中，每分钟5000转离心10分钟，取上清液同法再次离心，取上清液。精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各80μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算回收率，要求回收率在85％～110％之间，结果见表10。

表11：溴乙酸回收率试验结果

结果表明，3个浓度水平(80％、100％、120％)加标供试品溶液中溴乙酸回收率在99.3％～101.7％之间，该方法回收率较好，准确度高。

Claims (7)

1.一种高效液相色谱分析司来帕格中溴乙酸杂质的方法，其特征在于包括如下检测条件：

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；

流动相：以pH值2.1-2.3的磷酸-磷酸钠缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B；采用紫外检测器检测，检测波长为190-250nm；柱温38～42℃；采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下表所列：

。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，供试品溶液的制备为：取司来帕格200mg，置10ml量瓶中，加入2ml乙腈，不超过65℃水浴加热至溶解，再加入流动相A，边加边振摇并稀释至刻度，摇匀后静置，离心，取上清液再次离心，取上清液即得。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，对照品溶液的制备包括：取溴乙酸对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每lml中含9-10μg的溶液，所述溶剂为乙腈与流动相A按体积比20︰80的混合液。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流速为0.9～1.1ml/min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Kromasil100-5C18，4.6mm×250mm，5μm。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测波长为205nm。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流速为1.0ml/min，柱温40℃，缓冲液pH值为2.2。