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CN114854698B - 一种复制滴度提高的o型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种复制滴度提高的o型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用 Download PDF

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CN114854698B CN202210682771.8A CN202210682771A CN114854698B CN 114854698 B CN114854698 B CN 114854698B CN 202210682771 A CN202210682771 A CN 202210682771A CN 114854698 B CN114854698 B CN 114854698B
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Abstract

本发明提供了一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用，属于生物制品技术领域。本发明通过口蹄疫病毒的反向遗传操作技术，在嵌合口蹄疫病毒O/XJ/CHA/2017株主要免疫基因重组病毒骨架上，进一步用口蹄疫病毒O/NXYCh/CHA/2018株的G‑H环基因替换其对应基因，构建的重组病毒rHN/XJ/NXGH引起100％致感染细胞病变的时间显著缩短到12h，感染细胞12h的复制滴度提高了5倍以上。重组病毒连续传代，遗传稳定性良好，且G‑H环的替换没有影响疫苗的免疫原性。因此，本发明提供的重组口蹄疫病毒株rHN/XJ/NXGH有潜力作为疫苗候选株，用于我国O型口蹄疫的有效防控。

Description

一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus，FMDV)引起猪、牛和羊等70多种偶蹄动物感染的一种烈性传染病。该病传播迅速、传染性极强、发病率极高，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报动物疫病。FMD的暴发和流行，严重危害家畜的生产力和畜产品质量，影响家畜及其产品的国际贸易，给发病地区的畜牧养殖业造成巨大的经济损失。因此，有效预防和控制FMD对于全球畜牧业持续、健康发展具有重要的战略意义。
灭活疫苗的免疫接种是预防控制口蹄疫的重要手段。虽然灭活疫苗在FMD的预防、控制和净化中发挥了非常重要的作用，但FMDV血清型多，基因和抗原高度易变，使FMD难以防控。
近年来，O型FMDV依然是危害我国畜牧养殖业最严重的血清型。分析引发疫情FMDV的遗传关系，发现近几年流行的O型FMDV主要为三个拓扑型(中东-南亚(ME-SA)、东南亚(SEA)和古典中国(Cathay))中的四个谱系病毒株，分别为Mya-98谱系(SEA)、Cathay谱系、PanAsia谱系(ME-SA)和Ind-2001谱系(ME-SA)。我国当前这种O型FMDV多拓扑型并存，多谱系病毒株共同流行的复杂局面加剧了口蹄疫病毒的变异，导致新变异毒株不断出现，频繁引发疫情，迫切需要筛选免疫原性优良、与当前所有O型流行毒株高度匹配的疫苗候选株，用于我国当前FMD的有效防控。
FMDV疫苗株选择的关键决定因素：病毒在易感细胞上复制性能好、收毒时间短、免疫原性优良和抗原谱广。最近的研究表明，当前流行的O/ME-SA/Ind-2001谱系的FMDV(O/SKR/Boeun/2017和O/XJ/CHA/2017)与O型其他谱系(O/PanAsia，O/Mya-98和O/Cathay)病毒抗原匹配性好，免疫原性优良，适合做FMD疫苗株，用于当前FMD的有效防控。但我国分离的O/XJ/CHA/2017毒株(甚至国内流行的同谱系其他毒株)在BHK-21易感细胞上复制滴度较低(TCID50约105.2左右)，收毒时间太长(40h以上)，不适合FMD疫苗的规模化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复制滴度提高的O型FMDV株及其构建方法，构建得到的重组FMDV收毒时间显著缩短到12h，在感染易感细胞12h的复制滴度提高了5倍(107.5PFU/mL)以上，达到FMD疫苗规模化生产的要求。
本发明提供了一种复制滴度提高的O型FMDV，以重组FMDV rHN/XJ为骨架，嵌合了O/NXYCh/CHA/2018毒株的G-H环抗原表位基因所得；
所述重组FMDVrHN/XJ是以FMD疫苗毒株O/HN/CHA/93为骨架，嵌合O/XJ/CHA/2017流行毒株的L+P1基因所得。
优选的，所述O/NXYCh/CHA/2018毒株的G-H环抗原表位基因的核苷酸序列如SEQID NO：4。
优选的，O/XJ/CHA/2017毒株的L+P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2。
本发明提供了所述复制滴度提高的O型FMDV株的构建方法，包括以下步骤：
1)以FMD疫苗毒株O/HN/CHA/93半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含FMDV O/XJ/CHA/2017株L+P1基因的重组载体，得到pSK-Z123XJLP1重组质粒；
2)以步骤1)中所述pSK-Z123XJLP1重组质粒为骨架，嵌合入FMDV O/NXYCh/CHA/2018株的G-H环基因，得到pSK-Z123XJLP1/NXGH；
3)用SpeⅠ和BglⅡ消化步骤2)中所述pSK-Z123XJLP1/NXGH，得到酶切片段；
4)将所述酶切片段克隆至pOFS质粒中，得到PQSE；
5)将步骤4)中所述PQSE转染细胞，拯救病毒，得到rHN/XJ/NXGH。优选的，步骤3)所述SpeⅠ和BglⅡ消化的体系：10×Buffer H 10μL、BglⅡ4μL、SpeⅠ4μL、重组质粒4μg，ddH2O补充至100μL；
酶切体系为在37℃条件下孵育1h～2h。
优选的，步骤4)所述pOFS质粒的克隆位点为SpeⅠ/BglⅡ。
优选的，步骤4)所述克隆后，还包括对PQSE进行鉴定；
所述鉴定的方法为采用Pst I酶对所述重组质粒PQSE进行酶切，酶切出838bp，4250bp和6050bp三个条带，初步说明重组质粒PQSE大小正确，然后对酶切鉴定正确的重组质粒PQSE进行测序分析，结果表明重组质粒PQSE是在嵌合有FMDV O/XJ/CHA/2017毒株L+P1基因的骨架上，替换了FMDV O/NXYCh/CHA/2018株G-H环基因。
本发明提供了所述复制滴度提高的O型口FMDV株或所述构建方法得到的O型FMDV株在制备防控FMD疫苗中的应用。
本发明提供了一种防控FMD的疫苗，包括佐剂和所述复制滴度提高的O型FMDV株或所述构建方法得到的O型FMDV株。
本发明提供了一种复制滴度提高的O型FMDV株，以重组FMDV rHN/XJ为骨架，嵌合了O/NXYCh/CHA/2018流行毒株的G-H环抗原表位基因所得；其中所述重组FMDV rHN/XJ是以FMD疫苗毒株O/HN/CHA/93为骨架，嵌合O/XJ/CHA/2017流行毒株的L+P1基因所得。本发明在FMD疫苗毒株O/HN/CHA/93的基础上替换了嵌合有O/NXYCh/CHA/2018毒株G-H环的O/XJ/CHA/2017毒株的L+P1基因，结果表明，所得重组病毒株rHN/XJ/NXGH连续传至10代，G-H环氨基酸未发生任何突变，说明重组病毒具有良好的遗传稳定性；生长曲线结果表明，插入的G-H环氨基酸序列的不同，对FMDV复制水平的影响也不同，相比亲本病毒rHN/XJ，插入FMD流行毒株O/NXYCh/CHA/2018的重组病毒感染细胞后4h～20h内均显著提高了重组FMDV的复制滴度，而替换疫苗毒株O1/Manisa/TUR/69的G-H环，不能明显提高重组FMDV在不同感染时间病毒的复制滴度。同时所述重组病毒株经灭活与佐剂混合免疫动物后，重组病毒株和亲本病毒一样具有良好的免疫原性，说明G-H环的替换不会影响病毒的抗原性。可见，本发明提供的O型FMDV株不仅显著缩短致100％细胞病变的时间，具有高的复制滴度，而且保留原有毒株的免疫原性，为大规模生产FMD疫苗提供了理想的毒株材料。
附图说明
图1为重组质粒的构建示意图；注：深灰色部分表示FMDV O/XJ/CHA/2017株的L+P1基因，浅灰表示G-H的位置；
图2为重组质粒PstI酶切鉴定图，M:DNA标准marker；1:PQSA质粒用pstI酶切；2:PQSE质粒用pstI酶切；3:PQTM质粒用pstI酶切；
图3为三个全长重组质粒G-H环基因编码氨基酸的比对图；
图4为重组质粒转染60h后的BSR/T7细胞，A:正常BSR/T7细胞；B、C和D分别为质粒pQSA、PQTM和pQSE转染60h后的BSR/T7细胞)；
图5为间接免疫荧光结果；
图6为重组FMDV的电镜观察，其中A:rHN/XJ；B:rHN/XJ/NXGH；C:rHN/XJ/MSGH；
图7为本发明制备的4种重组FMDV的一步生长曲线结果。
具体实施方式
本发明提供了一种复制滴度提高的O型FMDV株，以重组FMDV rHN/XJ为骨架，嵌合了O/NXYCh/CHA/2018流行毒株的G-H环抗原表位基因所得；
所述重组FMDVrHN/XJ是以FMD疫苗毒株O/HN/CHA/93为骨架，嵌合了O/XJ/CHA/2017流行毒株的L+P1基因所得。
在本发明中，FMDV O/XJ/CHA/2017毒株的L+P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2。所述FMDV O/NXYCh/CHA/2018的G-H环抗原表位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4。本发明实验表明，含不同氨基酸组成的G-H环能够直接影响FMDV致100％细胞病变能力和毒株的复制能力，O/NXYCh/CHA/2018毒株来源的G-H环有利于提高重组FMDV的复制能力，而O1/Manisa/TUR/69来源的G-H环对重组FMDV的复制能力没有显著的提升。
本发明提供了所述复制滴度提高的O型FMDV株的构建方法，包括以下步骤：
1)以FMD疫苗毒株O/HN/CHA/93半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含FMDVO/XJ/CHA/2017的L+P1基因的重组载体，得到pSK-Z123XJLP1重组质粒；
2)以步骤1)中所述pSK-Z123XJLP1重组质粒为骨架，嵌合入FMDV O/NXYCh/CHA/2018毒株的G-H环基因，得到pSK-Z123XJLP1/NXGH；
3)用SpeⅠ和BglⅡ消化步骤2)中所述pSK-Z123XJLP1/NXGH，得到酶切片段；
4)将所述酶切片段克隆至pOFS质粒中，得到PQSE；
5)将步骤4)中所述PQSE转染细胞，拯救病毒，得到rHN/XJ/NXGH。
本发明以FMD疫苗毒株O/HN/CHA/93的半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含FMDVO/XJ/CHA/2017的L+P1基因的重组载体，得到pSK-Z123XJLP1重组质粒。
在本发明中，所述O/HN/CHA/93毒株半长质粒pSK-Z123在现有技术中报道，具体参见现有技术1(Evaluation of a genetically modified foot-and-mouth disease virusvaccine candidate generated by reverse genetics,Li et al.BMC VeterinaryResearch 2012,8:57))。本发明对人工合成重组载体的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的人工合成方法即可。在本发明实施例中，人工合成重组载体委托金唯志生物技术有限公司完成。
得到pSK-Z123XJLP1重组质粒后，本发明以所述pSK-Z123XJLP1重组质粒为骨架，嵌合入O/NXYCh/CHA/2018毒株的G-H环基因，得到pSK-Z123XJLP1/NXGH。
在本发明中，所述O/NXYCh/CHA/2018毒株属于Mya-98谱系，具体可参见GenBankMH791315.1登录号。所述G-H环基因优选位于VP1的第130～160位氨基酸。本发明对人工合成重组载体的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的人工合成方法即可。在本发明实施例中，人工合成重组载体委托金唯志生物技术有限公司完成。
得到pSK-Z123XJLP1/NXGH后，本发明用SpeⅠ和BglⅡ消化所述pSK-Z123XJLP1/NXGH，得到酶切片段。
在本发明中，所述SpeⅠ和BglⅡ消化的体系优选如下：10×Buffer H 10μL、BglⅡ4μL、SpeⅠ4μL、重组质粒4μg，ddH2O补充至100μL。酶切体系为在37℃条件下孵育1h～2h。所述酶切后，将酶切产物进行电泳，回收5400bp的条带为酶切片段。
得到酶切片段后，本发明将所述酶切片段克隆至pOFS质粒中，得到PQSE。
在本发明中，所述克隆的方法优选利用限制性内切酶酶切pOFS质粒，将酶切片段和线性质粒进行连接，得到PQSE。所述pOFS质粒在现有技术中报道，具体可参见现有技术1(Evaluation of a genetically modified foot-and-mouth disease virus vaccinecandidate generated by reverse genetics,Li et al.BMC Veterinary Research2012,8:57)。所述pOFS质粒的克隆位点为SpeⅠ/BglⅡ。
在本发明中，所述克隆后，优选还包括对PQSE进行鉴定。所述鉴定的方法为采用Pst I酶对所述重组质粒PQSE进行酶切，酶切出838bp，4250bp和6050bp三个条带，初步说明重组质粒PQSE大小正确，然后对酶切鉴定正确的重组质粒PQSE进行测序分析，结果表明重组质粒PQSE是在嵌合有FMD O/XJ/CHA/2017毒株L+P1基因的骨架上，替换了O/NXYCh/CHA/2018毒株G-H环基因。
本发明提供了所述复制滴度提高的O型FMDV株或所述构建方法得到的O型FMDV株在制备防控FMD的疫苗中的应用。
本发明提供了一种防控FMD的疫苗，包括佐剂和所述复制滴度提高的O型FMDV株或所述构建方法得到的O型FMDV株。
在本发明中，所述疫苗优选为灭活疫苗。所述佐剂优选为ISA201油佐剂。所述O型FMDV株和佐剂的体积比优选为46:54。所述O型FMDV株的抗原浓度优选为6μg/mL。本发明对所述抗原广谱O型FMD疫苗的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的疫苗制备方法即可。
在本发明中，所述疫苗的免疫方法优选如下：猪耳根肌肉注射，剂量为2mL/头。对免疫28天后的猪进行采血，收集血清，用O型口蹄疫病毒液相阻断ELISA(LPB-ELISA)试剂盒(中国农业科学院兰州兽医研究所)检测免疫血清的抗体效价，结果显示，rHN/XJ/NXGH和rHN/XJ两个FMD疫苗免疫的猪在14、21和28天后平均LPB-ELISA抗体效价基本相似，且免疫28天后两个疫苗均诱导机体产生的液相抗体大于1:128，说明G-H环替换的重组病毒和亲本病毒一样具有良好的免疫原性，G-H环的替换没有影响病毒的抗原性。
下面结合实施例对本发明提供的一种复制滴度提高的O型FMDV株及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
FMD疫苗毒株O/HN/CHA/93在现有技术1(Evaluation of a geneticallymodified foot-and-mouth disease virus vaccine candidate generated by reversegenetics，Li et al.BMC Veterinary Research 2012，8:57)中公开，FMDV O/XJ/CHA/2017(MF461724.1)、O/NXYCh/CHA/2018(MH791315.1)和疫苗毒株O1/Manisa/TUR/69(泛亚谱系，GenBank KY825719.1)在Genebank中公开。rHN是FMDV疫苗毒株O/HN/CHA/93的全长感染性克隆pOFS拯救获得的基因工程病毒(Evaluation ofa genetically modified foot-and-mouth disease virus vaccine candidate generated by reverse genetics,Li etal.BMC Veterinary Research,2012,8:57)为本发明的亲本病毒。
实施例1
1、含FMD流行毒株O/XJ/CHA/2017L+P1基因全长克隆的构建方法
以FMD疫苗毒株O/HN/CHA/93半长质粒pSK-Z123为骨架，根据Genebank中公布的O/XJ/CHA/2017流行毒株(Ind-2001谱系，GenBank MF461724.1)的L和P1核苷酸序列(SEQ IDNO:2)，设计合成含该病毒L+P1基因的重组半长质粒pSK-Z123XJLP1(金唯志生物技术有限公司合成)。该质粒用SpeⅠ和BglⅡ限制性内切酶消化后分别回收约5400bp的目的片段，并将其插入用同样酶消化的pOFS质粒中，得到嵌合O/XJ/CHA/2017病毒L+P1基因的全长质粒PQSA(见图1)。其中，质粒PQSA的L+P1基因核苷酸序列见SEQ ID NO:2，G-H环核苷酸序列见SEQ ID NO:3，G-H环氨基酸序列见SEQ ID NO:6。该质粒用Pst I进行酶切鉴定，结果切出838bp，4250bp和6050bp的目的条带，与预期大小相符(见图2)。将酶切鉴定正确的重组质粒送金唯智生物技术有限公司进行序列测定，结果表明构建的重组质粒含预期的替换。
2、含不同G-H环基因的FMDV重组全长克隆的构建方法
以上述合成的pSK-Z123XJLP1质粒为骨架，根据Genebank中公布的我国流行的FMDO/NXYCh/CHA/2018毒株(Mya-98谱系)以及国际上广泛使用的疫苗毒株O1/Manisa/TUR/69(泛亚谱系)的G-H环基因(VP1的第130～160位氨基酸)，设计合成含这2个病毒G-H环基因替换的质粒pSK-Z123XJLP1/NXGH和pSK-Z123XJLP1/MSGH(金唯志生物技术有限公司合成)。合成的2个质粒分别用SpeⅠ和BglⅡ限制性内切酶消化后分别回收约5400bp的目的片段，并将其插入用同样酶消化的pOFS质粒中，依次得到2个G-H环替换的重组全长质粒PQSE和PQTM(见图1)。其中，pQSE和PQTM是在pQSA的基础上嵌合了不同毒株来源的G-H环，pQSE中G-H环核苷酸序列见SEQ ID NO：4，G-H环氨基酸序列见SEQ ID NO：7；pQTM中G-H环核苷酸序列见SEQ ID NO：5，G-H环氨基酸序列见SEQ ID NO：8。2个重组质粒用Pst I进行酶切鉴定，结果切出与预期大小相符的目的条带(838bp，4250bp和6050bp)(见图2)。将酶切鉴定正确的重组质粒送金唯智生物技术有限公司进行序列测定。
结果表明构建的重组质粒含预期的替换。3个重组全长质粒G-H环基因编码的氨基酸比对见图3。
实施例2
重组病毒的拯救
QIAGEN Plasmid Midi Kits制备质粒pQSA、pQSE和PQTM，Not I线化后用DNA片段回收试剂盒纯化回收作为转染模板。常规培养的单层BSR/T7细胞生长至70％～80％时用脂质体LipofectamineTM2000介导转染(具体操作方法见操作说明)。转染后5h加入2mL含8％胎牛血清的DMEM培养基，置37℃5％CO2培养箱继续培养，并观察细胞出现致细胞病变的情况。
结果表明：3个质粒在转染BSR/T7细胞60h后均出现典型的致细胞病变(cytopathogenic effect，CPE)，即纤维状分布的细胞变大、变圆(图4)。转染72h后收获细胞，反复冻融3次后，在BHK-21上连续传代，-70保存各代病毒备用。拯救的基因工程病毒分别命名为rHN/XJ、rHN/XJ/NXGH和rHN/XJ/MSGH。
实施例3
重组病毒的鉴定
1、RT-PCR鉴定
取转染的上清分别用RNAasyMini Kit提取细胞毒总RNA，用表中引物OZ1490(+)/OZ3980(-)引物对(OZ1490(+)：gacaagaccacgccgtatt(SEQ ID NO：9)，OZ3980(-)：tgcatctggttgatggtgtc(SEQ ID NO：10))RT-PCR分别扩增转染上清的P1基因片段，纯化回收后送上海桑尼有限公司测序，验证重组病毒的正确性。
测序结果表明：rHN/XJ、rHN/XJ/NXGH和rHN/XJ/MSGH重组FMDV均含有预期的替换，说明本发明成功构建了含靶标基因替换的重组FMDV。
2、间接免疫荧光
BHK-21单层细胞生长至70％～80％满时，分别接种rHN/XJ、rHN/XJ/NXGH和rHN/XJ/MSGH重组病毒。接种病毒6h后用间接免疫荧光检测3A蛋白的表达。具体步骤为：(1)接种病毒的细胞弃培养液，PBS(0.01mol/L pH值7.2)漂洗3次，后加入4％冰冷的多聚甲醛，室温固定30min；(2)PBS漂洗3次，加入5％BSA室温封闭30min；(3)PBS漂洗3次后分别加入1:500稀释的抗FMDV非结构蛋白3A的单抗3A24，37℃孵育1h；(4)PBS漂洗5次，加入1:100稀释的FITC标记的IgG二抗，37℃孵育1h；(5)PBS漂洗5次，加入0.5μg/ml DAPI染色10min，PBS洗5次，去除多余的DAPI，置共聚焦荧光显微镜下拍照，同时设正常细胞对照。
结果表明：接种rHN/XJ、rHN/XJ/NXGH和rHN/XJ/MSGH的BHK-21细胞均能与3A单抗作用，出现特异的绿色荧光，而对照细胞与3A单抗作用均看不到任何可见荧光(见图5)，表明本发明成功构建了3个重组FMDV，L+P1或G-H环基因的替换没有影响感染性重组FMDV的拯救。
3、电镜观察
BHK-21细胞中分别增殖FMDV rHN/XJ、rHN/XJ/NXGH和rHN/XJ/MSGH各100mL，冻融2～3次后，加BEI灭活，12000rpm/min离心1h，收集病毒上清，4℃条件下35000rpm/min离心3h。离心的沉淀用PBS(pH＝7.6)缓冲液重悬，负染后电镜观察。电镜观察结果显示：4个重组病毒形态一样，直径约为25nm、球形的病毒粒子，与FMDV的形态完全一致(图6)。
实施例4
重组病毒的生长特性
1.拯救病毒的遗传稳定性分析
将实施例3制备的3个转染上清按10％接种量接种长满BHK-21细胞的T25细胞瓶，待接种转染上清的细胞100％出现典型CPE时收获细胞，反复冻融3次后继续用相同条件连续传代，观察第5代后每个病毒接种细胞100％细胞出现典型CPE的时间，并对第5和10代病毒进行RT-PCR，检测拯救病毒G-H环氨基酸的变化情况。连续传代的结果标明：拯救的3个重组病毒连续传至第5代后，出现典型CPE的时间趋于稳定，亲本病毒rHN/XJ感染细胞后100％细胞出现CPE的时间约为48h，rHN/XJ/NXGH病毒感染细胞后100％细胞出现CPE的时间约为12h，而rHN/XJ/MSGH病毒感染细胞后100％细胞出现CPE的时间与亲本病毒一样约为48h，表明FMDV O/NXYCh/CHA/2018G-H的替换显著缩短了重组FMDV致100％细胞出现CPE的时间。重组病毒第5代后100％细胞出现CPE的时间见表1。rHN/XJ/NXGH重组病毒第5和10代G-H基因的序列测定结果表明，重组病毒传至10代，G-H环未发生任何变化。
表1重组病毒第5代以后100％细胞出现典型CPE的时间(h)
病毒 P5代 P6代 P7代 P8代 P9代 P10代
rHN/XJ 48h 48h 48h 48h 48h 48h
rHN/XJ/NXGH 12h 12h 12h 12h 12h 12h
rHN/XJ/MSGH 48h 48h 48h 48h 48h 48h
2重组病毒的一步生长曲线
将第7代rHN/XJ、rHN/XJ/NXGH和rHN/XJ/MSGH病毒分别做10系列稀释，然后将不同稀释度病毒分别接种长满的单层BHK-21细胞(200μl/孔，6孔板)，置于37℃培养箱，每10min摇动一次，1h后加入2mL黄芪胶混合液(一份2×MEM，一份1.2％黄芪胶，1％血清)静止培养，48h后吸弃培养液，用PBS洗涤1～2次后，加入固定液(50％丙酮+50％甲醇)室温固定30min后结晶紫染色1h，清水冲洗后计算每个病毒的噬斑形成单位(PFU/ml)。将第7代重组病毒以1×106PFU/ml病毒感染量接种长满的单层BHK-21细胞(25mL培养瓶)，吸附1h后弃接种的病毒液，用MEM洗2次后，加5ml MEM培养基置于37℃培养箱继续培养。接种后4h、8h、12h、16h和20h收取样品，反复冻融3次后在BHK-21单层细胞上(6孔板)按照上述方法测定病毒的滴度(PFU/mL)(实验进行2次重复)，绘制病毒的一步生长曲线。
结果表明：和亲本病毒rHN/XJ相比，插入FMD流行毒株O/NXYCh/CHA/2018G-H环的重组病毒感染细胞后4h-20h内均显著提高了重组FMDV的复制滴度，而替换疫苗毒株O1/Manisa/TUR/69的G-H环，不能提高重组FMDV在不同感染时间病毒的复制滴度(见图7)。这说明插入G-H环氨基酸的不同，对FMDV复制水平的影响也不同。
实施例5
FMDV灭活疫苗的制备方法
1、FMDV的增殖，灭活和纯化
重组病毒rHN/XJ/NXGH和亲本病毒rHN/XJ作为对照分别接种100％长满的单层贴壁BHK-21细胞(175mL细胞瓶，27ml接毒液+3ml病毒液)，37℃温箱继续培养，待100％细胞出现典型CPE时，分别收获病毒，每个病毒收获约500mL。收集的病毒液反复冻融3次后，4℃6000rpm/min离心1h，去除细胞碎片。收集的病毒上清用1％～1.2％BEI 30℃灭活28h。灭活后的病毒抗原用乳鼠和细胞盲传4代，进行灭活抗原的安全检验。检验合格后，蔗糖密度梯度离心法纯化病毒粒子，用液相色谱仪测定病毒抗原的146S含量。用pH 7.6的PBS溶液稀释抗原浓度为12μg/mL。
2、疫苗配制
将ISA201佐剂置于37℃恒温水浴锅预热，按抗原:佐剂体积比＝46:54的比例将适量的佐剂缓慢加入病毒抗原中，缓慢摇振，直至抗原和佐剂不分层，将配好的疫苗制品(146S抗原浓度为6μg/mL)置于4～8℃保存备用。
实施例6
不同重组病毒株的免疫动物实验
选取90日龄健康易感猪10头(O型口蹄疫液相阻断ELISA抗体效价＜1:6，3ABC抗体阴性)，分为A和B 2组，每组5头。A组免疫接种亲本病毒rHN/XJ疫苗，B组免疫接种rHN/XJ/NXGH病毒疫苗。耳根肌肉注射，剂量为2mL/头。所有猪免疫14、21和28天采血，收集血清，用O型口蹄疫病毒液相阻断ELISA(LPB-ELISA)试剂盒(中国农业科学院兰州兽医研究所)检测免疫血清的抗体效价，具体步骤如下：
①在U型反应板上，用PBST倍比稀释待检血清，50μL/孔；在第11列稀释阳性对照血清，从1:2稀释至1:256；同时设置阴性对照血清，从1:2稀释至1:4；设置4孔全病毒对照。
②将病毒抗原用PBST稀释至工作浓度，以50μL/孔的量加至各孔，封板，振荡37℃温育1.5h。
③将抗原抗体混合物从U型反应板上按次序转移至已包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上，50μL/孔，封板，振荡37℃温育1h。
④用PBST洗板5次，拍干，按50μL/孔加入口蹄疫O型豚鼠抗体工作液(红色)，封板，振荡37℃温育30min。
⑤同上洗板5次，拍干，按50μL/孔加兔抗豚鼠IgG-HRP工作液(蓝色)，封板，振荡37℃温育30min。
⑥同上洗板5次，拍干。将TMB底物A溶液和B溶液以1:1比例混匀，加入混匀后底物溶液50μL/孔，置37℃显示15min。
⑦显示反应结束后，加入终止液50μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值。
⑧抗体效价判定：病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低OD450nm值，计算剩余2孔的平均OD450nm值，再除以2，即为临界值，表示阻断50％反应的对照OD450nm值。检测孔OD450nm值大于临界值为阴性孔，小于为阳性孔。若临界值与稀释倍数最高阳性孔的OD450nm值相同，则以被检样本阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于两个稀释孔OD450nm值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。其中免疫28天后测定的抗体效价大于1:128，免疫动物基本均可获得保护。
结果表明：rHN/XJ/NXGH和rHN/XJ两个病毒疫苗免疫的猪在14、21和28天后平均LPB-ELISA抗体效价基本相近，且免疫28天后两个疫苗诱导产生的液相抗体均大于1:128，说明含FMDV O/NXYCh/CHA/2018G-H环基因的重组病毒和亲本病毒一样具有良好的免疫原性，G-H环的替换没有影响病毒的抗原性(见表2)。
表2 FMDV疫苗免疫猪LPB-ELISA抗体效价
由上述实施例结果可知，在亲本病毒rHN/XJ的骨架上替换FMDV O/NXYCh/CHA/2018的G-H环基因，使100％细胞出现典型CPE的时间显著缩短到12h，病毒感染细胞12h后的复制滴度提高了5倍以上，但替换O1/Manisa/TUR/69的G-H环基因，不能缩短100％细胞出现典型CPE的时间，也不能显著提高重组FMDV的复制滴度。动物实验也表明：重组病毒rHN/XJ/NXGH和亲本病毒一样有良好的免疫原性，O/NXYCh/CHA/2018病毒G-H环基因的替换没有影响重组病毒的抗原性。
综上所述，O/NXYCh/CHA/2018病毒G-H环基因的替换，大大缩短了重组病毒rHN/XJ/NXGH感染100％细胞出现典型CPE的时间，显著提高了该病毒的复制滴度，而且病毒维持了亲本病毒的免疫原性，因此认为重组病毒rHN/XJ/NXGH有潜力做FMD疫苗候选株，用于我国O型FMD的有效防控。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2811
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaacacga ctgactgttt tatcgctctg ttacacgttc tcagggagat taaagcactg 60
tttctgtcac gaacacaagg gaaaatggaa ttcacacttc acaacggtga aaagaaggtc 120
ttctacgcca gacccaacaa ccacgacaat tgctggttga acgccatcct ccaactgttc 180
aggtacgtcg acgaaccctt cttcgactgg gtctacgact cacctgagaa ccttactctt 240
gaggcgatca ggcgactcga agaaattact ggtcttgagc tacacgaggg tggaccaccc 300
gcccttgtcg tctggaacat taagcacttg ctctgcaccg gaatcggcac cgcttcgcgg 360
cctagcgagg tgtgtatggt ggacggtaca gacatgtgct tggccgactt ccacgctggt 420
atctttctga agggacaaga ccacgccgta ttcgcctgtg tcacctccga cgggtggtac 480
gcgattgacg acgaggattt ttacccgtgg acaccagacc cggctgacgt tttggttttt 540
gttccgtacg atcaagaacc acttaatgga gaatggaaag caaaggtcca gaagcggctt 600
aagggcgccg ggcaatccag cccgacgacc gggtcacaga accaatcagg caacactgga 660
agcatcatta acaactacta catgcagcaa taccagaact ccatggacac acagcttggt 720
gacaacgcca ttagcggagg ctccaacgag ggttctacgg ataccacctc cacccacacg 780
aacaacaccc agaacaacga ctggttttca aaactggcca actccgctct cagcggtctc 840
ttcggtgctc ttctcgccga caaaaagaca gaggaaacta ccctcctcga ggaccgcatt 900
ctcaccaccc gcaacggaca cacgacctcg acaacccagt cgagcgtcgg ggtgacgtac 960
gggtatgcaa cagctgagga cttcgtgagc gggcccaaca cctctggtct tgagaccagg 1020
gttgtccagg ccgaacggtt cttcaaaacc cacttgttcg actgggtcac cagtgacccg 1080
tttggacggt gccacatgtt ggagctcccg actgaccaca aaggcgtcta cggcagccta 1140
accgactcgt acgcgtatat gaggaacggt tgggacgttg aagtcaccgc ggtgggaaac 1200
cagttcaacg gaggctgctt gttggtggca atggtaccag agctttgttc catcaacaag 1260
agagagctgt accagctcac acttttcccc caccagttca ttaacccacg gacgaacatg 1320
acggcacaca tcactgtgcc ctacgttggc gtcaacaggt acgaccaata caaggtgcat 1380
aaaccctgga cccttgttgt catggtcgtg gcccccttga cggtcaacaa tgagggtgct 1440
ccgcaaatca aggtgtatgc caacatcgcc cccaccaacg tttacgttgc gggtgaattc 1500
ccttccaagg aggggatctt ccccgtggca tgcagcgacg gttacggcgg tttggtgacc 1560
acggacccaa agacggcgga ccccgtgtac gggaaagtgt tcaacccccc ccgtaacttg 1620
ttgccagggc ggtttacaaa cctccttgat gtggccgagg cgtgtcccac gttcctacac 1680
ttcgaaggtg acgtaccgta cgtgaccacg aagacggact cagacagggt gttggcccaa 1740
ttcgacctgt ctctggcagc aaagcacatg tcgaacactt tcctcgcggg tcttgcccag 1800
tattacacac agtacagcgg caccatcaac ctacacttca tgttcacagg gcccaccgat 1860
gcgaaggcgc gctacatgat tgcgtatgcc cctcctggca tggaaccgcc gaaaacgcct 1920
gaggccgccg cacactgcat tcacgctgag tgggacacag ggctgaattc aaagttcaca 1980
ttttcaattc cctacctttc ggccgctgac tacgcgtaca ccgcgtccga cgtcgccgaa 2040
accacaaacg tgcagggatg ggtctgcttg ttccagataa cacacgggaa agccgacggc 2100
gatgctctga ttgtgctagc tagtgctggc aaagactttg acctacgcct accggttgac 2160
gcccgcacgc agaccacctc tgcgggcgag tccgcggacc ccgttaccgc caccgttgag 2220
aattacggtg gtgagacaca ggtccagaga cgccagcaca cggatatctc gtttatacta 2280
gacagatttg tgaaagtcac accaaaagac caaatcaatg tgctggacct gatgcagatc 2340
cctgcccaca ctttagtagg ggccctcctg cggacggcca cctactactt ctccgacttg 2400
gagttggctg tcaaacacaa gggtgatctc acctgggttc cgaacggggc ccctgagaca 2460
gctttggaca acaccaccaa cccaacagct taccacaaag caccactcac gcgactggcc 2520
ttgccttaca cggccccaca ccgcgtctta gcgaccgtct acaacggaag ttgtaagtac 2580
agtggcgccc gcgtgagcaa cgtgaggggt gaccttcaag tgttggctca gaaggcagaa 2640
agagctctgc ccacctcctt taactatggt gccattaagg caacccgggt gactgagtta 2700
ctctaccgaa tgaagagagc cgagacatac tgccccaggc cccttcttgc cattcaaccg 2760
agtgacgcta gacacaagca gaagatcgtg gcacccgcaa aacagcttct g 2811
<210> 2
<211> 2811
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaatacaa ctgactgttt tattgctctg ctgcacgctc tcagagagat aaaaacactg 60
tttctttcac gaacacaagg aaagatggaa ttcacacttc acaacggtga gaaaaagact 120
ttctattcta ggcccaacaa ccacgacaat tgttggttga acaccatcct ccaattgttt 180
aggtacgtcg atgaaccttt cttcgactgg gtctatgaat cacctgaaaa cctcactctt 240
gaggcgattg ggcaactgga agaactcact ggtcttaagc tgcacgaggg tgggccaccc 300
gctctcgtca tttggaacat caagcatttg ctccacaccg gaattggcac tgcctcgcga 360
cccagcgagg tgtgcatggt cgatggcacg gacatgtgtt tggctgactt ccacgctggc 420
atcttcctga aagggcaaga gcacgctgtg ttcgcctgcg tcacctccaa cgggtggtac 480
gcgatcgacg acgaggactt ctacccctgg acgcctgatc cgtccgacgt tctggtgttt 540
gtcccgtacg atcaagaacc actcaacgga gagtggaaga caaaggttca aaagcgactc 600
aaaggagccg ggcaatccag cccggcaact gggtcgcaga atcagtcagg caacactgga 660
agtattatca acaactacta catgcagcag taccagaact ctatggacac acaacttgga 720
gacaatgcca ccagcggagg atccaatgag gggtccacag acaccacttc cacccacaca 780
accaacacac aaaacaatga ttggttctca aaactggcca gttctgcttt cagcggtctg 840
tttggcgctc ttctcgccga caagaaaacc gaggagacca ctctcctcga ggaccgtatc 900
ctcactaccc gcaacggaca cacgacctcg acaacccagt cgagcgtcgg agttacttac 960
gggtacgcaa cagctgagga ttttgtgagc gggccaaaca catctggtct cgagaccagg 1020
gttgtgcagg cagagcggtt cttcaaaacc catctgttcg actgggtcac cagtgatcca 1080
ttcgggcggt gccacctgct agaacttcca actgaccaca aaggggtcta cggcggcctg 1140
actgactctt atgcttacat gagaaacggt tgggacgttg aggtcactgc agtgggaaac 1200
cagttcaacg gaggttgtct actggtggcc atggtgccag aactttgctc catccagaag 1260
agagagctgt accaacttac gctcttccct catcagttca tcaaccctcg cacgaacatg 1320
acggcgcaca tcactgtgcc ctttgttggc gtcaaccgct acgaccagta caaagtgcac 1380
aagccttgga cccttgtggt catggtcgtg gcccctttga ctgtcaacaa cgaaggtgcc 1440
ccacagatca aggtttacgc caacatcgcc cctaccaacg tccacgttgc gggtgagttc 1500
ccttccaaag aagggatttt ccccgtggcg tgcagcgacg gttacggcgg tctggtgacc 1560
actgacccga agacggctga ccccgcctac gggaaagtgt ttaacccccc tcgcaacatg 1620
ttgcccggcc ggttcaccaa cttccttgat gtggctgagg cgtgtcctac gtttctgcac 1680
tttgaaggtg acgtaccgta cgtgaccacg aagacagatt cggacagggt gctcgctcag 1740
tttgacctgt ctttggcagc aaagcacatg tcaaacacct tcctggcagg tctcgcccag 1800
tactacacac agtacagcgg caccatcaac ctgcacttca tgttcacagg ccccactgac 1860
gcgaaagcgc gttacatgat tgcatatgcc ccgcctggca tggagccgcc taaaacacct 1920
gaggcggctg ctcactgcat tcacgcagag tgggacacag ggctgaactc aaagttcaca 1980
ttttcaatcc cctacctttc ggcggctgat tacgcgtaca ccgcgtctga cgctgccgaa 2040
accacaaatg tgcagggatg ggtgtgcttg ttccaaataa cacacgggaa agccgacggt 2100
gacgcactgg tcattctggc gagcgccggt aaggactttg agttgcgttt gccggttgat 2160
gcccgcacac agaccacctc cacaggtgag tccgctgatc ccgtgaccac caccgttgag 2220
aactacggtg gagagacaca ggtccagaga cgtcaacaca ccgacgtttc tttcattttg 2280
gacagatttg tgaaagtaac accgaaagac caaatcaatg tgttggacct gatgcaaacc 2340
cctgctcaca ctttggtagg cgcgctcctc cgcaccgcca cttactactt cgcagaccta 2400
gaagtggcag tgaagcacga gggcaacctc acctgggtcc cgaacggggc gcccgaggcg 2460
gcgctggaca acaccaccaa cccgacggcc taccacaagg caccgctcac ccgtcttgct 2520
ctgccttaca cagcaccaca ccgtgttctg gctaccgttt acaacgggaa ctgcaagtat 2580
ggcgagggcg ctgtgaccaa cgtgaggggt gacttgcaag tgttggctca gaaggcagca 2640
agaacgctgc ccacctcctt taactacggt gccatcaagg ctacccgggt gactgaactg 2700
ctttaccgca tgaagagggc cgaaacatac tgccctcggc ctctgctggc cattcacccg 2760
gaacaagcca gacacaagca gaagattgtg gcacctgtga aacagttgtt g 2811
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacgggaact gcaagtatgg cgagggcgct gtgaccaacg tgaggggtga cttgcaagtg 60
ttggctcaga aggcagcaag aacgctgccc 90
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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ctggcgccga aggcggcgag gccgctgcct 90
<210> 5
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Gly Ala Val Thr Asn Val Arg Gly
1 5 10 15
Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro
20 25 30
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Thr Gly Gly Pro Leu Pro Asn Val Arg Gly
1 5 10 15
Asp Leu Gln Val Leu Ala Pro Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro
20 25 30
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg Gly
1 5 10 15
Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Ala Leu Pro
20 25 30
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacaagacca cgccgtatt 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgcatctggt tgatggtgtc 20

Claims (7)

1.一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株，其特征在于，以重组口蹄疫病毒rHN/XJ为骨架，嵌合了O/NXYCh/CHA/2018毒株的G-H环抗原表位基因所得；
所述重组口蹄疫病毒rHN/XJ是以口蹄疫疫苗毒株O/HN/CHA/93为骨架，嵌合流行毒株O/XJ/CHA/2017的L+P1基因所得；
所述O/NXYCh/CHA/2018毒株的G-H环抗原表位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4；
O/XJ/CHA/2017毒株的L+P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2。
2.权利要求1所述复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）以O/HN/CHA/93毒株半长质粒pSK-Z123为骨架，人工合成含口蹄疫病毒O/XJ/CHA/2017株L+P1基因的重组载体，得到pSK-Z123XJLP1重组质粒；
2）以步骤1）中所述pSK-Z123XJLP1重组质粒为骨架，嵌合入O/NXYCh/CHA/2018毒株的G-H环基因，得到pSK-Z123XJLP1/NXGH；
3）用SpeⅠ和BglⅡ消化步骤2）中所述pSK-Z123XJLP1/NXGH，得到酶切片段；
4）将所述酶切片段克隆至pOFS质粒中，得到PQSE；
5）将步骤4）中所述PQSE转染细胞，拯救病毒，得到rHN/XJ/NXGH。
3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤3）所述SpeⅠ和BglⅡ消化的体系：10× Buffer H 10 μL、BglⅡ4 μL、Spe Ⅰ4 μL、重组质粒 4 μg，ddH2O补充至100 μL；
酶切体系为在37 ℃条件下孵育1h~2 h。
4.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤4）所述pOFS质粒的克隆位点为SpeⅠ/BglⅡ。
5.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤4）所述克隆后，还包括对PQSE进行鉴定；
所述鉴定的方法为采用Pst I酶对所述重组质粒PQSE进行酶切，酶切出838bp，4250bp和6050bp三个条带，初步说明重组质粒PQSE大小正确，然后对酶切鉴定正确的重组质粒PQSE进行测序分析，结果表明重组质粒PQSE是在嵌合有O/XJ/CHA/2017毒株L+P1基因的骨架上，还嵌合了O/NXYCh/CHA/2018毒株G-H环基因。
6.权利要求1所述复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株或权利要求2~5任意一项所述构建方法得到的O型口蹄疫病毒株在制备防控口蹄疫的疫苗中的应用。
7.一种防控口蹄疫的疫苗，其特征在于，包括佐剂和权利要求1所述复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株或权利要求2~5所述构建方法得到的O型口蹄疫病毒株。
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